LU86518A1 - Procede d'obtention de produits genitaux de mammiferes convenant pour la fecondation naturelle et artificielle - Google Patents

Description

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La présente invention concerne un procédé d'obtention de produits génitaux sexuels de mammifères convenant pour la fécondation naturelle et artificielle au cours de la vie prénatale ou postnatale, de l'enfance, de la prépuberté 5 et à l'état adulte, par régulation de l'activité de leurs organes génitaux. L'invention concerne, en outre aussi, éventuellement, la production de descendants à partir de ces produits génitaux, ainsi qu'une augmentation de la production s de produits génitaux (par rapport à la vitalité caractéris- 10 tique de l'espèce).

Pour stimuler la fonction sexuelle et/ou pour induire l'ovulation, on utilise en premier lieu différents produits hormonaux répandus chez les animaux comestibles et les animaux reproducteurs, comme par exemple des stéroïdes, 15 des hormones gonadotropes ou des gonadotropines ou très récemment la GnRH (hormone libérant l'hormone gonadotrope) et certains analogues hyperactifs de ces hormones. Les substances ou procédés que l'on connaît actuellement induisent seulement l'ovulation des ovocytes déjà mûrs, mais non libérés 20 pour une raison quelconque, ou ils conviennent seulement pour supprimer brusquement en une fois par action hormonale un obstacle présent dans le déroulement normal du cycle et induire ainsi l'ovulation. On ne connaît pas actuellement de produit hormonal, ni de procédé, provoquant une stimulation 25 générale de la fonction ovarienne, accélérant le processus de maturation du follicule préantral ou du follicule primordial ou augmentant le nombre des follicules en cours de développement .

On ne connaît pas actuellement, non plus, de 30 produit et/ou de procédé permettant de préparer à partir - d'animaux non sexuellement mûrs (adultes) ou d'animaux chez qui le développement des produits génitaux a été stoppé à un stade antérieur prédéterminé, ou bien in vivo à partir d'animaux intacts, et/ou post mortem à partir des gonades, 35 des produits génitaux convenant pour la fécondation.

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La fonction des gonades et/ou la production des produits génitaux, subit un retard de développement ou reste stoppée chez de nombreux animaux reproducteurs parce qu'ils sont maintenus dans des conditions non appropriées, chez 5 certains animaux sauvages et à fourrures exotiques de grande veleur en raison du maintien dans des conditions non naturelles. Dans le cas de ces animaux, les produits hormonaux connus antérieurement se sont avérés en général sans effet.

1 Les dérivés de la GnRH spécifique de l'espèce 10 que l'on a fait connaître ces derniers temps (J.A. King et R.P. Millar, J. Biol. Chem. 257, 10722-28/1982/ ; N. Sherwood et autres, Proc. Natl. Acad. Sei. 8^, 2794-2798/19837), ainsi que le fait que la littérature spécialisée parle de la présence de différents facteurs hormonaux de type GnRH 15 dans les gonades ou les ovaires (R.M. Sharpe et autres.

Nature 290, 785-787/1981/ ; N. Dekel et autres, Biol. Reprod.

28, 161-166/19837), soulèvenet la question de facteurs de régulation spéciaux et de l'interaction avec ceux-ci.

Les dérivés de la GnRH spécifique des poissons 20 ou des oiseaux décrits dans un titre de propriété industrielle plus ancien (demande de brevet hongrois n° 4457/83) conviennent pour obtenir des produits génitaux dans le cas de poissons ne se multipliant pas d'eux-mêmes par ailleurs en captivité.

Cet effet repose sur une stimulation du développement des 25 follicules.

L'invention a pour but de fournir un procédé permettant de stimuler 1'activité des organes sexuels d'embryons de mammifères et de mammifères, de façon à permettre d'obtenir des produits génitaux convenant pour la fécondation 30 naturelle ou artificielle et de les utiliser pour produire des descendants. L'invention a, en outre, pour but d'augmenter la production de produits génitaux de mammifères mâles et femelles (par rapport à la vitalité caractéristique de l'espèce ).

35 L'invention repose sur le fait qu'on peut atteindre

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3 ce but en utilisant les nonapeptidalkyl (en Ci à C4)-amides ou les décapeptidamides répondant à la formule générale (I)

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Xi-X2-X3-Pro-X4 ( I ) dans laquelle 5 Χχ représente un groupe glycyle ou un reste quelconque de D-amino-acide naturel ou synthétique ; X2 représente un reste de L-amino-acide renfermant, en tant que chaîne latérale, un groupe alcoyle comportant 1 à 4 • atomes de carbone, un groupe phényle ou un groupe trypto- 10 phyle ; X3 représente un reste de L amino-acide renfermant, en tant que chaîne latérale, un groupe alcoyle comportant 1 à 4 atomes de carbone ou un groupe alcanoylamide comportant 2 à 4 atomes de carbone, et 15 X4 représente un groupe glycylamide ou groupe alkylamide comportant 1 à 4 atomes de carbone, ainsi que leurs sels et leurs complexes métalliques, c'est-à-dire qu'on peut obtenir des produtis génitaux convenant pour la fécondation naturelle ou artificielle avec ces composés 20 à partir de mammifères immatures sexuellement, ainsi que de mammifères en période anoestrale saisonnière ou en anoestrie provoquée par le maintien dans des conditions non naturelles, in vivo et in vitro à partir d'animaux intacts, ainsi qu'à partir d'organes sexuels post mortem, ou en accroître la 25 quantité.

La préparation des composés répondant à la formule générale (I) est connue par la Demande de Brevet hongrois n° 4458/83, ainsi que par le Brevet US n° 4 410 514.

En conséquence, l'invention a pour objet un 30 procédé d'obtention de produits génitaux convenant pour la fécondation naturelle et artificielle à partir de mammifères au cours de la vie prénatale et postnatale, de l'enfance, de la prépuberté et à l'âge adulte (on dira, en résumé : sujets dans la suite) par régulation de l'activité des organes 35 génitaux, et éventuellement de production de descendants à

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4 partir de ces produits génitaux, et d'augmentation de la production de produits génitaux (par rapport à la vitalité caractéristique de l'espèce). Ce procédé est caractérisé en ce qu'on traite les sujets au moins une fois, mais au 5 plus 60 fois, de préférence 1 à 5 fois, par des composés répondant à la formule générale (I), à une dose de 0,01 à 500 JJ g par kg de poids corporel, de préférence de 1 à 100 ><g/kg de poids corporel, et l'on observe entre les différents traitements des pauses d'au moins 2 heures, mais d'au plus 7 10 jours, de préférence de 2 à 8 heures. On utilise, de préférence, les composés sous la forme de solutions, de poudres, d'injections ou de pulvérisations, et l'application peut avoir lieu par voie intramusculaire, intrapéritonéale, subcutanée, intra-utérine, etc...

