PL205558B1 - Sekwencja kwasu nukleinowego kierująca do plastydu, sekwencja kodująca β-amylazę, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, gen chimerowy, komórki roślinne, nasiona transgenicznej rośliny, rośliny transgeniczne - Google Patents
Sekwencja kwasu nukleinowego kierująca do plastydu, sekwencja kodująca β-amylazę, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, gen chimerowy, komórki roślinne, nasiona transgenicznej rośliny, rośliny transgeniczneInfo
- Publication number
- PL205558B1 PL205558B1 PL346704A PL34670499A PL205558B1 PL 205558 B1 PL205558 B1 PL 205558B1 PL 346704 A PL346704 A PL 346704A PL 34670499 A PL34670499 A PL 34670499A PL 205558 B1 PL205558 B1 PL 205558B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- sequence
- nucleic acid
- amylase
- acid sequence
- plant
- Prior art date
Links
- 108010019077 beta-Amylase Proteins 0.000 title claims abstract description 98
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 title claims abstract description 52
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 112
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims abstract description 90
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims abstract description 89
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims abstract description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 71
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 43
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 claims abstract description 40
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 claims abstract description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims abstract description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 92
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 63
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 63
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 63
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 claims description 52
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 43
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 29
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 claims description 24
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 24
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 17
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 claims description 12
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 claims description 11
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 claims description 11
- 108010043943 Starch Phosphorylase Proteins 0.000 claims description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 11
- WFPZSXYXPSUOPY-ROYWQJLOSA-N ADP alpha-D-glucoside Chemical compound C([C@H]1O[C@H]([C@@H]([C@@H]1O)O)N1C=2N=CN=C(C=2N=C1)N)OP(O)(=O)OP(O)(=O)O[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WFPZSXYXPSUOPY-ROYWQJLOSA-N 0.000 claims description 10
- 101710096830 DNA-3-methyladenine glycosylase Proteins 0.000 claims description 10
- 102100039128 DNA-3-methyladenine glycosylase Human genes 0.000 claims description 10
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims description 10
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims description 10
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 claims description 10
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 10
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims description 10
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 9
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 9
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 8
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 8
- 101710091688 Patatin Proteins 0.000 claims description 8
- 108010039811 Starch synthase Proteins 0.000 claims description 8
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 8
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 claims description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims description 8
- 108090000344 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Proteins 0.000 claims description 7
- 102000003925 1,4-alpha-Glucan Branching Enzyme Human genes 0.000 claims description 7
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 7
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 7
- 102100024295 Maltase-glucoamylase Human genes 0.000 claims description 7
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 7
- 108010028144 alpha-Glucosidases Proteins 0.000 claims description 7
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 claims description 7
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims description 7
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 7
- 108700023224 Glucose-1-phosphate adenylyltransferases Proteins 0.000 claims description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 6
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 claims description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 6
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 claims description 5
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 claims description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010028688 Isoamylase Proteins 0.000 claims description 4
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 claims description 4
- 108010043934 Sucrose synthase Proteins 0.000 claims description 4
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 claims description 3
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 claims description 3
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 claims description 3
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 claims description 3
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 claims description 3
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 claims description 3
- 244000291473 Musa acuminata Species 0.000 claims description 3
- 108090000051 Plastocyanin Proteins 0.000 claims description 3
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 claims description 3
- 235000021015 bananas Nutrition 0.000 claims description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 claims description 3
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 claims description 3
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 3
- 230000037354 amino acid metabolism Effects 0.000 claims description 2
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 229930002868 chlorophyll a Natural products 0.000 claims description 2
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 claims description 2
- 229930002869 chlorophyll b Natural products 0.000 claims description 2
- NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M chlorophyll b Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C=O)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 NSMUHPMZFPKNMZ-VBYMZDBQSA-M 0.000 claims description 2
- 108010050792 glutenin Proteins 0.000 claims description 2
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 claims description 2
- 244000061322 Nicotiana alata Species 0.000 claims 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 claims 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 abstract description 20
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 17
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003413 degradative effect Effects 0.000 abstract 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 18
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 16
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 16
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 16
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 16
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 12
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 12
- 230000008676 import Effects 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 10
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 10
- 108090001109 Thermolysin Proteins 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 9
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 9
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 7
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 7
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 7
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 7
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 6
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 210000002377 thylakoid Anatomy 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 229920000945 Amylopectin Polymers 0.000 description 5
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 3
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 3
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000004890 malting Methods 0.000 description 3
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 3
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 108010043797 4-alpha-glucanotransferase Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 108010009595 Inorganic Pyrophosphatase Proteins 0.000 description 2
- 102100027050 Inorganic pyrophosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 108700001094 Plant Genes Proteins 0.000 description 2
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 2
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 235000011888 snacks Nutrition 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 2
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 2
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 2
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 2
- PSOZMUMWCXLRKX-UHFFFAOYSA-N 2,4-dinitro-6-pentan-2-ylphenol Chemical compound CCCC(C)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O PSOZMUMWCXLRKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 101000608750 Arachis hypogaea Alpha-methyl-mannoside-specific lectin Proteins 0.000 description 1
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102100026367 Pancreatic alpha-amylase Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920002387 Phytoglycogen Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001116809 Solanum tuberosum Patatin group M-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710177361 Soluble starch synthase 1, chloroplastic/amyloplastic Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 101000771730 Tropidolaemus wagleri Waglerin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101100115751 Trypanosoma brucei brucei dnaaf11 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 240000006677 Vicia faba Species 0.000 description 1
- 235000010749 Vicia faba Nutrition 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 108010050181 aleurone Proteins 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N alpha-D-glucose 1-phosphate Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O HXXFSFRBOHSIMQ-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229940025131 amylases Drugs 0.000 description 1
- 230000003625 amylolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000004464 cereal grain Substances 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 108091000085 chlorophyll binding Proteins 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007323 disproportionation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000004345 fruit ripening Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229950010772 glucose-1-phosphate Drugs 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- BYSGBSNPRWKUQH-UJDJLXLFSA-N glycogen Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O1 BYSGBSNPRWKUQH-UJDJLXLFSA-N 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009643 growth defect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 230000009916 joint effect Effects 0.000 description 1
- 230000004298 light response Effects 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 108010085781 maltodextrin phosphorylase Proteins 0.000 description 1
- 125000003071 maltose group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 1
- 230000018791 negative regulation of catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 239000001814 pectin Substances 0.000 description 1
- 230000008119 pollen development Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000018767 positive regulation of catalytic activity Effects 0.000 description 1
- 235000019684 potato crisps Nutrition 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000018883 protein targeting Effects 0.000 description 1
- 230000007398 protein translocation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 229930000044 secondary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8214—Plastid transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8221—Transit peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8237—Externally regulated expression systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8237—Externally regulated expression systems
- C12N15/8238—Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2425—Beta-amylase (3.2.1.2)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sekwencja kwasu nukleinowego kierująca do plastydu, sekwencja kodująca β-amylazę, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, gen chimerowy, komórki roślinne, nasiona transgenicznej rośliny, rośliny transgeniczne.
Precyzyjny mechanizm syntezy i rozkładu skrobi w roślinach jest nieznany pomimo wyizolowania i scharakteryzowania licznych enzymów, które przypuszczalnie biorą udział w tych procesach.
Skrobia jest gromadzona w chloroplastach liści w czasie dnia i jest zużywana w celu zaspokojenia potrzeb rośliny na energię i biosyntezę w czasie nocy. Sposób, w jaki ta, tak zwana przejściowa, skrobia jest mobilizowana, nie jest w pełni zrozumiały, ale musi obejmować skoordynowane aktywności fosforolityczne i hydrolityczne, a w szczególności aktywność α-glukozydazy (E.C. 3.2.1.3) (Nielson and Sitt, 1997).
Skrobia jest gromadzona w organach spichrzowych, takich jak nasiona, owoce i bulwy. W tym przypadku skrobia jest przechowywana przez dłuższy czas, a mobilizacji skrobi towarzyszy degeneracja tkanek organu spichrzowego i wzrost aktywności amylolitycznej i fosforolitycznej. Jednakże istnieją dane sugerujące, że rozkład skrobi następuje również w amyloplastach organów spichrzowych (Sweetlove et al, 1996). To znowu wymaga skoordynowanej regulacji aktywności enzymów syntetyzujących i rozkładających.
Zarówno chloroplasty jak i amyloplasty pochodzą z proplastydów i mają zatem wiele wspólnych cech charakterystycznych poza tym, że stanowią miejsce syntezy skrobi w liściach i organach spichrzowych, odpowiednio; chloroplasty mogą przekształcić się w amyloplasty i inne typy plastydów (Thomson and Whatley, 1980).
Skrobia stanowi mieszaninę dwóch polisacharydów: amylozy, która jest liniowym łańcuchem reszt glikozylowych połączonych wiązaniami a-1,4-glikozydowymi; i amylopektyny, która jest utworzona z wielu liniowych łańcuchów a-1,4-poliglukanów, które są połączone ze sobą wiązaniami α-1,6-glikozydowymi.
Enzymami biorącymi udział w syntezie skrobi są pirofosforylaza ADPG (E.C. 2.7.7.21), syntaza skrobiowa (E.C.2.4.1.21) i enzym rozgałęziający (E.C. 2.4.1.18). Pirofosforylaza ADPG jest odpowiedzialna za dostarczanie substratu ADPG, cząsteczki służącej jako donor monomerów glukozy, które są łączone ze sobą przez wspólne działanie syntaz skrobiowych (wiązania α-1,4) i enzymów rozgałęziających (wiązania α-1,6).
Uważa się, że nierozpuszczalna, krystaliczna struktura ziaren skrobiowych tworzy się przez ciasne upakowanie długich, helikalnych, rozgałęzionych cząsteczek amylopektyny z liniowymi cząsteczkami amylozy wypełniającymi wolne przestrzenie.
Opisano cały szereg aktywności enzymatycznych rozkładających skrobię, obejmujących α-amylazę (E.C. 3.2.1.1), izoamylazę (E.C. 3.2.1.68), β-amylazę (E.C. 3.2.1.2), α-glukozydazę (E.C. 3.2.1.3), fosforylazę skrobiową (E.C. 2.4.1.1) oraz enzym dysproporcjonujący (E.C. 2.4.1.25). Wiele z tych aktywności enzymatycznych występuje w wielu postaciach w roślinach, niektóre z nich, jak się sądzi, biorą udział w syntezie skrobi. Wszystko to ma miejsce, do pewnego stopnia, w procesie mobilizacji skrobi, jednakże ich dokładna rola i możliwe oddziaływania pozostają jeszcze do ustalenia. Trudności w przypisaniu roli tym różnym enzymom najlepiej ilustrują dwie z tych aktywności enzymatycznych, które uważa się za mające największy udział w rozkładzie skrobi w roślinach: fosforylaza skrobiowa i amylaza.
Fosforylaza skrobiowa katalizuje odwracalne uwolnienie glukozo-1-fosforanu z a-1,4-glukanów. Dwie postaci fosforylazy skrobiowej zostały znalezione w tkankach roślinnych: Pho1 albo typu-L jest zlokalizowana wewnątrz plastydów i ma wysokie powinowactwo do maltodekstryn; Pho2 lub typu H jest cytozolowa i ma wysokie powinowactwo do dużych, wysoce rozgałęzionych poliglukanów, takich jak glikogen. Jakkolwiek plastydowy enzym Pho2 byłby prawdopodobnym kandydatem na uczestniczenie w mobilizacji skrobi, antysensowna inhibicja aktywności enzymatycznej w liściach nie ma żadnego wpływu ma akumulację skrobi w liściach transgenicznego ziemniaka (Sonnewald et al., 1995). W innych badaniach, antysensowna inhibicja cytoplazmatycznego Pho2 miała wpływ na kiełkowanie transgenicznych bulw ziemniaka, ale nie miała wpływu na akumulację i rozkład skrobi (Duwenig et al., 1997).
Występują dwie główne grupy amylaz, z których każda hydrolizuje wiązania a-1,4-glukozydowe w amylozie i amylopektynie: α-amylaza działa losowo na wiązania nie-końcowe, podczas gdy β-amylaza uwalnia jednostki maltozy rozpoczynając od nieredukującego końca łańcucha poliglukanowego. Uważa się, że subkomórkowa lokalizacja β-amylazy w przestrzeni apoplastydowej komórek
PL 205 558 B1 roślinnych odzwierciedla fakt, że enzym normalnie jest wydzielany. Jednakże u wielu roślin, takich jak ryż (Chen et al., 1994) i burak cukrowy (Li et al., 1992) enzym jest zlokalizowany również wewnątrz chloroplastów i amyloplastów, pomimo stwierdzenia, że sekwencje sygnałowe na końcu aminowym wielu α-amylaz są charakterystyczne raczej dla translokacji białka przez błonę ER niż błonę plastydową (Chen et al., 1994. W badaniach, gdzie promotor i sekwencja sygnałowa genu α-amylazy z ryżu zostały połączone z bakteryjnym genem GUS i wprowadzone do ryżu, tytoniu i ziemniaka przy zastosowaniu transformacji za pośrednictwem Agrobacterium (Chen et al., 1994), wykazano, że wyrażana fuzja białkowa z GUS była najpierw transportowana do endoplazmatycznego retikulum, a następnie eksportowana do pożywki hodowlanej zawiesinowej hodowli transgenicznych komórek. W licznych badaniach pokazano, że α-amylaza będzie rozkładała natywne cząsteczki skrobi.
W przeciwieństwie do tego, badania in vitro wykazały, że β-amylaza nie będzie rozkładała natywnych ziaren skrobi bez wcześniejszego strawienia ziaren innymi enzymami. Mutanty ryżu (Daussant et al., 1981) i soi (Hildebrand and Hymowitz, 1981), którym brak aktywnej β-amylazy lub które zawierają jedynie ślady aktywności, odpowiednio, wyraźnie wykazują normalny wzrost i rozwój. Ponadto, transgeniczne rośliny Arabidopsis, w których poziom β-amylazy był znacznie obniżony, nie wykazują poważnych defektów wzrostowych (Mita et al., 1997). W usiłowaniach zdefiniowania dokładnej roli fizjologicznej β-amylaz w roślinach przeszkadzały nieprzekonywujące dane dotyczące subkomórkowej lokalizacji. Jakkolwiek jedno z badań (Kakefuda et al., 1986) donosiło o obecności dwóch β-amylaz w chloroplastach grochu, to wniosek z większości badań obejmujących gatunki, takie jak Vicia faba, jęczmień, pszenica, soja, słodki ziemniak i groch, był taki, że większość, jeżeli nie cała, aktywność β-amylazy jest pozachloroplastowa (Nakamura et al., 1991). Pogląd ten był poparty faktem, że wszystkie geny β-amylazy sklonowane do tej pory kodują białka, którym brak aminokońcowej chloroplastowej sekwencji peptydu sygnałowego.
