Vynález se týká .prostředku pro získávání sexuálních produktů připravených pro oplození ze sexuálně dospělých ryb v době me^· závislé (na jejich přirozeném třecím období.
Je známo, že sexuální aktivita obou pohlaví je regulována gonadotropními hormony uvolňovanými adenohypofysou. Tyto hormony řídí morfologický a funkční vývoj a zralost gonád, jejich gametogenetickou aktivitu (produkci jiker a spermatozoí) (gonád) a exkreci gonádních hormonů.
Adenohypofysa uvolňuje u olbou pohlaví tytéž dva gonadotropní hormony. Jeden z nicih se nazývá FSH (folikuly stimulující hormon), druhý je znám jako LH (luteinizační hormon) nebo podle svého účinku u samců ICSH (hormon stimulující intersticiální buňky).
Je také známo, že tyto dva hormony nevykazují žádnou sexuální specificitu, protože stejný FSH je odpovědný za gametogenetickou aktivitu u samců i samic a stejný LH nebo ICSH vyvolává exkreci androgenu u samců a estrogenu nebo progesteronu u samic.
Jak FSH, tak LH jsou glykoproteidy, které vykazují značnou druhovou specifitu u ryb.
Hypofysa ryb integruje funkce endokrinního systému a má také některé koordinační funkce, mezi endoikrynním systémem a nervovým systémem, zejména skrze nuklea autonomního nervového systému v hypoithalamové oblasti diencefalu. Kromě toho hypofysa reguluje reprodukční cyklus s pomocí druhově specifických tropních hormonů.
Za normálních podmínek dochází к ovulaci. u ryb v třecím prostředí charakteristickém pro daný rybí druh. Ovulace zralých vajíček se neuskutečňuje spontánně, ale vajíčka zůstávají v dormantním stavu po kratší nebo delší dobu až do vyvinutí vhodných podmínek. Toto reprodukční přizpůsobení, charakteristické pro ryby je společně řízeno hvpofvsou a centrálním nervovým svstémem. V dormantním stavu je organismus ryb v rovnováze na nízké úrovni gonadotroipnf aktivity, a tak len velmi malé množství gonadotroninu se uvolňuie do proudu krve. ÍBerhrlski N.: Sovreměnnoie sostoianie voorosa o něvrogormanolnoj repuliacii onlovo cvkla rvb i biotěchnika nnrmonalnvch vozděistvii v rvbovodstvě. Leningrad. 1.96'6. vvdavatel Gos. Univ.. str. 8.1
Те nemožné určit ořesnou dobu, kdv se obieví Příznivé (podmínky pro rvbv. protože se vvvinou v určité době víceméně nahodile í například pozdní iako nebo časné léto 1. To znamená, že regulační mechanismus reprodukce u rvb umožňuje adaptaci reprodukčního cyklu na vnější prostředí. Tato regulace se koordinuje u ryb hypothalamohyipofvsním svstémem.
Podle výzkumů. prováděných v posledních několika letech bylo zjištěno, že uvolňování určitých tropních hormonů adenohvpofysy je regulováno neurohormony. Neurohormony vystupují z iterminálních nervů, přecházejí ce do určitých nukleí hypothalamu a jsou ihned absorbovány tzv. portálními kapilárními cévami a tímto způsobem se dostanou krví přímo do sinusů adenohypofysy.
Všechny dosud známé neurohormony jsou oligoipeptidy nebo polypeptidy. Neurohormony vyvolávající sekreci tropních hormonů jsou nazývány ,,spouštěcí faktor“ (RF), zatímco neurohormony inhibující sekreci hormoinů se nazývají ,,inhibující faktor“ (IF). Podle současné nomenklatury v případě neurohormonů se známou strukturou a funkcí se používají výrazy „spouštěcí hormon“ (RH) nebo „spouštění inhibující hormon“ (RIH).
Je charakteristické pro všechny neurohormony, že jejich účinek u hypofysek.tomizovaných zvířat je analogicky účinku zjištěnému po podání tropních hormonů.
