HU228696B1 - Plastid-targeting nucleic acid sequence, beta-amylase sequence, a stimulus-responsive promoter and uses thereof - Google Patents

Plastid-targeting nucleic acid sequence, beta-amylase sequence, a stimulus-responsive promoter and uses thereof Download PDF

Info

Publication number
HU228696B1
HU228696B1 HU0200732A HUP0200732A HU228696B1 HU 228696 B1 HU228696 B1 HU 228696B1 HU 0200732 A HU0200732 A HU 0200732A HU P0200732 A HUP0200732 A HU P0200732A HU 228696 B1 HU228696 B1 HU 228696B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
sequence
plant
nucleic acid
seq
amylase
Prior art date
Application number
HU0200732A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Anthony Kavanagh
Nga Thi Lao
Original Assignee
Cambridge Advanced Tech
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB9817963.3A external-priority patent/GB9817963D0/en
Priority claimed from GBGB9817959.1A external-priority patent/GB9817959D0/en
Priority claimed from GBGB9913014.8A external-priority patent/GB9913014D0/en
Application filed by Cambridge Advanced Tech filed Critical Cambridge Advanced Tech
Publication of HUP0200732A2 publication Critical patent/HUP0200732A2/hu
Publication of HUP0200732A3 publication Critical patent/HUP0200732A3/hu
Publication of HU228696B1 publication Critical patent/HU228696B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8214—Plastid transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8221—Transit peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C12N15/8238—Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2425—Beta-amylase (3.2.1.2)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Bakery Products And Manufacturing Methods Therefor (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