U zbóż opisano trzy typy β-amylazy: postać specyficzną dla bielma, która akumuluje się czasie dojrzewania kłosów; formę, która jest syntetyzowana de novo w komórkach aleuronowych ryżu i kukurydzy w czasie kiełkowania (Wang et al., 1996, 1997); i β-amylazę, która występuje we wszystkich organach wegetatywnych. U Arabidopsis, wszechobecna postać odpowiada za około 80% całkowitej aktywności rozkładającej skrobię w liściach rozetowych. Podobnie jak wszystkie inne sklonowane dotychczas geny β-amylazy, gen wszechobecnej β-amylazy Arabidopsis nie koduje białka z subkomórkowym sygnałem kierującym, a zatem enzym jest prawdopodobnie zlokalizowany w cytozolu.
Odkrycia wielu badań, że aktywności rozkładające można usunąć bez szkodliwego wpływu na żywotność komórki, plus subkomórkowa lokalizacja enzymów rozkładających skrobię poza plastydem, są zaskakujące. Obserwowany brak aktywności β-amylazy zlokalizowanej w plastydach jest szczególnie nieoczekiwany w świetle faktu, że spodziewany produkt końcowy aktywności β-amylazy, a mianowicie maltoza, został zidentyfikowany jako produkt rozkładu skrobi w izolowanych chloroplastach (Peavey et al., 1977). Ostatnio pokazano, że zarówno glukoza, jak i maltoza są eksportowane z izolowanych amyloplastów w pączkach kalafiora w czasie procesu mobilizacji skrobi (Neuhaus et al., 1995).
Zdolność do manipulowania ilością skrobi w plastydach liści lub organów spichrzowych dawałaby duże korzyści dla wielu procesów przemysłowych, które wykorzystują skrobie roślinne. Przykładowo, podejmując próby zwiększenia zawartości skrobi w bulwach ziemniaka pokazano uprzednio, że kiedy glgC16 dla ADPG PPazy z E. coli ulega nadekspresji w transgenicznych bulwach ziemniaka, ma miejsce wzrost przepływu węgla do skrobi, ale następuje jedynie niewielki wzrost ostatecznej akumulacji skrobi (Sweetlove et al., 1997). Analiza aktywności enzymatycznych w liniach z nadekspresją pokazała, że poza zmianami dla ADPG PPazy, aktywność amylazy, a w szczególności β-amylazy, była również zmieniona. Te dane sugerują, że akumulacji skrobi w bulwach nadprodukujących białko glgC16 przeciwdziała rozkład nowo zsyntetyzowanej skrobi, tzn. ma miejsce obrót skrobią.
W innym przykładzie, dostępność skrobi w czasie procesu słodowania jest ściśle skorelowana z typem i ilością aktywności enzymów rozkładających w roślinach, a w szczególności w organach spichrzowych. Wzrost zdolności do rozkładu w roślinach uprawnych spowodowałby, ze słodowanie ziaren zbóż lub przekształcanie skrobi z bulw lub innych organów spichrzowych byłoby wydajne i produktywne.
Typ skrobi obecny w organach spichrzowych zależy od postaci i aktywności występujących tam pirofosforylazy ADPG, syntazy skrobiowej, enzymu rozgałęziającego i enzymów rozkładających. Oddziaływania pomiędzy różnymi enzymami będą miały również duże znaczenie.
Istnieje stosunkowo duże zainteresowanie w tworzeniu nowych skrobi w roślinach, ponieważ zmniejsza to koszty obróbki i modyfikacji skrobi przed ich użyciem w różnych przemysłach, takich jak spożywczy, papierniczy, farmaceutyczny, klejarski, olejarski i tekstylny. Następujące dalej przykłady
PL 205 558 B1 pokazują, w jaki sposób aktywność hydrolizy skrobi może być ważna przy zmienianiu struktury skrobi in vivo.
Pokazano, że w ziarnach kukurydzy, mutacja sugaryl powoduje nieobecność enzymu usuwającego rozgałęzienia, który hydrolizuje wiązania a-1,6-glikozylowe w skrobi (James et al., 1995). Mutacja powoduje zmniejszenie stężenia amylopektyny i akumulację wysoce rozgałęzionego glikopolisacharydu, fitoglikogenu.
Pokazano, że u grochu, krótkie cząsteczki oligosacharydowe, rozpoczynające się od maltozy i dodające kolejne reszty glukozy aż do uzyskania maltoheptozy, specyficznie stymulują aktywność związanej z ziarnami skrobi syntazy skrobiowej I (GBSSI) (Denyer et al., 1996), która jest ogólnie uważana za główny enzym odpowiedzialny za syntezę amylozy (np. van der Leij et al., 1991; Hylton et al., 1995: Ainsworth et al., 1993). Manipulacja aktywnością GBSSI przez kontrolowanie dostarczania malto-oligosacharydów jest przedmiotem wynalazku ujawnionego w WO 97/16554 i sugeruje, że wzrost stężenia malto-oligosacharydów, a zatem wzrost stosunku amylozy do amylopektyny w skrobi, można uzyskać przez wprowadzenie enzymów rozkładających, a mianowicie α-amylazy, β-amylazy, enzymu dysproporcjonującego, enzymu usuwającego rozgałęzienia i fosforylazy skrobiowej. W publikacji W097/16554 ujawniono również, że geny dla izoform plastydowych tych enzymów zostały sklonowane. Jednakże, jak omówiono powyżej, żaden z genów β-amylazy wyizolowanych do tej pory nie koduje enzymu β-amylazy z białkową sekwencją kierującą, a ponadto istnieją wątpliwości, czy te α-amylazy są wyjściowo kierowane do plastydów (Chen et al., 1994, Chan et al., 1994). Później, w WO/16554, wspomina się o wytworzeniu odpowiednich sekwencji cDNA β-amylazy metodą inżynierii genetycznej, tak aby dodać sekwencję kierującą do plastydów.
Poza zastosowaniem przemysłowym skrobi z organów spichrzowych, duża ilość skrobi w liściach ma istotne znaczenie dla uprawy roślin. Skrobia jest syntetyzowana w liściach na świetle w dzień z węgla wiązanego w trakcie fotosyntezy. Skrobia jest gromadzona w chloroplastach i ulega rozkładowi w nocy, stając się źródłem energii i związków pośrednich dla metabolizmu rośliny. Mechanizm kontrolujący zależność źródło-ujście jest obecnie nieznany, jednakże jest jasne, że manipulacja ilością i dostępnością skrobi w plastydach liści będzie miała zasadniczy wpływ na produktywność rośliny (biomasę i wydajność).
Ilość skrobi w liściach będzie również ważna dla tych roślin uprawnych, gdzie liście stanowią towar roślinny, na przykład tytoń. Wiadomo, że zawartość skrobi ma wpływ na zapach przy paleniu tytoniu. Dostarczenie sposobów manipulowania poziomem skrobi w liściach tytoniu mogłoby być przedmiotem zainteresowania przemysłu tytoniowego.
Opisano tu po raz pierwszy izolację cDNA kodującego nową β-amylazę, która jest kierowana do plastydów (i dlatego określana dalej jako kierowana do chloroplastów (ct) β-amylaza) za pośrednictwem nowej sekwencji kierującej. Izolacja tej całej sekwencji kodującej jest zaskakująca, ponieważ powszechnie sądzono, że β-amylaza bierze udział jedynie w hydrolizie skrobi po uwolnieniu z plastydu do cytoplazmy mniejszych fragmentów poliglukanowych bądź przez translokację bądź rozpad błony. Lokalizacja enzymu w plastydach otwiera nieprzewidywalną wcześniej możliwość, że ct β-amylaza bierze udział w rozkładzie przejściowej skrobi znajdującej się w chloroplastach i skrobi zapasowej znajdującej się w amyloplastach.
Podobieństwo cech chloroplastów i amyloplastów (Thomas i Whatley, 1980) jest ważne dla obecnego wynalazku, ponieważ wykazano, że peptydy przejściowe z polipeptydów kierujących do chloroplastów mogą importować polipeptydy heterologiczne do amyloplastów i odwrotnie. Przykładowo, peptyd kierujący syntazy skrobiowej związanej z ziarnami z kukurydzy po połączeniu z β-glukuronidazą (GUS) z E. coli będzie importował białko GUS nie tylko do amyloplastów, ale również do chloroplastów (Klosgen i Weil, 1991).
Ponadto, pokazano, że ekspresja genu ct-Bmy z Arabidopsis i ekspresja fuzji promotor ct-Bmy: GUS w transgenicznym tytoniu może być regulowana niezależnie zarówno przez światło, jak i sacharozę. Jest to nieoczekiwane w świetle ścisłego związku odpowiedzi na indukcję światłem i cukrem ATβ-Amy Arabidopsis (Mita et al., 1995).
Niniejszy wynalazek dotyczy sekwencji kwasu nukleinowego określonej jako Id. Sekw. Nr: 1 o nukleotydach 1-294 kodującej sekwencję zdolną do kierowania białka do plastydu roślinnego, lub sekwencje o 65% lub więcej identyczności z Id. Sekw. Nr: 1, które hybrydyzują z sekwencją z Id. Sekw. Nr: 1 w warunkach o umiarkowanej ostrości i które kodują sekwencję mającą taką samą zdolność kierowania.
Korzystnie sekwencja kwasu nukleinowego koduje do 94 aminokwasów lub do 85 aminokwasów.
PL 205 558 B1
Ponadto wynalazek dotyczy sekwencji kwasu nukleinowego określonej jako Id. Sekw. Nr: 2 o nukleotydach 1-1662 i kodującej β-amylazę, lub sekwencje mające 65% lub więcej identyczności z Id. Sekw. Nr: 2 i które hybrydyzują z Id. Sekw. Nr: 2 w warunkach o umiarkowanej ostrości i które kodują β-amylazę.
W zakres wynalazku wchodzi też sekwencja kwasu nukleinowego określona jako Id. Sekw. Nr: 3 o nukleotydach 1-1953 i kodująca β-amylazę kierowaną do chloroplastów, albo sekwencje mające co najmniej 65% albo więcej identyczności z ujawnioną sekwencją w Id. Sekw. Nr: 3, które hybrydyzują z sekwencją Id. Sekw. Nr: 3, w warunkach o umiarkowanej ostrości i które kodują β-amylazę kierowaną do chloroplastu.
Wszystkie sekwencje według wynalazku mogą być sekwencją mRNA, cDNA lub sekwencją genomowego DNA.
Wynalazek dotyczy też sposobu wytwarzania rośliny transgenicznej, który obejmuje etapy stabilnego wprowadzania do genomu roślinnego genu chimerowego zawierającego sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję kierującą do plastydów według wynalazku.
Korzystnie gen chimerowy ponadto zawiera sekwencję kodującą β-amylazę, korzystniej nieplastydową β-amylazą.
Korzystnie w sposobie według wynalazku sekwencją kodującą jest sekwencja według wynalazku kodująca β-amylazę.
Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje zwiększanie lub zmniejszanie aktywności β-amylazy w roślinie.
Korzystnie w sposobie według wynalazku sekwencją kodującą jest sekwencja według wynalazku kodująca β-amylazę kierowaną do chloroplastów.
Korzystnie sposób obejmuje zregenerowanie rośliny o zmienionym genomie.
Korzystnie gen chimerowy ponadto zawiera sekwencję kodującą enzym z grupy składającej się z syntazy sacharozowej, pirofosforylazy ADPG, syntazy skrobiowej, enzymu rozgałęziającego, α-amylazy, izoamylazy, nie-plastydowej β-amylazy, α-glukozydazy, fosforylazy skrobiowej i enzymu dysproporcjonującego.
Korzystnie chimerowy gen ponadto zawiera promotor, którym jest sekwencja kwasu nukleinowego zdolna do kierowania ekspresją produktu kodowanego przez sekwencję kodującą, która jest z nią funkcjonalnie połączona, przy czym ta sekwencja kwasu nukleinowego jest określona jako Id. Sekw. Nr: 8 lub mająca z nią co najmniej 65% identyczności i ma tę samą funkcję, i odpowiada na bodziec, a poziom ekspresji takiego produktu zmienia się w odpowiedzi na bodziec stosowany wobec tej sekwencji kwasu nukleinowego.
Bodźcem takim może być światło lub jego brak i/lub zróżnicowane poziomy cukru. Alternatywnie, bodźcem jest bodziec, który jest kontrolowany w rozwoju.
Indukowany promotor lub sekwencja kwasu nukleinowego zdolna do kierowania ekspresją takiego produktu w roślinach może działać w warunkach, kiedy nie ma światła, ale obecny jest cukier albo mnie ma cukru, ale obecne jest światło. Tkanką rośliny, gdzie nie ma światła, ale obecny jest cukier może być, odpowiednio, organ podziemny albo organ odbieralnikowy. Organami podziemnymi mogą być, na przykład bulwy, kłącza albo korzenie, podczas gdy innymi organami odbieralnikowymi mogą być młode liście i nasiona.
Tkanką rośliny, gdzie nie ma cukru, ale obecne jest światło mogą być starsze liście (gdzie żaden cukier nie jest transportowany), części kwiatu albo kiełkujące nasiona.
Korzystnie gen chimerowy zawiera ponadto sekwencję kodującą białko lub enzym, które są jednym lub więcej elementami w szlaku z następującej grupy: synteza lipidów, fotosynteza, metabolizm aminokwasów, wiązanie azotu, wiązanie węgla lub synteza polimerów węglowodanowych; albo mają zdolność nadawania cech roślinom.
Korzystniej sposób obejmuje kierowanie białka lub enzymu do plastydu roślinnego.
