SK282441B6

SK282441B6 - Polypeptid s aktivitou pľúcneho surfaktantu a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom

Info

Publication number: SK282441B6
Application number: SK1524-96A
Authority: SK
Inventors: R�diger NAVE; Wolf-R�diger ULRICH; Ernst Sturm; Uwe KR�GER; Dietrich H�FNER; Klaus P. SCH�FER; Klaus Melchers
Original assignee: Byk Gulden Lomberg Chemische Fabrik Gmbh
Priority date: 1994-05-31
Filing date: 1995-05-27
Publication date: 2002-02-05
Also published as: MX9605986A; PT764172E; WO1995032992A1; FI118126B; DE59510941D1; ES2227548T3; RU2145611C1; SK152496A3; US5874406A; AU2616995A; CN1154117A; CA2191344C; FI964766A0; CN1130374C; KR100355626B1; DE4418936A1; NZ287447A; NO965052D0; BG101028A; PL317420A1

Abstract

Sú opísané polypeptidy všeobecného vzorca (I), kde A znamená H alebo Phe, B znamená Phe alebo Trp a C znamená Ile, Leu alebo Ser, ktoré sú účinné ako prirodzené pľúcne surfaktanty. Uvedené polypeptidy možno produkovať vo veľkých množstvách, vo vysokej čistote a použiť pri výrobe farmaceutického prípravku na liečbu syndrómu respiračnej choroby u predčasne narodených detí a u dospelých.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa zaoberá polypeptidmi s aktivitou pľúcneho surfaktantu, spôsobmi ich prípravy a terapeutickými prípravkami s ich obsahom.

Doterajší stav techniky

Pľúca všetkých stavovcov obsahujú zmes látok, ktoré sú označené ako „pľúcny surfaktant“. Má povrchovo aktívne vlastnosti, znižuje povrchové napätie v alveolárnej oblasti pľúc do takej miery, že sa zabráni kolapsu koncových oblastí dýchacích ciest pri výdychu. Táto zmes látok reguluje povrchové napätie dynamickým spôsobom, takže kolapsu, ktorý sa očakáva podľa Laplaceovej teórie, pri malých alveolách v prospech väčších alveol, sa zabráni vhodnou úpravou povrchového napätia. Výsledkom je dobre vyvážená, histologický a fyziologicky stabilná štruktúra pľúc.

Pľúcny surfaktant je vylučovaný alveolárnymi pneumocytmi typu II vo forme lamelových útvarov. Tieto sú kompaktnými jednotkami fosfolipidových dvojvrstiev s vysokým obsahom dipalmitoylfosfatidylcholinu (DPPC) a fosfatidylglycerolu (PG). Ďalšie esenciálne zložky v pľúcnom surfaktante predstavujú proteíny, označené ako SP-A, SP-B a SP-C. SP-A je glykoproteín s vysokou molekulovou hmotnosťou, ktorý v regulácii sekrécie zohráva kľúčovú úlohu.

Pri proteínoch SP-C a v menšej miere pri proteínoch SP-B sa uvažuje, že majú úlohu „termodynamického katalyzátora“ pri tvorbe monomolekulového povrchového filmu (surfaktant v užšom zmysle). Prítomnosť týchto proteínov veľmi urýchľuje kinetiku napätia. Iba toto umožňuje bez oneskorenia upraviť zloženie surfaktantu na zvláštne požiadavky povrchového napätia. Tieto vlastnosti zodpovedajú extrémne hydrofóbnej povahe proteínov, najmä SP-C.

Je možné pomocou extrakcie pľúcneho tkaniva alebo irigáciou pľúc zvieraťa získať surfaktantové prípravky, ktoré rovnako pri fyzikálno-chemických meraniach, ako aj v modeloch na zvieratách a klinickom použití, majú schopnosť kompenzovať deficienciu surfaktanu, a teda sú vhodné napríklad na liečbu syndrómu respiračného zlyhania u detí (IRDS). Tieto zvieracie preparáty však majú závažné nedostatky:

Prípravok fosfolipidov veľmi závisí od zvieracieho druhu, zdravotného a nutričného stavu zvieraťa a môže byť kompenzovaný iba v ohraničenej miere pridaním definovaných komponentov. Obsah surfaktantových proteínov a pomer SP-B/SP-C je ovplyvnený tými istými nedostatkami. Ďalším faktorom je, že zmes použitá v terapii tiež obsahuje možné proteolytické rozpadové produkty proteínov alebo modifikované deriváty (napríklad oxidáciou pri metioníne). Z hľadiska dlhodobého používania alebo podávania veľkých množstiev surfaktantu v prípade nevyhnutnosti, napr. v prípadoch syndrómu respiračného zlyhania u dospelých (pľúcny šok, ARDS) alebo v iných oblastiach použitia, ako napríklad využitie surfaktantu ako „nosiča“ pre iné látky na pľúcne podávanie, ostáva otázka dodávania látky otvorená.

