JP2002523040A - 新規のプラスチドターゲティング核酸配列、新規のβ−アミラーゼ配列、刺激反応性プロモーター、およびその使用 - Google Patents
新規のプラスチドターゲティング核酸配列、新規のβ−アミラーゼ配列、刺激反応性プロモーター、およびその使用Info
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Abstract
Description
すると推定される多数の酵素が単離および特徴付けられているのにも関わらず、
知られていない。
合成を必要とするのを満たすために使用される。このいわゆる一過性デンプンが
動員される機構は十分に理解されていないが、合成酵素および分解酵素の活性を
協調して調節するのに違いない。葉組織における主要な分解経路は、加リン酸分
解活性および加水分解活性、特に、α−グルコシダーゼ(E.C.3.2.1.
3.)(NielsonおよびStitt,1997)が関与することが考えら
れる。
に蓄積される。この場合、デンプンは長期間にわたって貯蔵され、デンプンの動
員に付随して、貯蔵器官組織の退化ならびにデンプン分解活性および加リン酸分
解活性の増加が起こる。しかしながら、デンプン代謝回転は貯蔵器官のアミロプ
ラストでも起こっていることを示唆する証拠がある(Sweetloveら,1
996)。これもまた、合成酵素活性および分解酵素活性を協調して調節するこ
とを必要とする。
れぞれ葉および貯蔵器官におけるデンプン合成の場であることの他に、共通の特
徴が多数ある。葉緑体は、アミロプラストおよび他の型のプラスチドに変わるこ
とができる(ThomsonおよびWhatley,1980)。
コシル単位からなる直鎖であるアミロースと、α−1,6グリコシド結合により
結合した多数のα−1,4−ポリグルカン直鎖からなるアミロペクチンの混合物
である。
7.7.21)、デンプン合成酵素(E.C.2.4.1.21)、および分枝
酵素(E.C.2.4.1.18)である。ADPGピロホスホリラーゼは基質
ADPGの供給を担い、この分子は、デンプン合成酵素(α−1,4結合)およ
び分枝酵素(α−1,6結合)の共同作用により結合されるグルコースモノマー
供与体として働く。
ペクチン分子と、空間を充填する直線状アミロース分子とが密に束ねられること
により形成されると考えられる。
2.1.68)、β−アミラーゼ(E.C.3.2.1.2)、α−グルコシダ
ーゼ(E.C.3.2.1.3)、デンプンホスホリラーゼ(E.C.2.4.
1.1)、および不均化酵素(E.C.2.4.1.25)を含む、多種のデン
プン分解酵素活性が報告されている。これらの酵素活性の多くは植物において複
数形態で存在し、デンプン合成に関与すると考えられているものもある。恐らく
、ある程度、全ての酵素がデンプン動員プロセスに関与しているが、それらの正
確な役割および可能な相互作用はまだ決定されていない。様々な酵素の役割を考
える難しさは、植物におけるデンプン分解を主に担うと考えられる2つの酵素活
性:デンプンホスホリラーゼとアミラーゼを言及することで最もよく例示される
。
ン酸の可逆的放出を触媒する。2つの形態のデンプンホスホリラーゼが植物組織
に見出される。Pho1すなわちL型はプラスチド内にあり、マルトデキストリ
ンに対する親和性が高い。Pho2すなわちH型はサイトゾルにあり、グリコー
ゲンなどの大きな、非常に枝分かれしたポリグルカンに対する親和性が高い。プ
ラスチド型Pho1酵素は、デンプン動員に関与する有望な候補であるが、この
葉酵素活性がアンチセンスにより阻害されても、トランスジェニックジャガイモ
植物の葉におけるデンプン蓄積には影響しなかった(Sonnewaldら,1
995)。別の研究では、細胞質Pho2がアンチセンスにより阻害されると、
トランスジェニックジャガイモ塊茎の発芽行動に影響したが、デンプン蓄積およ
び分解には影響しなかった(Duwenigら、1997)。
ミロペクチンのα−1,4−グルコシド結合を加水分解する。α−アミラーゼは
非末端結合に対してランダムに作用するが、β−アミラーゼは、ポリグルカン鎖
の非還元末端から始まるマルトース単位を放出するように作用する。植物細胞の
アポプラスト空間におけるα−アミラーゼの亜細胞位置は、この酵素が正常に分
泌されたことを反映していると考えられる。しかしながら、多数のα−アミラー
ゼタンパク質のアミノ末端シグナル配列がプラスチド膜ではなくER膜を通るタ
ンパク質移動を示すという知見にもかかわらず(Chenら,1994)、イネ
(Chenら,1994)およびテンサイ(Liら,1992)などの多数の植
物では、この酵素は葉緑体およびアミロプラスト内にも位置する。イネα−アミ
ラーゼ遺伝子のプロモーターおよびシグナル配列を細菌GUS遺伝子と融合し、
アグロバクテリウム媒介形質転換を用いてイネ、タバコ、およびジャガイモに導
入した研究(Chenら,1994)では、発現したGUS融合タンパク質は最
初に小胞体に輸送され、次いで、トランスジェニック細胞からなる懸濁培養物の
培地に出されることが証明された。α−アミラーゼは未変性デンプン分子を分解
することが多数の研究で示されている。
なければ、β−アミラーゼは未変性デンプン粒を分解しないことがわかっている
。活性β−アミラーゼを欠いているか、または微量の活性しかないライムギ変異
体(Daussantら,1981)およびダイズ変異体(Hildebran
dおよびHymowitz,1981)はそれぞれ、見たところ正常な成長およ
び発育を示す。さらに、β−アミラーゼレベルが著しく減少したトランスジェニ
ックシロイヌナズナ植物は、ひどい成長異常を示さない(Mitaら,1997
)。植物におけるβ−アミラーゼの正確な生理学的役割を明らかにする試みは、
亜細胞位置に関する不確かなデータにより妨げられている。ある研究(Kake
fudaら,1986)によりエンドウ葉緑体には2種類のβ−アミラーゼが存
在することが報告されたが、ソラマメ、オオムギ、コムギ、ダイズ、サツマイモ
、およびエンドウなどの種に関係する大多数の研究では、全てではないがほとん
どのβ−アミラーゼ活性は葉緑体外にある(Nakamuraら,1991)。
この考えは、現在までクローニングされた全てのβ−アミラーゼ遺伝子が、アミ
ノ末端葉緑体トランジットペプチド配列を欠くタンパク質をコードするというこ
とにより支持される。
;発芽中にイネおよびトウモロコシのアリューロン細胞においてデノボ合成され
る形態(Wangら,1996;1997);ならびに栄養器官に遍在するβ−
アミラーゼが記載されている。シロイヌナズナでは、この遍在形態はロゼット葉
の総デンプン分解活性の約80%を占める。現在までクローニングされた他の全
てのβ−アミラーゼと共通して、遍在シロイヌナズナ β−アミラーゼの遺伝子
は、亜細胞ターゲティングシグナルを有するタンパク質をコードせず、従って、
この酵素はサイトゾルに位置するらしい。
いう多数の研究からの知見と、プラスチド外にあるデンプン分解酵素の亜細胞位
置は驚くべきことである。β−アミラーゼ活性の予想される主要な最終産物、す
なわちマルトースが、単離葉緑体においてデンプン分解産物として同定されたこ
とを考慮すれば、β−アミラーゼ活性がプラスチドに明らかにないことは特に驚
