SK330992A3 - Method for producing thrombin, which is free of infectious agent - Google Patents

Description

SPÔSOB VÝROBY TROMBÍNU ZABEZPEČENÉHO PROTI VÍRUSOM

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu výroby trombinu ľudského alebo zvieracieho pôvodu, zabezpečeného proti vírusom.

Doterajší stav techniky

Pri zrážaní krvi prebieha rad po sebe nasledujúcich reakcií, pri ktorých sú aktivované faktory zrážania krvi a nakoniec sa účinkom aktivovaného protrombínu (trombinu) na fibrinogén tvorí fibrín. Reakcia protrombínu na trombín prebieha samotná s faktorom Xa a vápnikom veľmi pomaly. Táto reakcia prebieha optimálne až potom, kedy je k dispozícii opäť komplex niekoľkých faktorov (protrombinázový komplex). K tomuto komplexu okrem faktoru Xa patrí faktor V, fosfolipidy a vápnik. Faktor Xa štiepi molekulu protrombínu (molekulová hmotnosť 68 kD) proteolyticky, a tým vytvára aktívny enzým trombín (molekulová hmotnosť 30 kD).

Plazmová proteáza trombín je viacfunkčný enzým, ktorý nie je koagulovaný iba štiepením fibrinogénu na fibrín, ale tiež aktivovaný zrážacími faktormi V, VIII a XIII a štiepený svojím vlastným proenzýmom (protrombínom).

V terapii je trombín sám alebo spoločne s fibrinogénmi používaný na zastavenie krvácania alebo v chirurgii na spájanie tkanív lepiacou technikou.

Aktivácia protrombínu cez protrombinázový komplex je ex situ ťažko napodobiteľná, a preto nechýbali pokusy pripraviť trombín pôsobením proteázy ľudského alebo zvieracieho pôvodu. Pritom je známe, že sa má vyhnúť každému kontaktu produktu s materiálom ľudského alebo zvieracieho pôvodu, aby sa zmenšilo nebezpečenstvo kontaminácie látkou spôsobujúcou infekciu.

Pokusy spracovať protrombínové komplexy izolované z plazmy s vápenatými iónmi, rovnako ako s vápenatými iónmi a suspenziou obsahujúcou hovädzí tromboplastín ukazujú, že spracovanie so samotnými vápenatými iónmi vedie k podstatnému zníženiu výťažku a čistoty vzniknutého trombínu, ako pri spracovaní s vápenatými iónmi a tromboplastínom (Cryobiology, 21, 661 - 663 (1984)).

Z DE-A38 43 126 je známe, že z plazmy, ktorá je adsorbovaná na základnej hmote a spracovaná s protrombínovým aktivátorom, sa môže dostať trombín. Ako aktivátor sa môžu napríklad uviesť vápenaté ióny, vápenaté ióny a tromboplastín alebo faktor Xa. Počas aktivácie sú prítomné všetky biologické kofaktory, ktoré sú rovnako viazané na základnú hmotu.

Pri použití plazmatického protrombínu na získanie trombínu vzniká nebezpečenstvo kontaminácie infekčnými látkami (napríklad vírusom hepatitídy alebo HIV). Okrem toho dochádza ešte k tomu, že pri všeobecne známom spôsobe aktivácie je okrem iónu dvojmocného vápnika odporučené dodatočné použitie biologických kofaktorov, čím sú dané ďalšie zdroje kontaminácie.

Teraz je síce známe, že infekčné látky v biologických preparátoch sa môžu spoľahlivo inaktivovať pôsobením tepla, najmä v kombinácii s ošetrením parou (AT-B 385 657). Pritom sa však ukázalo, že sa trom! ín na základe svojej tepelnej nestálosti musí zahrievať v prítomnosti stabilizátorov (DE-A 38 09 991), aby sa aktivita trombínu nepoškodila. Použitie stabilizátorov je však sporné, pretože sa počas pôsobenia tepla ochráni nielen aktivita trombínu, ale sa tiež stabilizujú vírusy.

Úlohou vynálezu je poskytnúť trombín, ktorý je bezpečný proti vírusom.

Podstata vynálezu

Trombín bezpečný proti vírusom sa dá získať z vírusovej inaktivovanej plazmovej frakcie obsahujúcej protrombín, výhradne aktiváciou soľami aktívnymi pri zrážaní, napríklad vápenatými, strontnatými alebo zinočnatými iónmi. Takéto soli podporujú tvorbu trombínu zo zodpovedajúcich zrážacích faktorov.

Vynález spočíva na poznatku, že infikujúce látky, ktoré sú prítomné v plazmatickom protrombine, sa môžu stať neškodné spracovaním protrombínu pre inaktiváciu vírusov, bez toho, aby sa biologická aktivita trombínu získaného z protrombínu podstatne ovplyvnila.

S prekvapením sa zistilo, že aktivácia samotnej vírusovej inaktivovanej frakcie, obsahujúcej protrombín, prídavok solí aktívnych pri zrážaní, vedie jednoduchým spôsobom k vyššiemu výťažku alebo čistote produktu, bez ďalšieho prídavku biologického kofaktora, ako sú zrážacie faktory V, Xa alebo fosfolipidy. Kontaminácia počas aktivácie sa teda zmenší, lebo je tiež pripravovaný trombín, rovnako ako východiskový materiál, zabezpečený proti vírusom.

Ako výhodné sa ukázalo pripravovať trombín zabezpečený proti vírusom z vírusovo inaktivovaného protrombínového komplexu, obzvlášť z vírusovo inaktivovaného aktivovaného protrombínového komplexu. Aktivácia aktivovaného protrombínového komplexu prebieha prídavkom solí aktívnych pri zrážaní prekvapujúco vyššou reakčnou rýchlosťou. Výťažok trombínu sa rovnako optimalizuje.

