CZ2001460A3 - Nová sekvence nukleové kyseliny pro směrování do plastidu, nová sekvence ß-amylázy, promotor odpovídající na stimul a uľití těchto sekvencí - Google Patents

Nová sekvence nukleové kyseliny pro směrování do plastidu, nová sekvence ß-amylázy, promotor odpovídající na stimul a uľití těchto sekvencí Download PDF

Info

Publication number
CZ2001460A3
CZ2001460A3 CZ2001460A CZ2001460A CZ2001460A3 CZ 2001460 A3 CZ2001460 A3 CZ 2001460A3 CZ 2001460 A CZ2001460 A CZ 2001460A CZ 2001460 A CZ2001460 A CZ 2001460A CZ 2001460 A3 CZ2001460 A3 CZ 2001460A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
sequence
nucleic acid
plant
amylase
acid sequence
Prior art date
Application number
CZ2001460A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ303574B6 (cs
Inventor
Thomas Anthony Kavanagh
Nga Thi Lao
Original Assignee
Advanced Technologies (Cambridge) Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9817963.3A external-priority patent/GB9817963D0/en
Priority claimed from GBGB9817959.1A external-priority patent/GB9817959D0/en
Priority claimed from GBGB9913014.8A external-priority patent/GB9913014D0/en
Application filed by Advanced Technologies (Cambridge) Limited filed Critical Advanced Technologies (Cambridge) Limited
Publication of CZ2001460A3 publication Critical patent/CZ2001460A3/cs
Publication of CZ303574B6 publication Critical patent/CZ303574B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8214—Plastid transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8221—Transit peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C12N15/8238—Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2425—Beta-amylase (3.2.1.2)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Nová sekvence nukleové kyseliny pro směrování do plastidu, nová sekvence β-amylázy, promotor odpovídající na stimul a užití těchto sekvencí
Oblast techniky
Vynález se týká nové sekvence β-amylázy směrované do chloroplastu (ct β-amylázu), nové sekvence nukleové kyseliny pro směrování do chloroplastu a nové sekvence β-amylázy. Vynález dále poskytuje indukovatelný promotor, který je nezávisle indukován stimuly v podobě světla a cukru. Popisuji se zde metody transformace rostlin užitím těchto nových sekvencí, a také transformované rostlinné buňky, rostliny a semena rostlin, a také chimérické geny obsahující uvedené sekvence. Dále jsou popsány způsoby modifikace obsahu škrobu v rostlinách, a také směrování genů účastnících se biosyntézy nebo degradace škrobu, nebo genů rezistence ke škůdcům, a nebo variací genové exprese, kterých lze podle vynálezu dosáhnout.
Dosavadní stav rechniky
Přesný mechanismus, jakým je syntetizován a degradován škrob v rostlinách není dosud znám, přestože byla izolována a charakterizována řada enzymů, které se zřejmě na těchto procesech podílejí.
Škrob je akumulován v chloroplastech v listech v průběhu dne a je užit k zásobováni rostliny energií a biosyntetických drah v průběhu noci. Způsob, jakým je tzv. přechodný {tranzientní) škrob mobilizován není plně poznán, ale musí zahrnovat koordinovanou regulaci syntetických a degradačních enzymatických aktivit. V listovém pletivu hlavní degradační metabolická dráha zahrnuje fosforolytické a hydrolytické • · • ·
aktivity, zejména α-glukosidázu (E.C. 3.2.1.3) (Nielson a Stitt, 1997).
Škrob je také akumulován v amyloplastech zásobních orgánů jako jsou např. semena, plody a hlízy. V takovém případě je škrob skladován dlouhodobě a jeho mobilizace je doprovázena degenerací pletiva zásobních orgánů a zvýšením amylolytické a fosforolytické aktivity. Ale existují důkazy, že k metabolickému obratu škrobu dochází i v amyloplastech zásobních orgánů (Sweetlove a kol. 1996). To opět vyžaduje koordinovanou regulaci syntetických a degradujících enzymatických aktivit.
Jak chloroplasty tak amyloplasty pocházejí z proplastidů a tudíž mají mnoho společných vlastnosti, a kromě toho že jsou obě organely místem syntézy škrobu v listech (chloroplasty) a v zásobních orgánech (amyloplasty), chloroplasty se mohou přeměnit na amyloplasty a jiné typy plastidů (Thomson a Whatley 1980).
Škrob je směs dvou polysacharidů, a sice amylózy, což je lineární řetězec glukosylových jednotek spojených a-1,4-glykosidickými vazbami, a amylopektinu, který je tvořen mnoha lineárními řetězci a-1,4-polyglukanů, které jsou navzájem spojeny α-1,6-glykosidickými vazbami.
Enzymy účastnící se syntézy škrobu jsou ADPG pyrofosforyláza (E.C. 2.7.7.21), syntáza škrobu (E.C. 2.4.1.21) a tzv. větvicí enzym (E.C. 2.4.1.18). ADPG pyrofosforyláza je odpovědná za dodávání substrátu ADPG, který slouží jako donor glukózových monomerů, které jsou pak navzájem pospojovány souhrou syntázy škrobu (a-1,4 vazby) a větvícího enzymu (a-1,6 vazby).
Má se zato, že nerozpustná krystalická struktura škrobových zrn je tvořena těsným nahloučením prodloužených šroubovicových rozvětvených molekul amylopektinu, kde lineární molekuly amylózy vyplňují volný prostor.
škrob ·· ···· · · ·· · · • · · · · · · · * · • · · ·· · · · · · · • · · · · ······ · ·· ··· ·· ·· ·· ···
Byla popsána řada enzymových je např. α-amyláza (E.C.
68), β-amyláza
3) , fosforyláza aktivit degradujících
3.2.1
1), isoamyláza a-glukosidáza (E.C.
škrobu (E.C.
tzv.
disproporcionačni enzym existuj í syntéze podílej i v rostlině v několika škrobu. Pravděpodobně na mobilizaci škrobu,
Mnohé z těchto enzymů některé se podílej na. se všechny, v určitém rozsahu, ačkoliv jejich přesné role a formách a možné interakce nejsou dosud známy. Potíže v přiřazení role různým enzymům jsou dobře patrné na příkladu dvou enzymů, které jsou považovány za hlavní účastníky rozkladu škrobu v rostlinách, a sice fosforyláza škrobu a amyláza.
Fosforyláza škrobu katalyzuje reverzibilní uvolňováni glukóza-1,6-fosfátu
V rostlinných pletivech se vyskytují dvě formy fosforylázy škrobu: Phol nebo-li a s vysokou afinitou k maltoclextrinům, Fho2, nebo-li
H-typ, cytosolu a mající vysokou afinitu polyglukanům jako je pravděpodobným inhibice této neměla žádný vliv na akumulaci transgenního bramboru (Sonnewald a antisense inhibice cytoplasmatické enzym Phol mobilizace škrobu v listu u klíčení hlíz transgenního bramboru, ale neměla žádný vliv na akumulaci a degradaci škrobu (Duwenig a kol. 1997).
Existují dvě hlavní skupiny amyláz hydrolyzujících a-1,4-glykosidické vazby amylózy a amylopektinu: a-amyláza působí náhodně na jiných než koncových vazbách, zatímco β-amyláza působí tak, že uvolňuje maltózové jednotky počínaje od neredukujičího konce polyglukanového řetězce. Má se zato, že subcelulární lokalizace α-amylázy v apoplastickém prostoru rostlinných buněk odráží tu skutečnost, že enzym je normálně • · · · · ·
secernován. Avšak u řady rostlin jako je např. rýže (Chen a kol., 1994) a cukrová řepa (Li a kol., 1992) je enzym lokalizován také uvnitř chloroplastů a amyloplastů, přestože bylo zjištěno, že signální sekvence na aminokonci řady α-amylázových proteinů jsou charakteristické pro translokaci proteinu přes membránu ER spíše než plastidovou membránu (Chen a kol., 1994). Ve studii, kde promotor a signální sekvence genu α-amylázy rýže byly fúzovány s bakteriálním genem GUS a vneseny do rýže, tabáku a bramboru pomocí transformace zprostředkované Agrobacterium (Chen a kol., 1994), bylo ukázáno, že exprimovaný fúzní protein GUS byl nejdříve transportován do. endoplasmatického retikula a teprve potom do kultivačního média suspenzní kultury připravené z transgenních buněk. Bylo také ukázáno v řadě studií, že α-amyláza degraduje nativní molekuly škrobu.
Naproti tomu in vitro studie ukázaly, že β-amyláza nedegraduje nativní škrobová zrna, aniž by předtím nebyla naštěpena jinými enzymy. Mutanty rýže (Daussant a kol. 1981) a sóji (Hildebrand a Hymowitz 1981) postrádající aktivní β-amylázu nebo obsahující pouze stopovou aktivitu zjevně projevují normální růst a vývoj. Kromě' toho transgenní rostliny Arabidopsis se silně redukovanou hladinou β-amylázy neprojevují významné růstové defekty (Mita a kol. 1997). Pokusy definovat přesně fyziologickou úlohu β-amylázy byly zmařeny nejednoznačnými daty týkajícími se subcelulární lokalizace. Ačkoliv jedna studie (Kafekuda a kol. 1986) popsal přítomnost dvou β-amyláz v chloroplastech hrachu, většina studií zahrnujících druhy jako je Vida faba, ječmen, pšenice, sója, topinambur a hrách, vedla k závěru, že většina, pokud ne všechna, β-amylázové aktivity je extrachloroplastová ÍNakarnura a kol. 1991). Tento názor je podpořen skutečností, že dosud klonované geny β-amylázy kódují proteiny, které postrádají aminokoncovou sekvenci chloroplastového tranzitního peptidu.
U obilnin byly popsány ti typy β-amylázy: forma specifická pro endosperm, která se akumuluje v průběhu dozráváni obilky, forma syntetizovaná de novo v aleuronových buňkách rýže a kukuřice v průběhu klíčeni (Wang a kol. 1996, 1997) a β-amyláza, která je všudypřítomná ve vegetativních orgánech. U Arabidopsis tato všudypřítomná forma představuje přibližně 80 % celkové aktivity degradující škrob u listů v růžici. Společně se všemi ostatními dodnes klonovanými geny β-amylázy ani gen pro všudypřítomnou formu z Arabidopsis nekóduje protein se subcelulárnim směrovacím signálem, takže enzym je pravděpodobně lokalizován v cytosolu.
Zjištění řady studií, že odstraněny degradativní aktivity mohou být následků pro ivotaschopnost rostliny, a navíc subcelulární lokalizace enzymů degradujících škrob mimo plastid, j sou velmi překvapující. Zjevná nepřítomnost β-amylázové aktivity lokalizované v plastidu je překvapující ve koncový aktivity, zejména maltóza, byl identifikován jako produkt škrobu izolovaných chloroplastech (Peavey a kol jsou exportovány z izolovaných amyloplastů pupenů květáku (Neuhaus a kol., 1995).
Možnost ovlivnit množství škrobu v ásobnich orgánů by byla velmi přínosná pro ruzne průmyslové procesy, ve kterých se užívá rostlinný škrob. Tak např.
při pokusu zvýšit obsah škrobu v bramborovýh hlízách bylo dříve ukázáno, ze když byla ADPG PPáza glgC16 z E.
nadměrně exprimována v transgenních bramborových hlízách, byl škrobu bylo ol. ,
Analýza že kromě změn • · ··· · • ·
byla změněna také aktivita amylázy, konkrétně β-amylázy. Tyto údaje nasvědčují tomu, že akumulaci škrobu v hlízách „overexprimujících protein glgC16 je zabráněno rozpadem nově syntetizovaného škrobu, tj. dochází k metabolickému obratu škrobu.
V jiném přikladu dostupnost škrobu v průběhu přípravy sladu velmi těsně korelovala s typem a množstvím degradačních enzymových aktivit v rostlině, zejména v zásobních orgánech. Zvýšení degradativní kapacity v plodině by učinilo proces přípravy sladu ze zrna obilnin nebo přeměnu škrobu z hlíz nebo jiných orgánů na alkohol mnohem účinnější.
Typ škrobu přítomného v zásobních orgánech závisí na formách a aktivitách ADPG pyrofosforylázy, syntázy škrobu, větvícího enzymu a degradačních enzymů, které jsou přítomny. Interakce mezi různými enzymy je také důležitá.
Existuje značný zájem o vytvoření nových druhů škrobu in planta, neboť by to snížilo náklady na jejich další zpracování a modifikaci před použitím při různých oblastech průmyslu jako např. v průmyslu potravinářském, papírenském, farmaceutickém, textilním a při výrobě lepidel a olejů. Následující příklady ukazují, jak aktivita hydrolyzující škrob může být důležitá pro změnu struktury škrobu in vivo.
