SK9812001A3

SK9812001A3 - Macrolides with anti-inflammatory activity

Info

Publication number: SK9812001A3
Application number: SK981-2001A
Authority: SK
Inventors: Franco Pellacini; Daniela Botta; Stefano Romagnano; Ermanno Moriggi; Lorenzo Pradella
Original assignee: Zambon Spa
Priority date: 1999-01-15
Filing date: 2000-01-12
Publication date: 2002-01-07
Also published as: RU2243230C2; ES2251966T3; HU229228B1; IL144044A0; AU2663600A; HUP0105105A3; JP2002534531A; MXPA01007164A; CN1336932A; DE60023647T2; ZA200105748B; HUP0105105A2; WO2000042055A2; CN1151165C; EP1144427B1; DE60023647D1; ITMI990061A1; BR0007514A; AU769006B2; NO20013517L

Description

Vynález sa týka makrolidov s protizápalovým účinkom a konkrétnejšie sa týka derivátov des-dimetylaminomakrolidov s protizápalovým účinkom, ich farmaceutický prijateľných soli a farmaceutických prostriedkov, ktoré ich obsahujú ako aktívne prísady.

Doterajší stav techniky

Je známe, že mnohé antibiotiká, najmä skupina makrolidov so 14 atómami, odvodené od erytromycinu, vykazujú popri protibakteriálnej aktivite protizápalové vlastnosti [Clin.lmmunother. 6, 454-464, 1996].

Erytromycín je prírodný makrolid (The Merck Index, XII edition, n° 3720, strana 625), ktorý má veľmi široké klinické použitie v liečení infekcií, zapríčinených grampozitívnymi baktériami, niektorými gramnegatívnymi baktériami alebo mykoplazmou.

V súčasnosti sa záujem vedeckej obce zameral na protizápalovú a imunomodulačnú zložku erytromycinu a derivátov [Journal of Antimicrobial Chemotherapy 41, Suppl.B, 37-46, 1998],

Takáto aktivita je dobre zdokumentovaná klinickými štúdiami tak s in vivo, ako aj s in vitro pokusmi.

Napríklad sa ukázalo, že makrolidy sú účinné pri liečení zápalových ochorení, ako je panbronchiolitída [Thorax 52, 915-918, 1997], bronchiálna astma [Chest 99, 670-673, 1991] a cystická fibróza [The Lancet 351, 420, 1998] alebo u zvieracích modelov zápalov, ako je napríklad zymosanom indukovaná peritonitída u myší [Journal of Antimicrobial Chemotherapy 30, 339-348, 1992] a nárast neutrofilov, indukovaný endotoxínom u potkanej priedušky [Antimicrobial Agents and Chemotherapy 38, 1641-1643, 1994], alebo v in vitro štúdiách na bunkách imunitného systému, ako sú neutrofily [The Journal of Immunology 159, 3395-4005, 1997] a T-lymfocyty [Life Sciences 51, PL 231-236, 1992] alebo pri modulovaní

-2cytokínov, ako je interleukín 8 (IL-8) [Am. J. Respir. Crit. Čare Med. 156, 266-271, 1997] alebo interleukín 5 (IL-5) (EP 0 775 489 a EP 0 771 564, Taisho Pharmaceutical Co., Ltd).

Špecifická terapeutická účinnosť makrolidov u ochorení, pri ktorých sa bežné protizápalové liečivá, ako sú napríklad kortikosteroidy, ukazujú byť neúčinnými [Thorax 52, 915-918, 1997, už citovaný], opodstatňuje vysoký záujem o túto novú potenciálnu skupinu protizápalových látok.

Napriek tomu silná protibakteriálna aktivita bežných makrolidov neumožňuje rozšíriť ich použitie na liečenie chronických zápalových procesov, nezapríčinených patogénmi, pretože rýchlo narastajú rezistentné kmene.

Preto by bolo žiaduce mať nové látky s makrolidovou štruktúrou, ktoré vykazujú protizápalovú aktivitu, zatiaľ čo nemajú antibiotické vlastnosti.

Pre väčšiu názornosť ukazujeme vzorec erytromycínu, v ktorom je naznačené číslovanie, zavedené v prihláške tohto vynálezu.

Niektoré skupiny derivátov erytromycínu, ktoré majú vysokú protizápalovú aktivitu, sú opísané v literatúre.

Napríklad v už citovaných Európskych patentových prihláškach pod menom

Taisho sa nárokujú deriváty erytromycínu, modifikované v polohe 3, 9, 11 a 12, ako silné inhibítory syntézy IL-5.

-3/V-alkyl deriváty azitromycínu, bez kladinózy a desozamínu, všeobecného ···· • · ·· • · ·· • · ··· · • ·· ···· vzorca

v ktorom

R¹ je vodík, nižší alkyl alebo nižší alkanoyl; R², R³ a R⁴, rovnaké alebo odlišné, sú vodík alebo nižší alkanoyl; sú opísané ako protizápalové látky v EP 0 283 055 (Sour Pliva).

Použitie erytromycínu ako protizápalovej látky, ktorá pôsobí znižovaním uvoľňovania interleukínu 1 prostredníctvom inhibície cicavčieho mdr-P glykoproteínu, sa nárokuje vo WO 92/16226 pod menom Smith-Kline Beecham Corporation.

Medzi makrolidovými derivátmi, opísanými v literatúre, je niekoľko 3'-desdimetylamino-9-oxyiminoderivátov. Obmedzený záujem o túto skupinu zlúčenín je ospravedlniteľný skutočnosťou, že dôležitosť dimetylamínovej skupiny pre aktivitu ribozomálnej väzby, typickej pre makrolidy, je známa [Tetrahedron Letters 35, 38373840, 1994].

V US 3 928 387 (Hoffmann-La Roche Inc.) je opísaný 3'-ctes-dimetylaminoS'^'-dehydroerytromycínový A oxím ako medziprodukt, užitočný na prípravu antibiotika 1745A/X.

V EP 0 254 534 (Robinson, William S.) sa nárokuje široká skupina makrolidov s protivírusovou aktivitou. Medzi nimi je opísaná zlúčenina vzorca • · • · • · • · • · ·· ·· ·· • · · · • · · · • · • · ·· ·· • · • · • · • · ··

-4·· ··· ··

ktorej správny chemický názov je S'-des-dimetylamino-S'^'-dehydroerytromycín A 9-0-metyloxím, hoci v texte EP 0 254 534 sa chybne uvádza ako des-dimetylaminoerytromycín 9-O-metyloxím (strana 10, riadok 46).

Teraz sa zistilo, že odstránením dimetylaminoskupiny z 3' polohy desozamínu ¹9-oxyimino-makrolidov sa získajú zlúčeniny, ktoré vykazujú protizápalovú aktivitu a v podstate nemajú antibiotické vlastnosti.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu sú makrolidy všeobecného vzorca I

o (D ·· ·· • · · · · • · · ·

kde

R je vodík alebo metyl;

R¹ a R² sú oba vodík alebo sú spolu viazané väzbou;

R³ je vodík, nerozvetvená alebo rozvetvená C1-C5 alkylová skupina, benzylová skupina, voliteľne substituovaná jedným alebo viacerými substituentami, vybranými z nitroskupín, hydroxyskupín, karboxylových skupín, aminoskupín, nerozvetvených alebo rozvetvených C1-C5 alkylových skupín, C1-C4 alkoxykarbonylových skupín, aminokarbonylových skupín alebo kyanoskupín, alebo reťazec vzorca kde