Basofily rybí hypofysy vykazují sezónní změny, jejich množství se snižuje v třecím období. V procesu adaptace na prostředí se vytvářejí spouštěcí hormony (RH), které se proudem krve dostávají do hypofysy a regulují tam uvolňování tropních hormonů do krve. Tímto způsobem jsou ryby informovány, že se dostávají do existence vhodných vnějších třecích podmínek. Následkem toho se hypofysa a vylučování gonadotropů do krve aktivuje regulujícím hormonem luteinizačního hormonu (LH/RH) a proces ovulace začíná (Breton B. a Weil C. L., C. R. Acad. Sc., Paříž, 277, 2 061 až 2 064 /1973/).
Smyslové nervové impulsy, vytvořené na třecím základě se převádějí tímto způsobem do endokrynního systému a tento mechanismus aktivuje reprodukční systém, který je ve vynuceném dormantním stavu, v momentě, kdy je zjištěno optimální vnější prostředí z hlediska přežití potomstva (Gerbilski Lok. cit.).
Neurohormony jsou ve značném stupni interspecifické. Sekvence LH/RH u ryb je rozdílná od této sekvence u savců, takže tyto neurohormony nejsou účinné, když se vvmění.
Vyvolané umělé množení u ryb je možné nalezením světově rozšířené hy-pofysační techniky (Gerbilski lok. «cit. Ί<Pro hormonální vyvolání ovulace se využívají hvpofvsární žlázy sebrané z dospělých nebo téměř dospělých kaprů obecných po vhodné konzervaci. Tíné přirozené nebo syntetické hormony, které se dosud zkoušely, nedávaly jednoznačně pozitivní výsledky.
Protože kapr obecný je chován v rozsáhlém měřítku, jsou velké zásoby po celém světě, z kterých mohou být snadno shromážděny hypofysní žlázy v množstvích dostatečných pro produkční účely. Hypofysní žláza kapra obecného může být úspěšně použita pro množení některých kultivovaných druhů ryb. Taxonomicky vzdálené druhy ryb, (.například jeseteři) jsou výjimky, protože v jejich případě se používá hormo
S nální suspenze připravené z hypofysních žláz stejných druhů.
Kolekce a konzervace hypofysních žláz se provádí stejným způsobem nezávisle na druhu dárce. Hypofysní žlázy by měly být získávány ze starších, pravděpodobně sexuálně dospělých ryb. To je možné jen velmi zřídka. Hypofysní žláza je menší u malých ryb; takže je dávkována váhově, to znamená, že v případě malých ry'b by bylo potřeba význačně více dárcovských ryb.
Hypofysy se známým způsobem dehydratují acetonem. Po třikrát 8- až l,2hodinovém máčení v acetonu jsou hypofysy zbaveny vody a tuku. Po ztvrdnutí se hypofysní žlázy suší po dobu 24 hodin při teplotě místnosti, přičemž se aceton odpaří. Aceton .není nebezpečným aktivním gonadotropním složkám hypofysy a žlázy vysušené tímto způsobem mohou být skladovány delší dobu lbeze ztrát.
Aby se gonadotropní hormony aktivovaly, žlázy se rozmělní v porcelánové třecí misce a hormony se rozpustí v rybím fyziologickém solném roztoku (0,65 °/o N-aCi).
Hormonální roztok se vstříkne do svalů hyb tak, aby se zabránilo zpětnému vytékání nebo nějakým jiným ztrátám. V případě malých ryb nebo ryb s nepatrnými svaly se injekce vstřikují do 'tělní dutiny. Injektované hypofysní hormony hrají stejnou roli, jako vlastní hormony ryb, uvolněné při detekci třecího prostředí: vyvolávají proces ovulace.
Hypofysační technika, ačkoli se rozsáhle používá při chovu rýb, není ve všech případech účinná. Hlavní důvody neúčinnosti jsou následující:
a) protože stav zrání dárcovských rýb, z kterých se sbírají hypofysní žlázy, není znám, není také znám obsah gonadotropního hormonu ve žlázách. Je tedy účinek nejistý dokonce i když byly dávky vypočítány s přebytkem.
b) Hormony hypofysy kapra· obecného jsou účinné jen u kapra a u druhů, které nejsou taxonomicky vzdálené. Tudíž některé druhy ryb, které jsou důležité z ekonomického hlediska, mohou být rozmnožovány pouze s nízkou účinností, nebo nemohou být rozmnožovány vůbec.
c) Pomocí hypofysy obecného kapra nebo jakékoli jiné hypofysy, byl dosažen pouze RH účinek v komerčních podmínkách, FSH účinek nemohl být tímto způsobem dosažen, pravděpodobně z důvodů, které byly uvedeny v bodě a).