Bylo ukázáno, že v zrnech kukuřice, mutace „sugaryl způsobuje absenci enzymu rušícího větvení, který hydrolyzuje a-1, 6-glykosylové vazby škrobu (James a kol., 1995). Mutace vede ke snížené koncentraci amylopektinu a akumulaci vysoce rozvětvených glukopolysacharidů, fytoglykogenu.
Bylo ukázáno u hrachu, že krátké oligosacharidové molekuly, počínaje maltózou a přidáváním další glukózy až po maltoheptózu,. specificky stimulují aktivitu syntázy škrobu i vázané na škrobová zrna (GBSSI)(Denver a kol., 1996), kterýžto enzym je obecně považován za hlavní enzym zodpovědný za syntézu amylózy (např. van der Leij a kol., 1991, Hylton a kol., 1995, Ainsworth a kol., 1993). Manipulace aktivity GBSSI je předmětem patentové navrhuje, tudíž zvýšení řízením dodávky malto-oligosacharidů (WO 97/16554), která malto-oligosacharidů, a přihlášky koncentrace amylózy k degradačnch disproporcionačního fosforylázy škrobu, tvrdí, že amylopektinu ve škrobu, enzymů, zejména lze dosáhnout zvýšení poměru vnesením enzymu,
Patentová a-amylázy, rušícího enzymu přihláška WO β-amylázy, rozvětvení a
97/16554 dále klonovány. izolovaný geny
Avšak, pro jak pro plastidové bylo již β-amylázu isoformy těchto diskutováno gen s proteinovou směrovací sekvencí že a-amylázy 1994, Chán nekóduj e a navíc, byly dosud o tom, jsou původně enzymů výše, žádný enzym β-amylázu není žádné pochyby směrovány do plastidů (Chen a a kol., 1994). V patentová přihlášce odkaz na genetickou úpravu vhodné cDNA sekvence β-amylázy doplněním plastidové směrovací sekvence.
Kromě průmyslového využití škrobu ze zásobních orgánů, množství škrobu v listech má značný význam pro agronomii plodin, škrob je syntetizován v listech v průběhu dne z oxidu uhličitého fixovaného ve fotosyntéze. Škrob se ukládá v chloroplastech a rozkládá se v noci, kdy se stává zdrojem energie a meziproduktů pro metabolismus rostliny. Jakým mechanismem je v rostlině řízen vztah zdroje a spotřeby („source-sink) není dosud známo, avšak je jasné, že ovlivnění množství a dostupnosti škrobu v listových plastidech má význačný vliv na produktivitu rostlin (biomasa a výnos).
Množství škrobu v listu je také významné u těch plodin, kde list je hlavní komoditou, např. u tabáku. Je známo, že obsah škrobu má vliv na vůní tabáku při kouřeni. Prostředky k ovlivnění hladiny škrobu u tabákových listů by tedy bylo zajímavé pro tabákový průmysl.
Podstata vynálezu
V předkládaném vynálezu kódující nový enzym β-amylázu, (tudíž označovaný jako β-amyláza nebo chloroplastová β-amyláza, („targeting) sekvenci, byla překvapivá, neboť se podílí pouze na hydrolýze škrobu, jakmile se malé menší polyglukanové fragmenty, buďto tránslokací směrovací sekvence je poprvé popsána izolace cDNA který je směrován do plastidů směrovaná do chloroplastu, ct β-amyláza, díky nové Izolace celé této kódující se obecně mělo zato, že β-amyláza uvolní nebo porušením membrány, z plastidů do cytoplazmy. Lokace enzymu v plastidech otevírá nepředvídané možnosti, že by se ct β-amyláza účastnila degradace tranzientniho škrobu v chloroplastech a zásobního škrobu v amyloplastech.
Podobnost vlastností mezi chloroplasty a amyloplasty (Thornson a Whatley, 1980) je důležitá ve vztahu k předkládanému vynálezu, neboť bylo ukázáno, že tranzitní peptidy z polypeptidů směrovaných do chloroplastu mohou importovat heterologní polypeptidy do amyloplastů a naopak. Tak např. tranzitní peptid syntézy škrobu vázané na škrobová zrna kukuřice, když byl fúzován s β-glukuronidázou (GUS) z E. coli, importoval protein GUS nejen do amyloplastů, ale také do chloroplastů (Klosgen a Weil, 1991). Kromě toho původci ukázaly, že exprese genu ct-Bmy v Arabidopsis a exprese fúze „promotor ct-Bmy:GUS v transgenním tabáku mohou být regulovány nezávisle jak světlem tak sacharózou. To je velmi překvapující vzhledem ke známé velmi těsné vazbě induktivní reakce AT β-Amy na světlo a cukry (Mita a kol., 1995).
Předkládaný vynález poskytuje sekvenci nukleové kyseliny popsanou zde jako sekvence id. č. 1 zahrnující nukleotidy 1 až 294 a obsahující sekvenci schopnou směrování další kódující sekvence do rostlinného plastidů, nebo sekvenci alespoň z 65 z sekvencí id. č.
a mající nebo více homologní s popsanou stejné směrovací schopnosti
Výhodně sekvence aminokyselinových zbytků.
Předkládaný kyseliny popsanou zbytků vynález zde nukleové kyseliny a výhodně 85 dále poskytuje jako sekvence id.
kóduje 94 aminokyselinových sekvenci nukleové
č. 2 zahrnující nukleotidy 1 až 1642 a obsahující sekvenci schopnou kódovat β-amylázu, nebo sekvenci alespoň z 65 % nebo více homologní s popsanou sekvencí id. ý č. 2 a mající stejné kódující schopnosti.
Předkládaný vynález dále poskytuje sekvenci nukleové kyseliny popsanou zde jako sekvence id. č. 3 zahrnující nukleotidy 1 až 1953 a obsahující sekvenci schopnou kódovat β-amylázu směrovanou do chloroplastu, nebo sekvenci alespoň z 65 % nebo více homologní s popsanou sekvencí id. č. 3a mající stejné kódující schopnosti.
K homologním sekvencím patří sekvence, které hybridizují se sekvencemi id. č. 1, 2 nebo 3 za středně stringentních podmínek (definovány promýváním ve 2 x SSC při 65 °C) .
Výhodně je sekvence nukleové kyseliny mRNA nebo cDNA, ale může to být i genomová DNA.
Předkládaný vynález dále poskytuje způsob zvýšení nebo snížení aktivity v rostlině enzymu v biosyntéze nebo degradaci škrobu, kterýžto způsob obsahuje kroky, kdy se trvale inkorporuje do rostlinného genomu chimérický gen obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující plastidcvou směrovací sekvenci a kódující sekvenci enzymu metabolické dráhy biosyntézy nebo degradace škrobu, a regeneruje se rostlina mající změněný genom.
Předkládaný vynález také poskytuje způsob směrováni proteinů nebo enzymů do rostlinných plastidů, krerýžto způsob obsahuje kroky, kdy se trvale inkorporuje áa rostlinného • · 9 99·
9 • ··
999
9
9 • · • 9 9 genomu chimérický gen obsahující kódující plastidovou směrovací sekvenci a enzymu metabolické dráhy biosyntézy nebo degradace sekvenci nukleové kódující
99
99
99
9 999 kyseliny sekvenci škrobu, a regeneruje se rostlina mající změněný genom, přičemž protein nebo enzym je jeden nebo několik v metabolické dráze z následujících skupin: syntéza lipidů, fotosyntéza, metabolizmus aminokyselin, fixace dusíku, fixace uhlíku nebo syntéza uhlovodíkových polymerů, nebo je schopen udělit rostlině znak, který je vybrán z jedné nebo několika následujících skupin: rezistence k herbicidu, rezistence ke škůdci, např. k houbám, bakteriím nebo virům.
Předkládaný vynález poskytuje rostliny nesoucí chimérický gen, který obsahuje promotor, kódující sekvenci nukleové kyseliny kódující plastidovou směrovací sekvenci, tj . sekvenci schopnou směrovat kódující sekvenci enzymu metabolické dráhy biosyntézy nebo degradace škrobu do rostlinného plastidu, a terminátor.
Předkládaný vynález dále poskytuje sekvenci nukleové schopnou řídit expresi produktu kódovaného kódující se kterou je operativně spojena, přičemž tato je zde uvedena jako sekvence id. č. 8, nebo sekvenci alespoň z 65 % nebo více homologní s touto sekvencí a mající v podstatě stejnou funkci, a tato sekvence nukleové kyseliny odpovídá na stimul, přičemž hladina exprese produktu se mění v závislosti na stimulu působícím na sekvenci nukleové kyseliny.
Předkládaný vynález dále poskytuje způsob změny hladiny exprese produktu kódovaného kódující sekvencí operativně spojenou se sekvencí nukleové kyseliny schopnou směrovat expresi produktu v rostlině, kterýžto způsob obsahuje kroky, kdy se trvale inkorporuje do rostlinného genomu chimérický gen obsahující sekvenci nukleové kyseliny schopnou směrovat expresi produktu kódovaného kódující sekvencí, která je s ni kysel myšek věnci , sekvence • · • ·· · operativně spojena, přičemž sekvence nukleové kyseliny má v podstatě sekvenci id. č. 8 nebo je s ni alespoň z 65 % homologni a má v podstatě stejnou funkci a také odpovídá na stimul.
Výhodně je stimulem přítomnost nebo absence světla a/nebo různé hladiny cukru. Alternativně je stimulem takový stimul, který je řízen vývojově.
Výhodně je cukr jeden ze sacharózy a glukózy nebo oba.
Výhodně je cukr sacharóza.
Výhodně indukovatelný promotor, nebo sekvence nukleové kyseliny schopná řídit expresi produktu v rostlině, pracuje za podmínek, kde není kdy je nepřítomno světlo, ale přítomen cukr, ale je přítomno je přítomen cukr, nebo
Rostlinné pletivo, např.
kde j e podzemní nepřítomno orgán nebo produkty světlo, ale je přítomen cukr, je tzv. „sinkový orgán (tj. orgán fotosyntézy). Příkladem podzemního orgánu jsou hlízy, rhizorný nebo kořeny, zatímco síňkovým orgánem může být např. mladý list nebo semeno.
Pletivem rostliny, kde není přítomen cukr, ale je přítomno světlo, je např. starý list (kam není transportován žádný cukr), části květu nebo klíčící semena.
Konstrukty DNA a chimérické geny mající vlastnosti výše popsané představují další aspekt předkládaného vynálezu.
Rostlinné buňky obsahující chimérický gen obsahující sekvenci nukleové kyseliny kódující plastidovou směrovací sekvenci popsanou výše a kódující sekvenci nukleové kyseliny enzymu metabolické dráhy biosyntézy nebo degradace škrobu, nebo chimérický gen obsahující sekvenci nukleové kyseliny schopnou směrovat expresi další kódující sekvence, nebo chimérický gen obsahující sekvenci nukleové kyseliny popsanou výše, která odpovídá na stimul aplikovaný na nukleovou kyselinu, stejně jako semena transformovaných rostlin obsahující jeden nebo více chimérických genů podle vynálezu.
Výhodně je plastidová směrovací sekvence uvedená zde jako sekvence id. č. 1.
Podle prvního aspektu vynálezu se způsob podle vynálezu užívá ke změně metabolismu listu, aby v něm byl akumulován škrob nebo aby z něho byl škrob mobilizován, takže tento způsob mění relaci zdroj-místo spotřeby („source-sink) v rostlině jako celku. Toho lze dosáhnout poskytnutím směrovací sekvence a sekvence nukleové kyseliny kódující enzym metabolické dráhy biosyntézy nebo degradace škrobu, řízené vhodným promotorem. Vhodný výběr promotoru poskytne rostliny se zvýšenou nebo sníženou hladinou škrobu v listech, což může být užitečné např. pro tabákový průmysl, nebo alternativně povede ke změnám výnosu škrobu v různých jiných rostlinných pletivech jako jsou hlízy, plody a kořeny, po modifikaci vztahu source-sink v rostlině.
V tomto provedení vynálezu vhodný promotor řídí expresi plastidové směrovací sekvence a kódující sekvence enzymu metabolické dráhy biosyntézy nebo degradace škrobu v celé rostlině, jde o tzv. konstitutivní expresi, a nebo specificky jen v listech. Takové změny mají výrazný účinek, takže se mění obsah škrobu a/nebo výnos orgánů rostliny.
Výhodný promotor schopný řídit expresi ve všech rostlinných pletivech je promotor z genu 35S viru mozaiky květáku. Pro expresi v listech je výhodný promotor z genu pro malou podjednotku ribulózabisfosfátkarboxylázy nebo genu pro plastokyanin z hrachu. Odborníkovi jsou známy další vhodné promotory pro konstitutivní expresi nebo pro specifickou expresi v listech jako je např. promotor nopalinsyntázy nebo promotor genu pro protein vázající chlorofyl a/b.
