HU220191B

HU220191B - SP-C tüdőfelületaktív-fehérje szintetikus peptid analógjai

Info

Publication number: HU220191B
Application number: HU9603249A
Authority: HU
Inventors: Dietrich Häfner; Uwe Krüger; Klaus Melchers; Rüdiger Nave; Klaus P. Schäfer; Ernst Sturm; Wolf-Rüdiger Ulrich
Original assignee: Byk Gulden Lomberg Chemische Fabrik Gmbh.
Priority date: 1994-05-31
Filing date: 1995-05-27
Publication date: 2001-11-28
Also published as: DK0764172T3; CA2191344C; AU2616995A; DE59510941D1; JPH10504025A; CY2552B1; WO1995032992A1; SI0764172T1; BG63210B1; ES2227548T3; CZ350296A3; NO317149B1; CZ286976B6; EE03775B1; SK282441B6; CA2191344A1; PL317420A1; KR100355626B1; DE4418936A1; PT764172E

Description

A találmány tüdőfelület-aktív polipeptidekre, előállítási eljárásukra és ezen polipeptideket tartalmazó gyógyászati készítményekre vonatkozik.

Valamennyi gerinces állat tüdeje egy „tüdőfelületaktív anyagnak” nevezett anyagkeveréket tartalmaz. Ez az anyagkeverék felületaktív tulajdonságokkal rendelkezik és a tüdő alveoláris tartományában a felületi feszültséget oly mértékben csökkenti, hogy kilégzéskor a végső légúti tartományban az összeesés elkerülhető. Ez az anyagkeverék a felületi feszültséget olyan dinamikusan szabályozza, hogy a kis alveolusoknak a nagyobb alveolusok javára, a Laplace-törvény értelmében várható összeesése a felületi feszültség megfelelő beállításával elkerülhető. Ennek eredményeként a tüdő jól kiegyensúlyozott, hisztológiailag és fiziológiailag stabil szerkezete alakul ki.

A tüdőfelület-aktív anyagokat a II. típusú alveoláris pneumociták lamelláris testecskék alakjában választják ki. Ezek foszfolipid kettős rétegekből álló, magas részarányban dipalmitoil-foszfatidil-kolint (DPPC) és foszfatidil-glicerint (PG) tartalmazó tömör egységek. A tüdőfelület-aktív fehérjékben további esszenciális komponensként az SP-A, SP-B és SP-C jelzésű fehéijék vannak jelen. Az SP-A a kiválasztás szabályozásánál döntő szerepet játszó nagy molekulájú glikoprotein.

Az SP-C és - kismértékben - az SP-B a monomolekuláris felületi film (szükebb értelemben a felületaktív anyag) képzésénél a „termodinamikai katalizátorok” szerepét átveszi. A fenti fehéijék jelenléte a szétterítési kinetikát rendkívüli módon meggyorsítja. A felületaktív anyag összetételének a felületi feszültség követelményeinek megfelelő, késlekedésmentes megváltoztatása csakis a fenti fehéijék jelenléte által válik lehetővé. Ezek a tulajdonságok a fehérjék - különösen SP-C - extrém hidrofób jellegében tükröződnek vissza.

A tüdőszövet extrakciójával vagy az állati tüdő átöblítésével felületaktívanyag-készítmények nyerhetők, amelyek fízikokémiai mérőkészülékekben, állatmodellekben, valamint klinikai felhasználás során a felületaktívanyag-hiány kiegyenlítésére képesek, és ezáltal például a gyermeklégszomj-szindróma (IRDS) kezelésére alkalmazhatók. Ezek az állati eredetű készítmények azonban rendkívül súlyos hátrányokat mutatnak.

A foszfolipidek összetétele az állatfajtól, valamint az állat egészségi állapotától és takarmányozási módjától erősen függ, és összetétele meghatározott komponensek hozzákeverésével csak korlátozottan egyenlíthető ki. A felületaktívfehéqe-tartalom és az SP-B/SP-C arány hasonlóképpen bizonytalan. További hátrány, hogy a fehérjék proteolitikus bomlástermékei vagy módosított származékai (például metionin oxidációja által) a gyógyászati felhasználásra kerülő keverékben szintén jelen vannak. A felületaktív anyag hosszabb időn át vagy nagyobb mennyiségben történő felhasználásakor (például felnőttlégszomj-szindróma, sokktüdő, ARDS)

1 2 3 4 5 6 (A) Gly lle Pro Β B Pro esetében, vagy más felhasználási területeken, mint például a tüdőben történő felhasználásnál „hordozóanyagként” más anyagok számára az anyagutánpótlás kérdése nem megoldott, nyitott kérdés.