ÚJ, plasztidba célzó nukleinsav szekvencia, egy új béta-a.miiáz szekvencia, egy ingerre reagáló promoter, és ezek használata
A keményítő növényben való szintézisének és lebomlásának pontos mechanizmusa nem ismert, annak ellenére, hogy számos enzimet izoláltak és jellemeztek, amikről feltételezik, hogy részt vesznek a folyamatban,
Á keményítő a kloroplaszt leveleiben akkumulálódik a nap folyamán, és arra használódik, hogy a növény energia- és bioszintézis-igényét ellássa az éjszaka folyamán. Nem teljesen értjük még annak a módját, hogy ez az úgynevezett tranziens keményítő miképpen mobilizálódik, de szintetikus és degradativ enzimek koordinált szabályozására lehet szükség, A levelek szöveteiben a fö lebomlási útról azt gondolják, hogy foszforon tikos és hídrolítikus aktivitásokat is magában foglal, különösen az alfa-, glükozidázt (E..C. 3.2.1,| |Hielson, T.H,, Deítlng, U, és Stitt, M.: Plánt PhysIoL I13, 503-510 (1997)^
A keményítő a tartalékoló szervek, azaz például a magvak, gyümölcsök és gumók amíloplasztjalban is akkumulálódik. Ebben az esetben a keményítő hosszabb ideig tárolódik, és a keményítő mobilizálását a tároló szerv szöveteinek lebomlása, valamint az amílolitikus és foszforolítikus aktivitások növekedése kíséri. Azonban van arra bizonyíték, hogy a keményítő-körfolyamat a tároló szervek amíloplasztjaihan is előfordul [Sweetlove, L,d.,
η
8'urr.eU, Μ.M, és ap Rees, T.: Bíoehemíeaí J. 320, 493(1996}]. Ehhez ismét a szintetikus és degradatív enzimek aktivitásának koordinált szabályozására van szükség.
A kloropiasztok és amiloplasztok. ís propiasztidokböl származnak, és ennek következtében számos közös jellemzővel rendelkeznek, amellett, hogy a levelekben és a tároló szervekben a keményítő-szintézis helyei; a kloropiasztok amiloplasztokká és más típusú plaszúdekká konvertálhatók (Thomson, W. W. és Whatley, 3.M.: Annual Rév. Plánt Physiok 31, 375-394 (1980)),.
A keményítő két políszacharíd keveréke: az egyik az amilóz, ami alfa- 1,4-glikozidos kötésekkel összekötött glúkozil egységek lineáris lánca; a másik az amílopektin, ami alfa-l,6-glikozidos. kötésekkel összekapcsolt lineáris alfa-1,4-poliglükán láncokból ált
A keményítő bioszintézisében szerepet játszó enzimek közé tartozik az ADPG pirofoszforiláz (E,C. 2,7,7.21), a keménykő szintetáz (E.C. 2,4.1.21) és az elágaztató enzim (E.C. 2,4.1,18). Az ADPG pirofoszforiláz felelős az ADPG szubsztrát biztosításáért, amely molekula a glükóz monomerek donoraként szolgál, amiket a keményítő szintetázok (alfa-1,4 kötések) és az elágaztató enzimek (alfa-1,8 kötések) összehangolt tevékenysége kapcsol össze.
Az ismert, hogy a keményítő-szemcsék oldhatatlan, kristályos struktúrája a .kinyúlt, helíkálís, elágazó szénláncú amílopektin molekuláknak a lineáris amilóz molekulákkal való .szoros pakolódásávaí alakul ki,
Számos különböző keményítőbontó enzimaktivitást írtak már le, beleértve az .alfa-amilázt (E.C. 3,2.1.1), az izoamilázt (E.C. 3.2.1.68), a béta-amílázt (E.C. 3.2,1.2), az alfa-glúkozidázt (E.C. 3.2.1.3), a keményítő foszforiíázt (E.C. 2.4,1.1) és a diszproporcionáló enzimet (E.C. 2.4.1.25). Ezek közül az enzim.aktivitások közül számos több különböző formában létezik a növényekben, és néhányról azt .gondolják, hogy a keményítő bioszintézisében játszik szerepet. Valószínűleg valamilyen mértékben mindegyik részt vesz a keményítő mobilizálás! folyamatában, bár pontos szerepüket és a lehetséges kölcsönhatásaikat még meg kell határozni. Annak a nehézségét, hogy a különböző enzimekhez szerepet rendeljünk, a legjobban két enzimaktivitás alapján lehet illusztrálni, amikről azt gondolják, hogy a növényekben ezek járulnak hozzá leginkább a keményítő lebontásához: az egyik a keményítő foszföríláz, a másik az amiláz.
A keményítő foszforilázok a glükóz-1-foszfát reverzibilis felszabadulását katalizálják az alfa-1,4-glükánokbői. A keményítő foszforilázok két formája található meg a növényi szövetekben: a Phol, vagy L-típusú a plasztídokban található, és nagy az affinitása a maltodexirinekhez; a Pho2, vagy H-típusú, citoszólos és nagy az affinitása nagy, erősen elágazó poliglükánokhoz, azaz például a glikogénhez. Bár a plasztidos Pho l enzim valószínű jelölt arra, hogy a keményítő mobilizálásában szerepet játszik, a levélben levő enzimaktivitás antíszensz gátlása nincs hatással a keményítő akkumulálödására a transzgenikus burgonyanövények leveleiben (Sonnewald, U., Basner, A.. Greve, B. és Steup,
MY; Plánt Molecular Biology 27, 567-576 (1995)1, Egy másik vizsgálatban a citoplazmatikus Pho2 antiszensz gátlása nem volt hatással a transzgenikus burgonyagumők csirázásí tulajdonságaira, de nem volt hatással a keményítő akkumulálódására és lebomlására sem (Duweníg, £,, Steup, M., Willmitzer, L. és Rossmann, Ja Plánt Journal 12, 323-333 (1997)),
Az amilázoknaJk van két nagy csoportja, amik hidrolízálják az alfa-1,4-glikozidos kötéseket az amílozban és az amilopektinben: az aífa-amilázok véletlenszerűen hatnak a nemterminális kötésekre, míg a béta-amilázok úgy működnek, hogy a políglükán lánc nem-redukáló végéről maltóz egységeket szabadítanak fel. Az alfa-amiláznak a növénysejtek apoplasztikus terében való szubeelluláris lokalizációjáról azt gondolják, hogy azt a tényt tükrözi, hogy az. enzim normálisan szekretálódík. Azonban számos növényben, mint például a rizsben jChen, M.H., Liu, LF, Ohen, YR., Wu, HK. és Yu, SM: Plánt Journal 6, 625-636 (1994)], és cukorrépában {Li, B,, Servaítes, J.C. és Geíger, D.R.r Plánt Physíology 98, 1277-1284 (1992)), Egy vizsgálatban, amiben a rizs .alfa-amiláz génjének promoterét és szignálszekvenciáját a bakteriális GUS génhez fuzionáltatták, és rizsbe, dohányba, valamint burgonyába juttatták be, .A^robacteríum által közvetített transzformációval (Chan, MT„ Chao, YC. és Yu, SMn Journal of Biological Chemistry Journal of Biological Chemistry 269, 1763517641 (1994)), demonstrálták, hogy az expresszált GUS fúziós fehérje először az endoplazmatikus retíkulumba szállitódott, majd innen exportálödott a transzgenikus sejtekből készített szuszpengazolták.
ziös tenyészet tenyésztő közegébe. Számos vizsgálatban i hogy az alfa-amiláz lebontja a természetes keményítő molekulákat.
Ezzel ellentétben az fn váró vizsgálatok kimutatták, hogy a béta-amíláz nem bontja le a természetes keményítőszemcséket, h.a. a szemcséket előzőleg nem emésztették más enzimek, A rozs |Daussant, d., Zbaszniak, Β.» Sadowski, J< és Wíatroszak, íz Planta 151, 176-179 (19Sl)j és a szója (Hildebrand, D.F. és Hymowitz, Tz Physiologia Plantarum 53, 429-434 (1981)] mutánsai, amikből hiányzik az aktív béta-amíláz, vagy csak nyomokban tartalmazzák ezt az aktivitást, láthatóan normális növekedést és fejlődést, mutatnak. Emellett, azok a transzgenikus Arabfdopsfs növények, amikben a béta-amíláz szintje erősen lecsökkent, nem mutatnak súlyos károsodásokat a növekedésben ÍMita, S., Murano, N., Akaiké, M. és Makamura, K.: Plánt Journal 11, 841851 (i997jj. Azokat a kísérleteket, amikben a béta-amilázok pontos fiziológiás szerepét próbálták meghatározod, gátolták a szubcelluláris lokalizációra vonatkozó következetlen adatok. Bár egy vizsgálatban [Kakeíuda, G,> Duke, S.H. és Hoztak, M.H.: Planta 168, 175-182 (1986]j leírták két béta-amiláz jelenlétét borsó kloroplasztokhan, a Fida/a&o, árpa, búza, szója, édesburgonya. és borsó fajokban, végzett legtöbb kísérletből azt a következtetést vonták le, hogy a legtöbb, ha nem az összes béta-amiláz aktivitás extrakloropla.sztos [Nakamura, K«, Ohto, M., Yoshída, N. és Nakamura, KJ Plánt Physioi, 96, 902-909 (199 l)j. Ezt a véleményt alátámasztja az a tény, hogy a mai napig klónozott összes kb béta-amiláz gén olyan fehérjét kódol, amikből hiányzik az N-terminális kio-ropiaszt tranzit peptid szekvencia.
A szemesterményekben három, különböző típusú bétaamilázt írtak le; egy endosperma-specifikus formát, ami a szem termés érése során akkumulálódik; egy olyan formát, ami a csírázás során de neon szintetízálódik a rizs és a kukorica aleuron sejtjeiben [Wang, SM., tue, WL. és Chen, J.: Plánt Molecular Biology 31, 975-982 {1996); Wang, SM„ Lue, WL., Huang, HW. és Chen, d,: Plánt Physíology 113, 403-409 (1997)1; valamint egy béta-amilázt, ami mindenütt megtalálható a vegetatív szervekben. Az AraObpsís-ban a mindenütt jelenlevő forma teszi kí a rozettalevelekben levő összes keményítö-lebontő aktivitás körülbelül 80%-áf, A mai napig klónozott Összes többi béta-amílázzal együtt, a mindenütt jelenlevő Arnbidopsís béta-amiláz génje nem szubcelluláris célzó szekvenciával rendelkező fehérjét kódol, tehát az enzim valószínűleg a címszóiban található.
Meglepő az a következtetés, amit számos vizsgálatból vonv.
tak le, hogy a ranv aKtivm ^'oldhatók, anélkül, hogy káros hatással lennének a növény életképességére, plusz a keményítőt lebontó enzimek plaszíidon kívül, szubcellulárisan. lokalizálódnak. A plasztídban lokalizált béta-amiláz aktivitás látható- hiánya különösen meglepő annak a ténynek a fényében, hogy izolált kloroplaszfcokhan a keményítő lebontás termékeként azonosították a béta-amiláz aktivitás várt végtermékét, nevezetesen a maltózt (Peavey, D.G., Steup, M, és Gibbs, Mű Plánt Physio-logy 60, 30-5-308 (1977)1. Legújabban kimutatták, hogy a aa «λ* keményítő mobilizációja során mind a glükóz, mind a maltóz exportálődik as izolált karfiolrügy amiloplasztokból [Neuhaus, H.E., Henriühs, G. és Schiebe, R.; Plants, 194, 454-460 (1995)],
Az a képesség:, hogy manipuláljuk a keményítő mennyiségét a levelek vagy tároló szervek plasztidjaiban, nagyon jó hatással lehet a különböző ipari folyamatokban, amik a növényi keményítőt használják. Egy kísérletben például, amiben megpróbálták növelni a burgonyagumók keményítő-tartalmát, korábban kimutatták, hogy ha az Escherichia eoá ADPG PPáz pipülő-ot túlexpresszáljuk transzgenikus burgonyagumokban, akkor megnő a szén áramlása a keményítőbe, de csak kis mértékben nő meg a keményítő nettó- akkumulációja (Sweetlove, -L.J., Burrell, MM. és ap Rees, ?.: Biochemical J. 320, 493-498 (1996)). Az enzimaktivitások tülexpresszálő vonalakban való elemzése azt mutatja, hogy az ADPG -PPáz megváltozásától eltekintve, az amíláz, specifikusan a béta-amíláz aktivitása is megváltozott. Ez az adat azt sugallja, hogy a keményítőnek a glgC.16 fehérjét tülexpresszálő gumóban, való akkumulációját megakadályozza az újonnan szintetizálódott keményítő lebomlása, azaz a keményítő „forog”.
Egy másik példában a keményítő hozzáférhetősége a malátázó eljárás során szoros korrelációban van a növényben, specifikusan a tároló -szervekben levő lebontó enzimaktivitások típusával és mennyiségével A termény lebontó kapacitásának növekedése a szemestermény malátázását, vagy a keményítőnek a gu* ♦ Α· kásának költségeit »4X4 £ * *> A * · Φ !♦. ’í * « * Φ i
mákból, vagy más tároló szervekből alkohollá való konverzióját hatékonyabbá és termelékenyebbé teszi.
A tároló szervekben jelenlevő keményítő típusa függ a jelenlevő ADPG pirofoszfonláz, a keményítő szintáz, az elágaztató enzim és a lebontó enzimek formájától és aktivitásától. A különböző enzimek közötti kölcsönhatás is fontos lehet.
Komolyan érdeklődnek új keményítők előállítása iránt in p/onía, mivel ez számos különböző iparágban., azaz például az élelmiszeriparban, papíriparban, gyógy szeriparban, a ragasztók, olajok, és textíliák előállítása során csökkenti a keményítő felhasználása előtti processzálásának és
Az alábbi példák azt mutatják, hogy a keményítő hidrolitikus aktivitása miképpen lehet fontos a. keményítő struktúrájának in wöö történő megváltoztatásában.
Kimutatták, hogy a kukorica magjaiban a sápon/í mutáció az elágazást megszüntető enzim hiányát okozza, ami hidrolizálja a keményítő alfa-.Ι,β-glikoziles kötéseit pames, M.G., Robertson, D.S. és Myers, A.M.: Plánt Celi 7, 417-429 (1995)), A mutáció az ainilopektin csökkenő koncentrációját, és az erősen elágazó glükopo-liszacharid, a fítogliko-gén akkumulálódását eredményezi Kimutatták, hogy a borsóban a rövid oligoszacharid molekulák, maltózzal kezdve és egymás -után glukóz egységeket adva hozzá, egészen a maltoheptózig., specifikusan serkentik a szemcséhez kötött keményítő-szintáz I~et (GBSSI) (Denyer, K., Clarké, B., Hylton, C,s Tatge, H. és Smíth, A.M.: Plánt Journal 10, 11351143 (1996)], amiről általában elfogadják, hogy ez a legfon tosabb s··”* * « ♦ ?A.
r 9 * ^e ' ♦ ♦ »«· * #>rX « ·* * 4 enzim, ami az amílóz szintéziséért felelős (van dér Lelj, F.R. Visser, R.G.F., Ponstein, A.S., Jacobsen, E. és Feenstra, W.J.: Mölécular and General Genetics 223, 240-248 (1991); Kylton, CM,, Denyer, K., Keeling, P.L., Chang, MT. és Smith, A.M.: Planta 198, 230-237 (1995); Ainsworth, C., Clark, J, és Salsdon, Ja Plánt Mölécular Biology 22, 67-82 (1993)). A GBSS1 aktivitás manipulálása., a maho-oligoszacharidokkal való ellátás szabályozásával, egy új szabadalmi bejelentés tárgya (WO 97/ 16554), és azt sugallja, hogy a malto-oligoszacbarídok koncentrációjának növekedése, és ezzel a keményítőben az amílóz amilopektinhez viszonyított arányának növekedése elérhető degradativ enzimek, nevezetesen alfa-amiláz, béta-amiláz, diszproporcionálö enzim, elágazást megszűntető enzim és keményítő foszforiláz bejuttatásával. A WO 97/16554 számú szabadalmi bejelentésben azt is állítják, hogy ezeknek az enzimeknek a plasztidos izo formáit kódoló géneket kiónozták. Azonban, amint azt az előzőkben tárgyaltuk a mai napig nem izoláltak olyan béta-amilázt kódoló gé~ £ * **·♦ «* ♦ l‘.Y * * * « r. ;
neket, amik egy fehérje-célzó szekvenciával rendelkeznek, és emellett kétséges, hogy az alfa-amilázok eredetileg a plasztid irányulnak-e ICben, M.H., Liu, LF, Cben, YR,, Wu, HK. és Yu, SM: Plánt Journal 6, 625-636 (1994); Chan, MT., Chao, YC. és Yu, SM.: Journal of Biologíeal Chemlstrv Journal of Síological Chemistry 269, 17635-17641 (1994)). Később, a WO 97/16554 számú szabadalmi bejelentésben említik egy megfelelő bétaamdáz eDNS szekvencia génsebészeti, módszerekkel történő módosítását, amivel egy plasztidba irányító szekvenciát adtak hozzá.
UöJt · « « ** ♦
A tároló szervekben levő keményítő ipari felhasználása mellett a levélben levő keményítő- mennyiségének szignifikáns jelentősége van a termény agronómiája szempontjából, A keményítő nappal a levelekben szintetízálődík, a fotoszintézis során fixált szénből. A keményítő a kloroplasztban tárolódik, és éjjel le bomfi n * * » • * * * $ ♦ á '* »* * * « * lik, hogy a növénynek energiaforrást és a metabolizmushoz intermediereket biztosítson. Jelenleg nem ismert, hogy a forrásnyelő kapcsolat miként van szabályozva, az azonban világos, hogy a keményítő mennyiségének és hozzáférhetőségének manipulálása a levél plasztídjaíban komoly hatással van a nővény termőképességére (biomassza és termés),