Kódující sekvence, nebo její část, enzymu metabolické dráhy biosyntézy nebo degradace škrobu je uspořádána ve směru shodném s normálním čtecím rámcem, tzn. v uspořádání „sense, nebo ve směru opačném k normálnímu čtecímu rámci, tzn.
• · · ·· ♦ • · v uspořádáni „antisense. Zesilování nebo zeslabování enzymové aktivity pomocí techniky „sense, „antisense nebo tzv. kosuprese (tato technika byla popsána DNAP v Evropských patentech č. 0465572 a 0647715).
Ve druhém aspektu vynálezu se způsob podle vynálezu užívá ke změně metabolismu obsah škrobu zvýšil která je požadována průmyslovým textilií, škrobu v zásobních, orgánech tak, a/nebo se získal škrob ve vhodné procesům patří např. výroba barviv a stavebních hmot, dále aby se formě, takovým léčiv, pečivá, mléčných sušených sirupů a produktů a občerstvení, výroba pro určitý průmyslový proces. K papíru, výroba konzervovaných, nebo instantních potravin, výroba sladu a také výroba alkoholu.
V prvním nebo druhém aspektu vynálezu je výhodným enzymem pro použití v chimérickém genu podle vynálezu jeden z enzymů metabolické dráhy degradace škrobu, tj. enzym degradující škrob. Výhodně chimérický gen obsahuje β-amylázu směrovanou o chloroplastu (dále označovanou jako ct β-amylázu) a výhodněji obsahuje β-amylázu pocházející z ňrabidopsis thaliana (dále označovanou jako At. ct β-amylázu), viz také sekvence id. č. 3. Sekvence homologni se sekvencí At ct β-amylázy, které jsou získatelné z rostlin jako je brambor, tabák, pšenice, kukuřice a ječmen, se mohou také použít. Standardní postupy klonování hybridizací nebo polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) se mohou užít k izolaci požadovaných sekvencí z těchto rostlin, metody klonování molekul byly popsány např. v příručce Sambrook a kol. 1990, a metody PCR byly popsány např. v publikaci Innes a kol., 1990. K dalším enzymům degradujícím škrob, jejichž jedna nebo více kódujících sekvencí by byly vhodné pro použití s plastidovou směrovací sekvencí, patří α-amyláza, disproporcionační enzym, enzym rušící větvení, fosforyláza škrobu, α-glukosidáza a neplastidová β-amyláza.
«· ΦΦ·· ·· φφ φφ φ
Φφφ φφφφ φφφφ φφφφφ φφφφ φφ φ φ φ φφφφ φφφ φφφ φ φφ φφφ φφφφ ·· φφφ φφ φφ φφ φφφ
Ve druhém aspektu vynálezu je výhodný promotor, který řídí expresi specificky v zásobních orgánech rostlin, vybrán ze skupiny genů obsahující gen pro gluteniny s vysokou molekulovou hmotností z endospermu pšenice, gen pro α,β-gliadin z endospermu pšenice, gen pro hordein z endospermu ječmene, gen pro patatin z hlíz bramboru. Odborníkovi jsou známy i další vhodné promotory.
V obou aspektech vynálezu je možné dosáhnout toho, aby změny metabolismu v pletivu nebo změna typu nebo vlastností škrobu byly reakcí na stimul, t j . indukovatelné, a sice tím, že se použije indukovatelný promotor zde popsaný jako sekvence id. č. 8. Tak např. indukovatelnost promotoru světlem může být využita k manipulaci semen indukci genů jako je barnáza (příkladem je WO 98/10081) k ovlivnění vývoje pylu, nebo k ovlivnění genů, které nereagují na světlo, v procesech, které jsou jinak na světle závislé, jako je zrání plodů nebo klíčení semen. Světlem indukovatelný promotor může být .užit také k zapínání genů, které ovlivňují produkci sekundárních metabolitů v listech, např. produkci alkaloidů. Světlem indukovatelný promotor může být dále užit k manipulaci genů enzymů biosyntézy škrobu v listech nebo jiných fotosyntetických pletivech, nebo např. k zapínáni genů po odstranění hlíz, např. pro skladováni v temnu. Indukovatelnost promotoru cukrem může být využita např. k regulaci genů vyvíjejících se hlíz nebo jiných nefotosyntetických pletiv, např. genů rezistence ke škůdcům a/nebo genů, které ovlivňují posklizňovou kvalitu úrody. Tak např. u bramboru by byly velmi výhodné geny rezistence k plísním a hnilobám, které by byly výhodně klonovány s promotorem indukovatelným cukrem. Alternativně indukovatelnost promotoru cukrem může být využita k řízeni exprese genů pro selekční markéry ve tkáňových kulturách.
• · •· ··♦·
Odborník snadno najde v sekvenci id. č. 8 element reagující na cukr a/nebo světlem indukovatelný element, a sice užitím známých metod, např. deleční studie. Tak např. Pwee a Gray (1993) popsali deleční studii genu plastokyaninu hrachu užitím markerového genu, ve které stanovili operativní úseky promotoru.
Metody zde popsané nebo popsané např. v laboratorní příručce Sambrook a kol.(1989) nebo Gelvin a Stanton (1995) pro klonování genových sekvencí a jejich vkládání do vhodných nosičů (vektorů, plazmidu apod.) jsou odborníkovi dostatečně známy, aby je mohl prakticky realizovat.
Chimérické geny nebo geny výše popsané se mohou vnést samotné nebo společně s dalšími chimérickými geny pospanými výše. V případě výše popsaných příkladů provedení vynálezu, kdy se užívá první chimérický gen kódující enzym metabolické dráhy degradace škrobu, druhý chimérický gen může obsahovat např. sekvenci nukleové kyseliny kódující enzym metabolické dráhy biosyntézy škrobu, taktéž řízenou vhodným promotorem a vhodným terminátorem. Promotor a/nebo terminátor druhého chimérického genu může být stejný nebo odlišný od promotoru a/nebo terminátoru prvního chimérického genu. Vhodné sekvence kóduj ící dráhy biosyntézy škrobu j sou sekvence nukleové kyseliny kódující sacharózasyntázu, ADPG škrobu, případně k nim patří i isoamyláza, neplastidová β-amyláza, pyroosforylázu, syntázu větvivcí enzym, a-amyláza, škrobu a disproporcionační enzym.
Metody po vnášení jednoho nebo více chimérických genů do rostliny byly popsány a obsahují konstrukci geny navzájem spojenými α-glukosidáza, fosforyláza binárního vektoru chimérickými nukleové dvou nebo víc*.
odlišných vektory obsahujícími odlišné chimérické geny, nebo transformaci rostliny, která již obsahuje chimérický gen, • · · ·· · ··
druhým odlišným chimérickým genem, tzv. retransformaci. V tomto druhém případě způsob selekce transgennich rostlin po vnesení druhého chimérického genu musí být odlišný od způsobu selekce použitého po vnesení prvního chimérického genu. K vhodným selekčním markérům patří geny rezistence k hygromycinu, kanamycinu, sulfonamidu a herbicidu Basta. Lze také užit biologického postupu, a sice křížení dvou rostlin, nichž každá obsahuje jeden chiméický gen.
Použití dvou konstruktů chimérických genů je vhodné ke změně obsahu škrobu již transformované rostliny, která vykazuje významné zvýšení aktivity prvního enzymu a následnou změnu v syntéze škrobu.
Tudíž předkládaný vynález dále poskytuje způsob změny, v transgennich rostlinách s ýšenou nebo sníženou enzymovou aktivitou v důsledku genetické transformace, dalšího enzymu, aby byl tento enzym nebo tlumen („downregulation), tudíž by bylo zvýšeno nebo sníženou množství v retransformované rostlině transformovaná rostlina enzymu v metabolické transgenni brambor transformovaný genem pro ADPG-PPázu, např. glgClo (viz např. WO 91/19806). Zvýšení obsahu škrobu v těchto rostlinách bylo relativně malé. Tato první transformovaná rostlina byla vhodně netransformována chimérickým genem pro degradaci škrobu, obsahujícím např. At ct β-amylázu. Protein glgC16 je exprimovaný v hlízách první transformované rostliny a vede ke zvýšení aktivity ADPG-PPázy a tudíž ke zvýšení toku uhlíku do škrobu. Výhodně exprese chimérického genu At ct β-amylázy nebo jeho části v netransformovaných hlízách vede k utlumení aktivity At ct β-amylázy, buďto kosupresí nebo „antisense technologii, a tudíž ke zvýšení akumulace škrobu.
specificky řízena
Výhodně je exprese druhého v hlízách.
Vhodným promotorem pro • ·· • ·· ·· • ·♦ • ·· ·· »·· enzymu expresi
chimérického genu
At ct β-amylázy specifickou pro hlízy je promotor z genu pro patatin.
První transformovaná rostlina bramboru exprimující glgC16 je rezistentní ke kanamycinu, tudíž konstrukt binárního vektoru pro chimérický gen At ct β-amylázy nese odlišný gen rezistence, např. výhodně gen rezistence k sulfonamidu. Zvýšená tvorba škrobu v hlízách bramboru by byla prospěšná např. pro výrobce bramborových lupínků, kdy 1% nárůst sušiny bramboru představuje 4% nárůst výrobku.
Výroba bramborových lupínků může posloužit i k ilustraci
Když jsou bramborové hlízy skladována při teplotě nižší než 8 °C, akumulují se redukující cukry, glukóza a se pak brambory nikající rozkladem škrobu. Když smaží na lupínky, redukující cukry reagují s am i n o k y s e1 i n ami v Maillardově reakci, čímž vzniká hnědé pachuť produktu.
chimérického genu do bramboru, který by škrobu a tudíž akumulaci redukujících cukrů, pro výrobce pochutin. Výhodně takový chimérický gen obsahuje kódující sekvenci, nebo její část, ct β-amylázy v konstruktu pro kosupresi nebo „antisense inhibici, řízenou hodným promotorem a terminátorem. Vhodným promotor je promotor z patatinového genu hlíz bramboru. Výhodně muže být místo ct β-amylázy užit kterýkoliv z výše zmíněných genů pro enzym degradující škrob.
Indukovatelný promotor v sekvenci id.
koordinovaná eta 1., 1989). Podobně sekvence pro chloroplastový směrovací polypeptid, tj. sekvence id. č. 1., může být také užita
s jakýmkoliv jiným genem, který postrádá svou vlastni směrovací sekvenci a u kterého je požadována plastidová lokalizace.
Výše uvedené příklady slouží k ilustraci možných přínosů užití předkládaného vynálezu. Odborníkovi je zřejmé, že existuje značné množství kombinací genů a rostlin, na kterých je možné vynález uplatnit.
K výhodným genovým kombinacím patří ct β-amyláza s jedním nebo více geny pro sacharózasyntázu, ADPG pyrofosforylázu, syntézu škrobu, větvicí enzym, α-amylázu, isoamylázu, neplastidovou β-amylázu, α-glukosidázu, fosforylázu škrobu a disproporcionační enzym, jejichž sekvence jsou odborníkovi známy. Alternativně může být užita směrovací sekvence ct β-amylázy s jedním nebo několika z výše uvedených genů.
K rostlinám, které mohou být takto transformovány, výhodně patří brambor, pšenice, kukuřice, ječmen, rajče, rýže, hrách, sója, podzemnice olejná, maniok, yam, banánovník a tabák.
V další části je předkládaný vynález popsán formou příkladů, a sice vzhledem k výhodným provedením izolace cDNA pro β-amylázu z Arabidopsis thaliara a inkorporace této DNA do rostlin tabáku a bramboru. V příkladech jsou také ukázána výhodná provedení promotoru reagujícího na stimul a jeho aktivity v transgenní rostlině.
Pro lepší vysvětlení a snadnější realizaci vynálezu budou dále uváděny odkazy na následující obrázky ilustrující výhodná provedení vynálezu.
• · · · · · ·· ·· · · · • · · · · · · ···· ····· ···· · · · • · · · · ·«···· · · ·· · · · ···· ·· ··· ·· ·· · · · · ·
Popis výkresů
Obr. 1.: Ukazuje výsledky radioaktivního in vitro značeni importu translačnich produktů na SDS-PAGE gelu a následované fluorografii. Legenda: markér (Standard) molekulové hmotnost dráha M, translační produkty - dráha Tr, chloroplasty reizolované a ošetřené termolysinem po inkubaci - dráha C, stromatální frakce - dráha S, promyté thylakoidy - dráha T, termolysinem ošetřené thylakoidy - dráha tT, frakce vnitřní membrány - dráha I, frakce vnější membrány - dráha 0. Domnělý prekuzor - P, intermediát - I a zralá forma β-amylázy - M. Kilodaltony - K.