Fentiek figyelembevételével a probléma olyan megoldására nyílik lehetőség, amelynek során a fehérjéket géntechnikai úton állítják elő. A rekombináns fehéijék - különösen bakteriális kifejezőrendszerek felhasználásával - gyakorlatilag korlátlan mennyiségben állíthatók elő és a modem elemzési módszerek, valamint minőség-ellenőrzés segítségével szintetikus foszfolipidek felhasználása esetén pontosan meghatározott összetételű felületaktív anyagok állíthatók elő. Ezek a felületaktív anyagok a gyógyászati követelményeknek megfelelően alakíthatók.

A központi részében kizárólag alifás, nagyobb hidrofób aminosavakból (például valin, leucin és izoleucin) álló humán SP-C fehérje [olyan (I) általános képletű vegyület, amelyben A jelentése H vagy Phe; B jelentése Cys és C jelentése Met] a szétterítési kinetikában különösen fontos. E központi rész hossza (12-34 aminosav) a pepiidnek a monomolekuláris foszfolipidfilmben történő integrálódását lehetővé teszi. A ProCys-Cys-Pro (3-6 helyzet) szekvenciában mindkét Cys maradék az SH-csoportokon palmitinsav által tioészterezve van. A palmitinsav tovább növeli a teljes fehérje hidrofób jellegét, egyidejűleg a cisztein két SHcsoportját zárja és ezáltal oxidációval és diszulfidhídképződéssel szemben megvédi. A központi tartomány (13-34 aminosav) transzmembránhelixet képez. Ezt a tartományt az N-végcsoporton pozitív töltésű aminosavakat (Lys, 10; Arg, 11) tartalmazó poláros szekvencia szegélyezi.

A WO 91/18015 számú nemzetközi közrebocsátási iratban rekombináns SP-C és mutánsainak előállítása került ismertetésre. Ebben a nemzetközi közrebocsátási iratban többek között a 4- és 5-helyzetben levő két ciszteinnek két szerinnel történő helyettesítését javasolták. Ennek előnye az előállítás során, hogy a nagyon hidrofób fehérje izolálása után a két cisztein költséges palmitoilezésére nincs szükség

Meglepő módon azt találtuk, hogy bizonyos SP-C mutánsok, amelyek a humán SP-C fehérjétől abban különböznek, hogy a 4- és 5-helyzetben levő két cisztein helyett fenil-alanin vagy triptofán, és a 32-helyzetü metionin helyett izoleucin, leucin vagy szerin van jelen, a természetes SP-C fehérjével szemben semmilyen íunkcióvesztést nem mutatnak, sőt jobb stabilitással rendelkeznek. A géntechnológiai előállítás lényegesen egyszerűbb, és magasabb kitermelésekkel végezhető el. Az új tüdőfelületaktívanyag-aktivitással rendelkező új polipeptidek rendkívül tiszta formában állíthatók elő.

Találmányunk tárgya valamely (I) általános képletű aminosavszekvenciát tartalmazó, tüdőfelületaktívanyagaktivitással rendelkező polipeptidek

8 9 10

His Leu Lys

HU 220 191 Β

11	12	13	14	15	16
Arg	Leu	Leu	Ile	Val	Val
21	22	23	24	25	26
Le u	Ile	Val	Val	Va 1	Ile
31	32	33	34
Leu	C	Gly	Leu

17	18	19	20
Val	Val	Val	Val	(I)
27	28	29	30
Val	Gly	Al a	Leu

(mely képletben

A jelentése H vagy Phe;

B jelentése Phe vagy Trp; és

C jelentése Ile, Leu vagy Ser).

Találmányunk előnyös kiviteli alakját képezik azok az (I) általános képletű polipeptidek, amelyekben A je- 15 lentése H vagy Phe; B jelentése Phe; és C jelentése Ile. Különösen előnyösek azok az (I) általános képletű polipeptidek, amelyekben A jelentése Η; B jelentése Phe; és C jelentése Ile.