A je vodík alebo fenylová skupina, voliteľne substituovaná jedným alebo dvoma substituentami, vybranými z nitroskupín, hydroxyskupín, karboxylových skupín, aminoskupín, nerozvetvených alebo rozvetvených C1-C5 alkylových skupín, C1-C4 alkoxykarbonylových skupín, aminokarbonylových skupín alebo kyanoskupín, alebo 5 alebo 6 článkový heterocyklus, nasýtený alebo nenasýtený, obsahujúci od 1 do 3 heteroatómov, vybraných z dusíka, kyslíka a síry, voliteľne substituované jedným alebo dvoma substituentami, vybranými z C1-C5 alkylových skupín, fenylových skupín, hydroxyskupín, oxo (=0) skupín, nitroskupín, C1-C4 alkoxykarbonylových skupín, aminokarbonylových skupín, mono alebo di-CrC₄ alkylaminokarbonylových skupín, C1-C4 alkylkarbonylových skupín;

X a Y, tie isté alebo rozličné, sú O, S, SO, S0₂ alebo NR⁴, v ktorom R⁴ je vodík, nerozvetvená alebo rozvetvená C1-C5 alkylová skupina, CrCs alkoxykarbonylová skupina, benzyloxykarbonylová skupina;

r je celé číslo od 1 do 6; m je celé číslo od 1 do 8; n je celé číslo od O do 2; a ich farmaceutický prijateľné soli;

s výnimkou zlúčenín S'-des-dimetylamino-S'.A'-dehydroerytromycín A oxím (R¹ a R²= väzba; R = H; R³ = H) a S'-des-dimetylamino-S'.A'-dehydroerytromycín A 9-0metyloxim (R¹ a R² = väzba; R = H; R³= CH3).

-6*··· • · ·· • · · ·* • · ···· • ·· ····

Ďalej vynález poskytuje použitie zlúčenín 3'-c/es-dimetylamino-3',4'-dehydroerytromycín A oxímu a S'-des-dimetylamino-S'^'-dehydroerytromycín A 9-O-metyloxímu ako protizápalových látok.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I sú protizápalové makrolidy, ktoré nemajú antibiotickú aktivitu, a preto sú užitočné pri liečení zápalových ochorení.

Pod výrazom nerozvetvené alebo rozvetvené C1-C5 alkylové skupiny sa rozumejú skupiny, vybrané z metylu, etylu, n-propylu, izopropylu, n-butylu, izobutylu, sec-butylu, ŕerc-butylu, n-pentylu a izopentylu.

Pod výrazom 5- alebo 6-členný heterocyklus, nasýtený alebo nenasýtený, obsahujúci od 1 do 3 heteroatómov, vybraných z dusíka, kyslíka a síry, sa rozumejú heterocykly, ako sú pyrol, tiofén, furán, imidazol, pyrazol, tiazol, izotiazol, izoxazol, oxazol, pyridín, pyrazín, pyrimidín, pyridazín, triazol, tiadiazol a ich čiastočne alebo úplne nasýtené formy.

Výhodnými zlúčeninami vzorca I sú zlúčeniny, v ktorých R, R¹ a R² sú vodík.

V tejto skupine sú zvlášť výhodné zlúčeniny, v ktorých R³ je reťazec vzorca kde

X, Y, A, r, m a n majú už uvedené významy.

Ešte výhodnejšími zlúčeninami sú zlúčeniny, v ktorých R³ je reťazec vzorca ^fcH^^X'(cH₂-)OfcH₂y_B ^A kde r je 2, m je 2 alebo 6, n je 1, Y je NR⁴, X je O alebo NR⁴, R⁴ je vodík a A je fenyl alebo tiazolyl.

Príkladmi farmaceutický prijateľných solí zlúčenín všeobecného vzorca I sú soli s organickými alebo anorganickými kyselinami, ako sú kyselina chlorovodíková, bromovodíková, jodovodíková, dusičná, sírová, fosforečná, octová, vínna, citrónová, benzoová, jantárová a glutarová.

··

-7• ·♦ ··- ·· · · 5Í · • · · ·· • · · · ·· • · · ·· ··· ···· *

Zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa tohto vynálezu, sa pripravujú podľa schémy syntézy, ktorá zahrnuje (a) odstránenie dimetylaminoskupiny v 3' polohe a (b) voliteľnou funkcionalizáciou oxímu.

Odstránenie dimetylaminoskupiny sa uskutoční oxidáciou, pyrolýzou a voliteľnou redukciou podľa známych spôsobov. Odborníkom v tejto oblasti je zrejmé, že ak sa chceme vyhnúť interakciám s funkčnými skupinami, ktoré sú voliteľne prítomné na R³ substituente, odstránenie dimetylaminoskupiny sa výhodne uskutoční tak, že vychádzame z medziproduktov všeobecného vzorca II

(II) v ktorom

R má už uvedený význam a R³' je vodík alebo nerozvetvené alebo rozvetvená C1-C5 alkylová skupina.

Oxidáciou sa získajú príslušné N-oxidy všeobecného vzorca III

(III)

-8v ktorom

R a R³' majú už uvedené významy;

ktoré pyrolýzou, po ktorej voliteľne nasleduje redukcia, poskytujú zlúčeniny vzorca

(l-A; R¹ a R²=väzba) (l-A; R¹=R²=H) podľa tohto vynálezu (l-R³=vodik alebo C1-C5 alkyl).

Podľa bežných metód sa zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorých R³ je iné než vodík, môžu pripraviť zo zlúčenín vzorca l-A a l-B, v ktorých R³' je vodík, funkcionalizáciou oxímu.

Vo všeobecnosti sa táto funkcionalizácia oxímu uskutoční reakciou so zlúčeninou všeobecného vzorca (IV)

R^3,l-W (IV) ···· • · ·· • · ·· • · ··· · • ·· ···· • ·· ·· · ·· · · · ··· • · · · ·· ······ · • · · · ·· ··· ·· ·· ···

-9v ktorom R³ má všetky významy R³ okrem vodíka a W je odstupujúca skupina, výhodne atóm chlóru alebo brómu alebo mesylová skupina.

Alternatívny spôsob syntézy, zvlášť vhodný na prípravu zlúčenín všeobecného vzorca I, v ktorých R³ je reťazec všeobecného vzorca v ktorom

X, Y, A, r, ma n majú už uvedené významy;

zahrnuje reakciu zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorom R³ je vodík, s medziproduktom všeobecného vzorca V

(V) v ktorom

X, Y, A, r, m a n majú už uvedené významy a Z znamená chrániacu skupinu; za vzniku medziproduktu všeobecného vzorca VI

(VI) v ktorom R, R¹, R², X, Y, A, r, m a n majú už uvedené významy;

ktorý po odstránení chrániacej skupiny Z reaguje s derivátom vzorca VII A-, y-W

w.

(VII) ·· • · ·· ·· • · · • · ·· • · ··· · • ·· • ·· •· · · • ·e ·· ·· ···· ··· v ktorom A, W a n majú už uvedené významy; za vzniku zlúčeniny všeobecného vzorca I.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorých Y je NR⁴, sa môžu pripraviť podľa vyššie uvedenej syntetickej cesty tiež s použitím aldehydu vzorca Vili

A-CHO (VIII) v ktorom A má už uvedený význam;

namiesto medziproduktu vzorca VII, po odstránení chrániacej skupiny Z z medziproduktu vzorca VI.

Naviac, zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorých R¹=R²=H, sa môžu pripraviť redukciou z príslušných zlúčenín všeobecného vzorca I, v ktorých R¹ a R² tvoria väzbu.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa tohto vynálezu, vykazujú protizápalovú aktivitu a nemajú antibiotickú aktivitu.

Farmakologická aktivita zlúčenín všeobecného vzorca I sa vyhodnotila in vitro a in vivo testami v porovnaní so známymi makrolidmi, ako sú erytromycín, klaritromycín a roxitromycín, ktoré vykazujú tak protizápalovú aktivitu, ako aj antibiotickú aktivitu.

Protizápalové aktivita sa vyhodnotila in vitro ako inhibícia uvoľňovania IL-8 a uvoľňovania superoxidového aniónu (príklad 11) a in vivo ako inhibícia LPS indukovanej neutrofílie po opakovaných podaniach (príklad 12).