Obr. 2.: Ukazuje účinek světla a účinek světla a cukru na expresi transkriptů ct β-amylázy v semenáčcích Arabidopsis thaliana. Obr. 2a ukazuje analýzu Northernovým přenosem (Northern blot) celkové RNA z 5 týdnů starých rostlinek Arabidopsis thaliana pěstovaných v půdě a vystavených 2 dnům souvislého osvětleni - L, 2 dnů souvislé tmy - D, 2 dnům světla následovaným dalšími 3 dny světla - LL, a nebo 2 dnům tma následovaným 3 dny světla -DL. Obr. 2b ukazuje Northernovou analýzu celkové RNA z 5 týdnů starých rostlinek
Arabidopsis thaliana pěstovaných in vitro, které byly přeneseny buďto do vody a vystaveny po 3 dny souvislému osvětlení - WL, nebo byly přeneseny do 5% sacharózy a vystaveny po 3 dny nepřerušen tmě - SD nebo 3 dny.
nepřerušenému světlu - SL, nebo byly přeneseny do 5% glukózy a vystaveny po 3 dny nepřerušen tmě - GD nebo 3 dny nepřerušenému světlu - GL. Northern bloty byly hybridizovány s radioaktivně značeným inzertem cz-Bmy cDNA a pak podrobeny autoradiografii (horní panely, odpovídající formaldehydové agarózové gely obarvené ethidiumbomidem jsou ukázány na dolních panelech).
Obr. 3. ukazuje schématické znázornění T-DNA chimérického genu ct β-amylázy promotor GUS zkonstruovaného v příkladu 3, kde NosP představuje promotor nopalinsyntázy, NosT terminátor nopalinsyntázy, BR je invertovaná repetice pravé hranice a BL je invertovaná repetice levé hranice T-DNA z ρΒΙΙΟΙ, NPTII je kódující sekvence neomycinfosfotransferázy II, GUS je kódující sekvence β-glukuronidázy, fragmenty promotoru ct β-amylázy jsou ukázány jsou čárkované obdélníčky, přemosťující fragmenty Xhol - BamHI amplifikované PCR jsou uvedeny černě.
Obr. 4 ukazuje účinek světla a sacharózy na aktivitu GUS exprimovanou z chimérického genu „ct Brny - GUS promotor v semenáčcích tabáku.
ukazuje plazmidovou mapu donorového vektoru pDV35S(SK)V.
Obr. 6 ukazuje plazmidovou mapu donorového vektoru pDV02000.
Obr. 7 ukazuje plazmidovou mapu binárního plazmidu pBNP10431, kde 35S představuje 35S promotor z CaMV, ct bamy představuje úplnou cDNA ct β-amylázy, 35St představuje 35S terminátor z CaMV, RB je pravá hranice binárního vektoru pBibPlus, colElori je bakteriální počátek replikace colEl z plazmidu RK2, nptll je gen neomycinfosfotransferázy pro bakteriální rezistenci ke kanamycinu, LB je levá hranice binárního vektoru, kan je rekombinantní gen rostlinné neomycinfosfotransferázy nutný pro rezistenci rostlin ke kanamycinu.
Obr. ý ukazuje plazmidovou mapu binárního plazmidu pBNP10432, kde byly užity shodné zkratky jako na obr. 7,
Obr. 9 ukazuje plazmidovou mapu binárního plazmidu pBNP02431, kde byly užity shodné zkratky jako na obr. 7, až na patp představující promotor patatinu třídy I z vektoru pDV02000 podle obr. 6 a nost je terminátor nopalinsyntázy.
Obr. 10 ukazuje plazmidovou mapu binárního plazmidu pBNP02432, kde byly užity shodné zkratky jako na obr. 9.
Přehled sekvenci uvedených v seznamu sekvencí:
Sekvence id. č. 1 je sekvence nukleové kyseliny schopné směrovat kódující sekvenci do rostlinného plastidu, zejména chloroplastu.
Sekvence id. č. 2 je nukleová kyselina kódující β-amylázu.
Sekvence id. c 3 je úplná sekvence β-amylá: 7.y směrované do
chloroplastu (Ct β—aiíiv la z v) ·
Sekvence id. č. 4 a 5 jsou ol igonukleot. idové primery použité
k amplifikaci v příkladu 3.
Sekvence id. č. 6 a 7 jsou oligonukleotidové primery použité
k amplifikaci v příkladu 4.
Sekvence id. č. 8 je nukleová kyselina reagující na stimul, konkrétně na světlo a/nebo cukr.
• · • · • ·
Příklady provedení vynálezu • · · · · · • ·9 • ·· · · • ·· · • ·· ·· · · ·
Příklad 1
Izolace a charakterizace chloroplastové β-amylázy AraMdopszs thaliana
Sekvencování inzertu cDNA v pBmySl
Prohledávání databáze nukleotidových sekvencí DNA fragmentu velikosti 37 kb z chromozómu IV Arabidopsis thaliana v kosmidu G16599 (Bevan a kol., 199b) pomocí programu BLASTN odhalilo přítomnost genu sdílejícího významnou homologii s extrachloroplastovou β-amylázou z Arabidopsis, ječmene, kukuřice, sóji a rýže. Průzkum také identifikoval několik 3'-koncových EST sekvencí, z nichž jedna, EST 81E10T7 (Newman a kol., 1995), dále nazývaná pBmy81, byla identická asi v úseku 300 nukleotidů. Klon EST 81E10T7 byl získán z Arabidopsis Biological Reource Center (ABRC) DNA Stock Center (Ohio University, USA). „Nested sada Bal31 delečnich subklonů, zahrnující cDNA inzert v pBmySl, byla užita jako templát v dvoj řetězcové sekvenační PCR s univerzálním fluorescenčně značenými primery. Sekvenační reakce byla analyzována na automatickém sekvenačnim zařízení Applied Biosystems Model 373A. Nukleotidová sekvence cDNA inzertu v klonu pBmy8'l je zde uvedena jako sekvence id. č. 3. Konstrukt pBmySl byl firmou Advanced Technologies (Cambridge) Limited, 210 Cambridge Science Park, Cambridge CB4 4WA, uložen dne 4. Srpna 1998 v souladu s Budapešťskou dohodou v Národní sbírce mikroorganismů, National Collection of Industrie! and Marino Bacteria (NCIMB), 23 St. Maohar Street, Aberdeen, Skotsko, a sice jako vzorek č. NCIMB 40964.
• · · ·
Identifikace domnělého chloroplastového směrovacího signálu
CDNA inzert pBmy81 obsahuje 36 netranslatovaných nukleotidů na 5'-konci, otevřený čtecí rámec (ORF), který kóduje protein složený z 548 aminokyselin, a 3'-koncový netranslatovaný úsek (UTR) velikosti 232 bp. Protein kódovaný inzertem pBmy81 má predikovanou molekulovou hmotnost 61 kDa a sdílí značnou aminokyselinovou podobnost s rostlinou extrachloroplastovou β-amylázou z kukuřice, rýže, ječmene, sóji a topinamburu. Avšak protein kódovaný pBmy81 se liší o všech dosud popsaných β-amyláz tím, že obsahuje jedinečnou A-koncovou extenzi mající vlastnosti choroplastového směrovacího signálu, tj. vysoký obsah šeřinu (16 %), threoninu (10 %) a pozitivně nabitých aminokyselinových zbytků (15 %)(Baier a Dietz, 199'7). Tři domény, které jsou rozlišující charakteristikou chloroplastových směrovacích signálů (Schatz Dobberstein, 1996), byly identifikovány v signální sekvenci: nenabitá amino-koncová doména, centrální doména bohatá na hydroxylované aminokyseliny, karboxy-koncová doména s potenciálem vytvářet amfifilní β-řetězec.
CDNA inzert v pBmyýl kóduje β-amylázu směrovanou do chloroplastu
Z 50 až 60 g nadzemní části rostlin hrachu (Pisum sativum L. var. Feltham First) byly izolovány chloroplasty pomocí gradientu Percollu. Rostliny byly pěstovány a izolace chloroplastů byla provedena jak bylo popsáno v Mould a Gray (1997a).
Plazmid pBmyol byl linearizován restrikčním štěpením Notl a pak byl transkribován in vitro užitím T7 RNA polymerázy.
značený prekurzorový protein, obsahující 35S-cystein, byl syntetizován v translačním
Radioaktivně ^S-methionin • ·· · • ···· · ·· · • 9 · · · 9 9 9 99 • · · · ·9
999 9999
systému z pšeničných klíčků v podstatě shodně s postupem
Mould a Gray
Import produktů byl Po inkubaci (1997b).
radioaktivně proveden stejně thermolysinem (0,2 pufru) a současně proteázová značených in vitro jak popsali Mould a translačnich s impotem byly intaktní chloroplasty mg/ml výsledná koncentrace v inkubovány 30 minut ošetřeny importovém reakce na ledu,
EDTA do pak byla výsledné
50mM
Chloroplasty byly reizolovány přes polštář 40% Percollu v importovém pufru a pak opláchnuty v imporotovém pufru (Mould a Gray, (1/10) vzorku thermolysinem koncentrace v importovém pufru.
1997b) . Alikvot ošetřených odebrán pro analýzu a zbytek byl frakcionován v podstatě postupem, který popsali Schnell a Blobel (1993). Vzorky thermolysinem thylakoidů a k v a n t i f i k o v á n y ošetřených chloroplastů, thermolysinem ošetřených na SDS-PAGE a pak barvením vyhodnoceny denzitometrií odpovídajících vnitřní a vnější membrány
10% polyakrylamidovém fluorografi i. Výsledky produkt (dráha Tr)měl izolované stromatu, thýla kódů byly
Coomasie modří a
o.
bylo gelu velikost v přítomnosti SDS a pak translačni chloroplasty hrachu značeným proteinem v přítomnosti intaktní inkubovány s radioaktivně
-ATP, byly detekovány polypeptidy velikosti 50 kDa a 48 kDa ( Rezistence těchto polypeptidů k degradaci exogenně thermolysinem ukazuje, že jde o produkty importu radioaktivně oset, řených na • · thylakoidů, thermolysinem ošetřených thylakoidů, vnitrní a vnější membrány, ukázala, že dva radioaktivně značené polypeptidy byly lokalizovány v stromatální frakci.
Příklad 2
Indukce genu ct β-amylázy z Arabidopsis thaliana sacharózou a světlem
Pro demonstraci indukce genu ct β-amylázy světlem rostliny Arabidopsis thaliana ekotypu Landsberg byly pěstovány ve skleníku při režimu 18 hodin světla, 6 hodin tmy, 18 °C. Po 5 týdnech byla dvě plata se semenáčky přenesena do úplné tmy a dvě plata byla dále ponechána na kontinuálním světle. Po dvou dnech bylo po jednom platu rostlin adaptovaných na tmu a na světlo použito pro izolaci celkové RNA a druhé plato každé varianty bylo po další 3 dny ponechání na kontinuálním světle.
Pro kombinovaný pokus sacharóza-světlo-tma byla semena Arabidopsis thaliana ekotypu Landsberg povrchově sterilizována, umístěna na MS agarové médium obsahující 1% sacharózu a pěstována v růstové komoře při režimu 18 hodin světla, 6 hodin tmy. 5 týdnů staré semenáčky byly přeneseny do sterilní vody nebo do 5% roztoku sacharózy nebo glukózy ve vodě. Tyto rostlinky pak byly ponechány po 3 dny buďto na kontinuálním světle nebo v kontinuální tmě. Z každé pokusné varianty byla připravena celková RNA. a analyzována Northernovým přenosem postupem jak popsali Eggermont a kol. (1996). Membrány s přenesenou RNA byly testovány se sondou, kterou byl cDNA inzert z pBmySl po náhodném značení J“P-dCTP postupem jak popsali Feinberg a Vogelstein (1983).
Výsledky uvedené na obr. 2A ukazují, že transkripty ct β-amylázy jsou indukovány ve tmě 5% sacharózou a v menší”· rozsahu 5% glukózou. Tato indukce je v přítomnosti cukrů navíc
• ·· · zesílena na světle. Tyto výsledky také ukázaly, že účinky • toto • toto ·· ·· toto • toto· toto
9 9 9 ·9 ··· ·· to* · • 9 9 99
9999 světla a cukrů jsou navzájem nezávislé.
Příklad 3
Konstrukce fúze „promotor ct β-amylázy - GUS
Promotorový fragment byl izolován z genu ct β-amylázy lokalizovaném v kosmidu G16599 (Bevan a kol., 1998) vyštěpením restrikčními enzymy. Vhodná restrikční místa v promotoru byla HindlII v pozici -1662 bp . (počínaje 19179 bp minus řetězce sekvence id. č. 8), Sáli v pozici -1127 bp a Pstl v pozici 371 bp a Xhol v pozici +21 bp „downstream od iniciačního methioninu byla užita k izolaci tří promotorových fragmentů různých délek a sekvence tranzitního peptidů (A z kodonu ATG iniciace translace je číslován +1).