15 Chez certaines espèces animales, le procédé selon l'invention augmente la production de produits génitaux, tandis que chez d'autres animaux (cas cliniques), l'activité sexuelle diminuée ou arrêtée est normalisée et atteint l'intensité typique pour l'espèce. Le procédé selon l'invention 20 convient également pour déclencher une hyperproductivité des organes génitaux et, par suite, pour augmenter la quantité de produits génitaux caractéristique de l'espèce (hyper-ovulation) .

Le procédé selon l'invention stimule la vésicule 25 germinative et augmente ainsi le nombre de cellules séminales motiles dans l'éjaculat.

Le procédé selon l'invention convient en outre pour déclencher une hyperproduction de l'hypophyse après " laquelle l'hypophyse devient insensible, de sorte qu'un 30 état d'équilibre s'établit ; ainsi, le procédé convient également pour empêcher la conception.

Avec le procédé selon l'invention, on peut préparer les produits finaux dans des conditions de vie naturelles et artificielles, ainsi que dans des conditions de vie de 35 laboratoire.

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Les formes des fonctions sexuelles régulées par dosage des analogues de GnRH à un rythme variable décrites sont de nouveaux phénomènes non encore décrits antérieurement.

On peut résumer les principaux avantages du 5 procédé selon l'invention de la façon suivante.

a) L'application du procédé permet d'améliorer l'activité des gonades de mammifères maintenus dans des conditions non naturelles et/ou de rétablir le fonctionnement normal, les animaux devenant aptes à la production de descen- 10 dants.

b) Le procédé permet d'induire une hyperproduction des ovaires, ce qui permet d'obtenir une multiplicité de gonocytes par rapport au nombre des ovulations caractéristiques de l'espèce envisagée dans chaque cas. On peut les conserver 15 après une fécondation in vitro sous la forme d'embryons ou bien les extraire d'animaux jouant le rôle de récepteurs ou accepteurs.

c) Le procédé permet d'induire chez des mammifères-sujets dans l'enfance une hyperstimulation des gonades et, 20 par suite, une hyperovulation. On peut ainsi obtenir déjà d'un sujet un descendant à un moment où le sujet lui-même n'est pas encore mûr sexuellement.

d) Le procédé convient dans des conditions de laboratoire spéciales, pour des cultures d'organes, pour 25 produire des ovocytes fécondables in vitro à partir d'ovaires intacts post mortem. On peut ainsi obtenir à partir d'animaux reproducteurs de grande valeur des descendants, même après la mort du sujet.

e) Les échanges de produits génitaux obtenus par 30 le procédé permettent l'hybridation des espèces entravée par la distance entre les continents et donne par suite la possibilité de sélectionner de nouvelles espèces d'animaux utiles.

f) Le procédé permet de produire dans des condi- 35 tions de production industrielles, à partir de groupes d'âge V'- 6 / v., quelconques mammifères mâles et femelles, de grandes quantités d'ovocytes, de sperme ou d'embryons, ce qui permet, par exemple, la création de banques d'embryons et les échanges intercontinentaux des descendants.

5 g) Le procédé permet de supprimer l'anoestrus saisonnier et l'inhibition de la spermatogénèse de mammifères. De ce fait, on peut produire des descendants à tout moment, ce qui entraîne une meilleure utilisation des objets économiques .

10 h) Le procédé convient pour la multiplication artificielle d'espèces rares dans le cadre de la sauvegarde de la nature.

i) On peut, par le procédé, insensibiliser l'hypophyse tant chez les mammifères mâles que chez les mammifères 15 femelles, et l'on peut ainsi éviter une gestation fâcheuse, même dans des cas pour lesquels les moyens contraceptifs connus ne sont pas applicables.

On va expliquer à présent l'invention avec davantage de détails sur les exemples non limitatifs qui suivent.

20 EXEMPLE 1 Déclenchement de 1'hyperovulation chez des rattes d'âge infantile.

On traite 60 sujets parmi des rattes d'âge infantile âgées de 21 jours, pesant 7 à 8 grammes, en leur 25 administrant par voie intrapéritonéale de l'analogue D-Phe^, Gin8-GnRH dissous dans une solution de chlorure de sodium physiologique. Selon le type de traitement, on subdivise les animaux en plusieurs groupes. Dans la série de traitements d'une durée comprise entre un jour et 8 jours, on administre 30 des doses préalables de 1 ou 2 ug par jour, respectivement deux fois par jour.

Une fois les traitements achevés, on tue tous les animaux au moyen de vapeur d'éther et l'on extrait chirurgicalement leurs ovaires après la mort, 24 heures après le 35 dernier traitement. On effectue les examens visuellement et à V» 7 l'aide d’échantillons histologiques. Dans les ovaires des animaux-témoins, on trouve plusieurs follicules en cours de développement, mais aucun n'atteint la taille de follicules de De Graaf, de plus il n'y a ni corps jaunes ni Corpus 5 haemorrhagicum. Par contre, on peut, dans tous les groupes traités, mettre en évidence une action hormonale qui se : manifeste par la croissance des follicules, leur transforma tion en follicules de De Graaf, l'ovulation de grands folli-- cules et la formation de corps jaunes normaux. Même les 10 trompes utérines et l'utérus grossissent. Parmi les 60 animaux traités, 4 en tout ne réagissent pas au traitement. Chez les animaux qui ont reçu quotidiennement, pendant 4 jours, deux fois 2 jjg d'analogue de GnRH et ont été traités le quatrième jour 6 heures après la dose de 2 jug par administration d'une 15 dose de 10 jjg, il y a dans les ovaires abondance de follicules de De Graaf ramollis, précédant juste l'ovulation. Le nombre de follicules de De Graaf ayant atteint le stade final de maturité par animal est compris entre 60 et 90, alors que, dans le cas d'animaux adultes, la valeur normale est de 20 12. On traite un second groupe d'animaux de la même façon, sauf que le traitement s'étend sur 6 jours. Dans le cas de ce groupe, on évalue le degré d'hyperovulation d'après le nombre des corps jaunes normaux apparus dans les ovaires.