Vo všetkých pokusoch sa zlúčeniny podľa vynálezu, ukázali byť veľmi aktívnymi protizápalovými látkami a protizápalové aktivita bola rovnaká alebo väčšia než protizápalové aktivita referenčných zlúčenín.

Na terapeutické použitie sa zlúčeniny všeobecného vzorca I môžu použiť vo farmaceutickej forme, ktorá je vhodná na orálne alebo parenterálne podanie.

Preto ďalej vynález poskytuje farmaceutické prostriedky, ktoré obsahujú terapeuticky aktívne množstvo zlúčeniny vzorca I alebo jej soli v zmesi s farmaceutický prijateľným nosičom.

V snahe lepšie ilustrovať tento vynález teraz uvádzame nasledujúce príklady.

·· ·· · ·· ·· · ···· ···· · · ·· ···· · · · · · · • · ··· · · · · · · * * ·· · ······ ·· 4· ··· ·· ·· ···

-11 Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava benzylesteru kyseliny [6-(2-hydroxyetylamino)hexyl]karbamidovej

Do roztoku benzylesteru kyseliny (6-hydroxyhexyl)karbamidovej (25 g; 99,47 mmol), pripraveného, ako je opísané vo WO 96/18633, v CH2CI2 (350 ml), ochladeného ľadom na asi 10 °C, sa najprv pridá roztok KBr (1,18 g; 9,94 mmol) vo vode (20 ml) a TEMPO (0,155 g; 0,994 mmol) a potom po kvapkách v priebehu asi 15 až 20 minút, pričom sa teplota udržiava pri 10 až 12 °C, roztok, pripravený s NaHCO3 (7,5 g; 89,28 mmol) a NaCIO (4,5% vodný roztok; 197 ml; 125 mmol).

minút po skončení prikvapkávania sa fázy oddelili a vodná fáza sa jedenkrát extrahovala CH2CI2 (100 ml). Zozbierané organické extrakty sa premyli dvakrát soľankou (20% NaCl) a sušili nad síranom sodným.

Do získaného roztoku (asi 800 ml) sa pridali 3 A molekulové sitá (30 g) a potom rýchlo po kvapkách a pri chladení vodou a ľadom roztok 2-aminoetanolu (35,9 ml; 0,597 mol) v etanole (600 ml).

Po skončení prikvapkávania sa zmes udržiavala za miešania pri teplote miestnosti 2 hodiny a potom sa prefiltrovala.

Do získaného roztoku sa po častiach pridal NaBH₄ (4,54 g; 120 mmol), roztok sa ochladil vodou a ľadom za miešania v atmosfére dusíka.

Na konci pridávania sa reakčná zmes udržiavala za miešania pri teplote miestnosti 2 hodiny a potom sa rozpúšťadlo odparilo.

Zvyšok sa zozbieral vodou a etylacetátom a fázy sa oddelili, vodná fáza sa znovu dvakrát extrahovala etylacetátom.

Zozbierané organické extrakty sa premyli soľankou (20% NaCl), sušili na sírane sodnom a skoncentrovali, aby sa získal olejovitý zvyšok, ktorý mal tendenciu tuhnúť.

Zvyšok sa trituroval hexánom, prefiltroval a premyl zmesou hexánu a etyléteru, za poskytnutia benzylesteru kyseliny [6-(2-hydroxyetylamino)hexyl]-karbamidovej (26,22 g; výťažok 89 %) ako bielu tuhú látku.

· ·· • · · · ···· • · ·· • · ·· •· ··· • ·· ···· ·· ·· ¹H-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 7,33 až 7,25 (m, 5H, Ar); 5,05 (s, 2H, COOCHz); 4,96 (široké t, 1H, NH); 3,63 až 3,58 (m, 2H, *CH₂-OH); 3,19 až 3,09 (m, 2H, CH2NCO); 2,72 až 2,67 (m, N-*CH₂-CH₂O); 2,59 až 2,52 (m, 4H, OH a CH₃); 1,53 až 1,23 (m, 8H, 4CH₂).

Príklad 2

Príprava benzylesteru kyseliny 6-(benzyloxykarbonylaminohexyl)-(2-hydroxyetyl)karbamidovej

Roztok benzylesteru benzylchlórmravčanu (50% v toluéne; 42,5 ml; 0,128 mol) v etylacetáte (85,5 ml) a 1N NaOH (128 ml; 0,128 mol) sa súčasne pridali po kvapkách do roztoku benzylesteru kyseliny [6-(2-hydroxyetylamino)hexyl]-karbamidovej (31,5 g; 0,107 mol), pripraveného, ako je opísané v príklade 1, v zmesi vody (87 ml), 1N NaOH (17 ml) a etylacetátu (180 ml), ochladenej na 0 až 5 °C, s kontrolovanou teplotou a pH (okolo 8).

Po skončení prikvapkávania sa zmes udržiavala za miešania 30 minút pri 0 až 5 °C, potom sa chladenie zrušilo a pridal sa ďalší 1N NaOH (15 ml), aby sa pH znovu nastavilo na 8, potom sa zmes nechala za miešania celú noc pri teplote miestnosti.

Fázy sa oddelili a vodná fáza sa ešte raz extrahovala etylacetátom. Zozbierané organické extrakty sa premyli soľankou, vysušili na sírane sodnom a skoncentrovali vo vákuu, aby sa získal olejový zvyšok.

Chromatografickým čistením (elučné činidlo etylacetátipetrolátum od 60:40 do 70:30) sa získal benzylester kyseliny 6-(benzyloxykarbonylaminohexyl)-2-hydroxyetylkarbamidovej (42,5 g; výťažok 92 %) ako olej.

¹H-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 7,39 až 7,25 (m, 10H, Ar); 5,10 a 5,07 (2s, 4H, 2COOCH₂); 3,71 (široký signál, 2H, *CH₂-OH); 3,43 až 3,01 (m, 4H, 2CH₂NCO); 1,57 až 1,19 (m, 8H, 4CH₂).

Podobným postupom sa získali nasledujúce zlúčeniny:

Benzylester kyseliny 2-(benzyloxykarbonylamino)etyl-2-hydroxyetylkarbamidovej, vychádza sa z 2-(2-aminoetylamino)etanolu.

(výťažok 32 %) ···· ··· ·· · • · ··· · ······ · ·· · · · · · · · ·· ·· ··· ·· ·· ···

-13¹H-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 7,33 až 7,28 (m, 10H, 2Ph); 5,06 a 5,04 (2s,

4H, 2CH₂-Ph); 3,73 až 3,34 (široké m, 8H, 4CH₂).

Benzylester kyseliny [2-(benzyl-benzyloxykarbonylamino)etyl]-2-hydroxyetylkarbamidovej, vychádza sa z 2-[2-(benzylamino)etylamino]etanolu, pripraveného, ako je opísané voWO 96/18633.

(výťažok 50 %) ¹H-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): (veľmi široké signály) 7,42 až 7,13 (m, 15H, 3Ar); 5,12 a 5,09 (2s, 4H, COOCH₂*); 4,55 (s, 2H, N-*CH₂-Ph).

Benzylester kyseliny 2-[2-(hydroxyetoxy)etyl]karbamidovej vychádza sa z 2-(2-aminoetoxy)etanolu.

(výťažok 85 %) ¹H-NMR (200 MHz, CDCI3) δ (ppm): 7,36 až 7,28 (m, 5H, Ar); 5,18 (široký signál, 1H, NH); 5,08 (s, 2H, Ph-*CHO); 3,74 až 3,34 (m, 8H, *CH₂-*CH₂-O-*CH₂-*CH₂OH); 2,13 (široké t, 1H, OH).

