MXPA01001815A - Secuencia de acido nucleico con terminacion de plastida secuencia beta-amilasa, un promotor responsivo a estimulos y usos de los mismos. - Google Patents

Secuencia de acido nucleico con terminacion de plastida secuencia beta-amilasa, un promotor responsivo a estimulos y usos de los mismos.

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MXPA01001815A
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Abstract

La invencion proporciona una nueva secuencia de ?-amilasa terminada de cloroplasto (ct ?- amilasa), una nueva secuencia de acido nucleico terminada de cloroplasto y una nueva secuencia de ?-amilasa. Tambien se describe un promotor inducible que se estimula independiente por estimulos de luz o azucar. Los metodos para transformar las plantas utilizando estas secuencias se describen, asi como las celulas vegetales transformadas, semilla y plantas transformadas de las mismas, asi como genes quimericos que contienen las secuencias. La modificacion de niveles de almidon en plantas puede lograrse, asi como se describe la terminacion de genes de las vias degradantes o biosinteticas de almidon, enfermedad o resistencia a peste o variacion de la expresion del gen debido a estimulos.

Description

SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO CON TERMINACIÓN DE PLASTIDA SECUENCIA BETA-AMILASA, UN PROMOTOR RESPONSIVO A ESTÍMULOS Y USOS DE LOS MISMOS Los mecanismos precisos por los cuales el almidón se sintetiza y se degrada en plantas son desconocidos, a pesar del aislamiento y caracterización de un número de enzimas que se presumen se incluyen en el proceso. El almidón se acumula en los cloroplastos de las hojas durante el día y se utiliza para suministrar las necesidades de la planta para energía y biosíntesis durante la noche. El modo por el cual este así llamado almidón transitorio se moviliza, no se entiende completamente, pero debe incluir la regulación coordinada de las actividades de ia enzima degradantes y sintéticas. En los tejidos de hoja la vía principal de degradación se considera que incluye actividades fosforolíticas e hidrolíticas, especialmente a-glucosidasa (E. C. 3.2.1 .3) (Nelson y Stitt, 1997). El almidón también se acumula en los amiloplastos en órganos de almacenamiento como las semillas, frutos y tubérculos. En este caso el almidón se almacena por períodos largos de tiempo y la movilización del almidón se acompaña por la degeneración de los tejidos de órgano de almacenamiento y aumenta en actividades amilolíticas y fosforolíticas. Sin embargo, existe la evidencia de sugerir que el trastorno del almidón también ocurre en los amiloplastos del órgano de almacenamiento (Sweetlove eí al., 1996). Esto requiere otra vez la regulación coordinada de las actividades de la enzima degradantes y sintéticas. Los cloroplastos y amiloplastos se derivan ambos de proplástidas y por consiguiente tienen muchas características en común además de ser el sitio de la síntesis de almidón en las hojas y órganos de almacenamiento respectivamente; los cloroplastos pueden convertirse en amiloplastos y otros tipos de plástida (Thomson y Whatley, 1980). El almidón es una mezcla de dos polisacáridos: amilosa que es una cadena lineal de unidades de glucosilo unidas enlazadas por enlaces a-1 ,4-glicosídicos; y amilopectina que se hace de muchas cadenas lineales de a-1 ,4-poliglucanos que se uñen junto por enlaces de a-1 ,6 glicosídicos. Las enzimas que se incluyen en la síntesis del almidón son pirofosforilasa ADPG (E. C. 2.7.7.21 ), sintasa de almidón (E. C. 2.4.1 .21 ) y enzima de ramificación (E. C. 2.4.1 .18). La fosforilasa ADPG es responsable de suministrar el substrato ADPG, esta molécula sirviendo como el donador de monómeros de glucosa que se unen junto por la acción concertada de síntesis de almidón (enlaces de a-1 ,4) y enzimas de ramificación (enlaces de a-1 ,6). Se considera que la estructura cristalina, insoluble de granos de almidón se forma por el empaque cerrado de las moléculas de amilpectina ramificadas, helicoidales alargadas, con las moléculas de amilosa lineales que llenan cualquiera de los espacios. Un rango de actividades de la enzima que degrada el almidón se ha reportado incluyendo a-amilasa (E. C. 3.2.1.1 ). isomilasa (E. C. 3.2.1 .68), ß-amilasa (E. C. 3.2.1 .2.), a-glucosidasa (E. C. 3.2.1 .3), fosforilasa de almidón (E. C. 2.4.1 .1 ) y enzima desproporcionante (E. C. 2.4.1 .25). Muchas de estas actividades de ia enzima existen en múltiples formas en plantas y algunas se considera que se incluyen en la síntesis de almidón. Todo probablemente toma parte, en algún grado, en el proceso de movilización de almidón, sin embargo sus funciones exactas e interacciones posibles todavía se encuentran por determinarse. Las dificultades para atribuir funciones para las diferentes enzimas se ejemplifica mejor por referencia a dos de las actividades de la enzima que se considera que son los mayores contribuidores a la desintegración del almidón en plantas: amilasa y fosforilasa de almidón. La fosforilasa de almidón cataliza la liberación reversible de gIucosa-1 -fosfato de a-1 ,4-glucanos. Dos formas de fosforilasa de almidón se encuentran en tejidos de planta: Pho1 , o el tipo L, se ubica dentro de las plástidas y tiene una afinidad elevada hacia las maltodextrinas; Pho2, o el tipo H, es citosólico y tiene una afinidad a los poliglucanos altamente ramificados elevados, largos tal como glicógeno. A pesar de que la enzima Pho1 plastídica sería un candidato similar a incluirse en la movilización de almidón, la inhibición antisensible de la actividad de la enzima de la hoja no tiene efecto en la acumulación de almidón en hojas de plantas de papas transgénicas (Sonnewald eí al. 1995). En otro estudio, la inhibición antisensible del Pho2 citoplásmico tuvo una influencia en el comportamiento de brotación de tubérculos de papas transgénicas, pero no tuvo efecto en la acumulación y degradación de almidón (Duwenig et al. 1997). Existen dos grupos principales de amilasa ambos de los cuales hidrolizan los enlaces de a-1 ,4-glucosidicos en amilosa y amilopectina: a- amilasa actúa al azar en enlaces no terminales, mientras que ß-amilasa actúa para liberar las unidades de maltosa que empiezan desde el extremo de no reducción de la cadena de poliglucano. La ubicación subcelular de a-amilasa en el espacio apoplástico de células vegetales se considera que refleja el hecho de que la enzima normalmente se secreta. Sin embargo, en un número de plantas tales como el arroz (Chen, eí al. , 1994) y remolacha (Li, eí al. , 1992) la enzima también se ubica dentro de los cloroplastos y amiloplastos, a pesar del descubrimiento de que las secuencias de señal en el término amino de un número de proteínas de a-amilasa son características para la translocación de proteína a través de la membrana ER en lugar de la membrana de plástida (Chen eí al. , 1994). En un estudio donde el promotor y la secuencia de señal de un gen de a-amilasa de arroz se fusionó al gen bacterial GUS y se introdujo en el arroz, tabaco y papa utilizando la transformación mediada por Agrobacterium (Chan eí al. , 1994), se demostró que la proteína de fusión GUS expresada se transportó primero al retículo endoplásmico y después se exportó en el medio de cultivo de los cultivos de suspensión hechos de células transgénicas. Se ha mostrado en un número de estudios que la a-amilasa degradará moléculas de almidón nativas. En contraste, los estudios in vitro han mostrado que la ß- amilasa no degradará granulos de almidón nativos sin antes de la descomposición bioquímica del granulo con otras enzimas. Los mutantes del centeno (Daussant eí al. , 1981 ) y semilla de soya (Hildebrand e Hymowitz, 1 981 ) que carecen de ß-amilasa o solamente contienen indicios de actividad, respectivamente, aparentemente muestran crecimiento y desarrollo normal. Además, las plantas transgénicas de Arabidopsis en las que los niveles de ß-amilasa se han reducido grandemente, no muestran defectos de crecimiento severo (Mita eí al. , 1997). Los intentos para definir la función fisiológica precisa de ß-amilasas en planta se han dificultado por los datos inconclusos concernientes a la ubicación subcelular. A pesar de que un estudio (Kafefuda eí al. , 1986) reportó la presencia de dos ß-amilasas en cloroplastos de grancilla, más estudios que incluyen las especies tales como Vicia faba, cebada, trigo, semilla de soya, papa dulce y grancilla han concluido esa mayoría, si no del todo, la actividad de ß-amilasa es extracloroplástica (Nakamura et al., 1991 ). Esta vista se soporta por el hecho de que todos los genes de ß-amilasa clonados a la fecha que codifica proteínas que carecen de secuencias de péptido transitorio de cloroplasto de terminal de amino. En cereales, tres tipos de ß-amilasa se han descrito: una forma específica endosperma que se acumula durante la maduración de cariopsis; una forma que se sintetiza de novo en células de aleurona de arroz y maíz durante la germinación (Wang eí al. 1996; 1997); y una ß-amilasa que se encuentra en órganos vegetativos. En Arabidopsis, la forma encontrada cuenta por aproximadamente 80% de la actividad total de degradación de almidón de hojas de roseta. En común con todos los otros genes de ß-amilasa clonados a la fecha, el gen por la ß-amilasa de Arabidopsis encontrada no codifica una proteína con una señal de terminación subcelular, de este modo la enzima es similar para colocarse en el citosol. Los descubrimientos de un número de estudios de que las actividades degenerativas pueden removerse sin un efecto adverso en la viabilidad de la planta, más la ubicación subcelular de las enzimas de degradación de almidón fuera del plástida, es sorprendente. La ausencia aparente de una actividad de ß-amilasa localizada de plástida es sorprendente especialmente en luz del hecho de que el producto terminal mayor esperado de la actividad de ß-amilasa, especialmente maltosa, se ha identificado como un producto de degradación de almidón en cloroplastos aislados (Peavey eí al. , 1977). Más recientemente, se ha mostrado que tanto la glucosa como la maltosa se exportan de los amiloplastos de germen de coliflor aislado durante el proceso de movilización de almidón (Neuhaus eí al. , 1995). La habilidad para manipular la cantidad de almidón en las plástidas de hojas u órganos de almacenamiento podrían ser de alto beneficio a diversos procesos industriales que utilizan almidones de planta. Por ejemplo, en un intento de aumentar el contenido de almidón de los tubérculos de papa, se ha mostrado previamente que cuando E. coli. ADPG Ppase glgCl ß se sobre expresa en tubérculos de papa transgénica, existe un incremento en flujo de carbono en el almidón pero solamente existe un incremento pequeño en la acumulación neta del almidón (Sweetlove eí al., 1997). El análisis de actividades de la enzima en las líneas de sobre expresión mostró que, aparte de la alteración en ADPG Ppase, la actividad de amilasa, específicamente ß-amilasa también se alteró. Estos datos sugieren que la acumulación de almidón en los tubérculos que sobre expresan proteína glgC16 se previene de la desintegración del almidón nuevamente sintetizado, es decir, el almidón a ser trastornado. En otro ejemplo, la disponibilidad del almidón durante el proceso de germinación se correlaciona exactamente con los tipos y cantidades de actividades de la enzima degradante en la planta, específicamente los órganos de almacenamiento. Un incremento en la capacidad degradante del cultivo haría que la germinación del grano de cereal o la conversión de almidón desde tubérculos, u otros órganos de almacenamiento, para alcoholizar más eficaz y productivo. El tipo de almidón presente en el órgano de almacenamiento depende en las formas y actividades de la pirofosforilasa ADPG, sintasa de almidón, enzima de ramificación y las enzimas degradantes presentes. Las interacciones entre las diversas enzimas también serán importantes. Existe un considerable interés en crear nuevos almidones en planta del almidón antes de utilizarse en una diversidad de industrias tales como comida, papel, farmacéuticos, pegamento, aceite, y textiles. Los siguientes ejemplos muestran cuanta actividad hidrolítica de aluminio puede ser importante en alterar la estructura del almidón in vivo. Se ha mostrado que, en almendras de maíz, la mutación sugaryl origina la ausencia de una enzima de desramificación que hidroliza los enlaces de a-1 ,6-glicosilo de aluminio (James eí al. , 1995). La mutación se da como resultado en la concentración reducida de amilopectina y acumulación del glucopo. ¡sacando, fitoglicogeno altamente ramificado. Se ha mostrado que en la grancilla, moléculas cortas de oligosacárido, comenzando con maltosa y agregando unidades de glucosa sucesiva arriba de la maltoheptosa, específicamente estimular