De façon analogue au cas des produits décrits indiqués précé-25 demment, le nombre de corps jaunes par animal est ici aussi compris entre 60 et 90. L'examen histologique confirme complètement ce résultat.

De la façon décrite, on produit d'une part déjà des ovocytes mûrs chez des sujets infantiles de l'espèce, 30 et d'autre part, le nombre d'ovocytes est accru par rapport à la valeur physiologique des animaux adultes.

EXEMPLE 2 Déclenchement d'une hyperovulation chez des souris femelles d'âge infantile.

35 De la façon décrite dans l'Exemple 1, on traite 8

Vf f 105 souris femelles en tout, âgées de 28 jours et pesant 5 à 6 g. Les animaux traités 1 à 8 jours reçoivent deux fois par jour 1 à 5 jMg d'analogue éthylamide D-Phe8, Gin8, de gly10 -GnRH. Un intervalle de 4 heures sépare les diffé-5 rents traitements. On retire les ovaires 27 heures après la dernière injection.

Les ovaires du groupe-témoin sont de couleur jaune mat et de structure homogène ; on trouve 1 ou 2 follicules en croissance dans certains ovaires. Dans les groupes 10 des animaux traités, on peut observer l'effet de l'hormone dans tous les ovaires, sur les trompes utérines agrandies et sur l'utérus. Chez les animaux qui ont reçu une fois par jour une dose de 1 .\jg et le troisième jour, quatre heures après la dose de l/jg, 5 ^g de l'analogue de GnRH cité, 15 on trouve dans les ovaires des follicules de De Graaf complètement mûrs, onduleux au toucher, en fait 45 à 70 unités par animal. Dans un groupe traité de façon analogue, mais pendant 5 jours, il se forme, au lieu des follicules de De Graaf, des corps jaunes normaux dans le nombre indiqué.

20 Le résultat de l'examen histologique concorde avec l'appréciation visuelle.

Ces résultats confirment les résultats du procédé selon 1'Exemple 1.

EXEMPLE 3 25 Déclenchement d'une hyperovulation chez les lapins d'âge infantile.

On traite trois jours, deux fois par jour, en leur administrant par voie intrapéritonéale, 5 jjg chaque fois d'analogue D-Phe6, Gln8-GnRH, 20 jeunes lapins de la 30 race "Perle Blanche", âgés de 42 jours, nés dans les conditions de maintien de la masse. On subdivise alors les animaux en deux groupes. On traite l'un des groupes, le quatrième jour, en administrant 50jjg d'agent actif, on tue l'autre groupe avec de la vapeur d'éther. Le nombre de follicules de De 35 Graaf mûrs dans le groupe tué avant le traitement sert de X* € 9 témoin pour la constatation des modifications provoquées par la dose de 50 JUg. Chez les animaux laissés en vie, on suit le début de l'ovulation sur deux animaux par un examen laparoscopique (examen au miroir de la cavité abdominale), 5 effectué sous anesthésie. Le traitement par administration de 50 /Jg entraîne au bout de 26 heures, par animal, 30 à 45 ovulations ou Corpus haemorraghicum, tandis que les ovaires des animaux-témoins sont inactifs.

On peut produiie par ce procédé des ovocytes 10 mûrs déjà à partir de lapins d'âge infantile et leur nombre est accru par rapport à la valeur physiologique.

EXEMPLE 4 Déclenchement d'une hyperovulation chez des porcs d'âge infantile.

15 On traite 20 cochons de lait femelles d'âge infantile, âgés de 10 jours, pendant 6 jours, deux fois par jour, en leur administrant par voie intramusculaire 10 jüg d'analogue D-Phe^, Gin**-GnRH chaque fois. Pour l'examen, on retire de chacun des animaux-témoins un ovaire, les méthodes 20 d'examen correspondent à celles décrites dans l'Exemple 3, on compare le nombre de follicules de De Graaf formés et le nombre des corps jaunes formés après l'ovulation. On observe le début de l'ovulation au laparoscope. La dose de 100 jug d'analogue D-Phe^, Gln**-GnRH administrée au septième jour 25 entraîne, au bout de 41 heures, sur les 10 cochons de lait traités, 15 à 36 ovulations. Le traitement des cochons de lait dans l'enfance entraîne le même résultat que dans le cas des espèces d'animaux indiquées dans les Exemples 1 à 3.

EXEMPLE 5 30 Déclenchement d'une hyperovulation chez des moutons d'âge infantile.

On traite 10 agneaux Jerke âgés de 50 jours, pendant cinq jours, en leur administrant deux fois par jour, par voie intramusculaire, 10 pg d'analogue éthylamide D-Phe^, 35 Gin**, desGly^O-GnRH. Une dose de 70 pg d'agent actif, adminis- 10 trée le sixième jour, entraîne 3 à 9 ovulations par animal.

Chez les animaux-témoins, il n'y a pas de modification.

On effectue l'examen, tant chez les animaux traités que chez les animaux-témoins, par laparoscopie. Les résultats 5 concordent avec ceux décrits dans les Exemples 1 à 3.

EXEMPLE 6 : Déclenchement d'une hyperovulation chez des génisses d'âge infantile.

On traite 8 jeunes veaux âgés de 65 jours, pendant 10 8 jours, en leur administrant trois fois par jour 2 jjg d'analogue éthylamide D-Phe^, Gin**, desGlylO-GnRH. Après une pause d'une journée, on administre par voie intramusculaire 100 /ig d'agent actif. Après la dernière injection, on prélève les deux ovaires ; on trouve en général environ 5 à 11 folli-15 cules de De Graaf développés par ovaire. La moitié des follicules n'est plus dure au toucher, et elle est donc juste au stade précédant l'ovulation.

Cette expérience prouve que, même dans le cas de génisses, on peut déjà obtenir à partir d'animaux d'âge 20 infantile davantage d'ovocytes mûrs, alors que la génisse adulte ne produit normalement par ovulation qu'un ovocyte.

EXEMPLE 7

Traitement de l'oligospermie physiologique chez des chimpanzés, pour obtenir la normospermie.