Príklad 3

Príprava 2-[benzyloxykarbonyl-(6-benzyloxykarbonylaminohexyl)amino]etylesteru kyseliny metánsulfónovej

Trietylamín (8,95 ml; 64,31 mmol) sa pridal do roztoku benzylesteru kyseliny 6-(benzyloxykarbonylaminohexyl)-2-hydroxyetylkarbamidovej (13,78 g; 32,15 mmol), pripraveného, ako je opísané v príklade 2, v CH₂CI₂ (140 ml). Zmes sa ochladila na 0 až 5 °C, a potom sa po kvapkách pridal roztok metánsulfonylchloridu (3,36 ml; 43,41 mmol) v CH2CI2 (20 ml).

Po skončení pridávania sa zmes udržiavala za miešania 60 minút, potom sa premyla 5% vodným roztokom kyseliny citrónovej, soľankou (20% NaCI), 5% vodným roztokom NaHCO3 a nakoniec znovu soľankou. Po sušení na sírane sodnom a odparení vo vákuu sa získal 2-[benzyloxykarbonyl-(6-benzyloxykarbonyl• · • · · · • · · ·· ··

-14···· • · ·· • · ·· • · ··· · • ·· ···· ·· ·· aminohexyl)amino]etylester kyseliny metánsulfónovej (16,37 g; výťažok 100 %) ako hnedý olej.

¹H-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 7,35 až 7,27 (m, 10H, Ar); 5,11 a 5.07 (2s, 4H, 2COOCH2); 4,36 až 4,19 (m, 2H, CH₂OSO₂); 3,57 až 3,51 (m, 2H, SO-CH₂-*CH₂N); 3,32 až 3,07 (m, 4H, 2CH₂N); 2,91 a 2,85 (2s-konforméry, 3H, CH₃); 1,50 až 1,20 (m, 8H, 4CH₂).

Podobným spôsobom sa získali nasledujúce zlúčeniny:

2-[2-(Benzyloxykarbonylamino)etoxy]etylester kyseliny metánsulfónovej, vychádzalo sa z benzylesteru kyseliny [2-(2-hydroxyetoxy)etyl]karbamidovej, pripraveného, ako je opísané v príklade 2.

(výťažok 98 %) ¹H-NMR (200 MHz, CDCI3) δ (ppm): 7,36 až 7,28 (m, 5H, Ar); 5,16 (široký signál, 1H, NH); 5.08 (s, 2H, COOCH₂); 4,34 až 4,30 (m, 2H, SO₃CH₂); 3,72 až 3,67 (m, 2H, SO₃-CH₂-*CH₂); 3,60 až 3,34 (m, 4H, N-*CH₂-*CH₂); 2,98 (s, 3H, SO3CH3).

2-[[2-Benzyl-(benzyloxykarbonylamino)etyl]benzyloxykarbonylamino]etylester kyseliny metánsulfónovej, vychádzalo sa z benzylesteru kyseliny 2-benzyl-(benzyloxykarbonylamino)etyl-2hydroxyetylkarbamidovej, pripraveného, ako je opísané v príklade 2.

(výťažok 72 %) ¹H-NMR (200 MHz, CDCI3) δ (ppm): 7,40 až 7,00 (m, 15H, 3Ar); 5,13 až 5,01 (široký signál, 4H, 2COOCH₂); 4,51 až 3,30 (široké m, 10H, 4CH₂N a CH₂SO3); 2,92 až 2,76 (široký signál, 3H, CH₃).

2-[Benzyloxykarbonyl-[2-(benzyloxykarbonylamino)etyl]amino]etylester kyseliny metánsulfónovej, vychádzalo sa z benzylesteru kyseliny 2-(benzyloxykarbonylamino)etyl-2-hydroxyetylkarbamidovej, pripraveného, ako je opísané v príklade 2.

(výťažok 100 %)

··	• ·	• · ·	• ·
• · • · • · • ·	• · • · ··· · •	·· · · • · · • · · • · ·	• · • · • · · • ·	•
··	··	··· ··	• ·	•

¹H-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 7,35 až 7,27 (m, 10H, 2Ar); 5,10 a 5,04 (2s, 4H, 2COOCH2); 4,41 až 4,15 (m, 2H, *CH₂-MeSO₂); 3,63 až 3,23 (m, 6H, N-*CH₂*CH₂-N-*CH₂); 2,90 (široké s, 3H, MeSO₂).

Príklad 4

Príprava N-oxidu erytromycín A oxímu

Roztok H₂O₂ (72 g; titer 34% (objem/hmotnosť); 0,72 mol) vo vode (780 ml) sa pridával 1 hodinu po kvapkách do roztoku erytromycín A oxímu (35,00 g; 0,0467 mol) v metanole (1400 ml) za mechanického miešania, udržiavajúc teplotu pri asi 20 až 25 °C. Po skončení pridávania sa reakčná zmes udržiavala za miešania 24 hodín pri teplote miestnosti. Po pridaní ďalšieho H₂O₂ (8 ml) sa zmes udržiavala za miešania ďalších 6 hodín.

Metanol sa odparil vo vákuu pri teplote okolo 40 °C, udržiavajúc objem vody konštantný (okolo 700 ml).

Po prefiltrovaní, premytí vodou a sušení sa získal erytromycín A oxím (36,3 g; výťažok 99 %) ako biela kryštalická látka.

¹H-NMR (200 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 10,71 až 10,19 (široký signál, 2H, posúvajúce sa H); 5,14 až 5.08 (m, 1H, H-13); 4,72 (d, 1H, Jhh=4,4 Hz, H-1); 4,45 (d, 1H,Jhh=7,0 Hz, H-ľ).

Príklad 5

Príprava S'-ďesídimetylaminoJ-S'^'-dehydroerytromycín A oxímu (zlúčenina 1)

Roztok N-oxidu erytromycín A oxímu (30,00 g; 38,3 mmol), pripraveného, ako je opísané v príklade 4, v dimetylformamide (235 ml) sa zahrial na 150 °C v predhriatom olejovom kúpeli (175 až 180 °C) a nechal sa pri tejto teplote 15 až 20 minút za mechanického miešania. Po ochladení a odparení dimetylformamidu sa olejovitý zvyšok zozbieral demineralizovanou vodou (500 ml), zahriatou a ochladenou. Prefiltrovaná tuhá látka sa triturovala a sušila vo vákuu pri 40 až 45 °C, čo poskytlo surový produkt (25,5 g).

-16···· • · ·· • · ·· • · ··· · • ·· ····

Surový produkt sa nechal najprv kryštalizovať z acetonitrilu (110 ml), prefiltroval sa, premyl vodou a sušil vo vákuu pri 50 °C, čím sa získal kryštalický produkt (20 g), ktorý znovu vykryštalizoval z metanolu/vody = 65/35 (400 ml), prefiltroval sa a sušil vo vákuu pri 40 až 50 °C.

Zlúčenina 1 (10,3 g; výťažok 38,2 %) sa tak získala ako kryštalický produkt.

Viac produktu (3,7 g) sa potom znovu získalo z kryštalizačnej kvapaliny s celkovým výťažkom 51,8 %.

¹H-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 5,67 až 5,55 (m, 2H, *CH=*CH); 4,44 (d, 1H, Jhh=7,0 Hz, H-ľ); 4,33 až 4,22 (m, 1H, H-5'); 4,13 až 4,04 (m, 1H, H-2'); 3,84 až 3,73 (m, 1H, H-8); 3,69 (s, 1H, H-11).

¹³C-NMR (200 MHz, CDCI3) δ (ppm): 171,11 (s, C-9); 132,2 a 126,1 (2s, C-3' a C4')·

Príklad 6

Príprava 3'-des(dimetylamino)erytromycín A oxímu (zlúčenina 2)

Oxid platiny (0,615 g) sa pridal pri teplote miestnosti do roztoku zlúčeniny 1 (20,0 g; 28,4 mmol), pripravenej, ako je opísané v príklade 5, v etanole (850 ml) (úplné rozpustenie sa dosiahlo po slabom zahriatí).

