SK288125B6 - Plastid-targeting nucleic acid sequence, beta-amylase sequence, a stimulus-responsive promoter and uses thereof - Google Patents

Abstract

Nucleic acid sequence known herein as SEQ. ID. No. 1 capable of targeting a further coding sequence to a plant plastid, method of increasing or decreasing in a plant the activity of an enzyme in the pathway of starch biosynthesis or degradation comprising the steps of stably incorporating into a plant genome a chimaeric gene comprising a nucleic acid sequence encoding a plastid targeting sequence for beta-amylase; and regenerating a plant having an altered genome, wherein the sequence of nucleic acid already comprises the mentioned sequence. A method of targeting proteins or enzymes to a plant plastid, a method of altering of enzyme in a transgenic plant, a chimaeric gene, plant cells, seed of the transformed plant and the plants.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka sekvencie nukleovej kyseliny schopnej smerovať proteín do rastlinného plastidu a spôsobu tohto smerovania, spôsobu regulácie aktivity enzýmu v rastline, chimérického génu, rastlinnej bunky a transformovanej rastliny, vrátane semien. Konkrétne sa týka novej sekvencie β-amylázy smerovanej do chloroplastu (ct β-amylázu), novej sekvencie nukleovej kyseliny na smerovanie do chloroplastu a novej sekvencie (β-amylázy). Vynález ďalej poskytuje indukovateľný promótor, ktorý je nezávisle indukovaný stimulmi v podobe svetla a cukru. Opisujú sa tu metódy transformácie rastlín použitím týchto nových sekvencií, a tiež transformované rastlinné bunky, rastliny a semená rastlín, a tiež chimérické gény obsahujúce uvedené sekvencie. Ďalej sú opísané spôsoby modifikácie obsahu škrobu v rastlinách, a tiež smerovanie génov účastniacich sa biosyntézy alebo degradácie škrobu, alebo génov rezistencie k škodcom, a/alebo variácií génovej expresie, ktoré je možné podľa vynálezu dosiahnuť.

Doterajší stav techniky

Presný mechanizmus, akým je syntetizovaný a degradovaný škrob v rastlinách, nie je dosiaľ známy, hoci bol izolovaný a charakterizovaný rad enzýmov, ktoré sa zrejme na týchto procesoch podieľajú. Škrob je akumulovaný v chloroplastoch v listoch počas dňa a je použitý na zásobovanie rastliny energiou a biosyntetických dráh počas noci. Spôsob, akým je tzv. prechodný (tranzientný) škrob mobilizovaný, nie je úplne poznaný, ale musí zahŕňať koordinovanú reguláciu syntetických a degradačných enzymatických aktivít. V listovom pletive hlavná degradačná metabolická dráha zahŕňa fosforolytické a hydrolytické aktivity, predovšetkým α-glukozidázu (E.C. 3.2.1.3) (Nielson a Stitt, 1997).

Škrob je tiež akumulovaný v amyloplastoch rezervných orgánov, ako sú napr. semená, plody a hľuzy. V takom prípade je škrob skladovaný dlhodobo a jeho mobilizácia je sprevádzaná degeneráciou pletiva rezervných orgánov a zvýšením amylolytickej a fosforolytickej aktivity. Ale existujú dôkazy, že k metabolickému obratu škrobu dochádza i v amyloplastoch rezervných orgánov (Sweetlove a kol. 1996). To opäť vyžaduje koordinovanú reguláciu syntetických a degradujúcich enzymatických aktivít.

Tak chloroplasty ako amyloplasty pochádzajú z proplastidov, a preto majú veľa spoločných vlastností, a okrem toho, že sú obidve organely miestom syntézy škrobu v listoch (chloroplasty) a v rezervných orgánoch, (amyloplasty), chloroplasty sa môžu premeniť na amyloplasty a iné typy plastidov (Thomson a Whatley 1980).

Škrob je zmes dvoch polysacharidov, a síce amylózy, čo je lineárny reťazec glukozylových jednotiek spojených a-1,4- glykozidickými väzbami, a amylopektínu, ktorý je tvorený mnohými lineárnymi reťazcami a-l,4-polyglukánov, ktoré sú navzájom spojené a-l,6-glykozidickými väzbami.

Enzýmy účastniace sa syntézy škrobu sú ADPG pyrofosforyláza (E.C. 2.7.7.21), syntáza škrobu (E.C. 2.4.1.21) a tzv. vetviaci enzým (E.C. 2.4.1.18). ADPG pyrofosforyláza je zodpovedná za dodávanie substrátu ADPG, ktorý slúži ako donor glukózových monomérov, ktoré sú potom navzájom pospojované súhrou syntázy škrobu (a-1,4 väzby) a vetviaceho enzýmu (a-1,6 väzby).

Predpokladá sa, že nerozpustná kryštalická štruktúra škrobových zŕn je tvorená tesným zhŕknutím predĺžených skrutkovicových rozvetvených molekúl amylopektínu, kde lineárne molekuly amylózy vypĺňajú voľný priestor.

Bol opísaný rad enzýmových aktivít degradujúcich škrob, ako je napr. α-amyláza (E.C. 3.2.1.1), izoamyláza (E.C. 3.2.1.68), β-amyláza (E.C. 3.2.1.2), α-glukozidáza (E.C. 3.2.1.3), fosforyláza škrobu (E.C. 2.4.1.1) a tzv. disproporcionačný enzým (E.C. 2.4.1.25). Mnohé z týchto enzýmov existujú v rastline v niekoľkých formách a niektoré sa podieľajú na syntéze škrobu. Pravdepodobne sa všetky, v určitom rozsahu, podieľajú na mobilizácii škrobu, hoci ich presné úlohy a možné interakcie nie sú dosiaľ známe. Problémy v priradení úlohy rôznym enzýmom sú dobre patmé na príklade dvoch enzýmov, ktoré sú považované za hlavných účastníkov rozkladu škrobu v rastlinách, a síce fosforyláza škrobu a amyláza.

Fosforyláza škrobu katalyzuje reverzibilné uvoľňovanie glukóza-1,6-fosfátu z a-l,4-glukánov. V rastlinných pletivách sa vyskytujú dve formy fosforylázy škrobu: Phol, čiže L-typ, lokalizovaná vnútri plastidov a s vysokou afinitou k maltodextrínom, Pho2, čiže H-typ, lokalizovaná v cytozole a majúca vysokú afinitu k veľkým, silne rozvetveným polyglukánom, ako je glykogén. Hoci plastidový enzým Phol je pravdepodobným kandidátom na enzým účastniaci sa mobilizácie škrobu, antisense inhibícia tejto enzýmovej aktivity v liste nemala žiadny vplyv na akumuláciu škrobu v liste pri rastline transgénneho zemiaka (Sonnewald a kol., 1995). V inej štúdii, antisense inhibície cytoplazmatickej Pho2, mala vplyv na klíčenie hľúz transgénneho zemiaka, ale nemala žiadny vplyv na akumuláciu a degradáciu škrobu (Duwenig a kol. 1997).

Existujú dve hlavné skupiny amyláz hydrolyzujúcich a-l,4-glykozidické väzby amylózy a amylopektínu: α-amyláza pôsobí náhodne na iných ako koncových väzbách, zatiaľ čo β-amyláza pôsobí tak, že uvoľňuje maltózové jednotky počínajúc od neredukujúceho konca polyglukánového reťazca. Predpokladá sa, že subce2 luláma lokalizácia α-amylázy v apoplastickom priestore rastlinných buniek odráža tú skutočnosť, že enzým je normálne secemovaný. Ale pri rade rastlín, ako je napr. ryža (Chen á kol., 1994) a cukrová repa (Li a kol., 1992), je enzým lokalizovaný tiež vnútri chloroplastov a amyloplastov, hoci bolo zistené, že signálne sekvencie na aminokonci radu α-amylázových proteínov sú charakteristické pre translokáciu proteínu cez membránu ER skôr ako plastidovú membránu (Chen a kol., 1994). V štúdii, kde promótor a signálne sekvencie génu α-amylázy ryže boli fiizované s bakteriálnym genóm GUS a vnesené do ryže, tabaku a zemiaka pomocou transformácie sprostredkovanej Agrobacterium (Chen a kol., 1994), bolo ukázané, že exprimovaný fúzny proteín GUS bol najskôr transportovaný do endoplazmatického retikula a až potom do kultivačného média suspenznej kultúry pripravenej z transgénnych buniek. Bolo tiež ukázané v rade štúdií, že α-amyláza degraduje natívne molekuly škrobu.

Naproti tomu in vitro štúdie ukázali, že β-amyláza nedegraduje natívne škrobové zrná, bez toho, aby predtým neboli naštiepené inými enzýmami. Mutanty ryže (Daussant a kol. 1981) a sóje (Hildebrand a Hymowitz 1981) postrádajúce aktívnu β-amylázu alebo obsahujúce len stopovú aktivitu zjavne prejavujú normálny rast a vývoj. Okrem toho transgénne rastliny Arabidopsis so silne redukovanou hladinou β-amylázy neprejavujú významné rastové defekty (Mita a kol. 1997). Pokusy definovať presne fyziologickú úlohu β-amylázy, boli zmarené nejednoznačnými údajmi týkajúcimi sa subcelulárnej lokalizácie. Hoci jedna štúdia (Kafekuda a kol. 1986) opísala prítomnosť dvoch β-amyláz v chloroplastoch hrachu, väčšina štúdií zahŕňajúcich druhy, ako je Vicia faba, jačmeň, pšenica, sója, topinambur a hrach, viedla k záveru, že väčšina, pokiaľ nie všetky, β-amylázovej aktivity je extrachloroplastová (Nakamura a kol. 1991). Tento názor je podporený skutočnosťou, že dosiaľ klonované gény β-amylázy kódujú proteíny, ktoré postrádajú aminokoncovú sekvenciu chloroplastového tranzitného peptidu.

Pri obilninách boli opísané tie typy β-amylázy: forma špecifická pre endosperm, ktorá sa akumuluje počas dozrievania obilky, forma syntetizovaná de novo v aleurónových bunkách ryže a kukurice počas klíčenia (Wang a kol. 1996, 1997) a β-amyláza, ktorá je všade prítomná vo vegetatívnych orgánoch. Pri Arabidopsis táto všade prítomná forma predstavuje približne 80 % celkovej aktivity degradujúcej škrob pri listoch v ružici. Spoločne so všetkými ostatnými dodnes klonovanými génmi β-amylázy ani gén pre všade prítomnú formu z Arabidopsis nekóduje proteín so subcelulámym smerovacím signálom, takže enzým je pravdepodobne lokalizovaný v cytozole.

Zistenie radu štúdií, že degradatívne aktivity môžu byť odstránené bez škodlivých následkov na životaschopnosť rastliny, a navyše subcelulárnej lokalizácie enzýmov degradujúcich škrob mimo plastid, sú veľmi prekvapujúce. Zjavná neprítomnosť β-amylázovej aktivity lokalizovanej v plastide je osobitne prekvapujúca v svetle toho, že očakávaný hlavný koncový produkt β-amylázovej aktivity, najmä maltóza, bol identifikovaný ako produkt degradácie škrobu v izolovaných chloroplastoch (Peavey a kol., 1977). Nedávno bolo ukázané, že tak maltóza ako glukóza sú exportované z izolovaných amyloplastov pupeňov karfiolu počas mobilizácie škrobu (Neuhaus a kol., 1995).

Možnosť ovplyvniť množstvo škrobu v plastidoch listov alebo rezervných orgánov by bola veľmi prínosná pre rôzne priemyselné procesy, v ktorých sa používa rastlinný škrob. Tak napr. pri pokuse zvýšiť obsah škrobu v zemiakových hľuzách bolo už skôr ukázané, že keď bola ADPG PPáza glgC16 z E. coli nadmerne exprimovaná („overexpression“) v transgénnych zemiakových hľuzách, bol zvýšený tok uhlíka do škrobu, ale zvýšenie čistej akumulácie škrobu bolo len veľmi malé (Sweetlove a kol., 1997). Analýza enzýmových aktivít pri „overexprimujúcich“ líniách ukázala, že okrem zmeny v ADPG PPáze bola zmenená tiež aktivita amylázy, konkrétne β-amylázy. Tieto údaje nasvedčujú o tom, že akumulácii škrobu v hľuzách „overexprimujúcich“ proteín glgC16 je zabránené rozpadom novo syntetizovaného škrobu, t. j. dochádza k metabolickému obratu škrobu.