Je preto obvyklé riešiť tieto problémy prípravou proteinov pomocou genetického inžinierstva. Keďže rekombinantné proteíny možno, najmä v prípadoch bakteriálnych systémov expresie, pripraviť v skutočne neohraničenom množstve a s použitím moderných analytických a kvalitných kontrolných metód, je možné s použitím syntetických fosfolipidov pripraviť surfaktant presne definovaného zloženia. Toto môže byť optimálne upravené podľa terapeutických požiadaviek.

Humánny protein SP-C (pozri vzorec (I) s A = H alebo Phe, B = Cys a C = Met), ktorý je zvlášť dôležitý pre kinetiku napätia, pozostáva vo svojej strednej časti výlučne z aliťatických, veľmi hydrofóbnych aminokyselín, ako sú valín, leucín a izoleucín. Dĺžka tejto strednej časti (aminokyseliny 12 až 34) umožňuje, aby bol peptid integrovaný do monomolekulového fosfolipidového filmu. V Pro-Cys-CysPro sekvencií (pozícia 3 až 6) sú dva Cys zvyšky tioesterifikované kyselinou palmitovou na SH skupinách. Kyselina palmitová ďalej zvyšuje hydrofobicitu kompletného proteínu a súčasne blokuje tieto dve SH skupiny cysteínov a ochraňuje ich pred oxidáciou a tvorbou disulfidových mostíkov. V strednej časti (aminokyseliny 12 až 34) vytvára transmembránový helix. Táto oblasť je primknutá na N-konci polárnou sekvenciou, ktorá obsahuje pozitívne nabité aminokyseliny (Lyz, 10 ; Arg, 11).

WO 91/18015 opisuje prípravu rekombinantného SP-C a mutantov SP-C. Medzi iným sa tu navrhuje, aby sa nahradili obidva cysteíny v pozícii 4 a 5 dvoma serínmi. Toto je výhodné z hľadiska prípravy, technicky komplikovaná palmitoylácia oboch cysteínov po izolácii veľmi hydrofóbneho proteínu nie je potrebná.

Podstata vynálezu

Teraz sa prekvapujúco zistilo, že pri SP-C mutantoch, ktoré sa od humánneho SP-C odlišujú nahradením oboch cysteínov v pozíciách 4 a 5 fenylalanínom alebo tryptofánom a nahradením metionínu v pozícii 32 izoleucinom, leucínom alebo serínom nedochádza k žiadnym stratám funkcie pri akomkoľvek porovnaní s prirodzeným SP-C a v skutočnosti ho predstihujú vzhľadom na stabilitu. Prípravok pripravený genetickým inžinierstvom je výrazne jednoduchší a poskytuje vyššie výťažky. Nové polypeptidy s aktivitou pľúcneho surfaktantu možno pripraviť vo vysokej čistote.

Vynález sa preto týka polypeptidov s aktivitou pľúcneho surfaktantu a so sekvenciou aminokyselín v súlade so vzorcom (I)

0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
(A)	Gly	lie	Pro	B	B	Pro	val	His	Leu	Lyz
	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
	Arg	Leu	Leu	lie	Val	Val	Val	Val	Val	Val	(D
	21	22	23	24	25	26	27	28	29	30
	Leu	lie	Val	Val	Val	lie	Val	Gly	Ala	Leu
	31	32	33	34
	Leu	C	Gly	Leu

kde

A znamená H alebo Phe,

B znamená Phe alebo Trp,

C znamená íle, Leu alebo Ser.

Vynález sa týka najmä polypeptidov všeobecného vzorca (I), kde A = H alebo Phe, B = Phe a C = íle, pričom špecifikácia, že A = H, B = Phe a C = íle je zvlášť výhodná.

Vynález sa ďalej týka farmaceutických prípravkov, ktoré zahrnujú jeden alebo viac polypeptidov podľa vynálezu a v prípade, že sa to požaduje, môžu obsahovať jeden alebo viac polypeptidov s aktivitou pľúcneho surfaktantu zo skupiny SP-A a SP-B, výhodne SP-B.

Polypeptidy podľa vynálezu možno pripraviť alebo spôsobmi známymi pri syntéze peptidov v tuhej fáze, alebo pomocou primeraných rekombinantných vektorov v hostiteľských bunkách. Technológie konštrukcie vektorov, transformácie buniek, umožnenie expresie proteínu do transformovaných buniek a izolácia a purifikácia exprimovaných proteínov sú odborníkom v oblasti techniky dobre známe (napríklad WO 86/03408, WO 87/06588 a WO 91/18015). Príprava vektorov na expresiu SP-C v bakteriálnych systémoch sa opiera o bežné metódy technológie s rekombinantnou DNA.