25 Pour des espèces animales viant en petits groupes, mais en particulier pour les primates, le fait suivant, publié à plusieurs reprises dans la littérature est caractéristique, à savoir que tous les mâles de la horde ont une libido active, mais que seuls les animaux meneurs copulent, 30 tandis que les mâles subordonnés présentent une oligospermie physiologique et réversible. Dans le cas présent, on a besoin, non seulement du sperme recueilli chez l'animal meneur et stocké dans la banque de sperme surtout pour l'insémination, mais également du sperme des 4 mâles subordonnés: (tous 35 sexuellement mûrs). Avant le traitement, on fait éjaculer les 'Wir 11 animaux sous anesthésie par des moyens électriques. On évalue au microscope la densité et la motilité des éjaculats, puis on leur fait subir un essai de congélation (-196°C). Des essais spermatologiques antérieurs particuliers ont en effet 5 montré que des cellules séminales défectueuses difficiles à déceler au microscope ne survivent pas à la congélation. L'image de sperme favorable obtenue après la congélation montre que la spermiogénèse (spermatogénèse) se déroule normalement. L'éjaculat prélevé avant le traitement sur 10 les mâles examinés présente une oligospermie physiologique. Ensuite, les chimpanzés, qui pèsent 60 à 90 kg, reçoivent une fois par semaine 100 χig d'analogue éthylamide D-Phe6, Gln^, desGlylO-GnRH dans 1 ml de solution physiologique de chlorure de sodium. L'application est effectuée par voie 15 intramusculaire au moyen d'un instrument d'injection à air comprimé. Dans les éjaculats que l'on a obtenus au cours de la quatrième semaine après le premier traitement sous anesthésie, par des moyens électriques, on peut enregistrer 40 à 60 % de formes prématurées de spermatozoïdes dont la 20 motilité est inférieure à 10 % après l'essai de congélation. Dans les éjaculats obtenus 60 jours après le premier traitement, la proportion des cellules séminales défectueuses est inférieure à 30 % et la motilité est supérieure à 60 %.

Les propriétés quantitatives et qualitatives des éjaculats 25 concordent avec celles de celui qui est prélevé sur l'animal meneur, ainsi qu'avec les indications de la littérature spécialisée. Lors de congélations des éjaculats dilués dans la proportion de 1 : 1, la motilité de 60 % descend à seulement 45 %. Le sperme de cette qualité convient aux fins 30 d'insémination, tant à l'état frais que congelé.

On peut prélever sur des mâles subordonnés, de la façon décrite, du sperme stockable dans la banque de sperme, dans une quantité et une qualité qui conviennent pour la fécondation.

35 i \ \ 1 » i 12 EXEMPLE 8 Déclenchement de la spermiogénèse (spermatogenèse) chez un bison présentant une oligospermie saisonnière pour obtenir un éjaculat convenant pour l'insémination et pour le stockage 5 à l'état congelé.

Sur un bison pesant environ 700 kg, appartenant au jardin zoologique, on prélève un échantillon de sperme, électriquement sous anesthésie, vers le mois de Mai. On constate que le bison se trouve en état d'oligospermie sai-10 sonnière. Les symptômes sont les suivants : dans le champ du microscope à agrandissement 1.500, en général utilisé pour l'examen du sperme, le nombre de spermatozoïdes est de 5 à 20, la proportion des cellules séminales défectueuses est de 75 à 80 % et la densité du sperme est de 0,5. Un 15 sperme de cette qualité ne convient pas pour la fécondation.

On traite alors l'animal en lui administrant par voie intramusculaire (au moyen d'une instrument d'injection à air comprimé) deux fois par semaine 200 /ig chaque fois d'analogue D-Phe^, Gln^-GnRH. Le cinquante-cinquième 20 jour après le début du traitement, on fait éjaculer l'animal deux fois, à un intervalle d'une heure. On réunit les deux éjaculats ; la densité est de 4, la motilité de 55 %. On congèle le sperme, puis l'on détermine la diminution de motilité due à la congélation. Elle n'est que de 5 %.

25 On parvient par ce procédé à influencer de telle façon la spermiogénèse qu'on peut obtenir, au lieu de 1'éjaculat non utilisable pour la fécondation, un sperme de très bonne qualité, convenant à la fois à l'état frais et après un stockage à l'état congelé pour féconder plusieurs vaches 30 (au total 14).

EXEMPLE 9 Déclenchement de la spermiogénèse chez des renard communs (Vulpes vulpes) présentant une oligospermie saisonnière.

On cherche à influer sur la spermiogénèse de 35 renards communs maintenus dans le parc zoologique (ou renards ·»* 13 roux) présentant une oligospermie saisonnière, de façon à pouvoir inséminer des renards argentés et bleus, pour pouvoir produire des fourrures (robes) hybrides particulières et de grande valeur. Il est connu par la littérature spécia- 5 lisée que tous les genres de renards ne sont chauds qu'une fois par an et qu'en dehors de cette seule période, les gonades des deux sexes sont entièrement inactives. Entre les oestrus des différents genres, il y a des intervalles de temps de plusieurs mois (renard commun : Janvier ; renard 10 bleu : Avril à Mai). Les résultats des essais ont été comparés à l'image de sperme d'une population en oestrus saisonnier pour laquelle la quantité moyenne d'éjaculat est de 2 ml, la densité de 3 et la motilité de 50 à 60 %. On considère celle-ci comme valeur physiologique.

15 On traite cinq renards rouges mâles sexuellement mûrs pesant 8 kg en moyenne, début avril, pendant sept semaines, en leur administrant deux fois par semaine 1, 5, 10, 50 JJ g d'analogue D-Phe^, Gln^-GnRH. La troisième semaine après le début du traitement, on prélève des échantillons 20 de sperme. Dans les échantillons, le nombre de cellules géminales est d'environ 60 à 70 % de la valeur physiologique, le nombre de spermatozoïdes dégénérés dépasse 40 %. Les formes défectueuses sont en majorité des formes jeunes (gouttes de plasma à la partie centrale du col). La septième semaine / 25 après le début du traitement, on recueille de nouveau de l'éjaculat sous anesthésie. On peut prélever du sperme avec succès sur tous les animaux, le volume de l'éjaculat est compris entre 1,2 ml et 3,1 ml, la densité est de 3, la motilité de 65 % dépasse numériquement considérablement 30 la valeur physiologique. (Les animaux mâles sont pendant ce temps séparés des animaux femelles, il n'y a pas de possibilité d'évacuation par copulation). On subdivise les échantillons de sperme en groupes selon la qualité et on les congèle. Après la dilution et la congélation et enfin la 35 décongélation, la motilité du sperme congelé à -196°C est de > » 14 45 %. En utilisant le sperme congelé, on peut obtenir (en utilisant la programmation GnRH (voir Exemple 17) et la technique de l'insémination) une gestation normale chez les renards bleus.