Fragment velikosti 294 bp (sekvence id. č. 1) genu pro ct β-amylázu lokalizovaného v kosmidu G16599 (Bevan a kol., 1998) byl amplifikován pomocí následujících oligonukleotidových primerů:
Sekvence id. č. 4:
Pl: 5'-ATT TCC TCG AGT TCT CTT ATC-3'
Sekvence id. č. 5:
P2: 5'-cgg gAT CCC TGA CAT TGT TAC-3'
V primerů Pl podtržené báze odpovídají štěpnému místu Xho v pozici +21 bp, v primerů P2 báze vyznačené malými písmeny odpovídají nukleotidům přidaným pro vytvoření místa BamHI.
Chimérické geny „promotor ct β-amylázy - GUS byly vytvořeny trojitou ligací promotorového . fragmentu, přemosťujícího PCR fragmentu naštěpeného Xhol a BamHI a GUS vektoru pBHOl (Jefferson a kol., 1987) naštěpeného HindlIIBamHI, Sall-BamHI nebo Pstl-BamHI (obr.3). Konstrukty byly nazvány ΗβΟΙΙ3, εβΟΆΒ a ΡβΟυΞ. .
9 9 99 9 · · · · · · • 9 9 9 9 9 9 9 99
9 999 999999 · 9 9 9 9 9 9 9'9 9· • · Φ · · · ·«
999 99 99 999
Konstrukty chimérických genů byly přeneseny do Agrobacterium tuixiefaciens LBA4404 triparentální konjugací (Bevan 1984) a pak vneseny do rostlin Nicotiana tabaccum var. Samsun metodou transformace listových terčíků (Horsch a kol., 1985).
Příklad 3A
Indukce chimérického genu „promotor ct β-amylázy z Arabidopsis thaliana - GUS sacharózou a světlem v semenáčcích tabáku
Rostliny obsahující konstrukty ΗβΘυβ a ΡβΟυε exprimovaly vysoké hladiny GUS aktivity a semenáčky potomstva F1 byly užity ke zkoumání indukce chimérických genů světlem a sacharózou. F’l semena tabáku byla povrchově sterilizována, umístěna na MS agarové médium obsahující 1% sacharózu a pěstována v růstové komoře při režimu 18 hodin světla, 6 hodin tmy. Dva až tři týdny staré semenáčky byly přeneseny do sterilní vody nebo do 5% roztoku sacharózy a pak byly ponechány po 3 dny buďto na kontinuálním světle nebo v kontinuální tmě. Extrakty celkového proteinu sloučené z 10 až 14 semenáčků byly analyzovány na aktivitu GUS užitím fluorogenního substrátu 4-methylumbelliferylglukuronidu
Í4-MUG), jak popsali Jefferson a kol. (1987). Pro oba konstrukty hladiny GUS aktivity u semenáčků exponovaných na kontinuálním světle bez přítomnosti sacharózy byla podobná hladině GUS aktivity u semenáčků exponovaných sacharóze bez přítomnosti světla (obr. 4) . Avšak expozice semenáčků současně
sacharóze a kontinuálnímu světlu zvýšila hladinu GUS aktivity
dvakrát až třikrát. Tyto výs ledky j sou v ' dobré shodě
s výsledk'. / pokusů se samotným genem ct β-ar ayrazy, kter'·.·
3 '<3 Z ci i V f že indukovatelnost genu světle Πΐ. 3 Sá charózou jscz
nezávislé procesy.
• · · ••••9 9 99 9 ·· 9 · ♦ · · ·····« · · • · 999999φ
999 99 99·· «Μ • 9····
Histochemické barveni na GUS ukázalo, že aktivita byla detekována v děložních lístkách semenáčků starých dva týdny, ale žádná aktivita nebo velmi nízká byla detekována v prvním pravém listu nebo ve stonku a kořenu. U semenáčků starých čtyři týdny byla GUS aktivita navíc detekována u v prvním pravém listu a ve stonku. Barvení na GUS bylo zejména spojeno s buňkami parenchymu bohatého na chloroplasty (tj. chlorenchymu) lokalizovanými mezi xylémovými paprsky a mezi xylémem a floémovými svazky, které vytvářejí vnitřní floem ve stonku.
Příklad 4
Konstrukce plazmidu s ct β-amylázou pro transformaci listů tabáku a bramboru
Místně cílená mutageneze byla užita k přeměně místa KpnI lokalizovaného v pozici 2302 bp v plazmidu pBmySl na místo BamHI. Byly připraveny následující oligonukleotidové primery:
Sekvence id. č. 6;
P3: 5'- GCT GGT ACG CCT GCA GGA TCC GGT CCG GAA TTC CC -3' a
Sekvence id. č i
P4: 5'- GGG AAT TCC GGA CCG GAT CCT GCA GGC GTA CCA GC -3 '
a byly použity se soupravou pro mís tně cllenou mutagenezi
Quick Change (Promega). Postup byl proveden podle protokolu výrobce.
Kódující sekvence ct β-amylázy plné délky byla vystřižena z mutovaného plazmidu pBmy81 štěpením BamHI a pak purifikována užitím soupravy GeneClean (BIO 101). Fragment BamHI byl ligován do místa BamHI donorového vektoru pDV35S(SK)V (viz obr. 5) a pDV02000 (viz obr. 6). Vektor pDV35S(SK)V je složen z plazmidu pBluescript (Stratagene) nesoucím 35S CaMV promotor a 35S terminátor, tyto konstrukty jsou odborníkům známy (viz φφ ···· • · · · φ φ φ φ • · φφφ φ · φ φ φ φ • · φ · · ··♦·♦♦ φ • · φφφ φφφ ···♦· ·· φφ φφ φ např. Oděli a kol., 1985). Vektor pDV02000 je složen z plazmidu pBluescript a 1,4 kbp fragmentu patatinový promotor nopalinsyntázový terminátor. Odborník snadno připraví podobné konstrukty ze známých sekvencí (viz např. Liu a kol., 1990). Plazmidy s kódující sekvenci v obou orientacích, tj. jak sense tak i antisense vzhledem k promotoru, byly izolovány a chimérické geny ct β-amylázy byly subklonovány z donorového vektoru do binárního vektoru pBinPlus (van Engelen a kol., 1995). Mapy těchto plazmidu jsou uvedeny na obr. 7 až 10.
Příklad 5
Transformace nebo retransformace rostlin
Rostliny bramboru byly transformovány metodou kokultivace listových terčíků, jak již popsal Horch (1985). Výše popsané binární vektory byly přeneseny do Agrobacterium tumefaciens LBA4404 metodou elektroporace a kultury Agrobacterium byly použity k transformaci, kterou byly připraveny rostliny, které po regeneraci nesly chimérické geny popsané v příkladu 4.
Binární plazmid obsahující chimérický gen „patatinový promotor - ct β-amyláza - nopalinsyntázový terminátor byl použit k transformaci rostlin bramboru již nesoucích chimérický gen ADPG PPázy glgClb z E. coli metodou kokultivace listových terčíků.
Příklad 6
Konstrukce plazmdů se směrovacím peptidem AT ct β-amylázy
Plastidová směrovací sekvence AT ct β-amylázy je obsažena ve fragmentu velikosti 294 bp uvedeném zde jako sekvence id. č. 1. Pro izolaci tohoto fragmentu z plazmidu popsaných • · • ···
v přikladu 3 byla užita PCR nebo restrikční štěpení, čímž se získal fragment obsahující 35S CaMV promotor a plastidovou směrovací sekvenci nebo patatinvý promotor a plastidovou směrovací sekvenci. Chimérické geny byly zkonstruovány ligací sekvencí kódujících proteiny nebo enzymy jakožto translačních fúzí s transitním (směrovacím) peptidem. Translatované proteiny pak byly transportovány do plastidů, kde poskytly buďto nové aktivity nebo ovlivnily stávající metabolické dráhy.
• · ♦»· · • · • · ·· • ·
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
Ainsworth, C., Clark, J. and Balsdon, J. (1993). Plant. Mol. Biol., 22, 67-82.
Baier, M. and Dietz, K.J., (1997) Plant J. 12, 179-190
Bevan, M.W. (1984) Nucl. Acids. Res., 12, 8711-8721
Bevan, M.W. et al. (1998). Nátuře, 391, 485-488.
Chán, MT., Chao, YC. and Yu, SM. (1994). J. Biol. Chem., 269, 17635-17641.
Chen, MH., Liu, LF., Chen, YR., Wu, HK. and Yu, SM. (1994).
Plant J., 6, 625-636.
Daussant, J., Zbaszyniak, B., Sadowski, J. and Wiatroszak, I.
(1981). Planta, 151, 176-179.
Denyer, K., Clarke, B., Hylton, C., Tatge, H. and Smith, A.M.
(1996). Plant J., 10, 1135-1143.
Duwenig, E., Steup, M., Willmitzer, L. and Kossmann, J. (1997).
Plant J., 12, 323-333.
Eggermont, K., Goderis, I. J. and Broekaert, W. F. (1996).
Plant Mol. Biol. Rep. 14, 273-279.
Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983). Anal. Biochem. 132,
6-13.
Gelvin, S. B. and Schilperoort, R. A. (1995). Plant Molecular ·· ··· · ·
• 999 • · 9 9
Biology Manual. 2nd edition. Kluwer Academie PuKlishers, The
Netherlands.
Hildebrand, D.F. and Hymowitz, T. (1981). Physiol. Plant., 53, 429-434.
Horsch, R.B., Fry, J.E., Hoffman, N.L., Eichholtz, D., Rogers,
5. G. and Swaley, R.T. (1985) Science, 227. 1229-1231.
Hylton, C.M., Denyer, K., Keeling, P.L., Chang, MT. and Smith,
A.M. (1995). Planta, 198, 230-237.
Innes, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. and White, T.J.
(1990). PCR Protocols. Publisher: Academie Press.
James, M.G., Robertson, D.S. and Myers, A.M. (1995). Plant
Cell, 7, 417-429.
Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A. and Bevan, M.W. (1987) EMBO, J.
6. 3901-3907.
Kakefuda, G. , Duke, S.H. and Hostak, M.H. (1986). Planta, 168, 175-182.
Klosgen, R.B. and Weil, J.H. (1991) Mol. Gen. Genet., 225, 297304
Li, B., Servaites, J.C. and Geiger, D.R. (1992). Plant Physiol., 98, 1277-1284.
Liu, X.J., Prát, S., Willmitzer, L. and Frommer, W.B. (1990)
Mol. Gen. Genet., 223, 401-406.
Mita, S., Suzuki-Fujii, K. and Nakamura, K. (1995) Plant
Physiol. 107,895-904.
Mita, S., Murano, N. , Akaike, M. and Nakamura, K. (1997). Plant
J., 11, 841-851.
Mould, R.M. and Gray, J.C. (1997a). In Cell
Laboratory Handbook, second edition, Volume ed) . New York: Academie Press, pp. 81-86.
Mould, R.M. and Gray, J.C. (1997b) . In Cell
Laboratory Handbook, second edition, Volume ed) . New York: Academie Press, pp. 286-292.
·· φφφφ· · φφφφ φ φ φφφφφ φ φ φ · φ ·φ φ φ φ ·φ
Biology: A φφφ φ ♦ Φ φφφ φΦ φΦ φΦ
2. (Cells, J.E.
Biology: A
2. (Cells, J.E.
Nakamura, Κ. , Ohto, Μ., Yoshida, Ν. and Nakamura, Κ. (1991).
Plant Physiol., 96, 902-909.
Neuhaus, H.E., Henrichs, G. and Schiebe, R. (1995). Planta,
194, 454-460.
Newman, T. et al. (1994). Plant Physiol., 106, 1241-1255.
Nielson, T.H., Deiting, U. and Stitt, M. (1997). Plant
Physiol., 113, 503-510.
Oděli, J.T. Nagy, F.
and Chua, N.H. (1985) Nátuře, 313, 810812.
Peavey, D.G., Steup,
M. and Gibbs, M. (1977). Plant Physiol.,
60, 305-308.
Pwee, K-H. and Gray,
J.C. (1993) Plant J. 3, 437-449.
Rocha-Sosa, Μ., Sonnewald, U., Frommer, W., Stratmann, M., Schell, J. and Willmitzer, L. (1989) EMBO, 8, 23-29.
Sambrook, J. , Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning. Publisher: Cold Spring Harbour.
Schatz, G. and Dobberstein, B. (1996). Science, 271, 1519-1526.
Schnell, D.J. and Blobel, G. (1993). J. Cell. Biol., 120, 10334 « ·
·· toto' • to • toto ··· · · to ·
115.
