SK285257B6

SK285257B6 - Imunologicky účinné prípravky z extraktu imela

Info

Publication number: SK285257B6
Application number: SK899-98A
Authority: SK
Inventors: Wilfried W�Chter; Klaus Witthohn
Original assignee: Madaus Ag K�Ln
Priority date: 1995-12-27
Filing date: 1996-12-19
Publication date: 2006-10-05
Also published as: DE59611058D1; AU1302997A; HUP9903664A2; EP0869811A1; DE19548367A1; WO1997024136A1; PL327583A1; HUP9903664A3; SK89998A3; ZA9610839B; CZ294604B6; ATE273018T1; PL186543B1; EP0869811B1; CZ206198A3

Abstract

Liečivý prípravok na parenterálne podávanie z extraktov imela obsahujúci od 5 do 50 ng/ml imunologicky aktívneho lektínu z imela viažuceho galaktozids obsahom stabilizátorov v množstve do 0,01 mg/ml.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka liečivých prípravkov na parenterálne podávanie lektínu z imela a ďalej zahŕňa farmaceutické prípravky z extraktu imela, ktoré sa vyznačujú tým, že na zabránenie vedľajších účinkov majú čo najmenší obsah imunologický účinného lektínu z imela a ktoré vplyvom stabilizujúcich prísad majú dlhodobú stabilitu pri použití.

Doterajší stav techniky

Imelo (Viscum album) je dlhodobo známe ako liečivá rastlina. Extrakty z imela sa používajú v prípravkoch na liečenie reumatických chorôb a artróz. Vodné prípravky z imela sa používajú ako injekčný roztok v paliatívnej terapii malignych nádorov. Mnohokrát boli skúmané a opísané rakovinu tlmiace vlastnosti imela. Ako obsiahnutá účinná látka boli zistené lektíny z imela. [Hajto, T., Hostanska, K., Gabius, W - J. , Modulátory Potency of the β - Galactoside - specific Lectin from Miesteltoe Extract (iscador) on the Host Defense Systém in Pivo in Rabbits and Patients. Cancer Res. 49 (1989), 4803 - 4808,, Beuth, J., Ko, H.L., Tunggal, L., Geisel, J., Pulverer, G. Vergleichende Untersuchungen zur immunakliven H'irkung von Galaktosid - spezifischem Mistelektin: Arzneim. Forsxh, 43 (1993), 166 -169,].

Lektíny z imela majú tak cytotoxické vlastnosti, ako aj vlastnosti modulujúce imunitu, takže sú pri vhodnom dávkovaní schopné kladne ovplyvňovať rôzne parametre imunitného systému. Patria ku triede glykoproteínov a sú tvorené ľahšou zložkou (reťazec A) s vlastnosťami inaktivujúcimi ribozómy (RIP) a ťažšou zložkou (reťazec B), ktorá sa vyznačuje špecifickou aktivitou viazania cukru. Zložky sú vzájomne spojené pomocou disulfidových mostíkov (Luther, P., Becker, H., Die Mistel, Berlín: Springer - Perlag 1987, 58- 119).

Vysoká toxicita extraktov z imela a v nich obsiahnutých látok vyžaduje na terapeutické použitie presné dávkovanie, aby sa zaistila znesiteľnosť prípravkov z imela, a aby sa zabránilo vyvolaniu účinkov potlačujúcich imunitu, vyvolanú predávkovaním. Ako optimálna dávka sa doteraz uvádza 1 ng laktinu na kg telesnej hmotnosti [Hajto, T., Hostanska, K., Gabius, W - J. , Modulátory Potency of the β - Galactoside - specific Lectin from Miesteltoe Extract (iscador) on the Host Defense Systém in Pivo in Rabbits and Patients. Cancer Res. 49 (1989), 4803 - 4808,, Hajto, T, Hostanska K, Erfínder, Madaus AG„ Anmelder. Lektinkonzentrate aus Mistelextrakten und entsprechende, stabilisierte Mistellektinpräparate. Perfahren zu ihrer Herstellung sowie diese enthaltende Arzneimittel und deren Verwendung zur Erhôhung der natijrlichen Immunresistenz und / oder in der Tumor - Therapie. EP 0 602 686 A2. Offenlegung 22.06.1984, Beuth, J., Ko, H.L., Tunggal, L., Geisel, J., Pulverer, G. Pergleichende Untersuchungen zur immunaktiven Wirkung von Galaktosid - spezifischem Mistellektin: Arzneim. Forsxh, 43 (1993), 166 - 169].