Zmes sa hydrogenizovala v Parrovom prístroji (0,1376 MPa (1,36 atm)) a absorpcia bola okamžitá.

Po odfiltrovaní katalyzátora a odparení rozpúšťadla vo vákuu sa biely kryštalický zvyšok trituroval petrolátom, prefiltroval a sušil vo vákuu pri 50 °C, aby sa získala zlúčenina 2 (19,8 g; výťažok 99 %).

¹H-NMR (200 MHz, CDCI3) δ (ppm): 5,05 až 4,98 (m, 1H, H-13); 4,94 (d, 1H, Jhh=4,4 Hz, H-1); 4,32 (d, 1H, J_Hh=7,4 Hz, H-ľ); 3,44 až 3,30 (m, 1H, H-2'); 2,07 až 1,21 (m, 2H, H-3'); 1,65 až 1,45 (m, 2H, H-4').

¹³C-NMR (200 MHz, CDCI3) δ (ppm): 171,2 (s, C-9); 104,7 (s, C-ľ); 31,8 (s, C-3');

29,5 (s, C-4').

Príklad 7

··	··	• ··	·· ·
•	•	• ·	·· · ·	« ·	··
•	•	• ·	• · ·	•	•
•	•	··· ·	• · ·	• · ·	•
•	•	•	• · ·	• ·	•
··	··	··· ··	··	···

Príprava 3'-des(dimetylamino)erytromycín A (E)-9-[O-[2-[benzyloxykarbonyl-6-(benzyloxy)karbonylaminohexylamino]etyl]oxím]u (zlúčenina 3)

Zlúčenina 2 (12,51 g; 17,73 mmol), pripravená, ako je opísané v príklade 6, sa pridala do 95% roztoku ŕerc-butylátu draselného (2,45 g; 19,48 mmol) v bezvodom THF (120 ml) za miešania a v dusíkovej atmosfére, udržiavajúc teplotu asi 25 °C.

Reakčná zmes sa nechala miešať 30 minút pri teplote miestnosti a potom sa pridal 18-crown-6-éter (4,69 g; 17,73 mmol) a roztok 2-[benzyloxykarbonyl-6-(benzyloxykarbonylaminohexyl)amino]etylesteru kyseliny metánsulfónovej (8,98 g; 17,73 mmol), pripraveného, ako je opísané v príklade 3, v bezvodom THF (60 ml) a nechala sa za miešania celú noc pri teplote miestnosti.

Po odparení rozpúšťadla vo vákuu sa zvyšok pridal do zmesi etylacetátu a soľanky (20% NaCI) a fázy sa oddelili. Vodná fáza sa znovu extrahovala etylacetátom. Zozbierané a vysušené organické extrakty sa skoncentrovali vo vákuu, aby sa získal surový produkt (23,4 g).

Chromatografickým čistením (elučné činidlo CH₂CI₂:CH₃OH = 97:3) sa získala stále slabo znečistená zlúčenina 3 (15,42 g), ktorá sa použila bez ďalších čistení.

¹H-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 7,35 až 7,28 (m, 10H, Ar); 5,14 až 5,06 (m, 1H, H-13); 5,11 a 5,07 (2s, 4H, 2COOCH₂); 4,84 (d, 1H, Jhh=4,4 Hz, H-1); 4,28 (d, 1H, Jhh=7,4 Hz, H-ľ).

Podobným spôsobom sa získali nasledujúce zlúčeniny:

S'-cfesíDimetylaminoJerytromycín A (E)-9-O-[2-[2-(benzyloxykarbonylamino)-etoxy]etyljoxím (zlúčenina 4), z [2-(2-benzyloxykarbonylamino)etoxy]etylesteru kyseliny metánsulfónovej.

(výťažok 62 %) ¹H-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 7,34 až 7,27 (m, 5H, Ar); 6,09 (široký signál,

1H, NH); 5,13 až 5.05 (m, 1H, H-13); 5,06 (s, 2H, COOCH₂); 4,79 (d, 1H, J_Hh=4,4

Hz, H-1); 4,26 (d, 1H, J_Hh=7,4 Hz, H-ľ).

·· ·· • · ·· • · ·· • · ··· · • ·· ·· ··

-18S'-desíDimetylaminoJerytromycín A (E)-9-[O-(2-metoxyetoxy)metyl]oxím (zlúčenina 5) z metoxyetoxymetylchloridu (výťažok 32,5 %) ¹H-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 5,21 až 5,12 (m, 2H, O-CH₂-O); 5,12 až 5,05 (m, 1H, H-13); 4,85 (d, 1H, Jhh=5,4 Hz, H-1); 4,39 (d, 1H, J_Hh=7,5 Hz, H-ľ); 3,40 (s, 3H, CH₂-O-*CH₃); 3,27 (s, 3H, H-3).

¹³C-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 172,5 (s, C-9); 97,44 (s, NO-C-O); 32,12 (s, C3'); 29,84 (s, C-4').

3'-des(Dimetylamino)erytromycín A (E)-9-O-[2-[2-benzyl(benzyloxykarbonylamino)etyl]benzyloxykarbonylamino]etyl]oxím (zlúčenina 12) z 2-[[2-benzyl(benzyloxykarbonylamino)etyl]benzyloxykarbonylamino]etylesteru kyseliny metánsulfónovej ¹H-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 7,40 až 7,16 (široké m, 15H, 3Ph); 5,17 až 5,00 (m, 5H, 2*CH₂-Ph a H-13).

3'-des(Dimetylamino)erytromycín A (E)-9-O-[2-[[2-(benzyloxykarbonylamino)etyl]benzyloxykarbonylaminojetyljoxím (zlúčenina 13) z 2-[benzyloxykarbonyl-2-(benzyloxykarbonylamino)etylamino]etylesteru kyseliny metánsulfónovej (výťažok 42 %) ¹H-NMR (200 MHz, CDCI3) δ (ppm): 7,38 až 7,25 (m, 10H, 2Ph); 5,11 a 5,05 (2s, 4H, 2COOCH₂); 5,14 až 5,00 (m, 1H, H-13); 4,89 až 4,79 (široké m, 1H, H-1); 2,26 (d, 1H, JHH=7,4 Hz, ΗΓ).

Príklad 8

Príprava 3'-des(dimetylamino)erytromycín A (E)-9-O-[2-[6-(aminohexyl)amino]-etyl]oxímu (zlúčenina 6)

10% Pd/C (1,6 g) sa pridalo do roztoku zlúčeniny 3 (15,42 g; 13,8 mmol), získanej, ako je opísané v príklade 7, v etanole (160 ml).

Zmes sa hydrogenizovala na Parrovom prístroji (1,02 atm). Po 2 hodinách sa odfiltroval katalyzátor a rozpúšťadlo sa odparilo.

·· •	• · • · ·	• ·· ·· ·	··	··
•	•	•
•
•	• ··· ·	• ·	• ·	•	•
B	• ·	• ·	•	•	•
··	• ·	··· ··		• ·		·· 1

Zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (elučné činidlo CH₂CI₂:CH₃OH:NH₃ = 85:15:1,5, potom 80:20:2), aby sa získala zlúčenina 6 (8,48 g) ako amorfná tuhá biela látka.

¹H-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 5,07 až 5,00 (m, 1H, H-13); 4,79 (d, 1H, Jhh=4,4 Hz, H-ľ'); 4,21 (d, 1H, J_HH=7,4 Hz, H-ľ).

¹³C-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 171,8 (s, C-9); 71,6 (s, =NO-C-O); 49,43 a 49,0 (2s, =N-O-C-*C-N-*C); 41,1 (s, C-NH₂).