Sonnewald, U., Basner, A., Greve, B. and Steup, M. (1995).
Plant. Mol. Biol., 27, 567-576
Sweetlove, L.J., Burrell, M.M. and ap Rees, T. (1996). Biochem.
J., 320, 493-498.
Thomson, W.W. and Whatley, J.M. (1980) Ann. Rev. Plant Physiol. 31, 375-394.
van Engelen, F. A., Molthoff, J. W., Conner, A. J. , Nap, J-P., Pereira, A. and Stiekema, W. J. (1995) . Transgenic Res. 4, 288290 .
van der Leij, F.R., Visser, R.G.F., Ponstein, A.S., Jacobsen, E. and Feenstra, W.J. (1991). Mol. Gen. Genet., 228, 240-248.
Wang, SM., Lue, WL. and Chen, J. (1996). Plant Mol. Biol., 31, 975-982.
Wang, SM., Lue, WL., Huang, HW. and Chen, J. (1997). Plant
Physiol., 113, 403-409.
1Γ
X
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 294 párů bázi (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA z mRNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Arabidopsis thaliana (B) KMEN: ekotyp Columbia (F) TYP TKÁNĚ: list (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(A) KNIHOVNA: ABRC DNA Stock Centre (B) KLON: EST 81E10T7 (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: chromozom IV (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: tranzitní peptid (B) POZICE: 37-291 bp (xi)
POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
TCATTTCTCATCATAACAAAGAGAGAGAAAAAAACTATGGAATTGACACTGAATTCCTCG
ME LTLNSS8
AGTTCTCTTATCAAACGTAAAGATGCCAAGAGTTCTAGAAACCAAGAAAGTTCCTCCAAC
SSLIKRKDAKSSRNQESSSN28
121 AACATGACCTTTGCGAAGATGAAGCCGCCAACATATCAGTTCCAAGCAAAGAACTCGGTT
N MTFAKMKPPTYQFQAKNSV48 »
181 AAGGAAATGAAGTTCACTCACGAG AAGACCTTCACGCCAGAAGGTGAAACCCTTGAGAAA KEMKFTHEKTFTPEGETLEK68
241 TGGGAGAAGCTCCACGTTCTCTCATACCCACACTCCAAG AACGACGCTAGCGTT
WEKLHVLSYPHSKNDASV 85 • ·· · • ·
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1662 párů baží (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA z mRNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Arabidopsis thaliana (B) KMEN: ekotyp Columbia (F) TYP TKÁNĚ: list (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(A) KNIHOVNA: ABRC DNA Stock Centre (B) KLON: EST 81E10T7 (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: chromozom IV (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: kódující sekvence (B) POZICE: 1-1393 bp (D) DALŠÍ INFORMACE: zralý peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
GTTCCGGTGTTCGTCATGTTACCGCTCGACACAGTAACAATGTCAGGGCATTTGAACAAA
VPVFVMLPLDTVTMS GHLNK20
CCACGAGCCATGAACGCTAGTTTGATGGCTCTGAAAGGAGCTGGTGTGGAAGGTGTGATG
PRAMNASLMALKGAGVEGVM40
121 GTGGATGCTTGGTGGGGATTGGTGGAGAAAGATGGACCTATGAATTATAACTGGGAAGGC
VDAWWGLVEKDGPMNYNWEG60
181 TATGCCGAGCTTATACAGATGGTTCAAAAGCACGGTCTCAAACTCCAGGTCGTTATGTCA YAEL IQMVQKHGLKLQVVMS80
241 TTCCATCAATGTGGAGGAAACGTAGGAGACTCTTGCAGTATCCCCTTGCCTCCATGGGTG
FHQCGGNVGDSCSIPLPPWV 100
301 CTTGAAGAGATCAGCAAGAACCCTGATCTTGTCTACACAGACAAATCTGGGAGAAGGAAC
LEEISKNPDLVYTDKSGRRN 120
361 CCTG AATATATCTCCTTGGGATGTGATTCTGTGCCTGTCCTAAGAGGAAGAACACCTATC
PEYI SLGCDSVPVLRGRTPI14 0
421 CAGGTCTACTCAGATTTCATGAGGAGCTTCCGTGAACGATTTGAAGGCTACATAGGAGGA
QVYSDFMRSFRERFEGYIGG 160 i
481 GTTATTGCGGAAATTCAAGTAGGAATGGGACCTTGTGGAGAATTGAGATACCCATCATAC
VIAEIQVGMGPCGELRYPSY 180
541 CCTGAAAGCAACGGGACCTGGAGATTCCCCGGAATTGGAGAGTTCCAGTGCTACGACAAG
P.ESNGTWRFPG IGEFQCYDK 200
601' TATATGAAATCGTCACTTCAGGCATATGCTGAATCAATTGGGAAAACTAACTGGGGAACA
YMKSSLQAYAESIGKTNWGT 220
661 AGCGGACCTCATGATGCCGGCGAGTACAAGAACCTCCCAGAAGATACTGAATTTTTCAGG
SGPHDAGEYKNLPEDTEFFR 240
721 AGAGACGGAACATGGAATAGCGAGTATGGAAAGTTTTTCATGGAATGGTACTCCGGGAAG
RDGTWNSEYGKFFMEWYSG K 260
781 CTGCTAG AACATGGAG ACCAACTCCTATCTTCAGCGAAAGGTATCTTTCAAGGAAG CGG A
LI>EHGDQLLSSAKGIFQGSG 280
841 GCAAAGCTATCAGGAAAGGTAGCTGGAATTCACTGGCACTACAACACCAGGTCACACGCA
AKLSGKVAGIHWHYNTRSHA300
901 GCTGAGCTAACCGCTGGATATTACAACACAAGAAACCATGACGGGTATCTGCCAATAGCT
AELTAGYYNTRNHDGYLP I A 320
961 AAGATGTTCAACAAACATGGAGTTGTGCTCAACTTCACCTGCATGGAGATGAAAGACGGG
KMFNKHGVVLNFTCMEMKDG 360
1021 GAGCAACCTGAGCACGCGAATTGCTCACCAGAAGGTCTGGTCAAGCAAGTACAGAACGCG
EQPEHANCSPEGLVKQVQNA 380
1081 ACAAGGCAGGCCGGAACCGAACTAGCAGGGGAGAACGCGCTAGAACG ATATGACTCGAGC
TRQAGTELAGENALERYDSS 400
1141 GCATTCGGACAAGTGGTAGCAACAAATAGGTCAGATTCTGGAAATGGGTTAACCGCATTT
AFGQVVATNRSDSGNGLTAF 420
1201 ACTTACCTAAGAATGAACAAGCGGTTATTTGAGGGTCAAAATTGGCAGCAGTTAGTGGAG
TYLRMNKRLFEGQNWQQLV E 440
1261 TTTGTTAAGAACATGAAGGAAGGTGGTCATGGGAGGAGACTCTCAAAAGAAGACACAACT
FVKNMKE GGHGRRLS KEDTT 460
1321 GGAAGTGACCTTTATGTTGGATTTGTCAAAGGCAAGATCGCTGAGAATGTGGAGGAGGCT
GSDLYVGFVKGKIAENVEEA 480
81 GCTTTAGTGTAATTTCCCACATAGGTACATAC ATATAGTGTGGTGTTTATTGTATTCCTG
A L V - 483
1441 TCTGATAAATAACTAGAGAGATCAAACCAGTAAGAGTGTTAAAGCTATAGATTTGCACAA
1501 TTCTGGGTCAGAGTCAGAGCÁAAGAGAAGCAAAATCAAGATGATGTACACTTAGATGTAT
1561 CCTATGAGTTTTCCTTGTACATCATCTTCATACTCTTAATCTCAAATACTATGCATTTTT
1621 CTCCAAAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGCTCTAGAGGATCC • ·
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1953 párů baží (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA z mRNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Arabidopsis thaliana (B) KMEN: ekotyp Columbia (F) TYP TKÁNĚ: list (vii) PŘÍMÝ ZDROJ:
(A) KNIHOVNA: ABRC DNA Stock Centre (B) KLON: EST 81E10T7 (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM/SEGMENT: chromozom IV (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 37-1683 bp (D) DALŠÍ INFORMACE: cílený chloroplast (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
TCATTTCTCATCATAACAAAGAGAGAGAAAAAAACTATGGAATTGACACTGAATTCCTCG
MELTLNSS8
AGTTCTCTTATCAAACGTAAAGATGCCAAGAGTTCTAGAAACCAAGAAAGTTCCTCCAAC
SSLIKRKDAKSSRNQESSSN28
121 AACATGACCTTTG CGAAGATGAAGCCGCCAAC ATATCAGTTCCAAGCAAAG AACTCGGTT
N Μ T F A K M': KPPTYQFQA KNSV48
181 AAGGAAATGAAGTTCACTCACGAGAAGACCTTCACGCCAGAAGGTGAAACCCTTGAGAAA
KEMKFT H EKTFTPEGETLEK68
241 TGGGAGAAGCTCCACGTTCTCTCATACCCACACTCCAAGAACGACGCTAGCGTTCCGGTG
WEKLHVLSYPHSKNDASVPV88
01 TTCGTCATGTTACCGCTCGACACAGTAACAATGTCAGGGCATTTGAACAAACCACGAGCC
FVMLPLDTVTMSGHLNKPRA108
361 ATGAACGCTAGTTTGATGGCTCTGAAAGGAGCTGGTGTGGAAGGTGTGATGGTGGATGCT
MN ASLMALKGAGVEGVMVDA 128
421 TGGTGGGGATTGGTGGAGAAAGATGGACCTATGAATTATAACTGGGAAGGCTATGCCGAG
WWGLVE KDGPMNYNWEGYAE 148
481 CTTATACAGATGGTTCAAAAGCACGGTCTCAAACTCCAGGTCGTTATGTCATTCCATCAA
L I QMVQKHGL KL QVVMS F H Q 168
541 TGTGG AGGAAACGTAGGAGACTCTTGCAGTATCCCCTTGCCTCCATGGGTGCTTGAAGAG
CGGNVGDSCSIPLPPWVLEE 188
601 ' ATCAGCAAGAACCCTGATCTTGTCTACACAGACAAATCTGGGAGAAGGAACCCTGAATAT
ISKNPDLVYTDKSGRRNPEY 208
661 ATCTCCTTGGGATGTGATTCTGTGCCTGTCCTAAGAGGAAGAACACCTATCCAGGTCTAC
ISLGCDSVPVLRGRTPIQVY 228
721 TCAGATTTCATGAGGAGCTTCCGTGAACGATTTGAAGGCTACATAGGAGGAGTTATTGCG
SDFMRSFRERFEGYIGGVIA 248
781 GAAATTCAAGTAGGAATGGGACCTTGTGGAGAATTGAGATACCCATCATACCCTGAAAGC
EIQVGMGPCGEL RYPSYPES 268
841 AACGGG ACCTGGAGATTCCCCGG AATTGGAGAGTTCCAGTGCTACGACAAGTATATGAAA
NGTWRFPGIGEFQCYDKYMK 288
901 TCGTCACTTCAGGCAT ATG CTGAATCAATTGGG AAAACTAACTGGGG AACAAGCGGACCT
SSLQAYAE S IGKT NWGTS G P 308
961 CATGATGCCGGCGAGTACAAGAACCTCCCAGAAGATACTGAATTTTTCAGGAGAGACGGA
HDAGEYKNLPEDTEFFRRDG 328
1021 ACATGGAATAGCGAGTATGGAAAGTTTTTCATGGAATGGTACTCCGGGAAGCTGCTAGAA
TWNSEYGKFFME.WYSGKLLE 348
1081 CATGGAGACCAACTCCTATCTTCAGCGAAAGGTATCTTTCAAGG AAGCGGAGCAAAGCTA
HGDQ LLS SAKG I FQGSGAK L 368
1141 TCAGGAAAGGTAGCTGGAATTCACTGGCACTACAACACCAGGTCACACGCAGCTGAGCTA
SGKVAGIHWHYNTRSHAAEL 388
1201 ACCGCTGGATATTACAACACAAGAAACCATGACGGGTATCTGCCAATAGCTAAGATGTTC
T A G Y Y N”Ť RNHDGYLPIAKMF 408
1261 AACAAACATGGAGTTGTGCTCAACTTCACCTGCATGGAGATGAAAGACGGGGAGCAACCT
NKHG VVLNFTCMEMKDGEQ P 428
1321 GAGCACGCGAATTGCTCACCAGAAGGTCTGGTCAAGCAAGTACAGAACGCGACAAGGCAG
EHANCS P EGLVKQVQNATRQ 448
81 GCCGGAACCGAACTAGCAGGGGAGAACGCGCTAGAACGATATGACTCGAGCGCATTCGGA
AGTELAGENALERYDSSAFG 468
1441 CAAGTGGTAGCAACAAATÁGGŤCAGATTCTGGAAATGGGTTAACCGCATTTACTTACCTA
QVVATNRŠDSGNG LTAFTYL 488
1501 AGAATGAACAAGCGGTTATTTGAGGGTCAAAATTGGCAGCAGTTAGTGGAGTTTGTTAAG
RMNKRLFEGQNWQQLVEFVK 508
1561 AACATGAAGGAAGGTGGTCATGGGAGGAGACTCTC AAAAGAAG ACACAACTGG AAGTGAC
NMKEGGH GRRLSKEDTTGSD52 8
1621 CTTTATGTTGGATTTGTCAAAGGCAAGATCGCTGAGAATGTGGAGGAGGCTGCTTTAGTG
LYVGFVKGKIAENVEEAALV 548
1681 TAATTTCCCACATAGGTACATACATATAGTGTGGTGTTTATTGTATTCCTGTCTGATAAA
1741 TAACTAGAGAGATCAAACCAGTAAGAGTGTTAAAGCTATAGATTTGCACAATTCTGGGTC
1801 AGAGTCAGAGCAAAGAGAAGCAAAATCAAGATGATGTACACTTAGATGTATCCTATGAGT
1861 TTTCCTTGTACATCATCTTCATACTCTTAATCTCAAATACTATGCATTTTTCTCCAAAAA
1921 AAAAAAAAAAAGGGCGGCCGCTCTAGAGGATCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů bázi (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
AATTCCTCGA GTTCTCTTAT C (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 21 párů bázi (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
CGGGATCCCT GACATTGTTA C
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 35 párů bázi (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