くべきことである(Peaveyら,1977)。さらに最近では、グルコース
とマルトースが、デンプン動員プロセス中に、単離されたカリフラワー芽アミロ
プラストから出されることが示された(Neuhausら,1995)。
プンを利用する様々な工業プロセスに非常に有利であろう。例えば、ジャガイモ
塊茎のデンプン含有量を増加させようとして、E.coli ADPG PPa
se glgC16をトランスジェニックジャガイモ塊茎において過剰発現させ
ると、デンプンへの炭素フラックスは増加するが、デンプンの正味蓄積は少しし
か増加しないことが、以前に示された(Sweetloveら,1997)。過
剰発現系統における酵素活性の分析から、ADPG PPaseが変化した以外
に、アミラーゼ(特に、β−アミラーゼ)活性もまた変化したことがわかった。
このデータから、glgC16タンパク質を過剰発現する塊茎におけるデンプン
蓄積は、新たに合成されたデンプンの分解により妨げられる、すなわち、デンプ
ンが代謝回転されることが示唆される。
分解酵素活性の型および量と密接に相関する。前記作物の分解能が増加すると、
穀粒の麦芽形成、あるいは塊茎または他の貯蔵器官に由来するデンプンからアル
コールへの変換がより効率的かつ生産的になる。
合成酵素、分枝酵素、および存在する分解酵素の形態および活性による。様々な
酵素間の相互作用もまた重要である。
、この新規デンプン産生により、食品、製紙、製薬、接着剤、油、および繊維な
どの様々な産業で使用する前にデンプンを加工および改良する費用が削減される
からである。以下の例は、どのくらいデンプン加水分解活性が、インビボでのデ
ンプン構造の改変に重要であるのかを示す。
ルコシル結合を加水分解する脱分枝酵素がなくなることが示されている(Jam
esら,1995)。この変異は、アミロペクチン濃度と、非常に枝分かれのあ
るグルコポリサッカライドであるフィトグリコーゲンの蓄積の低下をもたらす。
を付加する短いオリゴ糖分子は、アミロース合成を担う主要酵素であると一般に
認められているデンプン粒結合型デンプン合成酵素I(GBSSI)(Deny
erら,1996)の活性を特異的に刺激することが示されている(例えば、v
an der Leijら,1991;Hyltonら,1995;Ainsw
orthら,1993)。マルト−オリゴ糖の供給制御によるGBSSI活性の
操作は、最近の特許(WO97/16554)の主題であり、分解酵素、すなわ
ち、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、不均化酵素、脱分枝酵素、およびデンプ
ンホスホリラーゼを導入することにより、マルト−オリゴ糖濃度を増加すること
ができ、従って、デンプン中のアミロースとアミロペクチンの比を増加すること
ができることを示唆する。特許WO97/16554はまた、これらの酵素のプ
ラスチド型アイソフォームがクローニングされたことについて述べている。しか
しながら、上記のように、現在まで単離されたβ−アミラーゼ遺伝子は、タンパ
ク質ターゲティング配列を有するβ−アミラーゼ酵素をコードせず、さらに、α
−アミラーゼが初めからプラスチドに標的化されたことについては疑問がある(
Chenら,1994;Chanら,1994)。WO97/16554のもっ
と後になって、プラスチドターゲティング配列を付加するための適切なβ−アミ
ラーゼcDNA配列の操作が言及される。
上、非常に重要である。デンプンは、昼間、葉において、光合成中に固定された
炭素から合成される。デンプンは葉緑体に貯蔵され、夜間に分解されて、植物の
エネルギー源および代謝中間体になる。ソース−シンク関係が制御される機構は
現在未知であるが、葉プラスチド中のデンプンの量および利用率が、植物生産性
(バイオマスおよび収穫量)にかなり影響を及ぼすことは明らかである。
に重要である。デンプン含有量は、喫煙した時のタバコの最終的なフレーバーに
影響を及ぼすことが知られている。タバコ葉中のデンプン量を操作する手段の条
項は、タバコ産業が関心を持つ可能性がある。
チドに標的化される新規のβ−アミラーゼ酵素(今後、葉緑体標的化(ct)β
−アミラーゼとして知られる)をコードするcDNAの単離について述べる。こ
の全コード配列の単離は驚くべきことである。なぜなら、β−アミラーゼは、プ
ラスチドから細胞質への移動または膜破壊により、さらに小さなポリグルカン断
片を放出したデンプンの加水分解のみに関与すると一般に考えられていたからで
ある。この酵素がプラスチドに存在するので、ct β−アミラーゼは、葉緑体
にある一過性デンプンとアミロプラストにある貯蔵デンプンの分解に関与してい
る意外な可能性がある。
ey,1980)は本発明と関連している。なぜなら、葉緑体標的化ポリペプチ
ドに由来するトランジットペプチドが異種ポリペプチドをアミロプラストに運ぶ
ことができ、逆もまた同様であることが示されたからである。例えば、トウモロ
コシデンプン粒結合型デンプン合成酵素に由来するトランジットペプチドは、E
.coli β−グルクロニダーゼ(GUS)タンパク質に融合された場合、G
USタンパク質をアミロプラストだけではなく葉緑体にも運ぶ(Klosgen
およびWeil,1991)。
およびトランスジェニックタバコにおけるct−Bmyプロモーター:GUS融
合の発現は、光およびスクロースにより独立して調節することができることを示
す。このことは、シロイヌナズナ ATβ−Amyの密接に結びついた光および
糖誘導反応を考えると、驚くべきことである(Mitaら,1995)。
であり、かつ前記ヌクレオチド中に、さらなるコード配列を植物プラスチドに標
的化することができる配列を有する核酸配列、または開示された配列である配列
番号1と少なくとも65%以上相同であり、かつ同じ標的化能力を有する配列を
提供する。
のアミノ酸残基をコードすることがより好ましい。
オチドであり、かつ前記ヌクレオチド中に、β−アミラーゼをコードすることが
できる配列を有する核酸配列、または配列番号2内の開示された配列と少なくと
も65%以上相同であり、かつ同じコード能力を有する配列を提供する。
オチドであり、かつ前記ヌクレオチド中に、葉緑体標的化β−アミラーゼをコー
ドすることができる配列を有する核酸配列、または配列番号3内の開示された配
列と少なくとも65%以上相同であり、かつ同じコード能力を有する配列を提供
する。
で洗浄)、配列番号1、配列番号2、または配列番号3にハイブリダイズする配
列もまた挙げられる。
もよい。
て増加または減少させる方法を提供する。前記方法は、プラスチドターゲティン
グ配列をコードする核酸配列とデンプン生合成経路または分解経路の酵素のコー
ド配列とを含むキメラ遺伝子を植物ゲノムに安定に組み込ませるステップと、改
変したゲノムを有する植物を再生するステップを含む。
供する。前記方法は、プラスチドターゲティング配列をコードする核酸配列とタ
ンパク質または酵素のコード配列とを含むキメラ遺伝子を植物ゲノムに安定に組
み込ませるステップと、改変したゲノムを有する植物を再生するステップを含む
。前記タンパク質または酵素は、1以上の下記の群:脂質合成、光合成、アミノ
酸代謝、窒素固定、炭素固定、または炭水化物ポリマー合成の経路であるか、あ