Je možné exprimovať hydrofóbny SP-C proteín v baktériách vo veľkom množstve a bez poškodenia hostiteľskej bunky iba vo forme vhodnej fúzie proteínov, ako napríklad spolu s chloramfenikol acetyltransferázou (CAT). Napríklad vektor pTrpAmpCAT152 kóduje oblasť N-zakončenia CAT a poskytuje (5')EcoRl a (3')Pstl miesto štiepenia v rámci klonovania DNA fragmentov, ktoré kódujú SP-C. CAT a SP-C sú v tomto prípade vzájomne spojené na úrovni proteínov prostredníctvom hydroxylamín-senzitivneho bodu fúzie (AsN Gly). Vektory tohto typu, ako napríklad pTrpAmpCAT152::SPC dovoľujú kontrolovanú expresiu zodpovedajúcich fúznych proteínov až po štádium produkcie (fermentácia). Expresia fúznych proteínov spôsobuje tvorbu inklúznych častí v hostiteľskej bunke. Ďalej je možné meniť dĺžku CAT časti vo fúznom proteíne, takže sa získajú veľké vyťažky inklúznych časti s vysokým obsahom SP-C.

Expresia sa nevyskytuje iba pri baktériách, ale aj vo veľkom množstve systémov, ako napríklad v bunkách cicavcov, kvasiniek a insektov. DNA zostavy vhodné pre rôzne hostiteľské bunky sa syntetizujú známymi spôsobmi a sú inkorporované do genómu hostiteľských buniek s primeranými kontrolnými sekvenciami bežným spôsobom.

Dva DNA oligonukleotidy môžu byť zosyntetizované bežnou fosfoamiditovou metódou v MilliGen/Bioresearch Cyclone DNA syntetizátore.

Prvý DNA oligonukleotid vytvára „sense“ reťazec DNA s dĺžkou 118 nukleotidov. Tento kóduje (v 5' —> 3' smere) Eco Rl-špecifické 5' zakončenie pre následné subklonovanie, miesto štiepenia Asn/Gly hydroxylamínu a humánny SP-C začínajúci Gly-25 a končiaci Leu 58 SP-C prekurzorovej sekvencie, zodpovedajúci Gly-1 a Leu-34 vo vzorci (I). Toto má za následok známu sekvenciu aminokyselín humánneho SP-C proteínu translatovaného do DNA v súlade s pravidlami genetického kódu. Ale, sekvencia je modifikovaná, takže obidva cysteíny v pozícii 28 a 29 SP-C prekurzorovej sekvencie sú nahradené fenylalanínmi alebo tryptofánmi a metionín v pozícii 56 prekurzorovej proteínovej sekvencie je nahradený izoleucínom, Jeucínom alebo serínom. Je ďalej možné takto vziať do úvahy frekvencie používania kodónu hostiteľských buniek. Modifikovaná SP-C sekvencia, ktorá obsahuje fenylalanín v pozíciách 4 a 5 a izoleucín v pozícii 32 (číslovanie podľa vzorca (I) sa spomína v súlade bežným jednopísmeným kódom pre tieto dve aminokyseliny ako SPC34(FF/I). Na doplnenie, „sense“ vlákno ĎNA obsahuje TAA stop kodón na ukončenie ribozomálnej translácie a Pst 1-špecifické 3' zakončenie. Druhý DNA oligonukleotid predstavuje komplementárny, nekódujúci reťazec pozostávajúci zo 110 nukleotidov.

Synteticky pripravený SP-C DNA fragment je klonovaný do vhodného vektora expresie, ako napríklad pTrpAmpCAT152. Tento vektor sa skladá z pKK233 (Pharmacia), ktorý obsahuje gén rezistencie na ampicilín a je derivátom pBR322. Trc promótor môže byť nahradený trp promótorom, ako pri pTrpAmpCAT152. Podobne možno použiť iné indukovateľné promótory.

Na subklonovanie SP-C fragmentu sa najprv spolu hybridizujú komplementárne DNA oligonukleotidy. Dvojvlákno DNA, ktoré z toho vzniká má vysunuté jednovláknové zakončenia (Eco Rl/Pst 1).

Inkorporácia do vektora DNA sa koná bežným spôsobom po Eco Rl/Pst digescii vektorovej DNA, po purifikácii požadovaného vektorového DNA fragmentu elektroforézou na agarózových géloch a hybridizáciou SP-C DNA a vektorového fragmentu prostredníctvom kohezívnych zakončení. Následne sa oba fragmenty na seba kovalentné nadviažu ligáciou známymi metódami.

Na amplifikáciu DNA a izoláciu plazmidu sa používajú bežné protokoly, napríklad na transformáciu do MM 294 buniek CaCl₂-kompetentnej E. coli a na selekciu buniek nesúcich plazmidy, na nanášanie ampicilínu na LB agarové platne. Plazmidová DNA je izolovaná z výsledných Amp-rezistentých kolónií a analyzuje sa vhodnou kombináciou reštrikčných enzýmov. Selektujú sa klony očakávanej DNA reštrikčnej fragmentovej vzorky. Kompletné sekventovanie plazmidovej sekvencie potvrdzuje správnu inzerciu SPC34(FF/I) sekvencie.