d) Vzhledem к nedostatku FSH účinku, hypofysace může být použita jen pro vyvolání účinku u ryb s vajíčky zralými ipro ovulaci.
e) V případě hypofysace může být vyvo lané umělé rozmnožování provedeno jen v přirozené třecí době, to znamená, že možnost je omezena na několik dní v roce. Použití produkčních možností je tedy takto omezeno.
f) Sbírání hypofysních žláz ve velkých množstvích může být prováděno jen z .nedospělých ryb, jejichž hypofysa má nízkou gonádotropní -aktivitu. Sběr z dospělých ryb je možný jen při zabití hodnotné dárcovské ryby.
Vynález má za cíl vytvořit prostředek, který umožňuje získání sexuálních produktů připravených pro přirozené nebo umělé oplodnění, z kteréhokoli druhu dospělých ryb.
Vynález je založen na poznatku, že výše uvedeného gíle se může zcela dosáhnout, když se nove gonadoliberinové deriváty podávají do organismu dospělých ryb. Zjistili jsme, že FSH-LH/RH vyměšované v< hypothalamu ryb mohou být úspěšně nahrazeny těmito sloučeninami, to znamená, že vstříknutím těchto sloučenin může být úspěšně vyvolán vývoj spermií a vajíček a ovulace.
Vynález se tedy týká prostředku pro získání sexuálních produktů připravených pro oplodnění ze sexuálně dospělých ryb v době nezávislé na jejich přirozeném třecím období, při němž skutečný stav zrání sexuálních produktů, (spermií nebo vajíček) sexuálně dospělých ryb se určuje zkouškou, ryby ještě nezralé pro ovulaci se oddělí od zralých ryb, sloučeniny s hormonálním účinkem se těmto rybám podají a po ovulací sexuálních produktů se tyto produkty získají z ryb nebo jejich prostředí.
Podstata prostředku pro získávání sexuálních produktů ze sexuálně dospělých ryb v období nezávislém na jejich přiro-zeném -třecím období spočívá v- -tom, že obsahuje jako účinnou látku alespoň jeden dek-apeptiid vzorce I
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-X2-X3-Pro-Gly-NH2, v němž
X2 znamená L-Leu nebo L-Trp a
X3 znamená L-Gln nebo L-Leu.
Tyto sloučeniny, stejně jako soli nebo 'kovové komplexy těchto sloučenin, se jako sloučeniny s hormonálním účinkem, podají rybám v dávkách 0,1 mikrogramů až 5 miligramů, výhodně 2 -až 500 mikrogramů, zejména 5 až 100 mikrogramů a v případě ještě nezralých ryb pro ovulací se výše uivedené dávky podají alespoň 2X, ale nejvýše 12 X, přičemž poslední použitá dávka je alespoň stejná nebo výhodně alespoň 1,5 X vyšší, než předešlá dávka.
'Zkratky ve vzorci jsou identické se zkratkami /přijatými pro nomenklaturu peiptidové chemie, která je uveřejněna například v J. Biol. Chem. (241, 527 /1966/; 247, 977 /1972/).
Sloučeniny nejsou toxické, takže předávkování nevyvolá žádný škodlivý účinek.
V případě ošetření ryb ještě nezralých pro ovulaci počet injekcí závisí na tom, jak daleko je daná ryba od stavu zralosti pro ovulaci. Když je požadovaný stav blíže, pak je počet injekcí nižší.
Ryby jsou zralé pro ovulaci, když v případě samců se spermie stanou mobilními, když přijdou do- styku s vodou a u samic, v případě, když je jádro situováno na obvodu vaječné buňky.
Ze sloučenin obecného vzorce I mohou být ve způsobu podle vynálezu zvlášť výhodně použity dekapeptidy vzorce II а III
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Leu-Gln-Pro-Gly-NH2 (II)
Glp-His-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-Trp-Leu-Pro-Gly-NHz (III)
Je výhodné vyrábět sloučeniny obecného vzorce I, které jsou používány při způsobu podle tohoto vynálezu technikou tuhé fáze syntézy peptidů (Merrífield R. B., J. Am. Chem. Soc., 85, 2 149 až 2 151 /1963/).