V inom príklade dostupnosť škrobu počas prípravy sladu veľmi tesne korelovala s typom a množstvom degradačných enzýmových aktivít v rastline, predovšetkým v rezervných orgánoch. Zvýšenie degradatívnej kapacity v plodine by urobilo proces prípravy sladu zo zrna obilnín alebo premenu škrobu z hľúz alebo iných orgánov na alkohol oveľa účinnejší.

Typ škrobu prítomného v rezervných orgánoch závisí od foriem a aktivít ADPG pyrofosforylázy, syntázy škrobu, vetviaceho enzýmu a degradačných enzýmov, ktoré sú prítomné. Interakcia medzi rôznymi enzýmami je tiež dôležitá.

Existuje značný záujem o vytvorenie nových druhov škrobu in planta, pretože by to znížilo náklady na ich ďalšie spracovanie a modifikáciu pred použitím v rôznych oblastiach priemyslu, ako napr. v priemysle potravinárskom, papierenskom, farmaceutickom, textilnom a pri výrobe lepidiel a olejov. Nasledujúce príklady ukazujú, ako aktivita hydrolyzujúca škrob môže byť dôležitá pre zmenu štruktúry škrobu in vivo.

Bolo ukázané, že v zrnách kukurice, mutácia „sugaryl“ spôsobuje absenciu enzýmu rušiaceho vetvenie, ktorý hydrolyzuje a-l,6-glykozylové väzby škrobu (James a kol., 1995). Mutácia vedie k zníženej koncentrácii amylopektínu a akumulácii vysoko rozvetvených glukopolysacharidov, fytoglykogénu.

Bolo ukázané na hrachu, že krátke oligosacharidové molekuly, počínajúc maltózou a pridávaním ďalšej glukózy až po maltoheptózu, špecificky stimulujú aktivitu syntázy škrobu I viazanej na škrobové zrná

SK 288125 Β6 (GBSSI)(Denyer a kol., 1996). Tento enzým je všeobecne považovaný za hlavný enzým zodpovedný za syntézu amylózy (napr. van der Leij a kol., 1991, Hylton a kol., 1995, Ainsworth a kol., 1993). Manipulácia aktivity GBSSI riadením dodávky malto-oligosacharidov je predmetom patentovej prihlášky (WO 97/16554), ktorá navrhuje, že zvýšenie koncentrácie malto-oligosacharidov, a teda zvýšenie pomeru amylózy k amylopektínu v škrobe, je možné dosiahnuť vnesením degradačných enzýmov, najmä a-amylázy, β-amylázy, disproporcionačného enzýmu, enzýmu rušiaceho rozvetvenie a fosforylázy škrobu. Patentová prihláška WO 97/16554 ďalej tvrdí, že gény pre plastidové izoformy týchto enzýmov boli klonované. Ako bolo už diskutované, žiadny dosiaľ izolovaný gén pre β-amylázu nekóduje enzým β-amylázu s proteínovou smerovacou sekvenciou a navyše, nie je žiadna pochybnosť o tom, že α-amylázy sú pôvodne smerované do plastidov (Chen a kol., 1994, Chán a kol., 1994). V patentovej prihláške WO 97/16554 je tiež odkaz na genetickú úpravu vhodnej cDNA sekvencie β-amylázy doplnením plastidovej smerovacej sekvencie.

Okrem priemyselného využitia škrobu z rezervných orgánov má množstvo škrobu v listoch značný význam pre pestovanie plodín. Škrob je syntetizovaný v listoch počas dňa z oxidu uhličitého fixovaného v procese fotosyntézy. Škrob sa ukladá v chloroplastoch a rozkladá sa v noci, keď sa stáva zdrojom energie a medziproduktov pre metabolizmus rastliny. Akým mechanizmom je v rastline riadený vzťah zdroja a spotreby („source-sink“), nie je dosiaľ známe, ale je jasné, že ovplyvnenie množstva a dostupnosti škrobu v listových plastidoch má význačný vplyv na produktivitu rastlín (biomasa a úroda).

Množstvo škrobu v liste je tiež významné pri tých plodinách, kde list je hlavnou komoditou, napr. pri tabaku. Je známe, že obsah škrobu má vplyv na vôňu tabaku pri fajčení. Prostriedky na ovplyvnenie hladiny škrobu v tabakových listoch by teda boli zaujímavé pre tabakový priemysel.

Podstata vynálezu

V predkladanom vynáleze je prvýkrát opísaná izolácia cDNA kódujúca nový enzým β-amylázu, ktorý je smerovaný do plastidov (preto označovaný ako β-amyláza smerovaná do chloroplastu, alebo chloroplastová β-amyláza, ct β-amyláza), vďaka novej smerovacej („targeting“) sekvencii. Izolácia celej tejto kódujúcej sekvencie bola prekvapivá, pretože sa všeobecne predpokladalo, že β-amyláza sa podieľa iba na hydrolýze škrobu, len čo sa uvoľnia malé menšie polyglukánové fragmenty, buď translokáciou alebo porušením membrány, z plastidu do cytoplazmy. Lokalizácia enzýmu v plastidoch otvára nepredvídané možnosti, že by sa ct β-amyláza účastnila degradácie tranzientného škrobu v chloroplastoch a rezervného škrobu v amyloplastoch. Podobnosť vlastností medzi chloroplastmi a amyloplastmi (Thomson a Whatley, 1980) je dôležitá vo vzťahu k predkladanému vynálezu, pretože bolo ukázané, že tranzitné peptidy z polypeptidov smerovaných do chloroplastu môžu importovať heterológne polypeptidy do amyloplastov a naopak. Tak napr. tranzitný peptid syntázy škrobu viazanej na škrobové zrná kukurice, keď bol fúzovaný s β-glukuronidázou (GUS) z E. coli, importoval proteín GUS nielen do amyloplastov, ale tiež do chloroplastov (Klosgen a Weil, 1991). Okrem toho pôvodcovia ukázali, že expresia génu ct-Bmy v Arabidopsis a expresia fúzy „promotor ct-£/ny:GUS“ v transgénnom tabaku môžu byť regulované nezávisle tak svetlom ako sacharózou. To je veľmi prekvapujúce vzhľadom na známu veľmi tesnú väzbu induktívnej reakcie AT β-Amy na svetlo a cukry (Mita a kol., 1995).

Predkladaný vynález poskytuje sekvenciu nukleovej kyseliny opísanú tu ako sekvencia id. č. 1 zahŕňajúcej nukleotidy 1 až 294 a obsahujúcej sekvenciu schopnú smerovania ďalšej kódujúcej sekvencie do rastlinného plastidu, alebo sekvenciu aspoň zo 65 % alebo viac homológnu s opísanou sekvenciou id. č. 1 a majúcou rovnaké smerovacie schopnosti.

Výhodne sekvencia nukleovej kyseliny kóduje 94 aminokyselinových zvyškov a výhodne 85 aminokyselinových zvyškov.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje sekvenciu nukleovej kyseliny opísanú tu ako sekvencia id. č. 2 zahŕňajúcej nukleotidy 1 až 1642 a obsahujúcej sekvenciu schopnú kódovať β-amylázu, alebo sekvenciu aspoň zo 65 % alebo viac homológnu s opísanou sekvenciou id. č. 2 a majúcu rovnaké kódujúce schopnosti. Predkladaný vynález ďalej poskytuje sekvenciu nukleovej kyseliny opísanú tu ako sekvencia id. č. 3 zahŕňajúcej nukleotidy 1 až 1953 a obsahujúcej sekvenciu schopnú kódovať β-amylázu smerovanú do chloroplastu, alebo sekvenciu aspoň zo 65 % alebo viac homológnu s opísanou sekvenciou id. č. 3 a majúcou rovnaké kódujúce schopnosti.

K homológnym sekvenciám patria sekvencie, ktoré hybridizujú so sekvenciami id. č. 1, 2 alebo 3 za stredne stringentných podmienok (definované premývaním v 2 x SSC pri 65 °C).

Výhodne je sekvencia nukleovej kyseliny mRNA alebo cDNA, ale môže to byť i genómová DNA.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje spôsob zvýšenia alebo zníženia aktivity v rastline enzýmu v biosyntéze alebo degradácii škrobu. Tento spôsob obsahuje kroky, pri ktorých sa trvalo inkorporuje do rastlinného genómu chimérický gén obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúci do plastidu smerovaciu sekvenciu a kódujúci sekvenciu enzýmu metabolickej dráhy biosyntézy alebo degradácie škrobu, a regeneruje sa rastlina majúca zmenený genóm, pričom sekvencia nukleovej kyseliny obsahuje sekvenciu id. č. 1.

SK 288125 Β6

Predkladaný vynález tiež poskytuje spôsob smerovania proteínov alebo enzýmov do rastlinných plastidov. Tento spôsob obsahuje kroky, kde sa trvalo inkorporuje do rastlinného genómu chimérický gén obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúci do plastidu smerovaciu sekvenciu a kódujúci sekvenciu enzýmu metabolickej dráhy biosyntézy alebo degradácie škrobu, a regeneruje sa rastlina majúca zmenený genóm, pričom protein alebo enzým je jeden alebo niekoľko v metabolickej dráhe z nasledujúcich skupín: syntéza lipidov, fotosyntéza, metabolizmus aminokyselín, fixácia dusíka, fixácia uhlíka alebo syntéza uhľovodíkových polymérov, alebo je schopný udeliť rastline znak, ktorý je vybraný z jednej alebo niekoľkých nasledujúcich skupín: rezistencia k herbicídu, rezistencia k škodcom, napr. k hubám, baktériám alebo vírusom.

Predkladaný vynález poskytuje rastliny nesúce chimérický gén, ktorý obsahuje promótor, kódujúcu sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej do plastidu smerovaciu sekvenciu, tzn. sekvenciu schopnú smerovať kódujúcu sekvenciu enzýmu metabolickej dráhy biosyntézy alebo degradácie škrobu do rastlinného plastidu, a terminátor.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje sekvenciu nukleovej kyseliny schopnú riadiť expresiu produktu kódovaného kódujúcou sekvenciou, s ktorou je operatívne spojená, pričom táto sekvencia je tu uvedená ako sekvencia id. č. 8, alebo sekvenciu aspoň zo 65 % alebo viac homológnu s touto sekvenciou a majúcu v podstate rovnakú funkciu, a táto sekvencia nukleovej kyseliny odpovedá na stimul, pričom hladina expresie produktu sa mení v závislosti od stimulu pôsobiaceho na sekvenciu nukleovej kyseliny.

Predkladaný vynález ďalej poskytuje spôsob zmeny hladiny expresie produktu kódovaného kódujúcou sekvenciou operatívne spojenou so sekvenciou nukleovej kyseliny schopnou smerovať expresiu produktu v rastline. Tento spôsob obsahuje kroky, kde sa trvalo inkorporuje do rastlinného genómu chimérický gén obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny schopnú smerovať expresiu produktu kódovaného kódujúcou sekvenciou, ktorá je s ňou operatívne spojená, pričom sekvencia nukleovej kyseliny má v podstate sekvenciu id. č. 8 alebo je s ňou aspoň zo 65 % homológna a má v podstate rovnakú funkciu a tiež odpovedá na stimul.

Výhodne je stimulom prítomnosť alebo absencia svetla a/alebo rôzne hladiny cukru. Alternatívne je stimulom taký stimul, ktorý je riadený vývojovo.

Výhodne je cukor jeden zo sacharózy a glukózy alebo obidva.

Výhodne je cukor sacharóza.