A keményítő mennyisége a levélben azoknál a terményeknél ts fontos, amelyekben a levél a növény legfontosabb terméke, mint például a dohánynál. Az köztudott, hogy a keményítő-tartalom befolyásolja a dohány végleges illatát füstölés közben. A dohányipar számára érdekes lehet olyan eszközök biztosítása, amikkel a dohánylevelek keményítő-szintjét lehet manipulálni.
Az -alábbiakban mi írjuk le először egy olyan új béta-amiláz enzimet kódoló cDNS izolálását, ami egy új célzó szekvenciával plasztídokba irányul (ennek következtében kloroplasztba célzott (ct) béta-amiláz néven ismert). Ennek a teljes kódölő szekvenciának az izolálása meglepő, mivel általában azt gondolták, hogy a béta-amiláz csak a keményítő hidrolízisében vesz részt, amikor a kisebb poliglukán fragmensek a plasztidből már felszabadultak a vak Az enzim plasztídokba való lokalizációja megnyitja azt az elődí
-*« * re nem látott lehetőséget,, hogy a et béta-amíláz szerepet játszik a kloroplasztokban található tranziens keményítő és az amiloplasztokban levő tartalék keményítő lebontásában.
A kloroplasztok és az amíbpiasztofc jellemzői közötti hasonlóságnak (Thomson, W.W.. és Whatiey, J.M.t Annual Rév. Plánt. Physíol 31, 375-394 (198öj| van jelentősége a jelen találmány szempontjából, mivel kimutatták, hogy a kloroplasztba célzott poUpeptídekböl származó tranzit peptidek képesek heteroiög polipeptideket szállítani az amíloplasztokha, és yfca yersa. Ha például a kukorica granulumhoz kötött keményítő színtáz enzimből származó tranzit peptídet Escheríc/ua cok bétaglúkuronídáz (GUS) fehérjéhez luzionáitatjuk, akkor ezzel a GUS fehérjét nemcsak az amílopiasztckba, hanem a kloroplasztokba ís tudjuk importálni [Rlosgen, R.B. és Weil, J.H.: Molecular and General Genetics 225, 297-304 (1991)],
Emellett bemutatjuk, hogy a ct-.8nry gén Araóidopsís-ban való expressziója, és a et-Bnu/ promoterGUS fúziók transzgenikus dohányban való fúziója egymástól függetlenül fénnyel és szacharózzal is szabályozható. Ez meglepő, az Arabzdopsis ÁTb-A/ny fény- és cukor-indukcióra adott, szorosan kapcsolt válaszai lényében Iklíta, S., Suzuki-Fuju,. K. és Nákamura, Ku Plánt Physiology 107, 895-904 (1995)].
A jelen találmány tárgyát az alábbiakban az 1. számú szekvencia-vázlatban bemutatott nukieinsav szekvencia képezi, ami az 1-294-es nukleotídokat tartalmazza, és benne egy olyan í * ** ♦ X szekvencia van, ami képes egy további kódoló szekvenciát egy •♦-Λ..'-.··*·>'*' * « ♦ > »♦ * * növényi ρ laszti db a irányítani, vagy az olyan szekvenciák, amik legalább 65%-os, vagy ennél nagyobb homológiát mutatnak az L számú szekvenciavázlaton bemutatott szekvenciával, és azzal azonos célzási képességgel rendelkeznek.
A nukleinsav szekvencia előnyösen körülbelül 94, még előnyösebben körülbelül 85 aminosav csoportot kódol.
A jelen találmány tárgyát képezi továbbá egy, a 2. számú szekvenciavázlaton bemutatott nukleinsav szekvencia, ami l 1642~es nukleotidokat tartalmazza, és benne egy béta-amilázt kódoló szekvencia van, vagy az olyan szekvenciák, amik legalább 65%-os, vagy ennél nagyobb homológiát mutatnak a 2, számú szekvenciavázlaton bemutatott szekvenciával, és azzal azonos
A jelen találmány tárgyát képezi továbbá egy, a 3. számú szekvenciavázlaton bemutatott nukleinsav szekvencia, ami az 1 1953-as nukleotidokat tartalmazza, és benne egy kloropiasztba célzott béta-amilázt kódoló szekvencia van, vagy az olyan szekvenciák, amik legalább 65%-os, vagy ennél nagyobb homológiát. mutatnak a 3. számú szekvenciavázíaton bemutatott szekvenciával, és azzal azonos kódoló képességgel rendelkeznek.
A homológ szekvenciák közé tartoznak azok a szekvenciák ís, amik hibridízálodnak az h, 2. vagy 3. számú szekvenciához, közepes szigorúságú körülmények között (mosás 2*3SC~veÍ 65 °C~on}<
A nukleinsav szekvencia előnyösen egy mRHS vagy cDNS szekvencia, bár lehet genomlális DNS is.
$·* ** «-Λ * *
X «
- ΒA jelen találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás, amivel egy növényben a keményítő bioszintézisében vagy lebontásában szereplő enzim aktivitását csökkenteni vagy növelni lehet, és az eljárás az alábbi lépéseket tartalmazza: a nővény genomjába stabilan integrálunk egy kiméra gént, ami egy plasztidba irányító szekvenciát, valamint a keményítő bioszintézis vagy lebontás bioszintézis útjában levő enzimet kódoló szekvencia tartalmaz, majd a megváltoztatott genommal rendelkező növényt regeneráljuk,
A jelen találmány tárgya továbbá eljárás fehérjék vagy enzimek növényi plasztidokba való irányítására, amely eljárásban az alábbi lépéseket alkalmazzuk: a növény genomjába stabilan integrálunk egy kiméra gént, ami egy plasztidba irányító szekvenciát, valamint a keményítő bioszintézís vagy-' lebontás bioszintézís útjában tevő enzimet kódoló szekvencia tartalmaz, majd a megváltoztatott genommal rendelkező növényt regeneráljuk, és a fehérje vagy enzim az alábbi csoportból választható egyik bioszíntézis útba tartozik: lipid-szintézis, fotoszintézis, amlnosav metabolizmus, nitrogénkötés, szén-megkötés vagy szénhidrát polimerek szintézise; vagy a növényben képesek vagyunk egy jellemző tulajdonságot kialakítani, amely tulajdonságot az alábbiak közül választhatjuk ki: például herhícid-rezíszteneía és kártevő rezisztencia, beleértve a gomba-, bakteriális- vagy vitális rezisztenciát.
A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a kiméra gént tartalmazó növények, amely kiméra gén tartalmaz egy promotert, a plasztidba célzó szekvenciát kódoló nukleinsav szekvenciát, egy szekvenciát, ami képes a keményítő bioszintézís útjában vapv le„V « φ *
-Μö enzimet egy növényi plasztikba irányítani, valamint tartalmaz egy terminátort.
A jelen találmány tárgyát képezi továbbá egy nukleinsav szekvencia, ami képes egy termék, expresszióját irányítani, amely termeket egy működés szempontjából hozzá kapcsolódó kódoló szekvencia kódot, és az említett nukleinsav szekvencia azonos azzal, amit a 8. számú szekvenciavázlaton mutatunk be, vagy legalább 65%-ban homológ vele, és lényegében vele azonos funkciókkal rendelkezik, és az említett nukleinsav szekvencia képes egy ingerre reagálni, valamint az· említett termék expressziójának szintje változó, az említett nukleinsav szekvenciára irányuló ingerre adott választói függően.
A jelen találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás, amivel változtatni lehet egy termék expressziójának szintjét, amely terméket egy kódoló szekvencia kódol, és a szekvencia működés szempontjából egy olyan nukleinsav szekvenciához van kapcsolva,. ami képes az említett termék expresszióját növényben vezérelni, és az említett eljárás az alábbi lépésekből áll.: a növény genomjába stabilan, integrálunk egy tóméra gént, ami egy olyan nukleinsav szekvenciát tartalmaz, ami képes egy hozzá működés szempontjából hozzákapcsolt kódoló szekvencia által kódolt termék expresszíőját vezérelni, és az említett nukleinsav szekvencia lényégében azonos a 8. számú szekveneiavázlaton bemutatott szekvenciával, vagy azzal legalább 65%-ban homológ, és lényegében azzal azonos funkciókkal rendelkezik, és képes ingerekre reags
Az inger előnyösen fény és/vagy különböző koncentrációjú cukor jelenléte vagy távolléte. Egy másik változat szerint az inger egy olyan inger, amit a fejlődési folyamat szabályos.
A cukor előnyösen a szacharóz vagy glükóz közül az egyik vagy mindkettő.
A cukor előnyösen szacharóz.
Az indukálható promoter, vagy a nukleinsav szekvencia, ami képes az- említett termék expressziőját vezérelni egy növényben,. olyan körülmények között működőképes, amikor nincsen tény, de van cukor, vagy olyan körülmények között, amikor nincs cukor, de fény van. A növénynek az a szövete, aminél nincsen fény, de cukor lehet jelen, általában a földalatti szer vagy nyeld szerv. A földalatti szervek lehetnek például a gumók, rizómák vagy·' gyökerek, míg más nyelő szervek lehetnek a fiatal levelek vagy' magvak.
Az a szövet, aminél nincs cukor, de fény van, lehet idősebb levél (ahová nem szállitődik cukor}, virág-rész vagy csírázó magvak.
A jelen találmány tárgyát képezik továbbá azok a konstrukciók vagy kiméra gének, amiknek a DNS-e az előzőkben ismertetett strukturális tulajdonságokkal rendelkezik.
Az egy kiméra gént tartalmazó nóvénysejtek, amely kiméra gének tartalmaznak egy előzőkben ismertetett, plasztidha célzó szekvenciát kódoló nukleinsav szekvenciát, valamint egy olyan enzimet kódoló nukleinsav szekvenciát, ami részt vesz a keményítő bioszintetikus vagy lebontó bioszintézis útjában, vagy egy
Λ 9 ♦ * > * ♦ ♦ * Φ** kíméra gént, .ami egy olyan nukleinsav szekvenciát tartalmaz, ami képes egy további kódoló szekvencia expresszíóját vezérelni, vagy egy oly an kim éra gént, ami az előzőkben ismertetett, egy' ingerre reagáló nukleinsav szekvenciát tartalmaz, valamint tartalmaz. egy kódoló szekvenciát, és az említett kódoló szekvencia expressziójának szintje az említett nukleinsav szekvenciára alkalmazott inger hatására változó, szintén a jelen találmány tárgyát képezik, ugyanúgy, mint a jelen találmány szerinti egy vagy több kíméra gént tartalmazó transzformáit növény magvak
A plasztidba célzó szekvencia előnyösen az l, számú szekvencia.
A jelen találmány egyik első megvalósítási módja szerint az
X
t.:
előzőkben ismertetett módszert arra használhat!
a, megváltoztassuk egy levél metabokzmusát, oly módon, hogy' a keményítő akkumulálódik benne, vagy' mobilizálódik belőle, ez a módszer a teljes növényben megváltoztatja a forrás-nyelő kapcsolatokat, Ezt úgy érhetjük el, hogy a célzó szekvenciát és egy , a keményítő bíoszintézis- vagy lebontási útvonalában levő enzimet kódoló nukleinsav szekvenciát egy megfelelő promoter vezérlése alá helyezve biztosítjuk, A megfelelő promoter kiválasztása egy növényben a keményítő mennyiségének növekedését vagy csökkenését eredményezheti a levelekben, ami például a dohányipar számára lehet hasznos: vagy, egy másik változat szerint, különböző más növényi szövetekben, azaz például a gumókban, gyümölcsökben és gyökerekben eredményezi a keményítő-termelés
17Jl * φ »4 *** * ♦ ** * megváltozását, a forrás-nyelő kapcsolatok növényben való megváltoztatását követően.
Λ jelen találmánynak ebben a megvalösitásí módjában egy megfelelő promoter biztosítja a plasztídba célzó szekvencia és egy, a keményítő bíoszíntézis- vagy lebontási útvonalában levő enzimet kódoló nukleínsav szekvencia expresszióját a teljes növényben, azaz konstitutív expressziét biztosít, vagy specifikusan a növényekben való expressziót biztosítja. Ezek a változásoknak komoly a hatásuk, azaz a növényi szervek keményítő-tartalma és/vagy termelése szignifikánsan megváltozik.
Egy előnyben részesített promoter, amelyik az összes növényi szövetben képes vezérelni az expressziét, a karfiol mozaikvírus 35S génjének promotere, A levélben való expressziőhoz a ribulőz- l,5-biszíoszíát-karbcxiiáz kis alegységének génjéből származó promotert, vagy a borsé plasztocianin génjének promoterét használhatjuk. A szakterületen jártas szakember más alkalmas promoterek'et is ismer, mind a konstitutív expresszióhoz, mind a levélspecifikus expresszióhoz, mint például a nopaün szintetáz promotert és a klorofill a/b kötő fehérje promoterét,
A keményítő bioszintézisében vagy lebontásában szereplő enzim kódoló szekvenciáját vagy annak részeit a normális leolvasási rendnek megfelelően (azaz értelmes irányban}· rendezhetjük el, vagy pedig ezzel ellentétes (antiszensz} irányban. Egy enzim növényben való aktivitásának növelése vagy csökkentése értelmes-, -antiszensz- vagy ko-szuppressziés technológia alkalmazá-i84 4 savai (az utóbbit a DNAP írja le a 0465572 és Ö647715 számú európai szabadalmi bejelentésben) használható arra, hogy a keményítőben változást a növényekben.
v· v1
A jelen találmány egy második megvalósítási módja szerint a találmány szerinti eljárás arra is használható, hogy megváltoztassuk a keményítő metabolizmusát a tároló szervekben, oly módon, hogy a keményítő-tartalom megnöveljük, és/vagy a keményítőt egy kiválasztott ipari eljáráshoz az igényeknek megfelelő formában biztosítjuk. Ilyen eljárás például a papírgyártás, gyógyszerek, textíliák, festékek és építőanyagok gyártása, sütőipari, tejipari és gyorséttermi termékek előállítása, konzervált, szárított vagy instant élelmiszeripari termékek előállítása; magvak malátázása és szirupok, valamint alkoholok előállítása.
.Az- eljárás első vagy második szempontja szerint a találmány szerinti kiméra génben való használatra kiválasztott gén származhat a keményítő lebontási folyamatából, azaz például lehet keményítő-bontó enzim, A kiméra gén előnyösen tartalmaz egy kloroplasztba irányító béta-amilázt (a továbbiakban et bétaamiláz néven említjük), még előnyösebben tartalmaz egy Amőídopsis íhaánnu-bol származó et béta-amilázt (a továbbiakban At et béta-amiláz néven említjük), lásd a 3. számú szekveneíavázlatot. Az At et héta-amilázzal homológ szekvenciák, amik más növényekből, azaz például burgonyából, dohányból, búzából és árpából származhatnak, szintén használhatók. A hibridizációval vagy polimeráz láncreakcióval (PCR) végzett standard klónozást technikák használhatók a szekvenciák izolálására; pél5..:
V ’ * 4
-19* *** dául a Sambrook és munkatársai által leírt molekuláris klónozást technikák (Sambrook és mtsak Moiecular Cloning: A Laboratory Manual; 2. kiadás. Cold Spríng Harbor Press, Goid Spring Harfeor, N.Y. (1989)] és az limes és munkatársai által publikált polimeráz láncreakciős (PCR) technikák (ínnes, M.A., Gelíand, Ö.H., Snínsky, J.d. és White, T.J.: PCR Protocots, Academíc Press (1.990) t Más keményitőbontó enzimek, amik közül egynek vagy többnek a kódoló szekvenciája alkalmas a plasztidba irányító szekvenciával való használatra, lehetnek az alábbiak: alfaamiláz, diszproporcionáló enzim, elágazást megszüntető enzim, keményítő foszforíláz, alfa-glükczídáz cs nem-plasztidos bétaamiláz.
A találmány szerinti eljárás második tárgya szerint azokat az előnyben részesített promotereket, amik az expressziüt a növények tároló szerveiben vezérlik, az alábbi listában szereplő génekből vehetjük ki; a búza. endosperma nagy molekulasúlyú giuteninjének génje, a búza endosperma. al£a,béta~gliadin génje; az árpa endosperma hordóin génje, vagy a burgonyagumó patatin génje. Más megfelelő promoterek ismertek a szakterületen jártas szakember számára.
A jelen találmány tárgya továbbá, hogy a szöveti metabolizmusnak vagy a keményítő típusának vagy jellemzőinek megváltoztatását ingerre reagálóvá, azaz például índukálhatóvá tehetjük, az alábbiakban ismertetett indukálható promoter használatával (8. számú szekvencia). Például az indukálható promoter fénnyel való indukáihatösá.ga használható arra, hogy manipulátt*.