Plazmidové vektory získané týmto spôsobom umožňujú expresiu fúzneho proteínu CAT::SPC pod kontrolou Trp promótora (alebo iných promótorov). Rekombinantný fúzny proteín je produkovaný vo forme inklúznych častíc v bunkách hostiteľa po indukcii.

Fúzny proteín CAT152::SPC34 (FF/I) má nasledovnú sekvenciu aminokyselín, označenú bežným jednopísmenovým kódom.

20 30 4050

MEKKI TGYTT VDISQ WHRKE HEAFF OSVAQ CTYNO TVOLD ITAFL KTVKK

70 80 90100

NKHKF YPAFI HILAR ĽMNAH PEFRM AMKDG ELVIW DSVHP CYTVFHEQTE

110 120 130 140150

TFSSLWSEYH DDFRO FLHIY SQDVA CYGEN LAYFP KGFIE NMFFVSANPE

160 170 180186

FNGIP FFPVH LKRLL IWW WLIV WIVG ALLIG L 1 10 20 3034 aminokyselín SP-C(FF/I) v pozíciách 153 až 186 fúzneho proteínu je identifikovaných pomocou podčiarknutia a označenia pozícií 1 až 34.

Následné štiepenie hydroxylamínom na jednotlivé CAT A SP-C sa uskutočňuje medzi Asn-152 a Gly-153 (zodpovedá 1. aminokyseline v SP-C peptide). SP-C peptid sa odstráni a purifikuje spôsobmi používanými v chémii proteínov.

Polypeptidy podľa vynálezu môžu byť vyrobené jednotlivo alebo v kombinácii vo farmaceutických prípravkoch, ktoré sú upravené podľa požiadaviek liečby dýchacích ciest. Prípravky sú vhodné nielen na liečbu syndrómu respiračného zlyhania u predčasne narodených detí a u dospelých, ale aj na liečbu zápalu pľúc a bronchitídy. Polypeptidy podľa vynálezu sú tiež vhodné ako nosiče na liečivá podávané inhalačné.

Okrem polypeptidov prípravky obsahujú fosfolipidy, prednostne tie, ktoré sú prítomné v prirodzených pľúcnych surfaktantových prípravkoch, ako sú najmä dipalmitoyifosfatidylcholin (DPPC), palmitoyloleylfosfatidylglycerol (POPG) a/alebo fosfatidylglycerol (PG). Prípravky obsahujú vápnikové alebo horčíkové ióny a chlorid sodný na dosiahnutie vhodnej viskozity. Skúsený praktik stanoví typ a množstvo jednotlivých súčastí na jednej strane na základe známeho zloženia prirodzeného pľúcneho surfaktantu a na druhej strane podľa množstva predchádzajúcich návrhov, ako napríklad podľa EP-A 0119056 a EP-A 0406732.

Výhodné prípravky podľa vynálezu obsahujú 80 až 95 hmotnostných % fosfolipidov, 0,5 až 3,0 hmotnostných % polypeptidov, 4 až 7 hmotnostných % mastných kyselín, výhodne kyseliny palmitovej a 1 až 3 hmotnostných % chloridu vápenatého.

Príklady uskutočnenia vynálezu

1. Produkujúci kmeň

Produkujúci kmeň E. coli, ktorý bol použitý, je odvodený od E. col K12 kmeňa MM294, ktorý sa predáva pod číslom 5208 z Deusche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM, Braunschweig).

Vektor expresie pTrpAmpCAT152::SPC34 (FF/1), obsahujúci gén na proteínovú fúziu CAT152::SPC34 (FF/1) bol odvodený od DNA sekvencie pBR322, derivátu ColEl (E. Weber (ed.) (1988), Biologická bezpečnosť, Spolkové ministerstvo pre vedu a technológiu, Bonn). Trc promótor bol odstrihnutý z plazmidu pKK233-2, ktorý možno získať od Pharmacia s Eco R1/Hind 3 a bol nahradený Trp promótorom (pTrp233). Tento pozostáva z oblasti promótora (väzbové miesto na RNA polymerázu), oblasti operátora (väzbové miesto na Trp represor, Shine/Dalgamo (SÚD) sekvencie a reštrikčných miest na klonovanie. Gén (CAT152) kódujúci 152 aminokyselín časti 5' bakteriálnej chloramfenikol acetyltransferázy bol inzertovaný za Trp promótorom. Syntetický génový fragment, ktorý kóduje 34 aminokyselín SP-C(FF/I) podobného ľudskému bol fúzovaný do CAT152 DNA parciálnej sekvencie. Funkčná CAT::SPC(FF/I) transkripčná jednotka je kompletizovaná bakteriálnou rmB transkripčnou koncovou sekvenciou T1T2. Výsledný produkt konštrukcie sa označuje ako pTrpAmpCAT152::SPC34(FF/I).