るいは前記植物にある特徴を付与することができる。前記特徴は、1以上の下記
の群:除草剤抵抗性および有害生物抵抗性(例えば、真菌抵抗性、細菌抵抗性、
またはウイルス抵抗性を含む)から選択される。
核酸コード配列と、ターミネーターとを含むキメラ遺伝子を有する植物を提供す
る。前記配列は、デンプン生合成経路または分解経路の酵素のコード配列を植物
プラスチドに標的化することができる。
記産物は、前記核酸配列に作動可能に連結されたコード配列によりコードされる
。前記核酸配列は、本明細書では配列番号8として知られるか、あるいは配列番
号8と少なくとも65%相同であり、かつ配列番号8と実質的に同じ機能を有す
る。前記核酸配列は刺激反応性であり、前記産物の発現レベルは、前記核酸配列
に適用された刺激に応じて変化する。
、植物において産物の発現を指向することができる核酸配列に作動可能に連結さ
れたコード配列によりコードされる。前記方法は、産物の発現を指向することが
できる核酸配列を含むキメラ遺伝子を植物ゲノムに安定に組み込ませるステップ
を含む。前記産物は、前記核酸配列に作動可能に連結されたコード配列によりコ
ードされる。前記核酸配列は、配列番号8の配列を実質的に有するか、または配
列番号8と少なくとも65%相同であり、かつ配列番号8と実質的に同じ機能を
有し、刺激反応性である。
とが好ましい。あるいは、前記刺激は、発育段階により制御される刺激である。
る核酸配列は、光をうけていないが糖が存在する条件下で作動可能であるか、ま
たは糖は存在しないが光をうけている条件下で作動可能であることが有利である
。光をうけていないが糖が存在する植物組織は、地下器官またはシンク器官が適
切であり得る。地下器官は、例えば、塊茎、根茎、または根でもよいが、他のシ
ンク器官は若い葉または種子でもよい。
花の部分、または発芽中の種子である。
である。
経路または分解経路の酵素の核酸コード配列とを含むキメラ遺伝子を含む植物細
胞、さらなるコード配列の発現を指向することができる核酸配列を含むキメラ遺
伝子を含む植物細胞、または刺激反応性の上記の核酸配列とコード配列とを含む
キメラ遺伝子を含み、前記コード配列の発現レベルが前記核酸配列に適用された
刺激に応じて変化する植物細胞、本発明による1以上のキメラ遺伝子を含む形質
転換植物の種子もまた、本発明の態様である。
る。
、または葉から動員されるように葉の代謝を改変することができる。このプロセ
スは、全体的に植物内のソース−シンク関係を改変する。これは、適切なプロモ
ーターの制御下にある、ターゲティング配列とデンプン生合成経路または分解経
路の酵素の核酸コード配列を作成することにより達成することができる。適切な
プロモーターを選択すると、葉中のデンプン量が増加または減少した植物(例え
ば、これはタバコ産業で有用であり得る)が得られるか、あるいは、植物のソー
ス−シンク関係を改善した後に、様々な他の植物組織(例えば、塊茎、果実、お
よび根)のデンプン収量が変化する。
配列とデンプン生合成経路酵素または分解経路の酵素のコード配列との発現を植
物全体で指向するか(いわゆる構成的発現)、あるいは特異的に葉に指向する。
これらの変化は著しい影響を及ぼし、植物器官のデンプン含有量および/または
収量がかなり変化する。
ターは、カリフラワーモザイクウイルス35S遺伝子から得られるプロモーター
である。葉での発現に好ましいプロモーターは、リブロースビスリン酸カルボキ
シラーゼ小サブユニット遺伝子またはエンドウプラストシアニン遺伝子から得る
ことができる。当業者であれば、構成的発現および葉特異的発現に適切な他のプ
ロモーター(例えば、それぞれ、ノパリン合成酵素プロモーターおよびクロロフ
ィルa/b結合タンパク質プロモーター)を認識するであろう。
常なリーディングフレーム方向(すなわち、センス)で配置してもよいし、逆の
リーディングフレーム方向(すなわち、アンチセンス)で配置してもよい。セン
ス、またはアンチセンス、またはコサプレッション技術(最後の技術は、DNA
Pにより欧州特許第0465572号および同第0647715号において説明
される)を用いた、植物における酵素活性のアップレギュレーションまたはダウ
ンレギュレーションを用いて、植物デンプンを変えることができる。
かつ/またはデンプンが特定の工業プロセスに必要とされる適切な形態で得られ
るように、貯蔵器官におけるデンプン代謝を変えることができる。このようなプ
ロセスとして、製紙;医薬品、繊維、染料、および建築用品の製造;天火焼き製
品、乳製品、およびスナック食品の供給;缶詰製品、乾燥食品、またはインスタ
ント食品の製造;穀粒の麦芽形成ならびにシロップおよびアルコールの製造が挙
げられる。
選択される酵素は、デンプン分解経路に由来する酵素(すなわち、デンプン分解
酵素)でもよい。キメラ遺伝子は、葉緑体標的化β−アミラーゼ(以下、ct
β−アミラーゼとして知られる)を含むことが有利であり、シロイヌナズナに由
来するct β−アミラーゼ(以下、At ct β−アミラーゼとして知られ
る)(配列番号3を参照のこと)を含むことがより好ましい。ジャガイモ、タバ
コ、コムギ、トウモロコシ、およびオオムギなどの他の植物供給源から得ること
ができる、At ct β−アミラーゼと相同な配列もまた使用することができ
る。ハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術による
クローニングの標準的な方法、例えば、Sambrookら(1989)に記載
される技術およびInnesら(1990)に記載されるPCR技術などの分子
クローニング技術を用いて、このような生物から配列を単離することができる。
他のデンプン分解酵素として、α−アミラーゼ、不均化酵素、脱分枝酵素、デン
プンホスホリラーゼ、α−グルコシダーゼ、および非プラスチド型β−アミラー
ゼが挙げられる。前記酵素の1以上のコード配列がプラスチドターゲティング配
列との併用に適する。
ターを、例えば、以下のリストからの遺伝子から選択することができる:コムギ
内胚乳高分子量グルテニン遺伝子、コムギ内胚乳α,β−グリアジン遺伝子、オ
オムギ内胚乳ホルデイン遺伝子、またはジャガイモ塊茎パタチン遺伝子。他の適
切なプロモーターは当業者に周知である。
の変化を、本明細書に記載の誘導性プロモーター(配列番号8)を用いることに
よって、刺激反応性、すなわち、誘導性にすることができる。例えば、光誘導性
の誘導性プロモーターは、Barnase(特許WO98/10081に例示さ
れる)などの遺伝子の誘導により花粉発育に影響を及ぼすように種子を操作する
ために、または果実追熟および種子発芽などの光依存性プロセスにおいて非光反
応性遺伝子に影響を及ぼすために使用することができる。光誘導性プロモーター
はまた、葉での二次代謝産生(例えば、アルカロイド産生)に影響を及ぼす遺伝
子を活性化するために使用することができる。光誘導性プロモーターはまた、葉
または他の光合成組織においてデンプン生合成酵素遺伝子を操作するために、あ
るいは塊茎を例えば暗所貯蔵から取り出した後に遺伝子を活性化するために使用
することができる。糖誘導性の誘導性プロモーターは、例えば、発育中の塊茎ま
たは他の非光合成組織において、有害生物耐性遺伝子および/または収穫後の作