Találmányunk tárgya továbbá gyógyászati készítmé- 20 nyék, azzal jellemezve, hogy egy vagy több találmányunk szerinti polipeptidet és kívánt esetben egy vagy több további tüdőfelület-aktív anyag hatású polipeptidként SP-A-t és/vagy SP-B-t, előnyösen SP-B-t tartalmaznak. 25

A találmányunk szerinti polipeptideket a szilárd fázisú peptidszintézis ismert módszereivel vagy gazdasejtekben megfelelő rekombináns vektorok segítségével állíthatjuk elő. A vektorok felépítésére, a sejtek transzformálására, a fehérjéknek a transzformált sejtekben történő ki- 30 fejezésére, valamint a kifejezett fehérjék izolálására és tisztítására szolgáló módszerek a szakember számára jól ismertek, például WO 86/03408, WO 87/06588 és WO 91/18015 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés.

Az SP-C bakteriális rendszerekben történő kifejezé- 35 sére alkalmas vektorok előállítását a rekombináns DNS-technológia szokásos módszereivel végezzük el.

A hidrofób SP-C fehéije baktériumokban nagyobb mennyiségben és a gazdasejt károsítása nélkül csak megfelelő fúziós fehérje formájában fejezhető ki, 40 például a kloramfenikol-acetil-transzferázzal (CAT) képezett fúziós fehérje alakjában, így például a pTrpAmpCAT152 vektor a CAT N-végcsoport tartományát klónozza és az SP-C-t kódoló DNS-fragmensek „In frame” klónozása számára egy (5’-)EcoRI- 45 és egy (3’-)PstI hasítási helyet képez. Ennek során CAT-t és SP-C-t fehérjeszinten egy hidroxil-aminérzékeny fúziós helyen (AsNÍ-Gly) keresztül egymással összekapcsoljuk. Az olyan vektorok, mint a pTrpAmpCAT152: :SPC a megfelelő fúziós fehérjék 50 szabályozott kifejezését termelési méretekig (fermentáció) lehetővé teszik. A fúziós fehéijék kifejezésének hatására a gazdasejtben inklúziós testek képződnek. Ezáltal a fehérjében a CAT rész hossza oly mértékben megváltoztatható, hogy magas SP-C részarány mellett az 55 inklúziós testek magas kitermelése érhető el.

A kifejezést baktériumokon kívül nagyszámú gazdaszervezetben (például emlős-, élesztő- és rovarsejtek) is elvégezhetjük. A különböző gazdasejteknek megfelelő DNS-eket ismert módszerekkel szintetizálhatjuk, 60 és a gazdasejtek genomjába megfelelő szabályozószekvenciákkal szokásos módon beépíthetjük.

Két DNS-oligonukleotidot a hagyományos foszfoamidit-módszerrel MilliGen/Biosearch Cyclone DNSszintetizátoron szintetizálhatunk.

Az első DNS-oligonukleotid 118 nukleotid hosszúságú érzékelő DNS-oligonukleotidot képez. Ez 5’->3’ irányban EcoRl-specifikus 5’-véget kódol a későbbi alklónozás, az Asn/Gly hidroxil-amin hasítási hely és az SP-C előtermék-szekvencia Gly-25-tel kezdődő és Leu-58-cal végződő humán SP-C számára, az (I) általános képletben levő Gly-1-nek, illetve Leu-34-nek megfelelően. Ennek során a humán SP-C fehérje ismert aminosavszekvenciáját a genetikus kód szabályainak megfelelően DNS-re fordítjuk le. Ennek során azonban a szekvenciát úgy módosítjuk, hogy az SP-C előtermék-szekvencia 28- és 29-helyzetében levő két ciszteint fenil-alaninnal vagy triptofánnal, és az előtermékfehérje-szekvencia 56-helyzetében levő metionint izoleucinnal, leucinnal vagy szerinnel helyettesítjük. A fenti módszerrel továbbá a gazdasejtek kodonfelhasználási gyakoriságát is figyelembe vehetjük. A 4- és 5helyzetben fenil-alanint és a 32-helyzetben izoleucint [a számozás az (I) általános képletnek felel meg] tartalmazó megváltoztatott SP-C-szekvencia jelölése a két aminosav szokásos egybetűs kódjának megfelelően SPC34(FF/I). Az érzékelő DNS-szál továbbá a riboszomális transzláció befejezéséhez egy TAA stopkodont, valamint egy Pstl-specifikus 3’-véget tartalmaz. A második DNS-oligonukleotid képezi a 111 nukleotidból álló komplementer, nem kódoló (nem érzékelő) szálat.