Korzystnie nadawana cecha jest wybrana z następującej grupy: oporności na herbicydy i oporności na szkodniki.
Korzystnie w sposobie według wynalazku roślina już wykazuje zwiększenie lub zmniejszenie aktywności enzymatycznej w szlaku biosyntezy skrobi jako wynik transformacji genetycznej i obejmuje zmianę dalszego enzymu w celu podwyższenia lub obniżenia poziomu enzymu, a tym samym zwiększenia lub zmniejszenia ilości skrobi wytworzonej przez retransformowaną roślinę, przy czym kolejnym enzymem jest kierowana do plastydu β-amylaza, która zawiera sekwencję Id. Sekw. Nr: 1.
PL 205 558 B1
Korzystniej β-amylaza kierowana do plastydu obejmuje Id. Sekw. Nr: 1, a pierwszą stransformowaną rośliną jest transgeniczny ziemniak transformowany genem pirofosforylazy adenozynodifosforano-glukozowej (ADPG-PPazy).
Korzystnie w sposobie gen chimerowy ponadto zawiera promotor wybrany z grupy składającej się z promotora wirusa mozaiki kalafiora 35S (pełnego albo skróconego), promotora rubisco, promotora plastocyjaniny z grochu, promotora syntazy nopalinowej, promotora białka wiążącego chlorofil a/b, promotora gluteniny o wysokim ciężarze cząsteczkowym, promotora α,β-gliadyny, promotora hordeiny oraz promotora patatyny.
Korzystnie sekwencja kodująca enzym w genie chimerowym dostarcza możliwości regulowania w górę albo w dół aktywności tego enzymu.
W zakres wynalazku wchodzi też gen chimerowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję według wynalazku zdolną do kierowania białka do plastydu roślinnego.
Ponadto wynalazek dotyczy genu chimerowego, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję kierującą do plastydu według wynalazku i sekwencję kwasu nukleinowego kodującą enzym ze szlaku rozkładu skrobi, kodowany przez sekwencję według wynalazku.
W zakres wynalazku wchodzi również gen chimerowy, który zawiera sekwencję kwasu nukleinowego zdolną do kierowania ekspresją dalszej sekwencji kodującej, którą jest sekwencja według wynalazku.
Wynalazek dotyczy też komórek roślinnych zawierających sekwencję kwasu nukleinowego według wynalazku.
Ponadto w zakres wynalazku wchodzą nasiona transgenicznej rośliny zawierające jedną albo więcej sekwencji kwasu nukleinowego według wynalazku.
Wynalazek dotyczy też roślin transgenicznych zawierających komórki roślinne według wynalazku.
Korzystnie rośliny te są roślinami, z których jedna lub więcej jest wybrana z grupy składającej się z ziemniaków, pszenicy, kukurydzy, jęczmienia, pomidorów, ryżu, grochu, soi, orzeszków ziemnych, kasawy, słodkiego ziemniaka, bananów i tytoniu.
Komórki roślinne zawierające gen chimerowy zawierający sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję kierującą do plastydów i sekwencję kodującą sekwencję enzymu ze szlaku biosyntezy albo rozkładu skrobi, albo chimerowy gen zawierający sekwencję kwasu nukleinowego zdolną do kierowania ekspresją następującej po nim sekwencji kodującej, albo chimerowy gen zawierający opisaną powyżej sekwencję kwasu nukleinowego, która może odpowiadać na bodziec oraz sekwencję kodującą, gdzie poziom ekspresji takiego produktu podlega zmianom w odpowiedzi na bodziec stosowany wobec takiej sekwencji kwasu nukleinowego, stanowią również aspekty tego wynalazku.
W pierwszym wykonaniu wynalazku powyższe sposoby mogą być stosowane do zmieniania metabolizmu liści, tak, że skrobia jest w nich gromadzona lub z nich mobilizowana, przy czym proces ten zmienia stosunek źródło-ujście w roślinie jako całości. Można to osiągnąć przez dostarczenie sekwencji kierującej i kwasu nukleinowego kodującego sekwencję enzymu ze szlaku biosyntezy albo rozkładu skrobi pod kontrolą odpowiedniego promotora. Wybór odpowiedniego promotora będzie prowadził do powstania roślin o zwiększonych albo zmniejszonych poziomach skrobi, co mogłoby być przydatne, na przykład, w przemyśle tytoniowym; albo, alternatywnie prowadziłoby do zmian w zawartości skrobi w innych tkankach roślinnych, takich jak bulwy, owoce i korzenie po modyfikacji wzajemnego stosunku źródło-ujście w roślinach.
W tym wykonaniu wynalazku odpowiedni promotor kieruje ekspresją sekwencji kierującej do plastydu i sekwencji kodującej enzym ze szlaku biosyntezy albo rozkładu skrobi w całej roślinie, tak zwaną ekspresją konstytutywną, albo specyficznie w liściach. Te zmiany mają zasadniczy wpływ, tak że zawartość i/lub wydajność wytwarzania skrobi w organach roślinnych będzie znacząco zmieniona.
Korzystnym promotorem zdolnym do kierowania ekspresją we wszystkich tkankach roślinnych jest promotor pobrany z genu 35S wirusa mozaiki kalafiora. Do ekspresji w liściach korzystne promotory można uzyskać z genu dla małej podjednostki karboksylazy rybulozobifosforanowej albo genu plastocyjaniny z grochu. Specjalista w tej dziedzinie będzie świadomy możliwości zastosowania innych odpowiednich promotorów, zarówno do ekspresji konstytutywnej, jak i ekspresji specyficznej dla liści, takich jak promotor syntazy nopalinowej i promotor białka wiążącego chlorofil a/b, odpowiednio.
Sekwencja kodująca lub jej części dla enzymu ze szlaku biosyntezy albo rozkładu skrobi może być usytuowana w normalnym kierunku zgodnym z ramką odczytu, tj. sensownym, albo w orientacji przeciwnej do ramki odczytu, tj. antysensownym. Regulacja aktywności enzymu w roślinach w górę albo w dół przy zastosowaniu technologii sensownej, antysensownej lub kosupresji (ta ostatnia jak
PL 205 558 B1 opisano przez DNAP w ich patentach europejskich nr 0465572 i 0647715) mogą być zastosowane do uzyskania zmian w skrobi w roślinach.
W drugim wykonaniu wynalazku, sposób według wynalazku można również zastosować do zmiany metabolizmu skrobi w organach spichrzowych, tak, że zawartość skrobi jest zwiększana i/lub skrobia jest dostarczana w odpowiedniej postaci, takiej jaka jest wymagana dla celów konkretnych procesów przemysłowych. Takie procesy obejmują wytwarzanie papieru, wytwarzanie farmaceutyków, artykułów tekstylnych, barwników i artykułów budowlanych; dostarczanie artykułów spożywczych: pieczywa, nabiału i przekąsek, wytwarzanie produktów spożywczych puszkowanych, suszonych albo do szybkiego sporządzania; słodowanie ziarna i wytwarzanie syropów i alkoholu.
W pierwszym i drugim wykonaniu sposobu, enzym wybrany do zastosowania w chimerowym genie według tych sposobów może być jednym ze szlaku rozkładu skrobi, tj. enzymem rozkładającym skrobię. Korzystne jest, jeżeli chimerowy gen zawiera β-amylazę kierowaną do chloroplastów (znaną tu jako ct β-amylaza), a korzystniejsze jest jeżeli zawiera ct β-amylazę pochodzącą z Arabidopsis thaliana (określaną dalej jako At ct β-amylaza), patrz, Id. Sekw. Nr: 3. Można również zastosować sekwencje homologiczne do At ct β-amylazy, które mogą pochodzić z innych źródeł roślinnych, takich jak ziemniak, tytoń, pszenica, kukurydza i jęczmień. Standardowe metody klonowania przez techniki hybrydyzacji albo reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) można zastosować do izolowania sekwencji z takich organizmów: na przykład techniki klonowania molekularnego, takie jak opisane przez Sambrook et al. (1989) i techniki PCR opisane przez Innes et al. (1990). Inne enzymy rozkładające skrobię, których albo którego sekwencja kodująca byłaby przydatna do zastosowania wraz z sekwencją kierującą do plastydów obejmują β-amylazę, enzym dysproporcjonujący, enzym rozgałęziający, fosforylazę skrobiową, α-glukozydazę i nie-plastydową β-amylazę.
W drugim wykonaniu sposobu według wynalazku można będzie wybrać korzystne promotory, które kierowałyby ekspresję do organów spichrzowych roślin, na przykład, z genów z następującej listy: genu dla gluteiny o wysokiej masie cząsteczkowej z bielma pszenicy; genu dla α,β-gliadyny z bielma pszenicy; genu hordeiny z bielma jęczmienia; albo genu patatyny z bulw ziemniaka. Inne przydatne promotory są znane specjalistom w tej dziedzinie.
W każdym z wykonań wynalazku, zmiana metabolizmu tkanki albo zmiana typu lub właściwości skrobi może być dokonywana tak, aby mogła odpowiadać na bodziec tj. możliwa do indukowania, przez zastosowanie opisanego tu indukowalnego promotora (Id. Sekw. Nr: 8). Przykładowo, aspekt indukowalności światłem indukowalnego promotora może być zastosowany do manipulowania wschodzeniem nasion przez zaindukowanie genu, takiego jak barnaza (przykłady czego przedstawiono w patencie WO 98/10081), do wywierania wpływu na rozwój pyłku albo do wywierania wpływu na geny nieodpowiadające na światło w poza tym zależnych od światła procesach, takich jak dojrzewanie owoców lub kiełkowanie nasion. Promotor indukowalny światłem można również zastosować do włączania genów, które wpływają na wytwarzanie metabolitów wtórnych w liściach, na przykład, wytwarzanie alkaloidów. Indukowalne światłem promotory można również zastosować do manipulowania enzymami biosyntezy skrobi w liściach albo innej tkance fotosyntetyzującej, albo na przykład, do włączania genów po przeniesieniu bulw, na przykład po przechowywaniu w ciemności.
Aspekt indukowalności cukrem indukowalnego promotora mógłby być zastosowany do regulowania genów np. w rozwijającej się bulwie i innych niefotosyntetyzujących tkankach, takich jak geny oporności na szkodniki i/lub geny, które mogą wpływać na jakość roślin uprawnych po ich zebraniu. W przypadku ziemniaków oporność na rdzę, zgorzel (ang. blackleg) i butwienie dawałyby szczególne korzyści i mogłyby być z największą korzyścią klonowane w zrekombinowanych genach z promotorami indukowanymi cukrem. Alternatywnie, aspekt indukowalności cukrem indukowalnego promotora mógłby być użyty do kierowania ekspresją genów dla markerów selekcyjnych w procesie hodowli tkankowej.
Specjalista w tej dziedzinie łatwo zidentyfikuje element indukowanej odpowiedzi na cukier w Id. Sekw. Nr: 8 i/albo element indukowalnej odpowiedzi na światło przez zastosowanie dobrze znanych technik, takich jak analiza delecyjna. Pwee i Gray (1993) opisują taką analizę delecyjna dla genu plastocyjaniny przy zastosowaniu genu markerowego w celu określenia jego funkcjonalnych rejonów.
Sposoby tu opisane albo, na przykład, w podręczniku laboratoryjnym Sambrooka i wsp. (1989) oraz Gelvina i Stantona (1995) dla klonowania sekwencji genów i wstawiania ich do odpowiednich nośników (wektorów lub plazmidów itd.) są technikami dobrze znanymi specjalistom, dla wprowadzenia takich pomysłów w życie. Gen chimerowy lub geny, jak opisano powyżej, można wprowadzać osobno, albo może im towarzyszyć jeden lub więcej innych genów chimerowych, takich jak jeden lub
PL 205 558 B1 więcej innych opisanych tu genów. W przypadku opisanych powyżej wykonań wykorzystujących pierwszy gen chimerowy kodujący enzym ze szlaku rozkładu skrobi, drugi gen chimerowy może, przykładowo, zawierać sekwencję kwasu nukleinowego kodującą enzym ze szlaku biosyntezy skrobi również pod kontrolą odpowiedniego promotora i odpowiedniego terminatora. Promotor i/lub terminator drugiego genu chimerowego może być taki sam albo inny niż promotor i/lub terminator pierwszego genu chimerowego. Odpowiednimi sekwencjami kodującymi enzym ze szlaku biosyntezy skrobi są sekwencje kwasu nukleinowego dla syntazy sacharozowej, pirofosforylazy ADPG, syntazy skrobiowej i mogą również obejmować enzym rozgałęziający, α-amylazę, nieplastydową β-amylazę, α-glukozydazę, fosforylazę skrobiową i enzym dysproporcjonujący.
Sposoby wprowadzania jednego lub więcej genów chimerowych do roślin zostały opisane i obejmują konstruowanie binarnego wektora z genami chimerowymi połączonymi razem w jedną cząsteczkę kwasu nukleinowego; kotransformację przy zastosowaniu dwóch lub więcej różnych komórek Agrobacterium, na przykład, z różnymi wektorami binarnymi zawierającymi różne geny chimerowe; albo transformację rośliny, która już ma gen chimerowy innym, odmiennym genem chimerowym, tj. retransformację. W tym ostatnim przypadku, sposób selekcji transgenicznych roślin po wprowadzeniu drugiego genu chimerowego musi być różny od sposobu selekcji zastosowanej do wprowadzenia pierwszego genu chimerowego. Odpowiednie markery selekcyjne będą obejmowały te na oporność na higromycynę, kanamycynę, sulfonamid i Bastę. Można również zastosować metody biologiczne, takie jak krzyżowanie dwóch roślin, gdzie każda roślina zawiera jeden gen chimerowy.
W celu dokonania zmiany zawartości skrobi w już stransformowanych roślinach, które wykazują znaczący wzrost w aktywności pierwszego enzymu i w konsekwencji zmianę w syntezie skrobi można zastosować dwa chimerowe konstrukty genowe.
A zatem niniejszy wynalazek dotyczy ponadto sposobu dokonywania zmian w transgenicznej roślinie, która już wykazuje zwiększenie albo zmniejszenie aktywności enzymatycznej, jako rezultat transformacji genetycznej, kolejnego enzymu w celu zwiększenia lub zmniejszenia poziomu ekspresji tego innego enzymu i w ten sposób zwiększać albo zmniejszać ilość skrobi wytwarzanej przez retransformowaną roślinę.