GCTGGTACGC CTGCAGGATC CGGTCCGGAA TTCCC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 35 párů bázi (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:
GGGAATTCCG GACCGGATCC TGCAGGCGTA CCAGC 35
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
(i) (ii) (vi) (vii)
CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 1652 párů baží (B) TYP: nukleotid (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární
TYP MOLEKULY: genomová DNA
PŮVODNÍ ZDROJ:
(A) ORGANISMUS: Arabidopsis thaliana (B) KMEN: ekotyp Columbia (F) TYP TKÁNĚ: list
PŘÍMÝ ZDROJ:
(A) KNIHOVNA: EU Arabidopsis Genome Project (B) KLON: Cosmid G16599 (viii) POZICE V GENOMU:
(A) CHROMOZOM: chromozom 4 (ix) ZNAKY:
(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: promotor (B) POZICE: 17534-19185 bp z G16599 (D) DALŠÍ INFORMACE: komplementární vlákno (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
1 AAGCTTGTGT CTATTTCAAA TTCTTGACCG TAGATGTCAC AACATGCATA
51 TATCATTGAA AACAGAGCAA CACAGGAAAC CAAGCATATG TATCTAGATA
101 TACTTAGCAA GACATAACTA TAGTCTTTGA ATCAACATAG GGATTAATGA
151 TAGAGAATGA GGAAGCTCAA GATTTTATAC TCAGTTTCTT ACAAAACAAA
201 TTTCTCTCTA ACTGCAAAAA CACCAATTAG GATTTGAAGA GCGTACCTGT
251 TTGAGTCAAT GTCCAATGTC GTCCCCCCGC CTTCTACATT TCTTAGCCTG
301 CTGAATAAAA GCACAAGCCA AAATGAGAAG GTGCCAAAGG CGATAAGGAT
351 CAATTTCTAC CATTCAAAAA ACTAATGGTG AGAATTAGAA ACGAGAGAAA
401 ACTACTTGTT GAGGAAATAG CCAAAAGCGC AATCTTCGTC ACCTGAATAA
451 AGACCAAACC GTCACTTTCA ATGAGTCAGC AAGAAAAAGA GAGAGAGAGA
501 GAGAGAGATT CTCTATAACA TTTGAGTCGA CATGGATTCT AATGCATCAA
551 AAGTCATCTC CAATAAACAA ACACTTGAAA CTCACATGGC TAATAGAACA
601 AGATCAAAGC CTTAAGTATT AAGCATTACA GACACTACTG GCTAACTTTT
651 GACACATGTT CTTAAGTAAC ATAGTATCAA TATCCGTGAA TCACATCGAA
701 CACACACAAC AAGGGCTTAA TGCATCAAAG TCCTGTTATT TCCATATAAC
751 AACATATTTC ATTTACAAAC AGAATGCAGC ATTCAGGCAG TCCAAATGGA
801 AAGGTTGACA ΑΑΆΑΑΑΤΑΤΑ ATCTTGTAAC TCTACATATA TGGCAGAATG
851 TAATAACCAG GCAAGAAAAA AACAGAATAA ACAGATCAAT GAGTATGATA
901 TAAAAAAAAG TCACAAAGAA TGTGCCACAG TGAACAAGAG GGCCATGAGA
951 AGAAATTTTC AAAGAAAATA TTAGCATTGT TAGAATTTTT TGGGTCAATG
1001 GATCTGTCAG CTGCTTAGTT GGAAAACACA AATCTTACAG GAAGGAAAGT
1051 CCAAGAAAAA GAAAATAAGC AAAGTTAATA GCCACCACAA GAAATTTCAT
1101 ACAGAAATAA TTAAATCGTT GCACTTATCT TČTTATTCAA ACTAAAATCA
1151 AGAGAACTTA ATAATTTTCA GCCACACGAA CCATGTGTTC AAAGCCAAAG
1201 GTGAGAAGCC AAAATTATCA GCTTATCTCC ATTAACAAGG GAAAAGCAAG
1251 ACTAGATTTA AGAGTTCTCT GTAACTAAAA ACTGCAGGAG TGAGTAAGTA
1301 AATAÁTTCAC CAACAGGAAA ACAAAACTCA ATTATCTATA GCTGAATACA
1351 CATGTAAATG AGAATTTATT AACTAAAACA TCTTCCTTTG TAACTGATGT
1401 GACATTTACA ATTTTTCATT TTGAGGTGTA AGAACCGTGT GACAAGTGAA
1451 AAGGTTAAAA TAAGCAACCT TTGTGATATT TTCTCTCCAC TTTTTGAAAT
1501 TGGGTCTCCA AACCACAGCC AATCAATATT CTTTATAAAT ACAAACACAC
1551 AAACAGCATC TTTCTCTCAA ACACAAACAT ATCTTCTATC AAACACCAAC
1601 AGCTCTATTC TCTACCTCAT TTCTCATCAT AACAAAGAGA GAGAAAAAAA
1651 CT

Claims (36)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY ·« Μ* · • · • · ♦·
    Μ ·* ·Φ *·· (/οι/υ )
    1. Způsob zvýšení nebo sníženi aktivity enzymu v rostlině, který je zapojen v metabolické dráze biosyntézy nebo degradace škrobu, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se do rostlinného genomu stabilně vloží chimérický gen, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující plastidovou směrovací sekvenci a kódující sekvenci pro β-amylázu, a regeneruje se rostlina se změněným genomem.
  2. 2. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že sekvence nukleové kyseliny obsahuje sekvenci podle nároku
    10.
  3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že kódující sekvence je sekvence nukleové kyseliny podle nároku 13, přičemž jde o sekvenci kódující β-amylázu.
  4. 4. Způsob podle nároku lvyznačující se tim, že sekvence nukleové kyseliny je sekvence podle nároku 14.
  5. 5. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že enzym je neplastidová β-amyláza.
  6. 6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 vyznačující se tím, že chimérický gen dále obsahuje kódující sekvenci pro enzym vybraný ze skupiny skupiny obsahující sacharózasyntázu, ADPG pyrofosforylázu, syntázu škrobu, větvicí enzym, α-amylázu, isoamylázu, neplastidovou β-amylázu, α-glukosidázu, fosforylázu škrobu a disproporcionační enzym.
    ·« ··· · ·· » · • • • * · • • • · • ·· • • • · • • • · • » · • ··♦ • · • • ♦ • • « « • • • · ··· ·· ··
    7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 vyzná č u j í c i se tim, že chimérický gen dále obsahuje promotor, přičemž tento promotor je sekvence nukleové kyseliny podle nároku 15.
  7. 8. Způsob směrování proteinů nebo enzymů do rostlinného plastidu vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se do rostlinného genomu stabilně vloží chimérický gen, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující plastidovou směrovací sekvenci a kódující sekvenci pro protein nebo enzym, a regeneruje se rostlina se změněným genomem, přičemž protein nebo enzym je jeden nebo více vybraných ze skupiny metabolických drah obsahující: syntézu lipidů, fotosyntézu, metabolismus aminokyselin, fixaci dusíku, fixaci uhlíku nebo syntézu sacharidových polymerů, nebo protein nebo enzym udělující rostlině nějaký znak, přičemž sekvence nukleové kyseliny je sekvence podle nároku 10.
  8. 9. Způsob podle nároku 8vyznačující se tím, že znak je vybrán z jedné ze skupin znaků: rezistence k herbicidům a rezistence ke škůdcům.
  9. 10. Sekvence nukleové kyseliny uvedená zde jako sekvence id. č. 1 s nukleotidy 1 až 294 a obsahující sekvenci schopnou směrování kódující sekvence do rostlinného plastidu, nebo sekvence jí podstatně podobná, která má stejnou směrovací schopnost.
  10. 11. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 10, která kóduje 94 aminokyselinových zbytků.
    44 44« 4 44 • 4 «4 4 < • •4 4 4 4 4 4 4 • • 4 44 4 4 4 • 4 4 • 4 • · 4 4 • 44 4 4 4 • 4 4 4 4 4 • 4 4« 444 • 4 • 4 • 4 4
  11. 12. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 11, která kóduje 85 aminokyselinových zbytků.
  12. 13. Sekvence nukleové kyseliny uvedená zde jako sekvence id. č. 2 s nukleotidy 1 až 1662 a obsahující sekvenci kódující β-amylázu, nebo sekvence s ni v podstatě podobná,, která má stejnou kódující schopnost.
  13. 14. Sekvence nukleové kyseliny uvedená zde jako sekvence id. č. 3 s nukleotidy 1 až 1953 a obsahující sekvenci kódující do chloroplastu směrovanou β-amylázu, nebo sekvence alespoň z 65 % homologní se sekvencí id. č. 3, která má stejnou kódující schopnost.
  14. 15. Sekvence nukleové kyseliny schopná řídit expresi produktu kódovaného kódující sekvencí, která je s ní operativně spojena, kterážto sekvence je zde uvedena jako sekvence id. č. 8, nebo sekvence s ní alespoň z 65 % homologní a má stejnou funkci, přičemž tato sekvence odpovídá na stimul a hladina exprese produktu závisí na odpovědi na stimul aplikovaný na sekvenci nukleové kyseliny.
  15. 16. Sekvence nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 10 až 15, kde sekvence nukleové kyseliny je sekvence mRNA, cDNA nebo genomové DNA.
  16. 17. Způsob změny hladiny exprese produktu kódovaného kódující sekvencí operativně spojenou se sekvencí nukleové kyseliny schopnou řídit expresi produktu v rostlině, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se trvale inkorporuje do rostlinného genomu chimérický gen obsahující sekvenci nukleové kyseliny schopnou řídit expresi produktu kódovaného kódující sekvencí, která je χί
    ·· ···* ·· 4· ·· · • • • • • • · • • • 4 • • • • • · • • • • • • · • • 4·· • 4 • • • • ·· • 4·· 4 ·· • • »4 • • ·· • ···
    s ní operativně spojena, přičemž sekvence nukleové kyseliny je sekvence podle nároku 15.
  17. 18. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že kódující sekvence kóduje gen způsobující sterilitu rostliny v průběhu kvetení, jehož exprese je vyvolána sekvenci nukleové kyseliny po expozici světlu.
  18. 19. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že kódující sekvence kóduje gen, který mění hladinu genů pro enzymy biosyntézy škrobu v listech nebo jiném fotosyntetickém pletivu.
  19. 20. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že kódující sekvence kóduje gen, jehož expresní hladina se mění po tvorbě cukru ve vyvíjejícím se zásobním orgánu a účinku cukru na sekvenci nukleové kyseliny.
    21. Způsob podle že sekvence přítomnosti c nároku 17 nukleové :ukru. vyznačuj ící se t světle í m, bez kyseliny je funkční na 22. Způsob podle nároku 17 v y z n a č u j í c í se t i m, že sekvence nukleové kyseliny je funkční v přítomnosti
    světla bez cukru.