Podobným spôsobom sa získali nasledujúce zlúčeniny:

3'-des(Dimetylamino)erytromycín A (E)-9-O-2-[2-(aminoetoxy)etyl]oxím (zlúčenina 7), vychádzajúc zo zlúčeniny 4 (výťažok 85 %) ¹H-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 5,12 až 5.05 (m, 1H, H-13); 4,83 (d, 1H, Jhh=4,4 Hz, H-1); 4,26 (d, 1H, J_HH=7,5 Hz, H-ľ).

S'-desíDimetylaminoJerytromycín A (E)-9-O-[2-[2-(benzylamino)etylamino]etyl]oxím (zlúčenina 14), vychádzajúc zo zlúčeniny 12 (výťažok 48 %) ¹H-NMR (200 MHz, CDCI3) δ (ppm): 7,32 až 7,17 (m, 5H, Ph); 5,08 až 5.00 (m, 1H, H-13); 4,74 (d, 1H, J_Hh=4,6 Hz, H-ľ'); 4,22 (d, 1H, J_Hh=7,4 Hz, H-ľ); AB systém: Va=3,80, Vb=3,76, Jab=13,7 Hz,*CH₂Ph.

¹³C-NMR (200 MHz, CDCI3) δ (ppm): 171,3 (s, C-9); 105 (s, C-ľ); 32,2 (s, C-3');

29,8 (s, C-4').

3'-des(Dimetylamino)erytromycín A (E)-9-O-[2-[2-(aminoetyl)amino]etyl]oxím (zlúčenina 15), vychádzajúc zo zlúčeniny 13 (výťažok 70 %) ¹H-NMR (200 MHz, CDCI3) δ (ppm): 5,08 až 5.00 (m, 1H, H-13); 4,76 (d, 1H, Jhh=4,6 Hz, H-1); 4,23 (d, 1H, J_HH=7,4 Hz, H-ľ).

Príklad 9 ·· ·· • · · · • · · · • · ··· e • · · ·· ·· • ·· ·· · ·· · · · ··· • · · · ·· ······ · • · · · ·· ··· ·· ·· ···

-20Príprava 3'-des(dimetylamino)erytromycín A (E)-9-O-[2-[6-(2-tiazolylmetyl)amino]etyl]oxímu (zlúčenina 8)

Suspenzia zlúčeniny 6 (3 g; 3,53 mmol), pripravenej, ako je opísané v príklade 8, 97% 2-tiazolkarbaldehyd (0,412 g; 3,53 mmol) a molekulové sitá (3 A,

6,75 g) v etanole (60 ml) sa nechali miešať 3 hodiny.

Po prefiltrovaní molekulových sít na celite sa pridalo 10 % Pd/C (0,3 g) a zmes sa hydrogenizovala v Parrovom hydrogenizátore (0,103 (1,02 atm)). Po 20 hodinách sa odfiltroval katalyzátor a rozpúšťadlo sa odparilo.

Chromatografickým čistením zvyšku (elučné činidlo CHCI₃:petrolátum: trietylamín = 90:10:10) sa získala zlúčenina 8 (1,66 g; výťažok 49,8 %) ako amorfná tuhá látka.

¹H-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 7,66 (d, 1H, Jhh=3,2 Hz, CHN); 7,22 (d, 1H, CHS); 5,08 až 5,02 (m, 1H, H-13); 4,78 (d, 1H, J_Hh=4,4 Hz, H-1); 4,21 (d, 1H, Jhh=7,4 Hz, H-ľ); 4,07 (s, 2H, *CH₂-tiaz).

¹³C-NMR (200 MHz, CDCh) δ (ppm): 172,0 (s, S-C=N); 171,7 (s, C-8); 142,4 (s, CHN); 118,7 (s, CHS); 104,9 (s, C-ľ); 96,3 (s, C-1); 71,7 (s, N-O-C).

Podobným spôsobom sa získali nasledujúce zlúčeniny:

3'-des(Dimetylamino)erytromycín A (E)-9-O-[2-[6-(benzylamino)hexylamino]-etyl]oxím (zlúčenina 9) zo zlúčeniny 6 a benzaldehydu ¹H-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 7,27 až 7,17 (m, 5H, Ar); 5,07 až 5,01 (m, 1H, H-13); 4,75 (d, 1H, J_HH=4,4 Hz, H-1); 4,19 (d, 1H, J_HH=7,4 Hz, H-ľ); 3,73 (s, 2H, *CH₂-Ph).

¹³C-NMR (200 MHz, CDCh) δ (ppm): 171,8 (s, C-9); 104,9 (s, C-ľ); 96,3 (s, C-1);

71,8 (s, =N-O-C); 53,8 (s, N-*C-Ph); 49,7, 49,2 a 49,1 (3s, 3N-C).

3'-des(Dimetylamino)erytromycín A (E)-9-O-[2-[2-(2-tiazolylmetylamino)etoxy]-etyl]oxím (zlúčenina 10) zo zlúčeniny 7 a 2-tiazolkarbaldehydu ¹H-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 7,64 (d, 1H, J_Hh=3,2 Hz, CHN); 7,19 (d, 1H,

CHS); 5,10 až 5,02 (m, 1H, H-13); 4,78 (d, 1H, J_Hh=4,4 Hz, H-1); 4,21 (d, 1H,

Jhh=7,4 Hz, H-ľ); 4,13 (s, 2Η, *CH₂-tiaz).

···· e · e ·· • · ·· • · ··· · • ·· ·· ··· ···· · • · · ··· • · · ·· • · · · ·· • · · ·· • ·· ·····

-21 ¹³C-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 172,7 (s, SC=N); 171,5 (s, C-9); 142,4 (s, CHN'); 118,6 (s, CHS); 104,7 (s, C-ľ); 96,4 (s, C-1); 50,7 (s, N-*CH₂-tiaz).

3'-des(Dimetylamino)erytromycín A (E)-9-O-[2-[2-(benzylamino)etoxy]etyl]oxím (zlúčenina 11) zo zlúčeniny 7 a benzaldehydu ¹H-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 7,33 až 7,10 (m, 5H, Ar); 5,12 až 5,04 (m, 1H, H-13); 4,78 (d, 1H, J_Hh=4,4 Hz, H-1); 4,72 (d, 1H, J_Hh=7,4 Hz, H-ľ); 3,80 (s, 2H, NCH₂).

¹³C-NMR (200 MHz, CDCI3) δ (ppm): 171,5 (s, C-9); 104,8 (s, C-ľ); 96,5 (s, C-ľ’);

69,4, 70,8 a 72,4 (3s, 3OCH₂); 53,6 (s, *C-Ph); 48,2 (s, O-C-*C-N).

3'-des(Dimetylamino)erytromycín A (E)-9-O-[2-[2-(2-tiazolylmetylamino)etylamino]etyljoxím (zlúčenina 16) zo zlúčeniny 15 a 2-tiazolkarbaldehydu ¹H-NMR (200 MHz, CDCI3) δ (ppm): 7,62 (d, 1H, Jhh=3,0 Hz, N-*CH=CH); 7,18 (d, 1H, S-*CH=CH); 4,18 (d, 1H, Jhh=7,4 Hz, H-ľ).

¹³C-NMR (200 MHz, CDCI3) δ (ppm): 172,6 (s, SC=N); 171,3 (s, C-9); 142,4 (s, CHN); 118,6 (s, CHS); 104,9 (s, C-ľ); 96,4 (s, C-ľ'); 32,1 (s, C-3'); 29,9 (s, C-4').

3'-des(Dimetylamino)erytromycín A (E)-9-O-[2-[6-(2-fenyl-1 Η-4-imidazolylmetylamino)-hexylamino]etyl]oxím (zlúčenina 17) zo zlúčeniny 6 a 2-fenyl-1H-4-imidazolylkarbaldehydu ¹H-NMR (200 MHz, CDCI3) δ (ppm): 7,86 až 7,21 (m, 5H, Ar); 6,91 (s, 1H, CHImid.); 5,11 až 5,02 (m, 1H, H-13); 4,76 (d, 1H, J_Hh=4,2 Hz, H-1); 4,21 (d, 1H, Jhh=7,4 Hz, H-ľ); 3,76 (s, 2H, *CH₂-lmid.); 3,23 (s, 3H, OMe).