Výhodne indukovateľný promótor, alebo sekvencia nukleovej kyseliny schopná riadiť expresiu produktu v rastline, pracuje za podmienok, keď je neprítomné svetlo, ale je prítomný cukor, alebo kde nie je prítomný cukor, aleje prítomné svetlo. Rastlinné pletivo, kde je neprítomné svetlo, aleje prítomný cukor, je napr. podzemný orgán alebo tzv. „sinkový“ orgán (t. j. orgán spotrebovávajúci produkty fotosyntézy). Príkladom podzemného orgánu sú hľuzy, rhizómy alebo korene, zatiaľ čo sinkovým orgánom môže byť napr. mladý list alebo semeno.

Pletivom rastliny, kde nie je prítomný cukor, ale je prítomné svetlo, je napr. starý list (kam nie je transportovaný žiaden cukor), časti kvetu alebo klíčiace semená.

Konštrukty DNA a chimérické gény majúce skôr opísané vlastnosti predstavujú ďalší aspekt predkladaného vynálezu.

Rastlinné bunky obsahujúce chimérický gén obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej plastidovú smerovaciu sekvenciu opísanú skôr a kódujúcu sekvenciu nukleovej kyseliny enzýmu metabolickej dráhy biosyntézy alebo degradácie škrobu, alebo chimérický gén obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny schopnú smerovať expresiu ďalšej kódujúcej sekvencie, alebo chimérický gén obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny opísanú skôr, ktorá odpovedá na stimul aplikovaný na nukleovú kyselinu, rovnako ako semená transformovaných rastlín obsahujúce jeden alebo viac chimérických génov podľa vynálezu.

Výhodne je plastidová smerovacia sekvencia uvedená tu ako sekvencia id. č. 1.

Podľa prvého aspektu vynálezu sa spôsob podľa vynálezu používa na zmenu metabolizmu listu, aby v ňom bol akumulovaný škrob alebo aby z neho bol škrob mobilizovaný, takže tento spôsob mení reláciu zdroj-miesto spotreby („source-sink“) v rastline ako celku. To je možné dosiahnuť poskytnutím smerovacej sekvencie a sekvencie nukleovej kyseliny kódujúcej enzým metabolickej dráhy biosyntézy alebo degradácie škrobu, riadenej vhodným promótorom. Vhodný výber promótora poskytne rastliny so zvýšenou alebo zníženou hladinou škrobu v listoch, čo môže byť užitočné napr. pre tabakový priemysel, alebo alternatívne povedie k zmenám výnosu škrobu v rôznych iných rastlinných pletivách, ako sú hľuzy, plody a korene, po modifikácii vzťahu source-sink v rastline.

V tomto rozpracovaní vynálezu vhodný promótor riadi expresiu plastidovej smerovacej sekvencie a kódujúcej sekvencie enzýmu metabolickej dráhy biosyntézy alebo degradácie škrobu v celej rastline, ide o tzv. konštitutívnu expresiu, a/alebo špecificky len v listoch. Také zmeny majú výrazný účinok, takže sa mení obsah škrobu a/alebo výnos orgánov rastliny.

Výhodný promótor schopný riadiť expresiu vo všetkých rastlinných pletivách je promótor z génu 35S vírusu mozaiky karfiolu. Na expresiu v listoch je výhodný promótor z génu pre malú podjednotku ribulózabisfosfátkarboxylázy alebo génu pre plastokyanín z hrachu. Odborníkovi sú známe ďalšie vhodné promótory na konštitutívnu expresiu alebo na špecifickú expresiu v listoch, ako je napr. promótor nopalínsyntázy alebo

SK 288125 Β6 promótor génu pre proteín viažuci chlorofyl a/b.

Kódujúca sekvencia, alebo jej časť, enzýmu metabolickej dráhy biosyntézy alebo degradácie škrobu je usporiadaná v smere zhodnom s normálnym čítacím rámcom, t. j. v usporiadaní „sense“, alebo v smere opačnom k normálnemu čítaciemu rámcu, t. j. v usporiadaní „antisense“. Zosilňovanie alebo zoslabovanie enzýmovej aktivity pomocou techniky „sense“, „antisense“ alebo tzv. kosupresie (táto technika bola opísaná DNAP v európskych patentoch č. 0465572 a 0647715).

V druhom aspekte vynálezu sa spôsob podľa vynálezu používa na zmenu metabolizmu škrobu v rezervných orgánoch tak, aby sa obsah škrobu zvýšil a/alebo sa získal škrob vo vhodnej forme, ktorá je požadovaná pre určitý priemyselný proces. K takým priemyselným procesom patrí napr. výroba papiera, liečiv, textílií, farbív a stavebných hmôt, ďalej výroba pečiva, mliečnych produktov a občerstvení, výroba konzervovaných, sušených alebo instantných potravín, výroba sladu a tiež výroba sirupov a alkoholu.

V prvom alebo druhom aspekte vynálezu je výhodným enzýmom na použitie v chimérickom géne podľa vynálezu jeden z enzýmov metabolickej dráhy degradácie škrobu, t. j. enzým degradujúci škrob. Výhodne chimérický gén obsahuje β-amylázu smerovanú do chloroplastu (ďalej označovanú ako ct β-amylázu) a výhodnejšie obsahuje β-amylázu pochádzajúcu z Arabidopsis thaliana (ďalej označovanú ako At ct β-amylázu), pozri tiež sekvenciu id. č. 3. Sekvencie homológne so sekvenciou At ct β-amylázy, ktoré sú získateľné z rastlín, ako je zemiak, tabak, pšenica, kukurica a jačmeň, sa môžu tiež použiť. Štandardné postupy klonovania hybridizácií alebo polymerázovej reťazovej reakcie (PCR) sa môžu použiť na izoláciu požadovaných sekvencií z týchto rastlín, metódy klonovania molekúl boli opísané napr. v príručke Sambrook a kol. 1990, a metódy PCR boli opísané napr. v publikácii Innes a kol., 1990. K ďalším enzýmom degradujúcim škrob, ktorých jedna alebo viac kódujúcich sekvencii by boli vhodné na použitie s plastidovou smerovacou sekvenciou, patrí α-amyláza, disproporcionačný enzým, enzým rušiaci vetvenie, fosforyláza škrobu, α-glukozidáza a neplastidová β-amyláza.

V druhom aspekte vynálezu je výhodný promótor, ktorý riadi expresiu špecificky v rezervných orgánoch rastlín, vybraný zo skupiny génov obsahujúci gén pre gluteníny s vysokou molekulovou hmotnosťou z endospermu pšenice, gén pre α,β-gliadín z endospermu pšenice, gén pre hordeín z endospermu jačmeňa, gén pre patatín z hľúz zemiaka. Odborníkovi sú známe aj ďalšie vhodné promótory.

V obidvoch aspektoch vynálezu je možné dosiahnuť to, aby zmeny metabolizmu v pletive alebo zmena typu, alebo vlastností škrobu boli reakciou na stimul, t. j. indukovateľné, a síce tým, že sa použije indukovateľný promótor tu opísaný ako sekvencia id. č. 8. Tak napr. indukovateľnosť promótora svetlom môže byť využitá na manipuláciu semien indukciou génov, ako je bamáza (príkladom je WO 98/10081) na ovplyvnenie vývoja peľu, alebo na ovplyvnenie génov, ktoré nereagujú na svetlo, v procesoch, ktoré sú inak od svetla závislé, ako je zretie plodov alebo klíčenie semien. Svetlom indukovateľný promótor môže byť použitý tiež na zapínanie génov, ktoré ovplyvňujú produkciu sekundárnych metabolitov v listoch, napr. produkciu alkaloidov. Svetlom indukovateľný promótor môže byť ďalej použitý na manipuláciu génov enzýmov biosyntézy škrobu v listoch alebo iných fotosyntetických pletivách, alebo napr. na zapínanie génov po odstránení hľúz, napr. na skladovanie v temne. Indukovateľnosť promótora cukrom môže byť využitá napr. na reguláciu génov vyvíjajúcich sa hľúz alebo iných nefotosyntetických pletív, napr. génov rezistencie k škodcom a/alebo génov, ktoré ovplyvňujú pozberovú kvalitu úrody. Tak napr. pri zemiaku by boli veľmi výhodné gény rezistencie k plesniam a hnilobám, ktoré by boli výhodne klonované s promótorom indukovateľným cukrom. Alternatívne indukovateľnosť promótora cukrom môže byť využitá na riadenie expresie génov pre selekčné markéry v tkanivových kultúrach.

Odborník ľahko nájde v sekvencii id. č. 8 element reagujúci na cukor a/alebo svetlom indukovateľný element, a síce použitím známych metód, napr. delečnej štúdie. Tak napr. Pwee a Gray (1993) opísali delečnú štúdiu génu plastokyanínu hrachu použitím markérového génu, v ktorej stanovili operatívne úseky promótora.

Metódy tu opísané alebo opísané napr. v laboratórnej príručke Sambrook a kol. (1989) alebo Gelvin a Stanton (1995) na klonovanie génových sekvencii a ich vkladaní do vhodných nosičov (vektorov, plazmidov a pod.) sú odborníkovi dostatočne známe, aby ich mohol prakticky realizovať.

Chimérické gény alebo gény skôr opísané sa môžu vniesť samotné alebo spoločne s ďalšími chimérickými génmi opísanými skôr. V prípade opísaných príkladov uskutočnenia vynálezu, keď sa používa prvý chimérický gén kódujúci enzým metabolickej dráhy degradácie škrobu, druhý chimérický gén môže obsahovať napr. sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcej enzým metabolické dráhy biosyntézy škrobu, rovnako riadenou vhodným promótorom a vhodným terminátorom. Promótor a/alebo terminátor druhého chimérického génu môže byť rovnaký alebo odlišný od promótora a/alebo terminátora prvého chimérického génu. Vhodné sekvencie kódujúce enzýmy metabolickej dráhy biosyntézy škrobu sú sekvencie nukleovej kyseliny kódujúce sacharózasyntázu, ADPG pyroosforylázu, syntázu škrobu, prípadne k nim patrí i vetviaci enzým, a-amyláza, izoamyláza, neplastidová β-amyláza, α-glukozidáza, fosforyláza škrobu a disproporcionačný enzým. Metódy na vnášanie jedného alebo viacerých chimérických génov do rastliny boli opísané a obsahujú konštrukciu binárneho vektora s chimérickými génmi navzájom spojenými v jednej molekule nukleovej kyseli6

SK 288125 Β6 ny, kotransformáciu použitím dvoch alebo viacerých odlišných buniek Agrobacterium, napr. s odlišnými binárnymi vektormi obsahujúcimi odlišné chimérické gény, alebo transformáciu rastliny, ktorá už obsahuje chimérický gén, druhým odlišným chimérickým génom, tzv. retransformáciu. V tomto druhom prípade spôsob selekcie transgénnych rastlín po vnesení druhého chimérického génu musí byť odlišný od spôsobu selekcie použitého po vnesení prvého chimérického génu. K vhodným selekčným markérom patria gény rezistencie k hygromycínu, kanamycínu, sulfónamidu a herbicídu Bašta. Je tiež možné použiť biologický postup, a síce kríženie dvoch rastlín, z ktorých každá obsahuje jeden chimérický gén.

Použitie dvoch konštruktov chimérických génov je vhodné na zmenu obsahu škrobu už transformovanej rastliny, ktorá vykazuje významné zvýšenie aktivity prvého enzýmu a následnú zmenu v syntéze škrobu.

Predkladaný vynález čiže ďalej poskytuje spôsob zmeny, v transgénnych rastlinách už so zvýšenou alebo zníženou enzýmovou aktivitou v dôsledku genetickej transformácie, ďalšieho enzýmu, aby bol tento enzým aktivovaný („upregulation“) alebo tlmený („downregulation“), a preto by bolo zvýšené alebo znížené množstvo škrobu produkovaného v retransformovanej rastline.