Vektor pTrpAmpCAT152::SPC34(FF/I) má nasledovné funkčné elementy:

- CAT152::SPC34(FF/I) gén kontrolovaný promótorom Trp a transkripčným terminátorom T1T2;

- ori oblasť a priľahlé oblasti, prostredníctvom ktorých sa kontroluje číslo kópie plazmidu;

- Amp_gén.

Potom, keď sa plazmid zavedie do bunky hostiteľa, má táto vysoké číslo Trp génu kontrolovaného promótorom CAT::SPC(FF/I). Trp represor poskytuje samotná hostiteľská bunka.

Získanie rCAT/.SPC fermentáciou je kontrolované prostredníctvom koncentrácie tryptofánu v médiu alebo prostredníctvom adície β-ΙΑΑ (kyseliny β-indolylakrylovej).

2. Fermentácia dávky

Kultivačné médium (pozri zloženie uvedené ďalej) v miešacej nádobe je inokulované (1 1 prekultúry alebo východiskovej kultúry) so vzorkou pracujúcej banky buniek (glycerolová kultúra) a inkubuje sa za silného selekčného tlaku ampicilínu pri 37 °C s miešaním. Rast sa monitoruje prostredníctvom optickej hustoty pri 578 nm. Keď východisková kultúra E. coli 199 dosiahne optickú hustotu viac ako 3, kultúra sa použije na inokuláciu 10 1 fermentátora a rast baktérií pokračuje za zníženého selekčného tlaku ampicilínu. Hneď ako optická hustota dosiahne hodnotu medzi 5 a 6, prenesie sa 10 1 kultúry do 100 1 fermentátora a inkubuje sa ďalej za tých istých podmienok. Po dostatočnom raste sa transkripčná jednotka kontrolovaná Trp promótorom CAT::SPC(FF/I) indukuje pridaním napríklad 40 mg/1 β-ΙΑΑ. Po indukcii pokračuje fermentácia 4 až 5 hodín, až kým sa bunky nezozbierajú.

Počas fermentácie sa meria parciálny tlak kyslíka (pO₂), pH a teplota fermentačného bujónu a sú regulované on-line. pH sa udržiava na konštantnej hodnote pomocou roztoku hydroxidu sodného a parciálny tlak kyslíka (pO₂) sa reguluje prostredníctvom zavedenia kyslíka a rýchlosti miešača. Stanovenie optickej hustoty pri 578 nm a koncentrácie uhlíkového zdroja v médiu sa uskutočňuje off-line.

Tvorba peny je detegovaná pomocou senzora peny, cez ktorý možno zavádzať protipenivý agens, ak je vhodné penu regulovať.

Podiely kultivačného bujónu sa odoberajú v rôznych časových úsekoch. Po lýze baktérií sa expresia preskúma pomocou frakcionácie a farbenia proteínov E. coli na polyakrylamidových géloch. Percentuálny podiel (prevládajúcich) proteínov v celkovom proteíne E. coli sa stanoví denzitometricky. Krátko po indukcii rekombinantného génu sa objaví nová prevládajúca proteínová väzba (rCAT-.-.SPC).

Zloženie kultivačného média je nasledovné: sójový peptón 27,0 g/l, kvasinkový autolyzát KAV 14,0 g/l, NaCl 5,0 g/l, K₂HPO₄ x 3 H₂O 6,0 g/l, KH₂PO₄ 3,0 g/l, MgSO₄ x 7 H₂O, glycerol (99,5 %-ná čistota) 30,0 g/l, antipena J673 (Struktol Comp.) 0,2 ml/1, L-tryptofán 80,0 mg/1 a ampicilin 20 mg/1 pre 1. prekultúru a 5 mg/1 pre 2. prekultúru a 100 1 fermentátora.

Pred autoklávovaním a sterilizáciou kompexného nutričného média sa pH upraví na 6,8 pomocou 2N NaOH. Pre prekultúru v 10 1 fermentátora sa použije miešacia rýchlosť 750 rpm a prívod vzduchu 10 1/min. pri 37 °C a pre hlavnú kultúru v 100 1 fermentátora je miešacia rýchlosť 400 rpm prívod vzduchu 70 1/min. pri 37 °C. Antipena sa pridáva podľa požiadaviek pomocou použitia striekačky cez septum.

Asi 4 hodiny po indukcii sa bunky z kultivačného bujónu odstránia filtráciou a/alebo centrifugáciou. Vlhká biomasa sa zozbiera v kontajneri z čistej ocele a mieša sa s 10 1 prierezového pufra (pH 8,0) v chladnej miestnosti cez noc (4 °C, 16 hodín). Miešaná bunková suspenzia sa rozdrví (pri izbovej teplote) vo vysokotlakovom homogenizátore (ž 7 . 10⁴ kPa (700 barr)) a opäť sa zozbiera do kontajnera z čistej ocele. Inklúzne časti sa následne okamžite zozbierajú filtráciou a/alebo centrifugáciou (Sorvall RC2-B centrifúga, 27 000 g) pri 4 °C, sú resuspendované v pufri (asi 11) a napríklad po častiach asi 350 ml prenesené do 1 1 fliaš s okrúhlou spodnou časťou a nechajú sa lyofilizovať asi 96 hodín. Asi 200 g suchých inklúznych súčasti obsahujúcich viac ako 20 hmotnostných % fúzneho proteínu sa získa zo 100 fermentovaného podielu. Lyofilizované hlavné súčasti možno uchovávať pri -20 °C niekoľko mesiacov.