A szintetikusan előállított SP-C-DNS-fragmenst megfelelő kifejezővektorba (például pTrpAmpCAT152) klónozzuk. Ez a vektor egy amplicillinrezisztens gént tar talmazó pKK233-ból (Pharmacia) és a pBR322 egy származékából tevődik össze. A trc-promotor valamely tip-promotorral (például pTrpAmpCAT152) helyettesíthető. Más indukálható promotorok szintén felhasználhatók.

Az SP-C-fragmensek alklónozásához először a komplementer DNS-oligonukleotidokat egymással hibridizáljuk. A keletkező DNS kettős szál felülálló egyszálú végeket (EcoRI/PstI) tartalmaz.

A DNS-vektort szokásos módon építjük be a DNSvektor EcoRI/PstI emésztése, a kívánt DNS-fragmens agaróz-gélelektroforézissel, valamint az SP-C-DNS és a vektorffagmens kohéziós végeken keresztül történő hibridizálása útján végzett tisztítása után. Végül a két fragmenst ismert módszerekkel ligálás útján egymással kovalens módon összekapcsoljuk.

HU 220 191 Β

A DNS-amplifikálás és a plazmid izolálása céljából önmagukban ismert jegyzőkönyvek szerint például oly módon járhatunk el, hogy kalcium-klorid-kompetens E. coli MM294 sejteket transzformálunk, és a plazmidot hordozó sejtek szelektálásához LB agarlemezeken amplicillinnel szélesztünk. A kapott AMPrezisztens telepekből a plazmid-DNS-t izoláljuk, és megfelelő restrikciósenzim-kombinációkkal elemezzük. A várt DNS-restrikciós fragmens mintájú kiónokat kiválasztjuk. A plazmidszekvencia teljes szekventálásával igazoljuk az SPC34(FF/I)-szekvencia megfelelő beillesztését.

A kapott plazmidvektorok segítségével a

CAT:: SPC fúziós fehéije a Trp-promotor (vagy más promotorok) ellenőrzése alatt kifejezhető. A rekombináns fúziós fehéije a gazdasejtekben indukció után inklúziós testek formájában van jelen.

A CAT152: :SPC34(FF/I) fúziós fehérje szokásos egybetűs kóddal kifejezve az alábbi aminosavszekven10 ciával rendelkezik:

MEKKI	10 TGYTT	VDISQ	20 WHRKE	HFEAF	30 QSVAQ	CTYNQ	40 TVQLD	ITAFL	50 KTVKK
NKHKF	60 YPAFI	HILAR	70 LMNAH	PEFRM	80 AMKDG	ELVIW	90 DSVHP	CYTVF	100 HEQTE
TFSSL	110 WSEYH	DDFRQ	120 FLHIY	SQDVA	130 CYGEN	LAYFP	140 KGFIE	bMFFV	150 SANPE
FNGIP 1	160 FFPVH	LKRLL 10	170 IVVW	WLIV 20	180 WIVG	ALLIG 30	186 L 34

Az SP-C(FF/I) 34 aminosavát a fúziós fehérje 25 153-186 helyzetében az 1-34 helyzet aláhúzásával és megadásával jellemezzük.

A hidroxil-amin későbbi hasítása - a CAT és SP-C elválasztása céljából - az Asn-152 és Gly-153 között játszódik le (az SP-C pepiidben az 1. aminosavnak fe- 30 lel meg). Az SP-C peptid elválasztását és tisztítását a fehérjekémiában szokásos módszerekkel hajtjuk végre.

A találmányunk szerinti polipeptideket - egyenként vagy egymással képezett kombináció formájában - légúti kezeléseknek megfelelően kialakított gyógyászati ké- 35 szítményekben alkalmazhatjuk. A gyógyászati készítmények nem csupán újszülöttek és felnőttek légszomjszindrómája, hanem tüdőgyulladás és bronchitis kezelésére is alkalmazhatók. A találmányunk szerinti polipeptidek továbbá belélegzés útján adagolható gyógyszer- 40 hatóanyagok hordozójaként is alkalmazhatók.