la actividad de sintasa I de almidón de enlace de granulo (GBSSI) (Denyer eí al. , 1 996) que generalmente s acepta para ser la enzima mayor responsable para la síntesis de amilosa (por ejemplo, van der Leij eí al. , 1991 ; Hylton eí al. , 1 995; Ainsworth eí al. , 1 993). La manipulación de la actividad de GBSSI al controlar el suministro de malto-oligosacáridos es el objetivo de una patente reciente (WO 97/16554) y sugiere que un aumento en la concentración de malto-oligosacáridos, y de este modo un incremento en la proporción de amilosa a amilopectina en el almidón, puede llevarse aproximadamente por la introducción de enzimas degradantes especialmente a-amilasa, ß-amilasa, enzima de desproporción, enzima de desramificación y fosforilasa de almidón. La Patente WO 97/16554 también establece que los genes para isoformas plastidiales de estas enzimas se han clonado. Sin embargo, como se discute arriba, los genes de no ß-amilasa aislados a la fecha codifican una enzima de ß-amilasa con una proteína de secuencia de terminación y, además, existe duda de que las a-amilasas originalmente se terminan a las plástidas (Chen eí al. , 1994; Chan eí al. , 1994). Después en WO 97/16554, la referencia se hace para usos técnicos de una secuencia de cADN de ß-amilasa adecuada para agregar una secuencia de terminación de plástida. Además a los usos industriales para almidón en los órganos de almacenamiento, la cantidad de almidón en la hoja tiene significante importancia para la agronomía de un cultivo. El almidón se sintetiza en la hoja durante luz de día, del carbono fijado durante la fotosíntesis. El almidón se almacena en el cloroplasto y se desintegra para llegar a ser una fuente de energía e intermediario para el metabolismo en la planta. Por los mecanismos por los que la relación de vertedero de fuente se controla son desconocidos en la presente, sin embargo, es claro que la manipulación de la cantidad y disponibilidad del almidón en plástidas de hoja tendrán una influencia profunda en la productividad de planta (biomasa y cosecha). La cantidad del almidón en la hoja también será importante para aquello cultivos donde la hoja es la comodidad de planta mayor, por ejemplo tabaco. Es sabido que el contenido de almidón tiene una influencia en el sabor eventual del tabaco cuando se fuma. La provisión de un medio para manipular el nivel de almidón en niveles de tabaco podrían ser de interés a la industria del tabaco. Describimos aquí, por el primer momento, el aislamiento de un cADN que codifica una nueva enzima de ß-amilasa que se termina para las plástidas (en lo sucesivo, conocido como cloroplasto terminado (ct) ß-amilasa), por una nueva secuencia de terminación. El aislamiento de esta secuencia de codificación entera es sorprendente, como se ha considerado generalmente que la ß-amilasa tomaría parte solamente en la hidrólisis del almidón una vez que los fragmentos pequeños de poliglucano se habían liberado, ya sea por translocación o a través de la desintegración de la membrana, del plástida en el citoplasma. La locación de la enzima en plástidas abren la posibilidad imprevista de que ct ß-amilasa se incluya en la degradación del almidón transitorio colocado en cloroplastos y almidón de almacén colocado en amiloplastos. La similitud de características entre los cloroplastos y amiloplastos (Thomson y Whatley, 1 980) es de relevancia a la invención actual, como se ha mostrado que los péptidos transitorios de polipéptidos terminados de cloroplasto pueden importar polipéptidos heterólogos en amiloplastos y ceversa. Por ejemplo, el péptido transitorio de la enzima de cintaza de almidón de enlace de gránuio de maíz cuando se fusiona a la proteína de E. coli. ß-amilasa glucoronidasa (GUS) importará ia proteína GUS no solamente en amiloplastos pero también en cloroplastos (Klosgen y Weil, 1991 ). Además, mostramos que la expresión del gen ct-Bmy en Arabidopsis y la expresión del promotor ct-Bmy: fusiones GUS en tabaco transgénico puede regularse independientemente por tanto luz como sucrosa. Esto es sorprendente en vista de la luz acoplada ajustadamente y las respuestas de inducción de azúcar de ATß-Amy de Arabidopsis (Mita eí al. , 1995). La presente invención proporciona una secuencia de ácido nucleico conocida en la presente como SEQ. ID. No. 1 y que es de 1 -294 nucleótidos y que tiene dentro de la misma una secuencia capaz de terminar una secuencia más de codificación a un plástida de planta, o secuencias que son al menos de 65% o más homologas con la secuencia descrita SEQ. ID. No. 1 y que tiene la misma habilidad de terminación. Preferentemente la secuencia de ácido nucleico codifica aproximadamente 94 y más preferentemente aproximadamente 85 residuos de aminoácidos. La presente invención también proporciona una secuencia de ácido nucleico conocida en la presente como SEQ. ID. No. 2 y que es de 1 - 1642 nucleótidos y que tiene dentro de la misma una secuencia capaz de codificar ß-amilasa, o secuencias que son al menos del 65% o más homologas con la secuencia descrita dentro de la SEQ. ID. No. 2 y que tiene la misma habilidad de codificación. La presente invención también proporciona una secuencia de ácido nucleico conocida en la presente como SEQ. ID. No. 3 y que es de 1 -1953 nucleótidos y que tiene dentro de la misma una secuencia capaz de codificar ß-amilasa terminada de cloroplasto, o secuencias que son al menos del 65% o más homologas con la secuencia descrita dentro de la SEQ. ID. No. 3 y que tiene la misma habilidad de codificación. Las secuencias homologas también incluyen aquellas secuencias que hibridizan a SEQ. ID. No. 1 , SEQ. ID. No. 2 o SEQ. ID. No. 3 bajo condiciones de exigencia media (lavado a 2x SSC a 65°C). Preferentemente la secuencia de ácido nucleico es una secuencia de mARN o cADN, a pesar de que puede ser ADN genómico. La presente invención también proporciona un método de aumentar o reducir en una planta la actividad de una enzima en la vía de biosíntesis o degradación de almidón, el método que comprende las etapas de incorporar establemente en un genoma de planta un gen quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de terminación de plástida y una secuencia de codificación para una enzima en la vía degradante o biosíntetica del almidón, y regenerar una planta que tiene un genoma alterado. La presente invención también se proporciona un método de proteínas de terminación o enzimas a un plástida de planta, el método que comprende las etapas de incorporar establemente en un genoma de planta un gen quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de terminación de plástida y una secuencia de codificación para una proteína o una enzima, y regenerar una planta que tiene un genoma alterado, la proteína o enzima que es de uno o más en la vía del siguiente grupo: síntesis iípida, fotosíntesis, metabolismo de aminoácido, fijación de nitrógeno, fijación de carbono o síntesis de polímeros de carbohidrato; o que es capaz de conferir una característica a la planta, la característica se selecciona de uno o más del grupo siguiente: resistencia de herbicida, resistencia de pesticida, por ejemplo, incluyendo resistencia viral, bacterial, o fungal. La presente invención también proporciona plantas que tienen en la misma un gen quimérico que comprende un promotor, una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de terminación de plástida, la secuencia que es capaz de terminar una secuencia de codificación de una enzima en la vía degradante o biosíntetica de almidón a una plástida de planta, y un terminador. La presente invención además proporciona una secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un producto codificado por una secuencia de codificación que se une operablemente a la misma, dicha secuencia de ácido nucleico que es conocida en la presente como SEQ. ID. No. 8, o que es de al menos 65% homólogo con la misma y que tiene sustancialmente la misma función como la misma, y dicha secuencia de ácido nucleico que es respondiente a un estímulo, el nivel de expresión de dicho producto que es variable en respuesta al estímulo aplicado para dicha secuencia de ácido nucleico. La presente invención también proporciona un método de variación del nivel de expresión de un producto codificado por una secuencia de codificación unido operablemente a una secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de dicho producto en una planta, dicho método que comprende las etapas de incorporar establemente en un genoma de planta un gene quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un producto codificado por una secuencia de codificación que se une operablemente a la misma, dicha secuencia de ácido nucleico que tiene sustancialmente la secuencia de SEQ. ID. No. 8 o que es al menos del 65% homólogo con la misma y que tiene sustancialmente la misma función como la misma, y que es respondiente a estímulo. Preferentemente el estímulo es la presencia o ausencia de luz y/o variación de niveles de azúcar. Alternativamente el estímulo es un estímulo que se controla experimentalmente. Ventajosamente el azúcar es uno o más de sucrosa o glucosa. Preferentemente el azúcar es sucrosa. Ventajosamente el promotor inducible, o secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de dicho producto en una planta, es operable bajo condiciones cuando no existe luz pero el azúcar se encuentra presente, o cuando no existe azúcar pero la luz se encuentra presente. El tejido de una planta donde no hay luz pero el azúcar está presente puede ser adecuadamente órganos terrestres u órganos de vertedero. Los órganos terrestres pueden ser, por ejemplo, tubérculos, rizomas, o raíces, mientras que otros órganos de vertedero pueden ser hojas o semillas jóvenes. El tejido de una planta no hay azúcar pero la luz se encuentra presente puede ser de hojas (cuando no se transporta el azúcar), partes de flor o semillas de germinación viejas. Las células vegetales que contienen un gen quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de terminación de plástida descrita más arriba y una secuencia de codificación de ácido nucleico de una enzima en la vía degradante o biosíntetica de almidón, o un gen quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de una secuencia más de codificación, o una gen quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico descrita más arriba de que es respondiente a un estímulo y una secuencia de codificación, el nivel de expresión de dicha secuencia de codificación que es variable en respuesta al estímulo aplicado a dicha secuencia de ácido nucleico también son un aspecto de esta invención, como io es la semilla de la planta transformada que contiene uno o más genes quiméricos de acuerdo a la invención. Ventajosamente la secuencia de terminación de plástida es la secuencia SEQ. ID. No. 1 . En un primer aspecto de la invención el método de arriba puede utilizarse para alterar el metabolismo de una hoja de tal forma que el almidón se acumula en el mismo o se moviliza del mismo, este proceso que altera las relaciones de vertedero de fuente dentro de la planta como un entero. Tal puede lograr al proporcionar la secuencia de terminación y una secuencia de codificación de ácido nucleico de una enzima en la vía degradante o de biosíntesis de aluminio bajo la dirección de un promotor adecuado. La selección del promotor adecuado se daría como resultado en plantas con niveles aumentados o reducidos de almidón en las hojas que pueden ser útiles, por ejemplo, en la industria del tabaco; o alternativamente se darían como resultado en cambios en cosecha de almidón en otros diversos tejidos de planta tales como tubérculos, frutos y raíces siguientes a la modificación de las relaciones de vertedero de fuente de la planta. En esta modalidad de la invención un promotor adecuado puede dirigir la expresión de la secuencia de terminación de plástida y la secuencia de codificación de una enzima en la vía degradante o biosintética de almidón a través de la planta entera, tan llamada expresión constitutiva, o específicamente a las hojas. Estos cambios tendrán un efecto profundo de tal forma que el contenido de almidón y/o la cosecha de los órganos de la planta podrían alterarse significativamente. Un promotor preferido capaz de dirigir la expresión a través de todos los tejidos de planta es el promotor tomado del gen 35S de virus de mosaico de coliflor. Para la expresión de hoja, los promotores preferidos pueden tomarse del gen de la subunidad pequeña de carboxilasa de bisfosfato ribulosa o el gen de plastocianina de grancilla. Un experto en la materia reconocerá otros promotores adecuados tanto para la expresión constitutiva como para la expresión específica de hoja tal como el promotor de sintasa de nopalina y el promotor de proteína de unión a/b de clorofila respectivamente.