Korzystne, jeżeli pierwszą stransformowaną rośliną jest roślina mająca zwiększoną aktywność enzymatyczną w szlaku biosyntezy skrobi. Przykład próby zwiększenia zawartości skrobi w roślinie jest transgeniczny ziemniak stransformowany genem ADPG-PPazy, na przykład glgC16 (patrz, na przykład, WO 91/19806). Podwyższenie zawartości skrobi w takich roślinach jest stosunkowo niewielkie. Pierwszą stransformowaną rośliną jest korzystnie roślina retransformowaną genem chimerowym dla enzymu rozkładającego skrobię, zawierającym odpowiednio, na przykład, At ct β-amylazę. Białko glgC16 jest wyrażane w bulwach po w pierwszej transformacji i prowadzi do wzrostu aktywności ADPG-PPazy i zwiększenia przepływu węgla do skrobi. Korzystne, ekspresja genu chimerowego At ct β-amylazy albo jego części w bulwach po retransformacji prowadziła do obniżenia poziomu ekspresji aktywności At ct β-amylazy, tj. kosupresji lub technologii antysensownej, uzyskując zatem wzrost akumulacji skrobi.
Korzystne, ekspresja drugiego enzymu jest kierowana do bulw. Odpowiednim promotorem do kierowania ekspresją genu chimerowego At ct β-amylazy w bulwach jest promotor genu dla patatyny.
Pierwsza transformowana roślina ziemniaka wyrażająca glgC16 jest oporna na kanamycynę, a zatem binarny konstrukt wektorowy dla genu chimerowego At ct β-amylazy niesie inny gen oporności, na przykład, odpowiednio, gen oporności na sulfonamid. Zwiększone wytwarzanie skrobi w bulwie ziemniaka byłoby korzystne, na przykład, dla wytwórców chrupków, ponieważ 1% wzrostu suchej masy ziemniaka będzie dawał w rezultacie 4% wzrostu dla produktu.
Wytwórcy chrupków ziemniaczanych mogą posłużyć również do zilustrowania innej korzyści wynalazku. Gdy bulwy ziemniaczane przechowuje się w temperaturze poniżej 8°C, akumulują się cukry redukujące, glukoza i fruktoza na skutek rozkładu zgromadzonej skrobi. Gdy ziemniaki praży się w celu uzyskania chrupków, cukry redukujące reagują z aminokwasami w reakcji Miliarda wytwarzając brązowe zabarwienie i psując smak produktu. Wprowadzenie do ziemniaków genu chimerowego, który zatrzymywałby rozkład skrobi, a zatem akumulację cukrów redukujących, byłoby korzystne dla wytwórców przekąsek. Korzystne byłoby, gdyby gen chimerowy zawierał sekwencję kodującą albo część sekwencji dla ct β-amylazy w konstrukcie do kosupresji albo antysensownym, kierowanym przez odpowiedni promotor i terminator. Odpowiedni promotor mógłby być wzięty z genów dla patatyny z bulw ziemniaka. Korzystne byłoby, gdyby dowolny inny spośród wspomnianych wyżej enzymów rozkładających skrobię mógł być również zastosowany zamiast ct β-amylazy.
PL 205 558 B1
Indukowalny promotor z Id. Sekw. Nr: 8 mógłby być również zastosowany w konstrukcie, jeżeli wymagana byłaby skoordynowana ekspresja w rozwijających się liściach i rozwijających się bulwach, ponieważ promotor patatyny jest również indukowalny sacharozą (Rochsa-Sosa et al. (1989). Podobnie, sekwencja dla polipeptydu kierującego do chloroplastu z Id. Sekw. Nr: 1 mogłaby być zastosowana z dowolnym innym genem, któremu brak swojej własnej sekwencji kierującej i który powinien być kierowany do plastydów.
Powyższe przykłady służą do zilustrowania możliwych korzyści zastosowania niniejszego wynalazku. Specjalista w tej dziedzinie zorientuje się, że kombinacja genów i roślin, do których wynalazek może być stosowany jest znaczna.
Korzystnie, kombinacja genów będzie obejmowała ct β-amylazę z jednym lub więcej genów dla: syntazy sacharozowej, pirofosforylazy ADPG, syntazy skrobiowej, enzymu rozgałęziającego, α-amylazy, nie-plastydowej β-amylazy, α-glukozydazy, fosforylazy skrobiowej i enzymu dysproporcjonującego, sekwencje których są znane specjalistom. Alternatywnie, sekwencję kierującą z ct β-amylazy może być stosowana z jednym lub większą liczbą powyższych genów.
Korzystnie, lista roślin, które można transformować obejmuje, ziemniaki, pszenicę, kukurydzę, jęczmień, pomidory, ryż, groch, soję, orzeszki ziemne, kasawę, słodki ziemniak, banany i tytoń.
Wynalazek będzie teraz opisany, drogą przykładów z odniesieniem do wykonania dla izolowania cDNA z ct β-amylazy z Arabidopsis thaliana i dla wprowadzania cDNA do roślin tytoniu i ziemniaka. Podane są również przykłady promotora odpowiadającego na bodziec i jego aktywność w roślinach transgenicznych.
Aby wynalazek można było łatwo wprowadzić w życie, będzie poczynione odniesienie, drogą przykładów, do następujących schematycznych rysunków na których;
Na Fig. 1 pokazano wyniki testowania importu wyznakowanych radioaktywnie produktów translacji przez SDS-PAGE, a następnie fluorografię. Legenda: markery masy cząsteczkowej (ścieżka M); produkty translacji (ścieżka Tr); izolowane powtórnie i traktowane termolizyną chloroplasty po inkubacji dla zajścia importu (ścieżka C); frakcja stromy (ścieżka S); przemyte tylakoidy (ścieżka T); tylakoidy traktowane termolizyną (ścieżka tT); frakcja błony wewnętrznej (ścieżka I); frakcja błony zewnętrznej (ścieżka O). Prekursor próbny (P), pośrednia (I) i dojrzała (M) forma β-amylazy, odpowiednio. Kilodaltony (K).
Na Fig. 2 pokazano wpływ światła i cukrów oraz wpływ światła i cukrów na wyrażanie transkryptu ct β-amylazy z siewek Arabidopsis thaliana. Na Fig. 2a pokazano analizę Northern całkowitego RNA z 5-tygodniowych roślin Arabidopsis hodowanych w glebie i eksponowanych przez 2 dni na światło ciągłe (L), 2 dni ciągłej ciemności (D), 2, a następnie 3 dni światła ciągłego (LL) albo 2 dni ciemności, a następnie 3 dni światła ciągłego (DL). Na Fig. 2b pokazano analizę Northern całkowitego RNA z 5-tygodniowych roślin Arabidopsis hodowanych in vitro, które były przenoszone do wody i eksponowane przez 3 dni na światło ciągłe (WL); albo do 5% sacharozy i trzymane przez 3 dni w ciemności (SD) albo eksponowane 3 dni na światło ciągłe (SL) albo do 5% glukozy i trzymane przez 3 dni w ciemności (GD) albo eksponowane 3 dni na światło ciągłe (GL). Filtry Northern hybrydyzowano z wyznakowaną radioaktywnie wstawką cDNA ct-Bmy i poddano autoradiografii (część górna). Odpowiadające temu barwione bromkiem żele agarozowe z formaldehydem są pokazane w części dolnej;
Na Fig. 3 pokazano schematycznie T-DNA chimerowych genów promotor ct β-amylazy-GUS skonstruowanych w Przykładzie 3, poniżej, w których NosP reprezentuje promotor syntetazy nopalinowej, NosT reprezentuje terminator syntazy nopalinowej; Br to odwrócone powtórzenie prawej sekwencji granicznej, a BL to odwrócone powtórzenie lewej sekwencji granicznej T-DNA z pBI101; NPTII reprezentuje sekwencję kodującą fosfotransferazy II neomycynowej; GUS reprezentuje sekwencję kodującą β-glukuronidazy. Fragmenty promotorowe ct β-amylazy są reprezentowane przez zakreskowane prostokąty; powielone w reakcji PCR fragmenty łączące XhoI-BamHI są reprezentowane przez czarne prostokąty;
Na Fig. 4 pokazano wpływ światła i sacharozy na aktywność GUS wyrażaną z genu chimerowego promotor ct BmyGUS w siewkach tytoniu;
Na Fig. 5 pokazano mapę plazmidową donorowego wektora pDV35S (SK)V;
Na Fig. 6 pokazano mapę plazmidową donorowego wektora pDV02000;
Na Fig. 7 pokazano mapę plazmidową binarnego plazmidu pBNP10431, gdzie 35S reprezentuje promotor 35S CaMV, ct bamy reprezentuje cDNA β-amylazy pełnej długości; 35St reprezentuje terminator 35S CaMV, Br reprezentuje odwrócone powtórzenie prawej sekwencji granicznej z binarnego wektora pBinPlus, colE1ori reprezentuje początek bakteryjnej replikacji colE1, RKori reprezentuje
PL 205 558 B1 początek replikacji oriV plazmidu RK2, nptIII reprezentuje gen fosfotransferazy neomycynowej dla bakteryjnej oporności na kanamycynę, LB reprezentuje odwrócone powtórzenie lewej sekwencji granicznej binarnego wektora, a kan reprezentuje zrekombinowany roślinny gen fosfotransferazy neomycynowej wymagany dla oporności rośliny na kanamycynę;
Na Fig. 8 pokazano mapę plazmidową binarnego plazmidu pBNP10432, gdzie oznaczenia są jak na Fig. 7.
Na Fig. 9 pokazano mapę plazmidową binarnego plazmidu pBNP02431, gdzie oznaczenia są jak na Fig. 7 z tą różnicą, że patp reprezentuje promotor genu patatyny klasy I z wektora pDV02000 na Fig. 6, a nost reprezentuje terminator syntazy nopalinowej, oraz
Na Fig. 10 pokazano mapę plazmidową binarnego plazmidu pBNP02432, gdzie oznaczenia są jak na Fig. 9.
Na li ś cie sekwencji:
Id. Sekw. Nr: 1 jest kwasem nukleinowym zdolnym do kierowania sekwencji kodującej do plastydu roślinnego, a w szczególności chloroplastu;
Id. Sekw. Nr: 2 jest kwasem nukleinowym, który koduje β-amylazę;
Id. Sekw. Nr: 3 jest pełną sekwencją (ct) β-amylazy kierowanej do chloroplastów.
Id. Sekw. Nr: 4 i 5 są starterami używanymi w procesie amplifikacji w Przykładzie 3;
Id. Sekw. Nr: 6 i 7 są starterami używanymi w procesie amplifikacji w Przykładzie 3;
Id. Sekw. Nr: 8 jest kwasem nukleinowym, który może odpowiadać na bodziec, szczególnie światło i/lub cukier.
P r z y k ł a d 1
Izolacja i charakteryzacja kierowanej do chloroplastów β-amylazy z Arabidopsis thaliana
Sekwencjnowanie wstawki DNA w pBmy81
Analiza w bazie danych BLASTN sekwencji nukleotydowej 37 kb fragmentu DNA z chromosomu IV Arabidopsis w kosmidzie G16599 (Beven et al., 1998) wykazała obecność genu o znaczącej homologii z pozachloroplastową β-amylazą z Arabidopsis, jęczmienia, kukurydzy, soi i ryżu. W analizie tej zidentyfikowano również kilka 3'-końcowych sekwencji EST, z których jedna, EST 81E10T7 (Newman et al., 1995), określana tu dalej jako pBmy81, była identyczna na odcinku około 3000 nukleotydów. Klon EST 81E10T7 był dostarczony przez Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) DNA Stock Center (Ohio University, USA). Zestaw subklonów z zagnieżdżonymi delecjami Bal31 na odcinku wstawki DNA w pBmy81 zastosowano jako matryce DNA w reakcjach dwuniciowego sekwencjowania z zastosowaniem cykli PCR przy użyciu wyznakowanych barwnikiem fluorescencyjnym uniwersalnych starterów. Reakcje sekwencjonowania analizowano w automatycznym sekwenatorze Applied Biosystem Model 373A. Sekwencja nukleotydowa wstawki cDNA pBmy81 jest pokazana w Id. Sekw. Nr: 3. Konstrukt pBmy81 został zdeponowany przez Advanced Technologies (Cambridge) Limited, 210 Cambridge Science Park, Cambridge CB4 4WA zgodnie z porozumieniem budapeszteńskim w International Recognition of the Deposit of Micro-Organisms dla potrzeb procedur patentowych w National Collection of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Street, Aberdeen, Szkocja, 4 sierpnia 1998 pod numerem dostępu NCIMB 40964.
Identyfikacja przypuszczalnych sygnałów kierujących do chloroplastów
Wstawka cDNA pBmy81 zawiera 36 nie ulegających translacji nukleotydów na końcu 3' i otwartą ramkę odczytu (ORF), która koduje białko złożone z 548 aminokwasów oraz nie ulegający translacji rejon 3' (UTR) o długości 232 bp. Białko kodowane przez wstawkę cDNA pBmy81 ma przewidywany ciężar cząsteczkowy 61 kDa i wykazuje duże podobieństwo aminokwasowe z roślinnymi pozachloroplastowymi β-amylazami z kukurydzy, ryżu, jęczmienia, soi i słodkiego ziemniaka. Jednakże białko kodowane przez pBmy81 różni się od wszystkich innych opisanych dotychczas β-amylaz tym, że zawiera unikatowy N-końcowy dodatek, mający właściwości sygnału kierującego do chloroplastów, tj. wysoką zawartość seryny (16%), treoniny (10%) i naładowanych dodatnio reszt aminokwasowych (15%) (Baier and Dietz, 1997). Trzy domeny, które są cechami charakterystycznymi dla sygnałów kierujących do chloroplastów (Schatz and Dobberstein, 1966) zostały zidentyfikowane w sekwencji sygnałowej: nienaładowana domena amino-końcowa, centralna domena bogata w aminokwasy z grupą hydroksylową i domena karboksy-końcowa mogąca tworzyć amfifilowy łańcuch β.