:0 juk a magokat, egy gént, például a Barnase-t indukálva (amint azt például a WÖ 98/10081 számú szabadalmi .leírásban ismertetik), amivel a pollen fejlődése befolyásolható, vagy hogy a lényre nem reagáló géneket befolyásoljuk, a fénytől más módon függő folyamatokban, mint például a gyümölcsök érésében vagy a magvak érésében. A fénnyel indukálható promoter arra is használható-,. hogy vele olyan géneket kapcsoljunk be, amik a szekunder bíoszintézis folyamatokat, azaz például az alkaloidatermelés-t érintik a levelekben. A fénnyel indukálható promoterek arra is használhatók, hogy manipuláljuk a keményítő bioszintézis génjeit a levelekben vagy más fotoszintetikus szövetben, vagy például arra, hogy a gumó (például a sötétben való tárolásból való) eltávolítása után bekapcsoljunk géneket. Az indukálható promoter cukorral való indukáíhatösága használható a géneknek például a fejlődő gumóban vagy más, nem fotoszintetikus szövetben való szabályozására, ilyen gének lehetnek például a kártevő rezisztenciát biztosító gének, és/vagy a betakarítás után befolyásolhatják a termény minőségét. A burgonyáknál a penészedés, a torzsarothadás, és száraz rothadás elleni rezisztenciát biztosító gének lehetnek hasznosak, és ezek előnyösen rekombináns génekbe, cukorral indukálható promoterek mögé klónozhatok. Egy másik változat szerint az indukálható promoter cukorral való indukálhatós-ágát használhatjuk arra, hogy a szövettenyésztésí eljárásokban meghajtsuk a szelekciós markerek génjeit.
A szakterületen jártas szakember jól ismert technikák, mint például delécíős vizsgálatok, használatával könnyen felvázolhatja **φ a 8. számú szekvenciából a cukorral indukálható·, reagáló elemeket és/vagy a fénnyel indukálható, reagáló elemeket 'Pwee és Gray publikációjukban egy ilyen delécíós vizsgálatot ismertetnek a borsó- plasztocianin génjében, egy marker gén használatával, azzal a céllal, hogy meghatározzák, ezek operatív régióit {Pwee, K.H. és Gray, J.C.: Ránt Journal 3, 437-449 (i993)i
Az alábbiakban, vagy például Sambrook és munkatársai, illetve Gelvin és Stanton laboratóriumi kézikönyvében a génszekvenciák klónozására és· a megfelelő hordozókba (vektorok vagy plazmidok, stb.) való beillesztésére ismertetett eljárások jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára, hogy ezeket a koncepciókat működőképessé tegyék [Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, M.Y, (1989); Gelvin, S.8. és Sehilperoort, R.A.; Plánt Molecular 8-iolo-gy Manual, 2, kiadás. Kluwer Academic Publishers, Hollandia (1995)], Az előzőkben ismertetett kiméra gén vagy kiméra gének beilleszthetők önmagukbán, vagy kísérheti őket egy vagy több más kiméra gén, például az előzőkben ismertet más gének közül egy vagy több. Az előzőkben ismertetett megvalósítási módokban, amikben egy első, a keményítő lebontó bioszintézis útjába tartozó kiméra gént használunk, a második kiméra gén tartalmazhat például egy olyan nukleinsav szekvenciát, ami a keményítő bioszintézis útjába tartozó enzimet kódol, szintén egy megjelelő promoter és megfelelő termínátor vezérlése alatt. A. második kiméra gén promotere és/vagy ternúnátora lehet ugyanaz, vagy lehet más, mint az első ·>··>
*
4.4 - ·4 « 4 4
** 9 «ί* '·' 4 * ♦* ♦ méra gén promotere és/vagy ternnnátora, A keményítő bioszintézís útba tartozó enzimeket kódoló megfelelő szekvenciák az alábbi nukleinsav szekvenciák lehetnek: szacharóz-szí ntáz., ADPG pirofoszforíláz, keményítő szintáz, de lehetnek elágaztató enzim, alfa-amiiáz, ízo&miláz, nem-plasztídos béta-amiláz, alfaglükozidáz, keményítő foszforiláz és diszproporcionálő enzim.
Egynél több kíméra génnek a növénybe való bejuttatásához használt eljárásokat már publikálták, ide tartozik egy bináris vektor készítése, amiben a. kíméra géneket egyetlen nukleinsav molekulában kapcsolják össze; ko-transzformáció, aminek során kettő vagy több különböző xégrobacforium sejtet használnak, például különböző bináris vektorokkal, amik különböző kíméra géneket tartalmaznak', vagy már egy első kíméra gént tartalmazó növény transzformálása egy második, eltérő kiméra génnel, ezt nevezik retranszformáeiónak. Az utóbbi esetben a transzgeníkus növényeknek a második kiméra gén bevitele utáni szelekciós módszere eltérő kell, hogy legyen attól a szelekciós markertői, amit az első kíméra gén bevitelénél használtunk. A. megfelelő szelekciós markerek közé tartoznak például a hígrom lein-, szulfonamid- és Basta-rezisztenciát kódoló gének. A biológiai módszer, azaz például két, eltérő kiméra gént tartalmazó növény keresztezése is használható.
Kíméra génkonstrukciókat készíthetünk, hogy arra használjuk, hogy megváltoztassuk egy már transzformált növény keményítő-tartalmát, ami szignifikáns növekedést mutat egy első
5.
V c * v * 4 * * 4 r, :
enzim aktivitásában., és ennek következménye a keményítő szintézísének megváltozása.
Tehát a jelen találmány tárgya eljárás egy transzgenikus növény megváltoztatására, amely növényben egy enzim aktivitása genetikai transzformáció következtében megnőtt vagy lecsökkent, amely változtatás következtében a már említett enzim aktivitása megnő, vagy lecsökken, és ezzel a retranszformált növényben megnő a keletkezett keményítő mennyisége.
Az első transzformált növényben előnyösen megnőtt egy, a keményítő bioszintézis útba tartozó enzim aktivitása. Egyik példája annak a kísérletnek, hogy megnöveljék egy növény keményítő-tartalmát, egy' AÖPG- PPázzal, például a pípCIb-tal (lásd például a 91/19606 számú szabadalmi bejelentést) transzformált transzgenikus burgonya. A keményítő mennyiségének növekedése egy ilyen növényben viszonylag kicsi. Ezt az első transzformáit növényt előnyösen re transzformáljuk egy’ keményítő-bontó ♦ «
Λ- »
t.u* « * * * enzimet kódoló kiméra génnek ami megfelelően tartalmazza például az At ct béta-amilázt. A glgClő fehérje expresszálódík az első transzformált gumókban, és ennek eredménye a megnövekedett ADPG-PFáz aktivitás, valamint a szénatomoknak a keményítőbe való áramlása, A kiméra At ct béta-amiláz gén. vagy annak egy részének expressziöja a retranszformált gumókban előnyösen a ct béta-amiláz aktivitás csökkenését eredményezi, azaz például ko-szuppressziót vagy antíszensz hatást, ezzel biztosítva a keményítő akkumulálodásának fokozódását.
2:4A -isit. i.ü<.· enzim expresszióját előnyösen a gumókba irányítjuk. Egy megfelelő promoter,. amivel az At ct béta-amiláz kiméra gén expresszióját a gumókba lehet irányítani, a patatin génből származó promoter.
Az első, a pipCld-ot expresszálő transzformált burgonyanövény kanamicin rezisztens, ezért az .Al et béta-amilázt tartalmazó kiméra gént hordozó bináris vektor egy másik rezisztencia gént hordoz, előnyösen például egy szulfonamíd rezisztenciát kódoló gént. A megnőtt keményítő-termelés a burgonyagumóban előnyös lehet például a sültkrumpli készítésnél, mivel a burgonya szárazanyagának 1%-os növekedése 4%-os terméknövekedést eredményez,
A sültkrumplí készítés a találmány egy másik előnyét is illusztrálja, Ha a burgonyagumókat 8 *C alatt tároljuk, akkor a keményítő lebomlásából származó redukáló cukrok, a glükóz és a fruktóz mennyisége megnő. Amikor a burgonyát megsütik, akkor a redukáló cukrok Maitlard reakcióban reagálnak az aminosavakkal, ezzel a termék barna elszíneződését és rossz ízét okozzák, A burgonyanövényekbe egy kiméra gént juttatunk be, amí leállítja, a. keményítő lebomlását, és ezzel a redukáló cukrok ak~ kumulálődását, ami előnyös lehet a gyorsétkeztetéssel foglalkozó cégeknek. A kiméra gén előnyösen tartalmazza a béta-amiláz kódoló szekvenciáját, vagy a kódoló szekvencia egy részét, egy koszuppressziős vagy antíszensz konstrukcióban, amit egy megfelelő promoter és fcerminátor vezérel. Egy megfelelő promotert a rgony&gumőkban levő patatin génjéből vehetünk ki, A ct bétaΙ-Λ •25
-♦ *«. .·.·.·.*.......·*·' · · »* *·♦* * amiláz helvett előnyösen bármelyik másik, már említett kéményitó-bontó enzim, használható.
A 8. számú szekvencíavázlaton bemutatott, indukálható promoter is használható a konstrukcióban, ha fejlődő levelekben és a fejlődő gumóban ko-ordínált expressziőra van szükségünk, mivel a patatin promoter emellett szacharózzal is indukálható IRocha-Sosa, M., Sonnewald, U., Frommer, W., Stratmann, M.. Schell, d. és Willmitzer, k; EMBO 8, 23-29 (1989)), Hasonló módon, a kloroplasztba irányitó polipeptid (1. számú szekvencia) is használható bármilyen más génnel, amiből hiányzik a saját célzó szekvencia, és ami ahhoz szükséges, hogy a plasztidokfea legyenek Irányítva.
A fend példák azt a célt szolgálják, hogy a jelen találmány használatának lehetséges jótékony hatásait illusztráljuk. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a gének és növények kombinációja, amikre a találmány használható, igen jelentős.
A gén-kombinációk előnyösen tartalmazzák a. et bétaamiiázt, egy vagy több génnel, ami lehet szacharóz-szintáz, ADPG pirofoszfonláz, keményítő-szintáz, elágaztató enzim, alfa-amiláz, izoamiláz, nem-plasztídos béta-amíiaz, alfa-glükozidáz, keményítő foszforiláz és díszproporcíonáló enzim, .amiknek a szekvenciája ismert a szakterületen jártas szakember számára. Egy másik változat szerint a ct béta-amiláz célző- szekvenciáia használr„ j ható az előzőkben említett gének közül eggyel vagy főbbel.
.···♦' ♦ «** * ♦ »»*» **♦ **
9« 9 φ A
Előnyösen a transzformálható- növények közé tartozik a burgonya, a búza, a kukorica, az árpa, a paradicsom, a rizs, a oorso, a szója, az amerikai mogyoro, a ca, a oanan es a ooAz alábbiakban a találmányt példákon keresztül ismertetjük, hivatkozva arra a -megvalósítási módra, amiben ct bétaamíláz cDNS-t Izolálnak Amöidopsés fhoiiana-ból és a cDNS~t dohány, valamint burgonyanövényekbe építik be. Az ingerre reagáló promoterre és aktivitására ís adunk meg példát transzgenikus növényekben.
Ahhoz, hogy a találmány könnyen kivitelezhető legyen az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.
Az 1. ábrán az in oitro radioaktív izotóppal jelzett transzlációs termékekkel kapott eredményeket mutatjuk be, amikből mintát vettünk, és SDS-PAGE gélen futtatjuk, majd (luorográfíát hajtunk végre. Ábramagyarázat; Molekulasúly markerek (M sáv); transzlációs termékek (Tr sáv); kloroplaszt, újra izolálva és termolizinnel kezelve, import inkubálás után (C sáv); sztróma frakció (S sáv); mosott tiiakoídok (T sáv); termolizinnel kezelt tiiakoídok, (t’T sáv); belső burok frakció (I sáv); külső burok frakció (O sáv). Feltételezett, prekurzor (P), a öéta-amiláz intermedier (!) és érett (M> formái. Kilodalton (K).
A 2. ábrán látható a fény hatása, valamint a fény és a cukrok hatása a ct béta-amíláz transzkriptumok expressziójára Arabidqpsís tha&ana palántákban, A 2a. ábrán talajban növesztett, kétnapos folyamatos megvilágításnak kitett öthetes ι,,ί.
V* • X ·'·«« ♦ ·*· - •Ar ♦·*'·
Arabfoopsís növények össz-RRS-ének Northern biot elemzése látható (b), ugyanez kétnapos folyamatos sötétséggel (D), kétnapos megvilágítás plusz háromnapos megvilágítás (bt); vagy kétnapos sötétséget követő folyamatos megvilágítás (DL), A 2b. ábrán ín vitro növesztett» utána vagy vízbe rakott és háromnapos folyamatos megvilágításnak kitett. (Wlj. vagy 5%~os szacharózba tett és háromnapos sötétségnek kitett (SD), vagy háromnapos folyamatos megvilágításnak kitett (SL), vagy 5%-os glükózba tett, és háromnapos sötétségnek kitett (GD), vagy háromnapos folyamatos megvilágításnak kitett (Gt) öthetes Arabídopsís növények. össz-RNS-ének Northern bfottja látható. A Northern biottokat radioaktív izotóppal jelzett ct-öm.^ cDRS ínszerttel hibrídizáltatjuk és autoradiografáljuk (felső panelek). A megfelelő eiídiumbromiddal festett formaldehíd-agaróz géleket az alsó panelekben mutatjuk be,
A 3, ábrán az alábbi, 3» példában készített kiméra ct bétaamiláz promoter-GUS gének T-DNS-ének díagrammszerü reprezentációja látható, amiben a NosP a nopalín színtetáz- promotert jelenti; a NosTa nopalín színtetáz terminátort jelenti; BR jelenti a. pBHOl T-DNS jobboldali invertált ismétlődését, BL jelenti a pöl 101 T-DNS baloldali invertált ismétlődését. A ct béta-amiláz promoter fragmenseket vonalkázott derékszögű háromszögek mutatják; a polimeráz láncreakcióval amplifikált Xböl-BámHl összekötő fragmenseket fekete derékszögű háromszögek jelentik.
Φ* » ♦ « » ·> « *
··♦ V ♦*
4* * x * φ * » * ~'S
A 4.. ábrán a fény és a szacharóz hatása látható a ct S/rn/ promoter-GUS tóméra génről expresszált GUS aktivitására dohány palántákban;
Az 5. ábrán látható a pDV35S (SK) V donor vektor plazmidA 6. látható a pDV02000 donor vektor piazmíd-térképe.
A 7. ábrán látható a pBHP10431 bináris vektor piazmídtérképe, amiben 35S jelentése a CaMV 35S promoter, et bamy jelentése a teljes hosszúságú ct béta-amiláz cDKS, 35St jelentése a CaMV 35S termmátor, PB jelentése a pBinPlus bináris vektor jobb oldata, colElori jelentése a colEl eredetű bakteriális replikációs origó, Rkori jelenti az RK2 plazmid oriV replikációs origóját, npttn jelenti a baktériumokban kanamícin-rezísztenciáfc biztosító neomieínúbszfotra.nszferáz gént, LB jelentése a bináris vektor baloldali szekvenciája, kan jelentése a növényi rekombínáns neoniíein-foszfotranszferáz gént, amire azért van Sí a növény k:anamtein rezisztens tegyen.
A 8. ábrán látható a pBNP10432 bináris vektor plazmidtérképe, amin a rövidítések jelentése ugyanaz, mint a 7. ábrán.
A 9. ábrán látható a pSN.PÖ2431 bináris vektor plazmidtérképe, amin a rövidítések jelentése ugyanaz, mint a 7. ábrán, azzal az eltéréssel, hogy a patp a 6, ábrán látható pDVÖ2ÖOÖ vektorban levő I-es osztályú pata.tínt jelenti, nőst jelenti a nopalin szintetáz terminá.tort.
A 10. ábrán a pB.N.FÖ2432 bináris vektor piazmíd-térképe látható, amiben a rövidítések jelentése ugyanaz, min t a 9. ábrán.
*Αζ alábbiakban röviden ismertetjük a leírásban említett szekvenciákat.
Az 1. számú szekvencia annak a nukleínsavnak a szekven- Kb * * * * ciája, amely képes egy kódoló szekvenciát egy növényi plasztid, f·,* főleg kloroplasztba irányítani. * „ « *
A 2. számú szekvencia égy béta-amiiázt kódoló nukleinsav, * ♦
A 3. számú szekvencia a kloroplasztba irányított (ct) bétaamiláz komplett szekvenciája.
A 4, és 5. számú szekvencia a 3. számú példában használt prímerek szekvenciája.
A 6. és 7, számú szekvencia a 4. számú példában használt primerek szekvenciája.
A 8. számú szekvencia annak a nukleínsavnak a szekvenciája, amely ingerekre, főleg fényre és/vagy cukorra reagál.
1. Példa.
Arabldonsls thafenn kloroplasztba. irányított béta-amiiáz izolálása és szekvcnálása
A pSmy8X-feen levő cONS inszert szekvcnálása
Egy 37 kílobázis méretű Ara&ídopsis IV-es kromoszómálís
DNS G16599 kozmídban (Bevan, M.V. és mtsai: Natúré 39.1, 485-488 (1998}J levő fragmense nukleotíd szekvenciájának a BLASTN adatbázisban való kereséséből kiderült, hogy van rajta egy gén, ami szignifikáns homolőgí&t mutat az Arabidopsis, az árpa, a búza, a rizs és a szója extrakloroolasztos béta•Sö·
