SK412004A3 - Metabolic controlled fermentation process for pseudomonic acid production - Google Patents

Metabolic controlled fermentation process for pseudomonic acid production Download PDF

Info

Publication number
SK412004A3
SK412004A3 SK41-2004A SK412004A SK412004A3 SK 412004 A3 SK412004 A3 SK 412004A3 SK 412004 A SK412004 A SK 412004A SK 412004 A3 SK412004 A3 SK 412004A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
fermentation
acid
pseudomonic acid
medium
pseudomonic
Prior art date
Application number
SK41-2004A
Other languages
English (en)
Inventor
Eva Gulyas
Gabor Balogh
Janos Erdei
Peter Seress
Original Assignee
Biogal Gyogyszergyar
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biogal Gyogyszergyar filed Critical Biogal Gyogyszergyar
Publication of SK412004A3 publication Critical patent/SK412004A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/162—Heterorings having oxygen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. Lasalocid

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Oblasť techniky
Predkládaný vynález sa týka metabolický riadeného spôsobu fermentácie na výrobu pseudomónovej kyseliny. Konkrétne sa predkladaný vynález týka spôsobu fermentácie na výrobu pseudomónovej kyseliny A reguláciou hodnoty pH fermentačného kultivačného média prostredníctvom toho, že sa do média pridáva dextróza, minerálna sol, ako je napríklad chlorid vápenatý, kyslý roztok alebo alkalický roztok.
Doterajší stav techniky
Pseudomónová kyselina A, titež známa ako mupirocín, predstavuje hlavnú zložku pseudomónovej kyseliny. Pseudomónová kyselina A bola prvý krát objavená autormi A. T. Fuller et al. v roku 1971 [Náture, 234, 416, 1971] .
Pseudomónová kyselina A má nasledujúci chemický názov a obchodné názvy: [2S-[2~alpha (E), 3-bleta, 4-bleta, 5-alpha [2R*, 3R* (ÍR*,2R*)]]]-9-[[3-metyl-l-oxo-4-[tetrahydro-3,4dihydroxy-5-[[3-(2-hydroxy-1-metylpropyl)oxiranyl]metyl]2H-pyrán-2-yl]-2-butenyl]oxy]nonánová kyselina, pseudomónová kyselina A, trans-pseudomónová kyselina, BRL-491OA, Bactoderm, Bactroban a Turixin. Pseudomónová kyselina má topickú antibakteriálnu terapeutickú aktivitu.
Pseudomónová kyselina A (Mupirocín)
Pseudomónová kyselina A je silné antibiotikum proti Gram(+) baktériám (Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae) a niektorým Gram(-) baktériám (ffaemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae) [A. Ward, D. M. Campoli-Richards: Drugs, 32, 425-444, 1986]. Má sa zato, že mechanizmus pôsobenia zahrnuje inhibíciu enzýmu izoleucín-tRNA syntézy, ktorý ovplyvňuje syntézu peptidov v baktériách [J. Hughes a G.Mellows: Biochem. Journal, 191, 209-219, 1980]. Popisy z uvedených literárnych odkazov sú v plnom znení zahrnuté formou odkazu.
V súčasnosti je pseudomónová kyselina vyrábaná kultiváciou Pseudomonas sp. Obvyklý dávkovací systém používajúci tzv. „fed-batch technológiu zahrnuje zásobovanie živinami na začiatku spôsobu fermentácie bez regulácie pH a koncentrácie živín. V dôsledku fluktuácie hladiny pH a deplecie (spotrebovania) živín počas spôsobu fermentácie „fed-batch, výťažok pseudomónovej kyseliny je často znížený. Súčasné zvýšenie množstva prímesi často predstavuje hlavnú nevýhodu technológie.
nežiadúcich „fed-batch
Existuje trvalá potreba zlepšiť spôsob fermentácie na prípravu pseudomónovej kyseliny, obzvlášť zvýšiť stupeň čistoty produktu pseudomónovej kyseliny A (napr. podstatne znížiť nežiadúcu prímes pseudomónovej kyseliny B).
Podstata vynálezu
Podľa jedného aspektu predkladaný vynález poskytuje zlepšený spôsob výroby pseudomónovej kyseliny obsahujúci kroky:
a) prípravy fermentačného média obsahujúceho mikroorganizmus produkujúci pseudomónovú kyselinu,
b) regulácie pH fermentačného média a
c) získania pseudomonóvej kyseliny z fermentačného média.
Podlá ďalšieho aspektu predkládaný vynález poskytuje účinný spôsob výroby pseudomónovej kyseliny, ktorá dosahuje vysoký stupeň čistoty (t.j. pomer nežiadúcej prímesi pseudomónovej kyseliny B k pseudomónovej kyseline A je menší ako 3 %) . Predkladaný vynález teda poskytuje zlepšený a ekonomický spôsob fermentácie na výrobu zvýšeného výťažku vysoko purifikovanej pseudomónovej kyseliny A.