Wstawka DNA w pBmy81 koduje kierowaną do chloroplastów β-amylazę
Nienaruszone chloroplasty izolowano z 50-60 g pędów grochu (Pisum sativum L. var Feltham First) przy zastosowaniu gradientu schodkowego Percoll. Materiał roślinny hodowano i chloroplasty izolowano zgodnie z metodą Mould and Gray (1997a).
PL 205 558 B1
Plazmid pBmy81 linearyzowano poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym Notl i poddawano transkrypcji in vitro przy zastosowaniu polimerazy RNA T7. Wyznakowane radioaktywnie białko prekursorowe syntetyzowano w systemie translacji z kiełków pszenicy, włączając 35S-metioninę i 35S-cysteinę, z transkryptów cDNA pBmy81 zasadniczo tak, jak opisano przez Mould i Gray (1997a).
Import wyznakowanych radioaktywnie produktów translacji in vitro przeprowadzono tak, jak opisano przez Mould i Gray (1997b). Po przeprowadzeniu inkubacji dla zajścia importu, nienaruszone chloroplasty traktowano termolizyną (stężenie końcowe 0,2 mg/ml w buforze do importu) przez 30 min. w lodzie, a następnie reakcję z proteazą zatrzymywano przez dodanie EDTA do 50 mM w buforze do importu. Chloroplasty ponownie izolowano przez poduszkę 40% Percoll w buforze do importu, a następnie przemywano buforem do importu (Mould and Gray (1997a). Próbki (1/10) chloroplastów traktowanych termolizyną pobierano do analizy, a pozostałość frakcjonowano zasadniczo tak, jak opisano przez Schnell i Blobel (1993). Próbki chloroplastów traktowanych termolizyną, frakcje strony, tylakoidów i tylakoidy traktowane termolizyną analizowano ilościowo poprzez SDS-PAGE, a następnie barwienie błękitem Coomassie i skanowanie denstytometryczne wybarwionych prążków białkowych (podjednostki karboksylazy rybulozobifosforanowej i białek kompleksu świetlnego zastosowano jako standardy). Równoważne ilości tych frakcji (wynoszące około 2% chloroplastów odzyskanych z gradientu Percoll, a 505 uzyskanych frakcji wewnętrznej i zewnętrznej błony analizowano poprzez elektroforezę w 10% żelu poliakryloamidowym w obecności SDS, a następnie fluorografię. Wyniki (Fig. 1) pokazują, że główny produkt translacji (ścieżka Tr) ma około 58 kDa. Kiedy izolowane, nienaruszone chloroplasty grochu inkubowano z wyznakowanym radioaktywnie białkiem w obecności ATP, powstawały polipeptydy o wielkości 50 kDa i 48 kDa (ścieżka C). Odporność tych polipeptydów na rozkład przez egzogenne dodawaną termolizynę wskazuje, że są one produktami importu wyznakowanych radioaktywnie białek. Frakcjonowanie nienaruszonych traktowanych termolizyną chloroplastów na strome, przemywane tylakoidy i tylakoidy traktowane termolizyną oraz błonę wewnętrzną i zewnętrzną wykazało, że dwa wyznakowane radioaktywnie polipeptydy są zlokalizowane we frakcji stromy.
P r z y k ł a d 2
Indukcja sacharozą i światłem genu ct β-amylazy z Arabidopsis thaliana
W celu pokazania indukcji ct β-amylazy na świetle, rośliny Arabidopsis thaliana ekotyp Landsberg hodowano w szklarni w warunkach 18 godzin światła, 6 godzin ciemności w 18°C. Po 5 tygodniach, dwie skrzynki siewek przenoszono do kompletnej ciemności, a dwie skrzynki siewek hodowano przy ciągłym świetle. Po dwóch dniach, jedną skrzynkę z siewkami trzymanymi w ciemności i jedną skrzynkę siewek hodowanych na świetle użyto do izolacji całkowitego RNA, a drugą skrzynkę w obu przypadkach eksponowano przez dalsze 3 dni na ciągłe światło.
Dla kombinowanego traktowania sacharoza-światło-ciemność, nasiona ekotypu Landsberg sterylizowano powierzchniowo, umieszczano na pożywce agarowej MS zawierającej 1% sacharozę i hodowano w pokoju hodowlanym w warunkach 18 godzin światła, 6 godzin ciemności. Pięciotygodniowe siewki przenoszono na sterylną wodę destylowaną albo 5% roztwór sacharozy lub glukozy w wodzie. Siewki utrzymywano bądź przy ciągłym świetle, bądź w ciemności przez trzy dni. Całkowity RNA otrzymano z siewek dla każdego testu i poddano analizie Northern tak, jak opisano przez Eggermont et al. (1996). Filtry Northern hybrydyzowano z oczyszczonym z żelu wstawką cDNA pBmy81 jako sondą wyznakowaną radioaktywnie 32P-cdCTP metodą losowych starterów tak, jak opisano przez Feinberg i Vogelstein (1983).
Wyniki pokazane na Fig. 2A wskazują, że transkrypt genu ct β-amylazy jest indukowalny światłem.
Wyniki pokazane na Fig. 2B wskazują, że transkrypt genu ct β-amylazy jest indukowalny w ciemności 5% sacharozą i w mniejszym stopniu 5% glukozą. Ta indukcja jest dalej wzmacniana na świetle w obecności cukrów. Wyniki te pokazują, że wpływ światła i cukrów jest od siebie wzajemnie niezależny.
P r z y k ł a d 3
Konstrukcja fuzji promotor ct β-amylazy-GUS
Fragmenty promotorowe izolowano z genu β-amylazy znajdującego się na kosmidzie G16599 (Beven et al., 1998) przez trawienie enzymami restrykcyjnymi. Dogodnymi miejscami restrykcyjnymi w promotorze były Hind III w pozycji nukleotydowej -1662 bp (zaczynając od pozycji 19179 na nici minus w sekwencji Id. Sekw. Nr: 8), Sal I w pozycji -1127 bp i Pst I w pozycji -371 bp oraz miejsce Xho I zlokalizowane w pozycji +21 poniżej inicjacyjnej metioniny ct β-amylazy i zostały one użyte do wyizolowania trzech sekwencji promotora o różnej długości plus peptydu tranzytowego (A w kodonie inicjacyjnym ATG dla metioniny jest numerowana jako +1).
PL 205 558 B1
Fragment o długości 294 bp (Id. Sekw. Nr: 1) genu ct β-amylazy zlokalizowany w kosmidzie G16599 (Beven et al., 1998) powielono przy zastosowaniu starterów oligonukleotydowych:
Id. Sekw. Nr: 4
PI: (5' - AAT TCCTCGAGT TCT CTT ATC - 3') i
Id. Sekw. Nr: 5
P2: (5' - cgg gAT CCC TGA CAT TGT TAC - 3').
W starterze PI, podkreślone zasady oznaczają miejsce XhoI leżące w pozycji +21 bp; w starterze P2 zasady pisane małymi literami odnoszą się do nukleotydów dodawanych w celu utworzenia miejsca BamHI.
Chimerowe geny: promotor ct β-amylazy-GUS utworzono poprzez potrójną ligację fragmentów promotorowych; fragmentu łącznikowego PCR strawionego XhoI i BamHI, wektora GUS pBI101 (Jefferson et al., 1987) strawionego Hindlll-BamHI, Sall-BamHI lub Pstl-BamHI (Fig. 3). Konstrukty nazwano HjiGUS, SβGUS i PβGUS, odpowiednio.
Chimerowe konstrukty genowe przenoszono do Agrobacterium tumefacens LB4404 poprzez krzyżowanie trój rodzicielskie (Beven, 1984) i wprowadzano do Nicotiana tabacum var Samsun przy zastosowaniu metody transformacji dysków liściowych (Horsch et al., 1985).
P r z y k ł a d 3A
Indukcja sacharozą i światłem genu: promotor ct β-amylazy z Arabidopsis thaliana-GUS w siewkach tytoniu
W roślinach zawierających konstrukty HjiGUS i PβGUS miał miejsce wysoki poziom ekspresji aktywności GUS i linie potomne F1 siewek zastosowano do badania indukowalnej światłem i sacharozą ekspresji genów chimerowych. Nasiona F1 tytoniu sterylizowano powierzchniowo, umieszczano na pożywce agarowej MS zawierającej 1% sacharozę i hodowano w pokoju hodowlanym w warunkach 18 godzin światła, 6 godzin ciemności. Dwu- trzytygodniowe siewki przenoszono na sterylną wodę destylowaną albo 5% roztwór sacharozy lub glukozy w wodzie. Siewki utrzymywano bądź przy ciągłym świetle, bądź w ciemności przez trzy dni. Ekstrakty całkowitego białka z puli do 10 do 14 siewek analizowano pod kątem aktywności GUS przy zastosowaniu fluorogennego substratu 4-metylolumbeliferyloglukuronidu (4-MUG) tak, jak opisano przez Jefferson i wsp. (1987). W przypadku obydwu konstruktów, poziom aktywności GUS w siewkach eksponowanych na ciągłe światło w nieobecności sacharozy był podobny do poziomów aktywności GUS w siewkach eksponowanych na sacharozę w nieobecności ciągłego światła (Fig. 4). Jednakże ekspozycja siewek zarówno na ciągłe światło, jak i sacharozę podnosiła poziomy aktywności GUS około dwa do trzech razy. Wyniki te pozostają zasadniczo w zgodzie z wynikami dla samego genu β-amylazy, co pokazuje, że indukowalność światłem i indukowalność sacharozą są procesami niezależnymi.
Barwienie histochemiczne dla GUS pokazało, że aktywność była wykrywana w liścieniach dwutygodniowych siewek, a niewielka albo brak aktywności było w pierwszych prawdziwych liściach albo w łodygach i korzeniach. W czterotygodniowych siewkach dodatkową aktywność pokazano w pierwszych prawdziwych liściach, a także w łodygach. Barwienie GUS było w szczególności związane z bogatymi w chloroplasty komórkami miękiszowymi (chlorenchyma) zlokalizowanymi pomiędzy wiązkami ksylemu oraz pomiędzy wiązkami ksylemu i łyka, które tworzą wewnętrzne łyko w łodydze.
P r z y k ł a d 4
Ukierunkowaną mutagenezę zastosowano do przekształcenia miejsca KpnI położonego w pozycji 2302 bp plazmidu pBmy81 w miejsce BamHI. Startery oligonukleotydowe
Id. Sekw. Nr: 6
P3: (5' - GCT GGT ACG CCT GCA GGA TCC GGT CCG GAA TTC CC 3') i
Id. Sekw. Nr: 7
P4: (5' - GGG AAT TCC GGA CCG GAT CCT GCA GGC GTA CCA GC 3') zaprojektowano i zastosowano z zestawem Quick Change site-directed mutagenesis kit (Promega). Protokół był taki, jak zalecał producent.
Sekwencję kodującą β-amylazy pełnej długości wycięto ze zmutowanego plazmidu poprzez cięcie BamHI, a następnie oczyszczono przy użyciu GeneCleann (BIO101). Fragment BamHI poddano ligacji w miejscu BamHI z wektorami donorowymi pDV35S(SK)V (patrz Fig. 5) i pDV02000 (patrz Fig. 6).
pDV35S(SK)V składa się z pBluscript (Stratagene) niosącego 35S CaMV promotor-35S terminator, podobne konstrukty są znane w tej dziedzinie (np. Odell i wsp., 1985). pDV02000 składa się z pBluscript z 1,4 kb fragmentem z promotorem patatyny-terminatorem syntazy nopalinowej. Biegły w tej dziedzinie będzie mógł zrobić podobne konstrukty ze znanych sekwencji (np. Liu i wsp., 1990).
PL 205 558 B1
Izolowano plazmidy z sekwencją kodującą zarówno w orientacji sensownej, jak i antysensownej w stosunku do promotora, a chimerowe geny ct β-amylazy subklonowano z wektorów donorowych do binarnego wektora pBinPlus (van Engelen i wsp., 1995). Mapy plazmidów są pokazane na Fig. 7-10.
P r z y k ł a d 5
Transformacja i retransformacja roślin
Ziemniaki transformowano przy zastosowaniu metody jednoczesnej hodowli dysków liściowych, zasadniczo tak, jak opisano przez Hotsch (1985). Binarne wektory jak opisano powyżej przenoszono do Agrobacterium tumefaciens LBA4404 stosując metodę elektroporacji i hodowle takich Agrobacteria używano do transformacji tak, że zregenerowane rośliny przenosiły chimerowe geny jak opisano w Przykładzie 4.
Binarny plazmid z genem promotor β-amylazy terminatorem sytntazy nopalinowej można zastosować do transformacji ziemniaka już przenoszącego chimerowy gen dla ADPG-Ppazy glgC16 z E. coli metodami jednoczesnej hodowli dysków liściowych.
P r z y k ł a d 6
Konstrukcja plazmidów z sekwencją kodującą peptyd kierujący ct β-amylazy z At
Sekwencja kodująca sekwencję kierującą do plastydów ct β-amylazy z At jest zawarta we fragmencie o długości 294 bp równoważnym Id. Sekw. Nr: 1. Amplifikację w reakcji PCR lub trawienie enzymami restrykcyjnymi można zastosować do izolacji fragmentów DNA z plazmidów opisanych w Przykładzie 3, tj. fragmentów, które będą składały się z promotora 35S CaMV plus sekwencji kodującej sekwencję kierującą do plastydów lub promotora patatyny plus sekwencji kodującej sekwencję kierującą do plastydów. Chimerowe geny można skonstruować przez ligację sekwencji kodujących dla białek lub enzymów jako fuzje translacyjne z sekwencją kodującą peptyd tranzytowy. Powstające w procesie translacji białka będą transportowane do plastydów w celu dostarczenia nowych aktywności albo wpływania na szlaki metaboliczne.
Literatura
Ainsworth, C, Clark, J. and Balsdon, J. (1993). Plant. Mol. Biol., 22, 67-82.
Baier, M. and Dietz, K.J., (1997) Plant J. 12, 179-190
Bevan, M.W. (1984) Nucl. Acids. Res., 12 , 8711-8721
Bevan, M.W. et al. (1998). Nature, 391, 485-488.
Chan, MT., Chao, YC. and Yu, SM. (1994). J. Biol. Chem., 269, 17635-17641.
Chen, MH., Liu, LF., Chen, YR. , Wu, HK. and Yu, SM. (1994).
Plant J., 6, 625-636.