** amílázaval. Á kutatás során azonosítottunk számos 3‘ terminális EST szekvenciát is, amik közül az egyik, az EST 81E1ÖT7 (Newman, T. és mtsai: Plánt Physiot 106, 1242-1255 (1994)], amit a továbbiakban pBmyS 1 néven említünk, több mint 300 nukleotidban azonos volt. Az EST 81E1ÖT7 kiónt az Arabidopsis Resource Center (ASRC) DNA Stock Center-tői (Ohio University, USA) kaptuk. Bal31 deléciós szubklonck hálós sorozatát, amik lefedték a pBmyS 1-ben levő cDNS inszertet, használjuk DNS terápiáiként kétszálü polimeráz láncreakciős ciklus szekvenáló reakciókban, fluoreszcensen jelzett univerzális primerek felhasználásával. A szekvenáló reakciókat egy Applied Biosystems Model 373A automatizált szekvenálóval szekvenáljuk. A pBmyS 1-ben levő cDNS ínszert nukleotid szekvenciáját a 3. számú szekvenciayázlaton mutatjuk be. A pBmyS 1 konstrukciót 1998, augusztus 4-én az Advanced Technologies (Cambridge) Limited helyezte letétbe (Cambridge Science Park. Cambridge CB4 4WA, az „International Recognition. of the Deposit of Mícro-Organisms fór the purposes of Patent Procedures* Budapesti Egyezmény értelmében, a National Collection of Industrial and Maríné n , $ * >· * *
Λ *
S* * » » * *
♦ í
Bacteria (HClMB)-nél (23. St. Machar Street, Aberdeen Scotland), NCJMB 40964 letéti számon...
Egy feltételezett kioroplasztfea célzó szignál azonosítása
A pBmySl cDNS tartalmaz 36 nem-transzlálődő nukleotidot.
az 5' végén, valamint egy nyitott leolvasási keretet (ORF), ami 548 aminosavat kódol, és egy 232 bázíspár méretű 3' nem-3ί transzlálódó régiót (ÜTR). A my81 cDNS ínszert által kódolt várt molekulasúlya 61 kDa, és komoly aminosav homológiát mutat a kukoricából, rizsből,, árpából, szójából és édesburgonyából származó növényi extraklorcplaszícs béta-amüázofckal. Azonban a pBmySl által kódolt, fehérje eltér az összes eddig leírt bétaamiláztői, amennyiben tartalmaz egy egyedi N-termináíis extenzíőt, ami egy kloroplasztba célzó szignál jellemzőivel rendelkezik, azaz magas a szerin- (16%), treonín- (10%) és pozitív töltésű aminosav (15%) tartalma (Baier, M. és Dietz, K.J.: Plánt Journal 12, 179-190 :(1997)). Három, a kloroplasztba célzó szekvenciákra különösen jellemző domént (Schatz, G és Dobbersteín, 8u Science 271, 1519-1526 (1996)| azonosítottunk a szignálszekvenciában: egy töltés nélküli H-terminális domént: egy centrális, hidmxilezett aminosavakban gazdag domént; és egy C-terminális domént, aminek megvan az amfífil béta-lánc képződési potenci2 »
Λ * * xKG ♦ $ KG aha.
A pBmy81-ben levő cDNS inszert egy kloroplasztba célzó béta-amllázt kódol
Érintetlen kloroplasztokat izolálunk 50-60 g borsó hajtásból ÍFisuai salam L. var Feltham First), lépcsős Percoll gradiens alkalmazásával. A növény szaporítását és a kloroplasztok izolálását Mould. és Gray módszerével hajtjuk végre (Mould, R.M. és Gray, J.C.: /n: Cell Bioíogy, »A Laboratory Handbook, 2. kiadás, 2. 8186. oldal, szerk.: Cella, J.E., New York Academic Press f
A pBmy-81 plazmidot Noti restrikciós enzimmel végzett emésztéssel linearizáijuk, majd ín mire átírjuk, T7 RNS polimeráz alkalmazásával. A radioaktív izotóppal jelzett prekurzor fehérjét pBmvSl eDNS-röl búzacsíra transzlációs rendszerben szintetizáljuk, ami tartalmaz 35S~metionint és 35S-ciszteint, lényegében Mould és Gray módszere szerint [Mould, R.M. és Gray, J.C.: fn; Cell Biology, „A Laboratory Handbook, 2, kiadás, 2, 286-292. -oldal, -szerk.: Cells, J.E., New York Acaáemic Press (1997)).
A radioaktív izotóppal jelzett ín vitro transzlációs termékek importját Mould és Gray módszerével hajtjuk, végre (Mould, R.M. és Gray, J.C.: fn; Cell Biology, „A Laboratory Handbook, 2. kiadás, 2, 286-292. oldal, szerk.; Cells, J.E., New York Academic Press (1997)). Az import inkubáiás után az érintetlen kloroplasztokat--30 percig jégen termolizínnel kezeljük (0,2 mg/ ml végkoneentrácíó Import pufferben), majd a proteáz reakciót 50 mmol/1 BDTA-nak az import pufferhez való hozzáadásával állítjuk le. A kloroplasztokat re-izoiáljuk egy import pufferben készített, 40%-os Percoll párnán keresztül, majd Import pufferben mossuk [Mould, R.M. és Gray, J.C.: ín; Cell Biology, „A Laboratory Handbook, 2. kiadás, 2, 286-292, oldal, szerk.; Cells, J.E., New York Aoademic Press (1997)]. A termolizinnel kezelt kloroplaszt mintából 1/10 té-ríbgatnyi alikvot részt veszünk ki elemzés céljára, majd a megmaradt részt lényegében Sebnek és Blobel leírása szerint frakcíonáljuk [Sebnél!, D.d. és Blobel G.; of Cell Biology 120, 103-115 (1993)1. A termolizinnel kezelt kloroplasztokat, a sztróma-frakciót, a tilakoid-okat és a »> *
4V‘ ♦ X.
* «** 4 termolizínnel kezelt tílakoídokat SDS-PAGB-val, majd Coomassíe Blue festéssel, majd a festett fehérjeesíkok scanning denzítometriájával (standardként a ríbulóz- l,5~biszíoszfát~ karfooxüáz és a fénygyűjtő komplex fehérjék alegységeit használjuk) mennyiségileg meghatározzuk. Ezekből a frakciókból ekvivalens mennyiségeket (a Percoll gradiensről kinyert kloroplaszt körülbelül 2%~ának megfelelő mennyiség), valamint a kinyert belső és külső burok frakciók 5öS-jét elektroforézissel elemezzük 1Ö%os poliakrilamíd gélen, SDS jelenlétében, majd fluorográfiát hajtunk végre. Az eredmények (l. ábra) azt mutatják, hogy a fő transzlációs termék (Tr sáv) molekulasúlya körülbelül 58 köa. Izolálás után az intakt borsó kloroplo.szt.okat a radioaktív izotóppal jelzett fehérjével inkubáljuk AXP jelenlétében, ekkor'körülbe lül 50 és 48 kDa méretű polipeptidek keletkeznek (C sáv). Ezeknek a polípeptideknek a kívülről hozzáadott termolizínnel való teással szemben tanúsított ellenállása azt mutatja, hogy ezek radioaktív izotóppal jelzett fehérje importjának termékei. Az intakt, termolizínnel kezelt kloropiasztok sziromévá, mosott tilakoidokká, termolizínnel jelzett tilakoidokká, belső hurkokká és külső burkokká való írakeionálása azt demonstrálja, hogy a két, radioaktív izotóppal jelzett, fehérje a sztróma frakcióban található.
«4 * » * * « 4
t.
. Példa
Az Arabidopsis thabana ct béta-amiláz gén szacharózzal és fém nym való indukciója
A ct béta-amíláz Ambidopsís tkabana Landsberg Ökotípus növényekben fénnyel való indukálásának demonstrálására a növényeket üvegházban szaporítjuk 18 órás megvilágítás, 6 órás sötét ciklusban, 18 °C~on. 5 hét elteltével a hajtásokból 2 tálcát teljes sötétségbe viszünk át, két másik tálcát pedig folyamatosan megvilágítva szaporítunk. Két nap elteltével a sötéthez adaptált hajtások közül az egyik tálcát és a teljes fényben növesztett hajtások közút is az egyik tálcát használjuk arra, hogy ossz-RNS-1 izoláljunk belőlük, majd a megmaradt második tálcákat egyformán háromnapos folyamatos megvilágítás mellett növesztjük.
A kombinált szacharóz-fény-sötét kezelésekhez a Landsberg ökotípus- magvait a felületükön sterilezzük, 1% szacharózt tartalmazó MS agar felszínére helyezzük, majd megfelelő körülmények között 18 órás megvilágítás, ö órás sötét ciklusban növesztjük. Az öthetes hajtásokat steril desztillált vízbe, vagy 5%-os vizes szacharóz vagy glükóz oldatba tesszük, A magvakat 3 napig vagy folyamatosan megvilágítjuk, vagy folyamatosan sötétben tartjuk. Mindegyik féle hajtásból össz-RNS-t izolálunk, majd Northern blottal. elemezzük, Eggermont és munkatársai leírása szerint (Eggermont, K,, Goderis, I.J. és Broekaert, W.F.: Plánt Molecular Biology Rep, .14, 273-279 (1996)}. A Northern biottokat a pBmyS 1-ben levő, gélen tisztított, majd Feínberg és Vogelstein módszerével (Feínberg, A.P, és Vogelstein, Bo Analytical
n.:.
*
Bio-chemistry 132, 6-13 (1983)] ^P-dCTP-vel véletlenszerűen jelzett cDNS inszerttel vizsgáljuk át.
A 2A. ábrán ismertetett eredmények azt mutatják, hogy a ct béta-amiláz gén transzkriptuma fénnyel indukálható.
A 2B. ábrán ismertetett eredmények azt mutatják, hogy a ct béta-amíláz transzkrip-tum a sötétben 5% szacharózzal indukálható, és kisebb mértékben, de indukálható 5% glükózzal. Ez az indukció tovább fokozódik fényben, a cukrok jelenlétében. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a fény és a cukrok hatása egymástól független.
t.,n $» *, * * ♦
3. Példa ct béta-amilág promoter-GUS fúziók készítése
Restrikciós enzimes- emésztéssel promoter fragmenseket izolálunk a G16559 kozmidban (Bevan, M.V. és mtsai: Natúré 391, 485-488 (1998)) levő et béta-amiláz génből. A promoterben levő kényelmes restrikciós- hasítási hely a Hindik a -1662-as nukieotíd pozícióban (a 8. számú szekvencia mínusz szála 19179-es b-ázispárjánál indulva)., a Sáli a -~H27~es bázispámál és a PstI a -371-es bázispárnál, és egy Xhol hasítási hely a ct béta-amiláz ΉΙ-es pozíciójában, az iniciálö metionin után, ezeket használjuk három különböző hosszúságú promoter plusz tranzit peptid szekvencia izolálására (a transzlációt iniciálé metionin ATG kodonja. a 4-1 jelzésű).
A G16599 kozmádban (Bevan, M.V. és mtsaí: Natúré 391, 485-488' (1998)] levő ct béta-amiláz génnek egy 294 bázispár méliükáiink, az alábbi retü fragmenset (1. számú szekvencia) oligonukleotid primerek felhasználásával:
4< számú szekvencia
Pl: (S'-AAT TCC TCG AGT TCT CTT ATC ~3')
S. számú szekvencia
P2: IS'-cev aÁT CCC TGA CA? TGT TAC -33.
* X
A Pl primerben az aláhúzott bázisok a +2l-es pozícióban levő Xhol hasítási helynek felelnek meg; a P2 primerben a kisbetűvel írott bázisok a hozzáadott nukleotidoknak feleinek meg, amiket -egy BamHI hasítási hely létrehozása céljából adtunk hozÁ kíméra ct béta-amiláz promoter-GUS géneket a promoter íragmens tripla Ugatásával hozzuk létre; a polímeráz láncreakció áthidaló fragmenst Xhol és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük; és a pBIlÜl GUS vektort [deíiérson, R.A,, Kavanagh, T.a. és Bevan, AOV,: EMBO Journal 6, 3901-3907 (1987)1
HindllTBamHI, Báli-BamHI vagy Pstl-BamHl restrikciós enzimekkel emésztjük (3, példa). A konstrukciók jelzése HbétaGUS,
A kíméra génkonstrukciókat Áprohnctehum. tume/aciens LBA4404· törzsbe visszük át, háromszüiős keresztezéssel (Bevan, M.W.: Nuoleic Acids Research 12, 8711-8721 (1984)], majd Atbohann fahacum. var Samsun-ba visszük be a levélkorong transzformációs módszerrel (Horzsh, R.B., Pry, Hoffrnann, *♦«» ** Φ ♦ ♦ * ♦ φ ·.. ..Φ·· «..'··”♦ · · Φ » Φ φφ ββ>* X Φ ** φ
N.L, Eiehholtz, D., Rogers, S.G. és Swaley, R.T.: Science 227, 129-1231 (1985)1
A kiméra Araö?uonsiá thnátma et béta-amiláz promoter-GUS gén szacharóz- és fény-mdukcíóia dohány bahasokban
A HbétaGUS és Fbéta-GUS konstrukciókat -tartalmazó növények magas szintű GUS aktivitást expresszálnak, és a vonalak El utódait használjuk a kiméra gének fénnyel és szacharózzal való índukálhatóságának vizsgálatára. Az FI dohány magokat felületükön sterilezzük, 1% szacharózt tartalmazó MS agartáptalajra tesszük, majd inkubátorban 18 órás megvilágítás - hat órás sötétség ciklusban növesztjük. A két- háromhetes hajtásokat 5%-os szacharóz oldatba vagy desztillált vízbe teszszük, majd bárom napig vagy folyamatosan fényben, vagy' folyamatosan sötétben tartjuk. 10-14 hatásból származó egyesített osszíehérje kivonatoknak vizsgáljuk a GUS aktivitását, erre a célt. u * « «
X X * Φ
u. :.
»
«. u φφφ * -x * w
v. ;
ra a 4-metilumbllilerril-gÍükurouid (4-MUG) fluorogén szub-sztráto-t használjuk, Jefferson és munkatársai leírása szerint (Jefferson, R.A., Kavanagh, T.a. és Bevan, M.W.: EM.BO -Journal 6, 3901-3907 (1987)]. Mindkét konstrukció -esetében a szacharóz távollétében, folyamatos megvilágításban növesztett hajtásokban a GUS aktivitás szintje hasonló ahhoz a GUS aktivitáshoz, amit a szacharóz jelenlétében, de fény távoliétében növesztett hajtásokban. lehet merni (4. ábra). Azonban a hajtások mind folyamatos megvilágításn-ak, mind szacharóznak: való kitétele körülbelül kétháromszorosra növeli a GUS aktivitás szintjét. Ezek az eredmé-38nyék jó összhangban vannak a ct béta-amiláz génnel, magával végzett kísérletekkel, amik azt mutatják, hogy a fénnyel való indukálhatóság és a szacharózzal való indukálhatóság egymástól független folyamat,
A GUS hisztokémiai festése azt mutatja, hogy az aktivitás kimutatható a kéthetes hajtások szíkteveleíben, és nem mutatható ki, vagy csak nagyon kicsi az aktivitás az első igazi levelekben vagy a szárakban és a gyökerekben. A négyhetes hajtásokban a további GUS aktivitás kimutatható az első igazi levelekben és a szárakban is, A GUS festés különösen erős a kloroplasztban gazdag parencbima (chlorenchymal sejtekben, amik a xílem sugarak,. valamint a xílem és a fíoém-kőtegek között találhatók, amikből áll a belső fíoém a szárakban.
X X í * · ♦ ·» X X t\*í
X «
v.*í
4. Példa ct béta-amiláz plazmidok készítése dohány- és burgonyalevelek transzformálásában való felhasználáshoz
Helyspecifíkus mutagenezist. használunk a pBmySl piazmid 2302-es pozíciójában levő Kpní hely BamHl hasítási hellyé való átalakítására. Az alábbi oligonukleotid prímereket terveztük meg:
6, számú szekvencia
P3: (5- GCT GGT AGG CCT GCA GGA TCC GGT CCG GAA TTC CC -3' és
7. számú szekvencia • 39 ** ** λ # * * * * ·»·Χ^Φ... « * ·\.
μ** ... .. . .... .......
Ρ4: fő’-GGG AAT TCC GGA CCG GAT CCT GCA GGC GTA CCA _3Ί és használtuk a Quíck Change helyspedhkus mutagenezis kittel (Promega). Az eljáráshoz a gyártó által megadott protokollt használjuk.
A teljes hosszúságú ct béta-amiláz kódoló szekvenciát kivágjuk a mutált pBmySl plazmidból, BamHI restrikciós enzimmel való emésztéssel és GeneClean-nel (BIO 101) való tisztítással. .A BamHI fragmenst a pDV35S (SK)V (5. ábra) és pDVÖSÖOO (6. ábra) donor vektor BamHI hasítási helyére klónozzuk, A pDV35S (SK)S egy pBluescrípt (Stratagene) vektor, ami egy 35S CaMV promoter-35S termínátort tartalmaz, ehhez hasonló konstrukciókat publikáltak a szakirodalomban [Odeli, J.T., nagy, F. és Chua, N.H.: Natúré 313, 810-812 (1985)1. A pDVÖ200 tartalmaz egy pBluescrípt plazmidot egy .1,4 kílobázis méretű patatín promoter-nopalm szintetáz terminátor konstrukcióval. A szakterületen jártas szakember képes hasonló konstrukciókat készíteni ismert szekvenciákból [Lm, X.J., Prat, S,, Willmitzer, L. és Frommer, W.B.: Molecuiar and General Genetics 223, 401-406 (1990)), Plazmidokat izoláltunk, amik a klónozó szekvenciát a promoterekhez viszonyítva mind az értelmes, mind az antiszensz orientációban tartalmazták, majd a ct béta-amiiáz kíméra géneket a donor vektorból a pBinPIus bináris vektorba (van Engelen, F.A., Molthoff, J.W., Conner, A.J., Nap, J-R, Pereír.
-40* X Φ » « *♦ >· · •Χ··#·* · · · ··**··' ·' ·,«£<*· »«··. x«.V* ·»' re, A. és Stiekema, W.J.: Transgenic Research 4, 288-290 (1995) szuhklónozzuk. A piazmid-térképeket a 7-10. ábrán mutatjuk be.
5. Példa fövények transzformációja vagy réti
Burgonyanövényeket transzformálunk a lényegében Horsch és munkatársai által leírt levélkorong együtt-tenyésztéssel (Horsch, R.B., Pry, J.E., Hoffman, N.L., Eíehhoitz, D., Rogers,
S.G. és Swaíey, R.T.; Science 227; 1229-1231 (1985)(.. Az előzőkben ismertetett bináris vektorokat Aprobnctenum mme/bcáms LBA44Ö4 sejtekbe transzformáljuk, elektroporácíós módszerrel, és az említett Aprobootenúm tenyészeteit használjuk a transzformációban, így a. regenerált növények hordozzák a kiméra géneket, amint azt a 4, példában ismertetjük.