Podlá ďalšieho aspektu predkladaný vynález poskytuje spôsob fermentácie na výrobu pseudomónovej kyseliny s použitím kmeňa Pseudomonas sp. Deponovaného pod číslom kódu NCAIM (P)B 001235 v National Collection of the Agricultural and Industrial Micro-organisms.
Podlá ďalšieho aspektu predkladaný vynález poskytuje spôsob fermentácie, pričom pH fermentačného kultivačného média je upravené tak, aby bolo približne 5,5 až 6,0 v priebehu fermentácie. Najvýhodnejšie je pH fermentačného média regulované na približne 5,7.
Podlá ďalšieho aspektu predkladaný vynález poskytuje spôsob fermentácie na výrobu pseudomónovej kyseliny, kde pH je regulované zásobovaním fermentačného kultivačného média zdrojom asimilovatelného uhlíka. Výhodne je zdroj asimilovatelného uhlíka dextróza.
Podlá ďalšieho aspektu predkladaný vynález poskytuje spôsob fermentácie na výrobu pseudomónovej kyseliny, kde dextróza je udržiavaná v hladine menšia ako približne 0,5 % vo fermentačnom médiu počas produkčnej fázy.
Podlá ďalšieho aspektu predkladaný vynález poskytuje spôsob fermentácie na výrobu pseudomónovej kyseliny, kde fermentačná kultúra je zásobovaná roztokom obsahujúcim aspoň 0,1% chloridu vápenatého (CaCl2) počas produkčnej fázy fermentácie.
Podlá ďalšieho aspektu predkladaný vynález poskytuje spôsob fermentácie na výrobu pseudomónovej kyseliny, kde pH fermentačného kultivačného média je regulované zásobováním fermentačného média alkalickým roztokom a/alebo kyslým roztokom.
Podľa ďalšieho aspektu predkladaný vynález poskytuje spôsob fermentácie na optimálnu kombináciu zásobovania dextrózou a kyslým roztokom. Predkladaný vynález poskytuje optimálnu kombináciu zásobovania dextrózou a kyselinou, ktorá môže stimulovať biosyntézu pseudomónovej kyseliny počas fermentácie a zabrániť represívnemu účinku nadzvyšku zdroja uhlíka v médiu.
Podrobný popis vynálezu
Ak nie je uvedené inak, termín % sa týka % hmotnostného (hmotnosť/hmotnosť), termín vvm označuje „objem vzduchu/objem fermentačného média/minúta, HPLC sa týka vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie. Termín dextróza sa tiež týka glukózy.
Ako sa v tomto texte používa, termín submerzná kultúra sa týka fermentačnej kultúry, ktorá je tekutá kultúra s miešaním a prevzdušňovaním, termín fed-batch technológia sa týka spôsobu fermentácie, kde jedna alebo viac zložiek živín (napr. zdroj uhlíka alebo soľ) sú dodané ako zásoba iba na začiatku fermentačného procesu, metabolický riadená fermentácia sa týka spôsobu fermentácie, počas ktorého je regulovaná spotreba zdroja uhlíka alebo dusíka, produkčná fáza sa týka obdobia fermentácie, počas ktorého sú biosyntetizované požadované molekuly a logaritmická fáza sa týka obdobia fermentácie, počas ktorého sa mikroorganizmus množí logaritmickým spôsobom.
Ako sa v tomto texte používa, termín minerálna sol sa týka soli biologicky dôležitého prvku a stopového prvku. Výhodne je síran horečnatý používaný ako minerálna soľ, ktorá slúži na reguláciu pH a má niektoré ďalšie prídavné účinky. Najvýhodnejšie je ako minerálna soľ použitý chlorid vápenatý.
Ako sa v tomto texte používa, termín asimilovatelný sa týka daného mikroorganizmu, ktorý má enzýmový systém pre absorpciu živín a spotrebu alebo použitie alebo rozloženie takých živín na použitie v biosyntéze komplexných zložiek mikroorganizmu.
Výhodný mikroorganizmus produkujúci pseudomonovú kyselinu na uskutočňovanie spôsobu fermentácie podľa vynálezu je kmeň Pseudomonas sp. Iné mikroorganizmy produkujúce pseudomonovú kyselinu zahrnujú Pseudomonas sp. Progenies, jej prírodné varianty a mutanty. Najvýhodnejšie je použitý kmeň Pseudomonas sp. deponovaný pod číslom kódu NCAIM (P)B 001235 v National Collection of the Agricultural and Industrial Micro-organisms.
Výhodne je pH fermentačného média regulované tak, že pseudomónová kyselina A je zvýšená a pseudomónová kyselina B je znížená (t.j. pomer nežiadúcej prímesi pseudomonovej kyseliny B k pseudomonove j kyseline A je menší ako 3 %) . Výhodnejšie je pH fermentačného média regulované na hladinu pH približne medzi 5,2 až 6,2. Najvýhodnejšie, pH fermentačného média je pH 5,7.