Na základe súčasného stavu vedeckého poznania nie sú parenterálne liečivá, ktoré obsahujú vodné prípravky z imela, buď upravené na určitý obsah lektínu z imela, alebo obsahujú lektín z imela od 50 mg/ml do 350 mg/ml (EP 0 602 686 A2), alebo ešte viac, príklad Iscador Q 5 mg spezial s 375 ng/ml.

Základné zložky extraktov z imela, lektíny z imela, sú bielkoviny. Samé osebe sú vo vodných roztokoch, ktoré sú základom na použitie ako parenterálne liečivá, iba krátkodobo stabilné. Rozpustené bielkoviny sú vystavené rôznym spôsobom možnosti chemických alebo fyzikálnych zmien [Franks, F. Conformational Stability of Proteins. In Franks F. editor: Protein Biotechnology. Totowa, New Jersey, Humana Press 1993: 395 - 43, Franks F. Storage Stabilization of Proteins. In Franks F. editor: Protein biotechnology. Totowa, New Jersey, Humana Press 1993: 468 - 532, Wang, Y - CJ., Hanson MA. Parenteral Formulations od proteins and Peptides. Stability and Stabilizers. J. Parenter. Sci. Techn. 1998 suppl, 42: S3 - .8'26 ] Preto je nevyhnutné, aby bielkoviny, ktoré sa používajú ako účinné látky liečiv vo vodných roztokoch, boli stabilizované.

Spis EP 0 602 686 A2 opisuje možnosť stabilizácie vodných roztokov s nastaveným obsahom lektínu z imela. S uvedenými stabilizátormi sa síce podarilo zaistiť obmedzenú stabilitu roztokov čo sa týka adsorpcie na povrchoch, ale podarilo sa to iba po určitý čas, ktorý je príliš krátky na to, aby boli splnené nároky na bezpečné liečivo, ako sú stanovené napríklad v smerniciach na skúšanie liečiv [Allgemeine Verwaltungsvorschrift zur Anwendung der Arzeineimittelprufirichtlinien vom 14. Dezember 1989. Bundesanz. 1989, 41, 243a\. Tak nebola dosiahnutá stabilita po dostatočný čas ani pri skladovacích teplotách 25 °C, ani pri chladení (4 - 8 °C) (obr. 1). Tým liečivá vyrobené podľa EP 0 602 686 A2 zodpovedajú len po krátke obdobie všeobecným požiadavkám na bezpečnosť liečiv, kde sa požadujú reprodukovateľné aplikácie účinnej látky počas použiteľnosti liečiva.

Podstata vynálezu

Úlohou predloženého vynálezu je poskytnutie farmaceutického prípravku na kladné ovplyvňovanie imunologických parametrov pri terapii nádorov alebo infekčných chorôb, ktorý má optimálne účinný a bezpečne aplikovateľný obsah účinných látok z extraktov imela, pričom obsiahnuté účinné látky sú v lieku nastavené reprodukovateľné a počas času použiteľnosti liečiva sú stabilné.

Táto úloha bola vyriešená tým, že sa pripravil farmaceutický prípravok, ktorý obsahuje vodný výluh z vetvičiek imela a má vďaka stabilizujúcim prísadám v množstve < 0,01 mg/ml dlhý čas použiteľnosti.

Prípravok z extraktu imela podľa vynálezu obsahuje roztok s obsahom 5 až 50 mg/ml, výhodne 20 - 30 ng/ml, imunologický aktívneho lektínu z imela, viažuceho galaktosid, v zodpovedajúcom množstve a má vďaka prísade stabilizátorov v oblastiach koncentrácií od 0,001 do 0,01 mg/ml, výhodne 0,01 mg/ml, požadovanú stabilitu, pokiaľ sa týka väzby na povrch a skladovateľnosti.

Prípravky s íektínom z imela môžu byť v inej forme uskutočnenia upravené taktiež ako lyofylizát.

Prekvapivo bolo podľa vynálezu zistené, že v oblasti značne nižších dávok od 15 do 375 pg/kg telesnej hmotnosti je optimum účinnosti, ktoré sa prejaví najmä po opakovanom podávaní počas dlhšej doby. Tieto nízke dávkovania podstatne znižujú zvyčajné vedľajšie účinky.

Liečivé prípravky podľa vynálezu sa taktiež vyznačujú dávkovou jednotkou od 15 do 375 pg/kg telesnej hmotnosti s vhodným obsahom biologicky aktívneho lektínu z imela.