3. Štiepenie fúzneho proteínu purifikácia lipofilného peptidu SP-C(FF/1)

100 g suchých inklúznych častí sa rozpustí v 1,6 1 8 molámeho roztoku hydrochloridu guanidinu (917,1 g), za mierneho zohriatia. Nerozpustené rezíduá sa odstránia filtráciou cez žliabkovaný filter. Kvôli štiepeniu fúzneho proteínu v bode spájania Asn-Gly sa pridá k roztoku 167 g chloridu hydroxylamónia a pH roztoku sa upraví na 9,6 pomocou 2N NaOH. Potom sa štiepiaci roztok nechá stáť za miešania pri izbovej teplote 3 až 4 dni. Na konci reakčného času sa SP-C(FF/I) nechá precipitovať pridaním 6,4 1 tris pufra (pH 8,0) a sedimentuje s použitím centrifúgy (Sorvall RC2-B centrifúga). Supematant sa oddekantuje a SPC peleta je resuspendovaná v 400 až 500 ml tris pufra a opäť je centrifúgovaná za tých istých podmienok 30 minút.

SP-C peleta sa rozpusti v 3,5 l zmesi chloroform/metanol s obsahom kyseliny chlorovodíkovej (1,75 1 CHClj + 1,75 1CH₃OH + asi 30 ml 2N HCI). Tento surový SP-C roztok je ďalej purifikovaný pomocou preparačnej HPLC na C8 látke v reverznej fáze. Chloroform/metanolový extrakt je pľed aplikáciou na preparačnú HPLC kolónu zriedený 90 %-ným metanolom v pomere asi 1 : 2. Týmto roztokom možno naplniť napríklad kolónu (priemer 5 cm) asi 400 mg SP-C(FF/1) (napríklad 2 1 zriedeného surového extraktu. SP-C(FF/1) sa eluuje za kyslých podmienok (pH 2 až 3) gradientom voda/i-propanol (pozri separačné podmienky). Po chromatografii asi 30 minút sa 4 až 6 frakcií 200 ml zozbiera z oblasti, v ktorej SP-C eluuje (UV detekcia pri 220 nm). Frakcie sa preskúšajú analyticky pomocou HPLC a vhodne sa rozdelia. Kvôli skladovaniu sa zmrazia v tekutom dusíku a udržiavajú sa hlboko mrazené pri -80 °C. SP-C(FF/I) sa získa v 98,5 až 99,5 % čistote.

Podmieky separácie:

kolóna Kromasil C8 100 A 16 f m 300 mm * 50 mm I. D.

eluent A: HPLC voda od Millipore systém

B: i-PrOH lineárny gradient

C: 60 mmol/1 HC1 (zriedenie dymivej HC1)

gradient:	Tim &	%A	%B	%C	prietoková rýchlosť (ml/min.)
	v 0	45	50	5	100
	10	45	50	5	100
	55	0	95	5	100
	65	0	95	5	100
	75	45	50	5	100
	85	45	50	5	100
	90	45	50	5	0,2

4. Inkorporácia SP-C(FF/I) do fosfolipidovej matrice

Lipofilný peptid SP-C(FF/I) sa zmieša v roztoku i-propanolu so zložkami fosfolipidovej matrice a precipituje v homogénnej zmesi so zložkami fosfolipidovej matrice pomocou rozprašovania do zriedeného roztoku NaCl (0,06 % hmotnostných NaCl) pri izbovej teplote. LSF sa zo suspenzie pľúcneho surfaktantu odstráni s použitím valcovej centrifúgy a resuspenduje v roztoku elektrolytu (NaCl, CaCl₂) a pH sa upraví na 6,5 pomocou 0,1 N NaOH. Táto vodná suspenzia sa vloží do 20 ml liekoviek a je lyofilizovaná. Hmotnosti a objemy uvedené v nasledovnom príklade prípravy sa týkajú prípravy 10 g prípravku pľúcneho surfaktantu:

7,00 g dipalmitoylfosfatidylcholínu (DPPC), 3,08 g amóniovej soli palmitoyloleylfosfatidylglycerolu (POPG x NH₄) a 0,25 g kyseliny palmitovej sa rozpustia pri 40 °C v 200 ml 90 % i-propanolu a potom sa ochladia na izbovú teplotu. Výsledný fosfolipidový roztok sa zmieša s 1 1 roztoku, ktorý obsahuje 200 mg purifikovaného SP-C(FF/I) a bol získaný HPLC purifikáciou. Výsledný „rozprašovací roztok“ sa upraví na pH 4,5 miešaním s roztokom bikarbonátu (asi 5 ml 5 % roztoku NaHCO₃).