5 On peut préparer, par un seul prélèvement d'éja- culat effectué sur les cinq renards, 56 doses de sperme convenant pour la fécondation. La technique convient pour préparer des fourrures hybrides précieuses dans de grandes fermes.

10 EXEMPLE 10

Traitement d'un tigre de Sibérie infertile à cause d'une image de sperme dégénérée.

Un tigre de Sibérie âgé de 8 ans, appartenant au jardin zoologique, vit depuis trois ans avec une tigresse.

15 Lors de l'oestrus de la femelle, des accouplements ont lieu régulièrement, mais sans reproduction. L'absence de gestation par la faute de la femelle doit être exclue, du fait que la tigresse a déjà été pleine à la suite d'accouplements avec un autre mâle et a également élevé ses petits.

20 On prélève sur le tigre mâle, électriquement, sous anesthésie, un échantillon de sperme. L'éjaculat est très dilué, 4 ou 5 spermatozoïdes dégénérés par champ optique sont visibles, ils effectuent un mouvement frétillant. La forme des dégénérescences est caractéristique des phases 25 précoces de la spermatogénèse. On traite l'animal une fois par semaine, en lui administrant par voie intramusculaire (au moyen d'un instrument d'injection à air comprimé) 100 jjg d'analogue D-Phe^, Trp^, Leu^-GnRH, dissous dans 1 ml de solution physiologique de chlorure de sodium. On laisse 30 le tigre avec sa tigresse et des accouplements ont lieu régulièrement, même pendant la durée du traitement. La tigresse est pleine et met au monde trois petits tigres en bonne santé. On peut déduire de la date de la naissance que la copulation fertile a eu lieu 40 à 50 jours après le premier 35 traitement.

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Le procédé convient donc pour le traitement de l'image de sperme dégénérée de tigres mâles et ainsi pour obtenir des descendants.

EXEMPLE 11 5 Stimulation d'une normospermie physiologique sur un tigre du Bengale pour obtenir une hyperspermie permettant la congéla-Ί tion.

Un tigre du Bengale âgé de 8 ans, pesant environ 200 kg, appartenant au jardin zoologique, s'accouple réguliè-10 rement, sa femelle a auparavant été pleine chaque année. En connaissance de ces faits, on prélève sur le tigre électriquement, sous anesthésie, à l'époque de l'accouplement, un échantillon de sperme. On constate que la densité du sperme est de 3, la motilité de 30 % et la quantité de l'éja-15 culat de 0,2 ml. L'éjaculat présente l'image d'une normospermie physiologique. On ne peut, pour des raisons techniques, congeler une quantité d'éjaculat aussi réduite. Pour éviter de détériorer le foie, on doit effectuer l'anesthésie au plus tous les quatre jours et la maintenir au maximum 4 à 5 20 heures. Ce mode de collecte du sperme n'est pas réalisable.

On enferme le mâle dans une cage séparée et on le traite tous les jours pendant 12 jours en lui administrant 10 jug d'analogue éthylamide D-Phe6, Gin8, desGly18-GnRH. On dissout l'agent actif dans 1 ml de solution physiologique 25 de chlorure de sodium et on l'applique par voie intramusculaire au moyen d'un instrument d'injection à air comprimé. Le douzième jour, on fait éjaculer l'animal électriquement sous anesthésie deux fois, à un intervalle d'une heure, et l'on récupère ainsi 1 ml et respectivement 0,8 ml de sperme. La 30 densité des échantillons réunis est de 4, la motilité est de 70 %. On congèle les échantillons de sperme et on les subdivise en 21 doses séparées pour la fécondation artificielle. Après la décongélation du sperme, la motilité est de 60 %.

On peut ainsi prélever sur un tigre du Bengale en 35 quantité importante du sperme pouvant être stocké dans une * 16 banque de sperme.

EXEMPLE 12

Traitement d'une aspermie provoquée par le maintien dans des conditions non naturelles chez un orang-outang.

5 Un ourang-outang mâle âgé de 18 ans, pesant environ 350 kg, appartenant au jardin zoologique, a été capturé alors que c'était un jeune animal. Il a eu successivement trois propriétaires. Selon l'anamnèse, il n'a jamais eu de compagne, mais a toujours été laissé seul et ne s'est 10 jamais accouplé. Il vit au zoo depuis 11 ans, sans compagnons de son espèce et sans femelles. Son comportement est flegmatique, inactif, caractérisé par des symptômes d'hospitalisation. On fait au jardin zoologique une proposition selon laquelle une institution achèterait l'animal s'il appartient 15 au genre de Bornéo et est fertile. L'examen chromosomique montre que l'animal appartient au genre de Bornéo, c'est-à-dire est un sujet extrêmement rare (il y a 153 sujets dans le monde entier). Au cours de l'anamnèse, la fertilité est mise en question par le fait que l'agressivité caractéristique 20 des primates mâles et la masturbation régulière ont complètement cessé depuis le moment de l'hospitalisation qui a eu lieu il y a environ 5 ou 6 ans. On prélève électriquement sous anesthésie un échantillon de sperme sur l'animal. Seules les sécrétions des glandes secondaires ont été déchargées dans 25 l'éjaculat, trois fois une goutte, au total 0,1 ml. On ne peut trouver dans l'éjaculat de spermatozoïdes mobiles, il y a seulement quelques cellules séminales inactives. (A l'examen microscopique, on dénombre au total 1 ou 2 unités dans 10 champs optiques).