Ako dávková jednotka je výhodný analyticky kontrolovaný obsah lektínu z imela, špecifického pre galaktozid, na podávanie od 25 do 200 pg/kg telesnej hmotnosti, najmä 75 pg/kg telesnej hmotnosti.

Vďaka prípravkom podľa vynálezu je po prvýkrát možné reprodukovateľné vyrobiť parenterálne prípravky, ktoré počas celého času použiteľnosti dovoľujú bezpečnú aplikáciu, taktiež vo forme jednorazových striekačiek, kde inak adsorpcia bielkoviny na lipofilných povrchoch plastov je veľmi problematická. Tie sa používajú na zlepšenie imunitných parametrov u ľudí aj cicavcov, na terapiu nádorov, ako aj pri vírusových chorobách.

Zistenie optimálne účinného obsahu lektínu z imela:

Pre klinické skúšky sa pripravil injekčný roztok z vodného výluhu z nezdrevnatených vetvičiek imela s listami s obsahom 30 ng/ml lektínu z imela, viažuceho galaktozid, ktorý bol stanovený ako lektín z imela I. Čas použitia u pacientov s rakovinou bol 4 týždne pri dvoch aplikáciách týždenne. Pritom bolo prekvapivo zistené, že už pri dávke 75 pg/kg telesnej hmotnosti bolo možné pozorovať najsilnejšie kladné zmeny imunitných parametrov v sére chorých na rakovinu. Tieto nálezy sú nové, pretože za súčasného stavu techniky sa muselo vychádzať z toho, že až značne vyššie dávkovanie, a to 1 ng/kg telesnej hmotnosti, vyvoláva kladné zmeny v imunitných parametroch. Porovnávacie testy ukázali, že tak ako väčšie aj menšie dávkovanie (15 pg/kg, prípadne 375 pg/kg) vyvolávajú menšie zmeny imunitných parametrov počtu buniek CD 3 + HLA - DR + a LGL počet buniek - (Large granular lymphocytes) (pozri obrázky 2 a 3).

Stabilizácia prípravku s lektínom z imela:

Ako stabilizátory vodných prípravkov s lektínom z imela sa použili alkanoly, ako sú napríklad polyoly, a glycidy, hydrofílné polyméry, ako je napríklad polyvinylpyrolidón, polyvinylalkohol, neiónové tenzidy, ako napríklad polyalkylénglykoly (poloxaméry), estery mastných kyselín s polyoxyetylénom (polysorbáty) a bielkoviny, ako napríklad albumín, najmä albumín z ľudského séra.

Stabilizujúce prísady na prípravky lektínu z imela sú známe zo spisu EP 0 602 686 A2, kde sa pridávajú do roztoku v oblasti koncentrácií od 0,1 mg/ml do 10 mg/ml, výhodne 5 mg/1. Pri analýze roztokov podľa vynálezu sa plne prihliadalo ku spisu EP 0 602 686 A2.

Teraz sa prekvapivo zistilo, že koncentrácie uvedených stabilizátorov od 0,01 mg/ml a nižšie, sa čo do stabilizujúceho účinku chovajú ekvivalentne. To sa mohlo ukázať príkladne na stabilizátoroch polyvidon (PVP) a albumín, známych z literatúry. Tieto stabilizátory zvyšujú stabilitu bielkovín, pokiaľ sa týka povrchovej väzby na lipofilné povrchy (obrázok 4). Nad to sa docielila taktiež pre skladovaciu stabilitu porovnateľná kvalita, keď sa použili nižšie koncentrácie pomocných látok (napríklad polyvidónu) (obrázok 5).

Ďalej bolo prekvapivo zistené, že taktiež neiónové tenzidy, ako napríklad polyalkylénglykoly (blokové polyméry z etylénoxidu a propylénoxidu, napríklad Pluronic) a estery mastných kyselín s polyoxyetylénom (napríklad Tween 20), v rovnakých oblastiach koncentrácií pôsobia stabilizačné.

Prípravky z extraktu z imela sa používajú na trvalú terapiu. Zníženie obsahu pomocných látok na stabilizáciu podstatne prispieva k bezpečnosti liečiva, pretože napríklad polyméry, ako je polyvidon a polyalkylénglykoly na báze etylénoxidu a propylénoxidu, po parenterálnej aplikácii sa pri poruchách ťunkcie obličiek spomalene vylučujú. Okrem toho je nebezpečenstvo, že sa tieto látky hromadia. Toto nebezpečenstvo sa podstatne obmedzuje znížením koncentrácie na príkladných 0,01 mg/ml.