Obzvlášť výhodná je výroba trombínu zabezpeče; iho proti vírusom z Factor Eight Inhibitor Bypassing Activity, označovaného v nasledujúcom všeobecne používanou skratkou FEIBA. Aktivovaný protrombínový komplex alebo FEIBA sa môžu pripraviť pomocou už známych opatrení (AT-B 350 726, AT-B 368 883 a EP-B 0 041 173) z protrombínového komplexu.

Predmetom predloženého vynálezu teda je spôsob výroby trombínu zabezpečeného proti vírusom, ktorý spočíva v tom, že sa kombinujú opatrenia, totiž že

- sa pripraví aktivovaný protrombínový komplex z plazmovej frakcie obsahujúcej protrombín,

- aktivovaný protrombínový komplex sa spracuje na inaktiváciu infekčných látok a

- k spracovanému aktivovanému protrombínovému komplexu sa pridajú soli aktivujúce zrážanie, aby sa pripravil trombín.

Trombín sa s výhodou ďalej čistí iónomeničovou chromatografiou a/alebo afinitnou chromatografiou.

Využiteľnosť

Trombín zabezpečený proti vírusom podľa hore uvedeného popisu sa hodí najmä pre použitie vo farmaceutických prípravkoch a na výrobu diagnostík.

Príklady vyhotovenia vynálezu

Ďalej uvedené príklady ešte bližšie objasňujú vynález, pričom príklady 3 a 4 sa týkajú ďalšieho čistenia trombínu pripraveného podľa príkladu 1.

Príklad 1 litrov ľudskej krvnej plazmy, ochudobnenej o zrazeninu odstránenú kryoskopickým technickým postupom, sa uvedie do styku s protrombínom (faktor II) a okrem toho zrážacími faktormi VII, IX a X na iónomeničovej živici (DEAE-Sephadex). Po eluovaní frakcií obsahujúcich faktor II pomocou 0,5 molárneho roztoku chloridu sodného sa zníži v tomto roztoku koncentrácia chloridu sodného na 0,15 mól/l diafiltráciou a nakoniec sa vykoná lyofilizácia.

Aby sa prípadne obsiahnutý pôvodca choroby inaktivoval, táto frakcia sa zahrieva podľa návodu daného v AT-B 385 657 po dobu 10 hodín na teplotu 60 °C a po dobu jednej hodiny na teplotu 80 °C. Aktivita protrombínu je 5 250 jednotiek. Protrombín sa rozpustí na roztok obsahujúci 2,5 jednotiek na mililiter a pomaly mieša s 2,5 mmól/l chloridu vápenatého za teploty +30 °C pri hodnote pH 7,0. Po 80 minútach sa stanoví aktivita trombínu (pomocou chromogénneho substrátu Th-1 firmy IMMUNO AG, Viedeň) 48 jednotiek na 1 jednotku faktoru II.

Ochladením na teplotu +4 °C a prídavkom kyseliny etyléndiaminotetraoctovej (EDTA) sa zastaví tvorba trombínu. Pomocou ultrafiltrácie a/alebo diafiltrácie za použitia ultrafiltračnej membrány (veľkosť pórov 10 000) sa odstráni vápenatý komplex. Nakoniec sa koncentrát upraví na farmaceutický prípravok.

Príklad 2 ml roztoku obsahujúceho FEIBA (firmy IMMUNO AG, Viedeň) s aktivitou FEIBA 966 jednotiek a 992 jednotkami faktoru II sa zriedi 0,9 % roztokom chloridu sodného na 330 ml a pomaly mieša s 2,75 mmól/l chloridu vápenatého za teploty +30 °C. Po 90 minútach dosahuje aktivita trombínu maximum 51 jednotiek na 1 jednotku faktoru II. Aktivácia sa zastaví ochladením roztoku na teplotu +4 °C a prídavkom citronanu sodného.

Príklad 3

Trombín s aktivitou 20 000 jednotiek, pripravený podľa príkladu 1, sa adsorbuje na stĺpci 20 ml S-sefarózy pri vodivosti 10,5 mS/cm a pri hodnote pH 6,0. Nakoniec sa všetko premyje 140 ml 150-milimolárneho roztoku chloridu sodného, aby sa odstránili neviazané proteíny.

Frakcie obsahujúce trombín sa eluujú 100 ml 750 - milimolárneho roztoku chloridu sodného, skoncentrujú, diafiltrujú a r ikoniec upravia na farmaceutický prípravok.

Výťažok aktivity trombínu je väčší ako 90 %.

Príklad 4

Trombín s aktivitou 10 000 jednotiek, pripravený podľa príkladu 1, sa vnesie na stĺpec 10 ml lyzín - sefarózy ekvilibrovaný 150 - milimolárnym roztokom octanu sodného, s hodnotou pH 6,7. Naplnený stĺpec sa premyje rovnakým pufrom a frakcie obsahujúce trombín sa eluujú 300 - milimolámym roztokom lyzínu.

Aktivita trombínu je 9 400 jednotiek a špecifická aktivita je 1 850 jednotiek na mg proteínu.

Claims (2)

1. Spôsob výroby trombínu zabezpečeného proti vírusom, vyznačujúci sa tým, že sa aktivovaný protrombinový komplex, získateľný z plazmovej frakcie obsahujúcej protrombinový komplex, spracuje k inaktiváciU infekčných látok a k spracovanému aktivovanému protrombínovému komplexu sa pridajú soli aktívne pri zrážaní.

2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že sa trombín ďalej čistí iónomeničovou chromatografíou a/alebo afinitnou chromatografíou.