A találmányunk szerinti gyógyászati készítmények polipeptidek mellett foszfolipideket is tartalmazhatnak. Előnyösen alkalmazhatunk a természetes tüdőfelületaktívanyag-összetételekben jelen levő foszfolipideket, 45 mint például a dipalmitoil-foszfatidil-kolint (DPPC), palmitoil-oleil-foszfatidil-glicerint (POPG) és/vagy foszfatidil-glicerint (PG). A készítmények az előnyös viszkozitás beállításához kalcium- vagy magnéziumionokat, valamint nátrium-kloridot tartalmaznak. A szakem- 50 bér a készítmény komponenseinek megválasztásánál és mennyiségük megállapításánál egyrészről a természetes felületaktív anyagok összetételét, másrészről a szakirodalomban (például EP-A 0119056 és EP-A 0406732 számú európai közrebocsátási irat) foglaltakat veszi figyelembe.

A találmányunk szerinti gyógyászati készítmények előnyösen 80-95 tömeg% foszfolipidet, 0,5-3 tömeg% polipeptidet, 4-7 tömeg% zsírsavat, előnyösen palmitinsavat és 1-3 tömeg% kalcium-kloridot tartalmaznak.

Találmányunk további részleteit az alábbi példákban ismertetjük, anélkül, hogy a találmányunkat a példákra korlátoznánk.

Előállítási példa

1. Termelőtörzs

A felhasznált E. coli 199 termelőtörzs az E. coli K12 MM294 törzsből származtatható le, amely a Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM, Braunschweig) intézetnél 5208 számon került letétbe helyezésre.

A CAT 152:: SPC34(FF/I) fúziós fehéije génjét tartalmazó pTrpAmpCAT152: :SPC34(FF/I) kifejezővektort a pBR322 DNS-szekvenciából származtattuk le; utóbbi egy ColEl-származék [E. Weber (ed.) (1988), Biologische Sicherheit, Bundesministerium für Forschung und Technologie, Bonn]. A Pharmaciatól beszerzett pKK233-2 palzmidból a Trc-promotort EcoRI/HindlII segítségével kivágjuk és szintetikus Trp-promotorral (pTrp233) helyettesítjük. Ez a promotortartományból (RNS-polimeráz kötődési helye), az operátortartományból (Trp-represszor kötődési helye), egy Shine/Dalgamo(S/D)-szekvenciából, valamint a klónozáshoz restrikciós helyekből áll. A Trp-promotor mögé a bakteriális kloramfenikol-acetil-transzferáz 5’-része 152 aminosavat kódoló gént (CAT152) illesztjük be. A CAT152-DNS-részszekvenciához valamely, a humánhoz hasonló SP-C(FF/I) 34 aminosavát kódoló szintetikus génfragmentet fuzionálunk. A funkcionális CAT:: SPC(FF/I) transzkripciós egységet a bakteriális rmB transzkripciós 55 terminátorszekvenciával (T1T2) záljuk le. A kapott szerkezet jelölése pTrpAmp-CAT152:: SPC34(FF/I).

A pTrpAmpCAT152: :SPC34(FF/I) vektor az alábbi funkciós elemeket tartalmazza:

- a Trp-promotor és T1T2 transzkripció terminátor 60 által szabályozott CAT152: :SPC34(FF/I) gén;

HU 220 191 Β

- a plazmid másolatszámát szabályozó ori-tartomány és szomszédos tartományok;

- Amp®-gén.

A plazmid bevitele után a gazdasejt a Trp-promotor által szabályozott CAT:: SPC(FF/I) gén magas másolatszámával rendelkezik. A Trp-represszort a gazdasejt maga szállítja.

Az rCAT:: SPC fermentációs kinyerését a közeg triptofánkoncentrációjával, illetve β-ΙΑΑ (beta-indolilakrilsav) hozzáadásával szabályozzuk.

2. Batch-fermentáció

Táptalajt (az összetételt az alábbiakban közöljük) rázólombikban (előtenyészet vagy indítótenyészet, 1 liter) a Working Cell Bank (glicerintenyészet) kémcsövecskéjével beoltunk és 37 °C-on, rázatás közben, erős ampicillinszelekciós nyomás alatt inkubálunk. A növekedést 578 nm optikai sűrűség mellett követjük nyomon. Amikor az 54E. coli 199 indítótenyészet 3-nál nagyobb optikai sűrűséget elért, a tenyészettel 10 literes fermentorban beoltást végzünk, és a baktériumnövekedést csökkentett ampicillinszelekciós nyomás alatt folytatjuk. Mihelyt az optikai sűrűség 5 és 6 közötti értéket elért, a 10 literes tenyészetet 100 literes fermentorba visszük át és a fenti körülmények között tovább inkubáljuk. Megfelelő növekedés után a Trp-promotor által szabályozott CAT:: SPC(FF/I) transzkripciós egységet például 40 mg/liter β-ΙΑΑ hozzáadásával indukáljuk. Az indukció után a fermentációt további 4 órán át folytatjuk.