Výhodne je kmeň Pseudomonas sp. pestovaný v kultivačnom médiu submerzným spôsobom (submerzná kultúra). Výhodne je fermentačné kultivácia uskutočňovaná pri teplote v rozmedzí 20 až 30 °C.
Aby sa regulovalo pH fermentačnej kultúry, jedno výhodné uskutočnenie zahrnuje zásobovanie zdrojom asimilovateľného uhlíka do fermentačného kultivačného média. Výhodné uskutočnenie zdroja asimilovateľného uhlíka je dextróza. V súlade s tým, zásobovanie dextrózou slúži ako zdroj uhlíka a jej medziprodukty a konečné produkty často znižujú pH fermentačného média. Najvýhodnejšie je zásobovanie dextrózou je udržiavané v hladine menšie ako približne 0,5 % dextrózy vo fermentačnom médiu počas produkčnej fázy.
Ďalšie výhodné uskutočnenia zdroja asimilovateľného uhlíka zahrnujú glycerol, rastlinné a živočíšne oleje a tuky.
Keď je použitý glycerol na zásobovanie fermentačného kultivačného média ako zdroj asimilovateľného uhlíka, nemá dostatočný účinok na redukciu pH fermentačného média. V súlade s tým je často použitý kyslý roztok na súčasné zásobovanie fermentačného média, aby bol dosiahnutý optimálny účinok. Výhodne kyslé roztoky zahrnujú HC1, HNO3 a H2SO4. Najvýhodnejšie je kyslý roztok HC1.
Keď je pH fermentačného kultivačného média nízke, alkalický roztok je často použitý pre zásobovanie fermentačného média, aby dosiahlo optimálnu hladinu pH. Výhodne, alkalický roztok použitý pre zásobovanie fermentačného média zahrnuje NaOH a KOH. Najvýhodnejšie je alkalický roztok NaOH.
Ďalšie výhodné uskutočnenie na reguláciu pH fermentačného kultivačného média zahrnuje zásobovanie minerálnou solou. Výhodne, je pre zásobovanie fermentačného kultivačného média použitý roztok chloridu vápenatého. Výhodnejšie je použitý 0,3-0,8% (hmotnosť/hmotnosť) roztok chloridu vápenatého. Najvýhodnejšie je použitý 0,1% (hmotnosť/hmotnosť) roztok chloridu vápenatého.
Spôsob podlá vynálezu je detailnejšie znázornený v nasledujúcich príkladoch, ktoré rozsah vynálezu nijako neobmedzujú.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Násadové médium, g/i Hlavné fermentačné médium, g/1
Monohydrát dextrózy 20 20
Sójová múka — 50
Glycerín 5 10
δ
Kukuričný výluh - 5
Chlorid sodný 0, 5 5
Chlorid draselný 0,5
Uhličitan vápenatý 4 5
Síran amónnny 2
Dihydrofosforečnan draselný 0,4
Chlorid mangánatý x 2H2O 0,03
Síran horečnatý 0,4 ~~
Slnečnicový olej 2 10
NaOH, HCI upravenie PH upravenie pH
pH pred sterilizáciou 7,0-7,2 6,5±0,3
Kultivácia Pseudomonas sp. v násadovom médiu
Násadové médium (bez dextrózy) bolo pripravené v 601itrovej nádobe. Pripravené násadové médium (približne 40 litrov) bolo sterilizované po dobu približne 45 minút pri teplote približne 120 °C.
Roztok dextrózy bol pripravený oddelene. PH roztoku dextrózy bolo upravené s použitím chlorovodíkovej kyseliny na približne 4,0-5,0. Roztok dextrózy byl sterilizovaný po dobu približne 25 minút pri teplote približne 120 °C. Sterilizovaný roztok dextrózy bol pridaný do násadového média, aby sa dosiahla koncentrácia dextrózy 20 gm/1.
Kmeň Pseudomonas sp. (tj. NCAIM(P)B 001235) bol inokulovaný do sterilizovaného násadového média (približne 500 ml). Kmeň Pseudomonas sp. Bol ponechaný rásť v násadovom médiu, dokiaľ nedosiahol logaritmickú rastovú fázu. Kultivácia pseudomonas bola uskutočnená s nasledujúcimi parametrami:
Teplota: približne 25+1 °C,
Hydrostatický tlak: približne 400+100 kPa (0,4+0,1 bar), Rýchlosť miešania: približne 400 ot/min (rpm),
Stupeň prevzdušňovania: približne 0,5 vvm.
Celkový čas na násadové štádium bol 24 hodín.
Kultivácia Pseudomonas sp. Vo fermentačnom médiu
Hlavné fermentačné médium bolo pripravené v 300 litrovej nádobe. Pripravené hlavné fermentačné médium (približne 200 litrov) bolo sterilizované po dobu približne 45 minút pri teplote približne 120 °C.
Roztok dextrózy bol pripravený oddelene. pH roztoku dextrózy bolo upravené s použitím chlorovodíkovej kyseliny na približne 4,0-5,0. Roztok dextrózy bol sterilizovaný po dobu približne 25 minút v približne 120 °C. Sterilizovaný roztok dextrózy bol pridaný do hlavného fermentačného média.