物の品質に影響を及ぼすことが可能な遺伝子などの遺伝子を調節するために使用
することができる。ジャガイモでは、胴枯れ病、黒脚病、および乾腐病に対する
耐性遺伝子は特に有益であり、糖誘導性プロモーターを有する組換え遺伝子にク
ローニングできることが最も有利である。あるいは、糖誘導性の誘導性プロモー
ターは、組織培養プロセスにおいて選択マーカー遺伝子を発現させるために使用
することができる。
誘導性反応性エレメントおよび/または光誘導性反応性エレメントを容易に示す
ことができる。PweeおよびGray(1993)は、エンドウプラストシア
ニン遺伝子の作動可能な領域を決定するために、この遺伝子内での、マーカー遺
伝子を用いたこのような欠失試験について記載している。
スミドなど)に挿入するための、本明細書に記載の方法、あるいは、例えば、S
ambrookら(1989)ならびにGelvinおよびStanton(1
995)による実験マニュアルに記載の方法は、このような概念を実行に移す当
業者に周知の技術である。上記の1以上のキメラ遺伝子を単独で導入してもよい
し、1以上の他のキメラ遺伝子(例えば、1以上の上記の他の遺伝子)と共に導
入してもよい。デンプン分解経路の酵素をコードする第1のキメラ遺伝子を用い
る上記の実施態様の場合、第2のキメラ遺伝子は、例えば、デンプン生合成経路
の酵素をコードする核酸配列(この配列もまた、適切なプロモーターおよび適切
なターミネーターの制御下にある)を含んでもよい。第2のキメラ遺伝子のプロ
モーターおよび/またはターミネーターは、第1のキメラ遺伝子のプロモーター
および/またはターミネーターと同じでもよいし、異なっていてもよい。デンプ
ン生合成経路の酵素をコードする適切な配列は、スクロース合成酵素、ADPG
ピロホスホリラーゼ、デンプン合成酵素の核酸配列であり、分枝酵素、α−アミ
ラーゼ、イソアミラーゼ、非プラスチド型β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ
、デンプンホスホリラーゼ、および不均化酵素も含み得る。
に結合したキメラ遺伝子を有するバイナリーベクターを構築すること、例えば、
異なるキメラ遺伝子を含む異なるバイナリベクターを有する2以上の異なるアグ
ロバクレリウム細胞を用いて同時形質転換するか、または、キメラ遺伝子を既に
有する植物を第2の異なるキメラ遺伝子で形質転換(すなわち、再形質転換)す
ることを含む。後者の場合、第2のキメラ遺伝子を導入した後の、トランスジェ
ニック植物の選択方法は、第1のキメラ遺伝子の導入に用いた選択方法とは異な
らなければならない。適切な選択マーカーとして、ハイグロマイシン、カナマイ
シン、スルホンアミド、およびBasta耐性マーカーが挙げられる。各植物が
単一のキメラ遺伝子を含む2つの植物を交配するなど、生物学的方法もまた使用
することができる。
転換されている植物のデンプン含有量を変えるために、2つのキメラ遺伝子構築
物を使用することができる。
ートし、それにより再形質転換植物により産生されるデンプン量を増加または減
少させるために、トランスジェニック植物(この植物では、遺伝的形質転換の結
果としてある酵素活性が既に増加または減少している)において、さらなる酵素
を変える方法をさらに提供する。
である。植物のデンプン含有量を増加させる試みの例は、ADPG−PPase
遺伝子、例えば、glgC16(例えば、WO91/19806を参照のこと)
で形質転換されたトランスジェニックジャガイモである。このような植物のデン
プン増加量は比較的少ない。この第1の形質転換植物は、デンプン分解酵素のキ
メラ遺伝子(例えば、At ct β−アミラーゼを含むことが適する)で再形
質転換されることが有利である。glgC16タンパク質は第1の形質転換塊茎
で発現し、ADPG−PPase活性増加およびデンプンへの炭素フラックスの
増加をもたらす。再形質転換塊茎においてキメラAt ct β−アミラーゼ遺
伝子またはその一部を発現させると、ct β−アミラーゼ活性がダウンレギュ
レートされ(すなわち、コサプレッションまたはアンチセンス技術)、従って、
デンプン蓄積が増加する。
ラーゼキメラ遺伝子の発現を塊茎に指向するのに適したプロモーターは、パタチ
ン遺伝子に由来するプロモーターである。
あり、従って、At ct β−アミラーゼキメラ遺伝子用のバイナリーベクタ
ー構築物は異なる耐性遺伝子を有し、例えば、スルホンアミド耐性遺伝子が適切
である。ジャガイモ乾物が1%増加すると製品が4%増加するので、ジャガイモ
塊茎のデンプン産生増加は、例えば、ポテトチップス製造業者に有益であろう。
イモ塊茎を8℃以下の温度で貯蔵すると、デンプン分解により還元糖であるグル
コースおよびフルクトースが蓄積する。このジャガイモをポテトチップスにする
ために油で揚げると、メイラード反応により還元糖はアミノ酸と反応して、製品
は茶色になり、味がまずくなる。デンプン破壊を妨げ、従って、還元糖の蓄積を
妨げるキメラ遺伝子をジャガイモ植物に導入することは、スナック食品産業に有
益であろう。このキメラ遺伝子は、コサプレッションまたはアンチセンス構築物
中に、適切なプロモーターおよびターミネーターで駆動される、ct β−アミ
ラーゼのコード配列またはその配列の一部を含むことが好ましい。適切なプロモ
ーターは、ジャガイモ塊茎パタチン遺伝子から得られる。有利にも、ct β−
アミラーゼの代わりに、上記の他のどのデンプン分解酵素も使用できる。
ロモーターがスクロース誘導性でもあるので(Rocha−Sosaら(198
9))、配列番号8の誘導性プロモーターもまた前記構築物に使用することがで
きる。同様に、配列番号1の葉緑体ターゲティングポリペプチド配列もまた、自
身のターゲティング配列を欠き、かつプラスチドに指向されることが必要な他の
任意の遺伝子と併用することができる。
れば、遺伝子の組み合わせと本発明を適用することができる植物とが多数あるこ
とを認識するであろう。
スクロース合成酵素、ADPGピロホスホリラーゼ、デンプン合成酵素、分枝酵
素、α−アミラーゼ、イソアミラーゼ、非プラスチド型β−アミラーゼ、α−グ
ルコシダーゼ、デンプンホスホリラーゼ、および不均化酵素の遺伝子とが挙げら
れる。上記遺伝子の配列は当業者に周知である。あるいは、ct β−アミラー
ゼに由来するターゲティング配列を、1以上の上記遺伝子と併用してもよい。
ギ、トウモロコシ、オオムギ、トマト、イネ、エンドウ、ダイズ、ラッカセイ、
キャッサバ、ヤムイモ、バナナ、およびタバコが含まれる。
NAを単離し、このcDNAをタバコおよびジャガイモ植物に組み込ませる実施
態様に関して説明する。刺激反応性プロモーターおよびトランスジェニック植物
におけるその活性に関する実施例もまた示す。
照されよう。
できる核酸である。
る。
る。
ヌナズナ 4番染色体DNAフラグメントのヌクレオチド配列のBLASTNデ
ータベース検索から、シロイヌナズナ、オオムギ、トウモロコシ、イネ、ダイズ
、およびイネの葉緑体外β−アミラーゼと有意な相同性を有する遺伝子が存在す
ることがわかった。この検索から、いくつかの3’末端EST配列もまた同定さ
れた。これらの1つであるEST 81E10T7(Newmanら,1995
)(以下、pBmy81と呼ぶ)は約300ヌクレオチドにわたって同一であっ