V prípravkoch podľa vynálezu sa používajú chelátotvomé prísady, ako napríklad kyseliny nitriloalkánokarboxylové a ich deriváty, aby sa zvýšila skladovateľnosť injekčných roztokov. Použitím týchto zlúčenín, najmä vo forme solí s alkalickými kovmi vedľa uvedených stabilizátorov sa prekvapivo docielil drasticky predĺžený čas stability pri skladovaní prípravkov z extraktov z imela. Vplyv chclátotvomých prísad, ktoré sa dosiaľ v parenterálnych liekových formách používali hlavne na komplexovanie kovov (Wang, Hansen), na prípravky z extraktov z imela, je za súčasného stavu techniky neznámy.

Vhodnými zlúčeninami sú NTA (kyselina nitrilooctová ajej soli), EDTA (kyselina etyléndiamintetraoctová ajej soli), CDTA (kyselina l,2-diaminocyklohexán-N,N-tetraoctová ajej soli), kyselina N-(2-hydroxyetyl)-etyldiamín-Ν,Ν,Ν-trioctová ajej soli aTTHA (kyselina trietyléntetramínhexaoctová ajej soli). Môže sa použiť jedna zlúčenina alebo viac takýchto zlúčenín.

Vo výhodnej forme uskutočnenia sa ako derivát kyseliny nitriloalkánkarboxylovej použije kyselina etyléndiamíntctraoctová, najmä ako dvojsodná soľ. Výhodne sa použije dinatriumedetát v oblasti koncentrácií od 0,001 mg/ml do 0,1 mg/ml, najmä 0,01 mg/ml.

Nadradenosť kombinácie rôznych stabilizujúcich látok oproti jednej zlúčenine je, čo sa týka skladovacej stability prípravkov z imela, zreteľná podľa úbytku obsahu lektínu z imela, napríklad pre polyvidon, prípadne pre polyvidon a dinatriumedetát (obrázok 7).

Prísada stabilizátorov, ako je polyvidon a dinatriumedetát, preukázateľne neovplyvňuje aktivitu prípravkov z extraktu z imela. Prípravky z imela s rovnakým obsahom lektínu z imela majú tak s prísadou PVP a dinatriumedetátu, ako aj bez prísad, rovnakú aktivitu v teste cytotoxicity MOLT - 4 a pri uvoľňovaní cytokínov z ľudských krvných buniek. Prísady samy v tomto teste nemajú žiadnu aktivitu. Tým je zaistené, že prísady neovplyvňujú farmakologické pôsobenie prípravkov z extraktov z imela.

Nasledujúce príklady receptúr stabilných prípravkov vynález vysvetľujú bez toho, aby ho obmedzovali.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 Skladovacia stabilita vodného prípravku z vodného výluhu (1 : 1, 1 - 1,5) z nezdrevnatených vetvičiek imela s listami, upraveného na 65 ng/ml, obsahujúceho 0,1 mg Polyvidonu K17PF/ml, stanovenie lektínu z imela pomocou modifikovanej metódy ELLA (Táng. O, PiiLarsen K., Bog - Hansen TC. A New Quanlitative and Highly Specific Assay for Lectinbinding Activity. In Bog - Hansen TC, van Druesche E. editors. Lactins Biology - Biochemistry - Clinical Biochemicstry Vol. 5 Berlín V de Gruyter, 1986637 - 644).

Obrázok 2 Stredné hodnoty počtu buniek LGL počas štvortýždennej podkožnej aplikácie PS76A2:

deň: pred začiatkom aplikácie deň: koniec štúdie

Obrázok 3 Stredný priebeh aktivovaných lymfocytov (CD3 + HLA - DR +) v priebehu štvortýždennej podkožnej aplikácie PS76A2

0: pred začiatkom aplikácie

1: 24 hodín po začiatku aplikácie

2: 48 hodín po začiatku aplikácie

3: 28 dní po začiatku aplikácie

Obrázok 4 Úbytok obsahu lektínu z imela v percentách injekčných roztokov, obsahujúcich vodný prípravok z vodného výluhu (1:1,1- 1,5) z nezdrevnatených vetvičiek imela s listami, upravený na 65 ng/ml, v závislosti od času pobytu v jednorazových striekačkách (PE/PP) s gumovým piestom.

Obrázok 5 Skladovacia stabilita prípravku z imela v 20 mM fosfátovom pufri pH 7,4 meraná pomocou obsahu lektínu z imela v percentách.