Výhodne prvá transformovaná rastlina je rastlina majúca zvýšenú aktivitu enzýmu v metabolickej dráhe biosyntézy škrobu. Príkladom pokusu o zvýšenie obsahu škrobu v rastline je transgénny zemiak transformovaný génom prw ADPG-PPázu, napr. glgCI6 (pozri napr. WO 91/19806). Zvýšenie obsahu škrobu v týchto rastlinách bolo relatívne malé. Táto prvá transformovaná rastlina bola vhodne retransformovaná chimérickým génom pre degradáciu škrobu, obsahujúcim napr. At ct β-amylázu. Protein glgC16)e exprimovaný v hľuzách prvej transformovanej rastliny a vedie k zvýšeniu aktivity ADPG-PPázy, a preto k zvýšeniu toku uhlíka do škrobu. Výhodne expresia chimérického génu At ct β-amylázy alebo jeho časti v retransformovaných hľuzách vedie k utlmeniu aktivity At ct β-amylázy, buď kosupresiou, alebo „antisense“ technológiou, a preto k zvýšeniu akumulácie škrobu.

Výhodne je expresia druhého enzýmu špecificky riadená v hľuzách. Vhodným promótorom na expresiu chimérického génu At ct β-amylázy špecifickej pre hľuzy je promótor z génu pre patatín.

Prvá transformovaná rastlina zemiaka exprimujúca g/gC/d je rezistentná ku kanamycínu, preto konštrukt binárneho vektora pre chimérický gén At ct β-amylázy nesie odlišný gén rezistencie, napr. výhodne gén rezistencie k sulfónamidu. Zvýšená tvorba škrobu v hľuzách zemiaka by bola prospešná napr. pre výrobcov zemiakových lupienkov, kde 1 % nárast sušiny zemiaka predstavuje 4 % nárast výrobku.

Výroba zemiakových lupienkov môže poslúžiť aj na ilustráciu ďalšieho prínosu vynálezu. Keď sú zemiakové hľuzy skladované pri teplote nižšej ako 8 °C, akumulujú sa redukujúce cukry, glukóza a fruktóza, vznikajúca rozkladom škrobu. Keď sa potom zemiaky smažia na lupienky, redukujúce cukry reagujú s aminokyselinami v Maillardovej reakcii, čím vzniká hnedé zafarbenie a nežiaduca pachuť produktu. Vnesenie takého chimérického génu do zemiaka, ktorý by zastavil rozklad škrobu, a preto akumuláciu redukujúcich cukrov, by bolo prospešné pre výrobcov pochutín. Výhodne taký chimérický gén obsahuje kódujúcu sekvenciu, alebo jej časť, ct β-amylázy v konštrukte pre kosupresiu alebo „antisense“ inhibíciu, riadenou vhodným promótorom a terminátorom. Vhodným promótorom je promótor z patatínového génu z hľúz zemiaka. Výhodne môže byť miesto ct β-amylázy použitý ktorýkoľvek z uvedených génov pre enzým degradujúci škrob.

Indukovateľný promótor v sekvencií id. č. 8 môže byť tiež v konštrukte použitý, pretože je požadovaná koordinovaná expresia vo vyvíjajúcom sa liste a vyvíjajúcej sa hľuze, pretože patatínový promótor je tiež indukovateľný cukrom (Rocha-Sosa eta 1., 1989). Podobne sekvencia pre chloroplastový smerovací polypeptid, t. j. sekvencia id. č. 1., môže byť tiež použitá s akýmkoľvek iným génom, ktorý postráda svoju vlastnú smerovaciu sekvenciu a pri ktorom je požadovaná plastidová lokalizácia.

Uvedené príklady slúžia na ilustráciu možných prínosov použitia predkladaného vynálezu. Odborníkovi je zrejmé, že existuje značné množstvo kombinácií génov a rastlín, na ktorých je možné vynález uplatniť.

K výhodným génovým kombináciám patrí ct β-amyláza s jedným alebo viacerými génmi pre sacharózasyntázu, ADPG pyrofosforylázu, syntázu škrobu, vetviaci enzým, α-amylázu, izoamylázu, neplastidovú β-amylázu, α-glukozidázu, fosforylázu škrobu a disproporcionačný enzým, ktorých sekvencie sú odborníkovi známe. Alternatívne môže byť použitá smerovacia sekvencia ct β-amylázy s jedným alebo niekoľkými z uvedených génov.

K rastlinám, ktoré môžu byť takto transformované, výhodne patrí zemiak, pšenica, kukurica, jačmeň, rajčiak, ryža, hrach, sója, podzemnica olejná, maniok, yam, banánovník a tabak.

V ďalšej časti je predkladaný vynález opísaný formou príkladov, a síce vzhľadom na výhodné uskutočnenia izolácie cDNA pre β-amylázu z Arabidopsis thaliana a inkorporácie tejto DNA do rastlín tabaku a zemiaka. V príkladoch sú tiež ukázané výhodné uskutočnenia promótora reagujúceho na stimul a jeho aktivity v transgénnej rastline.

Na lepšie vysvetlenie a ľahšiu realizáciu vynálezu budú ďalej uvádzané odkazy na nasledujúce obrázky ilustrujúce výhodné uskutočnenia vynálezu.

SK 288125 Β6

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1. ukazuje výsledky rádioaktívneho in vitro značenia importu translačných produktov na SDS-PAGE géli a nasledované fluorografiou. Legenda: markér (Štandard) molekulová hmotnosť - dráha M, translačné produkty - dráha Tr, chloroplasty reizolované a ošetrené termolyzínom po inkubácii - dráha C, stromatálna frakcia - dráha S, premyté tylakoidy - dráha T, termolyzínom ošetrené tylakoidy - dráha tT, frakcia vnútornej membrány - dráha I, frakcia vonkajšej membrány - dráha O. Domnelý prekuzor - P, intermediát -1 a zrelá forma β-amylázy - M. Kilodaltony - K.

Obr. 2. ukazuje účinok svetla a účinok svetla a cukru na expresiu transkriptov ct β-amylázy v semenáčkoch Arabidopsis thaliana. Obr. 2a ukazuje analýzu Northemovým prenosom (Northern blot) celkovej RNA z 5 týždňov starých rastliniek Arabidopsis thaliana pestovaných v pôde a vystavených 2 dňom súvislého osvetlenia - L, 2 dňom súvislej tmy - D, 2 dňom svetla nasledovaným ďalšími 3 dňami svetla - LL, a/alebo 2 dňom tmy nasledovaným 3 dňami svetla -DL. Obr. 2b ukazuje Northemovu analýzu celkovej RNA z 5 týždňov starých rastliniek Arabidopsis thaliana pestovaných in vitro, ktoré boli prenesené buď do vody a vystavené 3 dni súvislému osvetleniu - WL, alebo boli prenesené do 5 % sacharózy a vystavené 3 dni neprerušenej tme - SD alebo 3 dni neprerušenému svetlu - SL, alebo boli prenesené do 5 % glukózy a vystavené 3 dni neprerušenej tme - GD alebo 3 dni neprerušenému svetlu - GL. Northern bloty boli hybridizované s rádioaktívne značeným inzertom ct-Bmy cDNA, a potom podrobené autorádiografíi (horné panely, zodpovedajúce formaldehydové agarózové gély ofarbené etídiumbromidom sú ukázané na dolných paneloch).

Obr. 3. ukazuje schematické znázornenie T-DNA chimérického génu ct β-amylázy promótor GUS skonštruovaného v príklade 3, kde NosP predstavuje promótor nopalínsyntázy, NosT terminátor nopalínsyntázy, BR je invertovaná repetícia pravej hranice a BL je invertovaná repetícia ľavej hranice T-DNA z pBlOl, NPTII je kódujúca sekvencia neomycínfosfotransferázy II, GUS je kódujúca sekvencia β-glukuronidázy, fragmenty promótora ct β-amylázy sú ukázané ako čiarkované obdĺžniky, premosťujúce fragmenty Xhol-BamHI, amplifikované PCR sú uvedené čierne.

Obr. 4. ukazuje účinok svetla a sacharózy na aktivitu GUS exprimovanú z chimérického génu „ct Bmy-GUS promótor“ v semenáčkoch tabaku.

Obr. 5. ukazuje plazmidovú mapu donorového vektora pDV35S (SK)V.

Obr. 6. ukazuje plazmidovú mapu donorového vektora pDV02000.

Obr. 7. ukazuje plazmidovú mapu binárneho plazmidu pBNP 10431, kde 35S predstavuje 35S promótor z CaMV, ct bamy predstavuje úplnú cDNA ct β-amylázy, 35St predstavuje 35S terminátor z CaMV, RB je pravá hranica binárneho vektora pBibPlus, colElori je bakteriálny počiatok replikácie colEl z plazmidu RK2, nptll je gén neomycínfosfotransferázy pre bakteriálnu rezistenciu ku kanamycínu, LB je ľavá hranica binárneho vektora, kan je rekombinantný gén rastlinnej neomycínfosfotransferázy nutný pre rezistenciu rastlín ku kanamycínu.

Obr. 8. ukazuje plazmidovú mapu binárneho plazmidu pBNP10432, kde boli použité zhodné skratky ako na obr. 7.

Obr. 9. ukazuje plazmidovú mapu binárneho plazmidu pBNP02431, kde boli použité zhodné skratky ako na obr. 7, až na patp predstavujúci promótor patatínu triedy I z vektoru pDV02000 podľa obr. 6. a nost je terminátor nopalínsyntázy.

Obr. 10. ukazuje plazmidovú mapu binárneho plazmidu pBNP02432, kde boli použité zhodné skratky ako na obr. 9.

Prehľad sekvencii uvedených v zozname sekvencii

Sekvencia id. č. 1 je sekvencia nukleovej kyseliny schopnej smerovať kódujúcu sekvenciu do rastlinného plastidu, najmä chloroplastu.

Sekvencia id. č. 2 je nukleová kyselina kódujúca β-amylázu.

Sekvencia id. č. 3 je úplná sekvencia β-amylázy smerovanej do chloroplastu (ct β-amylázy).

Sekvencie id. č. 4 a 5 sú oligonukleotidové prajmery použité na amplifikáciu v príklade 3.

Sekvencie id. č. 6 a 7 sú oligonukleotidové prajmery použité na amplifikáciu v príklade 4.

Sekvencia id. č. 8 je nukleová kyselina reagujúca na stimul, konkrétne na svetlo a/alebo cukor.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Izolácia a charakterizácia chloroplastovej β-amylázy Arabidopsis thaliana

Sekvenovanie inzertu cDNA v pBmy81

Prehľadávanie databázy nukleotidových sekvencii DNA fragmentu veľkosti 37 kb z chromozómu IV Arabidopsis thaliana v kozmide G16599 (Bevan a kol., 1998) pomocou programu BLASTN odhalilo prí8

SK 288125 Β6 tomnosť génu majúceho významnú homológiu s extrachloroplastovou β-amylázou z Arabidopsis, jačmeňa, kukurice, sóji a ryže. Prieskum tiež identifikoval niekoľko 3'-koncových EST sekvencii, z ktorých jedna, EST 81E10T7 (Newman a kol., 1995), ďalej nazývaná pBmy81, bola identická asi v úseku 300 nukleotidov. Kloň EST 81E10T7 bol získaný z Arabidopsis Biological Reource Center (ABRC) DNA Stock Center (Ohio University, USA). „Nested“ sada Bal31 delečných subklonov, zahŕňajúca cDNA inzert v pBmy81, bola použitá ako templát v dvojreťazcovej sekvenačnej PCR s univerzálnymi fluorescenčné značenými prajmermi. Sekvenačná reakcia bola analyzovaná na automatickom sekvenačnom zariadení Applied Biosystems Model 373A. Nukleotidová sekvencia cDNA inzertu v klone pBmy81 je tu uvedená ako sekvencia id. č. 3. Konštrukt pBmy81 bol firmou Advanced Technologies (Cambridge) Limited, 210 Cambridge Science Park, Cambridge CB4 4WA, uložený dňa 4. augusta 1998 v súlade s Budapeštianskou dohodou v Národnej zbierke mikroorganizmov, National Collection of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Street, Aberdeen, Škótsko, a síce ako vzorka č. NCIMB 40964.