た。クローンEST 81E10T7は、Arabidopsis Biolo
gical Resource Center(ABRC)DNA Stock
Center(Ohio University,USA)により供給された
。pBmy81内のcDNA挿入物にまたがるBal31欠失サブクローンのネ
ステッドセットを、蛍光色素標識ユニバーサルプライマーを用いた二本鎖PCR
サイクルシークエンシング反応でのDNA鋳型として使用した。シークエンシン
グ反応を、Apllied Biosystems Model373A自動化
シーケンサーにより分析した。pBmy81の前記cDNA挿入物のヌクレオチ
ド配列を配列番号3に示す。特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブ
タペスト条約により、Advanced Technologies(Camb
ridge)Limited,210 Cambridge Science
Park,Cambridge CB4 4WAは、構築物pBmy81を、1
998年8月4日にアクセッション番号NCIMB40964で、Nation
al Collection of Indurtrial and Mari
ne Bacteria(NCIMB),23 St.Machar Stre
et,Aberdeen Scotlandに寄託した。 推定葉緑体ターゲティングシグナルの同定
48アミノ酸からなるタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム(
ORF)、および232bpの3’非翻訳領域(UTR)を含む。pBmy81
cDNA挿入物によりコードされるタンパク質は、61kDaの推定分子量を
有し、トウモロコシ、イネ、オオムギ、ダイズ、およびサツマイモに由来する植
物葉緑体外β−アミラーゼと高いアミノ酸類似性を有する。しかしながら、pB
my81によりコードされるタンパク質は、葉緑体ターゲティングシグナルの特
徴(すなわち、高含有量のセリン(16%)、スレオニン(10%)、および正
に荷電したアミノ酸残基(15%))(BaierおよびDietz,1997
)を有する独特のN末端伸長を含む点で、現在まで報告された他の全てのβ−ア
ミラーゼとは異なる。葉緑体ターゲティングシグナルの特徴を識別する3つのド
メインである、非荷電アミノ末端ドメイン、ヒドロキシル化アミノ酸リッチな中
心ドメイン、および脂肪族β鎖を形成し得るカルボキシ末端ドメイン(Scha
tzおよびDobberstein,1996)を、このシグナル配列内で同定
した。 pBmy81内のcDNA挿入物は、葉緑体標的化β−アミラーゼをコードする
ート(Pisum sativum L.var Feltham First
)から単離した。植物材料を成長させ、MouldおよびGray(1997a
)の方法に従って葉緑体を単離した。
RNAポリメラーゼを用いてインビトロ転写した。放射性標識前駆体タンパク質
を、本質的にMouldおよびGray(1997b)に記載のように、pBm
y81 cDNAの転写物から35Sメチオニンおよび35Sシステインを含むコム
ギ胚翻訳系において合成した。
7b)に記載のように行った。移入インキュベーションの後、無傷の葉緑体を、
氷上で30分間、サーモリシン(移入緩衝液中で最終濃度0.2mg/ml)を
用いて処理し、次いで、プロテアーゼ反応を、50mM EDTAを移入緩衝液
に添加することで止めた。葉緑体を、移入緩衝液に溶かした40%パーコールの
緩衝物により再単離し、次いで、移入緩衝液で洗浄した(MouldおよびGr
ay,1997b)。サーモリシン処理した葉緑体試料のアリコート(1/10
)を分析のために採取し、残りを、本質的にSchnellおよびBlobel
(1993)に記載のように分画した。サーモリシン処理葉緑体、ストロマ画分
、チラコイド、およびサーモリシン処理チラコイドの試料を、SDS−PAGE
、続いてクマシーブルー染色、染色タンパク質バンドのデンシトメータースキャ
ニングにより定量した(リブロースビスリン酸カルボキシラーゼおよび集光性複
合体タンパク質のサブユニットを標準として使用した)。等量のこれらの画分(
パーコール勾配から回収した葉緑体の2%にほぼ等しい)と回収した内包膜およ
び外包膜画分の505とを、SDS存在下での10%ポリアクリルアミドゲルに
よる電気泳動、続いてフルオログラフィーにより分析した。結果(図1)から、
主要な翻訳産物(レーンTr)が約58kDaであることがわかる。単離した無
傷のエンドウ葉緑体を、ATPの存在下で放射性標識タンパク質とインキュベー
トすると、約50kDaおよび48kDaのポリペプチドが産生された(レーン
C)。外から添加したサーモリシンによる分解に対する耐性から、これらのポリ
ペプチドは、放射性標識タンパク質移入の産物であることがわかる。無傷のサー
モリシン処理葉緑体のストロマ、洗浄チラコイド、サーモリシン処理チラコイド
、内包膜および外包膜への分画により、2つの放射性標識ポリペプチドがストロ
マ画分にあることが証明された。 実施例2 シロイヌナズナ ct β−アミラーゼ遺伝子のスクロースおよび光誘導
Landsberg植物を、18時間明期、6時間暗期、18℃で、温室におい
て成長させた。5週間後、2トレイの芽生えを真っ暗闇に移し、2トレイの芽生
えを連続光で成長させた。2日後、1トレイの暗所適応した芽生えと1トレイの
明所で成長させた芽生えを総RNA単離のために使用し、それぞれの2つ目のト
レイを、さらに3日間、連続光に暴露した。
の種子を表面滅菌し、1%スクロースを含むMS寒天培地上に置き、18時間明
期、6時間暗期で培養室において成長させた。5週齢の芽生えを、滅菌蒸留水上
に、あるいは5%スクロース水溶液またはグルコース水溶液上に移した。この芽
生えを、3日間、連続して明所または暗所で維持した。総RNAを各試験の芽生
えから調製し、Eggermontら(1996)により記載されるようにノザ
ンブロット分析により分析した。ノザンを、FeinbergおよびVogel
stein(1983)により記載されるように、32P−dCTPでランダム標
識した後に、pBmy81内のゲル精製したcDNA挿入物を用いてプローブし
た。
ことがわかる。
クロースにより誘導され、それより少ない程度で5%グルコースにより誘導され
ることがわかる。この誘導は、明所で、糖の存在下でさらに高まった。これらの
結果から、光および糖の効果は互いに独立していることがわかる。 実施例3 ct β−アミラーゼプロモーター−GUS融合の構築
Bevenら,1998)内にあるct β−アミラーゼ遺伝子から単離した。
このプロモーター内にある便利な制限部位は、ヌクレオチド−1662bp位の
HindIII(配列番号8のマイナス鎖の19179bpで開始する)、−1
127bpのSalI、および−371bpのPstIであり、ct β−アミ
ラーゼ開始メチオニンの下流にある+21bp位に位置するXhoI部位を用い
て、3つの異なる長さのプロモーターとトランジットペプチド配列を単離した(
翻訳開始メチオニンATGのAに+1の番号をつけた)。
ーゼ遺伝子の294bp(配列番号1)フラグメントを、以下のオリゴヌクレオ