„Rozprašovací roztok“ sa pri izbovej teplote cez jcdnozložkovú dýzu zavedie pri rozprašovacej rýchlosti 25 ml/min. do 9,6 1 zriedeného roztoku NaCl (0,065 % hmotnostných) za silného miešania. Vytvorí sa opalescentný roztok a po uskladnení na 2 hodiny pri 4 °C až 8 °C sa prípravok pľúcneho surfaktantu precipituje rozprašovaním v roztoku elektrolytu (3,0 g CaCl₂ x 2 H₂O a 61,3 g NaCl v 300 ml H₂O). Suspenzia pľúcneho surfaktantu (celkový objem 10,8 až 11,0 1) sa uchováva cez noc pri 4 °C potom sa centrifúguje v Sorvall valcovej centrifúge (RC2-B) pri 16 000 g 30 minút v každom prípade. Centrifúgačná peleta je v každom prípade resuspendovaná v polovici objemu 0,65 % roztoku NaCl a opäť sa centrifúguje, aby sa odstránili adherentné rezíduá i-propanolu. Tento postup sa opakuje celkovo 3- až 4-krát. Peleta z poslednej centrifúgácie sa rozpustí v 400 ml 0,65 % roztoku NaCl, upraví sa pH na

6,5 pomocou 0,1 N NaOH a rozdelí sa na dávky po 6,2 g v 20 ml liekovkách. Obsah liekoviek je lyofilizovaný nasledovne: zmrazenie pri -45 °C počas 6 hodín za atmosférického tlaku, vysušenie zmrazením pri -20 °C pri 16 Pa (0,16 mbar) počas 54 hodín a potom ďalšie intenzívne sušenie pri 2 Pa (0,02 mbar) a -20 “C počas 5 hodín.

Získa sa 65 až 66 liekoviek, každá obsahujúca 0,150 g pľúcneho surfaktantu (prepočítané bez NaCl).

Vzorky suchého pľúcneho surfaktantu sa uchovávajú v chladničke pri 4 °C a pred použitím musia byť resuspendované vodou alebo fyziologickým roztokom NaCl (koncentrácia suspenzie 25 mg/ml).

Každá liekovka obsahuje:

95,6 mg dipalmitoylfosfatidylcholínu

42,1 mgpalmitoylolcylfosfatidylglycerolu (amóniová soľ)

2.7 mg SP-C(FF/I)

6.8 mg kyseliny palmitovej

2.9 mg chloridu vápenatého (bezvodého)

Testy biologickej účinnosti

Boli testované dva surfaktantové prípravky s tým istým fospolipidovým zložením, obsahujúce rekombinantný proteín-C surfaktantu (rSP-C surfaktant) a surfaktant bez proteinu SP-C (PL-surfaktant). rSP-C je analógom ľudského SP-C. Obsahuje fenylalanin namiesto dvoch cysteínov v polohách 4 a 5 sekvencie ľudského SP-C, a izoleucin namiesto metionínu v polohe 32. rSP-C bol v pomere 70 : 30 zmiešaný s fosfolipidom, obsahujúcim dipalmitoylfosfatidylcholín (DPPC) a palmitoyloleoylfosfatidylglycerol a 5 % hmotn. kyseliny palmitovej.

Účinok rSP-C surfaktantu bol taktiež porovnávaný s hovädzími surfaktantovými prípravkami Alveofact, bLES a Infasurf. Účinnosť jednotlivých surfaktantov bola stanovená na základe histopatologických zmien (napr. tvorba hyalínových membrán) a na základe zlepšenia oxygenácie, pričom zmeny boli porovnávané s kontrolnými skupinami, ktorým neboli podané žiadne prípravky. Pokusy boli uskutočnené prostredníctvom tzv. modelu akútneho pľúcneho ochorenia výplachom pľúc u samcov Sprague-Dawley potkanov s hmotnosťou 230 až 270 g, pričom boli podávané rôzne dávky 25, 50 a 100 mg fosfolipidového prípravku na kilogram hmotnosti. Bol stanovený arteriálny PaO₂ plyn v krvi prostredníctvom analyzátora krvných plynov. Okázalo sa, že len surfaktanty obsahujúce proteín vykazovali štatisticky signifikantné zvýšenie závislosti od dávky vzhľadom na zlepšenie oxygenácie. Hodnoty boli 318 ±120 mm Hg, 443 ±58 mm Hg a 480 ± 43 mm Hg (priemer ±SD) pre 3 dávky rSP-C surfaktantu a 105 ±81 mm Hg, 100 ±69 mm Hg a 131 ±108 mm Hg pre 3 dávky PL surfaktantu. Zodpovedajúce hodnoty pre Alveofact boli 104 ±81 mm Hg, 105 ±93 mm Hg a 260 ±143 mm Hg; pre bLES 373 ±138 mm Hg 441 ±88 mm Hg a 467 ±43 mm Hg; a pre Infasurf 146 ±96 mm Hg, 284 ±178 mm Hg, a 436 ±70 mm Hg. Hodnoty kyslíka kontrolných skupín ostala nízka 74 ±46 mm Hg. Všetky dávky rSP-C surfaktantu spôsobili výrazne vyššiu hodnotu PaO₂ ako zodpovedajúce dávky PL surfaktantu. Medzi rSP-C surfaktantom a bLES neboli žiadne štatisticky výrazné rozdiely pri akejkoľvek dávke, ale napríklad pri dávke 25 mg boli výrazné vyššie hodnoty PaO₂ po podaní rSP-C surfaktantu ako po podaní prípravku Alveofact alebo Infasurf. Pri dávke 50 mg boli výrazné rozdiely medzi rSP-C surfaktantom a prípravkom Alveofact, a taktiež hodnota PaO₂ po podaní prípravku Infasurf bola nižšia ako po rSP-C surfaktante.