Potom, čo bolo pripravené hlavné fermentačné médium, bolo pridané násadové médium obsahujúce kmeň Pseudomonas sp. Po jeho násadovom štádiu. Pomer násadového štádia k hlavnému fermentačnému médiu bol približne 10 % (hmotnosť/hmotnosť).
Kultivácia fermentačného média bola uskutočnená s nasledujúcimi parametrami:
Teplota: približne 25+1 °C,
Stupeň prevzdušňovania: približne 0,5-1,0 vvm,
Rýchlosť miešania: približne 300-600 ot/min (rpm), a Hydrostatický tlak: približne 500 kPa (0,5 bar) .
Ako rýchlosť miešania tak stupeň prevzdušňovania boli upravené vo vyššie uvedenom rozsahu, aby sa reguloval rozpustený kyslík na konštantnej hladine 30 % v priebehu celého spôsobu fermentácie.
Trvanie kultivácie fermentačného média bolo približne 64 hodín. Ak nastalo penenie média, bol počas fermentácie do fermentačného média pridaný ďalší olej.
Výťažok: dosiahnutý výťažok pseudomonovej kyseliny A bol približne 2,056 Dg/g fermentačného média, ako bolo zmerané prostredníctvom HPLC. Bolo zistené, že nežiaduca prímes pseudomonovej kyseliny B je približne 18 % (hmotnosť/hmotnosť) pseudomonovej kyseliny A.
Určenie obsahu a čistoty pseudomonovej kyseliny A a pseudomonovej kyseliny B:
Určenie obsahu a čistoty pseudomónovej kyseliny A a pseudomonovej kyseliny B bolo založené na testovacej metóde podlá USP 24. Test na určenie obsahu a čistoty bol uskutočnený prostredníctvom HPLC, v ktorej boli vyhodnotené príslušné koncentrácie pseudomonovej kyseliny A a pseudomónovej kyseliny B, a tiež hmotnostný pomer pseudomónovej kyseliny A a pseudomónovej kyseliny B.
Chromatograficky systém zahrnoval:
Kolóna: LiChrosper 100 RP-18,5 m, 250-4,
Detektor: UV 229 nm,
Rýchlosť prietoku: 0,7 ml/minuta,
Injikovaný objem: 20 Dl, a
Mobilná fáza: Príprava vhodnej zmesi s pH 6,3, fosfátový pufor (0,05 M dihdrogénfosforenan sodný) a acetonitril (75: 25) .
Štandardný roztok:
Navážky pseudomónovej kyseliny A a pseudomónovej kyseliny B boli vložené do 100 ml volumetrickej banky, potom nasledovalo pridanie 25 ml acetonitrilu za vzniku zmesi, zmes bola nariedená fosfátovým pufrom (pH 6,3) a potom bola miešaná. Výsledná koncentrácia štandardov bola približne 100 ug/ml.
Doba: približne 15 minút.
Príprava vzorky fermentačného média:
ml mupirocinového fermentačného média bolo prenesené do 10,0 ml volumetrickej banky a nariedené etanolom (96%), ultrasonikované po dobu 20 minút, stočená po dobu 15 minút pri 5,000 ot/min (rpm),
1,0 ml supernatantu bol nariedený 10,0 ml s mobilnou fázou, sfiltrované cez Millipore filter (0,45 pm).
Príklad 2
Násadové médium, g/i Hlavné fermentačné médium, g/1
Monohydrát dextrózy 20 20
Sójová múka —· 50
Glycerín 5 10
Kukuričný výluh — 5
Chlorid sodný 0, 5 5
Chlorid draselný 0,5 —
Uhličitan vápenatý — 3
Síran amónny 2 —
Dihydrogénfosforečnan draselný 0,4
Chlorid mangánatý x 2R2O 0, 03 —
Síran horečnatý 0,4
Slnečnicový olej 2 10
NaOH, HC1 upravení e pH Upravenie pH
pH pred sterilizáciou 7,0-7,2 6,5+0,3
Kultivácia Pseudomonas sp. v násadovom médiu
Násadové médium (bez dextrózy) bolo pripravené v 60 litrovej nádobe. Pripravené násadové médium (približne 4060 litrov) bolo sterilizované po dobu približne 45 minút pri teplote približne 120 °C.
Roztok dextrózy bol pripravený oddelene. Hodnota pH roztoku dextrózy bola upravená s použitím chlorovodíkovej kyseliny na približne 4,0 až 5,0. Roztok dextrózy bol sterilizovaný po dobu približne 25 minút v približne 120 °C. Sterilizovaný roztok dextrózy bol pridaný do násadového média tak, aby koncentrácia dextrózy bola 20 gm/1.
Kmeň Pseudomonas sp. (tj . NCAIM (P) B 001235) bol inokulovaný do sterilizovaného násadového média 500 ml. Kmeň Pseudomonas sp. bol ponechaný rásť v násadovom médiu dokial nedosiahol logaritmickú rastovú fázu. Kultivácia Pseudomonas bola uskutočnená s nasledujúcimi parametrami: Teplota: približne 251 °C,
Hydrostatický tlak: približne 40 - 100 kPa (0,4 ±0,1 bar), Rýchlosť miešania: približne 400 ot/min (rpm) a Stupeň prevzdušňovania: približne 0,5 vvm.
Celkový čas na násadové štádium bol 24 hodín.
Kultivácia Pseudomonas sp. vo fermentačnom médiu