A patatin promoter-et béta-amiláz-nopalin szinte táz terminátor kiméra gén bináris vektor használható egy olyan burgonyanövény transzformálására, ami már hordozza az Escnanchih coli plpCló ADPG-PPáz kiméra gént. A transzformáláshoz a levélkorong együtt-tenyésztési módszert használjuk.
f-Λ
X XΦ * v,:
6, Példa
Plazmidok készítése az ÁT ct béta-amiláz célzó pepfiddel
Az AT ct béta-amiláz plasztidba irányító szekvenciája egy
294 bázispár méretű fragmensen található, ami ekvivalens az 1. számú szekvenciával. Polimeráz láncreakciót vagy restrikciós enzimes emésztést használhatunk, hogy izoláljuk a 3. példában leUl ·χ·
Λ-ί
X X « 4
4*'· χ írt piazmídok DNS-ének fragmenseit, azaz a fragmensek tartalmazzák a 3SS CaMV promotert plusz a plasztidba célzó szekvenciát, vagy a patatin promotert plusz a plasztidba célzó szekvenci át. Kiméra gének készíthetők, oly módon, hogy a fehérjéket vagy enzimeket kódoló szekvenciákat a tranzit peptid szekvenciával való transzlációs fúziók formájában Kgáijuk. A transzlációba vitt fehérjék a plasztidokha transzportálódnak, ezzel új aktivitásokat : biztosítani, vagy befolyásolni lehet a metabolikus bioszínté* X
zís utakat.
«* υ *# » φ « ♦ » .....,»· *
;..«····· ·····*' *** φ * * ;
** * 'V •χ- · · · · «··
U ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ:
(ί) BENYÚJTÓ:
(A) NÉV: Advanced Technologies (Cambridge) Limited (B) UTCA; Globe House, l Water Street (C) VÁROS: London (Ei IRÁNYÍTÓSZÁM :W2 (ii) A TALÁLMÁNY Új, plasztidba célzó nukleinsav CÍME; szekvencia, egy új béta-amiláz szekvencia, egy ingerre reagáló promoter, és ezek használata (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 8 (Ív) LEVELEZÉSI CÍM;
(A) CÍMZETT; British American Tobacco (Investments)
Limited (B) UTCA: Regents Park Ráad (C) VAROS: Southampton (D) ÁLLAM: Hampshire (E) ORSZÁG: Nagy-Britannia (F> IRÁNYÍTÓSZÁM: SOI5 STI
TÍPUSA: FLOPPY LEMEZ (3,5Ί (B) SZÁMÍTÓGÉP; Víglen P5/75 t: MS-DOS Windows 95 iM: Microsoft Word 97 «4* >
ς « ., * < ν .
...χ· ··”' ♦ ««* u * ♦ * ./ * * «.«.« 3* «
A JELENLEGI BENYÚJTÁS ADATAI:
(AJ A BENYÚJTÁS SORSZÁMA: Még nem ismert
ÜGYVIVÖ/OGYNÖK
U A BENYÚJTÁS
g nem ismert (AJ NÉV: Mts. M.R. Walford/Mr. ÍCJ.H.MacLean (C) REFERENCIA/LAJSTROMSZÁM: RD-ATC-18
TELEKOMMUNIKÁCIÓS INFORMÁCIÓ:
(A) TELEFON: 01703777155 (B) TELEFAX: 01703779856 (C) TELEX:
1. számú szekvend&vázlat (1) A szekvencia jellemzői;
(AJ Hossz; 294 bázispár (B) Típus: nukleotíd (CJ Száltípus: kétszálű (DJ Topológia: lineáris fii) A molekula típusa: cDNS-ről mRNS (vi) Eredeti forrás;
(A) Szervezet: Ar&Mdppsm rtudúmo.
(BJ Törzs; Colombía ökotípus (FJ Szövettípus: Levél (vii) Közvetlen forrás:
(A). Könyvtár; ABRC DNA Stock Centre (BJ Klón: EST 81E10T7 „44 .♦'* '* ...SA-*. Ü ···* < ♦ ** * # * * * * „- · * ««« * * ♦<·> * at' ♦ $♦& * (vii) Pozíció a genomban:
(A) Kromoszőma/szegmens:
(A) Név: Tranzit peptid (Bi Lokalizáció: 37-291
-es kromoszóma
X ♦ ♦♦ 9 :« e « íxií A szekvencia leírása: 1. számú .szekvencia rOATrTCTGAZCArAAGAAAGAOAGAGAAAAAAACrATGGAATTGACACTGAATTCC'rGG
MELTLXSS 8'
AGTTCTCTTArCAAACGTAAAGArGCCAAGAGTrcrAGAAACCAAGAAAGTTCC'Í'CCAAC
S S L ΐ K R K 0 A K S S R N 0 £· S S S N 28
121 AACArGAGCT'?rGCCAAGATSAAGCCCCCAACATAtCAOiTCCAAGCAAAGAAG’?CGGTT
Ν Η T r A K Μ K r » T V Q F Q A X N S V 4 3
181 AAGGAAArGAAGTTCACTCACGAGAAGACCT'rCACGCCAGAAŰGTGAAAGCCTTGAGAAA
X Z. :M K F T A S K T F T ? £ G £ T L S X 63
41 TGGCAGAAGCTCCACGTT CTCTCATACCCACACTCCAAGAACC-ACGCTAGCCTT
W Ζ X L Η V L S V S A 3 X X G A S V 35
2; számú szekveneiavazlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 1642 bázispár (B) Típus: nukleotld (C) Száltípus: kétszálú (D) Topológia: lineáris (A) Szervezet: Aramúqpsis thnúúna (B) Törzs: Colombia ökotípus (F) Szövettípus: Levél m45 ·*
(vii) Közvetlen forrás;
(A) Könyvtár; A8RC DNA Stock Centre *♦ A (8) Klón; EST 81E10T7 »/\
AA* * ♦ (vii) Pozíció a genomban: y.:.
* ** (A) Kromoszóma/szegmens; IV-es kromoszóma ./ * ♦ s*. ;
fix) Tulajdonság; ’ * (Aj Hév; Kódoló szekvencia (Bj Lokalizáció; 1-1393 bázispár (D) Más információ: Érett peptid fxí) A szekvencia leírása; 2. számú szekvencia
X OTTCCOGTSTTCG^CArGTTAeCCCTCCACACAOTAACAATGTCAGGCCATTTOAACAAA
V F V F V :M. I» P L 0 Τ' V T M S G H t. N K 20
CCACCAGCCATGAACGCTAOTTTGATGGCrCTGAMCGAGCTGCTGTOOAAOGTCTOATO
F R A Μ N A S: L M A L. K C- A G V S Ο V X 40
1.21 GTGGATGCTTGGTGGGGATTGGTGGAGAAAGATGGAeCTATGAAT'tArAACTGOGAAGOC
V 0 A W W 0 L V 2 K 0 G F K Μ Y R W g G €0
X 81 GATGCCGAGCTT ATACAGATGGTTCAAAAGCACGGTGTCAAACTGCAGCíTCGTTA'í'GTCA
V A S L J Q Μ V Q R H G G K 0 0 V V X S 80
41 TTGGATCAATGTGGAGGAAACGTAGGAGACTCTTGCACTATCCCCTTGCCTCCATGGG7G r Η. o C G G R V G D 5 C S X A L 0 F W V 100
X CTiGAAGAGAl'GAGGAAGAAGCCTGATCTTGTCTACACAGACAAATGl'GGGAGAAGGAAC
L E £ I 3 R R R O G V Y TOKSORON 120
301 CCTGAGTATATCTCCTTGGGATGTGÁTTCTGTGCCTGTCCTAAGAGGAAGAACACCTATC o s y x s l ο c ο s v r v r r g r t ο x 140
421 CAGGTCTAGTGACATTTCATGAGGAGCTTGGGTGAACGATTTGAAGGCTACATAGGAGGA
Q V Y S 0 F X R S F R S R R E G Y 1 G G xeo
481 GTTATTGCGGAAATTCAAGTAGGAATGGGACCT'rGTGGAGAATTGAGATACCCATCATAC
V 1 A £ X Q V G X G F C G Z 1, R Y F S Y ISO
341 CCTGAAAGCAACGGGACCTGGAGATTCCCGGGAATTGGAGAGTTCGAGTGCTACGAGAAG
R E S N G T W R F F G I G £ F Q C Y C K‘ 200
601 TATATGAAXTCGFCACTTeAGGCATATGCTGAATCAATTGGGAAAACTAAGTGGGGAACA
V X K S S L Q A Y A £ S I G K T X W G T 220
661 AGCGGACCTCATGATGCCGGCGAGTAOAASAACCTCCCAGAAGATACTGAATTTTTCAGG
S G F Η O A G S Y ·< N L P S D T S F R R 240
21 AGAGACGGAACATGGAATAGCGAGTATGG&AAGT GTTTCATGGAAG'GGTACTCCGGGAAG
R D G T X S S S Y G K R F M S '5? Y SOK 260
« *0 ί C i GC’xAG&&CA7GGáGACCAAÜTCCTATÜTVGA6CüAAAüC-7AtC í T'rGAAGeiAeÁjC.í.julrt
L, 0 3 8 G 0 p L 0 S S A K G 1 f 0 G .0 G 280 íC GCAAAGC'rA'rCAGGAAAGGTAGCTGGAATTCACTGGGAeTACAACACGAGGTCACACGCA , .
A X L S G Κ V A G I M W 8 ϊ N T -R 3 8 A 300 í\ :
♦ -*:
* «
902 GC; GAGCTAACCGCTGGATATTACAACACAAGAAACCATGAGGGGTA’rGTGGCAA2'AGCT ;\®
A £ L T A G 2 ¥ N ' ? R N H D G ¥ Ο ? 2 A 320 *04 « « 0
2 AAGATGTTGAACAAACAGGGAGT'rGTGCTCAACTTCACCTGCATGGAGATCÍAAAGAGGGG ·,
Κ M F S K 8 G V V L 0 F T C H S Μ K 0 G 360 * 0 V *
202IGAGGAACCTGAGGAGGCGAATGGCTGACCAGAAGGTOTGGTGAAGCAAGTACAGAACGGG ‘ V
E Ο Ρ E H A 3 C 3 Ρ E G ΐ, V K Q V Q: 3 A 330
8 2 ACAAGGCAGGGGGGAACGGAACT AGCAGGGGAGAACGCGGTAGAAGGAT ATGAGTGGAGC
T p Q A G ΐ E L A G S N A L E R ¥ 0 3 3 4 00
14 tGGATTCOGACAAGTOGTAGGAACAAATAGGTGAGAT'í GTGGAAATGGGTTAAGCOGATTT
A F G Q V V A T 3 K S 0 3 G - 0 G L T A F 4 20
22ö LA(2'TTAGGTAAGAATGAACAAGCG6s,TATTTGAGöG'f'CAAAATTGGGAGCAG''G’AGTG(;AG
V Y L R Μ N: X R L F F G Q. K 'W Q. 0 L V E 440
1262 TTTGTTAAGAAGATGAAGGAAGGTGGTCATGGGAGGAGAGTGTGAAAAŰAAGAG ACAAGT
F V K 8: Μ Κ F G G H G A R 0 3 K 3 ΰ T T 4 00
132 IGGAAGTGAGCT sTATGTTGGATTTGTCAAAGGCAAGATGGGTGAGAATGTGGAGGAGOÍCT
G 3 Ο Ο Y V G F V K G -8 2 A 0 3 V 3 K A 480
1BÓIGGTtTAGíGTAATTTCGCAGATAGGTACATAGATATAGTGTGGTGTTTATTGTATTCCTG
A L V - 483
4 4 ITCTGATAAATAACTAGAGAGATCAAACCAGTAAGAGTGTTAAAGOTATAGAT'rTGOAGAA
ISOlTTCTGGGTGAGAGTCAGAGCAAAGAGAAGCMAATCMGATGATGTACACTTZvGATGTAT
ISolCCTAiGAGWTTCCFTGTACAFCATCTTCATAGi'CTiAATCTCAAATACTATGCAT'r'rT?
.162 2 CTGCAAAAAAAAAAAAAAAAGGGGGGCCGCTGTAGAGGATCC
3. számú szekveneiayázlat
A szekvenciajellemzői;
(A) Hossz; 1953 bázispár (B) Típus: nukieotid (C) Száltípus; kétszáiú lineáris (íí) A molekula típusa; cDNS-rőI mRNS ,<-ϊ ’ / (vi)
Szervezet: Arabidopsís óinkra Törzs: Coiombía. ökotípus (vií) Közvetlen forrás:
(A) Könyvtár: ABRC DNA Stoek Centre :·. i * X? * *4 4 XX km (vií) Pozíció a genomban:
(A) Kromoszóma/szegmens: IV-es kromoszóma (ix) Tula (A) Ní (B) Lokalizáció: 37-1633 bázispár (D) Más információ: Kloroplasztba célozva l'xí'i A szekvencia leírása: 3. számú szekvencia
ΤϋΑτττΟΤΟΑΤΟΑΤΜΟΑΜΟΑδΑΟΑδΛΑΑΑΑΑΑΟτΜΟδΜτΤΟΑϋΑετΟΑΑΤτΟΟΤΟΰ s s r τ l m s s
AGTTCTCTTATCAAACOTAAAOATGCCAAGAGTTCTACAAACCAAGAAAGTTCCTCCAAC
SS L< ΐ K & K 0 A K 3 S R N Q S S S S N 28 .121 AAGATGACGTTTGCCÍAAGATGAAGCCGCCAACATA'i'CAGT TCCAAGCAAACAACTCGOTT n μ τ r a κ e κ r r τ ϊ o r q a k g s v
181 AACÍGAAATGAAGTTCACTCAGGAGAAGACCTTCACGCCAGAAGGTGAAACGGTGGAGAAA
K S Μ K F Τ H S K T S' T F £ G S T G £ K 6-8
241 TCGGAGAAGGTCCAGGTTCTCTGATAGCCAGACTCCAAGAACGACGCTAGCGTTGCGGTG
W E · K L Η V L S ϊ Ρ 8 S K S D Ά S V Ρ V 88
3öl TrCGrCATGCrACCGCTCCACACAGiAACAATGTCAGGGCATTTGAACAAACGACGAGCC
F V S L F L Ο Τ V Τ M S G H L S K F R A 108 »1 ATGAACSCTAGTTTGATGGCTCTSAAAGGAGCTGGTGTGGAAGG’r GTGATGGTGG AT GCT
M S A S L M A I, S G A G V E G V S V D A .128
4.21· TGCTGGGGATTGGTGGAGAAAGATGGACCTATGAATTATAACTGGGAAGGCTATGCCGAG >4' W G L V g X 0 G P M ü ϊ N W E G ¥ A S 14.8
481 GTTATAGAGATGGTTCAAAAGCACGGTCTCAAAmCGAGGTCGTTATGTCATTGCATCAA r 1 α e V ο K 8 G L K S Q V V M S G H Q 168
-ί ί T^'Í'wGAí3Í;iZüAACÍsTAfeGAÍ5AeTCT''i’Gí'A,3TA?CeeC”<t vCC i CCAPGOC-Tbc TTgAAijmíj
C G G 4 V G D S C S r P t 6 P W V L E £ 188
6-01 ATCAGCAAGAACCCTGATGGTGTGTAGACAGAGAAATGTGGGAGAAGGAACCGTŰAATAx
I S Κ Ν F 0 A V ¥ T S · X S G ? Κ Ν 0 £ Y 2-08
661 ATClxGCTTOGGAi'GTGATTG'rG'iGGG'GTCCTAAGAGGAAGAACACCx ATGCAGGTCTAC
S L G C 0 S V Ρ V L S G R Τ ? X Ο V ¥ 226
2 X TCAGATTTCATGAGGAGGTTCGGTGAAGGATCTGAAGGGGACATAGGAGGAGTTATTGGG
S D F M· A S F R E A F £ G Y Σ G G V í A 2 4 8 ·? 61. GAAATTCAAGTAGGAATGGGAGG'kTGTGGAGAATTGAGAx ACGCATCATACGCTGAAAGG
E λ C V G M G P C G £ L R Y F S ¥ f? E S 268
4 X AAGGGGACGTGGAGATTCCGGGGAATTGGAGAGTTCGAGTGGTAGGAGAAGTATATGAAA
N G ΐ W A E ·? G Γ G · δ F Q G ¥ ö X ¥ Μ ?< 288
i. Tvx/xCagO íx.AGGGOV.xATGC’í GAATCA.'x FO kxGí.íAAAAGx AAGTía^GGAACAAGC-Gtj;\k.x.- i
S S 1« ö A ¥ A E 3 X G X Τ K W G T G G 6 208
862 CATGATGCCGGCGAG'xACAAGAACCTCCCASAAGATACTGAATTT'x'rCAGGAGAGACGGA
H 0 A G S Y X N 1. P G 0 T £ E Y 8 8 0 G 328 xOGxACATGGAATAGGGAGTATCGAAAGTTTTTCATGGAATGGtACTCCGOGAAGCTGCxAGAA
T 6Í N .8 G ¥ G X F F M 6 W ϊ G G X L L 0 <4 8
I 08 LGATGGAGAGGAACTGGTATG?TGAGGGAAAfíG'rATCTT'rCAAGGAAGGGGAGCAAAo;CTA
H G D Q L L 3 G A K G I F Q G S G A X 2- 360
I X 4 xYCAGGAAAOGTAGGTGGAAT'xCACTGGCACTACAACAÜCAGGTCACACGklAGCTGAGÜTA
G G Κ V A G χ H W H ¥ R ϊ £ -S M A A A L 368
2201AGGGGTGGATATTACAACAGAAGAAAGCAxGAGGGGTAxCTGCCAATAGGTAAGATGxTG
A G ¥ Y Ν T R 8 H 0 G Y L ? I A Κ M F 408 ί 2 61 AACAAACATGGAGTO'GTGCt GAAGTTGACGTGG ATGGAGAYGAAAGACGGGGAGCAAGGT
Ν K 8 G V V L N F T G M S Μ K □ G E Q 2 4 28
1821GAGCACGCGAA??GC'iCACCAGAAGGTCTGGTCAAGCAAGTACAGAACGCGACAAGGCAG
S A A ίΐ G 8 P S G G V χ Q V Q 0 A ? £ y 448 x 381 GCCGGAAGCGAAGTAGCAGGGGAGAAGGCGCT AGAACGATATGACTCGAGCGGAT TCCJGA
A G Τ E 1, A G £ N A L G R Y 0 S S A G G 4 88
184iGAAGTGGxAGCAACAAAxAGGTGAGA'rTG-4'GGAASTGGGTTAACCGGATTTAGTTAGCTA
Q V V A T 8 A S 0 S G M G L Τ A E Τ Y L 4 88
ISGiAGAATGAAGAAGGGGTTATY'rGAGGG'rCAAAA'iTGGGAGGAGrxAGTGGAGxxGGx'rAAG
A Μ Ν K S L F G G G N W Q Q L V £ F V K 508 iSoi.AAGATGAAGGAAGGx'GGTCAYGGGAGGAGACTGTGAAAAGAAGACACAAGTGGAAGxGAC
R Μ X S G G H G R A L S K S 3 Τ T G S 0 326 x 621C4X x ATGTTGGATTTGTCAAAGGCAAGAGCGGTGAGAATGx GGAGGAGGCGGCT xxA.GxG
L · Y V G F ν X G: Κ I A S Ο V S. S A A L V 54 8 •·49» « 4 4 » * * ♦ * . *
.....♦.........*·-·-·······'*♦··.....·*......
♦·*#,4 4 44 *♦ ****
1881TAATT TeCCACATAOOTACATACATATASTSWGTSTTTATTSTATrCCTGTCTOATAAA
4 1T AACTAGAGAGATGAAAGCAGT AAGAGT OTTAAAGCTATACATT T GCACAAT'i'CT GGGTG » 4 »'♦' » 4 4 >
18Q iAGAGTCAGAGGAAAGAGAAGCAAAATCAAGZ^TGATGTACftCTTAGAi'G-iíVrCCTATGAG·? 1
r. :
>
8IT’TTCCTTSTACATCATCTTCATACrCTTAATCTCAAATACTATGCAT TTTTCTCGAAAAA . .
X 4 4 4
1» *
132 iAAAAAAAÁAÁAGGGCGGCCGCTCTAGAGGÁTCC Γ* / v
»*. í
4, számú szekvencia vázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(Aj Hossz: 21 bázispár (B) Típus: nukíeotid (C) Száltípus: egvs (D) Topológia:
(xi) A szekvencia leírása: 4. számú szekvencia
AATTCCTCGA CTTCTCTTAT C
5^zámú„sz§kyenaayázlat (i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossz: 21 bázíspár (B) Típus: nukíeotid (C) Száltípus: egyszálú (Dj Topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása: 5. számú szekvencia
GGGGATCCCT GACATGGTTA C
- 506, számú szekvencia vázlat (0 a lenemzöi:
(xí) A
- -G
: nukleotid ögia: lineáris szekvencia leírása; 6. számú •’enexa
GCT'G'GTACTC CTCCSGŰATC CGÖTCCGGAA TTCCC
7. számú szekvenci&vazxat ii) A szekvencia jellemzői;
(A) Hossz: 35 bázispár (B) Típus: nukleotid (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása; 7, számú
GGGAATTCCG CACCGGATCC TGCAGGCGTA CCAGC
8. számú szekvenciavázlat
A sz zencia jellemzői; 1652 bázispár s: nukleotid
GgX&I
-51j«e * « ♦ ** * (ii) A molekula típusa; genomiális DNS (vi) Eredeti forrás: » .
>♦ ·> * * > * >
(A) Szervezet: Brabkfopms ίηαίίαηα pps * * (B) Törzs: Colombia ökotípus p.n !♦ k (F) Szövettípus; Levél * ’f
p.k (vü) Közvetlen forrás;
(A) Könyvtár: ABRC DNA Stock Centre (Bj Klón: Cl6599 kozmíd.
(vü) Pozíció a genomban:
(A) Kromoszóma: IV~es kromoszóma (íx) Tulajdonság:
(A) Név: promoter (B) Lokalizáció: A G16599 17534-19! 85-os bázispárja
Komplementer szál (xi): A szekvencia leírása: 8. számú szekvencia
AAGCTTGTGT CTATTTCAAA TTCTT'GACCG TAGATGTCAC AACATGCATA .51 TATGATTGAA AACAGAGCAA GACAGGAAAC CAAGCATATG TATGTAGATA
101 TACTTAGCA& GACATAACTA TAGTCTTTOA AíCAAGATAG GGATTAAZGA
151 TAGÁGAATGA GGAAGCTCAA GATTTTATAG TCAGTTTCTT ACAAAACAAA
201 TTTCTCTCTA ACTGCAAAAA CACCAATTAG GATTTGAAGA GCGTACCTGT
251 TTGAGTCAAT. GTCCAATG'TC GTCCCCCCOC CTTCTACATT TCTTAGCCTG
301 CTGAATAAAA GCACAAGCCA AA&TGAGAAG· GTGCCAAAGG CGATikAGGAT
351 CAATTZCTAC CAZTCAAAAA ACTAATGGTG- AGAATTAGAA ACGAGAGAAA
401 ACTACTTG-TT GAGGAAATAG CGAAAAGCGC A&TCxTCGTC ACCTGAA.TAA
451 AGACCAAAOC GTCACTTTCA AZGAGTCAGC AAGAAAAAGA GAGAGAGAGA
501 GAGAGAGAIT GTCTATAACA. TTTGASTCGA CATGGATTCT AATGCATCAA
551 AAGTGATCTC CAATAAACAA ACACTTGAAA CTCACATGGC TAATAGAACA
501 AGATCAA&GC CTT&AST&VT AAGCATTACA GACACTACTG GCTAACTTVT
CS1 GACACATGTT CTTAAGTAAC ATAGTATCAA .''•j 1 GACACA.CAAC AAuGGCTTAA ígCATCAAAG
751 AACATATTTC ATTTACAA&C AGAATGGAGC
SOI AAGGTTGACA AAAAAATATA &TCTTGTAAC
851 TAATAACCAG GGAAGAAAAA AACAGAATAA
SOI TAAAAAAAAG TGAGAAAGAA TGTGCCACAG
551 AGAAATTTTC AAAGAAAATA TTAGGATTGT lOGiGATCTGTCAO CTGCTFAG'TT GGAAAACACA
51CCAAGAAAAA GAAAATAAGC AAAG-TTAATA
ΙlÖiACAGAAATAA 77AAA7CGTT GCACTTA7CT
1XSIAGAGAACTTA ATAÁTTTTCA GCCACACGAA.
UOIGTOAGAAGCC AAAATTATCA GCTTATCTGC
1251ACTAGATTTA AGAGTTCTCT SXAACTAAAA
1301AATAATTCAC CAACASGAAA ACAAAACTCA
13S1GATGTAAATG AGAATTTATT AACTAAAACA
1401GACATTTACA ATTTTTCATT TTGAGGTGTA
1451AAGGTTAAAA TAAGGAAGCT TFGTGATATT
ISOITGGGTCTCCA AACCACAÖCC AATCAATATT
1SS1AAACAGCATC TTTCTCTCAA ACAGAAACAT
1601AGGTCTATTC TCTAGCTCAT TTCTCATGAT
TAíGCGTGAA TCACATCGAA
TCCTGT'TATT TCCATATAAC
ATTCAGGCAG TCCAAATGGA í
TCTACATATA TGGCAGAATG ;\i
ACAGATCAAT GAGTATGATA
I»
TGAACAAGAG GGCCATGAGA · /
Φ «
TAGAATTTTT TGGGTCAATG ♦ '?
AATGTTAGAG GAAGGAAAG?
GCCACCACAA GAAATTTCAT
TCTCATTCAA ACTAAAATCA
CCATGTGTTC AAAGCCAAAG
ATTAACAAGG GAAAAGCAAG
ACTGCAGGAG TGAGTAAGTA
ATTATCTATA GCTGAATACA tcttccttfg taactgatgt
AGAACCGTGT GACAAGTGAA
TTCTCTCCAC TTTTTGAAAT
CTTTATA&AT ACAAAGAGAC atcttctatc aaacaccaac
16SICT * « * *