La secuencia de codificación, o partes de la misma, por la enzima en la vía degradante o biosintética de almidón puede arreglarse en la dirección de estructura de lector, es decir, sensitivo, o en la dirección de estructura de lector reversa, es decir, antisensible. La regulación hacia arriba o abajo, tecnología de cosupresión o antisensibilidad (la última como se describe por DNAP en sus Patentes Europeas Nos. 0465572 y 0647715) puede utilizarse para lograr la alteración en el almidón de la planta. En un segundo aspecto de la invención el método invención también puede utilizarse para altear el metabolismo de almidón en órganos de almacenamiento de tal forma que el contenido de almidón se aumente y/o el almidón se proporcione en una forma adecuada como se requiere para propósitos de procesos industriales particulares. Tales procesos incluyen la fabricación de papel; fabricación de farmacéuticos, textiles, productos de proyección y tintes; provisión de cocción, productos lácteos y productos alimenticios; preparación de conservas, alimentos secos e instantáneos; germinación de grano y producción de jarabes y alcohol. En el primer o segundo aspecto del método la enzima seleccionada para el uso del gen quimérico de los métodos puede ser de una vía degradante de almidón, es decir, una enzima de degradación de almidón. Ventajosamente, el gen quimérico comprende una ß-amilasa terminada de cloroplasto (en lo sucesivo, conocida como At ct ß-amilasa), y más preferentemente comprende ct ß-amilasa derivada de Arabidopsis thalianañ, (en lo sucesivo, conocida como At ct ß-amilasa), ver SEQ. ID. No. 3. Las secuencias homologas a At ct ß-amilasa que pueden ser derivables de otras fuentes de planta tales como papa, tabaco, trigo, maíz y cebada también pueden utilizarse. Los métodos estándar de clonación por hibridización o técnicas de reacción en cadena de polimerasa (PCR) pueden utilizarse para aislar las secuencias de tales organismos: por ejemplo las técnicas de clonación molecular tales como aquellas descritas en Sambrook eí al. (1989) y las técnicas de PCR descritas por Innes eí al. (1990). Otras enzimas de degradación de almidón, la secuencia de codificación de una o más de las cuales que pueden adecuarse para el uso con la secuencia de terminación de plástida, que incluyen a-amilasa, enzima de desproporción, enzima de desramificación, fosforilasa de almidón, a-glucosidasa y ß-amilasa no plastídica. En el segundo aspecto de la invención de los promotores preferidos del método inventivo que podrían dirigir la expresión a los órganos de almacenamiento de plantas podrían seleccionarse, por ejemplo, de los genes de la siguiente lista: el gen para glutenina de peso molecular elevado de endosperma de trigo; el gen para a-ß-gliadina de endosperma de trigo; el gen de hordeina de endosperma de cebada; o el gen para patatina de tubérculos de papa. Otros promotores adecuados son conocidos por aquellos expertos en la materia. En otro aspecto más de la invención, la alteración del metabolismo del tejido o alteración del tipo o características del almidón pueden hacerse respondientes a estímulo, es decir, inducible, por virtud de uso del promotor inducible descrito en la presente (SEQ. ID. No. 8). Por ejemplo, el aspecto de inducibilidad de luz del promotor inducible podría utilizarse para manipular que la semilla se establezca al inducir un gen tal como Barnasa (como se ejemplifica en la Patente WO 98/10081 para afectar el desarrollo del polen, o afectar los genes respondientes de no luz en otra forma los procesos dependientes de luz tal como maduración de fruto o germinación de semilla. El promotor de luz inducible también podría utilizarse para convertirse en genes que afectan la producción secundaria de metabolito en las hojas, por ejemplo, producción de alcaloide. Los promotores de luz inducible también pueden utilizarse para manipular los genes de enzima biosintética de almidón en las hojas u otro tejido fotosintético, o por ejemplo en convertirse en genes después de la remoción de tubérculos, por ejemplo, del almacén en oscuridad. El aspecto de inducibilidad de azúcar del promotor inducible podría utilizarse para regular los genes al, por ejemplo, desarrollar el tubérculo u otro tejido no fotosintético tal como genes para resistencia de pesticida y/o genes que pudieran afectar la calidad del cultivo post-silvestre. Para las papas, los genes de resistencia a marchitar, el esquirol y la pudrición seca podrían ser particularmente de beneficio y podrían clonarse más ventajosamente en genes recombinantes con promotores inducibles de azúcar. Alternativamente, el aspecto de inducibilidad de azúcar del promotor inducible puede utilizarse para conducir la expresión de genes para marcadores selectos en el proceso de cultivo. Un experto en la materia fácilmente puede delinear el elemento respondiente inducible de azúcar de la SEQ. ID. No. 8 y/o el elemento respondiente inducible de luz al utilizar técnicas bien conocidas, tal como estudios de supresión. Pwee y Gray (1993) describen tal estudio de supresión dentro del gen de plastocianina de grancilla utilizando un gen marcador a fin de determinar regiones operativas del mismo. Los métodos descritos en la presente o en, por ejemplo, manuales de laboratorio por Sambrook eí al. (1989) y Gelvin y Stanton (1995) para clonar secuencias de gen e insertarlas en dispositivos adecuados (vectores o plásmidos etc.) son técnicas bien conocidas para el hombre experto para poner tales conceptos en efecto. El gen quimérico o genes como se describen arriba pueden introducirse por sí mismos, o acompañarse por uno o más genes quiméricos, tal como uno o más de los otros genes descritos arriba. En el caso de lo descrito arriba las modalidades que utilizan un primer gen quimérico codifican una enzima de la vía degradante de almidón, el segundo gen quimérico puede, por ejemplo, comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de la vía biosintética de almidón también bajo la dirección de un promotor adecuado y un terminador adecuado. El promotor y/o terminador del segundo gen quimérico puede ser el mismo o diferente del promotor y/o terminador del primer gen quimérico. Las secuencias adecuadas que codifican enzimas de ia vía biosintética de almidón son las secuencias de ácido nucleico para sintasa de sucrosa, pirofosforilasa ADPG, sintasa de almidón, y también pueden incluir enzima de ramificación, a-amilasa, isoamilasa, ß-amilasa no plastidíca, a-glucosidasa, enzima de desproporción y fosforilasa de almidón. Los métodos para la introducción de más que un gen quimérico en una planta se han descrito y comprenden la proyección de un vector binario con los genes quiméricos unidos juntos en una molécula de ácido nucleico; cotransformación utilizando dos o más células Agrobacterium diferentes, por ejemplo, con vectores binarios diferentes que contienen genes quiméricos diferentes en los mismos; o la transformación de una planta que ya tiene un gen quimérico con un segundo, gen quimérico diferente, es decir retransformación. En el último caso, el método de selección de plantas transgénicas después de la introducción del segundo gen quimérico puede ser diferente del método de selección utilizado para la introducción del primer gen quimérico. Los marcadores selectos adecuados incluirían aquellos para higromicina, canamicina, sulfonamida y resistencia Basta. Los métodos biológicos tal como cruce de dos plantes, cada planta que contiene un gen quimérico único también puede utilizarse. El uso de dos estructuras de gen quimérico podrían hacerse a fin de alterar el contenido de almidón de una planta ya transformada que muestra un aumento significante en una primer actividad de la enzima y un cambio consecuente en la síntesis de almidón. De este modo, la presente invención además proporciona un método de alterar en una planta transgénica, que planta ya muestra un aumento o reducción en una actividad de la enzima como un resultado de la transformación genética, una enzima más a fin de supra o sub regular dicha enzima más y por lo tanto aumentar o reducir la cantidad de almidón producido por la planta retransformada. Ventajosamente la primer planta transformada es una planta que tiene una actividad de la enzima aumentada en la vía biosintética de almidón. Un ejemplo de un intento de aumentar el contenido de almidón de una planta es una papa transgénica transformada con el gen para ADPG-Ppase, por ejemplo glgC16 {ver por ejemplo, WO 91/19806). La cantidad de almidón aumentado en tal planta ha sido relativamente pequeño. Esta primer planta transformada se retransforma ventajosamente con un gen quimérico para una enzima de degradación de aluminio, que comprende adecuadamente, por ejemplo, At ct ß-amilasa. La proteína de glgC16 se expresa en los primeros tubérculos transformados y se da como resultado en una actividad de ADPG-Ppase y un aumento en flujo de carbono a almidón. Ventajosamente, la expresión del gen quimérico At ct ß-amilasa, o partes del mismo, en los tubérculos retransformados se da como resultado en una regulación inferior de la actividad de ct ß-amilasa, es decir tecnología antisensible y de cosupresión, de este modo se proporciona por un aumento en la acumulación de