A fermentáció alatt a fermentlében az oxigén parciális nyomását (pO₂), a pH-értéket és a hőmérsékletet online regisztráljuk és szabályozzuk. A pH-értéket nátrium-hidroxid-oldattal állandó értéken tartjuk, az oxigén parciális nyomását (pO₂) oxigénbevitellel és a keverő fordulatszámával szabályozzuk. Az 578 nm melletti optikai sűrűséget és a C-forrás koncentrációját a táptalajban off-line meghatározzuk. A habképződést habérzékelővel regisztráljuk, és szükség esetén a habképződés megakadályozása céljából habzásgátlót adunk hozzá.

A fermentlé aliquot részeit különböző időpontokban vesszük le. A baktériumok lizálása után a kifejezés ellenőrzése céljából az E. coli fehérjéket poliakrilamidgélen szétválasztjuk és megfestjük. Az E. coli összfehérjében a domináns fehérjék százalékos arányát denzitometrikusan meghatározzuk. A rekombináns gél indukciója után röviddel új domináns fehérjesáv lép fel (rCAT::SPC).

A táptalaj összetétele a következő:

Szójapepton 27,0 g/1; élesztőautolizátum KAV 14,0 g/1; nátrium-klorid 5,0 g/1; dikálium-hidrogén-foszfát-trihidrát 6,0 g/1; kálium-dihidrogén-foszfát 3,0 g/1; magnézium-szulfát-heptahidrát 0,5 g/1; glicerin (99,5%os) 30,0 g/1; habzásgátló J673 (Struktol Comp.) 0,2 ml/1; L-triptofán 80,0 mg/1; és ampicillin 20 mg/1 az 1. előtenyészet számára és 5 mg/1 a 2. előtenyészet és a 100 literes fermentor számára.

A komplex táptalaj autoklávozása és sterilezése előtt a pH-t 2 n nátrium-hidroxid-oldattal 6,8 értékre állítjuk, be. A 10 literes fermentorban levő előtenyészethez percenkénti 750 fordulat melletti kevertetést és °C-on percenkénti 10 liter levegőbevezetést alkalmazunk. A 100 literes fermentorban levő főtenyészetnél a keverési sebesség percenkénti 400 fordulat és a levegőbevitel 37 °C-on percenkénti 70 liter. Habzásgátlót a szükségletnek megfelelően egyszerű befecskendezéssel adunk hozzá.

A sejteket az indukálás után körülbelül 4 órával a fermentlétől szűréssel és/vagy centrifugálással elválasztjuk. A nedves sejtmasszát nemesfém tartályban összegyűjtjük és hűtőtérben 10 liter feltárópufferrel (pH 8,0) egy éjjelen át keverjük (16 óra, 4 °C). A kevert sejtszuszpenziót nagynyomású homogenizátorban (>700 bar) feltárjuk (szobahőmérséklet), majd steril nemesfém tartályban ismét összegyűjtjük. Az inklúziós testeket szűréssel és/vagy centrifugálással (Sorval-centrifuga RC2-B, 27 000 g) 4 °C-on azonnal összegyűjtjük, pufferben újraszuszpendáljuk (körülbelül 1 liter) és körülbelül 350 ml-es részletekben 1 literes gömblombikba visszük át, ahol körülbelül 96 órán át liofilizáljuk. Egy 100 literes fermentációból körülbelül 200 g inklúziós testeket nyerünk, amelyek fuziósfehérje-tartalma 20 tömeg%-nál nagyobb. A liofilizált inklúziós testek -20 °C-on hónapokon át tárolhatók.