Identifikácia domnelého chloroplastového smerovacieho signálu

CDNA inzert pBmy81 obsahuje 36 netranslatovaných nukleotidov na 5'-konci, otvorený čítací rámec (ORF), ktorý kóduje protein zložený z 548 aminokyselín, a 3'-koncový netranslatovaný úsek (UTR) s veľkosťou 232 bp. Proten kódovaný inzertom pBmy81 má predikovanú molekulovú hmotnosť 61 kDa a má značnú aminokyselinovú podobnosť s rastlinou extrachloroplastovou β-amylázou z kukurice, ryže, jačmeňa, sóje a topinambura. Ale protein kódovaný pBmy81 sa líši od všetkých dosiaľ opísaných β-amyláz tým, že obsahuje jedinečnú A-koncovú extenziu majúcu vlastnosti choroplastového smerovacieho signálu, t. j. vysoký obsah serínu (16 %), treonínu (10 %) a pozitívne nabitých aminokyselinových zvyškov (15 %)(Baier a Dietz, 1997). Tri domény, ktoré sú rozlišujúce charakteristikou chloroplastových smerovacích signálov (Schatz Dobberstein, 1996), boli identifikované v signálnej sekvencii: nenabitá amino-koncová doména, centrálna doména bohatá na hydroxylované aminokyseliny, karboxy-koncová doména s potenciálom vytvárať amfifilný β-reťazec.

CDNA inzert v pBmy81 kóduje β-amylázu smerovanú do chloroplastu

Z 50 až 60 g nadzemnej časti rastlín hrachu (Pisum sativum L. var. Feltham First) boli izolované chloroplasty pomocou gradientu Percollu. Rastliny boli pestované a izolácia chloroplastov bola vykonaná ako bolo opísané v Mould a Gray (1997a).

Plazmid pBmy81 bol linearizovaný reštrikčným štiepením Nôti, a potom bol transkribovaný in vitro použitím T7 RNA polymerázy. Rádioaktívne značený prekurzorový protein, obsahujúci ³⁵S-metionín a ³⁵S-cysteín, bol syntetizovaný v translačnom systéme z pšeničných klíčkov v podstate zhodne s postupom v Mould a Gray (1997b).

Import rádioaktívne značených in vitro translačných produktov bol vykonaný rovnako ako opísali Mould a Gray (1997b). Po inkubácii s impotom boli intaktné chloroplasty ošetrené termolyzínom (0,2 mg/ml výsledná koncentrácia v importovom tlmivom roztoku) a súčasne inkubované 30 minút na ľade, potom bola proteázová reakcia zastavená pridaním EDTA do výslednej koncentrácie 50mM v importovom tlmivom roztoku. Chloroplasty boli reizolované cez vankúš 40 % Percollu v importovom tlmivom roztoku, a potom opláchnuté v imporotovom tlmivom roztoku (Mould a Gray, 1997b). Alikvót (1/10) vzorky termolyzínom ošetrených chloroplastov bol odobraný na analýzu a zvyšok bol frakcionovaný v podstate postupom, ktorý opísali Schnell a Blobel (1993). Vzorky termolyzínom ošetrených chloroplastov, frakcie stromatu, tylakoidov a termolyzínom ošetrených tylakoidov boli kvantifikované na SDS-PAGE, a potom farbením Coomasie modrosťou a vyhodnotené denzitometriou zodpovedajúcich proteínových pásov (ako štandardy boli použité podjednotky ribulózabisfosfát-karboxylázy a proteiny svetlozbemého komplexu). Ekvivalentné množstvá týchto frakcií (približne zodpovedajúce 2 % chloroplastov získaných na gradiente Percollu) a 505 frakcií vnútornej a vonkajšej membrány bolo analyzovaných elektroforézou na 10 % polyakrylamidovom géli v prítomnosti SDS, a potom fluorografiou. Výsledky (obr. 1) ukázali, že hlavný translačný produkt (dráha Tr) mal veľkosť približne 58 kDa. Keď boli izolované intaktné chloroplasty hrachu inkubované s rádioaktívne značeným proteínom v prítomnosti ATP, boli detekované polypeptidy s veľkosťou 50 kDa a 48 kDa (dráha C). Rezistencia týchto polypeptidov k degradácii exogénne pridaným termolyzínom ukazuje, že ide o produkty importu rádioaktívne značeného proteínu. Frakcionácia intaktných termolyzínom ošetrených chloroplastov na frakcie stromatu, premytých tylakoidov, termolyzínom ošetrených tylakoidov, vnútornej a vonkajšej membrány, ukázala, že dva rádioaktívne značené polypeptidy boli lokalizované v stromatálnej frakcii.

Príklad 2

Indukcia génu ct β-amylázy z Arabidopsis thaliana sacharózou a svetlom

Na demonštráciu indukcie génu ct β-amylázy svetlom rastliny Arabidopsis thaliana ekotypu Landsberg boli pestované v skleníku pri režime 18 hodín svetla, 6 hodín tmy, 18° C. Po 5 týždňoch boli dve platá so semenáčkami prenesené do úplnej tmy a dve platá boli ďalej ponechané na kontinuálnom svetle. Po dvoch

SK 288125 Β6 dňoch bolo po jednom plate rastlín adaptovaných na tmu a na svetlo použité na izoláciu celkovej RNA a druhé plató každého variantu bolo počas ďalších 3 dní ponechané na kontinuálnom svetle.

Na kombinovaný pokus sacharóza-svetlo-tma boli semená Arabidopsis thaliana ekotypu Landsberg povrchovo sterilizované, umiestnené na MS agarové médium obsahujúce 1 % sacharózu a pestovaná v rastovej komore pri režime 18 hodín svetla, 6 hodín tmy. 5 týždňov staré semenáčky boli prenesené do sterilnej vody alebo do 5 % roztoku sacharózy alebo glukózy vo vode. Tieto rastlinky boli potom ponechané 3 dni buď na kontinuálnom svetle, alebo v kontinuálnej tme. Z každého pokusného variantu bola pripravená celková RNA a analyzovaná Northemovým prenosom postupom, ktorý opísali Eggermont a kol. (1996). Membrány s prenesenou RNA boli testované so sondou, ktorou bol cDNA inzert z pBmy81 po náhodnom značení ³²P-dCTP postupom, ktorý opísali Feinberg a Vogelstein (1983).

Výsledky, uvedené na obr. 2A, ukazujú, že transkripty ct β-amylázy sú indukované v tme 5 % sacharózou a v menšom rozsahu 5 % glukózou. Táto indukcia je v prítomnosti cukrov navyše zosilnená na svetle. Tieto výsledky tiež ukázali, že účinky svetla a cukrov sú navzájom nezávislé.

Príklad 3

Konštrukia fúzy „promótor ct β-amylázy - GUS“

Promótorový fragment bol izolovaný z génu ct β-amylázy lokalizovanom v kozmide G16599 (Bevan a kol., 1998) vyštiepením reštrikčnými enzýmami. Vhodné reštrikčné miesto v promótore bola HindlII v pozícii -1662 bp (počínajúc 19179 bp mínus reťazce sekvencie id. č. 8), Sali v pozícii -1127 bp a PstI v pozícii-371 bp a Xhol v pozícii +21 bp „downstream“ od iniciačného metionínu bola použitá na izoláciu troch promótorových fragmentov rôznych dĺžok a sekvencie tranzitného peptidu (A z kodónu ATG iniciácia translácie je číslovaná +1).

Fragment s veľkosťou 294 bp (sekvencia id. č. 1) génu pre ct β-amylázu lokalizovaného v kozmide G16599 (Bevan a kol., 1998) bol amplifikovaný pomocou nasledujúcich oligonukleotidových prajmerov: Sekvencia id. č. 4:

Pl: 5'-ATT TCC TCG AGT TCT CTT ATC-3'

Sekvencia id. č. 5:

P2: 5'-cgg gAT CCC TGA CAT TGT TAC-3'

V prajmere Pl podtrhnutej bázy zodpovedajú štiepnemu miestu Xho v pozícii +21 bp, v prajmere P2 bázy vyznačenej malými písmenami zodpovedajú nukleotidom pridaným na vytvorenie miesta BamHI.

Chimérické gény „promótor ct β-amylázy - GUS“ boli vytvorené trojitou ligáciou promótorového fragmentu, premosťujúceho PCR fragmentu naštepeného Xhol a BamHI a GUS vektora pBHOl (Jefferson a kol., 1987) naštiepeného HindlII- BamHI, Sall-BamHI alebo Pstl-BamHI (obr. 3). Konštrukty boli nazvané Ηβΰυβ, 8βΰυ8 a Ρβσυ8.

Konštrukty chimérických génov boli prenesené do Agrobacterium tumefaciens LBA4404 triparentálnou konjugáciou (Bevan 1984), a potom vnesené do rastlín Nicotiana tabaccum var. Samsun metódou transformácie listových terčíkov (Horsch a kol., 1985).

Príklad 3A

Indukcia chimérického génu „promótor ct β-amylázy z Arabidopsis thaliana - GUS“ sacharózou a svetlom v semenáčkoch tabaku

Rastliny obsahujúce konštrukty ^GUS a PfiGUS exprimovali vysoké hladiny GUS aktivity a semenáčky potomstva F1 boli použité na skúmanie indukcie chimérických génov svetlom a sacharózou. F1 semená tabaku boli povrchovo sterilizované, umiestnené na MS agarové médium obsahujúce 1 % sacharózu a pestované v rastovej komôrke pri režime 18 hodín svetla, 6 hodín tmy. Dva až tri týždne staré semenáčky boli prenesené do sterilnej vody alebo do 5 % roztoku sacharózy, a potom boli ponechané 3 dni buď na kontinuálnom svetle, alebo v kontinuálnej tme. Extrakty celkového proteínu zlúčené z 10 až 14 semenáčkov boli analyzované na aktivitu GUS použitím fluorogénneho substrátu 4-metylumbelliferylglukuronidu (4-MUG), ako opísali Jefferson a kol. (1987). Pre obidva konštrukty hladiny GUS aktivity semenáčkov exponovaných na kontinuálnom svetle bez prítomnosti sacharózy bola podobná hladine GUS aktivity semenáčkov exponovaných sacharóze bez prítomnosti svetla (obr. 4). Ale expozícia semenáčkov súčasne sacharóze a kontinuálnemu svetlu zvýšila hladinu GUS aktivity dvakrát až trikrát. Tieto výsledky sú v dobrej zhode s výsledkami pokusov so samotným génom ct β-amylázy, ktoré ukázali, že indukovatelnosť génu svetlom a sacharózou sú nezávislé procesy.

Histochemické farbenie na GUS ukázalo, že aktivita bola detekovaná v klíčnych lístkoch semenáčkov starých dva týždne, ale žiadna aktivita alebo veľmi nízka aktivita bola detekovaná v prvom pravom liste alebo v stonke a koreni. Pri semenáčkoch starých štyri týždne bola GUS aktivita navyše detekovaná v prvom pravom liste a v stonke. Farbenie na GUS bolo predovšetkým spojené s bunkami parenchymu bohatého na chloroplasty (t. j. chlorenchymu) lokalizovanými medzi xylémovými lúčmi a medzi xylémom a floémovými zväzkami, ktoré vytvárajú vnútorný floém v stonke.

SK 288125 Β6

Príklad 4

Konštrukcia plazmidu s ct β-amylázou pre transformáciu listov tabaku a zemiaka

Miestne cielená mutagéneza bola použitá na premenu miesta KpnI lokalizovaného v pozícii 2302 bp v plazmide pBmy81 na miesto BamHI. Boli pripravené nasledujúce oligonukleotidové prajmery:

Sekvencia id. č. 6:

P3: 5'- GCT GGT ACG CCT GCA GGA TCC GGT CCG GAA TTC CC -3' a sekvencia id. č. 7:

P4: 5'- GGG AAT TCC GGA CCG GAT CCT GCA GGC GTA CCA GC -3', a boli použité so súpravou na miestne cielenú mutagénezu Quick Change (Promega). Postup bol uskutočnený podľa protokolu výrobcu.