V závislosti na struktuře požadovaných sloučenin se výhodně použije chlormethylovaná polystyrendivinylbenzenová pryskyřice v případě peptidalkylamidu a benzhydrylaminové pryskyřice v případě ipeptidamidu. Aminokyseliny se vážou na pryskyřici jako jejich N-alfa-terc.butyloxykarbonyl (BOC) deriváty z-a použití dicyklohexylkarbodiimidu (DCC), N,N‘-diisopropylkarbodiimidu {DIC) nebo způsobem aktivního esteru. Konečný produkt může být oddělen z tuhého nosiče kyselou nebo alkalickou štěpící technikou.
Požadované konečné produkty obecného vzorce I mohou být vytvořeny z vhodně chráněných aminokyselin pomocí odpovídající kombinace postupné syntézy a fragmentální kondenzace v závislosti na chemickém charakteru jednotlivých aminokyselinových složek.
Hlavní výhody způsobu podle vynálezu jsou následující:
a) Umožňuje množení druhů ryb taxonomicky vzdálených od kapra obecného, které dosud nemohly být množeny vzhledem к nedostatku druhově specifické hypofysy.
b) Může být použit v rozsáhlých ekologických mezích, poněvadž sloučeniny obecného vzorce I vykazují svůj fyziologický účinek dokonce za velmi rozdílných biologických podmínek.
c) Stává se možným množení ryb mimo jejich přirozené třecí období a současně plné využití produkčních možností.
d) Může být eliminována absence ovulace způsobená nepřesným dávkováním hypofysy.
e) Aktivní složka použitá ve způsobu tohoto vynálezu může být vyráběna synteticky v laboratořích, čímž může býit eliminována nejistota účinku charakterizujícího známou technikou hypofysace.
f) Účinek syntetického hormonu použitého v tomto způsobu je identický s účinkem při uvolňování vlastních gonadotroipních hormonů u ryb.
g) Syntetický hormon použitý ve způsobu tohoto vynálezu je mezidruhový, to znamená, že je účinný dokonce i v případě taxonomicky velmi rozdílných druhů ryb.
Způsob podle vynálezu je dále znázorněn pomocí následujících příkladů provedení, ovšem bez omezení rozsahu ochrany.
Příklad 1
Vyvolané umělé množení jesetera malého (Acipenser ruthenus L.)
Z populace daného prostředí se vyberou dospělé ryby a pak se transportují na místo množení. Oddělí se pohlaví a určí se stav zrání vajíček u samic. Ryby se považují za zralé pro ovulaci, když je jádro situováno na obvodu vaječné buňky. Spermie samců se nezkoušejí, protože u populace daného prostředí jsou sexuální produkty samců a samic prakticky ve stejném stavu zralosti. Když je ryba zralá pro ovulaci, vstříkne se dekapeptid vzorce II v jedné dávce 70 mikrogramů do každé ryby včetně samců.
Když ryby nejsou zralé pro ovulaci, měly by být udržovány při teplotě přirozeného tření a výše uvedená sloučenina by měla být podána v dávkách po 10 mikrogramech alespoň '2X, ale nejvýše 12 X, dokud se jádro nedostane ze středu na obvod. Počet ošetření závisí na skutečném stavu zralosti sexuálních produktů ve srovnání se stavem ,,zralým pro ovulaci44. Postup zrání trvá alespoň 100, ale nejvýše 630 stupňoonů v teplotním intervalu 12 až 18 °C. (Stupňoden znamená počet dnů násobený střední teplotou vody použité v období zrání.)
Ovulace se uskuteční za 24 až 32 hodin po podání poslední dávky. Pak se sexuální produkty získají za 40 až 60 minut.
Příklad 2
Vyvolané umělé množení kapra obecného (Cyprinus carpio L.)
V jakémkoli období roku a při jakékoli teplotě se vyberou dospělé chovné kusy ze zásoby a transportují se na místo množení. Oddělí se pohlaiví a stupeň zralosti sexuál262420 nich produktů se určí podle příkladu 1. Když je ryba zralá pro ovulaci, podá se 1 dávka 70 mikrogramů dekapeptidu vzorce III, a to I samcům.
Ryby ještě nezralé pro provedení ovulace by měly být udržovány při teplotě přirozeného tření .a výše uvedená sloučenina by měla být podána po dávkách '5 mikrogramů alespoň 2X, ale nejvýše 15X tak dlouho, dokud se jádro vajíčkové buňky nedostane ze středu na obvod. Počet zásahů závisí na skutečném stavu zralosti sexuálních produktů ve srovnání se stavem „zralým pro ovulaci“. Postup zrání 'trvá alespoň 100, ale nejvýše 750 stupňodnů při teplotním intervalu 20 až 24 °'C.