Daussant, J., Zbaszyniak, B., Sadowski, J. and Wiatroszak, I. (1981). Planta, 151, 176-179.
Denyer, K., Clarke, B., Hylton, C, Tatge, H. and Smith, A.M. (1996). Plant J., 10, 1135-1143.
Duwenig, E., Steup, M., Willmitzer, L. and Kossmann, J. (1997).
Plant J., 12, 323-333.
Eggermont, K., Goderis, I. J. and Broekaert, W. F. (1996).
Plant Mol. Biol. Rep. 14, 273-279.
Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983). Anal. Biochem. 132, 6-13.
Gelvin, S. B. -and Schilperoort, R. A. (1995). Plant Molecular
Biology Manual. 2nd edition. Kluwer Academic Publishers, The Netherlands.
Hildebrand, D.F. and Hymowitz, T. (1981). Physiol. Plant., 53, 429-434.
Horsch, R.B., Fry, J.E., Hoffman, N.L., Eichholtz, D., Rogers, S. G. and Swaley, R.T. (1985) Science, 227. 1229-1231.
Hylton, C.M., Denyer, K., Keeling, P.L., Chang, MT. and Smith, A.M. (1995). Planta, 198, 230-237. Innes, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J. and White, T.J. (1990). PCR Protocols. Publisher: Academic Press.
James, M.G., Robertson, D.S. and Myers, A.M. (1995). Plant Cell, 7, 417-429.
Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A. and Bevan, M.W. (1987) EMBO, J. 6. 3901-3907.
Kakefuda, G., Duke, S.H. and Hostak, M.H. (1986). Planta, 168, 175-182.
Klosgen, R.B. and Weil, J.H. (1991) Mol. Gen. Genet., 225, 297-304
Li, B., Servaites, J.C. and Geiger, D.R. (1992). Plant Physiol., 98, 1277-1284.
Liu, X.J., Prat, S., Willmitzer, L. and Frommer, W.B. (1990) Mol. Gen. Genet., 223, 401-406.
Mita, S., Suzuki-Fujii, K. and Nakamura, K. (1995) Plant Physiol. 107,895-904.
Mita, S., Murano, N., Akaike, M. and Nakamura, K. (1997). Plant J., 11, 841-851.
PL 205 558 B1
Mould, R.M. and Gray, J.C. (1997a). In Cell Biology: A Laboratory Handbook, second edition, Volume 2. (Cells, J.E. ed). New York: Academic Press, pp. 81-86.
Mould, R.M. and Gray, J.C. (1997b). In Celi Biology: A Laboratory Handbook, second edition, Volume 2. (Cells, J.E. ed). New York: Academic Press, pp. 286-292.
Nakamura, K., Ohto, M., Yoshida, N. and Nakamura, K. (1991). Plant Physiol., 96, 902-909.
Neuhaus, H.E., Henrichs, G. and Schiebe, R. (1995). Planta, 194, 454-460.
Newman, T. et al. (1994). Plant Physiol., 106, 1241-1255.
Nielson, T.H., Deiting, U. and Stitt, M. (1997). Plant Physiol., 113, 503-510.
Odell, J.T. Nagy, F. and Chua, N.H. (1985) Nature, 313, 810-812.
Peavey, D.G., Steup, M. and Gibbs, M. (1977). Plant Physiol., 60, 305-308.
Pwee, K-H. and Gray, J.C. (1993) Plant J. 3, 437-449.
Rocha-Sosa, M., Sonnewald, U., Frommer, W., Stratmann, M., Schell, J. and Willmitzer, L. (1989)
EMBO, 8, 23-29.
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning. Publisher: Cold Spring Harbour.
Schatz, G. and Dobberstein, B. (1996). Science, 271, 1519-1526. Schnell, D.J. and Blobel, G. (1993). J. Cell. Biol., 120, 103-115.
Sonnewald, U., Basner, A., Greve, B. and Steup, M. (1995). Plant. Mol. Biol., 27, 567-576 Sweetlove, L.J., Burrell, M.M. and ap Rees, T. (1996). Blochem. J., 320-493-498.
Thomson, W.W. and Whatley, J.M. (1980) Ann. Rev. Plant Physiol. 31, 375-394.
van Engelen, F. A., Molthoff, J. W., Conner, A. J., Nap, J-P., Pereira, A. and Stiekema, W. J. (1995).
Transgenic Res. 4, 288-290.
van der Leij, F.R., Visser, R.G.F., Ponstein, A.S., Jacobsen, E. and Feenstra, W.J. (1991). Mol. Gen.
Genet., 228, 240-248.
Wang, SM., Lun, WL. and Chen, J. (1996). Plant Mol. Biol., 31, 975-982.
Wang, SM., Lue, WL., Huang, HW. and Chen, J. (1997). Plant Physiol., 113, 403-409.
LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:
(i) ZGŁASZAJĄCY:
(A) ADRESAT: Advanced Technologies (Cambridge) Ltd.
(B) ULICA: Globe House, 1 Water Street (C) MIASTO: Londyn (D) KRAJ: Anglia (F) KOD POCZTOWY: WC2R 3LA (ii) TYTUŁ WYNALAZKU:
Sekwencja kwasu nukleinowego kierująca do plastydu, sekwencja kodująca β-amylazę, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, gen chimerowy, komórki roślinne, nasiona transgenicznej rośliny, rośliny transgentczne (iii) LICZBA SEKWENCJI: 8 (iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER (A) TYP NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: Viglen P5/75 (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Windows 3.1
PL 205 558 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 294 par zasad (B) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA (A) ORGANIZM: Arabidopsis thaliana (B) SZCZEP: Ekotyp Colombia (C) RODZAJ TKANKI: liść (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(A) BIBLIOTEKA: ABRC DNA Stock Centre (B) KLON: EST 81E10T7 (viii) POŁOŻENIE W GENOMIE:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT: Chromosom IV (ix) CECHA (A) NAZWA: peptyd tranzytowy (B) POŁOŻENIE: 37-291 bp (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 1 :
TCATTTCTCATCATAACAAAGAGAGAGAAAAAAACTATGGAATTGACACTGAATTCCTCG
MELTLNSS8
AGTTCTCTTATCAAACGTAAAGATGCCAAGAGTTCTAGAAACCAAGAAAGTTCCTCCAAC
S SL I KR KD AKSS RNQ E S SSN28
121 AACATGACCTTTGCGAAGATGAAGCCGCCAACATATCAGTTCCAAGCAAAGAACTCGGTT
NMTFAKMKPPTYQFQAKNSV48
181 AAGGAAATGAAGTTCACTCACGAGAAGACCTTCACGCCAGAAGGTGAAACCCTTGAGAAA
KEMKFTHE KTFTPEG ETLEK68
241 TGGGAGAAGCTCCACGTTCTCTCATACCCACACTCCAAGAACGACGCTAGCGTT
WEKLHVLSYPHSKNDASV 85
PL 205 558 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1642 pary zasad (B) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA (A) ORGANIZM: Arabidopsis thaliana (B) SZCZEP: Ekotyp Colornbia (C) RODZAJ TKANKI: liść (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(A) BIBLIOTEKA: ABRC DNA Stock Centre (B) KLON: EST 81E10T7 (viii) POŁOŻENIE W GENOMIE:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT: Chromosom IV (ix) CECHA (A) NAZWA: peptyd tranzytowy (B) POŁOŻENIE: 1-1393 bp (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 2 :
GTTCCGGTGTTCGTCATCITACCGCTCGACACAGTAACAATGTCAGGGCATTTGAACAAA
VPVFVMLPLDTVTMSGH LNK20
CCACGAGCCATGAACGCTAGTTTGATGGCTCTGAAAGGAGCTGGTGTGGAAGGTGTGATG
PRAMNASLMAL K G A G V E GVM40
121 gtggatgcttggtggggattggtggagaaagatggacctatgaattataactgggaaggc
VDAWWGLVE KDGPMNYNWEG60
181 TATGCCGAGCTTATACAGATGGTTCAAAAGCACGGTCTCAAACTCCAGGTCGTTATGTCA
YAEL I QMVQKHGLKLQVVMS80
241 TTCCATCAATGTGGAGGAAACGTAGGAGACTCTTGCAGTATCCCCTTGCCTCCATGGGTG fhqcggnvgdscsiplppwvioo
01 CTTGAAGAG atcagcaagaaccctgatcttgtctacacagacaaatctgggagaaggaac
LEE ISKNPDLVYTDKSGRRN 120
361 cctgaatatatctccttgggatgtgattctgtgcctgtcctaagaggaagaacacctatc
PEYISLGCDSVPVLRGRTPI14 0
421 caggtctactcagatttcatgaggagcttccgtgaacgatttgaaggctacataggagga
QVYSDFMRSFRERFEGY IGG 160
PL 205 558 B1
481 gttattgcggaaattcaagtaggaatgggaccttgtggagaattgagatacccatcatac
VIAEIQVGMGPCGELRYPSY 180
541 CCTGAAAGCAACGGGACCTGGAGATTCCCCGGAATTGGAGAGTTCCAGTGCTACGACAAG
P .ESNGTWRFPG I G E F Q C Y D K 200
601 TATATGAAATCGTCACTTCAGGCATATGCTGAATCAATTGGGAAAACTAACTGGGGAACA
YMKSSLQAYAESIGKTNWGT 220
661 AGCGGACCTCATGATGCCGGCGAGTACAAGAACCTCCCAGAAGATACTGAATTTTTCAGG
SGPHDAGEY KNLPEDT E F F E 240
721 AGAGACGGAACATGGAATAGCGAGTATGGAAAGTTTTTCATGGAATGGTACTCCGGGAAG
RDGTWNSEYGKFFMEWYSGK 260
781 CTGCTAGAACATGGAGACCAACTCCTATCTTCAGCGAAAGGTATCTTTCAAGGAAGCGGA
LLEHGDQLLSSAKGIFQGSG 280
841 GCAAAGCTATCAGGAAAGGTAGCTGGAATTCACTGGCACTACAACACCAGGTCACACGCA
A K L S G K V A G I H W Η Υ Ν T R S H A 300
901 gctgagctaaccgctggatattacaacacaagaaaccatgacgggtatctgccaatagct
AELTAGYYNTRNHDGYLPIA320
961 AAGATGTTCAACAAACATGGAGTTGTGCTCAACTTCACCTGCATGGAGATGAAAGACGGG
KMFNKHGVVLNFTCMEMKDG3 60
1021 GAGCAACCTGAGCACGCGAATTGCTCACCAGAAGGTCTGGTCAAGCAAGTACAGAACGCG
EQPEHANCSPEGLVKQVQNA 380
1081 ACAAGGCAGGCCGGAACCGAACTAGCAGGGGAGAACGCGCTAGAACGATATGACTCGAGC
TRQAGTELAGENALERYDSS 400
1141 GCATTCGGACAAGTGGTAGCAACAAATAGGTCAGATTCTGGAAATGGGTTAACCGCATTT
AFGQVVATNRSDSGNGLTAF 420
1201 ACTTACCTAAGAATGAACAAGCGGTTATTTGAGGGTCAAAATTGGCAGCAGTTAGTGGAG
T Y L R Μ Ν K R L F E G Q N W Q Q L V E 440
1261 TTTGTTAAGAACATGAAGGAAGGTGGTCATGGGAGG AGACTCTCAAAAGAAGACACAACT
FVKNMKEGGHGRRLS KEDTT 460
1321 GGAAGTGACCTTTATGTTGGATTTGTCAAAGGCAAGATCGCTGAGAATGTGGAGGAGGCT
GSDLYVGFVKGKXAENVEEA 480
81 GCTTTAGTGTAATTTCCCACATAGGTACATACATATAGTGTGGTGTTTATTGTATTCCTG
A L V - 4g3
1441 TCTGATAAATAACTAGAGAGATCAAACCAGTAAGAGTGTTAAAGCTATAGATTTGCACAA
1501 TTCTGGGTCAGAGTCAGAGCAAAGAGAAGCAAAATCAAGATGATGTACACTTAGATGTAT
1561 CCTATGAGTTTTCCTTGTACATCATCTTCATACTCTTAATCTCAAATACTATGCATTTTT
1621 CTCCAAAAAAAAAAAAAAAAGGGCGGCCGCTCTAGAGGATCC
PL 205 558 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1953 pary zasad (B) TYP: nukleotyd <C) NICIOWOŚĆ: podwójna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA (A) ORGANIZM: Arabidopsis thaliana (B) SZCZEP: Ekotyp Colombia <C) RODZAJ TKANKI: liść (vii) ŹRÓDŁO BEZPOŚREDNIE:
(A) BIBLIOTEKA: ABRC DNA Stock Centre (B) KLON: EST 31E10T7 (viii) POŁOŻENIE W GENOMIE:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT: Chromosom IV (ix) CECHA (A) NAZWA: CDS (B) POŁOŻENIE: 37-1683 bp (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 3
TCATTTCTCATCATAACAAAGAGAGAGAAAAAAACTATGGAATTGACACTGAATTCCTCG
MELTLNSS6
AGTTCTCTTATCAAACGTAAAGATGCCAAGAGTTCTAGAAACCAAGAAAGTTCCTCCAAC
SSLIKRKDAKSSRNQESSSN28
121 AACATGACCTTTGCGAAGATGAAGCCGCCAACATATCAGTTCCAAGCAAAGAACTCGGTT
NMTFAKM KPPTYQFQAKNSV48
181 AAGGAAATGAAGTTCACTCACGAGAAGACCTTCACGCCAGAAGGTGAAACCCTTGAGAAA
KEMKFT H EKTFTPEGETLEK68
241 TGGGAGAAGCTCCACGTTCTCTCATACCCACACTCCAAGAACGACGCTAGCGTTCCGGTG
WEKLHVLSYPHSKNDA£VPV88
01 TTCGTCATGTTACCGCTCGACACAGTAACAATGTCAGGGCATTTGAACAAACCACGAGCC
F V M L P L D Τ V Τ M S G H L Ν K P R A 108
61 ATGAACGCTAGTTTGATGGCTCTGAAAGGAGCTGGTGTGGAAGGTGTGATGGTGGATGCT
MNASLMALKGAGVEGVMVDA 128
421 TGGTGGGGATTGGTGGAGAAAGATGGACCTATGAATTATAACTGGGAAGGCTATGCCGAG
WWGLVEKDGPMNYNWEGYAE 148
PL 205 558 B1