Hlavné fermentačné médium bolo pripravené do 300 litrovej nádoby. Pripravené hlavné fermentačné médium (približne 200 litru) bolo sterilizované po dobu približne 45 minút pri teplote približne 120 ’C.
Roztok dextrózy bol pripravený oddelene. Hodnota pH roztoku dextrózy bola upravená s použitím chlorovodíkovej kyseliny na približne 4,0 - 5,0. Roztok dextrózy bol sterilizovaný po dobu približne 25 minút v približne 120 ’C. Sterilizovaný roztok dextrózy bol pridaný do hlavného fermentačného média tak, aby bola dosiahnutá koncentrácia 20 gm/1.
Potom, čo bolo pripravené hlavné fermentačné médium, násadové médium obsahujúce Kmeň Pseudomonas sp. po jeho násadovom štádiu bolo pridané. Pomer násadového štádia k hlavnému fermentačnému médiu bol približne 10 % (hmotnosť/hmotnosť).
Kultivácia Pseudomonas sp. vo fermentačnom médiu bola uskutočnená s nasledujúcimi parametrami:
Teplota: približne 25±1 °C,
Prevzdušňovanie Rýchlosť: približne 0,5-l,0vvm,
Rýchlosť miešania: približne 300-600 ot/min (rpm) a
Hydrostatický tlak: približne 50 kPa (0,5 bar).
Ako rýchlosť miešania tak i stupeň prevzdušňovania boli upravené vo vyššie uvedenom rozsahu tak, aby v priebehu fermentácie bola udržiavaná konštantná 30% hladina rozpusteného kyslíka.
Keď fermentačné médium dosiahlo pH približne 5,5-5,8, pH sa začalo zvyšovať. Vo fermentačnom médiu bolo pH regulované na konštantnú hladinu približne 5,5 až 6,0. To bolo dosiahnuté pridávaním roztoku chlorovodíkovej kyseliny do fermentačného média. Doplňovacia rýchlosť kyseliny chlorovodíkovej sa menila v závislosti od skutočného pH média.
Doba kultivácie vo fermentačnom médiu bola približne 66 hodín. V priebehu tejto fermentácie bol do fermentačného média pridaný ďalší olej, pokial došlo na akékoľvek penenie média.
Výťažok: dosiahnutý výťažok pseudomonovej kyseliny bol približne 2,251 pg/g fermentačného média podlá merania na HPLC. Nežiaduca prímes pseudomónovej kyseliny B bola zistená približne v množstve 1,6 % (hmotnosť/hmotnosť) pseudomónovej kyseliny A.
1F
Príklad 3
V tomto príklade bola príprava násadového média, hlavného fermentačného média a kultivácia kmeňa Pseudomonas sp. v násadovom médiu a hlavnom fermentačnom médiu boli uskutočnené zhodne ako v príklade 2.
Kultivácia vo fermentačnom médiu bola tiež uskutočnená s rovnakými parametrami kultivácie, ako boli definované v príklade 2.
Predsa len, hodnota pH fermentačného média v tomto príklade bola regulovaná iným spôsobom. Miesto toho, aby sa do fermentačného média pridávala chlorovodíková kyselina, pH bolo upravované tým, že sa doplňoval roztok dextrózy.
Bolo pozorované, že keď fermentačné médium dosiahlo pH približne 5,5-5,8, začalo sa pH zvyšovať. V tomto príklade bola hodnota pH regulovaná na konštantnej hladine približne
5,5 až 6,0. To bolo dosiahnuté tým, že sa doplňoval roztok dextrózy. Doplňovacia rýchlosť roztoku dextrózy do fermentačného média závisela od aktuálnej hodnoty pH a od aktuálneho obsahu dextrózy v médiu. Pri doplňovaní dextrózy bola hladina glukózy regulovaná tak, aby sa nezvýšila nad približne 0,5 % (hmotnosť/hmotnosť). Keď sa pH zvýšilo nad 5,8-6,0 a hladina dextrózy bola vyššia ako 0,45 % (hmotnosť/hmotnosť), hodnota pH sa regulovala tak, že sa do fermentačného média miesto dextrózy pridala chlorovodíková kyselina.
Doba kultivácie vo fermentačnom médiu bola približne 65 hodín. Počas fermentácie bol pridaný ďalší olej, pokial došlo na nejaké penenie.
lF
Výťažok: dosiahnutý výťažok pseudomónovej kyseliny A bol približne 3,021 pg/g fermentačného média, ako bolo zmerané prostredníctvom HPLC. Nežiadúca prímes pseudomónovej kyseliny B bola zistená vo výši približne
2,9 % (hmotnosť/hmotnosť) pseudomónovej kyseliny A.
Predkladaný vynález nie je nijako obmedzený, pokiaľ sa jedná o rozsah nárokov, špecifickými uskutočneniami popisovanými v texte prihlášky. Rôzne ďalšie modifikácie vynálezu, okrem tých, ktoré sú popísané v texte, budú odborníkom zrejmé na základe predchádzajúceho popisu a sprievodných obrázkov. Také modifikácie však spadajú do rozsahu pripojených nárokov.
V popise sú citované rôzne publikácie, ktoré sú tamto v plnom rozsahu zahrnuté formou odkazu.