almidón. Preferentemente la expresión de la segunda enzima se dirige a los tubérculos. Un promotor adecuado para dirigir la expresión del gen quimérico At ct ß-amilasa en tubérculos es el promotor del gen para patatina. La primer planta de papa transformada que expresa glgC16 es resistente de canamicina, por consiguiente la proyección del vector binario para el gen quimérico At ct ß-amilasa lleva un gen de resistencia diferente, adecuadamente un gen para resistencia de sulfonamida, por ejemplo. La producción de almidón aumentada en el tubérculo de papa podría ser de beneficio, por ejemplo, al fabricante de papa fresca como un 1 % de aumento en problema de papa seca se daría como resultado en un 4% de aumento en producto. La fabricación de papa fresca también sirve para ilustrar otro beneficio de la invención. Cuando los tubérculos de papa se almacenan a temperaturas bajo 8°C, reducen los azúcares, glucosa y fructosa de la desintegración de almidón acumulado. Cuando las papas se fríen para frescas los azúcares de reducción reaccionan con aminoácido en la reacción Maillard para dar alcance a desintegrar la coloración y fuera de gusto en el producto. La introducción en plantas de papa de un gen quimérico que detendría la desintegración de almidón y de este modo la acumulación de azucares de reducción sería de beneficio parra la industria de comida chatarra. Preferentemente el gen quimérico comprendería la secuencia de codificación, o una parte de la secuencia, para ct ß-amilasa en una proyección antisensible o cosupresión, conducida por un promotor y terminador adecuado. Un promotor adecuado tomaría la forma del gen para patatina en tubérculos de planta. Ventajosamente cualquiera de otras enzimas de degradación de almidón mencionadas arriba podrían también utilizarse en lugar de la ct ß-amilasa. El promotor inducible de la SEQ. ID. No. 8 podría también utilizarse en la proyección de expresión coordinada en la hoja de desarrollo y en el tubérculo de desarrollo que fue requerida, como el promotor de patatina también es sucrosa inducible (Rocha-Sosa eí al. (1989). Similarmente, la secuencia para el polipéptido de terminación de la SEQ. ID. No. 1 podría también utilizarse con cualquier otro gen que carezca de su propia secuencia de terminación y que se requiera para dirigirse a las plástidas. Los ejemplos de arriba sirven para ilustrar los beneficios posibles de usar la presente invención. Un experto en la materia reconocerá que la combinación de genes y las plantas para la cual la invención podría aplicarse es considerable. Las combinaciones de gen preferentemente incluirán ct ß-amilasa con uno o más de los genes para sintasa de sucrosa, ADPG pirofosforilasa, sintasa de almidón, enzima de ramificación, a-amilasa, isoamilasa, ß-amilasa no plastídica, a-glucosidasa, fosforilasa de almidón y enzima de desproporción, las secuencias de las cuales se conocen por el hombre experto. Alternativamente, la secuencia de terminación de ct ß-amilasa puede utilizarse con uno o más de los genes de arriba. La lista de plantas que podrían transformarse preferentemente incluyen papa, trigo, maíz, cebada, jitomate, arroz, guisante, semilla de soya, cacahuate, mandioca, ñame, plátano y tabaco. La invención ahora se describirá, por vía de ejemplo, con referencia a una modalidad para aislar el cADN para ct ß-amilasa de Arabidpsis thaliana y para incorporar el cADN en plantas de papa y tabaco.
Los ejemplos también se dan en el promotor respondiente de estímulo y su actividad en las plantas transgénicas. A fin de que la invención puede llevarse fácilmente se hará ahora referencia, a manera de ejemplo, a los siguientes dibujos esquemáticos en los cuales; La Figura 1 muestra los resultados de los productos de translación de importación in vitro radiomarcados mostrados en gel SDS-PAGE seguido por fluorografía. Leyenda: Marcadores de peso molecular (vía M); productos de translación (vía Tr); cloroplastos reaislados y tratados de termolisina después de la incubación de importación (vía C); fracción estromal (vía S); tilacoidos lavados (vía T); tilacoidos tratados de termolisina (vía tT); fracción de envoltura interna (vía I); fracción de envoltura externa (vía O). Precursor putativo (P), formas intermedia (I) y madura (M) de ß-amilasa respectivamente. Kilodaltones (K); La Figura 2 muestra el efecto de luz y el efecto de luz y azúcares en la expresión de ct ß-amilasa transcripta en planta de vivero de Arabidopsis thaliana. La Figura 2a muestra el análisis de mancha Septentrional de ARNs totales de 5 semanas de edad de plantas de Arabidopsis crecidas en suelo y expuestas a 2 días de luz continua (L), 2 días de oscuridad continua (D), 2 seguidos por 3 días de luz continua (DL). La Figura 2b muestra el análisis de mancha Septentrional de ARNs totales de 5 semanas de edad de plantas de Arabidopsis, crecidas in vitro, que se transfirieron ya sea en agua y se expusieron a 3 días de luz continua (WL); o a 5% de sucrosa y se expusieron a 3 días de oscuridad (SD) o 3 días de luz continua (SL); o a 5% de glucosa y se expusieron a 3 días de oscuridad (GD) o 3 días de luz continua (GL). Las manchas septentrionales se hibridizaron con un cADN ct-Bmy inserto y autoradiografiado (paneles superiores). Los geles de formaldehído-agarosa teñidos de bromuro de etidio se muestran en los paneles de la parte inferior; La Figura 3 muestra la representación esquemática del T-ADN de los genes de promotor GUS de ct ß-amilasa quimérico proyectados en el Ejemplo 3 de abajo, en el que NosP representa el promotor de sintasa de nopalina; NosT representa el terminador de sintasa de nopalina; BR es el borde derecho invertido repetido y BL es el borde izquierdo invertido repetido del T-ADN de pBI 101 ; NPTII representa la secuencia de codificación de fosfotransferasa II de neomicina; GUS representa la secuencia de codificación de ß-glucoronidasa. Los fragmentos del promotor de ct ß-amilasa se representan por rectángulos de rayado sencillo; los fragmentos de derivación de PCR amplificado Xho l-Batn se representan por rectángulos negros; La Figura 4 muestra el efecto de luz y sucrosa en la actividad de GUS expresada de un gen quimérico de promotor GUS de ct Bmy en plantas de vivero de tabacco; La Figura 5 muestra el mapa de plásmido del vector donador pDV35S (SK) V; La Figura 6 muestra el mapa de plásmido del vector donador pDV02000; La Figura 7 muestra el mapa de plásmido del plásmido binario pBNP10431 donde 35S representa el promotor CaMV 35S, ct bamy representa la longitud completa del cADN ct ß-amilasa, 35St representa el terminador CaMV 35S, RB representa el borde derecho del vector binario pBinPlus, colElori representa la replicación bacterial de origen ColEl , RKori representa el origen oriV de replicación del plásmido RK2, nptlll representa el gen de fosfotransferasa de neomicina para resistencia bacterial a canamicina, LB representa la secuencia del borde izquierdo del vector binario, y kan representa la planta de gen recombinante de fosfotransferasa de neomicina requerida para la resistencia de planta a canamicina; La Figura 8 muestra el mapa de plásmido del plásmido binario pBNP10432 donde las abreviaciones son como para la Figura 7; La Figura 9 muestra el mapa de piásmido del plásmido binario pBNP02431 donde las abreviaciones son como para la Figura 7 excepto que el patp representa el promotor de clase I de patatina del vector pDVO2000 en la Figura 6 y nost representa el terminador de sintasa de nopalina; y La Figura 1 0 muestra el mapa de plásmido del plásmido binario pBNP02432 donde las abreviaciones son como para la Figura 9. En el listado de secuencia: SEQ. ID. No. 1 es el ácido nucleico capaz de llevar a cabo una secuencia de codificación a un plástida de planta, particularmente un cloropolasto; SEQ. ID. No. 2 es el ácido nucleico que codifica ß-amilasa; SEQ. ID. No. 3 es la secuencia completa de cloroplasto terminado de (ct) ß-amilasa; SEQ. ID. Nos. 4 y 5 son primarios utilizados en el proceso de amplificación del Ejemplo 3; SEQ. ID. Nos. 6 y 7 son primarios utilizados en el proceso de amplificación del Ejemplo 4; y SEQ. ID. No. 8 es el ácido nucleico que es respondiente al estímulo, particularmente a la luz y/o azúcar. EJEMPLO 1 Aislamiento v caracterización de cloroplasto de Arabidoosis thaliana terminado de ß-amilasa Secuencia de cADN insertada en p Bmy 81 Una búsqueda de base de datos BLASTN de la secuencia de nucleotido de un fragmento de ADN de cromosoma IV de Arabidopsis 37kb en cósmido G16599 (Bevan eí al. , 1 998) reveló la presencia de un gen de participación de homología significante con el extraclorplastico ß-amilasa de Arabidpsis, cebada maíz arroz semilla de soya y arroz. La búsqueda también de varias secuencias 3' terminal EST identificadas, una de las cuales, EST 81 E10T7 (Newman eí al. , 1995), en lo sucesivo referida como pBmydl , fue idéntica sobre aproximadamente 300 nucleótidos. El clon EST 81 E10T7 se suministró por el Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) DNA Stock Center (Ohio University, USA). Un conjunto jerarquizado de subclones de supresión ßa/31 , que extiende el cADN inserto en pBmydl , se utilizó como patrones de ADN en reacciones de secuencia de ciclo de PCR doble filamentado utilizando primarios