  20. 23. Způsob změny dalšího enzymu v transgenni rostlině, vyznačující se tím, že rostlina již vykazuje zvýšení nebi snížení enzymové aktivity v metabolické dráze biosyntézy škorbu v důsledku genetické transformace, a cílem je stimulovat nebo utlumit daný další enzym, a tím zvýšit nebo snížit množství produkovaného škrobu v retransformované rostlině, přičemž další enzym je do plastidů směrovaná β-amyláza.
  21. 24. Způsob podle nároku 23 vyznačující se tím, že do plastidů směrovaná β-amyláza obsahuje sekvenci id. č. 1.
  22. 25. Způsob podle nároku 23 nebo 24 vyznačující se tím, že do plastidů směrovaná β-amyláza obsahuje sekvenci id. č. 2.
  23. 26. Způsob podle nároku 23 vyznačující se tím, že poprvé transformovaná rostlina je rostlina transgenního bramboru transformovaná genem pro adenosindifosfoglukózapyrofosoforylázu (ADPG-PPázu).
  24. 27. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1, 8, nebo 17 vyznačující se tím, že chimérický gen dále obsahuje promotor vybraný ze skupiny obsahující promotor 35S z viru mozaiky květáku (zkrácený nebo úplný), promotor z rubisco, promotor plastocyaninu z hrachu, promotor nopalinsyntázy, promotor chlorofyl a/b vazebného proteinu, promotor gluteninu s vysokou molekulovou hmotností, promotor a,β-gliadinu, promotor hordeinu a promotor patatinu.
  25. 28. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1, 8, nebo 17 vyznačující se tím, že kódující sekvence enzymu v chimérickém genu vede ke stimulaci nebo utlumení aktivity enzymu.
    • ·
  26. 29.
    Způsob podle nároku 17 v y z n že stimulem je přítomnost nebo proměnlivá hladina cukru.
    a č u j ící nepřítomnost světla tím, a/nebo
  27. 30.
    Způsob podle nároku 17 že stimulem je vývojově v y z n řízený stimul.
    a č u j ící m,
  28. 31.
    Způsob podle že cukr je sacharózy.
    nároku 29 jeden nebo v y z více načuj ící cukrů vybraných m, glukózy
  29. 32.
    Způsob podle že cukr je nároku 31 sacharóza.
  30. 33.
    Chimérický nároku 10.
  31. 34.
    Chimérický
  32. 35.
    načuj ící m, gen obsahující sekvenci nukleové kyseliny podle gen obsahující sekvenci kódující plastidovou sekvenci nukleové směrovací sekvenci nukleové kyseliny podle nároku 10 a v metabolické dráze kódován sekvencí kyseliny degradace podle nároku 13.
    kóduj ící škrobu, enzym přičemž zapojený enzym je
    Chimérický gen schopnou řídit kódující sekvence obsahující sekvenci expresi další kódující sekvence, kde je sekvence podle nároku 13.
    nukleové kyseliny ♦
  33. 36. Chimérický gen, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny podle nároku 15, která odpovídá na stimul, a kódující sekvenci, přičemž hladina exprese kódující sekvence se mění v závislosti na stimulu aplikovaném na sekvenci nukleové kyseliny.
    • · • · • · π>
    #4
  34. 37. Rostlinné buňky obsahující sekvenci nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 10, 13, 14 a 15.
  35. 38. Semena transformovaných rostlin obsahující jednu nebo více sekvencí nukleových kyselin podle kteréhokoliv z nároků 10, 13, 14 a 15.
  36. 39. Rostliny transformované způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1, 8, nebo 17, přičemž jde o rostliny vybrané z jedné nebo více skupin obsahující brambor, pšenici, kukuřici, ječmen, rajče, rýži, hrách, sóju, podzemnici olejnou, maniok, yam, banán a tabák.
CZ20010460A 1998-08-19 1999-08-13 Sekvence nukleové kyseliny, zpusob zvýšení nebo snížení aktivity ß-amylázy v rostline, zpusob smerování proteinu nebo enzymu do rostlinného plastidu, zpusob zvýšení nebo snížení množství škrobu produkovaného transgenní rostlinou, chimérický gen obsah CZ303574B6 (cs)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9817963.3A GB9817963D0 (en) 1998-08-19 1998-08-19 A plastid-targeting nucleic acid sequence and uses therefor
GBGB9817959.1A GB9817959D0 (en) 1998-08-19 1998-08-19 A novel plastid-targeting nucleic acid sequence and a novel B-amylase sequence and uses therefor
GBGB9913014.8A GB9913014D0 (en) 1999-06-05 1999-06-05 A plastid-targeting nucleic acid sequence,a stimulus-responsive promoter,and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2001460A3 true CZ2001460A3 (cs) 2001-11-14
CZ303574B6 CZ303574B6 (cs) 2012-12-19

Family

ID=27269441

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20010460A CZ303574B6 (cs) 1998-08-19 1999-08-13 Sekvence nukleové kyseliny, zpusob zvýšení nebo snížení aktivity ß-amylázy v rostline, zpusob smerování proteinu nebo enzymu do rostlinného plastidu, zpusob zvýšení nebo snížení množství škrobu produkovaného transgenní rostlinou, chimérický gen obsah

Country Status (18)

Country Link
US (2) US6489540B1 (cs)
EP (1) EP1105468B1 (cs)
JP (2) JP2002523040A (cs)
CN (2) CN1528904B (cs)
AT (1) ATE527346T1 (cs)
AU (1) AU773492B2 (cs)
BR (1) BR9914299A (cs)
CA (1) CA2336249C (cs)
CZ (1) CZ303574B6 (cs)
ES (1) ES2375034T3 (cs)
HU (1) HU228696B1 (cs)
MX (1) MXPA01001815A (cs)
NZ (1) NZ509642A (cs)
PL (1) PL205558B1 (cs)
SK (1) SK288125B6 (cs)
TR (1) TR200100625T2 (cs)
WO (1) WO2000011144A2 (cs)
ZA (1) ZA200100736B (cs)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3546337B2 (ja) * 1993-12-21 2004-07-28 ゼロックス コーポレイション 計算システム用ユーザ・インタフェース装置及びグラフィック・キーボード使用方法
ATE527346T1 (de) 1998-08-19 2011-10-15 Cambridge Advanced Tech Neue plastidgezielte nukleinsäure sequenz, neue beta-amylase sequenz, stimulus-abhängiger promoter und deren verwendungen
MXPA03007469A (es) 2001-02-22 2004-07-30 Pioneer Hi Bred Int Manipulacion de genes sucrosa sintasa para mejorar la calidad del grano y tallo.
JP2004535789A (ja) * 2001-04-25 2004-12-02 マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フォルデルング デル ヴィッセンシャフテン エー．ファウ． デンプン分解酵素をコードする核酸分子
KR20040029122A (ko) * 2001-08-27 2004-04-03 신젠타 파티서페이션즈 아게 자가-프로세싱 식물 및 식물 부분
WO2004040999A1 (en) * 2002-11-08 2004-05-21 Bayer Cropscience Gmbh Process for reducing the acrylamide content of heat-treated foods
JP2007151435A (ja) * 2005-12-02 2007-06-21 Niigata Univ デンプン集積能力の高い形質転換植物およびその製造方法
MX2010004960A (es) * 2007-11-05 2010-05-20 Syngenta Participations Ag Metodos para incrementar el contenido de almidon en las plantas.
US20120054915A1 (en) * 2009-02-25 2012-03-01 Syngenta Participations Ag Methods for increasing starch content in plant cobs
US10443068B2 (en) 2010-06-25 2019-10-15 Agrivida, Inc. Plants with engineered endogenous genes
US9598700B2 (en) 2010-06-25 2017-03-21 Agrivida, Inc. Methods and compositions for processing biomass with elevated levels of starch
WO2011163659A2 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Agrivida, Inc. Plants with altered levels of vegetative starch
WO2015021600A1 (en) * 2013-08-13 2015-02-19 Danisco Us Inc. Beta-amylase and methods of use
CN104232681B (zh) * 2014-09-28 2017-02-15 浙江大学 一种植物表达载体及在制备磷酸化改性水稻淀粉中的应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5391725A (en) * 1989-12-08 1995-02-21 New York University Medical Center Organ-specific plant promoter sequences
US5451513A (en) * 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
US5349123A (en) * 1990-12-21 1994-09-20 Calgene, Inc. Glycogen biosynthetic enzymes in plants
ATE212670T1 (de) 1990-06-18 2002-02-15 Monsanto Technology Llc Erhöhter stärkegehalt in pflanzen
US5750876A (en) * 1994-07-28 1998-05-12 Monsanto Company Isoamylase gene, compositions containing it, and methods of using isoamylases
GB9522589D0 (en) * 1995-11-03 1996-01-03 Innes John Centre Modified plants and plant products
US6372960B1 (en) 1996-09-03 2002-04-16 Plant Genetic Systems, N.V. Barstar gene
ATE527346T1 (de) 1998-08-19 2011-10-15 Cambridge Advanced Tech Neue plastidgezielte nukleinsäure sequenz, neue beta-amylase sequenz, stimulus-abhängiger promoter und deren verwendungen

Also Published As

Publication number Publication date
US6489540B1 (en) 2002-12-03
CN1323349A (zh) 2001-11-21
CN1528904B (zh) 2010-05-26
CN1234868C (zh) 2006-01-04
EP1105468B1 (en) 2011-10-05
ATE527346T1 (de) 2011-10-15
HUP0200732A2 (hu) 2002-07-29
PL205558B1 (pl) 2010-05-31
EP1105468A2 (en) 2001-06-13
SK288125B6 (sk) 2013-10-02
TR200100625T2 (tr) 2001-06-21
NZ509642A (en) 2003-08-29
ES2375034T3 (es) 2012-02-24
HUP0200732A3 (en) 2004-10-28
CN1528904A (zh) 2004-09-15
CZ303574B6 (cs) 2012-12-19
JP2002523040A (ja) 2002-07-30
AU773492B2 (en) 2004-05-27
HU228696B1 (en) 2013-05-28
WO2000011144A3 (en) 2000-09-08
MXPA01001815A (es) 2002-06-21
CA2336249C (en) 2011-03-08
PL346704A1 (en) 2002-02-25
AU5432699A (en) 2000-03-14
JP4673431B2 (ja) 2011-04-20
ZA200100736B (en) 2002-06-26
US20030074690A1 (en) 2003-04-17
SK2042001A3 (en) 2002-01-07
CA2336249A1 (en) 2000-03-02
JP2010131029A (ja) 2010-06-17
BR9914299A (pt) 2001-11-27
WO2000011144A2 (en) 2000-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4673431B2 (ja) 新規のプラスチドターゲティング核酸配列、新規のβ−アミラーゼ配列、刺激反応性プロモーター、およびその使用
US6563025B1 (en) Nucleotide sequences encoding anthranilate synthase
JPH09510342A (ja) 植物プラスチドにおけるトランスジェニック構造体の制御された発現
JP2005516589A (ja) 植物ポリペプチドおよびそれをコードするポリヌクレオチド
AU2268899A (en) Vegetable (gnti) sequences and the use thereof to obtain plants with a reduced or lack of n-acetylglucosaminyltransferase i (gnti) activity
EP1235480A1 (en) A process for converting storage reserves of dicot seeds into compositions comprising one or more gene products
IE20020633A1 (en) Plasmids for the Production of Transgenic Plants that are Modified in Habit and Yield
JPH10510162A (ja) バイオマス生産が改良されたトランスジェニック植物
AU774004B2 (en) Plant selectable marker and plant transformation method
TWI534265B (zh) 用於操縱植物之光合細胞中果聚糖生合成之方法、基因建構體及基因轉殖植物細胞
WO2005113771A1 (en) An embryo preferred promoter and method of using same
Huang et al. The tissue-specific activity of a rice beta-glucanase promoter (Gns9) is used to select rice transformants
JP2001512685A (ja) 植物において収量を増加させるための方法
US5917127A (en) Plasmids useful for and methods of preparing transgenic plants with modifications of habit and yield
Tonoike et al. Hypocotyl expression and light downregulation of the soybean tubulin gene, tubB1
AU2001276398B2 (en) Transgenic plants which produce isomalt
Nakata et al. Cis-elements important for the expression of the ADP-glucose pyrophosphorylase small-subunit are located both upstream and downstream from its structural gene
WO2002012450A1 (en) Gossypium hirsutum tissue-specific promoters and their use
US7728192B2 (en) Process for converting storage reserves of dicotyledonous seeds into compositions comprising one or more gene products
EP1458878B1 (en) Method of increasing the transgene-coded biomolecule content in organisms
WO2003064649A1 (fr) Promoteur exprimant un gene etranger dans une racine ou l&#39;apex d&#39;une pousse
Koivu Novel sprouting technology for recombinant protein production
US20050268351A1 (en) Modulation of storage organs
Doyle et al. Hypocotyl expression and light downregulation of the soybean tubulin gene, tubB1

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20140813