481 CTTATACAGATGGTTCAAAAGCACGGTCTCAAACTCCAGGTCGTTATGTCATTCCATCAA b I Q Μ V Q K H G b K L Q V V M S F H Q 168
541 TGTGGAGGAAACGTAGGAGACTCTTGCAGTATCCCCTTGCCTCCATGGGTGCTTGAAGAG
CGGNVGDSCSI PLPPWVLEE188
601 ATCAGCAAGAACCCTGATCTTGTCTACACAGACAAATCTGGGAGAAGGAACCCTGAATAT
I S K Ν P D L V Y T D K S G R R Ν Ρ E ¥ 208
661 ATCTCCTTGGGATGTGATTCTGTGCCTGTCCTAAGAGGAAGAACACCTATCCAGGTCTAC
I S L G C D S V Ρ V b R G R Τ Ρ I Q V Y 228
721 TCAGATTTCATGAGGAGCTTCCGTGAACGATTTGAAGGCTACATAGGAGGAGTTATTGCG
SDFMRSFRERFEGYIGGVIA248
781 GAAATTCAAGTAGGAATGGGACCTTGTGGAGAATTGAGATACCCATCATACCCTGAAAGC
E I Q V G M G P C G E L R Y P S Y Ρ E S 268
841 AACGGGACCTGGAGATTCCCCGGAATTGGAGAGTTCCAGTGCTACGACAAGTATATGAAA
N G T W R F P G I G E F Q C Y D K Y Μ K 2B8
901 TCGTCACTTCAGGCATATGCTGAATCAATTGGGAAAACTAACTGGGGAACAAGCGGACCT
S S L Q A Y A E S I G K Τ N W G T S G P 308
961 CATGATGCCGGCGAGTACAAGAACCTCCCAGAAGATACTGAATTTTTCAGGAGAGACGGA
HDAGEYKNLPEDTEFFRRDG 328
1021 ACATGGAATAGCGAGTATGGAAAGTTTTTCATGGAATGGTACTCCGGGAAGCTGCTAGAA
TWNSEYGKFFMEWYSGKLLE 348
1081 CATGGAGACCAACTCCTATCTTCAGCGAAAGGTATCTTTCAAGGAAGCGGAGCAAAGCTA
H G D Q L L S SAKG I F Q G S G A K L 368
1141 TCAGGAAAGGTAGCTGGAATTCACTGGCACTACAACACCAGGTCACACGCAGCTGAGCTA
S G K V A G I H W Η Y Ν T R S H A A E L 388
1201 ACCGCTGGATATTACAACACAAGAAACCATGACGGGTATCTGCCAATAGCTAAGATGTTC
T A G Y Y Ν T RNHDGYLPIAKMF408
1261 AACAAACATGGAGTTGTGCTCAACTTCACCTGCATGGAGATGAAAGACGGGGAGCAACCT
Ν K H G V V L K F T C K E Μ K D G E Q P 428
1321 GAGCACGCGAATTGCTCACCAGAAGGTCTGGTCAAGCAAGTACAGAACGCGACAAGGCAG
EHANCS P EGLVKQVQNATRQ 448
1381 GCCGGAACCGAACTAGCAGGGGAGAACGCGCTAGAACGATATGACTCGAGCGCATTCGGA
A G Τ E L A G E N A L E R Y D S S A F G 468
1441 CAAGTGGTAGCAACAAATAGGtCAGATTCTGGAAATGGGTTAACCGCATTTACTTACCTA
Q V V A Τ N R S D S G N G L T A F Τ Y b 488
1501 AGAATGAACAAGCGGTTATTTGAGGGTCAAAATTGGCAGCAGTTAGTGGAGTTTGTTAAG
RMNKRLFEGQNWQQLVEFVK 508
1561 AACATGAAGGAAGGTGGTCATGGGAGGAGACTCTCAAAAGAAGACACAACTGGAAGTGAC
NMKEGGHGRRLS KEDTTGSD 528
PL 205 558 B1
1621 CTTTATGTTGGATTTGTCAAAGGCAAG ATCGCTGAG AATGTGGAGG AGGCTGCTTTAGTG
LYVGFVKGKIAENVEEAALV 548
1681 TAATTTCCCACATAGGTACATACATATAGTGTGGTGTTTATTGTATTCCTGTCTGATAAA
1741 TAACTAGAGAGATCAAACCAGTAAGAGTGTTAAAGCTATAGATTTGCACAATTCTGGGTC
1801 agagtcagagcaaagagaagcaaaatcaagatgatgtacacttagatgtatcctatgagt
1861 TTTCCTTGTACATCATCTTCATACTCTTAATCTCAAATACTATGCATTTTTCTCCAAAAA
1921 AAAAAAAAAAAGGGCGGCCGCTCTAGAGGATCC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: nukleotyd
CC) NICIOWOŚĆ: pojedyncza
CD) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 4
AATTCCTCGA GTTCTCTTAT C 21
PL 205 558 B1 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 5
GGGATCCCT GACATTGTTA C 21 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 6:
( i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 6
GCTGGTACC CTGCAGGATC CGGTCCGGAA TTCCC 35
INFORMATION FOR SEO.ID.NO.7 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 35 par zasad (B) TYP: nukleotyd (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 7 :
GGGAATTCCG GACCGGATCC TGCAGGCGTA CCAGC 3 5
PL 205 558 B1
SEQUENCE INFORMATION FOR SEQ. ID. NO. 8 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKWENCJI NR: 8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) | DŁUGOŚĆ: 1652 pary zasad |
(B) | TYP: nukleotyd |
CC) | NICIOWOŚĆ: podwójna |
CD) | TOPOLOGIA: liniowa |
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: cDNA do mRNA (vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA (A) ORGANIZM: Arabidopsis thaliana (B) SZCZEP: Ekotyp Colombia (C) RODZAJ TKANKI: liść (vii) ŻRÓDLÓ BEZPOŚREDNIE:
(A) BIBLIOTEKA: EU Arabidopsis Genome Project (B) KLON: Kosmid G16599 <viii> POŁOŻENIE W GENOMIE:
(A) CHROMOSOM/SEGMENT: Chromosom 4 (ix) CECHA (A) NAZWA: promotor (B) POŁOŻENIE: 17534-19185 bp G115599 nić komplementarna (xi> OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR: 8 :
(ii) SEQUENCE DESCRIPHON: SEQ.ID.NO:8
1 | AAGCTTGTGT | CTATTTCAAA | TTCTTGACCG | TAGATGTCAC | AACATGCATA |
51 | TATCATTGAA | AACAGAGCAA | CACAGGAAAC | CAAGCATATG | TATCTAGATA |
101 | TACTTAGCAA | GACATAACTA | TAGTCTTTGA | ATCAACATAG | GGATTAATGA |
151 | TAGAGAATGA | GGAAGCTCAA | GATTTTATAC | TCAGTTTCTT | ACAAAACAAA |
201 | TTTCTCTCTA | ACTGCAAAAA | CACCAATTAG | GATTTGAAGA | GCGTACCTGT |
251 | TTGAGTCAAT | GTCCAATGTC | GTCCCCCCGC | CTTCTACATT | TCTTAGCCTG |
301 | CTGAATAAAA | GCACAAGCCA | AAATGAGAAG | GTGCCAAAGG | CGATAAGGAT |
351 | CAATTTCTAC | CATTCAAAAA | ACTAATGGTG | AGAATTAGAA | ACGAGAGAAA |
401 | ACTACTTGTT | GAGGAAATAG | CCAAAAGCGC | AATCTTCGTC | ACCTGAATAA |
451 | AGACCAAACC | GTCACTTTCA | atgagtcagc | AAGAAAAAGA | GAGAGAGAGA |
SOI | GAGAGAGATT | CTCTATAACA | TTTGAGTCGA | CATGGATTCT | AATGCATCAA |
PL 205 558 B1
551 | AAGTCATCTC | CAATAAACAA | ACACTTGAAA | CTCACATGGC | TAATAGAACA |
601 | AGATCAAAGC | CTTAAGTATT | AAGCATTACA | GACACTACTG | GCTAACTTTT |
651 | GACACATGTT | CTTAAGTAAC | ATAGTATCAA | TATCCGTGAA | TCACATCGAA |
701 | CACACACAAC | AAGGGCTTAA | TGCATCAAAG | TCCTGTTATT | TCCATATAAC |
751 | AACATATTTC | ATTTACAAAC | AGAATGCAGC | ATTCAGGCAG | TCCAAATGGA |
801 | AAGGTTGACA | AAAAAATATA | ATCTTGTAAC | TCTACATATA | TGGCAGAATG |
851 | TAATAACCAG | GCAAGAAAAA | AACAGAATAA | ACAGATCAAT | GAGTATGATA |
901 | TAAAAAAAAG | TCACAAAGAA | TGTGCCACAG | TGAACAAGAG | GGCCATGAGA |
951 | AGAAATTTTC | AAAGAAAATA | TTAGCATTGT | TAGAATTTTT | TGGGTCAATG |
1001 | GATCTGTCAG | CTGCTTAGTT | GGAAAACACA | AATCTTACAG | GAAGGAAAGT |
1051 | CCAAGAAAAA | GAAAATAAGC | AAAGTTAATA | GCCACCACAA | GAAATTTCAT |
1101 | ACAGAAATAA | TTAAATCGTT | GCACTTATCT | TCTTATTCAA | ACTAAAATCA |
1151 | AGAGAACTTA | ATAATTTTCA | GCCACACGAA | CCATGTGTTC | AAAGCCAAAG |
1201 | GTGAGAAGCC | AAAATTATCA | GCTTATCTCC | ATTAACAAGG | GAAAAGCAAG |
1251 | ACTAGATTTA | AGAGTTCTCT | GTAACTAAAA | ACTGCAGGAG | TGAGTAAGTA |
1301 | AATAATTCAC | CAACAGGAAA | ACAAAACTCA | ATTATCTATA | GCTGAATACA |
1351 | CATGTAAATG | AGAATTTATT | AACTAAAACA | TCTTCCTTTG | TAACTGATGT |
1401 | GACATTTACA | ATTTTTCATT | TTGAGGTGTA | AGAACCGTGT | GACAAGTGAA |
1451 | AAGGTTAAAA | TAAGCAACCT | TTGTGATATT | TTCTCTCCAC | TTTTTGAAAT |
1501 | TGGGTCTCCA | AACCACAGCC | AATCAATATT | CTTTATAAAT | ACAAACACAC |
1551 | AAACAGCATC | TTTCTCTCAA | ACACAAACAT | ATCTTCTATC | AAACACCAAC |
1601 | AGCTCTATTC | TCTACCTCAT | TTCTCATCAT | AACAAAGAGA | GAGAAAAAAA |
1651 CT
Claims (30)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sekwencja kwasu nukleinowego określona jako Id. Sekw. Nr: 1 o nukleotydach 1-294 kodująca sekwencję zdolną do kierowania białka do plastydu roślinnego, lub sekwencje o 65% lub więcej identyczności z Id. Sekw. Nr: 1, które hybrydyzują z sekwencją z Id. Sekw. Nr: 1 w warunkach o umiarkowanej ostrości i które kodują sekwencję mającą taką samą zdolność kierowania.
- 2. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje do 94 aminokwasów.PL 205 558 B1
- 3. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że koduje do 85 aminokwasów.
- 4. Sekwencja kwasu nukleinowego określona jako Id. Sekw. Nr: 2 o nukleotydach 1-1662 i kodująca β-amylazę, lub sekwencje mające 65% lub więcej identyczności z Id. Sekw. Nr: 2 i które hybrydyzują z Id. Sekw. Nr: 2 w warunkach o umiarkowanej ostrości i które kodują β-amylazę.
- 5. Sekwencja kwasu nukleinowego określona jako Id. Sekw. Nr: 3 o nukleotydach 1-1953 i kodująca β-amylazę kierowaną do chloroplastów, albo sekwencje mające co najmniej 65% albo więcej identyczności z ujawnioną sekwencją w Id. Sekw. Nr: 3, które hybrydyzują z sekwencją Id. Sekw. Nr: 3, w warunkach o umiarkowanej ostrości i które kodują β-amylazę kierowaną do chloroplastu.
- 6. Sekwencja kwasu nukleinowego według zastrz. 1-5, znamienna tym, że jest sekwencją mRNA, cDNA lub sekwencją genomowego DNA.
- 7. Sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, znamienny tym, że obejmuje etapy stabilnego wprowadzania do genomu roślinnego genu chimerowego zawierającego sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję kierującą do plastydów określoną w zastrz. 1.
- 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że gen chimerowy ponadto zawiera sekwencję kodującą β-amylazę.
- 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że enzym jest nieplastydową β-amylazą.
- 10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że sekwencja kodująca jest sekwencją kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 4.
- 11. Sposób według zastrz. 8-10, znamienny tym, że obejmuje zwiększanie lub zmniejszanie aktywności β-amylazy w roślinie.
- 12. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że sekwencja kwasu nukleinowego obejmuje sekwencję kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 5.
- 13. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że obejmuje zregenerowanie rośliny o zmienionym genomie.
- 14. Sposób według zastrz. 7-13, znamienny tym, że gen chimerowy ponadto zawiera sekwencję kodującą enzym wybrany z grupy składającej się z syntazy sacharozowej, pirofosforylazy ADPG, syntazy skrobiowej, enzymu rozgałęziającego, α-amylazy, izoamylazy, nie-plastydowej β-amylazy, α-glukozydazy, fosforylazy skrobiowej i enzymu dysproporcjonującego.
- 15. Sposób według zastrz. 7-14, znamienny tym, że chimerowy gen ponadto zawiera promotor, którym jest sekwencja kwasu nukleinowego zdolna do kierowania ekspresją produktu kodowanego przez sekwencję kodującą, która jest z nią funkcjonalnie połączona, przy czym ta sekwencja kwasu nukleinowego jest określona jako Id. Sekw. Nr: 8 lub mająca z nią co najmniej 65% identyczności i ma tę samą funkcję, i odpowiada na bodziec, a poziom ekspresji takiego produktu zmienia się w odpowiedzi na bodziec stosowany wobec tej sekwencji kwasu nukleinowego.