universales marcados de tinte fluorescente. Las reaccione de secuencia se analizaron en un secuenciador automatizado Modelo Applied Biosystems 373A. La secuencia de nucleotido del cADN inserto en pBmydl se muestra en SEQ. ID. No. 3. La proyección pBmydl se depositó por Advanced Technologies (Cambridge) Limited of 210 Cambridge Science Park, Cambridge CB4 4WA bajo el Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los propósitos del Procedimiento de Patente en la Colección Nacional de la Bacteria Marina e Industrial (NCIMB), 23 St. Machar Street, Aberdeen Scotland el 4 de Agosto de 1998 bajo el No. de Acceso NCIMB 40964. Identificación de una señal de terminación de cloroplasto putativo El cADN pBmydl inserto comprende 36 nucleótidos no trasladados en la terminal 5', una estructura de lector abierta (ORF) que codifica una proteína de 548 aminoácidos y una región no trasladada 3' (UTR) de 232bp. La proteína codificada por el cADN pBmy81 inserto tiene un peso molecular predicho de 61 kDa y comparte similitud de aminoácido elevada con la planta extracloroplastica ß-amilasas de maíz, arroz, cebada, semilla de soya y papa dulce. Sin embargo, la proteína codificada por pBmydl difiere de todas las otras ß-amilasas reportada hasta ahora en que contiene una extensión de terminal N única que posee las características de una señal de terminación de cloroplasto es decir, un contenido elevado de serina (16%), treonina (10%) y cargada positivamente de residuos de aminoácido (15%) (Baier y Dietz, 1 997). Tres dominios que son características distinguibles de señales de terminación de cloroplasto (Schatz y Dobberstein, 1996) se identificaron en la secuencia de señal: un dominio de terminal de amino no cargado; un dominio central rico en aminoácidos hidrolizados; y un dominio de terminal de carboxi con el potencial para formar un filamento ß anfifílico. cADN inserto en pBmydl codifica una ß-amilasa terminada de cloroplasto Los cloroplastos intactos se aislaron de 50-60 g de vastagos de grancilla (Pisum sativum L. Var Feltham First) utilizando etapa-gradientes Percoll. El material de planta creció y los cloroplastos se aislaron de acuerdo al método de Mould y Gray (1997a). El plásmido pBmydl se linealizó por restricción de descomposición bioquímica con ?/sí/ y se transcribió in vitro utilizando polimerasa de ARN T7. La proteína de precursor radiomarcada se sintetizó en un sistema de translación de germen de trigo, que incluye 35S- metionina 35 S-cisteina de copias exactas del cADN pBmy81 esencialmente como se describe por Mould y Gray (1997b). La importación de productos de translación in vitro radiomarcados se desempeñaron como se describe por Mould y Gray (1997b). Después de la incubación de importación, los cloroplastos intactos se trataron con termolisina (0.2 mg/ml de concentración final en regulador de importación) por 30 min en hielo y después la reacción de proteasa se detuvo por la adición de EDTA a 50 mM en regulador de importación. Los cloroplastos se reaislaron a través de un amortiguador 40% Precolí en regulador de importación y después se lavaron en regulador de importación (Mould y Gray, 1997b). Una alícuota (1 /10) de la muestra de cloroplasto tratado de termolisina se tomó para análisis y el resto se fraccionó esencialmente como se describe por Schnell y Blobel (1993). Las muestras de cloroplastos tratados de termolisina, fracción estromal, tilacoides y tilacoides tratados de termolisina se cuantificaron por SDS-PAGE seguidos por coloración azul comasi y densitometría de exploración de bandas de proteína teñidas (subunidades de carboxilasa de bisfosfato de ribulosa y proteínas de complejo de recolección de luz se utilizaron como estándares). Las cantidades equivalentes de estas fracciones (aproximadamente iguales al 2% de los cloroplastos recubiertos del gradiente Precoll), y 505 de la fracciones de envoltura interna y externa recubiertas, se analizaron por electroforesis en un 10% de gel poliacrilamida en la presencia de SDS, seguido por flurografía. Los resultados (Figura 1 ) muestran que el producto de translación mayor (vía Tr) fue de aproximadamente 58 kDa. Cuando se aislaron, los cloroplastos de grancilla intacta se incubaron con la proteína radiomarcada en la presencia de ATP, polipéptidos de aproximadamente 50 kDa y 48 kDa se generaron (vía C). La resistencia de estos polipéptidos a la degradación por termolisina agregada exógenamente, indica que son productos de importación de producto radiomarcado. El fraccionamiento de los cloroplastos tratados de termolisina intacta en estroma, tilacoides lavados, tilacoides tratados de termolisina, envolturas internas y envolturas externas, demostraron que los dos polipéptidos radiomarcados se colocaron en la fracción estromal. EJEMPLO 2 Sucrosa e inducción de luz de Arabidopsis thaliana de gen ct ß-alimasa Para demostrar la inducción de ct ß-alimasa en luz de plantas de Landsberg ecotipo de Arabidopsis thaliana crecieron en el invernadero bajo 18 horas de luz, 6 horas de régimen oscuro a 18°C. Después de 5 semanas, dos platillos de planta de vivero crecieron en luz continua. Después de 2 días, un platillo de planta de vivero adaptada a la oscuridad y un platillo de planta de vivero de crecimiento de luz se utilizaron para aislamiento de ARNs totales, y el segundo platillo de cada una se expuso a 3 días más de luz continua. Para los tratamiento combinados de sucrosa luz-oscura, semillas de ecotipo de Landsberg se esterilizaron en superficie, colocados en un medio agar MS que contiene 1 % de sucrosa y crece en un cuarto de cultivo con 18 horas de luz, 6 horas de régimen oscuro. Las plantas de vivero de cinco semanas de edad se transfirieron en agua destilada esterilizada o un 5% de solución de sucrosa o glucosa en agua. Las plantas de vivero se mantuvieron ya sea en luz u oscuridad continua por tres días. Los ARNs totales se prepararon de plantas de vivero de cada prueba y se analizaron por análisis de mancha septentrionales como se describe por Eggermont eí al. (1 996). Las septentrionales se probaron con el cADN inserto purificado de gel en pBmydl siguiendo el marcado al azar con 32P-dCTP como se describe por Feinberg y Vogelstein (1983). Los resultados mostrados en la Figura 2A indican que el genetranscripto de ct ß-amilasa es inducible debido a la luz. Los resultados mostrados en la Figura 2B indica que la copia exacta de ct ß-amilasa se induce en la oscuridad con 5% de sucrosa y a una menor extensión con 5% de glucosa. Esta inducción se mejora además en la luz en la presencia de los azúcares. Estos resultados muestran que el efecto de luz y azúcares son independientes de cada uno. EJEMPLO 3 Proyección de fusiones de promotor GUS de ct ß-amilasa Los fragmentos del promotor se aislaron del gen ct ß-amilasa colocado en cósmido G16599 (Bevan eí al., 1998) por restricción de descomposición bioquímica de enzima. Los sitios de restricción convenientes en el promotor fueron Hind III en la posición de nucleótido -1662 bp (comenzando en 19179 bp en el filamento menor de SEQ. ID. No. 8), Sal I en -1 127 bp y Pst I en -371 bp y un sitio Xho I colocado en la posición +21 bp contracorriente de la metionina de inicio de ct ß-amilasa se utilizaron para aislar tres longitudes diferentes del promotor más la secuencia de péptido transitorio (la A de ia metionina de inicio de translación ATG se numera +1 ). Un fragmento 294 bp (SEQ. ID. No. 1 ) del gen de ct ß-amilasa colocado en cósmido G 16599 (Bevan eí al. , 1998) se amplificó utilizando ios primarios de oligonucleótido; SEQ. ID. No. 4 P1 : (5' - AAT TCC TCG AGT TCT CTT ATC - 3') y SEQ. ID. No.5 P2: (5' - cgg gAT CCC TGA CAT TGT TAC - 3'). En el primario P1 , las bases subrayadas se refieren al sitio Xho I colocado en la posición +21 bp; en el primario P2 las bases en el caso inferior se refieren a los nucleótidos agregados a fin de crear un sitio Bam Hl. Los genes quiméricos de promotor GUS de ct ß-amilasa se crearon por triple ligación del fragmento del promotor; el fragmento de derivación de PCR recopilado con Xho I y Bam Hl; y el vector GUS pBI101 (Jefferson eí al., 1987) recopilado con Hind lll-Bam Hl, Sal \-Bam Hl o Pst i-Bam Hl (Figura 3). Las proyecciones se denominaron HßGUS, SßGUS y PßGUS respectivamente. Las proyecciones de gen quimérico se transfirieron a Agrobacterium tumefaciens LBA4404 por acoplamiento triparental (Bevan, 1984) y se introdujeron en Nicotiana tabacum var Samsun por el método de transformación de disco de hoja (Horsch eí al. , 1985). Sucrosa e inducción de luz de gen quimérico de Arabidopsis thaliana de promotor GUS de ct ß-amilasa en plantas de vivero de tabaco. Las plantas que contienen las proyecciones de HßGUS y PßGUS que expresaron niveles elevados de actividad GUS y la descendencia de planta de vivero F1 de las líneas se utilizaron para investigar la expresión inducible de sucrosa y luz de ios genes quiméricos. Las semillas de tabaco F1 se esterilizaron en superficie, colocados en un medio agar MS que contiene 1 % de sucrosa y crecieron en un cuarto de cultivo con 18 horas de luz, 6 horas de régimen oscuro. Las plantas de vivero de dos a tres semanas de edad se transfirieron en una solución de 5% de sucrosa a un agua destilada y se mantuvieron ya sea en luz u oscuridad