30 On traite alors l'animal en lui administrant deux fois par semaine 100 Jjg d'analogue éthylamide D-Phe6,

Gln^, desGlylO-GnRH. Le traitement est effectué de la façon décrite dans les Exemples 1 à 11. Pendant la durée du traitement, les mouvements de l’animal deviennent plus vifs, plus 35 actifs, mais l’on ne peut l'attribuer à une augmentation de 17 V 1» la libido, car cela peut aussi avoir été déclenché par la peur des injections à la seringue. On achève le traitement le 47ème jour après la première injection. On fait éjaculer l'animal deux fois en le réanesthésiant, à un intervalle 5 d'une heure, ce qui permet de récupérer 3,2 ml de sperme au total. La densité du sperme est de 3, la motilité est de 35 %. La proportion de cellules séminales dégénérées est de 20 %, il ne s'agit pratiquement que de formes de développement précoces (goutte de plasma au milieu du col).

10 En raison de la valeur extrêmement élevée de l'animal, et également pour sauvegarder l'intégrité du personnel effectuant le traitement, on ne poursuit pas le traitement. L'acheteur est satisfait de l'image de sperme contrôlée, qui correspond aux valeurs caractéristiques des primates 15 fertiles.

On peut ainsi rétablir la fertilité d'un animal précieux extrêmement rare et constituer, en conservant son sperme, une réserve de gènes ayant une désignation dans le catalogue international.

20 EXEMPLE 13

Inhibition de l'activité ovarienne chez des lions aux fins de contraception.

Dans les jardins zoologiques du monde entier, on présente le lion parmi les grands animaux féroces (carnas-25 siers). Pour les panoramas différents et les parcs pour safaris, il faut présenter les deux sexes ensemble, dans un seul et même cadre de vie. Parmi les grands carnassiers, le lion est le seul qui se reproduit bien en captivité dans des conditions alimentaires suffisantes. En raison de la 30 saturation absolue du "marché des lions", il est souhaitable d'élaborer un procédé anticonceptionnel sans danger pour l'animal, ne produisant pas de modification de son aspect extérieur et de son comportement et empêchant la conception malgré une copulation fertile. Les procédé anticonceptionnels 35 à base de stéroïdes sexuels entraînent, en peu de temps, une V »’ 18 dégénérescence graisseuse pathologique et la perte de la valeur démonstrative de l'animal.

On traite une lionne fertile pesant environ 200 kg, intacte, appartenant au jardin zoologique, qui a 5 déjà mis bas cinq fois au cours de sa vie, en lui administrant deux fois toutes les trois semaines de l'analogue D-Phe^, Gln^-GnRH de la façon suivante : d'abord 50 jjg, au bout de 4 heures 500 pg, puis l'on observe une pause de trois semaines. On effectue ce traitement qui a lieu toutes les 10 trois semaines du début de l'oestrus au cinquantième jour après la date de terminaison de l'oestrus caractéristique de l'espèce (donc d'Avril à Août). L'animal présente un comportement normal et s'accouple régulièrement pendant l'oestrus, le mâle en question présente un état de normospermie selon 15 l'examen. La lionne n'est pas pleine pendant la durée du traitement, et l'on n'observe d'anomalies ni dans son comportement, ni dans son aspect.

EXEMPLE 14 Déclenchement de l'activité sexuelle de pourceaux femelles à 20 la puberté dans des conditions de maintien à une masse importante, pour le premier déclenchement de l'état de fertilité.

Dans les conditions de maintien de la masse, on s'efforce d'utiliser les animaux reproducteurs prévus pour la conservation de l'effectif, pour la reproduction 25 aussitôt que possible, ainsi que de synchroniser la fécondation et la mise-bas dans le sens d'une adaptation à une technologie continue. L'activité gonadique de pourceaux femelles maintenus à une grande masse, obligés à une croissan-- ce rapide par une alimentation intensive, est labile à l'épo- 30 que de la prépuberté et de la puberté, c'est pourquoi il arrive rarement et de façon disséminée dans la population totale que l'état de fertilité en soi soit suivi ultérieurement par une gestation.

Pour les objectifs de l'expérience, on sélectionne 35 soixante animaux dans un centre d'élevage de porcs parmi 200 % « 19 futures truies (sur la base du meilleur développement, du meilleur rendement de la nourriture, etc...). On les répartit au hasard en 2 groupes de 30 animaux chacun. On laisse les deux groupes 24 heures sans nourriture ni boisson, également 5 selon la technologie de ce centre. On traite les animaux, au moment de leur sélection, en leur administrant par voie intramusculaire de l'analogue D-Phe^, Gln^-GnRH dissous dans une solution physiologique de chlorure de sodium, on répète deux fois encore, à intervalles de 24 heures, les injections 10 avec des doses de 20 jjg du composé indiqué chacune. Tant dans le groupe-témoin non-traité que dans le groupe traité, l'état de fécondité apparaît chez le premier animal 5 jours après la sélection des animaux. On maintient 26 jours les deux groupes dans la même étable, dans le même volume d'air, 15 dans des conditions identiques autorisées du point de vue de la technologie. Pendant ce temps, 3 animaux du groupe-témoin non-traité (10 %), 21 animaux du groupe traité (70 %) parviennent à l'état fécondable. On ne comptabilise comme réussite que les cas pour lesquels l'état de fécondité est suivi 20 par une gestation et une mise-bas normales.

Dans cette série d'essais, l'objectif ne s'étend pas à l'établissement précis de l'instant d'ovulation, caron ne dispose pas de suffisamment de verrats (ou mâles reproducteurs). Par conséquent, l'objectif est le "premier état de 25 fécondité" en 26 jours. La proportion de 10 % d'animaux en gestation dans le groupe-témoin correspond à la moyenne de l'exploitation. Par suite, l'augmentation de 60 % obtenue par le traitement implique une utilicé économique considérable .

30 EXEMPLE 15

Traitement de chincillas stériles depuis assez longtemps.

On traite 20 chincillas, stériles depuis au moins deux ans, par injection intrapéritonéale, trois jours, deux fois par jour, de 10 jdg d'analogue D-Phe^, Gln^-GnRH.

35 Le quatrième jour, on applique 75 pg de l'analogue hormonal.

20

Ensuite, on laisse les animaux à leur chaleurs, selon la technologie. 12 des chinchillas mettent bas en 4 mois.