Kódujúca sekvencia ct β-amylázy s úplnou dĺžkou bola vystrihnutá z mutovaného plazmidu pBmy81 štiepením BamHI, a potom purifikovaná použitím súpravy GeneClean (BIO 101). Fragment BamHI bol ligovaný do miesta BamHI donorového vektora pDV35S(SK)V (pozri obr. 5) a pDV02000 (pozri obr. 6). Vektor pDV35S(SK)V je zložený z plazmidu pBluescript (Stratagene) nesúcim 35S CaMV promótor a 35S terminátor, tieto konštrukty sú odborníkom známe (pozri napr. Odeli a kol., 1985). Vektor pDV02000 je zložený z plazmidu pBluescript a 1,4 kbp fragmentu patatínový promótor - nopalínsyntázový terminátor. Odborník ľahko pripraví podobné konštrukty zo známych sekvencií (pozri napr. Liu a kol., 1990). Plazmidy s kódujúcou sekvenciou v obidvoch orientáciách, t. j. tak sense ako aj antisense vzhľadom na promótor, boli izolované a chimérické gény ct β-amylázy boli subklonované z donorového vektora do binárneho vektora pBinPlus (van Engelen a kol., 1995). Mapy týchto plazmidov sú uvedené na obr. 7 až 10.

Príklad 5

Transformácia alebo retransformácia rastlín

Rastliny zemiaka boli transformované metódou kokultivácie listových terčíkov, ako už opísal Horch (1985). Skôr opísané binárne vektory boli prenesené do Agrobacterium tumefaciens LBA4404 metódou elektroporácie a kultúry Agrobacterium boli použité na transformáciu, ktorou boli pripravené rastliny, ktoré po regenerácii niesli chimérické gény opísané v príklade 4.

Binárny plazmid obsahujúci chimérický gén „patatínový promótor - ct β-amyláza - nopalínsyntázový terminátor“ bol použitý na transformáciu rastlín zemiaka už nesúcich chimérický gén ADPG PPázy g/gC16 z E. coli metódou kokultivácie listových terčíkov.

Príklad 6

Konštrukcia plazmidov so smerovacím peptidom AT ct β-amylázy

Plastidová smerovacia sekvencia AT ct β-amylázy je obsiahnutá vo fragmente s velkosťou 294 bp uvedenom tu ako sekvencia id. č. 1. Na izoláciu tohto fragmentu z plazmidov opísaných v príklade 3 bola použitá PCR alebo reštrikčné štiepenie, čím sa získal fragment obsahujúci 35S CaMV promótor a plastidovú smerovaciu sekvenciu alebo patatínový promótor a plastidovú smerovaciu sekvenciu. Chimérické gény boli skonštruované ligáciou sekvencií kódujúcich proteíny alebo enzýmy ako translačných fúz s transitným (smerovacím) peptidom. Translatované proteíny boli potom transportované do plastidov, kde poskytli buď nové aktivity, alebo ovplyvnili stávajúce metabolické dráhy.

ZOZNAM POUŽITEJ LITERATÚRY

Ainsworth, C., Clark, J. and Balsdon, J. (1993). Plánt. Mol. Biol., 22, 67-82.

Baier, M. and Dietz, K.J., (1997) Plánt J. 12, 179-190

Bevan, M.W. (1984) Nucl. Acids. Res., 12, 8711-8721

Bevan, M.W. et al. (1998). Náture, 391,485-488.

Chán, MT„ Chao, YC. and Yu, SM. (1994). J. Biol. Chem., 269, 17635-17641.

Chen, MH., Liu, LF., Chen, YR., Wu, HK. and Yu, SM. (1994). Plánt J., 6, 625-636.

Daussant, J., Zbaszyniak, B., Sadowski, J. and Wiatroszak, I. (1981). Planta, 151, 176-179.

Denyer, K., Čiarke, B., Hylton, C., Tatge, H. and Smith, A.M. (1996). Plánt J., 10, 1135-1143.

Duwenig, E., Steup, M., Willmitzer, L. and Kossmann, J. (1997). Plánt J., 12, 323-333.

Eggermont, K., Goderis, I. J. and Broekaert, W. F. (1996).

Plánt Mol. Biol. Rep. 14, 273-279.

Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983). Anál. Biochem. 132, 6-13.

Gelvin, s. B. and Schilperoort, R. A. (1995). Plánt Molecular Biology Manual. 2^nd edition. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands.

Hildebrand, D.F. and Hymowitz, T. (1981). Physiol. Plánt., 53,429-434.

Horsch., R.B., Fry, J.E., Hoffman, N.L., Eichholtz, D., Rogers, S.G. and Swaley, R.T. (1985) Science, 227. 1229-1231.

SK 288125 Β6

Hylton, C.M., Denyer, K., Keeling, P.L., Chang, MT. and Smith, A.M. (1995). Planta, 198, 230-237.

Innes, M.A., Gelfand, D,H., Sninský, J.J. and White, T.J. (1990). PCR Protocols. Publisher: Academic Press. James, M.G., Robertson, D.S. and Myers, A.M. (1995). Plánt Celí, 7, 417-429.

Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A. and Bevan, M.W. (1987) EMBO, J. 6. 3901-3907.

Kakefuda, G., Duke, S.H. and Hostak, M.H. (1986). Planta, 168, 175-182.

Klosgen, R.B. and Weil, J.H. (1991) Mol. Gen. Genet., 225,297- 304

Li, B., Servaites, J.C. and Geiger, D.R. (1992). Plánt Physiol., 98,1277-1284.

Liu, X.J., Prat, S., Willmitzer, L. and Frommer, W.B. (1990) Mol. Gen. Genet., 223,401-406.

Mita, S., Suzuki-Fujii, K. and Nakamura, K. (1995) Plánt Physiol. 107,895-904.

Mita, S., Murano, N., Akaike, M. and Nakamura, K. (1997). Plánt J., 11, 841-851.

Mould, R.M. and Gray, J.C. (1997a). In Celí Biology: A Laboratory Handbook, second edition. Volume 2. (Cells, J.E. ed). New York: Academic Press, pp. 81-86.

Mould, R.M. and Gray, J.C. (1997b). In Celí Biology: A Laboratory Handbook, second edition, Volume 2. (Cells, J.E. ed). New York: Academic Press, pp. 286-292.

Nakamura, K., Ohto, M., Yoshida, N. and Nakamura, K. (1991). Plánt Physiol., 96, 902-909.

Neuhaus, H.E., Henrichs, G. and Schiebe, R. (1995). Planta, 194,454-460.

Newman, T. et al. (1994). Plánt Physiol., 106, 1241-1255.

Nielson, T.H., Deiting, U. and Stitt, M. (1997). Plánt Physiol., 113, 503-510.

Odeli, J.T. Nagy, F. and Chua, N.H. (1985) Náture, 313, 810- 812.

Peavey, D.G., Steup, M. and Gibbs, M. (1977). Plánt Physiol., 60,305-308.

Pwee, K-H. and Gray, J.C. (1993) Plánt J. 3,437-449.

Rocha-Sosa, M., Sonnewald, U., Frommer, W., Stratmann, M., Schell, J. and Willmitzer, L. (1989) EMBO, 8,23-29.

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning. Publisher: Cold Spring Harbour. Schatz, G. and Dobberstein, B. (1996). Science, 271, 1519-1526.

Schnell, D.J. and Blobel, G. (1993). J. Celí. Biol., 120, 103-115.

Sonnewald, U., Basner, A., Greve, B. and Steup, M. (1995). Plánt. Mol. Biol., 27, 567-576

Sweetlove, L.J., Burrell, M.M. and ap Rees, T. (1996). Biochem. J., 320, 493-498.

Thomson, W.W. and Whatley, J.M. (1980) Ann. Rev. Plánt Physiol. 31, 375-394.

van Engelen, F. A., Molthoff, J. W., Conner, A. J., Nap, J-P., Pereira, A. and Stiekema, W. J. (1995). Transgenic Res. 4, 288- 290.

van der Leij, F.R., Visser, R.G.F., Ponstein, A.S., Jacobsen, E. and Feenstra, W.J. (1991). Mol. Gen. Genet., 228,240-248. Wang, SM., Lue, WL. and Chen, J. (1996). Plánt Mol. Biol., 31, 975-982.

Wang, SM., Lue, WL., Huang, HW. and Chen, J. (1997). Plánt Physiol., 113,403-409.

Zoznam sekvencií (2) INFORMÁCIE PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA. SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 294 párov báz (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA z mRNA (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Arabidopsis thaliana (B) KMEŇ: ekotyp Columbia (F) TYP TKANIVA: list (vii) PRIAMY ZDROJ:

(A) KNIŽNICA: ABRC DNA Stock Centre (B) KLOŇ: EST 81E10T7 (viii) POZÍCIA V GENÓME:

(A) CHROMOZÓM/SEGMENT: chromozóm IV (ix) ZNAKY:

(A) MENO/OZNAČENIE: tranzitný peptid (B) POZÍCIA: 37-291 bp (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 1:

TCATTTCTCATCATAACAAAGAGAGAGAAAAÄAACTATGGAATTGACACTGAATTCCTCG

MELTLNSS8

AGTTCTCTTATCAAACGTAAAGATGCCAAGAGTTCTAOAAACCAAGAAAGTTCCTCCÄAC

SSLIKRKDAKSSRNQESSSN28

121 AACATGACCTTTGCGAAGATGAAGCCGCCAACATATCAGTTCCAAGCAAAGAACTCGGTT

NMTFAKMKPPTYQFQAKNSV48

181 AAGGAAATGAAGTTCACTCACGAGAAGACCTTCAeGCCAGAAGGTGAAACCCTTGAGAAA

KEMKFTHEKTFTPEGETLEK68

241 TGGGAGAAGCTCCACGTTCTCTCATACCCACACTCCAAGAACGACGCTAGCGTT

MEKLHVLSYPHSKNDASV 85 (2) INFORMÁCIE PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1662 párov báz (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA z mRNA 10 (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Arabidopsis thaliana (B) KMEŇ: ekotyp Columbia (F) TYP TKANIVA: list (vii) PRIAMY ZDROJ:

(A) KNIŽNICA: ABRC DNA Stock Centre (B) KLOŇ: EST81E10T7 (viii) POZÍCIA V GENÓME:

(A) CHROMOZÓM/SEGMENT: chromozóm IV (ix) ZNAKY:

(A) MENO/OZNAČENIE: kódujúca sekvencia (B) POZÍCIA: 1-1393 bp (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: zrelý peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 2:

GTTCCGGTGTTCGTCATGTTACCGCTCGACACAGTAACAATGTCAGGGCATTTGAACAAA

VPVFVMLPLDTVTMS G H L N K 20

CCACG AGCCATG AACGCTAGTTTG ATGGCTCTGAAAGG AGCTGGTGTGGAAGGTGTGATG

PRAMNASLMALKGAGVEGVM40

121 GTGGATGCTTGGTGGGGATTGGTGGAGAAAGATGGACCTATGAATTATAACTGGGAÄGGC

VDAWWGLVEKDGPMNYNWEG60

181 TATGCCGAGCTTATACAGATGGTTCAAAAGCACGGTCTCAAACTCCAGGTCGTTATGTCA

YAELIQMVQKHGLKLQVVMS80

241 TTCCATCAATGTGGAGGAAACGTAGGAGACTCTTGCAGTATCCCCTTGCCTCCATGGGTG

FHQCGGNVGDSCSIPLPPWV 100

301 CTTGAAGAGATCAGCAAGAACCCTGATCTTGTCTACACAGACAAATCTGGGAGAAGGAAC

LEEISKNPDLVYTDKSGRRN 120

61 CCTGAATATATCTCCTTGGGATGTGATTCTGTGCCTGTCCTAAGAGGAAGAACACCTATC

PEYISLGCDSVPVLRGRTPI 140

421 CAGGTCTACTCAGATTTCATG AGG AGCTTCCGTGAACG ATTTGAAGGCTACATAGG AGG A

QVYSDFMRSFRERFEGYIGQ 160

SK 288125 Β6

481 GTTATTGCGGAAATTCAAGTAGGAATGGGACCTTGTGGAGAATTGAGATACCCATCATAC

VIAEIQVG MGPCGEIiRYPSY 180

541 CCTGAAAGCAACGGGACCTGGAGATTCCCCGGAATrGGAGAGTTCCAGTGCTACGACAAG

PESNGTWRFPGXGBFQCYDX 200

601 TATATGAAATCGTCACTTCAGGCATATGCTGAATCAATTGGGAAAACTAACTGGGGAACA

Y M K S S I» Q A Y A E S I G K T N W G T 220

661 AGCGGACCTCATGATGCCGGCGAGTACAAGAACCTCCCAGAAGATACTGAATTTTTCAGG

SGPHDAGEYKNLPEDTEFFR 240

721 AGAGACGGAACATGGAATAGCGAGTATGGAAAGTTTTTCATGGAATGGTACTCOGGGÄAG

RDGTWNSEYGKFFMEWYSGK 260

781 CTGCTAGAACATGGAGACCAACTCCTATCTTCÄGCGAAAGGTATCTTTCAAGGAAGCGGA

L· L E K G D Q L L S S A K G I F Q G S G 280

841 GCAAAGCTATCAGGAAAGGTAGCTGGAATTCACTGGCACTACAACACCAGGTCACACGCA

A K I< S G K V A G I H W K Y N T R S H A 300

901 GCTGAGCTAACCGCTGGATATTACAACACAAGAAACCATGACGGGTATCTGCCAATAGCT

A B L T A O Y Y M T R N H D G Y X» P X A 320

961 AAGATGTTGAACAAACATGGAGTTGTGCTCAACTTCACCTGCATGQAGATGÄAAGACGGG

K M F N K H G V V Xi N F T C M E M K D G 360

1021 GAGCAACCTGAGCACGCGAATTGCTCACCAGAAGGTCTGGTCAAGCAAGTACAGAACGCG

E Q P E H A N C S P E G L V K Q V Q K A 380

1081 ACAAGGCAGGCCGGAACCGAACTAGCAGGGGAGAACGC^CTAGAACGATATGACTCGAGC

TRQAGTE LAGEMÁliERYDS S 400

1141 GCATTCGGACAAGTGGTAGCAACAAATAGGTCAGATTCTGGAAATGGGTTAACCGCAT'rr

AFGQVVATKRSDSGNGIiTAF 420

1201 ACTTACCTAAGAATGAACAAGCGGTTATTTGAGGGTCAAAATTGGCAGCAGTTAGTGGAG

T Y I> R M N K R L F E G Q N W Q Q L V E 440

1261 TTTGTTAAGAÄCATGAAGGAAGGTGGTCATGGGAGGAGACTCTCAAAAGAAGACACÄACT

F V K N M K E G G H G R R L S K E D T T 460

1321 GGAAGTGACCTTTATGTTGGATTTGTCAAAGGCAAGATCGCTGAGAATGTGGAGGAGGCT

G S D L Y V G F V K G K I A E N V E E A 480

1381 GCTTTAGTGTAATTTCCCACATAGGTACATACATATAGTGTGGTGTTTATTGTATTCCTG

A L V - 483

1441 TCTGATAAATAACTAGAGAGATCAAACCAGTAAOAGTGTTAÄAGCTATAGATTTGCACAA

1501 TTCTGGGTCAGAGTCAGAGCAAAGAGAAGCAAAATCAAGATGATGTACACTTAGATGTAT

1561 CCTATGAGTTTTCCTTGTACATCATCTTCATACTCTTAATCTCAAATACTATGCATTTTT

1621 CTCCAAAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGCTCTAGAGGATCC (2) INFORMÁCIE PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 3: (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1953 párov báz (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité

SK 288125 Β6 (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA z mRNA (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Arabidopsis thaliana 5 (B) KMEŇ: ekotyp Columbia (F) TYP TKANIVA: list (vii) PRIAMY ZDROJ:

(A) KNIŽNICA: ABRC DNA Stock Centre (B) KLOŇ: EST 81E10T7 (viii) POZÍCIA V GENÓME:

(A) CHROMOZÓM/SEGMENT: chromozóm IV (ix) ZNAKY:

(A) MENO/OZNAČENIE: CDS (B) POZÍCIA: 37-1683 bp (D) ĎALŠIA INFORMÁCIA: cielený chloroplast (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 3:

TCATTTCTCATCATAACAAAGAGAGAGAAAAAAACTATGGAATTGACACTGAATTCCTCG

MELTLNSS8

AGITCTCTTatcaaacgtaaagatgccaagagttctagaaaccaagaaagttcctccaac

SSLIKRKDAKSSRNQESSSN28

121 AACATGACCTTTGCGAAGATGAAGCCGCCAACATATCAGTTCCAAGCAAAGAACTCGGTT

NMTFAKMKPPTYQPQAKNSV48

181 AAGGAAATGAAGTTCACTCÄCGÄGAAGACCTTCACGCCAGAÄGGTGAAACCCTTGÄGAÄA

KEMKFTHEKTFTPEGETLEK68

241 TGGGAGAAGCTCCACGTTCTCTCATACCCACACTCCAAGAACGACGCTAGCGTTCCGGTG

WEKLHVLSYPHSKNDASVP V 88

301 TTCGTCATGTTACCGCTCGACACAGTAACAATGTCAGGGCATTTGAACAAACCACGAGCC

PVMLPLDTVTMSGHLNKPRA 108

361 ATGAACGCTAGTTTG ATGGCTCTGAAAGGAGCTGGTGTGGAAGGTGTGATGGTGGATGCT

MNASLMALKGAGVEGVMVDA 128

421 TGGTGGGGATTGGTGGAGAAAGATGGACCTATGAATTATAACTGGGAAGGCTATGCCGAG

W W G L V E KDGPMNYNWEGYAE 148

481 CTTATACAGATGGTTCAAAAGCACGGTCTCAAACTCCAGGTCGTTATGTCATTCCATCAA

L I Q M V Q K H G L K L Q V V M S P H Q 168

541 TGTGGAGGAAACGTAGGAGACTCTTGCAGTATCCCCTTGCCTCCATGGGTGCTTGAAGAG

CGGNVGDSCS I PLPPHVLEE 186

601 ATCAGCAAGAACCCTGATCTTGTCTACACAGACAAATCTGGGAGAAGGAACCCTGAATAT

I S K N P D L V Y T D K S G R R H P E Y 208

661 ATCTCCTTGGGÄTGTGATTCTGTGCCTGTCCTAAGAGGAAGAACACCTATCCAGGTCTAC

I S L Q C D S V P V L R G R T P I Q V Y 228

721 TCAGATTTCATGAGGAGCTTCCGTGAACGATTTGAAGGCTACATAGGAGGAGTTATTGCG

SDFMRSPRERFBGYIGGVIA 248

781 GAAATTCAAGTAGGAATGGGACCTTGTGGAGAATTGAGATACCCATCATACCCTGAAAGC

EIQVGMOPCGBLRYPSYPES 268

SK 288125 Β6

841 AACGGGACCTGGAGATTCCCCGGAATTGGAGAGTTCCAGTGCTACGACAAGTATATGAAA

NGTWRFPGIGEFQCYDKYMK 288

901 TCGTCACTTCAGGCATATGCTGAATCAATTGGGAAAACTAACTGGGGAACAAGCGGACCT

SSLQAYAESIGKTNWGTSGP 308

961 CATGATGCCGGCGAGTACAAGAACCTCCCAGAAGATACTGAATTTTTCAGGAGAGACGGA

HDAGEYKNLPEDTEFFRRDG 328

1021 ACATGGAATAGCGAGTATGGAAAGTTTTTCATGGAATGGTACTCCGGGAAGCTGCTAGAA

TWNSEYGKFFME W Y S G K I· L E 348

1081 CATGGAGACCAACTCCTATCTTCAGCGAAAGGTATCTTTCAAGGAAGCGGAGCAAAGCTA

HGDQ LLSSAKGI FQGSGAKL 368

1141 TCAGGAAAGGTAGCTGGAATTCACTGGCACTACAACACCAGGTCACACGCAGCTGAGCTA

SGKVAGIHWHYNTRSHAAEL 388

1201 ACCGCTGGATATTACAACACAAGAAACCATGACGGGTATCTGCCÄATAGCTAAGATGTTC

T A G Y Y N T R N H D G Y 1» P I A K M F 408

1261 AACAAACATGGAGTTGTGCTCAACTTCACCTGCATGGAGATGAAAGACGGGGAGCAACCT

NKHGVVLNFTCMEMKDQEQP 428

1321 GAGCACGCGAATTGCTCACCAGAAGGTCTGGTCAÄGCAAGTACAGAACGCGACAAGGCAG

E H A N C S P E G L V K Q V Q N A T R Q 448

1381 GCCGGAACCGAACTAGCAGGGGAGAÄCGCGCTAGAACGATATGACTCGAGCGCATTCGGA

AGTELAGENALERYDSSAFG 468

1441 CAAGTGGTAGCAACAAATAGGTCAGATTCTGGAAATGGGTTAACCGCATTTACTTACCTA

QVVATNRSDSGNGLTAFTYL 488

1501 AGAATGAACAÄGCGGTTATTTGAGGGTCAAAATTGGCAGCAGTTAGTGGAGTTTGTTAAG

R M N K R L F E G Q N W Q Q L V E F V K 508

1561 AACATGAAGGAAGGTGGTCATGGGAGGAGACTCTCAAAAGAAGACACAACTGGAAGTGÁC

NMKEGGHGRRLS K E D T T G S D 528

1621 CTTTATGTTGGATTTGTCAAAGGCAAGATCGCTGAGAATGTGGAGGAGGCTGCTTTAGTG

LYVGFVKGKIAENVEBAALV 548

1681 TAATTTCCCACATAGGTACATACATATAGTGTGGTGTTTATTGTATTCCTGTCTGATAAA

1741 TAACTAGAGAGATCAAACCAGTAAGAGTGTTAAAGCTATAGATTTGCACAATTCTGGGTC

1801 AGAGTCAGAGCAAAGAGAAGCAAAATCAAGATGATGTACACTTAGATGTATCCTATGAGT

1861 TTTCCTTGTACATCATCTTCATACTCTTAATCTCAAATACTATGCATTTTTCTCCAAAAA

1921 AAAAAAAAAAAGGGCGGCCGCTCTAGAGGATCC (2) INFORMÁCIE PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov, báz (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 4:

AATTCCTCGA GTTCTCTTAT C 21 (2) INFORMÁCIE PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 5:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 5:

CGGG ATCCCT GAC ATTGTTA C 21 (2) INFORMÁCIE PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 6:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 35 párov báz (B) TYP.nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 6:

GCTGGTACGC CTGCAGGATC CGGTCCGGAA TTCCC 35 (2) INFORMÁCIE PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 7:

(1) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 35 párov báz (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 7:

GGGAATTCCG GACCGGATCC TGCAGGCGTA CCAGC 35 (2) INFORMÁCIE PRE SEKVENCIU S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1652 párov báz (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: genómová DNA (vi) PÔVODNÝ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Arabidopsis thaliana (B) KMEŇ: ekotyp Columbia (F) TYP TKANIVA: list (vii) PRIAMY ZDROJ:

(A) KNIŽNICA: EU Arabidopsis Genóme Project (B) KLOŇ: Cozmid G16599 (viii) POZÍCIA V GENÓME:

(A) CHROMOZÓM: chromozóm 4 (ix) ZNAKY:

(A) MENO/OZNAČENIE: promotor (B) POZÍCIA: 17534-19185 bp z G16599 (D) ĎALŠIE INFORMÁCIE: komplementárne vlákno (xi) OPIS SEKVENCIE: SEKVENCIA S IDENTIFIKAČNÝM ČÍSLOM 8:

AAGCTTGTGT CTATTTCAÄA TTCTTGACCG TAGATGTCAC AACATGCATA

SI TATCATTGAA AACAGAGCAA CACAGGAAAC CAAGCATATG TATCTAGATA

101 TACTTAGCAA GACATAACTA TAGTCTTTGA ATCAACATAO GGATTAATGA

151 TAGAGAATGA GGAAGCTCAA GATTTTATAC TCAGTTTCTT ACAAAACAAA

201 TTTCTCTCTA ACTGCAAAAA CACCAATTAG GATTTGAAGA GCGTACCTGT

SK 288125 Β6

TTGAGTCAAT GTCCAATGTC GTCCCCCCGC CTTCTACATT TCTTAGCCTG

CTGAATAAAA GCACAAGCCA AAATGAGAÄG GTGCCAAAGG CGATAAGGAT

CAATTTCTAC CATTCAAAAA ACTAATGGTG AGAATTAGAA ACGAGAGAAA

ACTACTTGTT GAGGAÄATAG CCAAAAGCGC AATCTTCGTC ACCTGAATAA

AGACCAAACC GTCACTTTCA ATGAGTCAGC AAGAAAAAGA GAGAGAGAGA

GAGAGAGATT CTCTATAACA TTTGAGTCGA CATGGATTCT AATGCATCAA

AAGTCATCTC

AGATCAAAGC

QACACATGTT

CACACACAAC

AACATATTTC

AAGGTTGACA

TAATAACCAG

TAAAAAAAAG

AGAAATTTTC

GATCTGTCAG

CCAAGAAAAA

ACAGAAATAA

AGAGAACTTA

GTGAGAAGCC

ACTAGATTTA

AATAATTCAC

CATGTAAATG

GACATTTACA

AAGGTTAAAA

TGGGTCTCCA

AAACAGCATC

AGCTCTATTC

CT

CAATAAACAA

CTTAAGTATT

CTTAAGTAAC

AAGGGCTTAA

ATTTACAAAC

AAAAAATATA

GCAAGAAAAA

TCACAAAGAA

AAAGAAAATA

CTGCTTAGTT

GAÄAATAAGC

TTAAATCGTT

ATAATTTTCA

AAAATTATCA

AGAGTTCTCT

CAACAGGAAA

AGAATTTATT

ATTTTTCATT

TAAGCAACCT

AACCACAGCC

TTTCTCTCAA

TCTACCTCAT

ACACTTGAAA

AAGCATTACA

ATAGTATCAA

TGCATCAAAG

AGAATGCAGC

ATCTTGTAAC

AACAGAATAA

TGTGCCACAG

TTAGCATTGT

GGAAAACACA

AAAGTTAATA

GCACTTATCT

GCCACACGAA

GCTTATCTCC

GTAACTAAAA

ACAAAACTCA

AACTAAAACA

TTGAGGTGTA

TTGTGATATT

AATCAATATT

ACACAAACAT

TTCTCATCAT

CTCACATGGC

GACACTACTG

TATCCGTGAA

TCCTGTTATT

ATTCAGGCAG

TCTACATATA

ACAGATCAAT

TGAACAAGAG

TAGAATTTTT

AATCTTACAG

GCCACCACAA

TCTTATTCAA

CCÄTGTGTTC

ATTAACAAGG

ACTGCAGGAG

ATTATCTATA

TCTTCCTTTG

AGAACCGTGT

TTCTCTCCAC

CTTTATAAAT

ATCTTCTATC

AACAAAGAGA

TAATAGAACA

GCTAACTTTT

TCACATCGAA

TCCATATAAC

TCCAAATGGA

TGGCAGAATG

GAGTATGATA

GGCCATGAGA

TGGGTCAATG

GAAGGAAAGT

GAAATTTCAT

ACTAAAATCA

AAAGCCAAAG

GAAAAGCAAG

TGAGTAAGTA

GCTGAATACA

TAACTGATGT

GACAAGTGAA

TTTTTGAAAT

ACAAACACAC

AAACACCAAC

GAQAAAAAAA

Claims (20)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Sekvencia nukleovej kyseliny, ktorá je tu uvedená ako sekvencia id. č. 1, majúca 1 - 294 nukleotidov a kódujúca sekvenciu schopnú smerovania proteínu do rastlinného plastidu, alebo sekvencia majúca aspoň 65 % alebo vyššiu identitu so sekvenciou id. č. 1 a hybridizujúca na uvedenú sekvenciu id. č. 1 za stredne stringentných podmienok a kódujúca sekvenciu majúcu rovnakú schopnosť smerovania.

2. Sekvencia nukleovej kyseliny podľa nároku 1, ktorá kóduje až 94 aminokyselinových zvyškov.

3. Sekvencia nukleovej kyseliny podľa nároku 2, ktorá kóduje až 85 aminokyselinových zvyškov.

4. Sekvencia nukleovej kyseliny, ktorá je tu uvedená ako sekvencia id. č. 3, majúca 1 - 1953 nukleotidov a kódujúca do chloroplastu smerovanú β-amylázu, alebo sekvencia majúca aspoň 65 % alebo vyššiu identitu so sekvenciou id. č. 3 a hydridizujúca na uvedenú sekvenciu id. č. 3 za stredne stringentných podmienok a kódujúca do chloroplastu smerovanú amylázu.

5. Sekvencia nukleovej kyseliny podľa niektorého z nárokov 1 až 4, ktorou je sekvencia mRNA, c DNA alebo genómovej DNA.

6. Spôsob zvýšenia alebo zníženia aktivity enzýmu v rastline, kde tento enzým je zapojený v metabolickej dráhe biosyntézy alebo degradácie škrobu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kroky: stabilného vloženia do rastlinného genómu chimérického génu obsahujúceho sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu sekvenciu smerujúcu do plastidu a kódujúcu sekvenciu pre β-amylázu; a regenerácie rastliny so zmeneným genómom, pričom sekvencia nukleovej kyseliny obsahuje sekvenciu podľa nároku L

7. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že kódujúcou sekvenciou je sekvencia nukleovej kyseliny id. č. 2, ktorá je kódujúcou sekvenciou pre β-amylázu.

8. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že uvedenou sekvenciou nukleovej kyseliny je sekvencia nukleovej kyseliny podľa nároku 4.

9. Spôsob podľa nároku 6, vyznačujúci sa tým, že uvedeným enzýmom je neplastidová β-amyláza.

10. Spôsob podľa niektorého z nárokov 6 až 9, vyznačujúci sa tým, že uvedený chimérický gén ďalej obsahuje kódujúcu sekvenciu pre enzým zvolený zo sacharóza syntázy, ADPG pyrofosforylázy, syntázy škrobu, vetviacieho enzýmu, izoamylázy, neplastidovej a-amylázy, α-glukozidázy, fosforylázy škrobu a disproporciačného enzýmu.

11. Spôsob podľa niektorého z nárokov 6 až 10, vyznačujúci sa tým, že chimérický gén ďalej obsahuje promótor, pričom týmto promótorom je sekvencia nukleovej kyseliny tu uvedená ako sekvencia id. č. 8 alebo sekvencia majúca aspoň 65 % identitu so sekvenciou id. č. 8 a v podstate rovnakú funkciu ako ona, pričom uvedená sekvencia nukleovej kyseliny má odozvu na stimul a hladina expresie uvedeného produktu je variabilná v odozvu na stimul aplikovaný na uvedenú sekvenciu nukleovej kyseliny.

12. Spôsob smerovania proteínov alebo enzýmov do rastlinného plastidu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje kroky: stabilného vloženia do rastlinného genómu chimérického génu obsahujúceho sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu sekvenciu smerujúcu do plastidu a kódujúcu sekvenciu pre protein alebo enzým; a regenerácie rastliny so zmeneným genómom, pričom protein alebo enzým je zapojený aspoň v jednej metabolickej dráhe zvolenej zo syntézy lipidov, fotosyntézy, metabolizmu aminokyselín, fixácie dusíka, fixácie uhlíka a syntézy sacharidových polymérov, alebo je schopný udeliť rastline charakteristický znak, pričom sekvenciou nukleovej kyseliny je sekvencia nukleovej kyseliny podľa nároku 1.

13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že uvedeným charakteristickým znakom je aspoň jeden znak zvolený z rezistencie proti herbicídom a rezistencie proti škodcom.

14. Spôsob zmeny ďalšieho enzýmu v transgenickej rastline, ktorá už má zvýšenie alebo zníženie enzymatickej aktivity v metabolickej dráhe biosyntézy škrobu v dôsledku genetickej transformácie, na dosiahnutie stimulácie alebo útlmu uvedeného ďalšieho enzýmu a tým aj zvýšenie alebo zníženie množstva škrobu produkovaného transgenickou rastlinou, vyznačujúci sa tým, že uvedeným ďalším enzýmom je do plastidu smerovaná β-amyláza, ktorá obsahuje sekvenciu id. č. 1 alebo sekvenciu majúcu aspoň 65 % alebo vyššiu identitu so sekvenciou id. č. 1 a hybridizujúcu na uvedenú sekvenciu id. δ. 1 za stredne stringentných podmienok.

15. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že do plastidu smerovaná β-amyláza obsahuje sekvenciu id. č. 2.

16. Spôsob podľa nároku 14, vyznačujúci sa tým, že uvedenou po prvý raz transformovanou rastlinou je rastlina transgenického zemiaka transformovaná génom pre adenozíndifosfoglukóza pyrofosfororylázu.

17. Spôsob podľa nároku 6 alebo 12, vyznačujúci sa tým, že chimérický gén ďalej obsahuje promótor zvolený zo skráteného alebo úplného promótor 35S z vírusu mozaiky karfiolu, promótora z rubisco, promótora plastocyanínu z hrachu, promótora nopalín-syntázy, promótora chlorofyl a/b vazajúceho proteínu, vysokomolekulárneho promótora glutenínu, promótora a, β-gliadínu, promótoru hordeínu a promótora patatínu.

18. Spôsob podľa nároku 6 alebo 11, vyznačujúci sa tým, že uvedená kódujúca sekvencia uvedeného enzýmu v uvedenom chimérickom géne vedie k stimulácii alebo útlmu aktivity uvedeného enzýmu.

19. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedeným stimulom je prítomnosť 5 alebo neprítomnosť svetla a/alebo premenlivej hladiny cukru.

20. Spôsob podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že uvedeným stimulom je vývojovo riadený stimul.

21. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že cukrom je aspoň jeden cukor zvolený zo sacharózy alebo glukózy.

10

22. Spôsob podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že cukrom je sacharóza.

23. Chimérický gén obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny podľa nároku 1.

24. Chimérický gén obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu do plastidu smerujúcu sekvenciu podľa nároku 1 a sekvenciu nukleovej kyseliny kódujúcu enzým zapojený v metabolickej dráhe degradácie škrobu, pričom tento enzým je kódovaný sekvenciou id. č. 2.

15

25. Chimérický gén obsahujúci sekvenciu nukleovej kyseliny schopnú riadenia expresie ďalšej kódujúcej sekvencie, pričom touto kódujúcou sekvenciou je sekvencia id. č. 2.

26. Rastlinné bunky obsahujúce sekvenciu nukleovej kyseliny podľa nároku 1 alebo 4.

27. Semeno transformovanej rastliny obsahujúcej aspoň jednu sekvenciu nukleovej kyseliny podľa nároku 1 alebo 4.

20 28. Rastliny transformované spôsobom podľa nároku 6 alebo 12, pričom rastlinami sú aspoň jedna rastlina zvolená zo súboru zahŕňajúceho zemiak, pšenicu, kukuricu, jačmeň, rajčiak, ryžu, hrach, sóju, podzemnicu olejnú, maniok, jam, banán a tabak.