continua por tres días. Los extractos de proteína totales de grupos de 10 a 14 plantas de vivero se analizaron por la actividad GUS utilizando el sustrato fluorogénico 4-metilumbeliferil-glucuronido (4-MUG) como se descpbe por Jefferson eí al. (1987). Con ambas proyecciones, el nivel de actividad GUS en plantas de vivero expuestas a luz continua en la ausencia de sucrosa fue similar a los niveles de actividad GUS en plantas de vivero expuestas a sucrosa en la ausencia de luz (Figura 4). Sin embargo, la exposición de plantas de vivero tanto a la luz continua y niveles aumentados de sucrosa de actividad GUS por aproximadamente de dos a tres pliegues. Estos resultados en general se encuentran de acuerdo con los resultados de los experimentos con el gen por sí mismo de ct ß-amilasa que mostró que la inducibilidad de luz e inducibilidad de sucrosa son procesos independientes. La coloración histoquímica para GUS mostraron que la actividad se detectó en los cotiledones de las plantas de vivero de dos semanas de edad y la pequeña o no actividad en las primeras hojas o en los troncos y raíces naturales. En las plantas de vivero de cuatro semanas de edad, la actividad GUS adicional se mostró a través de las primeras hojas naturales y también en los troncos. La coloración de GUS se asoció particularmente con células de parenquima (clorenquima) ricas en cloroplasto colocadas entre los rayos xilema y entre xilema y en los fascículos de floema que constituyen el floema interno en los troncos. EJEMPLO 4 Proyección de plásmidos de ct ß-amilasa para utilizarse en la transformación de hojas de papa v tabaco La mutagénesis de sito dirigido se utilizó para convertir el sitio Kpn I colocado en la posición 2302 bp del plásmido pBmydl a un sitio Bam HL Los primarios de oligonucleótido: SEQ. ID. No. 6 P3: (5' - GCT GGT ACG CCT GCA GGA TCC GGT CCG GAA TTC CC -3') y SEQ. ID. No. 7 P4: (5' - GGG AAT TCC GGA CCG GAT CCT GCA GGC GTA CCA GC - 3') se designaron y se utilizaron con el equipo de mutagénesis de Quick Change de sitio dirigido. El protocolo fue como se perfiló por el fabricador. La longitud completa de la secuencia de codificación de ct ß-amilasa se separó del plásmido pBmydl mutado por la división con Bam Hi y después se purificó con GeneClean (BIO 101 ). El fragmento de Bam Hl se ligó en el sitio Bam Hl de los vectores donadores pDV35S (SK)V (ver Figura 5) y pDV02000 (ver Figura 6). El pDV35S (SK)V consiste de pBluescript (Strategen) que lleva un terminador 35S CaMV de promotor 35S, proyecciones similares se conocen en la materia (por ejemplo, Odell eí al. , 1985). El pDV02000 consiste de pBluesript con un terminador de cintaza de promotor de nopalina de 1 .4 kbp de patatina. Un experto en la materia podría hacer proyecciones similares de secuencias conocidas (por ejemplo, Liu eí al. , 1990). Los plásmidos con la secuencia de codificación tanto en la orientación sensitiva y antisensible en relación a los promotores se aislaron, y los genes quiméricos de ct ß-amilasa subclonados de los vectores donadores en el vector binario pBinPlus (van Engelen eí al. , 1995). Los mapas de plásmido se mostraron en las Figuras 7-10. EJEMPLO 5 Transformación o Retransformación de plantas Las plantas de papa se transformaron utilizando el método de cocultivación de disco de hoja como se describe esencialmente por Horsch (1985). Los vectores binarios como se describieron arriba se transfirieron a Agrobacterium tumefaciens LBA4404 utilizando el método de electroporación, y cultivos de dicha Agrobacteria utilizados en la transformación de tal forma que las plantas regeneradas llevan los genes quiméricos como se describen en el Ejemplo 4. El plásmido binario de patatina de gen quimérico del terminador de sintasa del promotor ct ß-amilasa-nopalina, puede utilizarse para transformar una planta de papa que lleva ya el gen quimérico para E. coli ADPG-Ppase glgCl ß por los métodos de cocultivación de disco de hoja. EJEMPLO 6 Proyección de plásmidos con el péptido de terminación de AT de ct ß- amilasa La secuencia de terminación de plástida de AT ct ß-amilasa se contiene dentro de un fragmento 294 bp equivalente a SEQ. ID. No. 1 . La amplificación de PCR o restricción de descomposición bioquímica de enzima puede utilizarse para aislar los fragmentos de ADN de los plásmidos descritos en el Ejemplo 3, es decir, los fragmentos consistirán del promotor 35S CaMV más la secuencia de terminación de plástida o el promotor de patatina más la secuencia de terminación de plástida. Los genes quiméricos pueden proyectarse al ligar las secuencias de codificación para proteínas o enzimas como fusiones traslacionales con la secuencia de péptido transitorio. Las proteínas trasladadas podrían transportarse a las plástidas para proporcionar nuevas actividades o para afectar las vías metabólicas. REFERENCIAS Ainsworth, C, Clark, J. y Balsdon, J. (1993). Plant. Mol. Biol., 22, 67-82.
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LISTADQ DE SECUENCIAS d) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTES: (A) NOMBRE: Advanced Technologies (Cambridge) Limited (B) CALLE: Globe Housel Water Street (C) CIUDAD: Londres (D) PAÍS: Inglaterra (F) CÓDIGO POSTAL: WC2R 3LA (") TITULO DE LA INVENCIÓN: Secuencia de ácido Nucleico con terminación de plástida secuencia beta-amilasa, un promotor responsivo a estímulos u usos de los mismos (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 8 (iv) DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO:: British American Tobacco (Investments) Limited (B) CALLE: Regents Park Road (C) ESTADO: Southampton (D) PAÍS: Inglaterra (F) CÓDIGO POSTAL: S0158TL (v) FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Diskette 3.50 pulgadas (B) COMPUTADORA: Vigíen p575 (C) SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS Windows 95 (D) SOFTWARE: Microsoft Word 97 (vi) FECHA DE SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: Aun no se conoce (C) CLASIFICACIÓN: Aun no se conoce (viii) INFORMACIÓN DEL AGENTE/ABOGADO (A) NOMBRE: Mrs. M.R. Walford/Mr. K.J.H. MacLean (C) CLASIFICACIÓN: RD-ATC-18 (ix) INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN: (A) TELEFONO: 01703 777155 (B) TELEFAX 01703 779856 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID. NO:1 (!) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD: 294 bps (B) TIPO: Nucleótido (C) FILAMENTACIÓN: Doble (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Arabidopsis thaliana (B) CEPA: Ecotype Colombia (C) TIPO DE TEJIDO Hoja (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: Centro de Reserva de ADN ABRC (B) CLON: EST81E10T7 (viii) POSICIÓN EN EL GENOMA: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: Cromosoma IV (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE: Péptido de tránsito (B) UBICACIÓN: 37-291 bp (x¡) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID. NO:1: 1 TCATTTCTCATClATAACS tf-sAGAGA M E L T L N S S 8 61 AC-TTCTCTTATC?AACsTAAAGATsCCAAG^^ S S L I K R K D A K S S R N Q E S S S N 28 121 AAC?TGACCrcTGCGAAGATGAAGCCGCa N M T F A K M K P P T Y Q F Q A K N S V 8 181 AAGGA TGAAGTTCACri^C GAAGACCrm^^ K E M K F T H E K T F T P E G E T L E K 68 241 TGGGAGAAGCTCC-ACOTTCTCrc?TACCCACAC E K L H V L S Y P H S K N D A S V 85 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID. NO:2 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA . (A) LONGITUD: 1662 (B) TIPO: Nucleótido (C) FILAMENTACIÓN: Doble (D) TOPOLOGÍA: Lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Arabidopsis thaliana (B) CEPA: Ecotype Colombia (C) TIPO DE TEJIDO Hoja (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: Centro de Reserva de ADN (B) CLON: EST81E10T7 (viii) POSICIÓN EN EL GENOMA: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: Cromosoma IV (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE: Secuencia de Codificación (B) UBICACIÓN: 1-1393 bps (D) OTRA INFORMACIÓN: Péptido maduro (x¡) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID. NO:2: 1 GTTCCOGTOTtCaTC&TGTTACCGCTCGACA^^ V F V F V K l_ P I» D T V T M S Gr H I? ?I K 2C SI QCÍ_QG?l&CA?(___W& P R A M H A S Ii M A ?í K ß ? G V B G V M 40 121 GTGSATGCTTGsTOGGGAraaGTCGA<2J^^ V D A W H G L V B K D Q P M -í Y H W E íS ßO 181 TATGCO^GCCTATAC^ATí^TTaiAAAGC^^ Y A E ? I Q M V Q K H G ?. L Q V V M S 80 F H Q C G G H V G D S C S X P J. P P W V 100 501 CTTGAAO?^T -AGCJVAGAACCC^ I. E B I S K H P D I. V Y T D S G R K N 20 361 CCTOAMATATCTCCITGQGATG TATTCTßTQCMaTC P E Y I S L G G TI S V P V R G R T P I 140 421 CA3GTCpACTCAGATTrCATGAG^3AGCTTCCGTGAAC<_A ^ Q V Y S D F M R S F R E R F S G Y I G G 160 481 GT ATTGCGGARAtTC7?VGTAssAA GGGACCT GTGGAGAATTGAGA ACCCATCATAC V I A E I Q V G M G P C G E R Y P S Y 180 5 1 CCTGAAAGCAACGGGACCIOGAsATTCCCCGGAATTsGAGAGTTC<_AGTGCrA _aCAAG P E S N G T W R F P G I G E F Q C Y D K 200 601 TATATGAAATCGTa.CTTC-AssCATATGCTGAAT Y M K S S L Q A Y A E S I G K T N W G T 220 661 AGCGaACCTC-ATGATr^CGGCGAGTAa-AGAACCTC S G P H D A G E Y K N L P E D T E F F 240 721 AGAGACGGAACATsGAATAGCGAGTATGGAAAGTTTp^ R D G T W N S E Y G K F F M E W Y S G K 260 781 CTGCT GAACATGGAsACK_-? CTarrATCra^ L E H G D Q L S S A K G I F Q G S G 280 841 GC-AAAGCTATCAGGAAAGGTAGC GGAATTC_ACTGGC_AC^^ A K L S G K V A G I H W H Y N T R S H A 300 901 GCTGAGCTAAO.aCTGGATAT AClAACACAAGAAA(XATfJACGG^ A E L T A G Y Y N T R N H D G Y Ii P I A 320 961 AAGATGT C?AC_AAAC-ATGGAsT GTGC_^aUCTTCACCTGCATGGA K M F -T K H G V V I. N F T C M E M K D G 360 1021 GAGCAACCTGAG _ACGCsAATTGCTC?CCAG-AAsstCTGGTCAAGCAAGTACAs E Q P E H A M C S P E G L V K Q V Q N A 380 1081 ACAAGGCAGGC _GAACCGAACrAGC_AGsGsAsAACGCGCTAGAACGATATsACTCGAGC T R Q A G T E A G E N A L E R Y D S S 400 1141 aCATTCGGAaU_GTGGTAGC_AAÍ_AAATAsGTCAsATT^^ A F G Q V V A T N R S D S G N G L T A F 420 1201 ACTTACCTAAGAATGAACS?GCGGTTATTTGAGGGTC?