Parallèlement à cet essai, on traite 3 chinchillas de particulièrement grande valeur (mutants "black"), stériles 5 depuis plus de 2 ans, pendant trois jours, deux fois par jour en leur administrant 10 pg chaque fois de D-Phe8, Gln8-GnRH. On administre l'agent actif par injection intrapéritonéale. Le quatrième jour, on applique l'analogue hormonal * à une dose de 75 j)g, puis on laisse les animaux à leurs 10 chaleurs, comme d'habitude. En 4 mois, les trois animaux mettent bas.

Ce procédé permet de faire reproduire de nouveau des animaux à fourrure de grande valeur, stériles depuis assez longtemps.

15 EXEMPLE 16

Suppression de l'anoestrus saisonnier de chats sauvages adultes (Felis silvestris).

On traite en Août deux chattes sauvages appartenant au jardin zoologique, pesant 6 kg en moyenne, dont 20 le cycle se place, dans des conditions naturelles, les mois de Février/Mars, en leur administrant l'analogue éthylamide D-Phe8, Gin8, desGlylO-GnRH. Avant le traitement, on ouvre sous anesthésie la cavité abdominale pour contrôler l'état des deux ovaires. Après avoir recousu la cavité abdominale, 25 on traite quatre fois en tout les animaux, en observant des pauses de deux jours, par l'agent actif que l'on applique par voie intramusculaire, dissous dans une solution physiologique de chlorure de sodium. Entre la première injection et la seconde, on observe une pause de deux heures ; la première 30 dose est de 100 jjg, la seconde de 500/ig. 48 heures après, on applique la troisième dose (lOO^üg) et, deux heures encore après, la quatrième dose (500 /4g). Aux jours 0, 2, 4 et 8, on ouvre la cavité abdominale sous anesthésie, et l'on évalue visuellement l'état des ovaires. Après l'achèvement des 35 traitements, on retire les deux ovaires chirurgicalement, on t ♦* * 21 les fixe et on les examine histologiquement.

Le jour 0, on observe, dans le cas des deux animaux, dans l'ovaire de gauche, 3 ou 4 follicules secondaires présumés, un corps jaune ancien reconstitué et, dans l'ovaire 5 de droite, 5 ou 6 follicules secondaires présumés. Sous l'effet du traitement, au bout de 4 jours, tous les follicules secondaires se transforment en follicules de De Graaf, l'ovulation a lieu, et, au lieu des follicules, on trouve des s Corpora haemorrhagica au cours de leur transformation en 10 corps jaune. A côté de ces derniers, il se développe, dans une quantité non dénombrable visuellement, des follicules qui continuent à se développer sous l'effet des autres traitements et subissent une atrésie avec lutéinisation intra-folliculaire après la dernière dose de 500jdg. Les constatais tions visuelles sont entièrement confirmées par l'examen histologique.

L'ovulation qui se produit sous l'effet du traitement décrit montre que l'on peut obtenir chez les félins la fécondation même hors saison, et que l'on peut même obtenir 20 des descendants dans des conditions non naturelles.

EXEMPLE 17

Traitement d'une femelle de renard bleu en anoestrus saisonnier pour déclencher un oestrus fertile.

On effectue un examen laparoscopique sous anes-25 thésie en Décembre sur une femelle de renard bleu en anoestrus saisonnier. On constate que les deux ovaires sont inactifs, ne contiennent pas de follicules en développement ou de follicules de De Graaf.

> On traite l'animal 10 jours en lui administrant 30 deux fois par jour, par voie intramusculaire, 1,5_Lg d'analogue D-Phe^, Gln^-GnRH. Le dixième jour, on effectue un nouvel examen laparoscopique sous anesthésie. Dans les deux ovaires, on trouve de gros corps jaunes dont le nombre (que l'on ne peut qu'apprécier en raison d'insuffisances techniques) est 35 de 10 à 20. On constate en même temps que le col de l'utérus t ** 22 9 est ouvert.

On traite, également en Décembre, de façon analogue, en lui administrant deux fois par jour 2 μ g d'analogue D-Phe**, Gln^-GnRH, une femelle condamnée à ne pas reproduire 5 à cause d'une atteinte mammaire. On suit l'effet du traitement sur la modification de l'état du col de l'utérus. Le ^ sixième jour après le premier traitement, le col de l'utérus s'ouvre. On administre ensuite une dose de 50/ig. 16 heures après, on examine l'état des ovaires par laparoscopie ; 10 l'ovulation est imminente. On ouvre alors entièrement la cavité abdominale, on extrait les ovaires, et l'on retire par ponction les ovocytes des follicules de De Graaf au nombre de 11 au total. On trouve six ovocytes normaux recouverts d'une Corona radiata normale.

15 Ce procédé permet la production d'ovocytes appro priés pour la fécondation in vitro, d'embryons au cours de l'anoestrus saisonnier, sans perturbation du cycle annuel normal. Cela offre la possibilité de produire des descendants hybrides particuliers en utilisant moins d'animaux-hôtes de 20 grande valeur.

EXEMPLE 18

Stimulation de la fonction ovarienne de chats domestiques d'âge infantile (Felis cattus domesticus) par l'analogue D-Phe6, Gln8-GnRH.

25 On traite 5 jeunes chats âgés de 45 jours, présen tant chacun un poids d'environ 0,3 kg, à intervalles de deux jours, en leur administrant en quatre fois en tout 100 Mq d'analogue D-Phe**, Gln^-GnRH chaque fois. On dissout l'agent actif dans une solution physiologique de chlorure 30 de sodium et on l'applique par voie intramusculaire. Après l'achèvement du traitement, on retire chirurgicalement les deux ovaires sous anesthésie et on les examine visuellement.

On fixe ensuite les ovaires dans de la formaline et on les soumet à des examens histologiques. Il y a dans les deux 35 ovaires 5 à 7 unités de Corpus haemorrhagicum. Sous la croûte, » * *' * 23 on trouve les follicules en cours de développement, faciles à séparer des ovaires clairs couleur beurre, dont certains ont la taille de follicules de De Graaf.

Ces résultats prouvent sans ambiguité que l'ovaire 5 de chats domestiques encore dans l'enfance présente, sous l'effet du procédé décrit, les particulairités histologiques et morphologiques caractéristiques de l'animal sexuellement mûr. Ainsi, l'animal convient, avant la maturité sexuelle biologique au sens courant, pour la production d'ovocytes 10 convenant pour la fécondation in vitro.