Obrázok 6 Skladovacia stabilita prípravku z imela v 20 mM fosfátovom pufri s pH 7,4 meraná pomocou obsahu lektínu z imela v percentách, skladovanie pri 4 - 8 °C.

Obrázok 7 Skladovacia stabilita injekčných roztokov, obsahujúcich vodný prípravok z vodného výluhu (1 : 1,1 - 1,5) z nezdrevnatených vetvičiek imela s listami v 20 mM fosfátovom pufri, skladovanie 4 - 8 °C.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1: Injekčný roztok (5 1)

Vodný výluh (1:1,1- 1,5) z nezdrevnatených vetvičiek imela s listami, zodpovedajúci 30 ng/ml aktívneho lektínu z imela 0,2 - 0,7 g

Monohydrogénfosfát sodný. 12 H₂O 20,13g

Dihydrogénfosfát sodný. 2H₂O 1,88g

Chlorid sodný 37,50g

Polyvidón K17PF 0,05g

Dinatriumedetát 0,05g

Voda 4965 g

Príklad 2: Injekčný roztok (6 1)

Vodný výluh (1 : 1, 1 - 1,5) z nezdrevnatených vetvičiek imela s listami, zodpovedajúci 30 ng/ml aktívneho lektínu z imela 0,2 - 0,7 g

Monohydrogénfosfát sodný. 12H₂O 20,13g

Dihydrogénfosfát sodný. 2H₂O 1,88 g

Chlorid sodný 37,50 g

Pluronic F 68 0,05g

Dinatriumedetát 0,05g

Voda 4965 g

Príklad 3: Injekčný roztok (5 1)

Vodnývýluh(l : 1, 1 - 1,5) z nezdrevnatených vetvičiek imela s listami, zodpovedajúci 30 ng/ml aktívneho lektínu z imela 0,2 - 0,7 g

Monohydrogénfosfát sodný. 12H₂O 20,13g

Dihydrogénfosfát sodný. 2H₂O 1,88g

Chlorid sodný 37,50g

Tween 20 0,05g

Dinatriumedetát 0,05g

Voda 4965g

2. Liečivý prípravok podľa nároku 1,vyznačujúci sa tým, že má obsah stabilizujúceho tenzidu v množstve 0,01 mg/ml.

3. Liečivý prípravok podľa nároku 2, vyznačujúci sa tým, že obsahuje polyoly, uhlohydráty, polyvinylpyrolidón, polyvinylalkohol, polyalkylénglykoly, estery mastných kyselín s polyoxyetylénom a'alebo bielkoviny, najmä albumín, najmä albumín z ľudského séra, ako stabilizátory.

4. Liečivý prípravok podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že má dodatočný obsah chelátotvorných zlúčenín v množstve od 0,1 do 0,001 mg/ml, najmä 0,01 mg/ml.

5. Liečivý prípravok podľa nároku 4, vyznačujú c i sa t ý m , že má obsah soli alkalického kovu s kyselinami nitriloalkánkarboxylovými ako chelátotvomými zlúčeninami.

6. Liečivý prípravok podľa nároku 5,vyznačujúci sa tým, že ako derivát kyseliny nitriloalkánkarbónovej obsahuje kyselinu etyléndiamíntetraoctovú, výhodne ako dvojsodnú soľ.

7. Liečivý prípravok podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa tým, že je v lyofilizovanej forme.

8. Liečivý prípravok podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vo forme jednotkovej dávky, vyznačujúci sa tým, že má obsah biologicky aktívneho lektínu z imela, viažuceho galaktozid, na aplikáciu 15 až 375 pg/kg telesnej hmotnosti.

9. Liečivý prípravok podľa nároku 8 vo forme jednotkovej dávky, vyznačujúci sa tým, že má obsah lektínu na aplikáciu 25 až 200 pg/kg, najmä 75 pg/kg telesnej hmotnosti.

výkresy

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Liečivý prípravok na parcntcrálnc podávanie z extraktov z imela ako vodného výluhu z vetvičiek imela, vyznačujúci sa tým, že ako roztok obsahuje od 5 do 50 ng/ml, výhodne 20 až 30 ng/ml, imunologický aktívneho lektínu z imela, viažuceho galaktozid, s obsahom stabilizátorov zo skupiny alkanolov, hydrofilných polymérov neiónových tenzidov a/alebo proteínov v množstve < 0,01 mg/ml.