^ T Y L R M N K R I. F E G Q N W Q Q L V E 440 1261 TTTaCTAAGAACATGAAGGAAGGTGGTCATsGGAGX_AsA<_TCTC2^^ F V K N M K B G G H G R R L S E D T T 460 1321 QGAAGTGAa?ITTATGTTGGATTTGTro? _GGCAAG G S D I. Y V G F V K G K I A E N V E E A 80 1381 GCTTTArrGTAA TTCCCACATAQ3 ACATACATATAaTGTGaTGTTTATTGTATTCCTG A 1. V - 483 1441 C GATAAATAACTAr_aGAGATa!WU.CCAsTAAsAGTsTTAAAsCTATAGATTTGCACAA 1501 TCTGGGTCAGAG CAGAGCaAAGAGAAGCAAAA CAAGAT TGTAClACrTAGA GTAT 1561 CCTATGMTTTTCCTTGTACLATCATCra^ 1621 ercCAAAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCsC CTAGAGGATCC (2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID. NO:3 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1953 (B) TIPO: Nucleótido (C) FILAMENTACIÓN: Doble (D) TOPOLOGÍA: Lineal (il) TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Arabidopsis thaliana (B) CEPA: Ecotype Colombia (C) TIPO DE TEJIDO Hoja (vii) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: Centro de Reserva de ADN ABRC (B) CLON: EST81E10T7 (viii) POSICIÓN EN EL GENOMA: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: Cromosoma IV (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE: CDS (B) UBICACIÓN: 37-1683 bps (D) OTRA INFORMACIÓN: Cloroplasto terminado (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID. NO:3: 1 TC_ATTTCrC?TCATAACAAAGAGAGAsAAAAAAACTATGGAATTGAC_AC GAATrCCTCG M E L T L N S S 8 61 AGTTCTCITAlX_ ACGTAAAGATGCC_AAG^^ S S L I K R K D A K S S R N Q E S S S N 28 121 AACATGACCI GCGAAGATGAAGCCGCCAACATATC?GTTCCAAGCAAAsAACrCGGTT N M T F A K M K P P T Y Q F Q A K N S V 48 181 AAGGAAATGAAGTTCACTC-A8AsAAGACCI C?CGC^ K E M K F T H E K T F T P E G E T E K 68 241 TGGGAGAAGCTCC^CGTTCTCTCATACCCl^^ W E K L H V L S Y P H S K N D A S V P V 88 301 Ta3TCATX.TTACCGCTCGACACAGTAACAATGTCAGGGCATTTGAACAAACCACGAGCC F V M L P L D T V T M S G H L N K P R A 108 361 ATGAACGCTAGTTTGATGGCTCTGAA?GGAGCTGGTGTGGAAGGTGTGATGGTGGATGCT M N A S L M A L K G A G V E G V M V D A 128 21 TGGTGGGGATTGGTGsAGAAAGATGGACCTATGAATTATAACTGGGAAGGCTATGCCGAG W W G L V E K D G P M N Y N W E G Y A E 148 481 CTTATAC^USATGGTTCAAAAGCACsGTCTCAAACTCCAGGTCGTTATGTCATTC CATCAA L I Q M V Q K H G L K L Q V V M S F H Q 168 5 1 TG GGAGGAAACGTAGGAGACTCTTGCAGTATCX:CCT GCCTCCATGGGTGCTTGAAGAG C G G K V G D S C S I P L P P W V L E E 188 601 ATCAGC_AAGAACCCTaATCTTGTCTACACAGA(aj^TCTGGGAsAAGGAACCCTGAATAT I S K N P D L V Y T D K S G R R IT P E Y 208 661 ATCrrcCTTGGGATGTGATTCroTGCCTGTCC^^ I S L G C D S V P V L R G R T P I Q V Y 228 721 TGAGATTTC_ATGAGGAGCITCCGTGAA _ArrTGAAGsCTAC^ S D F M R S F R E R F E G Y I G G V I A 248 781 GAAATTCAAGTAGGAATGGGACX iTCTGGAGAATTGAaA^ E I Q V G M G P C G E Ii R Y P S Y P E S 268 841 AACGGGACCTGGAGATTCCCCGGAATTsGAGAGTTCCAGTGCTACGACAAGTATATGAAA N G T W R F P G I G E F Q C Y D K Y M K 288 901 TCGTCACTTCAGGCATATGCTGAATCAATTGGGAAAAC^^ S S L Q A Y A E S I G K T N W G T S G P 308 961 CATsATGCr_OGCGAOTAO«VGAACCTCCCA^ H D A G E Y K KT Ir P E D T E F F R R D G 328 1021 AC&TGGAATAsCGAGTATGGAAAGTr-TTCAT^ T W N S B Y G K F F M E W Y S G K L L E 348 íosi CATGGAGACO?CGCCTATCTTCAGC?AA^ H G D Q L L S S A K G I F Q G S G A K 'L 368 11 1 TCAGGAAAGGTAGCK8AATTC_ACTGGC?CTACAAC-AC^ S G K V A G I H W H Y N T R S H A A ? L 388 1201 ACCGCTGGATATTACAAC_ACAAGAAACCATGA T A G Y Y N T" R N H D G Y I? P I A K M F 408 1261 Aa?ACATGGAGTTGTGCTraiACTTCACCT^ H K H G V V L N F T C M E M K D G E Q P 428 1321 GAGCAax ATIGCTCACCAGAAGGTCTGGTCAA^ E H A K C S P E G L V K Q V Q K A T R Q 448 1381 GCOK3AAO_OAACrAGC?GGGGAGAACGC»CrAGAACGATATGACT 3AGC A G T E A G B N A L E R Y D S S A F G 468 14 1 C_AAGTGGTAGCAA(_AAATAGGTCAsATTCrGGAAATsGGTTAACCGC^ Q V V A T N R S D S G N G L T A F T Y I. 488 1501 AGAATGAAClAArJCGGTTATTTGAGGsTCAAAATTGGCAGClAGTTAGTGsA R M N K R L F E G Q N W Q Q L V E F V K 508 1561 AAC-ATGAAGGAAGGTGGTCaTGGGAGGAGACTCIX-?AAAGAA N M K E G G H G R R L S K E D T T G S D 528 1621 CTTTATGTTC33ATTTGTayy^GG<_AAsATCGCrrGAGAATGTGGAGsAGGCrrGCTTTAGTG L Y V G F V K G K I Á E N V E E A A L V 548 1681 TAATTTCCCACATAGGTAC-ATACATATAGTGTGGTGTTTATTGTATTCCTGTCTGATAAA 17 1 TAACGAGAGAGATO -ACCAGTAAGAGTCTTAAAGCTATAGATT GCACAATT GGGGTC 1801 AGAGTCAGAGCAAAGAGAAGC.AAAATCAAGATGATGTAC-ACTTAGATGTATCCTATGAGT 1861 TTTCCTTGTACATC?TCTTCATACTCriTAATCT^ 1921 AAAAAAAAAAAGGGCGGCCGCTCTAGAssATCC (2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID. NO:4 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA J (A) LONGITUD: 21 bp (B) TIPO: Nucleótido (C) FILAMENTACIÓN: Filamento único (D) TOPOLOGÍA: Lineal (xl) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID. No.4: AATTCCTCGA GTTCTCTTAT C 21 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID. NO:5 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD. 21 bp (B) TIPO: Nucleótido (C) FILAMENTACIÓN: Filamento único (D) TOPOLOGÍA: Lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID. No:5: CGGGATCCCT GACATTGTTA C 21 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID. NO:6 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 bp (B) TIPO: Nucleótido (C) FILAMENTACIÓN: Filamento único (D) TOPOLOGÍA: Lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID. No:6: GCTGGTACGC CTGCAGGATC CGGTCCGGAA TTCCC 35 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID. NO:7 (I) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 35 bp (B) TIPO: Nucleótido (C) FILAMENTACIÓN: Filamento único (D) TOPOLOGÍA: Lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID. No:7: GGGAATTCCG GACCGGATCC TGCAGGCGTA CCAGC 35 INFORMACIÓN DE SECUENCIA PARA SEQ. ID. NO. 8 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ. ID. NO:8 (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1652 bp (B) TIPO: Nucleótido (C) FILAMENTACIÓN: Doble filamento (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN Genómico (vi) FUENTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Arabidopsis thaliana (B) CEPA: Ecotype Colombia (C) TEJIDO Hoja (v?i) FUENTE INMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: Proyecto de Genoma de Arabidopsis EU (B) CLON: Cosmido G16599 (viii) POSICIÓN EN EL GENOMA: (A) CROMOSOMA/SEGMENTO: Cromosoma 4 (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE: Promotor (B) UBICACIÓN: 17534-19185 bps de G16599 Cepa complementaria (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ. ID. NO:8: 1 AAGCTTGTGT CTATTTCAAA TTCTTGACCG TAGATGTCAC AACATGCATA 51 TATCATTGAA AACAGAGCAA CACAGGAAAC CAAGCATATG TATCTAGATA 101 TACTTAGCAA GACATAACTA TAGTCTTTGA ATCAACATAG ssATTAATGA 151 TAGAGAATGA GGAAGCTCAA GATTTTATAC TC-AGTTTCTT ACAAAACAAA 201 TTTCTCTCTA ACTGCAAAAA CACCAATTAG GATTTGAAGA GCGTACCTGT 251 TTGAGTCAAT GTCCAATGTC GTCCCCCCGC CTTCTACATT TCTTAGCCTG 301 CTGAATAAAA GCACAAGCCA AAATGAGAAG GTGCCAAAGG CGATAAGGAT 351 CAATTTCTAC CATTCAAAAA ACTAATGGTG AGAATTAGAA ACGAGAGAAA 401 ACTACTTGTT GAGGAAATAG CCAAAAGCGC AATCTTCGTC ACCTGAATAA 451 AGACCAAACC GTCACTTTCA ATGAGTCAGC AAGAAAAAGA GAGAGAGAGA 501 GAGAGAGATT CTCTATAACA TTTGAGTCGA CATGGATTCT AATGCATCAA 551 AAGTCATCTC CAATAAACAA ACACTTGAAA CTCACATGGC TAATAGAACA 601 AGATCAAAGC CTTAAGTATT AAGCATTACA GACACTACTG GCTAACTTTT 651 GACACAGT CTTAAGTAAC ATAGTATCAA TATCCGTGAA TCACATCGAA 701 CACACACAAC AAGGGCTTAA TGCATCAAAG TCCTGTTATT TCCATATAAC 751 AACATAGTTC ATTTACAAAC AGAATGCAGC ATTCAGGCAG TCCAAATGGA 801 AAGGTTGACA AAAAAATATA ATCTTGTAAC TCTACATATA TGGCAGAATG 851 TAATAACCAG GCAAGAAAAA AACAQAATAA ACAGATCAAT GAGTATGATA 901 TA?A??AAAG TCACAAAQAA TGTGCCACAG TGAACAAGAG GGCCATGAsA 951 AGAAATXTTC AAAGAAAATA TTAGCATTGT TAGAATTTTT TssGTCAATG 1001 GATCTGTCAG CTGCTTAGTT GGAAAACACA AATCTTACAG GAAGGAAAGT 1051 CCAAGAAAAA GAAAATAAGC AAAGTTAATA GCCACCACAA GAAATTTCAT 1101 ACAGAAATAA TTAAATCGTT GCACTTATCT TCTTATTCAA ACTAAAATCA 1151 AGAGAACTTA ATAATTTTCA GCCACACGAA CCATGTGTTC AAAGCCAAAG 1201 GTGAGAAGCC AAAATTATCA GCTTATCTCC ATTAACAAss GAAAAGCAAG 1251 ACTAGAT TA AGAGTTCTCT GTAACTAAAA ACTGCAGGAG TGAGTAAGTA 1301 AATAATTCAC CAACAGGAAA ACAAAACTCA ATTATCTATA sCTGAATACA 1351 CATGTAAATG AGAATTTATT AACTAAAACA TCTTCCTTTG TAACTGATGT 1401 GACATTTACA ATTTTTCATT TTsAGGTGTA AGAACCGTGT GACAAGTGAA 1451 AAGGTTAAAA TAAGCAACCT TTGTGATATT TTCTCTCCAC TTTTTGAAAT 1501 TGGGTCTCCA AACCACAGCC AATCAATATT CTTTATAAAT ACAAACACAC 1551 AAACAGCATC TTTCTCTCAA ACACAAACAT ATCTTCTATC AAACACCAAC 1601 AGCTCTATTC TCTACCTCAT TTCTCATCAT AACAAAGAGA GAGAAAAAAA 1651 CT