EXEMPLE 19

Stimulation de la fonction ovarienne de chats domestiques d'âge infantile par l'analogue D-Phe8, Trp7, Leu8-GnRH.

On adminsitre à 5 jeunes chats âgés de 45 jours, 15 pesant chacun environ 0,3kg, l'analogue D-Phe8, Trp7, Leu8-

GnRH. Avant le traitement, on retire chirurgicalement l'ovaire gauche, on administre aux animaux par voie intramusculaire à intervalles de deux jours, trois fois en tout, des doses de 100 >tg chacune de solution préparée sous la forme de solution 20 physiologique de chlorure de sodium. Après l'achèvement du traitement, on extrait chirurgicalement l'ovaire restant (droit ), on l'examine visuellement et, après fixation, on lui fait subir des examens histologiques. Après le traitement, on trouve dans les ovaires 7 ou 8 unités de Corpus 25 haemorrhagicum et beaucoup de follicules (non dénombrables) en cours de dévleoppement.

Ce résultat confirme entièrement ce qui a été trouvé selon l'Exemple 18, même pour un autre analogue hormonal et ouvre la voie d'autres expériences sur la physiologie 30 du reste du cycle des ovaires.

EXEMPLE 20

Stimulation des follicules primordiaux de chattes domestiques d'âge infantile (Felis cattus domesticus).

On administre à 5 jeunes chats âgés de 45 jours, 35 qui présentent un poids d'environ 0,3 kg chacun, l'analogue * < * 24 D-Phe8, Gln8-GnRH. Avant le traitement, on retire chirurgicalement l'ovaire gauche sous anesthésie. On administre alors aux animaux pendant trois jours, 3 fois par jour, à intervalles de 4 heures, neuf fois en tout 0,1 jjg de l'agent 5 actif par voie intramusculaire chaque fois, sous la forme d'une suspension préparée avec une solution physiologique de chlorure de sodium et du propylène-glycol. Après l'achèvement du traitement, on retire chirurgicalement l'ovaire restant, on l'examine visuellement et, après la fixation on 10 lui fait subir des examens histologiques. A l'oeil nu, les deux ovaires sont homogènes et de couleur jaune beurre, l'ovaire traité est un peu plus gros. Dans les ovaires non traités, on ne peut déceler histologiquement que des follicules primordiaux, tandis que, sur la surface de coupe des 15 ovaires non traités, on enregistre une quantité non dénombrable (plusieurs centaines) de follicules en cours de développement, présentant les divers stades de la formation de l'antre.

On parvient par ce procédé à stimuler plusieurs centaines de follicules primordiaux de l'ovaire en même 20 temps.

EXEMPLE 21

Production d'ovocytes de boeuf pour la culture embryologique in vitro à partir d'une culture d'organes post mortem.

On retire les ovaires intacts de génisses 30 à 25 55 minutes après les avoir tuées à l'abattoir et les avoir laissées se vider de leur sang et on les place dans un adjuvant complet dans des conditions de laboratoire. Au liquide nutritif, on ajoute de l'analogue éthylamide D-Phe8, Gin8, desGlylO-GnRH à une concentration de 10“9 à 10“8. Les restes 30 d'ovaires maintenus dans la culture d'organes ovulent en 16 à 43 heures. Parmi les ovocytes extraits des ovaires par des ovulations spontanées in vitro, puis ponction, 85 % sont capables de poursuivre la meiose (division cellulaire réductrice) et d'être fécondés avec succès in vitro avec du 35 sperme de boeuf préparé. On observe les deux premières divi- 4 Λ 25 sions cellulaires des ovocytes fécondés in vitro dans la culture.

Ce procédé permet, de façon analogue à la technologie de l'insémination chez les boeufs, mondialement répandue, 5 d'"inséminer" directement des embryons vivants, c'est-à-dire de les transplanter. On a la possibilité, dans les abattoirs, de produire une quantité d'embryons dépassant largement les besoins.

£

Claims (1)

1. 26 1°) Procédé d'obtention de produits génitaux appropriés pour la fécondation naturelle et artificielle à partir de mammifères au cours de la vie prénatale et post-5 natale, dans l'enfance, au cours de la prépuberté et à l'âge adulte (apellés dans la suite : sujets) par régulation de l'activité des organes génitaux, et aussi éventuellement de production de descendants à partir de ces produits génitaux * et d'augmentation de la production de produits génitaux (par 10 rapport a la vitalité caractéristique de l'espèce), caractérisé en ce qu'on traite les sujets au moins une fois, mais au plus 60 fois, de préférence 1 à 5 fois, par des composés répondant à la formule générale (I) Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Xi-X2~X3-Pro-X4 (I) 15 dans laquelle X]_ représente un groupe glycyle ou un reste de D-amino-acide naturel ou synthétique quelconque ; X2 représente un reste de L-amino-acide renfermant, en tant que chaîne latérale, un groupe alcoyle comportant 1 à 4 20 atomes de carbone, un groupe phényle ou un groupe trypto- phyle ; X3 représente un reste de L-amino-acide renfermant, en tant que chaîne latérale, un groupe alcoyle comportant 1 à 4 atomes de carbone ou un groupe alcanoylamide comportant 25 2 à 4 atomes de carbone, et X4 représente un groupe glycylamide ou alkylamide comportant 1 à 4 atomes de carbone, dans une proportion de 0,01 à 500 jdg/kg de poids corporel, de préférence de 1 à 100 jUg/kg de poids corporel, et l'on 30 observe entre les différents traitements des pauses d'au moins 2 heures, mais d'au plus 7 jours, de préférence de 2 à 8 heures. 2°) Procédé d'obtention de produits médicamenteux utilisables en médecine vétérinaire pour agir sur l'activité 35 sexuelle de mammifères, caractérisé en ce que l'on mélange 27 Λ1 des composés répondant à la formule générale (I) dans laquelle la signification de Χχ, X2, X3 et X4 est la même que dans la revendication 1, avec les supports usuels dans la préparation des médicaments et/ou des adjuvants, et on leur donne 5 la formulation de produits médicamenteux. 3°) Produits de médecine vétérinaire, caractérisés en ce qu'ils renferment des composés répondant à la formule générale (I) selon la revendication 1. ; 4°) Application de composés répondant à la formule 10 générale (I) selon la revendication 1 à l'action sur l'activité sexuelle de mammifères.