3. Fúziós fehérje tisztítása és az SP-C(FF/J) lipofil peptid tisztítása

100 g szárított infúziós testeket 1,6 liter 8 mólos guanidin-hidroklorid-oldatban (917,1 g) enyhe melegítés közben oldunk. Az oldhatatlan részeket redős szűrőn leszűqük. A fúziós fehérjének az Asn-Gly kötődési helyen történő hasítása céljából az oldathoz 167 g hidroxil-ammónium-kloridot adunk, és az oldat pH-ját 2 N nátrium-hidroxid-oldattal 9,6-ra állítjuk be. A hasítóoldatot szobahőmérsékleten keverés közben 3-4 napon át állni hagyjuk. A reakcióidő végén az SP-C(FF/I)-t 6,4 liter trisz-puffer (pH 8,0) hozzáadásával kicsapjuk és centrifuga (Sorvall-centrifuga, RC2-B, 20 000 g) segítségével ismét lecsapjuk. A maradékot dekantáljuk, az SP-C pelletet 400-500 ml trisz-pufferben ismét szuszpendáljuk és a fenti körülmények mellett 30 percen át centrifugáljuk.

Az SP-C pelletet 3,5 liter sósavas kloroform/metanol elegyben (1,75 liter kloroform+1,75 liter metanol + körülbelül 30 ml 2 n sósav) felvesszük. A kapott nyers SP-C-oldatot C8 fordított fázisú anyagon végzett preparatív HPLC segítségével tovább tisztítjuk. A kloroformos/metanolos extraktumot a preparatív HPLC-oszlopra történő felvitel előtt 90%-os metanollal körülbelül 1:2 arányban hígítjuk. A kapott oldatból az oszlopra (átmérő 5 cm) körülbelül 400 mg SP-C-t (FF/I) viszünk fel (például mintegy 2 literrel hígított nyersextraktummal). Az SP-C-t (FF/I) savas körülmények között (pH 2-3) víz/izopropanol gradiens szerint eluáljuk (lásd szétválasztási körülmények). Mintegy 30 perces kromatografálás után az SP-C eluálási tartományában (UV kimutatás 220 nm mellett) 4-6, egyenként 200 ml-es frakciót gyűjtünk össze. A frakciókat analitikai HPLC segítségével vizsgáljuk, és a megfelelő frakciókat összegyűjtjük. A minták tárolása folyékony nitrogénben fagyasztva és hűtőszekrényben -80 °C-on történik. Az SP-C(FF/I)-t 98,5-99,5%-os tisztaságban kapjuk.

HU 220 191 Β

Szétválasztási körülmények:

Oszlop: Kromasil C8 100 A 16 pm

300 mm*50 mm I. D.

Eluálószer: A: HPLC-víz, millipore-berendezésből

B: izopropanol lineáris gradiens 5

C: 60 millimol/1 sósav (füstölgő sósav hí-

gításával).
Gradiens: Idő	%A	%B	%C	Átfolyás (ml/min)
0	45	50	5	100	10
10	45	50	5	100
55	45	50	5	100
65	0	95	5	100
75	45	50	5	100
85	45	50	5	100	15
90	45	50	5	0,2

4. SPC(FF/I) beépítése egy foszfolipidmátrixba

Az SPC(FF/I) lipofil peptidet izopropanolos oldatban a foszfolipidmátrix komponenseivel elegyítjük és 20 szobahőmérsékleten híg konyhasóoldatba (0,065 tömeg% nátrium-klorid) befecskendezve a foszfolipidmátrix komponenseivel homogén keverék formájában kicsapjuk. A tüdőfelületaktívanyag-szuszpenzióból az LSF-t serlegcentrifuga segítségével elválasztjuk, elekt- 25 rolitoldatban (nátrium-klorid, kalcium-klorid) újraszuszpendáljuk, és a pH-t 0,1 nátrium-hidroxid-oldattal 6,5-re állítjuk be. A kapott vizes szuszpenziót 20 literes ampullákba töltjük és liofilizáljuk. Az alábbi előállítási példában megadott tömeg- és térfogatértékek 10 g tüdőfe- 30 lületaktívanyag-készítmény előállítására vonatkoznak.

7,00 g dipalmitoil-foszfatidil-kolint (DPPC), 3,08 g palmitoil-oleil-foszfatidil-glicerin-ammóniumsót (POPGxNH₄) és 0,25 g palmitinsavat 40 °C-on 200 ml 90%-os izopropanolban oldunk, majd az oldatot szobahő- 35 mérsékletre hűtjük. A kapott foszfolipidoldatot 1 liter, HPLC-tisztításból nyert, 200 mg tisztított SPC(FF/I)-t tartalmazó oldattal egyesítjük. A kapott „beporlasztóoldat” pH-ját keverés közben hidrogén-karbonát-oldattal (körülbelül 5 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát-ol- 40 dat) 4,5-re állítjuk be.