¹³C-NMR (200 MHz, CDCI3) δ (ppm): 171,7 (s, C-9); 104,8 (s, C-ľ); 96,3 (s, C-ľ');

32,1 (s, C-3'); 29,9 (s, C-4').

3'-des(Dimetylamino)erytromycín A (E)-9-O-[2-[6-(1-metyl-2-fenyl-1 Η-4-imidazolylmetylamino)hexylamino]etyl]oxím (zlúčenina 18) zo zlúčeniny 6 a 1-metyl-2-fenyl1 /-/-4-imidazolylkarbaldehydu

• · •	·· • · ·	• ··	··	• ··
·· ·	•	•	•
•
•	• ··· ·	• ·	• ·	•	•	•
•	• ·	• ·	•	•	•	•
··	··	···	··		··	• · ·

¹H-NMR (200 MHz, CDCI₃) δ (ppm): 7,57 až 7,31 (m, 5H, Ar); 6,87 (s, 1H, CHImid.); 5,09 až 5,00 (m, 1H, H-13); 4,76 (d, 1H, Jhh=4,2 Hz, H-1); 4,20 (d, 1H,

Jhh=7,4 Hz, H-ľ); 3,71 (s, 2H, *CH₂-lmid.); 3,62 (s, 3H, NMe); 3,21 (s, 3H, OMe).

¹³C-NMR (200 MHz, CDCI3) δ (ppm): 171,8 (s, C-9); 104,9 (s, C-ľ); 96,3 (s, C-T);

32,1 (s, C-3'); 29,7 (s, C-4').

Príklad 10 Príprava 3'-des(dimetylamino)erytromycín A (E)-9-O-[2-[2-(2-tiazolylmetylmetylamino)etoxy]etyl]oxímu (zlúčenina 19)

Zlúčenina 10 (0,23 g; 0,258 mmol), formaldehyd (37% (objem/hmotnosť); 42 μΙ; 0,516 mmol), 10% Pd na drevenom uhlí (25 mg) a 4:1 zmes etanolu a vody (10 ml) sa vložili do Parrovho prístroja pri 0,103 MPa (1,02 atm). Po 2 a 3 hodinách sa pridal ďalší formaldehyd (42 μΙ + 21 μΙ). Po skončení reakcie (celkove 6 hodín) sa odfiltroval katalyzátor a rozpúšťadlo sa odparilo. Výsledný zvyšok sa čistil rýchlou chromatografiou (elučné činidlo CH₂CI₂:CH₃OH = 95:5), aby sa získala zlúčenina 19 ako amorfná tuhá látka.

¹H-NMR (200 MHz, CDCI3) δ (ppm): 7,64 (d, 1H, J_Hh=3,6 Hz, N-*CH=CH); 7,21 (d, 1H, S-*CH=CH); 5,10 až 5,00 (m, 1H, H-13); 4,80 (d, 1H, Jhh=4,6 Hz, H-1); 4,23 (d, 1H, J_Hh=7,4 Hz, H-ľ); 3,94 (s, 2H, *CH₂-tiaz).

¹³C-NMR (200 MHz, CDCI3) δ (ppm): 172,0 (s, SC=N); 171,8 (s, C-9); 142,2 (s, CHN); 119,3 (s, CHS); 104,9 (s, C-ľ); 96,4 (s, C-1); 32,2 (s, C-3'); 29,9 (s, C-4').

Príklad 11

In vitro farmakologická aktivita

A) Uvoľňovanie interleukínu 8 (IL-8)

Línia usmrtených ľudských endotelových buniek (ECV304) sa získala z ATTC (Rockville, Md) a rástla v Médiu 199, mod. Earlove soli (GIBCO, Life Technologies,

Grand Island, N.Y.), doplnená 20% fetálnym teľacím sérom (GIBCO), 100 U/ml

-23penicilínu a 100 pg/ml streptomycínu (SIGMA, St.Louis, MO) vo vlhkej atmosfére s 5% CO₂ pri 37 °C.

Bunky sa kultivovali na 96-miskových platniach, aby sa získala jedna splývajúca monovrstva.

Zlúčeniny, ktoré sa mali vyhodnotiť, sa rozpustili v DMSO pri 10'²M a zriedili živným médiom.

Zlúčeniny sa predinkubovall s bunkami 1 hodinu pred vyvolaním odozvy.

Uvoľňovanie IL-8 sa indukovalo pridaním 0,66 pg/ml lipopolysacharidu B (E. coli 055:B5, Difco, Detroit, Mi) v konečnom objeme 200 μΙ.

Po jednej noci sa supernatant zozbieral pre IL-8 test.

Špecifická imunoreaktivita IL-8 v supernatante kultúry sa stanovila ELISA súpravou (Amersham, UK).

Výsledky sa vyjadrili ako najvyššia možná inhibícia (účinnosť) a, ak je to možné, ako koncentrácia, pri ktorej sa získa 50 % takého účinku (IC50).

B) Uvoľnenie superoxidových aniónov

Neutrofily sa oddelili od venóznej krvi zdravých dobrovoľníkov centrifugáciou na Ficoll-Hypague, po ktorej nasledovala sedimentácia na 6% dextráne a osmotická lýza erytrocytov. Neutrofily sa potom premyli a resuspendovali v médiu, vyrobenom z RPMI-1640, doplneného 5% fetálnym teľacím sérom a 1,34 mmol/l dihydrátu disodnej soli EDTA. Bunky sa udržiavali 24 hodín pri 4 °C a pred testom sa suspenzia centrifúgovala a resuspendovala v HBSS (roztok Hankovej rovnovážnej soli). Vitalita a čistota neutrofllového preparátu sa zistila zafarbením trypánovou modrou a tureckou modrou.

Superoxidové anióny sa stanovili chemiluminiscenčnou metódou, zlepšenou použitím lucigenínu (b/s-N-metylakridínnitrát).

Neutrofily (2 x 10⁶ buniek/ml) sa predinkubovall 30 minút pri 37 °C v 900 μΙ HBSS s testovanou zlúčeninou a bez nej (čítací systém).

Tvorba superoxidových aniónov sa stanovila Lumac/3M biočítačom po pridaní 100 μΙ roztoku lucigenínu (2 mmol/l) v HBSS a /V-formyl-L-metionyl-L-leucyl-24-

··	··	• ··	·· ·
• ·	• ·	·· · ·	• ·	··
•	•	• ·	• · ·	• ·	•
•	•	··· B	• · ·	• · ·	•
• ·	•	• · ·	• ·	•
·»	··	··· ··	··	···

L-fenylalanínu (FLMP) ako stimulačného činidla s koncentráciou 1 x 10'⁵ M do čítacieho systému.

FLMP sa rozpustil v DMSO (1 x 10'² M) a ďalej sa zriedil v HBSS. Zlúčenina, ktorá sa mala testovať, sa rozpustila v DMSO s koncentráciou 10'² M. Nižšie koncentrácie v DMSO sa pripravili z tohto roztoku a testovali sa. Množstvo DMSO, prítomné v čítacom systéme, bolo nižšie než 1 %.

Hodnoty jasnosti, získané v maxime pre každú testovanú koncentráciu zlúčeniny, sa previedli na percento inhibície v porovnaní so štandardom.

Koncentrácia, schopná inhibovať tvorbu superoxidového aniónu pri 50% (IC₅o), sa vypočítala zo získanej krivky odpovede na dávku.

V nasledujúcej tabuľke sú uvedené výsledky, získané pre niektoré zlúčeniny všeobecného vzorca I, ktoré reprezentujú celú skupinu v porovnaní serytromycínom, klaritromycínom a roxitromycínom.