- 16. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że gen chimerowy zawiera ponadto sekwencję kodującą białko lub enzym, które są jednym lub więcej elementami w szlaku z następującej grupy: synteza lipidów, fotosynteza, metabolizm aminokwasów, wiązanie azotu, wiązanie węgla lub synteza polimerów węglowodanowych; albo mają zdolność nadawania cech roślinom.
- 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że gen chimerowy obejmuje sekwencję kierującą białka lub enzymu do plastydu roślinnego.
- 18. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że nadawana cecha jest wybrana z następującej grupy: oporności na herbicydy i oporności na szkodniki.
- 19. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się roślinę, która już wykazuje zwiększenie lub zmniejszenie aktywności enzymatycznej w szlaku biosyntezy skrobi jako wynik transformacji genetycznej, a sposób i obejmuje zmianę dalszego enzymu w celu podwyższenia lub obniżenia poziomu enzymu, a tym samym zwiększenia lub zmniejszenia ilości skrobi wytworzonej przez retransformowaną roślinę, przy czym kolejnym enzymem jest kierowana do plastydu β-amylaza, która zawiera sekwencję Id. Sekw. Nr: 1.
- 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że β-amylaza kierowana do plastydu obejmuje Id. Sekw. Nr: 2.
- 21. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że pierwszą stransformowaną rośliną jest transgeniczny ziemniak transformowany genem pirofosforylazy adenozynodifosforano-glukozowej (ADPG-PPazy).
- 22. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że chimerowy gen ponadto zawiera promotor wybrany z grupy składającej się z promotora wirusa mozaiki kalafiora 35S (pełnego albo skróconego),PL 205 558 B1 promotora rubisco, promotora plastocyjaniny z grochu, promotora syntazy nopalinowej, promotora białka wiążącego chlorofil a/b, promotora gluteniny o wysokim ciężarze cząsteczkowym, promotora α, β-gliadyny, promotora hordeiny oraz promotora patatyny.
- 23. Sposób według zastrz. 8-13, znamienny tym, że sekwencja kodująca enzym w genie chimerowym dostarcza możliwości regulowania w górę albo w dół aktywności tego enzymu.
- 24. Gen chimerowy, znamienny tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 1.
- 25. Chimerowy gen, znamienny tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą sekwencję kierującą do plastydu określoną w zastrz. 1 i sekwencję kwasu nukleinowego kodującą enzym ze szlaku rozkładu skrobi, kodowany przez sekwencję określoną w zastrz. 4.
- 26. Gen chimerowy, znamienny tym, że zawiera sekwencję kwasu nukleinowego zdolną do kierowania ekspresją dalszej sekwencji kodującej, którą jest sekwencja określona w zastrz. 5.
- 27. Komórki roślinne, znamienne tym, że zawierają sekwencję kwasu nukleinowego określoną w zastrz. 1, 4, albo 5.
- 28. Nasiona transgenicznej rośliny, znamienne tym, że zawierają jedną albo więcej sekwencji kwasu nukleinowego określonych w zastrz. 1, 4 albo 5.
- 29. Rośliny transgeniczne, znamienne tym, że zawierają komórki roślinne określone w zastrz. 27.
- 30. Rośliny według zastrz. 29, znamienne tym, że są roślinami wybranymi z grupy składającej się z ziemniaków, pszenicy, kukurydzy, jęczmienia, pomidorów, ryżu, grochu, soi, orzeszków ziemnych, kasawy, słodkiego ziemniaka, bananów i tytoniu.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GBGB9817963.3A GB9817963D0 (en) | 1998-08-19 | 1998-08-19 | A plastid-targeting nucleic acid sequence and uses therefor |
GBGB9817959.1A GB9817959D0 (en) | 1998-08-19 | 1998-08-19 | A novel plastid-targeting nucleic acid sequence and a novel B-amylase sequence and uses therefor |
GBGB9913014.8A GB9913014D0 (en) | 1999-06-05 | 1999-06-05 | A plastid-targeting nucleic acid sequence,a stimulus-responsive promoter,and uses thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL346704A1 PL346704A1 (en) | 2002-02-25 |
PL205558B1 true PL205558B1 (pl) | 2010-05-31 |
Family
ID=27269441
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL346704A PL205558B1 (pl) | 1998-08-19 | 1999-08-13 | Sekwencja kwasu nukleinowego kierująca do plastydu, sekwencja kodująca β-amylazę, sposób wytwarzania rośliny transgenicznej, gen chimerowy, komórki roślinne, nasiona transgenicznej rośliny, rośliny transgeniczne |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US6489540B1 (pl) |
EP (1) | EP1105468B1 (pl) |
JP (2) | JP2002523040A (pl) |
CN (2) | CN1528904B (pl) |
AT (1) | ATE527346T1 (pl) |
AU (1) | AU773492B2 (pl) |
BR (1) | BR9914299A (pl) |
CA (1) | CA2336249C (pl) |
CZ (1) | CZ303574B6 (pl) |
ES (1) | ES2375034T3 (pl) |
HU (1) | HU228696B1 (pl) |
MX (1) | MXPA01001815A (pl) |
NZ (1) | NZ509642A (pl) |
PL (1) | PL205558B1 (pl) |
SK (1) | SK288125B6 (pl) |
TR (1) | TR200100625T2 (pl) |
WO (1) | WO2000011144A2 (pl) |
ZA (1) | ZA200100736B (pl) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP3546337B2 (ja) * | 1993-12-21 | 2004-07-28 | ゼロックス コーポレイション | 計算システム用ユーザ・インタフェース装置及びグラフィック・キーボード使用方法 |
TR200100625T2 (tr) | 1998-08-19 | 2001-06-21 | Advanced Technologies (Cambridge) Limited | Nükleik asit serisini hedefleyen yeni plastidlerin kullanımları |
EP1389902A4 (en) | 2001-02-22 | 2005-01-05 | Pioneer Hi Bred Int | MANIPULATION OF SACCHAROSESYNTHASE GENES TO IMPROVE THE STEM AND CORN QUALITY |
JP2004535789A (ja) * | 2001-04-25 | 2004-12-02 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フォルデルング デル ヴィッセンシャフテン エー.ファウ. | デンプン分解酵素をコードする核酸分子 |
AR036370A1 (es) * | 2001-08-27 | 2004-09-01 | Syngenta Participations Ag | Plantas con auto-procesamiento y partes de las mismas |
WO2004040999A1 (en) * | 2002-11-08 | 2004-05-21 | Bayer Cropscience Gmbh | Process for reducing the acrylamide content of heat-treated foods |
JP2007151435A (ja) * | 2005-12-02 | 2007-06-21 | Niigata Univ | デンプン集積能力の高い形質転換植物およびその製造方法 |
CN101910404A (zh) | 2007-11-05 | 2010-12-08 | 先正达参股股份有限公司 | 提高植物淀粉含量的方法 |
US20120054915A1 (en) * | 2009-02-25 | 2012-03-01 | Syngenta Participations Ag | Methods for increasing starch content in plant cobs |
US9598700B2 (en) | 2010-06-25 | 2017-03-21 | Agrivida, Inc. | Methods and compositions for processing biomass with elevated levels of starch |
MX358759B (es) | 2010-06-25 | 2018-09-04 | Agrivida Inc | Plantas con niveles alterados de almidon vegetativo. |
US10443068B2 (en) | 2010-06-25 | 2019-10-15 | Agrivida, Inc. | Plants with engineered endogenous genes |
WO2015021600A1 (en) * | 2013-08-13 | 2015-02-19 | Danisco Us Inc. | Beta-amylase and methods of use |
CN104232681B (zh) * | 2014-09-28 | 2017-02-15 | 浙江大学 | 一种植物表达载体及在制备磷酸化改性水稻淀粉中的应用 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5034323A (en) | 1989-03-30 | 1991-07-23 | Dna Plant Technology Corporation | Genetic engineering of novel plant phenotypes |
US5391725A (en) * | 1989-12-08 | 1995-02-21 | New York University Medical Center | Organ-specific plant promoter sequences |
US5451513A (en) * | 1990-05-01 | 1995-09-19 | The State University of New Jersey Rutgers | Method for stably transforming plastids of multicellular plants |
US5349123A (en) * | 1990-12-21 | 1994-09-20 | Calgene, Inc. | Glycogen biosynthetic enzymes in plants |
EP0536293B1 (en) | 1990-06-18 | 2002-01-30 | Monsanto Technology LLC | Increased starch content in plants |
US5750876A (en) * | 1994-07-28 | 1998-05-12 | Monsanto Company | Isoamylase gene, compositions containing it, and methods of using isoamylases |
GB9522589D0 (en) * | 1995-11-03 | 1996-01-03 | Innes John Centre | Modified plants and plant products |
CZ133598A3 (cs) | 1996-09-03 | 1998-10-14 | Plant Genetic Systems, N. V. | Molekula DNA, rostlinná buňka a rostlina |
TR200100625T2 (tr) | 1998-08-19 | 2001-06-21 | Advanced Technologies (Cambridge) Limited | Nükleik asit serisini hedefleyen yeni plastidlerin kullanımları |
-
1999
- 1999-08-13 TR TR2001/00625T patent/TR200100625T2/xx unknown
- 1999-08-13 AT AT99940330T patent/ATE527346T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-08-13 ES ES99940330T patent/ES2375034T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-13 CZ CZ20010460A patent/CZ303574B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1999-08-13 CN CN2004100074054A patent/CN1528904B/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-13 JP JP2000566401A patent/JP2002523040A/ja active Pending
- 1999-08-13 CN CNB998123005A patent/CN1234868C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-13 SK SK204-2001A patent/SK288125B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1999-08-13 HU HU0200732A patent/HU228696B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1999-08-13 CA CA2336249A patent/CA2336249C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-08-13 AU AU54326/99A patent/AU773492B2/en not_active Ceased
- 1999-08-13 PL PL346704A patent/PL205558B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1999-08-13 MX MXPA01001815A patent/MXPA01001815A/es not_active IP Right Cessation
- 1999-08-13 NZ NZ509642A patent/NZ509642A/en not_active IP Right Cessation
- 1999-08-13 WO PCT/GB1999/002697 patent/WO2000011144A2/en active IP Right Grant
- 1999-08-13 EP EP99940330A patent/EP1105468B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-08-13 BR BR9914299-6A patent/BR9914299A/pt not_active Application Discontinuation
- 1999-08-16 US US09/375,140 patent/US6489540B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-01-25 ZA ZA2001/00736A patent/ZA200100736B/en unknown
-
2002
- 2002-09-30 US US10/261,189 patent/US20030074690A1/en not_active Abandoned
-
2010
- 2010-02-12 JP JP2010028677A patent/JP4673431B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU5432699A (en) | 2000-03-14 |
ES2375034T3 (es) | 2012-02-24 |
SK288125B6 (sk) | 2013-10-02 |
JP2010131029A (ja) | 2010-06-17 |
ZA200100736B (en) | 2002-06-26 |
JP2002523040A (ja) | 2002-07-30 |
NZ509642A (en) | 2003-08-29 |
CZ303574B6 (cs) | 2012-12-19 |
JP4673431B2 (ja) | 2011-04-20 |
WO2000011144A3 (en) | 2000-09-08 |
ATE527346T1 (de) | 2011-10-15 |
CN1528904A (zh) | 2004-09-15 |
AU773492B2 (en) | 2004-05-27 |
BR9914299A (pt) | 2001-11-27 |
HU228696B1 (en) | 2013-05-28 |
PL346704A1 (en) | 2002-02-25 |
TR200100625T2 (tr) | 2001-06-21 |
CN1323349A (zh) | 2001-11-21 |
SK2042001A3 (en) | 2002-01-07 |
WO2000011144A2 (en) | 2000-03-02 |
CA2336249A1 (en) | 2000-03-02 |
EP1105468B1 (en) | 2011-10-05 |
HUP0200732A3 (en) | 2004-10-28 |
US20030074690A1 (en) | 2003-04-17 |
CA2336249C (en) | 2011-03-08 |
CZ2001460A3 (cs) | 2001-11-14 |
US6489540B1 (en) | 2002-12-03 |
MXPA01001815A (es) | 2002-06-21 |
HUP0200732A2 (hu) | 2002-07-29 |
EP1105468A2 (en) | 2001-06-13 |
CN1528904B (zh) | 2010-05-26 |
CN1234868C (zh) | 2006-01-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4673431B2 (ja) | 新規のプラスチドターゲティング核酸配列、新規のβ−アミラーゼ配列、刺激反応性プロモーター、およびその使用 | |
AU656920B2 (en) | Transgenic plants having a modified carbohydrate content | |
RU2129609C1 (ru) | СПОСОБ КАТАЛИЗА РЕАКЦИИ ФЕРМЕНТАЦИИ СУБСТРАТА, СПОСОБ УЛУЧШЕНИЯ ПОТРЕБЛЕНИЯ ПИЩЕВОГО РАЦИОНА ЖИВОТНЫМ, ПЛАЗМИДА pMOG413, ПЛАЗМИДА pMOG429 И ПЛАЗМИДА pMOG227 | |
US5436394A (en) | Plasmid for the preparation of transgenic plants with a change in habit and yield | |
JPH09510342A (ja) | 植物プラスチドにおけるトランスジェニック構造体の制御された発現 | |
JPH05236971A (ja) | 習性及び収量において変更されたトランスジェニック植物を作製するプラスミド | |
AU715002B2 (en) | Transgenic plants with improved biomass production | |
US6284956B1 (en) | Plant selectable marker and plant transformation method | |
CA2248023A1 (en) | Process for the production of degradation and/or conversion products of storage substances present in transgenic plant material with the help of a malting process | |
US5917127A (en) | Plasmids useful for and methods of preparing transgenic plants with modifications of habit and yield | |
JPH05507626A (ja) | トランスジェニック植物におけるシクロデキストリンの生産 | |
AU2001276398B2 (en) | Transgenic plants which produce isomalt | |
US20030028925A1 (en) | Plant selectable marker and plant transformation method | |
EP1458878B1 (en) | Method of increasing the transgene-coded biomolecule content in organisms | |
US7728192B2 (en) | Process for converting storage reserves of dicotyledonous seeds into compositions comprising one or more gene products | |
Koivu | Novel sprouting technology for recombinant protein production |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20140813 |