Claims (9)

1. Spôsob fermentácie na výrobu pseudomónovej kyseliny vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kroky:
a) pripraví sa fermentačné médium obsahujúce mikroorganizmus produkujúci pseudomonovú kyselinu,
b) reguluje sa pH fermentačného média a
c) z fermentačného média sa získa pseudomónová kyselina.
2. Spôsob fermentácie podlá nároku 1, vyznačujúci sa tým, že pseudomónová kyselina je pseudomónová kyselina A.
3. Spôsob fermentácie podlá nároku 1 alebo 2, vyznačujúci sa tým, že mikroorganizmus produkujúci pseudomonovú kyselinu je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí kmeň Pseudomonas sp., jeho potomstvo, a prírodný variant alebo mutantný variant Pseudomonas sp.
4. Spôsob fermentácie podľa nároku 3, vyznačujúci sa tým, že kmeň Pseudomonas sp. je kmeň uložený v Národnej Zbierke Poľnohospodárskych a priemyselných Mikroorganizmov pod číslom NCAIM (P)B 001235.
5. Spôsob fermentácie podľa nároku 1, 2, 3 alebo 4, vyznačujúci sa tým, že fermentácia sa uskutočňuje v submerznej kultúre.
6. Spôsob fermentácie pódia nároku- 1, 2, 3, 4 alebo 5, vyznačujúci sa tým, že fermentácia je udržiavaná pri teplote približne 20 °C až 30 °C.
Spôsob fermentácie podľa nároku 1, 2, vyznačujúci sa tým, že hodnota média je regulovaná počas produkčnej fázy
3, 4, 5 alebo 6, pH fermentačného fermentácie.
8. Spôsob fermentácie podľa nároku 1, 2, 3, 4, 5, 6 alebo
7, vyznačujúci sa tým, že hodnota pH fermentačného média je regulovaná na približne 5,7.
9.
Spôsob fermentácie podlá alebo
8, vyznačujúci fermentačného média je fermentačného média pridáva nároku 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 sa tým, že hodnota pH regulovaná tým, že sa do zdroj asimilovatelného uhlíka.
10. Spôsob fermentácie podlá nároku 9, vyznačujúci sa tým, že doplňovanie zdroja asimilovatelného uhlíka je metabolický riadené.
12.
Spôsob fermentácie podľa vyznačujúci sa tým, že uhlíka je dextróza.
nároku 9 alebo 10, zdrojom asimilovatelného
Spôsob fermentácie podľa nároku 1, 9, 10 alebo 11, vyznačujúci sa fermentačného média je regulovaná zdroja asimilovatelného uhlíka a fermentačného média.
2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, tým, že hodnota pH súčasným pridávaním kyslého roztoku do
13. Spôsob fermentácie podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že zdroj asimilovatelného uhlíka je glycerol a kyslý roztok je chlorovodíková kyselina.
14. Spôsob fermentácie podľa nároku 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 alebo 13, vy značujúci sa tým, že hodnota pH fermentačného média je regulovaná pridávaním minerálnej soli do fermentačného média.
15. Spôsob fermentácie podlá nároku 14, vyznačujúci sa tým, že minerálna soľ je roztok chloridu vápenatého.
16. Spôsob fermentácie podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že roztok chloridu vápenatého je približne 0,1% až 0,8% (hmotnosť/hmotnosť) .
17. Spôsob fermentácie podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že roztok chloridu vápenatého je približne 0,3% (hmotnosť/hmotnosť).
18. Spôsob fermentácie podlá nároku 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 alebo 17, vyznačujúci sa tým, že hodnota pH f ermentačného média je regulovaná pridávaním alkalického roztoku do fermentačného média.
19. Spôsob fermentácie podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že alkalický roztok je vybraný ze skupiny, ktorú tvorí hydroxid sodný a hydroxid draselný.
20. Spôsob fermentácie podľa nároku 18, vyznačujúci sa tým, že alkalický roztok je hydroxid draselný.
21. Spôsob fermentácie podlá nároku 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 alebo 20, vyznačujúci sa tým, že hodnota pH fermentačného média je regulovaná pridávaním kyslého roztoku do fermentačného média.
22. Spôsob fermentácie podlá nároku 21, vyznačujúci sa tím, že kyslý roztok je vybraný zo skupiny, ktorú tvorí kyselina dusičná (HNO3) , kyselina sírová (H2SO4) a kyselina chlorovodíková (HCI) .
23. Spôsob fermentácie podlá nároku 21 alebo 22, vyznačujúci sa tým, že kyslý roztok je kyselina chlorovodíková.
24. Spôsob fermentácie podľa nároku 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8,
9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, alebo vyznačujúci sa tým, že hodnota pH fermentačného média je udržiavaná na hodnote 5,2 až 6,2.
25. Spôsob fermentácie podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že poskytuje pseudomonovú kyselinu s čistotou aspoň
82% (hmotnosť/hmotnosť) pseudomónovej k pseudomónovej kyseline B. kyseliny A vzhladom 26. Spôsob fermentácie podía nároku 25, tým, že čistota je aspoň 97%. vyznačuj ú c i sa 27 . Pseudomonová kyselina, ktorá bola podľa nároku 26. pripravená spôsobom
28. Spôsob fermentácie na výrobu pseudomónovej kyseliny vyznačujúci sa tým, že zahrnuje kroky:
a) pripraví sa fermentačné médium obsahujúce mikroorganizmus produkujúci pseudomónovou kyselinu a chlorid vápenatý,
b) reguluje sa pH fermentačného média tým, že sa pridáva dextróza a potom v prípade potreby kyselina, a z fermentačného média sa získa pseudomónová kyselina.
29. Spôsob fermentácie podľa nároku 24 alebo 28 vyznačujúci sa tým, že se hodnota PH reguluje na 5,5 až 6,0.
30. Spôsob fermentácie podlá nároku n, 28 alebo 29 vyznačujúci sa tým, že pri regulácii PH koncentrácia dextrózy dosiahne najviac 0,5 O Ό (hmotnosť/hmotnosť). 31. Spôsob fermentácie podlá nároku 28, 29 alebo 30
vyznačujúci sa tým, že sa pridá kyselina, keď pH dosiahne hodnotu najmenej 5,8 a koncentrácia dextrózy je prinajmenšom 0,45 % (hmotnosť/hmotnosť).
32. Spôsob fermentácie podľa nároku 1, 28, 29, 30 alebo 31 vyznačujúci sa tým, že poskytuje pseudomónovú kyselinu s čistotou aspoň 82% (hmotnosť/hmotnosť) pseudomónovej kyseliny A vzhľadom k pseudomónovej kyseline B.
2€
33. Spôsob fermentácie podlá nároku 32, vyznačujúci sa tým, že čistota je aspoň 97%.
34. Fermentačné médium mikroorganizmu produkujúceho pseudomónovú kyselinu, ktorá obsahuje 97% hladinu pseudomónovej kyseliny A vzhladom k pseudomónovej kyseline B, pričom obe kyseliny sú v médiu prítomné v dôsledku fermentácie mikroorcamizmu.
35. Farmaceutická kompozícia pseudomonovej kyseliny, vyznačujúca sa tým, že obsahuje pseudomónovú kyselinu A a farmaceutický prijatelné excipienty, pričom hladina pseudomónovej kyseliny A je aspoň 97% (hmotnosť/hmotnosť) vzhladom k pseudomónovej kyseline B.
36. Spôsob liečenia infekcie vnímavej k pseudomónovej kyseline u zvieraťa, vyznačujúci sa tým, že se podáva kompozícia podlá nároku 35.
SK41-2004A 2001-06-21 2002-06-21 Metabolic controlled fermentation process for pseudomonic acid production SK412004A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US29992701P 2001-06-21 2001-06-21
PCT/US2002/020044 WO2003000910A2 (en) 2001-06-21 2002-06-21 Metabolic controlled fermentation process for pseudomonic acid production