Tabuľka 1

In vitro inhibícia uvoľňovania IL-8, vyjadrená ako schopnosť (IC50) a ako účinnosť (%) a uvoľňovanie superoxidového aniónu (IC50).

Zlúčenina	uvoľňovanie IL-8	uvoľňovanie O₂'
schopnosť IC50 μΜ	účinnosť (%)	IC50 μΜ
1	-	29	35,3 ± 5,4
2	-	29	11,4 ±2,9
5	12	55 ± 0,9	>100
6	7,7 ±0,3	37 ±10	9,9 ± 0,69
8	-	19 ± 1	3,5 ± 0,2
9	-	-	3,5 ±0,5
11	-	22 ±4	5
16	-	35	14,3
klaritromycín	8,9 ±3,2	48 ±6	49,2 ±1,9
erytromycín	-	27 ± 1	>100
roxitromycín	5,5 ±1,5	43 ±6	89 ±5

··

-25··

Príklad 12

In vivo farmakologická aktivita

Zvieratá

Použili sa samce Sprague-Dawley potkanov s hmotnosťou medzi 200 a 300 g.

Potkany, ktoré sa použili v tomto pokuse, neboli viditeľne infikované. Zvieratá sa udržiavali v štandardných podmienkach 7 dní pred utratením.

Podanie endotoxínu

LPS (E. coli lipopolysacharid) (endotoxín; 055:B5 typ séra; Sigma Chemical Co., St.Louis, MO) sa rozpustil v sterilnom soľnom roztoku a podal sa intraperitoneálnou injekciou (i.p.) v dávke 6 mg/kg (1 ml/kg). Rovnako sa do kontrolných zvierat injekčné podal soľný roztok a/alebo nosič (soľný roztok + 0,5 % Tween 20).

Podanie zlúčeniny (profylaktické liečenie)

Každá zlúčenina sa podávala i.p. injekciou dvakrát denne 6 dní, 7. deň 1 hodinu pred a 5 hodín po podaní LPS. Zlúčeniny sa suspendovali s 0,5 % Tween 20 v soľnom roztoku.

Bronchoalveolárna laváž

Po 24 hodinách od podania injekcie LPS sa potkany utratili ukončovacou dávkou nembutalu (100 mg/kg i.p.). Do priedušky sa zaviedla kanyla a pľúca sa premyli zavedením dvoch 5 ml alikvotov PBS (fosfátový pufrovací soľný roztok) pri 37 °C a kvapalina sa okamžite odstránila. Kvapalina sa znovu vstrekla a postup sa celkove opakoval trikrát pre každý alikvot.

Počítanie a diferenciácia buniek

200 μΙ BALF (bronchoalveolárna lavážna kvapalina) sa rozpustilo v 1 ml studenej vody a 19 ml Isotonu. Celkové množstvo buniek sa počítalo dvakrát s použitím prístroja Contraves autolyzer 800. Keď bolo celkové množstvo buniek menšie než 2000, BALF-y sa 10 minút centrifúgovali pri 800 ot./min., aby sa bunky ·· ·· · ·· ·· ···· ···· ··· ···· ··· ·· • · ··· · ······ ·· · ····· ·· ·· ··· ·· ·· ·

-26oddelili od supernatantu. Supernatanty sa odstránili a bunky sa resuspendovali v malom množstve PBS. Pre cytologické vyhodnotenie sa 50 μΙ roztoku s resuspendovanými bunkami centrifúgovalo 1 minútu pri 1300 ot./min. s použitím Shandon Cytospin centrifúgy. Sklíčka sa fixovali v acetóne a zafarbili DiffQuick-om. Diferenciálne sčítania buniek sa uskutočnili na každom sklíčku náhodným spočítaním 200 buniek; bunkové typy sa klasifikovali podľa štandardných morfologických kritérií ako neutrofily, eozinofily mononukleárne bunky.

V nasledujúcej tabuľke sú uvedené výsledky, získané s niektorými zlúčeninami vzorca I, ktoré reprezentujú celú skupinu.

Tabuľka 2

In vivo inhibícia neutrofílie, indukovanej LPS po opakovaných podaniach

Zlúčenina	Inhibícia (%)
2	-31
6	-11
9	-96
erytromycín	-46
klaritromycín	-47
roxitromycín	-50

Claims

1. Makrolidy všeobecného vzorca I

·· ·· • · • · • • · • · • · ··· · • · • • · ·· •

·· ·· · • · · · ·· • · · · · • · · · · · • · · · · • ·· ·· ··· kde

R je vodík alebo metyl;

R¹ a R² sú oba vodík alebo spolu tvoria väzbu;

R³ je vodík, nerozvetvené alebo rozvetvená C1-C5 alkylová skupina, benzylová skupina, voliteľne substituovaná jedným alebo viacerými substituentami, vybranými z nitroskupín, hydroxyskupín, karboxylových skupín, aminoskupín, nerozvetvených alebo rozvetvených C1-C5 alkylových skupín, C1-C4 alkoxykarbonylových skupín, aminokarbonylových skupín alebo kyanoskupín, alebo reťazec všeobecného vzorca kde

A je vodík alebo fenylová skupina, voliteľne substituovaná jedným alebo dvoma substituentami, vybranými z nitroskupín, hydroxyskupín, karboxylových skupín, aminoskupín, nerozvetvených alebo rozvetvených C1-C5 alkylových skupín, C1-C4 alkoxykarbonylových skupín, aminokarbonylových skupín alebo kyanoskupín, alebo

5- alebo 6-členný heterocyklus, nasýtený alebo nenasýtený, obsahujúci od 1 do 3 heteroatómov, vybraných z dusíka, kyslíka a síry, voliteľne substituovaný jedným alebo dvoma substituentami, vybranými z C1-C5 alkylových skupín, fenylových

·· • · • ·· ·· · • • · · ·· · • • · • · • • • ··· · • · • · • · • • • · • · • • · • ·· • · ··· ·· ·· ···

skupín, hydroxyskupín, oxo (=0) skupín, nitroskupín, C1-C4 alkoxykarbonylových skupín, aminokarbonylových skupín, mono- alebo di-Ci-C4 alkylaminokarbonylových skupín, C1-C4 alkylkarbonylových skupín;

X a Y, tie isté alebo rozličné, sú O, S, SO, SO2 alebo NR⁴, v ktorom R⁴ je vodík, nerozvetvené alebo rozvetvená C1-C5 alkylová skupina, C1-C5 alkoxykarbonylová skupina, benzyloxykarbonylová skupina;

r je celé číslo od 1 do 6;

m je celé číslo od 1 do 8;

n je celé číslo od O do 2;

a ich farmaceutický prijateľné soli;

s výnimkou zlúčenín S'-des-dimetylamino-S'A-dehydroerytromycín A oximu a 3'des-dimetylamino-S'^'-dehydroerytromycín A 9-O-metyloxímu.

2. Makrolidy podľa nároku 1, kde R, R¹ a R² sú vodík.

3. Makrolidy podľa nároku 2, kde R³ je reťazec všeobecného vzorca kde

X, Y, A, r, m a n sú určené v nároku 1.

4. Makrolidy podľa nároku 2, kde R³ je reťazec všeobecného vzorca kde r je 2, m je 2 alebo 6, n je 1, Y je NR⁴, X je O alebo NR⁴, R⁴ je vodík a A je fenyl alebo tiazolyl.

·· ·· • ·· ·· • · • · ·· · · • • t e • · • · • · · • · Φ · ··· · • · · • · • • · • • · · • • ·· ·· ··· ·· ·· ···

5. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje farmaceutický účinné množstvo makrolidu podľa nároku 1 v zmesi s farmaceutický prijateľným nosičom.

6. Použitie S'-des-dimetylamino-S'^'-dehydroerytromycín A oxímu a 3'-desdimetylamino-S'^'-dehydroerytromycín A 9-0-metyloxímu na výrobu lieku s protizápalovou aktivitou.