Ovulace se uskuteční 240 až 260 stupňohodin po podání poslední dávky. Pak se sexuální produkty vytřou během 40 až 60 minut.
Příklad 3
Vyvolané umělé množení okouna (Perca fluviatills L.)
Z populace se vyberou dospělé ryby a transportují do místa množení. Zralost sexuálních produktů se určí podle příkladu' 1, ale pohlaví se neoddělují. Ryby zralé pro ovulaci, včetně samců, se ošetří jednou dávkou 20 mikroigramů dekapeptidu vzorce II.
Ryby ještě nezralé pro ovulaci by měly být udržovány při teplotě přirozeného tření a výše uvedená sloučenina by měla být podána v dávkách po 2 mikrogramech alespoň 2X, ale nejvýše 10X, dokud se jádro vaječné 'buňky nedostane ze středu na obvod. Počet ošetření závisí na skutečném stavu zralosti sexuálních produktů ve srovnání se stavem „zralým pro ovulaci“. Proces zrání trvá alespoň 100 stupňodnů, v extrémních případech 400 stupňodnů při teplotě vody v intervalu 12 až 1'6 °C.
Tření se uskuteční 24 až 36 hodin po podání poslední dávky. Okoun se může snadno vytřít v nádržích, v takovémto případě není nutné vytření sexuálních produktů.
Příklad 4
Vyvolané umělé množení kranase (Trachurus trachurus L.)
Z kranasů živě chycených z Jadranu v listopadu se kusy o délce alespoň 240 mm transportují na místo množení (ryby o těchto rozměrech jsou již sexuálně dospělé). Do každé ryby se vstříkne sloučenina vzorce II v jedné dávce 10 mikrogramů. Ovula ce se uskuteční během 24 hodin ve vodě o teplotě 18 až 24 QC. Sexuální produkty se získají během 2 hodin.
IV případě kranase není určení stavu zralosti a pohlaví nutné, protože zralé ryby jsou к dispozici v prakticky neomezeném množství.
Příklad 5
Vyvolané umělé množení štiky (Esox lucius L.)
Sexuálně dospělé ryby se vyberou z populace a transportují na místo množení. Pohlaví se oddělí a určí se stav zralosti sexuálních produktů podle příkladu 1. Ryby zralé pro vytvoření ovulátu, včetně samců, se ošetří jednou dávkou 100 mikrogramů dekapeptidu vzorce II.
Ryby ještě nezralé pro ovulaci by měly být udržovány při teplotě přirozeného tření a výše uvedená sloučenina by měla být podána v dávkách po 5 mikrogramech alespoň 2X, ale nejvýše 10X, dokud se jádro vaječné buňky nepohne ze středu na obvod. Počet ošetření závisí na skutečném stavu zralosti sexuálních produktů ve srovnání se stavem „zralý pro ovulaci. Proces zrání trvá alespoň 70, v extrémních případech 350 stupňodnů při teplotě vody 8 až 14 °C.
Příklad 6
Vyvolané umělé množení tolstolobika (Hypophthalamichthys molitrix Val.)
Sexuálně dospělé ryby se vyberou ze zásoby a transportují na místo množení. Pohlaví se oddělí. Stupeň zralosti sexuálních produktů se určí podle příkladu 1 a ryby zralé pro ovulaci, včetně samců, se ošetří jednou dávkou 100 mikrogramů dekapeptidu vzorce III.
Ryby ještě nezralé pro ovulaci by měly být udržovány při 'teplotě přirozeného tření a výše uvedená sloučenina by měla být podána v dávkách po 10 mikrogramech alespoň 2X, ale nejvýše 10X, pokud jádro vaječné buňky se nedostane ze středu na obvod. Počet ošetření závisí na skutečném stavu zralosti sexuálních produktů ve srovnání se stavem „zralým pro ovulaci“. Tento proces zrání trvá alespoň 150, v extrémních případech 8'50 stupňodnů ve vodě v 'teplotním Intervalu 20 až 26 °C.
Ovulace se uskuteční 240 až 260 stupňohodin po podání poslední dávky. Pak se vytřou sexuální produkty.