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK412004A3 true SK412004A3 (en) 2004-12-01

Family

ID=23156895

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK41-2004A SK412004A3 (en) 2001-06-21 2002-06-21 Metabolic controlled fermentation process for pseudomonic acid production

Country Status (16)

Country Link
US (1) US7439045B2 (sk)
EP (1) EP1409703A4 (sk)
JP (1) JP2005518780A (sk)
KR (1) KR20040026669A (sk)
AU (1) AU2002345856A1 (sk)
CA (1) CA2448547A1 (sk)
CZ (1) CZ200467A3 (sk)
DE (1) DE02744598T1 (sk)
ES (1) ES2228294T1 (sk)
HR (1) HRP20040051A2 (sk)
HU (1) HUP0500797A2 (sk)
MX (1) MXPA03012044A (sk)
PL (1) PL374255A1 (sk)
SK (1) SK412004A3 (sk)
TR (1) TR200403211T3 (sk)
WO (1) WO2003000910A2 (sk)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HUP0600679A2 (en) * 2001-12-28 2008-06-30 Biogal Gyogyszergyar Processes for preparing crystalline and amorphous mupirocin calcium and pharmaceutical compositions containing the same
IL150907A (en) * 2002-07-25 2007-07-04 Stephan Cherkez Process for the preparation of stable amorphous calcium pseudomonate
CA2560984A1 (en) * 2004-06-01 2005-12-15 Teva Gyogyszergyar Zartkoruen Mukodo Reszvenytarsasag Process for preparation of amorphous form of a drug
EP1856111B1 (en) 2005-02-21 2014-01-29 Syngen Biotech Co., Ltd. Purification of mupirocin
CN108277243B (zh) * 2018-01-19 2021-03-12 浙江瑞邦药业股份有限公司 一种假单胞菌酸a的制备方法
CN108949845B (zh) * 2018-08-08 2021-08-10 福建康鸿生物科技有限公司 一种发酵培养基及由发酵培养基制备莫匹罗星的方法
US20240043888A1 (en) * 2021-02-07 2024-02-08 Hangzhou Zhongmeihuadong Pharmaceutical Co., Ltd. Fermentation method for mupirocin