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1 . Un método para aumentar o reducir en una planta la actividad de una enzima en la vía de degradación o biosíntesis de almidón, comprendiendo el método las etapas de incorporar establemente en un genoma de planta un gen quimérico que comprende una secuencia de aminoácido que codifica una secuencia de terminación de plástida y una secuencia de codificación para ß-amilasa, y regenerar una planta que tiene un genoma alterado. 2. Un método según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha secuencia de ácido nucleico comprende la secuencia de la reivindicación 10. 3. Un método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque dicha secuencia de codificación es la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 1 3, que es una secuencia de codificación para una ß-amilasa. 4. Un método según la reivindicación 1 , caracterizado porque dicha secuencia de ácido nucleico es la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 14. 5. Un método según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque dicha enzima es ß-amilasa. 6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, caracterizado porque dicho gen quimérico comprende además la secuencia de codificación de una enzima del grupo que consiste de sintasa de sucrosa, pirofosforilasa ADPG, sintasa de almidón, enzima de ramificación, a-amilasa, isoamilasa, ß-amilasa no plastídica, a-glucosidasa, fosforilasa de almidón y enzima de desproporción . 7. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, caracterizado porque dicho gen quimérico comprende además un promotor, dicho promotor es una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1 5. 8. Un método para terminar enzimas o proteínas para una plástida de planta, comprendiendo el método las etapas de incorporar establemente en un genoma de planta un gen quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de terminación de plástida y una secuencia de codificación para una proteína o una enzima, y regenerar una planta que tiene un genoma alterado, la proteína o enzima siendo una o más en la vía del grupo siguiente: síntesis lípida, fotosíntesis, metabolismo de aminoácido, fijación de nitrógeno, fijación de carbono o síntesis de polímeros de carbohidrato; o siendo capaz de conferir una característica a la planta, la secuencia de ácido nucleico siendo la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 10. 9. Un método según la reivindicación 8, caracterizado porque dicha característica se selecciona de uno o más del grupo siguiente: resistencia a herbicida y resistencia a pesticida. 10. Una secuencia de ácido nucleico conocida en la presente es SEQ. ID. No. 1 y que es desde 1 -294 nucleótidos y que tiene dentro de los mismos una secuencia capaz de terminar una secuencia de codificación para un plástida de planta, o secuencias sustancialmente similares a la misma y que tienen la misma habilidad de terminación. 1 1 . Una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1 0, caracterizada porque dicha secuencia de ácido nucleico codifica hasta 94 residuos de aminoácido. 12. Una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque dicha secuencia codifica hasta 85 residuos de aminoácido. 13. Una secuencia de ácido nucleico conocida en la presente como SEQ. ID. No. 2 y que es de 1 -1662 nucleótidos y que tiene dentro de los mismos una secuencia capaz de codificar ß-amilasa, o secuencias sustancialmente similares a la misma y que tiene la misma habilidad de codificación. 14. Una secuencia de ácido nucleico conocida en la presente como SEQ. ID. No. 3 y que es de 1 -1953 nucieótidos y que tiene dentro de los mismos una secuencias capaz de codificar ß-amiiasa terminada de cioroplasto, o secuencias que son de al menos 65% o más homologas con la secuencia descrita dentro de SEQ. ID. No. 3 y que tiene la misma habilidad de codificación. 15. Una secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un producto codificado por una secuencia de codificación que se une operablemente a la misma, dicha secuencia de ácido nucleico conociéndose en la presente como SEQ. ID. No. 8, o que es de al menos 65% homologa con la misma y que tiene sustancialmente la misma función como la misma, y dicha secuencia de ácido nucleico siendo responsiva a estímulos, el nivel de expresión de dicho producto siendo variable en respuesta al estímulo aplicado a dicha secuencia de ácido nucleico. 16. Una secuencia de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicac?ones 1 0-1 5, caracterizada porque dicha secuencia de ADN genómico, mARN, o cADN. 17. Un método para variar el nivel de expresión de un producto que se codifica por una secuencia de codificación unida operablemente a una secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de dicho producto en una planta, comprendiendo dicho método las etapas de incorporar establemente en un genoma de planta un gen quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un producto codificado por una secuencia de codificación que se une operablemente al mismo, siendo dicha secuencia de ácido nucleico la secuencia de la reivindicación 15. 18. Un método según la reivindicación 17, caracterizado porque dicha secuencia de codificación codifica un gen que origina la esterilidad en dicha planta durante la floración y que se origina para expresarse por dicha secuencia de ácido nucleico en la exposición a la luz. 19. Un método según la reivindicación 17, caracterizado porque dicha secuencia de codificación codifica un gen que altera el nivel de genes de enzima biosintética de almidón en hojas u otros tejidos fotosintéticos. 20. Un método según la reivindicación 17, caracterizado porque dicha secuencia de codificación codifica un gen cuya expresión de nivel se varía en la generación de azúcar en un órgano de almacenamiento en desarrollo y el efecto de azúcar y dicha secuencia de ácido nucleico. 21 . Un método según la reivindicación 17, caracterizado porque dicha secuencia de ácido nucleico es operable cuando existe luz pero no azúcar. 22. Un método según la reivindicación 1 7, caracterizado porque dicha secuencia de ácido nucleico es operable cuando existe azúcar pero no luz. 23. Un método de alteración en una planta transgénica, tal planta muestra un aumento o reducción en una actividad de la enzima en la vía biosintética de almidón como un resultado de la transformación genética, una enzima adicional con objeto de supra o sub regular dicha enzima adicional y por consiguiente aumentar o reducir la cantidad del almidón producido por la planta retransformada, dicha enzima adicional siendo ß-amilasa terminada de plástida. 24. Un método según la reivindicación 23, caracterizado porque dicha ß-amilasa terminada de plástida comprende SEQ. ID. No. 1 . 25. Un método según las reivindicaciones 23 o 24, caracterizado porque dicha ß-amilasa terminada de plástida comprende SEQ. ID. No. 2. 26. Un método según la reivindicación 23, caracterizado porque dicha primer planta transformada es una papa transgénica transformada con el gen para pirofosforilasa de difosfoglucosa de adenosina (ADPG-PPase). 27. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 , 8 o 17, caracterizado porque dicho gen quimérico comprende además un promotor que se selecciona del grupo que consiste del promotor 35S de virus de mosaico de coliflor (completo o truncado), el promotor rubisco, el promotor plastocianina de grancilla, el promotor de sintasa de nopalina. El promotor de enlace r/b clorofila , el promotor de glutenina de peso molecular elevado, el promotor de a, ß-gliadina, el promotor hordein y el promotor de patatina. 28. Un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 , 8 o 17, caracterizado porque dichas secuencia de codificación de dicha enzima en dicho gen quimérico proporciona una supra o sub regulación de la actividad de dicha enzima. 29. Un método según la reivindicación 1 7, caracterizado porque dicho estímulo es la presencia o ausencia de luz y/o niveles de variación de azúcar. 30. Un método según la reivindicación 17, caracterizado porque dicho estímulo es un estímulo que se controla experimentalmente. 31 . Un método según la reivindicación 29, caracterizado porque el azúcar es una o más de sucrosa o glucosa. 32. Un método según la reivindicación 31 , caracterizado porque el azúcar es sucrosa. 33. Un gen quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 1 0. 34. Un gen quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de terminación de plástida según la reivindicación 10 y una secuencia de codificación de ácido nucleico de una enzima en el almidón, vía degradante, codificándose la enzima por la secuencia según la reivindicación 1 3. 35. Un gen quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de una secuencia de codificación adicional, dicha secuencia de codificación siendo la secuencia según la reivindicación 1 3. 36. Un gen quimérico que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 15 que responde a estímulos y una secuencia de codificación, el nivel de expresión de dicha secuencia de codificación siendo variable en respuesta al estímulo aplicado a dicha secuencia de ácido nucleico. 37. Las células vegetales que comprenden la secuencia de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 0, 1 3, 14 o 1 5. 38. La semilla de la planta transformada que contiene una o más secuencias de ácido nucleico según la reivindicación 10, 13, 14 o 15. 39. Las plantas transformadas de acuerdo a los métodos de cualquiera de una de las reivindicaciones 1 , 8 o 1 7, caracterizadas porque dichas plantas se encuentran en una o más del grupo que consiste de papa, trigo, maíz, cebada, jitomate, arroz, guisante, semilla de soya, cacahuate, mandioca, ñame, plátano y tabaco.
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