チドプライマー: 配列番号4 P1:(5’−ATT TCC TCG AGT TCT CTT ATC−3
’)および 配列番号5 P2:(5’−cgg gAT CCC TGA CAT TGT TAC−3
’) を用いて増幅した。
を示す。プライマー2の小文字の塩基は、BamHI部位を作成するために付加
したヌクレオチドを示す。
合フラグメントと、HindIII−BamHI、SalI−BamHI、また
はPstI−BamHIで消化したGUSベクターpBI101(Jeffer
sonら,1987)のトリプルライゲーションにより、キメラct β−アミ
ラーゼプロモーター−GUS遺伝子を作成した(図3)。構築物を、それぞれ、
HβGUS、SβGUS、およびPβGUSと名づけた。
4)によりアグロバクテリウム−ツメファシエンス LBA4404に移し、リ
ーフディスク形質転換法(Horschら,1985)によりNicotian
a tabacum var Samsumに導入した。 実施例3A タバコ芽生えにおけるキメラシロイヌナズナ ct β−アミラーゼプロモータ
ー−GUS遺伝子のスクロースおよび光誘導
し、この系統のF1芽生え子孫を用いて、キメラ遺伝子の光およびスクロース誘
導性発現を調べた。F1タバコ種子を表面滅菌し、1%スクロースを含むMS寒
天培地上に置き、18時間明期、6時間暗期で培養室において成長させた。2〜
3週齢の芽生えを5%スクロース溶液または蒸留水上に移し、3日間、連続して
明所または暗所で維持した。Jeffersonら(1987)に記載のように
、10〜14個の芽生えプールからの総タンパク質抽出物を、蛍光基質4−メチ
ルウンベリフェリル−グルクロニド(4−MUG)を用いてGUS活性について
分析した。両構築物を用いた、スクロースの非存在下で連続光に暴露された芽生
えのGUS活性レベルは、光の非存在下でスクロースに暴露された芽生えのGU
S活性レベルと類似した(図4)。しかしながら、芽生えを連続光とスクロース
との両方に暴露すると、GUS活性レベルは約2〜3倍増加した。これらの結果
は、光誘導性とスクロース誘導性が独立したプロセスであることを示した、ct
b−アミラーゼ遺伝子自体を用いた実験からの結果と大まかに一致する。
または茎および根の活性は全くといってよいくらいないことがわかった。4週齢
の芽生えでは、さらなるGUS活性が第1本葉全体で示され、茎でも示された。
GUS染色は、木部放射組織間にある、および木部と茎内部師部を構成する師部
維管束との間にある、葉緑体が豊富な柔組織(葉緑組織)細胞と特に関連してい
た。 実施例4 タバコおよびジャガイモの葉の形質転換に使用するためのct β−アミラーゼ
プラスミドの構築
位置するKpnI部位をBamHI部位に変換した。オリゴヌクレオチドプライ
マー: 配列番号6 P3:(5’−GCT GGT ACG CCT GCA GGA TCC G
GT CCG GAA TTC CC−3’)および 配列番号7 P4:(5’−GGG AAT TCC GGA CCG GAT CCT G
CA GGC GTA CCA GC−3’) を設計し、Quick Change位置指定突然変異誘発キット(Prome
ga)と共に使用した。プロトコールは、製造業者により概説された通りであっ
た。
Bmy81プラスミドから切り出し、次いで、GeneClean(BIO10
1)を用いて精製した。BamHIフラグメントを、供与体ベクターpDV35
S(SK)V(図5を参照のこと)およびpDV02000(図6を参照のこと
)のBamHI部位に連結した。pDV35S(SK)Vは、35S CaMV
プロモーター−35Sターミネーターを有するpBluescript(Str
atagene)からなり、類似する構築物が当該分野で周知である(例えば、
Odellら,1985)。pDV02000は、1.4kbパタチンプロモー
ター−ノパリン合成酵素ターミネーターを有するpBluescriptからな
る。当業者は、既知の配列から類似する構築物を作成することができる(例えば
、Liuら,1990)。プロモーターに対してセンス方向とアンチセンス方向
のコード配列を有するプラスミドを単離し、ct β−アミラーゼキメラ遺伝子
を、供与体ベクターからバイナリーベクターpBinPlus(van Eng
elenら,1995)にサブクローニングした。プラスミドマップを図7〜1
0に示す。 実施例5 植物の形質転換または再形質転換
フディスク共培養法を用いて形質転換した。上記のバイナリーベクターを、エレ
クトロポレーション法を用いてアグロバクテリウム−ツメファシエンス LBA
4404に移し、このアグテバクテリア培養物を、再生した植物が実施例4に記
載のキメラ遺伝子を有するように形質転換に使用した。
ターキメラ遺伝子バイナリープラスミドは、リーフディスク共培養法により、E
.coli ADPG−PPase glgC16キメラ遺伝子を既に有するジ
ャガイモ植物を形質転換するために使用することができる。 実施例6 AT ct β−アミラーゼのターゲティングペプチドを有するプラスミドの構
築
に等しい294bpフラグメント内に含まれる。PCR増幅または制限酵素消化
を用いて、DNAフラグメントを実施例3に記載のプラスミドから単離すること
ができる。すなわち、フラグメントは、35S CaMVプロモーター+プラス
チドターゲティング配列またはパタチンプロモーター+プラスチドターゲティン
グ配列からなる。キメラ遺伝子は、翻訳融合として、タンパク質または酵素のコ
ード配列とトランジットペプチド配列とを連結することにより構築することがで
きる。翻訳されたタンパク質はプラスチドに運ばれて、新規の活性をもたらすか
、または代謝経路に影響を及ぼす。 参考文献 Ainsworth,C.,Clark,J.およびBalsdon,J.(1
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インビトロ移入翻訳産物の結果を示す図である。説明:分子量マーカー(レーン
M);翻訳産物(レーンTr);移入インキュベーション後に再単離およびサー
モリシン処理された葉緑体(レーンC);ストロマ画分(レーンS);洗浄した
チラコイド(レーンT);サーモリシン処理チラコイド(レーンtT);内包膜
画分(レーンI);外包膜画分(レーンO)。それぞれ、β−アミラーゼの推定
前駆体(P)、中間体(I)、および成熟(M)形態。キロダルトン(K)。
の効果ならびに光および糖の効果を示す図である。図2aは、土壌で成長させ、
2日連続光(L)、2日連続暗所(D)、2日連続光の後に3日連続光(LL)
、または2日暗所の後に3日連続光(DL)に暴露された5週齢シロイヌナズナ
植物の総RNAノザンブロット分析を示す。図2bは、インビトロで成長させ、
水上に移して3日連続光に暴露された(WL)、あるいは5%スクロース上に移
して3日暗所(SD)または3日連続光(SL)に暴露された、あるいは5%グ
ルコース上に移して3日暗所(GD)または3日連続光(GL)に暴露された、
5週齢シロイヌナズナ植物の総RNAノザンブロット分析を示す。ノザンブロッ
トを、放射性標識ct−Bmy cDNA挿入物とハイブリダイズさせ、オート
ラジオグラフィーにかけた(上部パネル)。対応する臭化エチジウム染色ホルム