A „beporlasztóoldatot” szobahőmérsékleten 25 ml/perc beporlasztási sebességgel erős keverés közben 9,6 liter hígított nátrium-klorid-oldatba (0,065 tömeg%) visszük be. Opaleszkáló oldat képződik, amelyből 2 órás 4-8 °C-on történő állás után a tüdőfelületaktívanyag-készítményt elektrolitoldat (3,0 g kalciumklorid-dihidrát és 61,3 g nátrium-klorid 300 ml vízben) beporlasztásával kicsapjuk. A tüdőfelületaktívanyagszuszpenziót (össztérfogat 10,8-11,0 liter) egy éjjelen át °C-on tároljuk, majd Sorvall serleges centrifugán (RC2-B) 16 000 g mellett 30 percen át centrifugáljuk. A centrifugalepényt a hozzátapadó maradék izopropanol eltávolítása céljából fele térfogat 0,65%-os konyhasóoldatban újraszuszpendáljuk és ismét centrifugáljuk. Ezt a műveletet összesen 3-4-szer megismételjük. Az utolsó centrifugálásnál nyert lepényt 400 ml 0,65%-os nátriumklorid-oldatban felvesszük, a pH-t 0,1 n nátrium-hidroxid-oldattal 6,5-re állítjuk be és 6,2 g-os részletekben 20 ml-es ampullákba töltjük. Az ampullák tartalmát a következőképpen liofilizáljuk: fagyasztás -45 °C-on, normál nyomáson, 6 órán át; fagyasztva szárítás -20 °Con, 0,16 mbar nyomáson, 54 órán keresztül; majd további intenzív szárítás -20 °C-on, 0,02 mbar nyomáson, órán át.

65-66 ampullát kapunk, amelyek 0,150-1,150 g tüdőfelület-aktív anyagot tartalmaznak (nátrium-klorid nélkül számítva).

A száraz tüdőfelületaktívanyag-mintákat -4 °C-on tároljuk, és felhasználás előtt vízben vagy fiziológiás konyhasóoldatban újraszuszpendáljuk (a szuszpenzió koncentrációja 25 mg/ml).

Az ampullák összetétele a következő:

Komponens Mennyiség (mg)

Dipalmitoil-foszfatidil-kolin	95,6
Palmitoil-oleil-foszfatidil-glicerin
(ammóniumsó)	42,1
SPC(FF/I)	2,7
Palmitinsav	6,8
Kalcium-klorid (vízmentes)	2,9

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. (I) általános képletű, tüdőfelületaktívanyag-aktivitású polipeptidek

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 (A) Gly Ile Pr o B B Pro Val ] Hi s Leu Ly s 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Arg Leu Leu Ile Val Val Val Val Val Va 1 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Leu Ile Va 1 Val Va 1 Ile Val Gly Alá Leu 31 32 33 34 Le u C Gly Leu

HU 220 191 Β (mely képletben A jelentése H vagy Phe;

B jelentése Phe vagy Trp; és C jelentése Ile, Leu vagy Ser).
2. Az 1. igénypont szerinti polipeptidek, amelyek- 5 ben A jelentése H vagy Phe; B jelentése Phe; és C jelentése Ile.
3. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, amelyekben A jelentése Phe; B jelentése Phe; és C jelentése Ile.
4. Az 1. igénypont szerinti polipeptid, amelyben A jelentése Η; B jelentése Phe; és C jelentése Ile.
5. Gyógyászati készítmény légszomj szindróma (RDS) emlősökön történő kezelésére, amely az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti felületaktívanyagaktivitású polipeptidet és adott esetben további felületaktívanyag-aktivitású polipeptidként SP-A és/vagy

SP-B tüdőfelületaktív-aktivitású polipeptidet tartalmaz.
6. Az 5. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely SP-B-t tartalmaz.
7. A 4. vagy 5. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely foszfolipidet tartalmaz.
8. A 7. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely dipalmitoil-foszfatidil-kolint (DPPC), palmitoiloleil-foszfatidil-glicerint (POPG) és/vagy foszfatidil-gli10 cerint (PG) tartalmaz.
9. A 7. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely palmitinsavat és elektrolitot tartalmaz.
10. A 9. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, amely elektrolitként kalcium- és/vagy nátriumsókat tar15 talmaz.