Claims (28)

1. Az 1« számú nukleinsav- szekvencia, amelv 1-294
nukieotíd ból. áll, és- amely egy olyan szekvenciát kódol, amely képes egy fehérjének egy növényi plasztikba való célzására, vagy az 1. számú szekvenciával legalább 65 %-fean vagy ennél nagyobb mértékben azonosságot mutató szekvenciák, amelyek az 1. számú szekvenciához közepesen szigorú körülmények között hibridizálnak, és amelyek egy olyan szekvenciát kódolnak, amely ugyanolyan célzóképességgel rendelkezik.
2. Az 1. igénypont szerinti nukleinsav-szekvencía, ahol az említett szekvencia, legfeljebb 85 aminosav-csoportot kódol.
3. Nukleinsav szekvencia, ami megfelel a 3. számú szekvenciának, 1-1953 nukleotidot tartalmaz és egy kloroplasztba célzó bétaamílázt kódoló szekvenciát, vag^’ olyan szekvenciákat tartalmaz, amik legalább 65%-os, vagy magasabb azonosságot, mutatnak a 3. számú szekvenciával, és amely az említett 3. számú szekvenciával közepesen szigorú körülmények között híbridizál, és amely egy kloroplasztba célzó béta-arnilázt kódol.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav szekvencia, amely említett nukleinsav szekvencia mRNS, c.DNS vagy genomiális DNS szekvencia..
5. Eljárás egy, a növény keményítő bioszintézis útjában vagy lebontásában szerepet játszó enzim aktivitásának növelésére vagy csökkentésére, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk: a növény genomjába stabilan beépítünk egy kánéra gént, ami tártál54 *♦** ♦ » * «*φφ *
Φ Φ φ φX φ φ φ * φ » φ * χ Φ * Φ Φ « Φ ♦ ♦ ♦ » Φ Φ «ί ΦΦ Φ Μ Φ máz egy plasztidba célzó szekvenciát kódoló nukleinsav szekvenciát, valamint a béta-amilázt kódoló szekvenciát, majd regeneráljuk a megváltoztatott genommal rendelkező növényt, ahol a plasztidba célzó szekvenciát kódoló szekvencia tartalmazza az I. igénypont szerinti
6, Az 5. igénypont szerinti, eljárás, ahol az említett nukieinsavszekvencia tartalmazza az 1. igénypont szerinti szekvenciát..
7. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, ahol az említett kódoló szekvencia a 2. számú szekvencia, amely egy S -amílázf. kódoló szekvencia.
8. Az 5. igénypont szerinti eljárás, ahol az. említett, nukleinsavszekvencia a 3. igénypont szerinti szekvencia.
9. Az 5. vagy 6. igénypont szerinti eljárás, ahol az említett enzim nem-plasztidos béta-amiláz.
10. Az 5-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az emelt kiméra gén tartalmazza még egy, az alábbi csoportban található egyik enzim kódoló szekvenciáját: szacharóz-szintáz, ADPG pírofoszforiláz, keményítő szinéáz, elágaztató enzim, alfa-amiláz, izoamiláz, nem-plasztidos alfa-amiláz, alfa-glukozídáz, keményítő foszforiláz és
11. Az 5-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett kiméra gén tartalmaz egy promotert is, amely promoter a 8. számú szekvencia vagy egy a 8. számú szekvenciával, legalább 65 %-os azonosságot mutató szekvencia, amely lényegében «♦♦κ χ χ«*« β * * « «« « ««
X Χ·Χ # X « ♦ * ♦ ί ♦ * ν X
Φ ♦' Φ· »χ« ΦΦ »*· ugyanazokkal a funkciókkal rendelkezik, és ingerekre reagál, és az említett termék expressziós szintje változik, az említett nukleinsav szekvenciára alkalmazott ingerre adott válaszként,
12, A 11. igénypont szerinti eljárás, ahol az inger egy a fejlődési folyamat által szabályozott inger,
13, All, igénypont szerinti eljárás, ahol .az inger a fény és/vagy a változó cukorszint jelenléte vagy hiánya.
14, A 13. igénypont szerinti eljárás, ahol a cukor szacharóz vagy glükóz vagy’ mindkettő.
15, A 13. igénypont szerinti eljárás, ahol a cukor a szacharóz.
taimaz egy'
16. Eljárás fehérjéknek vagy enzimeknek egy növényi plasztidba való irányítására, azzal jellemezve, hogy az: alábbi lépéseket alkalmazzuk: a növény genomjába stabilan beépítünk egy kiméra gént, ami tara célzó szekvenciát kódoló nukleinsav szekvenciát, valamint egy fehérjét vagy enzimet kódoló szekvenciát, majd regeneráljuk. a megváltoztatott genommal rendelkező növényt, és a fehérje vagy az enzim lehet egy vagy több, az alábbi csoportba tartozó bioszintézisüt enzim: lipid szintézis, fotoszintézis, aminosav metabólizmus, nitro6vux.vu,a, vagy szénhidrát polimerek szintézise; vagy képes a növénynek egy jellemzőt biztosítani, és a nukleinsav szekvencia a 1. igénypont szerinti nukleinsav szekvencia.
17. A 16. igénypont szerinti eljárás, ahol az említett jellemző vagy herbicid rezisztencia, vagy kártevő rezisztencia.
4 Χ· 4 *4 4 « X .
18. Eljárás egy transzgeníkus növényben, amely növényben a transzformáció következtében egy enzim aktivitása a keményítő szántézísútban már megnőtt vagy lecsökkent, egy további enzim megváltoztatására, az említett újabb enzim aktivitásának növelésére vagy csökkentésére, és ezzel a retranszformáif növény által termelt keményítő mennyiségének növelésére, vagy csökkentésére, ahol az említett további enzim egy plasztidba irányított béta-amiláz, és ahol az említett plasztidba irányított β-amiláz az 1. sz. szekvenciát vagy azzal legalább 65 %-ban vagy' annál nagyobb mértékben azonos szekvenciákat tartalmaz, amelyek az 1. számú szekvenciával közepesen szigorú körülmények között hibrid.izáinak.
19. A 18. igénypont szerinti eljárás, ahol az említett plasztidba irányított δ-amiláz tartalmazza a 2. számú szekvenciát.
20. A 18. igénypont szerinti eljárás, ahol az említett első transzformált növény egy transzgeníkus burgonyanövény, amit az adenozindilbszfoglúkóz-pírofoszforiláz génnel transzformáltunk.
21. Az 5. vagy 16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahol az említett kiméra gén emellett tartalmaz még egy prometer is, amit az alábbi csoportból választhatunk ki; a karfiol mozaikvirus 358 promoter (teljes vagy csonkított), a rubisco promoter, a borsó plaszto-ci&nin promoter, a nopalin szintetáz promoter, a klorofill a/b kötő fehérje, a nagy molekulasűlvú gíutenín promofere, az alfa,béta-gliadin promoter, a hordeín promoter és a patatín promoter.
22. Az 5, vagy 16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, ahöl az említett kiméra génben az említett kódoló szekvencia biztosítja az említett enzim aktivitásának csökkentését vagy növelését.
23. Kiméra gén, amely egy az 1. igénypont szerinti nukleinsavszekvenciát tartalmaz.
24. Kíméra gén, ami az 1. igénypont szerinti, plasztídba célzó szekvenciát kódoló nukleinsav-szekveneíát tartalmaz, valamint tartalmaz egy nukleinsav szekvenciát, ami a keményítő lebontásában szereplő enzimet kódol, amely említett enzimet a 2. számú szekvencia kódolja.
25. Kiméra gén, amely 2, számú szekvenciát és egy olyan nukleínsav szekvenciát tartalmaz, ami képes egy másik kódoló szekvencia expressziojának vezérlésére, amely említett kódoló szekvencia a 2. számú szekvencia.
26, Növényi sejtek, amelyek az 1, vagy- 3. igénypont szerinti m i ki ein s»v~ szék niá f t srtal m a -wá .k
27. Transzformált növény magja, amely egy vagy több, az 1. vagy 3. igénypont szerinti nukleinsav-szekvenciát tartalmaz.
28. Nővény, amelyek az 1. vagy 3. igénypont szerinti nukleinsav-szekvenciát tartalmazzák, ahol a növény egy' vagy több az alábbi csoportba tartozó növény: burgonya, búza, kukorica, árpa, paradicsom, rizs, borsó, szója, amerikai mogyoró, manióka, yam., banán és dohánv.
HU0200732A 1998-08-19 1999-08-13 Plastid-targeting nucleic acid sequence, beta-amylase sequence, a stimulus-responsive promoter and uses thereof HU228696B1 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9817963.3A GB9817963D0 (en) 1998-08-19 1998-08-19 A plastid-targeting nucleic acid sequence and uses therefor
GBGB9817959.1A GB9817959D0 (en) 1998-08-19 1998-08-19 A novel plastid-targeting nucleic acid sequence and a novel B-amylase sequence and uses therefor
GBGB9913014.8A GB9913014D0 (en) 1999-06-05 1999-06-05 A plastid-targeting nucleic acid sequence,a stimulus-responsive promoter,and uses thereof
PCT/GB1999/002697 WO2000011144A2 (en) 1998-08-19 1999-08-13 Plastid-targeting nucleic acid sequence, beta-amylase sequence, a stimulus-responsive promoter and uses thereof