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1643240A1 (de) 1966-09-16 1971-06-24 Boehringer Sohn Ingelheim Verfahren zur Herstellung neuer racemischer oder optisch aktiver 1-Phenoxy-2-aminoalkane
US3977943A (en) 1971-06-12 1976-08-31 Beecham Group Limited Antibiotics
GB1395907A (en) 1971-06-12 1975-05-29 Beecham Group Ltd Antibiotics
US4071536A (en) 1971-06-12 1978-01-31 Beecham Group Limited Antibiotics
JPS5270083A (en) 1975-12-04 1977-06-10 Yoshitomi Pharmaceut Ind Ltd Manufacture of an antibiotics, trans-pseudomonic acid
GB1577730A (en) 1976-10-23 1980-10-29 Beecham Group Ltd Treatment of infections with pseudomonicacid salts or esters thereof
GB1577545A (en) 1977-07-27 1980-10-22 Beecham Group Ltd Treatment of swine dysenter
CA1103264A (en) 1977-09-30 1981-06-16 Norman H. Rogers Purification of pseudomonic acid
CA1115699A (en) 1978-05-20 1982-01-05 Alan D. Curzons Lithium pseudomonate and its preparation
CA1196284A (en) 1982-05-28 1985-11-05 Joshua Oduro-Yeboah Pharmaceutical formulations
GB8415579D0 (en) 1984-06-19 1984-07-25 Beecham Group Plc Compounds
GB8428952D0 (en) 1984-11-16 1984-12-27 Beecham Group Plc Formulations
GB8530796D0 (en) 1985-12-13 1986-01-22 Beecham Group Plc Pharmaceutical composition
IE59628B1 (en) 1986-06-26 1994-03-09 Beecham Group Plc Treatment of fungal infections
US5594026A (en) 1990-12-11 1997-01-14 Smithkline Beecham Group P.L.C. Polymorphs of crystalline mupirocin
US5292892A (en) * 1991-05-07 1994-03-08 Sankyo Company, Limited Anti-bacterial compound and pharmaceutical compositions thereof
US6503881B2 (en) 1996-08-21 2003-01-07 Micrologix Biotech Inc. Compositions and methods for treating infections using cationic peptides alone or in combination with antibiotics
BR9711843A (pt) 1996-10-01 2001-07-31 Smithkline Beecham Corp Uso de mupirocina para a fabricação de um medicamento para o tratamento de infecções bacterianas associadas com colonização da nasofaringe por organimos patogênicos
US6231875B1 (en) 1998-03-31 2001-05-15 Johnson & Johnson Consumer Companies, Inc. Acidified composition for topical treatment of nail and skin conditions
CN1203184C (zh) 1999-02-03 2005-05-25 拜奥盖尔药厂有限公司 经微生物学方法制备假单胞菌酸a抗生素的方法
YU55501A (sh) 1999-02-03 2003-07-07 Biogal Gyogyszergyar Rt. Proces za izolaciju pseudomonične kiseline a iz kompleksa pseudomonične kiseline sadržanog u kulturnom bujonu
US6335023B1 (en) 1999-06-30 2002-01-01 Ruey J. Yu Oligosaccharide aldonic acids and their topical use
US6528086B2 (en) 1999-09-28 2003-03-04 Zars, Inc. Methods and apparatus for drug delivery involving phase changing formulations
IL137363A (en) 2000-07-18 2005-12-18 Agis Ind 1983 Ltd Pharmaceutical compositions containing mupirocin
IL150907A (en) 2002-07-25 2007-07-04 Stephan Cherkez Process for the preparation of stable amorphous calcium pseudomonate

Also Published As

Publication number Publication date
CZ200467A3 (cs) 2004-10-13
WO2003000910A3 (en) 2003-04-24
JP2005518780A (ja) 2005-06-30
US20030027292A1 (en) 2003-02-06
WO2003000910A2 (en) 2003-01-03
DE02744598T1 (de) 2005-03-31
US7439045B2 (en) 2008-10-21
EP1409703A2 (en) 2004-04-21
CA2448547A1 (en) 2003-01-03
PL374255A1 (en) 2005-10-03
HUP0500797A2 (en) 2007-06-28
AU2002345856A1 (en) 2003-01-08
HRP20040051A2 (en) 2004-10-31
KR20040026669A (ko) 2004-03-31
ES2228294T1 (es) 2005-04-16
TR200403211T3 (tr) 2005-02-21
MXPA03012044A (es) 2004-06-17
EP1409703A4 (en) 2004-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1330750C (zh) 磷酸甘油酸族氨基酸及氨基酸衍生物的发酵制造方法
EP2019869B1 (en) Fermentative production of lipstatin
CA2719581C (en) Improved fermentation process for higher yield coefficient of lipase-inhibitor with respect to consumed fatty acid
CN112592944A (zh) 一种氨基葡萄糖的生产方法
SK412004A3 (en) Metabolic controlled fermentation process for pseudomonic acid production
CN117327747B (zh) 采用微生物发酵生产d-泛酸的方法
CN102978252A (zh) 一种l-色氨酸分批补料发酵工艺
CN101671706A (zh) 一种霉酚酸发酵过程中补糖方法
JPH03505817A (ja) ガンマ及びデルタ　ラクトンの調製方法
KR101579766B1 (ko) 일종의 사이클릭 리포펩티드 화합물의 제조방법
CN115181774A (zh) 一种提高多粘菌素b有效组分含量的发酵液制备方法
DE112018006584T5 (de) Verfahren zur fermentativen Herstellung von oxidiertem Coenzym Q10 sowie daraus hergestelltes hochgehaltiges oxidiertes Coenzym Q10
CN111154815B (zh) 一种提高l-色氨酸生产效率的方法
CN110468051A (zh) 一种k252a发酵培养基及其制备方法
PL185620B1 (pl) Sposób wytwarzania kwasu klawulanowego
CN111979277A (zh) 一种生产利普司他汀的培养基及其使用方法
CN114990178B (zh) 一种提高阿维拉霉素发酵液质量的方法
EP2032712A1 (en) Regulation of acid metabolite production
CA2521419A1 (en) Fermentation processes with low concentrations of carbon-and nitrogen-containing nutrients
SI20079A (sl) Metabolično kontrolirani fermentacijski postopek za izdelavo hidroksi kisline lovastatina
CN116083507A (zh) 一种基于调控代谢合成速度的纳他霉素培养基及其培养工艺
CN115595342A (zh) 一种基于控制比氧消耗速率提高色氨酸生产水平的方法
JP2001527424A (ja) ロバスタチンヒドロキシ酸を製造するための代謝コントロール発酵操作
SK702019A3 (sk) Príprava farmaceutickej aktívnej látky lipstatín s použitím produkčného mikroorganizmu Streptomyces toxytricini NRL
CA2433813A1 (en) Metabolic controlled fermentation process for carbamoyl tobramycin production

Legal Events

Date Code Title Description
FC9A Refused patent application