アルデヒド−アガロースゲルを下部パネルに示す。
子からなるT−DNAを示す図である。ここで、NosPはノパリン合成酵素プ
ロモーターを示す。NosTはノパリン合成酵素ターミネーターを示す。BRは
ライトボーダー逆方向反復であり、BLは、pBI101 T−DNAのレフト
ボーダ逆方向反復である。NPTIIは、ネオマイシンホスホトランスフェラー
ゼIIコード配列を示す。GUSは、β−グルクロニダーゼコード配列を示す。
ct β−アミラーゼプロモーターフラグメントを、斜線を引いた長方形で示す
。PCR増幅したXhoI−BamHI架橋フラグメントを黒色の長方形で示す
。
現したGUS活性に対する光およびスクロースの効果を示す図である。
。ここで35Spは、CaMV 35Sプロモーターを示す。ct bamyは
完全長ct β−アミラーゼcDNAを示す。35StはCaMV 35Sター
ミネーターを示す。RBはバイナリーベクターpBinPlusのライトボーダ
ーを示す。colE1oriはcolE1細菌複製起点を示す。RKoriは、
RK2プラスミドのoriV複製起点を示す。nptIIIは、細菌カナマイシ
ン耐性のためのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を示す。LBは、
バイナリーベクターのレフトボーダー配列を示す。kanは、植物カナマイシン
耐性に必要とされる植物ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ組換え遺伝子を
示す。
。略語は図7の通りである。
。patpが図6のベクターpDV02000に由来するパタチンクラスIプロ
モーターを示し、nostがノパリン合成酵素ターミネーターを示す以外は、略
語は実施例7の通りである。
。略語は図9の通りである。
レオチドであり、かつ前記ヌクレオチド中にコード配列を植物プラスチドに標的
化することができる配列を有する核酸配列、または前記核酸配列と実質的に類似
し、かつ同じ標的化能力を有する配列。
求項10に記載の核酸配列。
クレオチドであり、かつ前記ヌクレオチド中にβ−アミラーゼをコードすること
ができる配列を有する核酸配列、または前記核酸配列と実質的に類似し、かつ同
じコード能力を有する配列。
クレオチドであり、かつ前記ヌクレオチド中に葉緑体標的化β−アミラーゼをコ
ードすることができる配列を有する核酸配列、または配列番号3内の開示された
配列と少なくとも65%以上相同であり、かつ同じコード能力を有する配列。
記産物は、前記核酸配列に作動可能に連結されたコード配列によりコードされ、
前記核酸配列は、本明細書では配列番号8として知られるか、あるいは配列番号
8と少なくとも65%相同であり、かつ配列番号8と実質的に同じ機能を有し、
前記核酸配列は刺激反応性であり、前記産物の発現レベルは前記核酸配列に適用
された刺激に応じて変化する、核酸配列。
Aの配列である、請求項10〜15のいずれか1つに記載の核酸配列。
、植物において前記産物の発現を指向することができる核酸配列に作動可能に連
結されたコード配列によりコードされ、前記方法は、前記核酸配列に作動可能に
連結されたコード配列によりコードされる産物の発現を指向することができる核
酸配列を含むキメラ遺伝子を植物ゲノムに安定に組み込ませるステップを含み、
前記核酸配列は請求項15に記載の配列である、方法。
き起こす遺伝子をコードし、かつ光に暴露されると前記核酸配列により発現させ
られる、請求項17に記載の方法。
プン生合成酵素遺伝子のレベルを変化させる遺伝子をコードする、請求項17に
記載の方法。
れ、かつ糖が前記核酸配列に作用すると、発現レベルが変化する遺伝子をコード
する、請求項17に記載の方法。
る、請求項17に記載の方法。
る、請求項17に記載の方法。
ートし、それにより再形質転換植物により産生されるデンプン量を増加または減
少させるために、遺伝的形質転換の結果としてデンプン生合成経路酵素活性の増
加または減少を既に示しているトランスジェニック植物において前記さらなる酵
素を変える方法であって、前記さらなる酵素はプラスチド標的化βアミラーゼで
ある、方法。
Sプロモーター(完全または切断)、ルビスコプロモーター、エンドウプラスト
シアニンプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、クロロフィルr/b結
合プロモーター、高分子量グルテニンプロモーター、α,β−グリアジンプロモ
ーター、ホルデインプロモーター、およびパタチンプロモーターからなる群から
選択されるプロモーターをさらに含む、請求項1、8、または17のいずれか1
つに記載の方法。
酵素の活性をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする、請求項1、8
、または17のいずれか1つに記載の方法。
とか、またはないことである、請求項17に記載の方法。
項17に記載の方法。
請求項29に記載の方法。
ドする核酸配列とデンプン分解経路の酵素の核酸コード配列とを含むキメラ遺伝
子であって、前記酵素は請求項13に記載の配列によりコードされる、キメラ遺
伝子。
列を含むキメラ遺伝子であって、前記コード配列は請求項13に記載の配列であ
る、キメラ遺伝子。
とを含むキメラ遺伝子であって、前記コード配列の発現レベルは前記核酸配列に
適用された刺激に応じて変化する、キメラ遺伝子。
載の核酸配列を含む植物細胞。
酸配列を含む形質転換植物の種子。
よって形質転換された植物であって、前記植物は、1以上のジャガイモ、コムギ
、トウモロコシ、オオムギ、トマト、イネ、エンドウ、ダイズ、ラッカセイ、キ
ャッサバ、ヤムイモ、バナナ、およびタバコからなる群である、植物。
Claims (37)
- 【請求項1】 本明細書では配列番号1として知られ、1〜294のヌクレ
オチドであり、かつ前記ヌクレオチド中に、さらなるコード配列を植物プラスチ
ドに標的化することができる配列を有する核酸配列、または開示された配列であ
る配列番号1と少なくとも65%以上相同であり、かつ同じ標的化能力を有する
配列。 - 【請求項2】 前記核酸配列は約94のアミノ酸残基をコードする、請求項
1に記載の核酸配列。 - 【請求項3】 前記配列は約85のアミノ酸残基をコードする、請求項2に
記載の核酸配列。 - 【請求項4】 本明細書では配列番号2として知られ、1〜1642のヌク
レオチドであり、かつ前記ヌクレオチド中にβ−アミラーゼをコードすることが
できる配列を有する核酸配列、または配列番号2内の開示された配列と少なくと
も65%以上相同であり、かつ同じコード能力を有する配列。 - 【請求項5】 本明細書では配列番号3として知られ、1〜1953のヌク
レオチドであり、かつ前記ヌクレオチド中に、葉緑体標的化β−アミラーゼをコ
ードすることができる配列を有する核酸配列、または配列番号3内の開示された
配列と少なくとも65%以上相同であり、かつ同じコード能力を有する配列。 - 【請求項6】 産物の発現を指向することができる核酸配列であって、前記
産物は、前記核酸配列に作動可能に連結されたコード配列によりコードされ、前
記核酸配列は、本明細書では配列番号8として知られるか、あるいは配列番号8
と少なくとも65%相同であり、かつ配列番号8と実質的に同じ機能を有し、前
記核酸配列は刺激反応性であり、前記産物の発現レベルは前記核酸配列に適用さ
れた刺激に応じて変化する、核酸配列。 - 【請求項7】 前記核酸配列は、mRNA、cDNA、またはゲノムDNA
の配列である、前記請求項のいずれか1つに記載の核酸配列。 - 【請求項8】 デンプン生合成経路または分解経路の酵素の活性を植物にお
いて増加または減少させる方法であって、前記方法は、プラスチドターゲティン
グ配列をコードする核酸配列とデンプン生合成経路または分解経路の酵素のコー
ド配列とを含むキメラ遺伝子を植物ゲノムに安定に組み込ませるステップと、改
変したゲノムを有する植物を再生するステップを含む、方法。 - 【請求項9】 前記核酸配列は請求項1に記載の配列を含む、請求項8に記
載の方法。 - 【請求項10】 前記デンプン分解経路の酵素はβ−アミラーゼである、請
求項8に記載の方法。 - 【請求項11】 前記コード配列は請求項4に記載の核酸配列であり、デン
プン分解経路の酵素のコード配列である、請求項8、9、または10に記載の方
法。 - 【請求項12】 前記核酸配列は請求項5に記載の核酸配列である、請求項
8に記載の方法。 - 【請求項13】 請求項8〜12のいずれか1つに記載の方法であって、前
記デンプン分解経路の酵素は、スクロース合成酵素、ADPGピロホスホリラー
ゼ、デンプン合成酵素、分枝酵素、αアミラーゼ、イソアミラーゼ、非プラスチ
ド型β−アミラーゼ、α−グルコシダーゼ、デンプンホスホリラーゼ、および不
均化酵素からなる群の1つである、方法。 - 【請求項14】 タンパク質または酵素を植物プラスチドに標的化する方法
であって、前記方法は、プラスチドターゲティング配列をコードする核酸配列と
タンパク質または酵素のコード配列とを含むキメラ遺伝子を植物ゲノムに安定に
組み込ませるステップと、改変したゲノムを有する植物を再生するステップを含
み、前記タンパク質または酵素は、1以上の下記の群:脂質合成、光合成、アミ
ノ酸代謝、窒素固定、炭素固定、または炭水化物ポリマー合成の経路であるか、
あるいは前記植物にある特徴を付与することができ、前記核酸配列は請求項1に
記載の核酸配列である、方法。 - 【請求項15】 前記特徴は、1以上の下記の群:除草剤抵抗性および有害
生物抵抗性から選択される、請求項14に記載の方法。 - 【請求項16】 産物の発現レベルを変化させる方法であって、前記産物は
、植物において前記産物の発現を指向することができる核酸配列に作動可能に連
結されたコード配列によりコードされ、前記方法は、前記核酸配列に作動可能に
連結されたコード配列によりコードされる産物の発現を指向することができる核
酸配列を含むキメラ遺伝子を植物ゲノムに安定に組み込ませるステップを含み、
前記核酸配列は、配列番号8の配列を実質的に有するか、または配列番号8と少
なくとも65%相同であり、かつ配列番号8と同じ機能を実質的に有し、刺激反
応性である、方法。 - 【請求項17】 前記コード配列は、前記植物において開花中に不稔性を引
き起こす遺伝子をコードし、かつ光に暴露されると前記核酸配列により発現させ
られる、請求項16に記載の方法。 - 【請求項18】 前記コード配列は、葉または他の光合成組織におけるデン
プン生合成酵素遺伝子のレベルを変化させる遺伝子をコードする、請求項16に
記載の方法。 - 【請求項19】 前記コード配列は、発育中の貯蔵器官において糖が産生さ
れ、かつ糖が前記核酸配列に作用すると、発現レベルが変化する遺伝子をコード
する、請求項16に記載の方法。 - 【請求項20】 前記核酸配列は、光はあるが糖がない場合に作動可能であ
る、請求項16に記載の方法。 - 【請求項21】 前記核酸配列は、糖はあるが光がない場合に作動可能であ
る、請求項16に記載の方法。 - 【請求項22】 さらなる酵素をアップレギュレートまたはダウンレギュレ
ートし、それにより再形質転換植物により産生されるデンプン量を増加または減
少させるために、遺伝的形質転換の結果として酵素活性の増加または減少を既に
示しているトランスジェニック植物において前記さらなる酵素を変える方法。 - 【請求項23】 前記第1の形質転換植物は、デンプン生合成経路の酵素活
性が増加または減少した植物である、請求項22に記載の方法。 - 【請求項24】 前記第1の形質転換植物は、ADPG−PPase遺伝子
で形質転換されたトランスジェニックジャガイモである、請求項23に記載の方
法。 - 【請求項25】 前記キメラ遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルス35
Sプロモーター(完全または切断)、ルビスコプロモーター、エンドウプラスト
シアニンプロモーター、ノパリン合成酵素プロモーター、クロロフィルr/b結
合プロモーター、高分子量グルテニンプロモーター、α,β−グリアジンプロモ
ーター、ホルデインプロモーター、およびパタチンプロモーターからなる群から
選択されるプロモーターをさらに含む、請求項8、14、または16のいずれか
1つに記載の方法。 - 【請求項26】 前記キメラ遺伝子中の前記酵素の前記コード配列は、前記
酵素の活性をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする、請求項8、1
4、または16のいずれか1つに記載の方法。 - 【請求項27】 前記刺激は、光および/または様々なレベルの糖があるこ
とか、またはないことである、請求項16に記載の方法。 - 【請求項28】 前記刺激は、発育段階により制御される刺激である、請求
項16に記載の方法。 - 【請求項29】 前記糖は、1以上のスクロースまたはグルコースである、
請求項27に記載の方法。 - 【請求項30】 前記糖はスクロースである、請求項29に記載の方法。
- 【請求項31】 請求項1に記載の核酸配列を含むキメラ遺伝子。
- 【請求項32】 請求項1に記載のプラスチドターゲティング配列をコード
する核酸配列とデンプン分解経路の酵素の核酸コード配列とを含むキメラ遺伝子
であって、前記酵素は、請求項4に記載の配列によりコードされる、キメラ遺伝
子。 - 【請求項33】 さらなるコード配列の発現を指向することができる核酸配
列を含むキメラ遺伝子であって、前記コード配列は請求項4に記載の配列である
、キメラ遺伝子。 - 【請求項34】 刺激に反応する請求項6に記載の核酸配列とコード配列と
を含むキメラ遺伝子であって、前記コード配列の発現レベルは、前記核酸配列に
適用された刺激に応じて変化する、キメラ遺伝子。 - 【請求項35】 請求項1、4、5、または6のいずれか1つに記載の核酸
配列を含む植物細胞。 - 【請求項36】 1以上の請求項1、4、5、または6に記載の核酸配列を
含む形質転換植物の種子。 - 【請求項37】 請求項8、14、または16のいずれか1つに記載の方法
によって形質転換された植物であって、前記植物は、1以上のジャガイモ、コム
ギ、トウモロコシ、オオムギ、トマト、イネ、エンドウ、ラッカセイ、キャッサ
バ、ヤムイモ、バナナ、およびタバコからなる群である、植物。
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