Pri sledovaní histopatologických zmien bolo zistené, že surfaktanty s obsahom proteínu inhibovali v závislosti od dávky tvorbu hyalínových membrán v porovnaní s kontrolnými skupinami. PL surfaktant nemal účinnosť v závislosti od dávky vzhľadom na prevenciu tvorby hyalínových membrán, a stupňovanie tvorby bolo väčšie ako po podaní rSP-C surfaktantu, bLES, alebo Infasurf. PL surfaktant mal najvyššiu hodnotu (2,8; priemer) vzhľadom na tvorbu hyalínových membrán a rSP-C surfaktant najnižšiu hodnotu (0,9; priemer). rSP-C surfaktant nielenže mal preventívny účinok vzhľadom na ďalšiu exacerbáciu tvorby hyalínových membrán, ale mal aj schopnosť reverzného účinku. Taktiež infiltrácia PMN (polymorfonukleáme leukocyty) v alveolárnych priestoroch bola znížená po podaní surfaktantov s obsahom proteínov v porovnaní so surfaktantmi bez proteínov a kontrolnými skupinami.

Z výsledkov vyplýva, že surfaktant obsahujúci rSP-C je dostatočný na dosiahnutie oxygenácie porovnateľnej alebo ešte lepšej ako sa dosahuje pri hovädzích surfaktantoch, ktoré obsahujú SP-B a SP-C. Čo sa týka tvorby hyalínových membrán, rSP-C mal značne lepšie výsledky vinhibičnom pôsobení v porovnaní z ostatnými surfaktantmí s obsahom proteínov.

Na záver je možné konštatovať, že rSP-C surfaktant je aspoň taký účinný ako hovädzie surfaktanty, a teda je vhodný na účinnú liečbu pacientov s akútnym respiračným syndrómom (ARDS) a syndrómom respiračného zlyhania (RDS).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Polypeptid s aktivitou pľúcneho surfaktantu, ktorý má všeobecný vzorec (1)

8. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 4 alebo nároku 5, vyznačujúci sa tým, že obsahuje fosfolipidy.

9. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 7, v y značujúci sa tým, že obsahuje dipalmitoylfosfatidylcholín (DPPC), palmitoyloleylfosfatidylglycerol a/alebo fosfatidylglycerol.

10. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 7, v y značujúci sa tým, že obsahuje kyselinu palmitovú a elektrolyty.

11. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 9, vyzná č u j ú c i sa tým, že ako elektrolyty obsahuje vápenaté a/alebo sodné soli.

Koniec dokumentu

0 1 2 3 4 $ e 7 8 9 10 (A) Gly Ife Pro B B Pro Val His Leu Lyz 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Arg Leu Leu lle Val Val Val Val Val Val 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Leu He Val Val Val lle Val Gly Ala Leu

31 32 33 34

Leu C Gly Leu v ktorom A je H alebo Phe,

B je Phe alebo Trp a

C je íle alebo Ser.
2. Polypeptid podľa nároku 1, kde

A je H alebo Phe,

B je Phe a

C je íle.
3. Polypeptid podľa nároku 1, kde

A je Phe,

B je Phe a C je íle.
4. Polypeptid podľa nároku 1, kde

A je H,

B je Phe a

C je íle.
5. Farmaceutický prostriedok na liečbu syndrómu respiračného zlyhania (RDS) u cicavcov, vyznačujúci sa t ý m , že obsahuje polypeptid s aktivitou pľúcneho surfaktantu, podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3.
6. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 4, v y značujúci sa tým,že obsahuje najmenej jeden ďalší polypeptid s aktivitou pľúcneho surfaktantu zo skupiny SP-A a SP-B.
7. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 5, v y značujúci sa tým, že obsahuje SP-B.