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0200732A2 HUP0200732A2 (hu) 2002-07-29
HUP0200732A3 HUP0200732A3 (en) 2004-10-28
HU228696B1 true HU228696B1 (en) 2013-05-28

Family

ID=27269441

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0200732A HU228696B1 (en) 1998-08-19 1999-08-13 Plastid-targeting nucleic acid sequence, beta-amylase sequence, a stimulus-responsive promoter and uses thereof

Country Status (18)

Country Link
US (2) US6489540B1 (hu)
EP (1) EP1105468B1 (hu)
JP (2) JP2002523040A (hu)
CN (2) CN1528904B (hu)
AT (1) ATE527346T1 (hu)
AU (1) AU773492B2 (hu)
BR (1) BR9914299A (hu)
CA (1) CA2336249C (hu)
CZ (1) CZ303574B6 (hu)
ES (1) ES2375034T3 (hu)
HU (1) HU228696B1 (hu)
MX (1) MXPA01001815A (hu)
NZ (1) NZ509642A (hu)
PL (1) PL205558B1 (hu)
SK (1) SK288125B6 (hu)
TR (1) TR200100625T2 (hu)
WO (1) WO2000011144A2 (hu)
ZA (1) ZA200100736B (hu)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3546337B2 (ja) * 1993-12-21 2004-07-28 ゼロックス コーポレイション 計算システム用ユーザ・インタフェース装置及びグラフィック・キーボード使用方法
AU773492B2 (en) 1998-08-19 2004-05-27 British American Tobacco (Investments) Limited A novel plastid-targeting nucleic acid sequence, a novel beta-amylase sequence, a stimulus-responsive promoter and uses thereof
US7091398B2 (en) 2001-02-22 2006-08-15 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Isolated sucrose sythase polynucleotides and uses thereof
EP1381676A2 (en) * 2001-04-25 2004-01-21 Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissenschaften E.V. Nucleic acid molecules encoding starch degrading enzymes
ATE488585T1 (de) * 2001-08-27 2010-12-15 Syngenta Participations Ag Selbstprozessierende pflanzen und pflanzenteile
WO2004040999A1 (en) * 2002-11-08 2004-05-21 Bayer Cropscience Gmbh Process for reducing the acrylamide content of heat-treated foods
JP2007151435A (ja) * 2005-12-02 2007-06-21 Niigata Univ デンプン集積能力の高い形質転換植物およびその製造方法
CA2704016A1 (en) 2007-11-05 2009-05-14 Syngenta Participations Ag Methods for increasing starch content in plants
CN102405291A (zh) * 2009-02-25 2012-04-04 先正达参股股份有限公司 用于增加植物穗轴中的淀粉含量的方法
US9598700B2 (en) 2010-06-25 2017-03-21 Agrivida, Inc. Methods and compositions for processing biomass with elevated levels of starch
WO2011163659A2 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Agrivida, Inc. Plants with altered levels of vegetative starch
US10443068B2 (en) 2010-06-25 2019-10-15 Agrivida, Inc. Plants with engineered endogenous genes
WO2015021600A1 (en) * 2013-08-13 2015-02-19 Danisco Us Inc. Beta-amylase and methods of use
CN104232681B (zh) * 2014-09-28 2017-02-15 浙江大学 一种植物表达载体及在制备磷酸化改性水稻淀粉中的应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5391725A (en) * 1989-12-08 1995-02-21 New York University Medical Center Organ-specific plant promoter sequences
US5451513A (en) * 1990-05-01 1995-09-19 The State University of New Jersey Rutgers Method for stably transforming plastids of multicellular plants
US5349123A (en) * 1990-12-21 1994-09-20 Calgene, Inc. Glycogen biosynthetic enzymes in plants
WO1991019806A1 (en) 1990-06-18 1991-12-26 Monsanto Company Increased starch content in plants
US5750876A (en) * 1994-07-28 1998-05-12 Monsanto Company Isoamylase gene, compositions containing it, and methods of using isoamylases
GB9522589D0 (en) * 1995-11-03 1996-01-03 Innes John Centre Modified plants and plant products
CN1157478C (zh) 1996-09-03 2004-07-14 拜尔生物科学股份有限公司 改进的芽孢杆菌rna酶抑制剂基因
AU773492B2 (en) * 1998-08-19 2004-05-27 British American Tobacco (Investments) Limited A novel plastid-targeting nucleic acid sequence, a novel beta-amylase sequence, a stimulus-responsive promoter and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP4673431B2 (ja) 2011-04-20
US6489540B1 (en) 2002-12-03
CA2336249C (en) 2011-03-08
ATE527346T1 (de) 2011-10-15
CN1234868C (zh) 2006-01-04
PL346704A1 (en) 2002-02-25
CN1528904B (zh) 2010-05-26
WO2000011144A2 (en) 2000-03-02
BR9914299A (pt) 2001-11-27
JP2010131029A (ja) 2010-06-17
CN1323349A (zh) 2001-11-21
WO2000011144A3 (en) 2000-09-08
HUP0200732A3 (en) 2004-10-28
JP2002523040A (ja) 2002-07-30
TR200100625T2 (tr) 2001-06-21
ES2375034T3 (es) 2012-02-24
EP1105468A2 (en) 2001-06-13
AU773492B2 (en) 2004-05-27
CZ303574B6 (cs) 2012-12-19
SK288125B6 (sk) 2013-10-02
NZ509642A (en) 2003-08-29
EP1105468B1 (en) 2011-10-05
CZ2001460A3 (cs) 2001-11-14
SK2042001A3 (en) 2002-01-07
PL205558B1 (pl) 2010-05-31
CN1528904A (zh) 2004-09-15
US20030074690A1 (en) 2003-04-17
AU5432699A (en) 2000-03-14
ZA200100736B (en) 2002-06-26
CA2336249A1 (en) 2000-03-02
HUP0200732A2 (hu) 2002-07-29
MXPA01001815A (es) 2002-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4673431B2 (ja) 新規のプラスチドターゲティング核酸配列、新規のβ−アミラーゼ配列、刺激反応性プロモーター、およびその使用
CA2104123C (en) Plasmids containing dna-sequences that cause changes in the carbohydrate concentration and the carbohydrate composition in plants, as well as plant cells and plants containing these plasmids
US5436394A (en) Plasmid for the preparation of transgenic plants with a change in habit and yield
EP0455316B1 (en) Plasmide containing DNA sequences that bring about changes in the carbohydrate and protein concentration and the carbohydrate and protein composition in plants, and plant cells and plants containing those plasmids
US5492820A (en) Plasmids for the production of transgenic plants that are modified in habit and yield
AU672017B2 (en) Dna sequences and plasmids for the preparation of plants with changed sucrose concentration
EP0647273B1 (en) Dna sequences encoding oligosaccharide transporter
AU715002B2 (en) Transgenic plants with improved biomass production
US6284956B1 (en) Plant selectable marker and plant transformation method
JP2001512685A (ja) 植物において収量を増加させるための方法
WO2009077973A1 (en) Expression cassettes and methods for increasing plant yield
WO1999007841A2 (en) Regulatory mutants of adp-glucose pyrophosphorylase and related compositions and methods

Legal Events

Date Code Title Description
GB9A Succession in title

Owner name: BRITISH AMERICAN TOBACCO (INVESTMENTS) LIMITED, GB

Free format text: FORMER OWNER(S): ADVANCED TECHNOLOGIES (CAMBRIDGE) LIMITED, GB

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees