SK10962002A3 - Použitie FSH a/alebo jeho biologicky aktívneho analógu - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka použitia gonadotropínov na liečenie subfertilných a infertilných žien.

Doterajší stav techniky

Poruchy ovulácie sú prítomné približne u 15 až 25 % párov prichádzajúcich k lekárovi kvôli neplodnosti (Hull, Gynecol. Endocrinol. 1:235-245 (1987); Speroff a spol., Clinical Gynecologic Endocrinology and Infertility, 5. vydanie, Baltimore, Williams and Wilkins (1994)). Väčšina infertilných anovulačných pacientiek spadá do kategórie WHO skupina II (WHO Scientific Group Report (B. Lunenfeld, predseda), WHO Techn. Rep. Ser. 514:1-28 (1973)) a prevažná väčšina týchto žien má diagnózu polycystického ovariálneho syndrómu (PCOS) (Hill a spol., Gynecologic Endocrinology and Infertility, A. C. Wenta, C. M. Herbert III, G. A. Hill (vydavatelia) Baltimore, Williams and Wilkins, strany 147-160 (1988); Speroff a spol., Clinical Gynecologic Endocrinology and Infertility, 5. vydanie, Baltimore, Williams and Wilkins (1994)). U týchto pacientiek je prvou voľbou liečby antiestrogén, ako je napríklad klomiféncitrát, na indukciu ovulácie, avšak u žien s diagnózou PCOS, ktoré neovulujú (približne 20 % je rezistentných na klomifén), alebo nepočnú v dôsledku opakovaných cyklov liečby klomiféncitrátom, je alternatívnou liečbou obyčajne gonadotropínová liečba (Franks a Gilling-Smith, Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 6:136-140 (1996); The ESHRE Capri Workshop, Hum. Reprod. 11:1775-1807 (1996)). Hoci sa ukázalo, že močové gonadotropíny sú užitočné na indukovanie ovulácie u pacientiek s diagnózou PCOS (Balasch a spol., J. Assist. Reprod. Genet. 13:551-556 (1996)); Hamilton-Fairley a spol., Hum. Reprod. 6:1095-1099 (1991); White a spol., J. Clin. Endocrinol. Metab. 81:38213824 (1996), r-FSH sa dnes stal ďalším užitočným nástrojom na indukovanie ovulácie u takýchto žien vzhľadom na jeho vyššiu účinnosť (Balasch a spol. (1998) (pozri vyššie); Coelingh-Bennink a spol., Fertil. Steril. 69:19-25 (1998)).

-2Najdôležitejším princípom pri indukcii ovulácie je poskytnúť čo najlepšiu fyziologickú obnovu cyklickej funkcie vaječníkov; osobitne, cieľom by malo byť dosiahnuť ovuláciu jediného folikulu. Vývoj viacerých folikulov je komplikácia, ktorá je charakteristická pre indukciu ovulácie exogénnymi gonadotropínmi, osobitne u žien s diagnózou PCOS, ktoré sú veľmi citlivé na stimuláciu gonadotropínmi (Franks a Gilling-Smith (1996) (pozri vyššie)). V skutočnosti približne 75 % iatrogénnych multifetálnych tehotenstiev sa dá pripísať indukcii ovulácie, kým zostávajúcich 25 % je výsledkom asistovaných reprodukčných techník (Levene a spol., Br. J. Obstet. Gynecol. 99:607-613 (1992); Hecht, Assist. Reprod. Rev. 3:75-87 (1993); Evans a spol., Am. J. Obstet. Gynecol. 172:1750-1755 (1995); Corchia a spol., Am. J. Public Health 86:851-854 (1996)). PCOS je tiež hlavným rizikovým faktorom ovariálneho hyperstimulačného syndrómu (Schenker, Hum. Reprod. 8:653-659 (1993)). Liečba subfertility a infertility asistovanými reprodukčnými technikami (ART), ako je napríklad IVF a prenos embryí (embryo transfer, ET) vyžaduje stimuláciu ovárií, aby sa zvýšil počet ženských gamét, a aby sa zvýšila šanca na úspešný výsledok liečby (Healy a spol., Lancet, 1994, 343:15391544). V súčasnosti štandardný režim ovariálnej stimulácie zahŕňa fázu regulácie smerom dole, v ktorej sa endogénny luteinizačný hormón (LH) potláča podaním agonistu hormónu uvoľňujúceho gonadotropín (GnRH), po ktorej nasleduje stimulačná fáza, v ktorej sa vývoj viacerých folikulov (folikulogenéza) indukuje denným podávaním exogénneho hormónu stimulujúceho folikuly (FSH). Ďalšou alternatívou je zahájiť stimuláciu po spontánnej alebo indukovanej menštruácii a zabrániť výskytu zle načasovaného zvýšenia LH podaním antagonistu GnRH. Keď sa dosiahne adekvátny vývoj folikulov, môže sa podať jednorázová dávka močového ľudského choriového gonadotropínu (u-hCG) na napodobenie zvýšenia endogénneho LH a na vyprovokovanie dozretia oocytov (Loumaye a spol., Human Reproduction Updatei, 1995; 1:188-199).

V konvenčnej terapii sa podáva denná dávka FSH, kým sa nedosiahne zodpovedajúca odpoveď vaječníkov. Tento prístup zahŕňa predĺženú expozíciu vysokým hladinám FSH, čo môže zabrániť vyselektovaniu dominantného zrelého folikulu a môže viesť k mnohopočetnému folikulárnemu vývoju ako primárnych, tak

-3aj sekundárnych folikulov počas celej stimulácie (Salat-Baroux a spol., poslané na publikovanie r. 1998 do Human Reproduction).

Ako sa terapia vyvíjala v priebehu posledných niekoľkých rokov, pôvodná počiatočná dávka FSH v liečbe IVF sa znížila (napríklad pôvodne sa podávalo 225 lU počas prvých 5 dní, po ktorých sa dávka upravila, kým neskôr sa podávalo 150 IU počas prvých 6 dní, po ktorých došlo k úprave dávky).

Chronické podávanie malých dávok gonadotropínov je v poslednom desaťročí bežná liečba, a to v stúpajúcom režime, kedy počiatočná denná dávka FSH je 75 IU, ktorá sa postupne (o pol ampulky denne) zvyšuje na 1- až 2-týždňové intervaly s cieľom pomaly a opatrne prekonať individuálny prah FSH na spustenie vývinu folikulov (Balasch a spol., J. Assist. Reprod. Genet. 13:551-556 (1996)); Hamilton-Fairley a spol., (1991) (pozri vyššie); White a spol., (1996) (pozri vyššie); Buvat a spol., Fertil. Steril. 52:553-559 (1989); Sagle a spol., Fertil. Šteril. 55:56-60’ (1991); Shoham a spol., Fertil. Steril. 55:1051-1056 (1991); Homburg a spol., Fertil. Steril. 63:729-733 (1995)). Gonadotropínová liečba s malými, stúpajúcimi dávkami však napriek tomu môže viesť u pacientiek s diagnózou PCOS k nadmerne stimulovaným cyklom s vývinom viacerých folikulov (Herman a spol., Hum. Reprod. 8:30-34 (1993)). Najväčší súbor doteraz publikovaný výborným lekárskym tímom (Hamilton-Fairley a spol., (1991) (pozri vyššie); White a spol., (1996) (pozri vyššie) vychádzajúci z 934 liečebných cyklov ukazuje, že 20 % z nich bolo prerušených ešte pred ukončením cyklu, vo väčšine prípadov preto, lebo sa vyvinuli viac ako tri veľké folikuly. V súbore bolo 72 % ovulačných cyklov, z ktorých 77 % bolo uniovulačných. Tieto údaje vo všeobecnosti ukazujú, že ovulácia jediného dominantného folikulu sa dosiahne iba približne v 50 % zahájených liečebných cyklov gonadotropínom (Hamilton-Fairley a spol., (1991) (pozri vyššie); White a spol., (1996) (pozri vyššie)).

Na druhej strane bol publikovaný aj režim, v ktorom sa počas prvých 2 alebo 3 dní podávajú veľké dávky gonadotropínu (150 až 225 IU), aby sa napodobnila fyziologická sekrécia endogénneho FSH (Mizunuma a spol., Fertil. Steril. 55:11951196 (1991); van Santbrink a spol., Hum. Reprod. 10:1048-1053 (1995)). Potom nasleduje buď situácia podobná protokolu so stúpajúcimi dávkami (Mizunuma a spol., (1991) (pozri vyššie)) alebo progresívny pokles (každé 3 dni) dennej dávky

-4FSH až na minimum 75 IU denne, aby sa dosiahla taká podprahová dávka, aby sa zachoval iba rast dominantného folikulu (van Santbrink a spol., (1995) (pozri vyššie)). Prvá možnosť je spojená s nízkym pomerom (35 %) vývinu jediného dominantného folikulu (Mizunuma a spol., (1991) (pozri vyššie)), kým druhá voľba viedla k monofolikulárnemu vývinu v 62 % z 234 liečebných cyklov (van Santbrink a spol., (1995) (pozri vyššie), toto však vyžaduje intenzívnejšie monitorovanie (Franks a Hamilton-Fairley, Ovulation Induction: Gonadotropins. In: Adashi E.Y., Rock J.A., Rosenwaks Z. (vydavatelia), Reproductive Endocrinology, Surgery, and Technology, Lippincott-Raven, Philadelphia, strany 1207-1223 (1996)) a jej reprodukovateľnosť môže byť obtiažna hlavne kvôli dlhému biologickému polčasu prípravkov FSH (Baird, Use of gonadotropins to induce ovulation in polycystic ovary syndróme. In: Filicori M. a Flamigni C. (vydavatelia) The Ovary: Regulation, dysfunction and Treatment. Elsevier Science B.V., Amsterdam, strany 391-401 (1996)).

Vyskúšali sa aj iné režimy podávania FSH. Sharma a spol. (Hum. Reprod., 1987; 2:553-556) porovnali odpovede na denné dávky 150 IU FSH a dávky každý druhý deň oproti 300 IU FSH podávaného každý druhý deň pacientkám, ktoré boli predtým liečené s GnRH. Táto štúdia sa však robila na pomerne malom počte pacientiek, preto výsledky nemožno vyhodnotiť ako definitívne. Okrem toho táto štúdia bola robená roku 1987, kedy boli dostupné iba prípravky FSH odvodené z moču.

Nedávno Reddy a spol., (1996, Abstracts of the 12th Annual Meeting of the EHSRE) v Spojenom kráľovstve v jednej multicentrickej štúdii vyšetrili bezpečnosť a účinnosť pohodlne použiteľného režimu s klesajúcimi dávkami podávanými každý druhý deň. Podkožná stimulácia s Gonal-F® (rekombinantný ľudský FSH) sa začala počiatočnou dávkou 450 lU/deň v 1. a 3. deň s poklesom dávky v 5. deň na 300 lU/deň. S dávkami 300 IU podávanými každý druhý deň sa pokračovalo až kým sa nevyhovelo kritériám hCG. Priemerné trvanie liečby s Gonal-F® bolo 10 dní a stredná dávka bola 1800 IU (čo zodpovedalo 24 ampulám po 75 IU) a 83,7 % pacientiek dosiahlo podávanie hCG do 12. dňa. Výsledkom liečby bolo priemerne

8,6 folikulov s priemerom > 14 mm v deň podania hCG. Dospelo sa k záveru, že možno odporúčať zjednodušený režim s klesajúcimi dávkami podávanými každý

-5druhý deň, v ktorom sa kombinuje vysoké akceptovanie pacientkami a znížená spotreba gonadotropínov s takým podielom tehotenstiev, ktorý je porovnateľný s pomerom zisteným v prípade konvenčných režimov. Táto štúdia však nezahrnula kontrolnú skupinu dostávajúcu konvenčnú IVF liečbu, aby sa získali referenčné hodnoty pre vyhodnotenie údajov.

Lolis a spol. (Fertil. Steril., 1995; 63:1273-1277) ukázali, že jediná vnútrosvalová injekcia vysokej dávky FSH bolusu v ranej folikulárnej fáze zdravých žien indukovala 3-dňový vzostup sérovej koncentrácie FSH, ktorý bol postačujúci na stimulovanie vývinu viacerých folikulov. Avšak okrem dominantného folikulu ostatné folikuly neboli schopné udržať produkciu estrogénu a dospieť vo vývoji za určitú veľkosť v prítomnosti fyziologických koncentrácií FSH. V prípade, kedy sa použil silnejší stimul FSH v čase vzostupu sérovej koncentrácie FSH počas strednej a neskorej folikulárnej fázy podaním ďalších dávok FSH, sa pozoroval stály vzostup hodnôt sérového estradiolu (E₂), ako aj proporcionálny vzostup počtu preovulačných folikulov.

Hoci tieto štúdie navrhovali použitie vyšších dávok FSH podávaných vo väčších časových intervaloch, navrhlo sa, že prekročenie dennej dávky 300 IU je zbytočné (Lashen a spol., J. Assist. Reprod. and Genet., 1998, 15(7):428-443).

Je potrebné zlepšiť protokoly stimulácie ovulácie.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je použitie FSH a/alebo biologicky aktívneho analógu FSH na výrobu lieku na liečenie infertility u žien, kde počiatočná dávka liečiva je v rozmedzí 100 až 600 IU, po ktorej nasleduje druhá dávka aspoň o 3 dni neskôr v stimulačnej fáze.

Pre jednoduchosť sa ďalej pod FSH budú rozumieť aj biologicky aktívne analógy FSH.

Podľa tohto vynálezu sa stimulačná fáza používa na definovanie štádia počas asistovaného reprodukčného cyklu (obyčajne s cieľom pomôcť subfertilným alebo infertilným ženám počať), v ktorom lekár zváži indukciu folikulogenézy. Toto môže byť po dostatočnom potlačení endogénneho LH obyčajne podaním agonistu

-6GnRH, napríklad keď hladina estradiolu je 200 pmol a ultrazvukovým vyšetrením sa nepreukáže folikulárny rast a/alebo endometrium je tenké. Podobne, toto môže byť po spontánnej alebo indukovanej menštruácii podaním antagonistu GnRH, aby sa zabránilo vzostupu LH v nesprávnom čase.

Podľa tohto vynálezu infertilné ženy zahŕňajú ženy, ktoré nemôžu ovulovať, včítane tých, ktoré majú diagnózu polycystického ovariálneho syndrómu (PCOS), ako aj tých, ktoré majú normálnu ovuláciu a nemôžu počať.

Podávanie FSH podľa vynálezu môže podporiť monofolikulárny vývoj a potlačiť multifolikulárny vývoj, čím sa zníži pravdepodobnosť viacnásobných tehotenstiev. Okrem toho takéto podávanie môže viesť k vyššej frekvencii tehotenstiev. Je však potrebný nižší počet injekcii, čo je pre pacientku významnou výhodou. Injekcie si môže pacientka podávať aj sama, takže nižší počet injekcií znižuje pravdepodobnosť, že liečba bude musieť byť kvôli vynechaným injekciám zastavená. Aj v prípade, že injekcie si pacientka nepodáva sama, súčasný vynález poskytuje výhodu, že je potrebných menej návštev, a to buď pacientky na klinike, alebo lekára alebo sestry u pacientky.

V jednom uskutočnení FSH sa podáva v dávke 300 až 600 IU každý tretí deň počas prvých 6 dní stimulačnej fázy. Dávka je výhodne 400 až 500 IU, výhodnejšie 430 až 470, a najvýhodnejšie približne 450 IU. Toto uskutočnenie môže poskytnúť výsledky, ktoré sú prinajmenšom rovnaké, čo sa týka folikulárneho vývoja, ako je konvenčné podávanie 150 lU/deň, a môže skutočne viesť k vyššej frekvencii tehotenstiev. Avšak, ako to bolo uvedené vyššie, je potrebných menej injekcií (2 v porovnaní so 6 v prípade konvenčného režimu).

Podľa tohto uskutočnenia vynálezu sa FSH podáva každý tretí deň stimulačnej fázy. Je výhodné, ak sa podávanie uskutoční 1. a na 4. deň, hoci je možné FSH podávať aj na 2. a 5., alebo na 3. a 6. deň.

Po prvých 6 dňoch stimulačnej fázy FSH možno podávať v dávke, ktorú určí lekár, aby sa dosiahol adekvátny folikulárny vývoj. FSH možno napríklad podávať v dennej dávke 150 IU, ak odpoveď vaječníkov je adekvátna, alebo v dávke 225 IU, ak odpoveď nie je adekvátna. V prípade potreby tieto dávky možno zvýšiť napríklad o 75 IU FSH/deň.

-7Podľa ďalšieho uskutočnenia počiatočná dávka je 100 až 500 IU, pričom druhá dávka sa podáva výhodne o tri až šesť, výhodne o štyri dni neskôr.

Počiatočná dávka je výhodne 200 až 400 IU, výhodnejšie 250 až 350 IU, a najvýhodnejšie približne 300 IU.

Podľa tohto uskutočnenia druhá dávka môže byť 50 až 200 IU, výhodnejšie 70 až 100 IU, a najvýhodnejšie približne 75 IU. Toto uskutočnenie je osobitne účinné pri podpore monofolikulárneho vývoja a pri potláčaní multifolikulárneho vývoja. Druhá dávka sa výhodne opakuje denne počas 1 až 4 dní, výhodne 2 dní, a FSH môže byť potom podávané v dávke, ktorú určí lekár, aby sa dosiahol adekvátny folikulárny vývoj. FSH možno napríklad podávať v dennej dávke 75 IU, ak je odpoveď vaječníkov adekvátna. V prípade potreby túto dávku možno zvýšiť napríklad o 37,5 IU FSH/deň.

Podľa tohto uskutočnenia je výhodné, ak počiatočná dávka sa podá na 3. deň, hoci je možné, aby bola podaná na 1., 2. alebo 4. ,deň.

Po adekvátnom folikulárnom vývoji možno podať jednu dávku u-hCG alebo r-hCG alebo r-hLH, aby sa vyvolalo dozretie oocytov. Toto sa môže stať napríklad vtedy, keď najväčší folikul dosiahol priemer aspoň 18 mm, sú prítomné aspoň dva ďalšie folikuly s priemerom > 16 mm, a hladina E₂ je v rozsahu, ktorý je prijateľný vzhľadom na počet prítomných folikulov.

Súčasný vynález možno použiť na stimulovanie viacnásobného folikulárneho vývoja, a to výhodne pred in vitro fertilizáciou (IVF) alebo intracytoplazmatickým injikovaním spermií (ICSI), hoci sa môže uskutočniť aj pred prirodzenou fertilizáciou.

LH, FSH a hCG možno získať z prírodných zdrojov, napríklad môžu byť izolované z moču, z hypofýzy alebo z placenty, alebo ich možno získať s použitím DNA technológií (pozri WO85/01959 a Loumaye a spol., Human Reprod., 11:95107, 1996). Ich biologické aktívne analógy zahŕňajú muteíny, peptidické analógy, nepeptidické analógy a chiméry. Príklady vhodných FSH chimér sú opísané vo WOA-90/09800, WO-A-93/06844, WO-A-91/16922 a WO-A-92/22568. Je výhodné, ak sa v tomto vynáleze použije ľudský FSH.

Liečivo možno zabaliť tak, aby poskytovalo iba požadovanú dávku FSH, napríklad v nádobe na jednotkové dávky, ako je napríklad liekovka. Je však možné aj to, aby sa FSH podával dva- alebo viackrát počas dňa - samozrejme za

-8predpokladu, že celková dávka FSH podávaného počas dňa sa bude rovnať požadovanej dávke, a liečivo je podľa toho aj balené, t.j. v nádobe umožňujúcej podávať opakované dávky. Takéto rozhodnutia prijíma lekár podávajúci liečivo a budú závisieť od takých parametrov, ako je napríklad index telesnej hmotnosti (BMI) pacientky, anamnéza, odpoveď na liečbu, biologický polčas liečiva, atď.

Zlúčeniny užitočné podľa vynálezu možno formulovať na podávanie akýmkoľvek vhodným spôsobom, často v spojením s farmaceutický a/alebo veterinárne prijateľným nosičom. Je výhodné, ak zlúčeniny sú formulované na parenterálne podávanie.

Je výhodné, aby sa FSH podával podkožné, výhodne do prednej brušnej steny.

Formulácie na parenterálne podávanie sú obyčajne sterilné. Farmaceutické formulácie prispôsobené na parenterálne podávanie zahŕňajú vodné a nevodné sterilné injekčné roztoky, ktoré môžu obsahovať antioxidačné prostriedky, tlmivé roztoky, bakteriostatické prostriedky a solúty, ktoré upravia formulácie tak, aby boli izotonické s krvou predpokladaného príjemcu; vodné a nevodné sterilné suspenzie, ktoré môžu zahŕňať suspendujúce prostriedky a zahusťovacie prostriedky, sú tiež zahrnuté do súčasného vynálezu. Formulácie môžu byť k dispozícii buď v jednotkovej dávke alebo v nádobách pre opakované dávky, napríklad v zatavených ampulách a liekovkách, a môžu byť uchovávané v lyofilizovanom stave, ktorý vyžaduje iba pridanie sterilného kvapalného nosiča, napríklad vody pre injekcie, bezprostredne pred použitím. Injekčné roztoky a suspenzie podľa receptu možno pripraviť zo sterilných práškov, granúl a tabliet. Formulácie možno podávať prostredníctvom dopredu naplnenej injekčnej striekačky, autoinjektora alebo autoinjektora na viacnásobné dávky.

Ústne a iné enterálne formulácie nemusia byť sterilné a môžu byť k dispozícii vo forme jednotkovej dávky alebo vo forme viacnásobných dávok. Ústne formulácie môžu byť vo forme tuhých látok, ako sú napríklad prášky, granuly, tablety, kapsuly (napríklad kapsuly z tvrdej alebo mäkkej želatíny), čapíky, alebo vo forme tekutín, ako sú napríklad sirupy a elixíry. Plnivá a/alebo nosiče môžu byť v prípade potreby prítomné, a osoby oboznámené s problematikou farmaceutických formulácií sú schopné poskytnúť také dodatočné alebo alternatívne excipienty, jedným príkladom

-9sú dochucovadlá. Všetky formulácie určené na ústne podávanie môžu byť formulované na enterickú rezistenciu tak, aby podporili podanie liečiva do tenkého čreva s cieľom eliminovať alebo znížiť natrávenie zlúčeniny (zlúčenín) v žalúdku alebo v proximálnej časti tenkého čreva. Tablety alebo kapsuly môžu byť entericky povlečené, napríklad konvenčnými spôsobmi. Tekuté formulácie možno upraviť tak, aby boli účinne entericky rezistentné tým, že sa do nich zahrnú alebo sa spolu s nimi podajú vhodné prostriedky, ako sú napríklad triglyceridy so stredne dlhým reťazcom.

Enterálne zmesi iné ako sú ústne zmesi zahŕňajú rektálne zmesi, ktoré môžu byť vo, forme čapíkov. Čapíky všeobecne zahŕňajú základ čapíkov, ako je napríklad kakaové maslo. Osobitné formulácie obsahujúce účinnú látku (látky) môžu byť rutinne pripravené osobami, ktoré majú skúsenosti s problematikou farmaceutických formulácií.

Podľa druhého aspektu vynálezu sa poskytuje spôsob na indukovanie folikulogenézy u subfertilných alebo infertilných žien, ktorý zahŕňa podávanie FSH a/alebo biologicky aktívneho analógu v počiatočnej dávke 100 až 600 IU, po ktorej druhá dávka nasleduje aspoň o tri dni neskôr v stimulačnej fáze.

Výhodné vlastnosti každého aspektu podľa vynálezu sú po vykonaní potrebných zmien také ako u všetkých ostatných aspektov.

Všetky patentové a literárne dokumenty, na ktoré sa včelej špecifikácii odkazovalo, sú týmto referenčne zahrnuté v najväčšom možnom rozsahu, aký zákon dovoľuje.

Vynález bude ďalej opísaný v nasledujúcich nelimitujúcich príkladoch.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Nasledujúca štúdia bola urobená s cieľom (a) odhadnúť viacpočetný folikulárny vývoj po podávaní r-hFSH v časových intervaloch 3 dní počas prvých 6 dní stimulácie, po ktorom nasledovalo denné podávanie počnúc od 7. dňa, v porovnaní s denným podávaním od 1. dňa stimulácie, s použitím parametrov účinnosti ako je napríklad počet injekcií počas stimulačnej fázy, kumulatívna dávka

-10r-hFSH a trvanie liečby s r-hFSH, a (b) ukázať, že alternatívny dávkový režim vedie prinajmenšom k ekvivalentnej klinickej účinnosti, ktorá bola vyhodnotená parametrami účinnosti ako je napríklad počet folikulov > 11 mm a > 14 mm v 7. deň a y deň podania hCG, a počet nájdených oocytov.

Súhrnom, pacientky zahrnuté do štúdie boli infertilné ženy, ktoré si želali tehotenstvo a ktorým sa nepodarilo počať ani po koitoch bez ochrany trvajúcich aspoň rok a mali nárok na ART (IVF, ICSI), s podmienkou, že vyhovovali určitým kritériám vhodnosti, ktoré sú nižšie opísané podrobnejšie.

Hypofyzárna regulácia smerom dole sa dosiahla podaním agonistu GnRH pred liečbou r-hFSH. Schéma dávkovania r-hFSH medzi 1. a 6. dňom stimulačnej fázy bola opísaná vyššie. Treba si všimnúť, že všetkým pacientkám sa v 1. až 6. deň včítane podávala rovnaká celková dávka 900 IU FSH. Titrácia dávky sa vykonala na základe individuálnej reakcie vaječníkov (maximálna denná dávka 450 IU) zo 7. dňa. Od 7. dňa sa FSH podávalo denne v dávke podľa individuálnej reakcie vaječníkov, až kým sa neusúdilo, že folikulárny vývoj je adekvátny, a to na základe ultrazvukového vyšetrenia vaječníkov a stanovenia koncentrácie estradiolu (E₂) vsére. Aby sa dosiahla finálna folikulárna maturácia pred prijatím vajíčka (ovum pick up, OPU), podal sa močový ľudský choriový gonadotropín (u-hCG) v jedinej dávke 5000 IU. Kontrola účinnosti zahŕňala monitorovanie endokrinnej odpovede na r-hFSH prostredníctvom odberov krvných vzoriek na stanovenie sérových koncentrácií E₂, FSH, LH a P₄, ako aj pravidelné ultrazvukové vyšetrovanie vaječníkov počas stimulačnej fázy. Kontrola účinnosti zahŕňa celkový počet injekcií, celkovú kumulatívnu dávku a trvanie liečby. Kontrola účinnosti zahŕňa počet folikulov >11 mm a > 14 mm v 7. deň a v deň podania hCG, a počet nájdených oocytov.

Výber pacientiek

Vybralo sa 68 pacientiek, ktoré vyhoveli všetkým z nasledujúcich kritérií na účasť:

- Infertilná pacientka definovaná ako žena želajúca si tehotenstvo, ktorej sa nepodarilo počať ani po roku koitov bez ochrany. Táto infertilita sa musí dať pripísať aspoň jednému z nasledujúcich dôvodov a musí zdôvodniť liečbu IVF-ET:

- Tubálny faktor. Kritériá na účasť

- Mierna endometrióza (podľa klasifikácie Američan Fertility Society štádium I alebo II).

- Mužská infertilita (pozri podmienky nižšie)

- Neobjasnené

- Mužský partner s analýzou semena nie dávnejšie ako pred šiestimi mesiacmi s > 1,0 x 10⁶ pohyblivých spermatozoí (stupeň pohyblivosti A a B) v 1 ml v ejakuláte a frekvencia fertilizácie oocytov > 20 % počas ktoréhokoľvek predchádzajúceho pokusu o IVF. Ak pacientka týmto kritériám vyhovuje, môže sa použiť regulárna inseminácia alebo intracytoplazmatická injekcia spermií (ICSI). Ak pacientka týmto kritériám nevyhovuje, možno ju zahrnúť, ale iba ak sa použije ICSI,

- vek 18 až 38 rokov,

- tehotenstvo vylúčené pred zahájením ústnej antikoncepcie a/alebo liečbou s agonistom GnRH,

- spontánny ovulačný menštruačný cyklus 25 až 35 dní,

- sérové hladiny včasnej folikulárnej fázy (2. až 4. deň) stanovené miestnym laboratóriom v nasledovnom rozmedzí:

- FSH menej ako 10 IU/I

- LH menej ako 13,5 IU/I

-PRL menej ako 800 IU/I

- oba vaječníky prítomné,

- nie viac ako tri cykly asistovanej reprodukčnej techniky (ART) v minulosti, alebo nie viac ako tri cykly ART od posledného klinického tehotenstva,

- pacientka dostala aspoň WASH-OÚT cyklus po poslednom ART, a/alebo liečbu klomiféncitrátom alebo gonadotropínom pred prvým dňom stimulácie (S1) predchádzajúca liečba M cyklus wash-out agonista M študovaný cyklus --------------------------> -------------------> -------------------->

- bez predchádzajúcich cyklov asistovanej reprodukčnej techniky (ART) naznačujúcich nízku odpoveď na stimuláciu gonadotropínom (ktorá sa definuje ako maturácia < 2 folikulov),

- bez predchádzajúceho výskytu mierneho alebo ťažkého ovariálneho hyperstimulačného syndrómu (OHSS),

- dutina maternice bez abnormalít, ktoré by mohli zhoršiť implantáciu embrya alebo priebeh tehotenstva na základe ultrazvukového vyšetrenia (US) alebo hysteroskopie (HSC) alebo hysterosalpingografie (HSG) vykonanej nie dávnejšie ako 5 rokov pred prvým dňom stimulačného cyklu,

- bez známej alergie alebo hypersenzitivity na prípravky ľudských gonadotropínov.

- Normálny PAP ster z krčka (vykoná sa, ak ster nebol robený počas posledných 12 mesiacov), a ktoré nevyhoveli ktorémukoľvek z nasledujúcich kritérií na vylúčenie:

- akákoľvek kontraindikácia voči tehotenstvu a dokončeniu tehotenstva v plnom rozsahu,

- mimomaternicové tehotenstvo počas posledných 3 mesiacov,

- klinicky závažné systémové ochorenie,

- index telesnej hmotnosti väčší ako 30 (vypočíta sa ako telesná hmotnosť (kg) delená výškou² (m²)),

- akékoľvek medicínske stavy, ktoré môžu interferovať s absorpciou, distribúciou, metabolizmom alebo exkréciou FSH,

- abnormálne gynekologické krvácanie,

- počas posledných 5 rokov nadmerné užívanie drog, liekov alebo alkoholu.

Najviac 6 mesiacov pred zahájením regulácie smerom dole (liečba GnRHa) sa zisťovali nasledujúce parametre:

Demografické údaje: dátum narodenia, výška, hmotnosť a rasa.

Anamnéza, súčasné užívané lieky a fyzické vyšetrenie: zahŕňa krvný tlak, tep a všeobecné zdravotné informácie. Zaznamenali sa súčasné fajčiarske návyky.

Gynekologická a pôrodnícka anamnéza: Prehľad predchádzajúcej závažnej gynekologickej a pôrodníckej anamnézy včítane údajov všetkých predchádzajúcich cyklov ART.

Gynekologické vyšetrenie: Gynekologické vyšetrenie (včítane cervikálneho PAP steru, ak nebol robený za uplynulé 3 roky).

Diagnostická ultrasonografia: US vyšetrenie panvy sa uskutočnilo počas ranej folikulárnej fázy s použitím endovaginálnej sondy. Zahŕňa sa opis oboch

-13vaječníkov, dĺžka v troch rovinách, počet folikulov < 10 mm prítomných na najväčšom priereze vaječníka, veľkosť všetkých folikulov > 11 mm a veľkosť všetkých ovariálnych cýst. Zaznamenala sa veľkosť maternice (dĺžka, výška a šírka) a jej vzhľad.

Laboratórny skríning: odobrali sa 2 ml séra a poslali sa do miestneho laboratória na stanovenie koncentrácií FSH, PRL a LH ranej folikulámej fázy (2. až

4. deň spontánneho cyklu).

Analýza semena: Uskutočnila sa analýza semena mužského partnera.

Pacientky boli randomizované podľa počítačom generovaného randomizačného zoznamu do dvoch skupín. 33 pacientiek sa zaradilo do skupiny 1 (150 IU denne) a 35 pacientiek sa zaradilo do skupiny 2 (450 IU každý tretí deň).

Medikácia, podávanie a monitorovanie

Leuprorelin acetát (Uno-Enantone®, Takeda) sa použil ako agonista desenzibilizácie hypofyzárnych gonadotropných buniek. Podával sa v dávke 0,1 ml s obsahom 0,5 mg denne podkožné do stehna raz denne so začiatkom v strednej luteálnej fáze menštruačného cyklu a s ukončením v deň injekcie u-hCG. Hypofyzárna desenzibilizácia bola potvrdená ultrazvukovým vyšetrením a stanovením hladiny E₂ počas prvých 10 dní po začatí liečby. Ak vtom čase pacientka ešte nebola regulovaná smerom dole, liečba Leuprorelinom pokračovala ďalších 15 dní. V každom prípade regulácia smerom dole bola potvrdená pred začatím superovulačnej liečby.

Po potvrdení regulácie smerom dole sa začala liečba s r-hFSH (Gonal-F®, Serono). Gonal-F® sa podával buď raz denne, alebo každý tretí deň, vo forme podkožnej injekcie na bruchu. Počiatočná dávka (v deň S1) bola 150 lU/deň alebo 450 IU FSH/tretí deň počas 6 dní (včítane). V deň S7 (7 dní po začatí liečby s r-hFSH), dávky boli prispôsobené podľa odpovede vaječníkov, ktorá bola monitorovaná prostredníctvom US a sérových hladín E₂. V tomto ohľade sa v deň S1, S5, S7 a vždy počas návštevy pacientky v stredisku kvôli monitorovaniu, včítane dňa podávania u-hCG, odobrala vzorka krvi, odstredila sa a sérum (2 ml) sa použilo v miestnom laboratóriu na okamžité stanovenie E₂, P₄, LH a FSH. Vykonali sa

-14ultrazvukové vyšetrenia s použitím endovaginálnej sondy v tie isté dni ako sa stanovovali hladiny E₂. Zakaždým sa merali všetky folikuly s priemerom > 11 mm.

Gonal-F® bol dodávaný vampulách obsahujúcich 150 IU FSH, 30 mg sacharózy a fosfátového tlmivého roztoku v lyofilizovanej forme. Počet ampúl potrebných na denné dávky bol rekonštituovaný vodou na injekcie a injikovaný podkožné ihneď potom. Nasledujúca tabuľka 1 ukazuje špecifické riedenie potrebné pri príprave dávky na podanie:

Tabuľka 1

Dávka (IU)	Počet ampúl 150 IU FSH	Riedidlo (ml)	Objem injekcie (ml)
150	1	1	1
225	2	1,33	1
300	2	1	1
375	3	1,2	1
450	3	1	1

Dávka FSH bola nastavená v 7. deň liečby podľa reakcie vaječníkov. Ak odpoveď vaječníkov bola dostatočná, v oboch skupinách sa použila dávka 150 IU. Ak odpoveď vaječníkov nebola adekvátne, použila sa dávka 225 IU. Následne, ak sa dávka zvýšila, nárast bol iba o 75 IU FSH/deň v porovnaní s predchádzajúcou dávkou. Takže denné dávky boli iba 150, 225, 300, 375 a 450 IU FSH/deň.

Jediná podkožná dávka 5000 IU u-hCG (Profasi®, Serono) sa injikovala v deň po poslednom podaní r-hFSH a agonistu GnRH, keď: najväčší folikul dosiahol priemer aspoň 18 mm; boli prítomné aspoň dva ďalšie folikuly s priemerom > 16 mm; a hladina E₂ bola v prijateľnom rozmedzí na počet prítomných folikulov. Profasi® sa dodával vampulách obsahujúcich 5000 IU u-hCG a 10 mg laktózy vo forme lyofilizovaného prášku na podkožné podanie. Jedna ampula u-hCG sa rekonštituovala s 1,0 ml fyziologického roztoku na injekciu (0,9 % NaCI) a hneď potom sa injikoval objem 1,0 ml podkožné.

-15Tridsaťštyri až tridsaťosem hodín po podaní u-hCG sa počas ultrazvukového monitorovania získali oocyty buď abdominálnou alebo vaginálnou cestou. Oocyty sa potom oplodnili in vitro a embryá sa nahradili 2 až 3 dni po získaní oocytov.

Nenahradilo sa viac ako 3 embryá. Zaznamenávali sa nasledujúce informácie:

Počet oocytov: Zaznamenával sa celkový počet nájdených oocytov včítane poškodených a nezrelých.

Zrelosť jadier oocytov: Zrelosť jadier oocytov bola stanovená vždy, keď to bolo možné. Oocyty boli klasifikované ako zárodočné mechúriky (zárodočný mechúrik, alebo jadro, ľudského oocytu je viac-menej sférické, a obyčajne obsahuje jediné excentrický umiestnené jadierko. Samotný zárodočný mechúrik je v raných nezrelých oocytoch umiestnený centrálne v rámci ooplazmy a umiestňuje sa excentrickejšie tesne pred rozpadom zárodočného mechúrika), oocyty metafázy I (oocyt v štádiu metafázy I sa vyznačuje neprítomnosťou spojenia ani s prvým polárnym telieskom, ani so zárodočným mechúrikom. Pod svetelným mikroskopom typický oocyt metafázy I (intermediátny oocyt) sa vyznačuje tým že (a) nemá prvé polárne teliesko a zárodočný mechúrik; (b) má ooplazmu, ktorá je okrúhla a rovnomerná, svetlo zafarbená ale niekedy mierne zrnitá) alebo oocyty metafázy II (typický oocyt metafázy II (zrelý, predovulačný) má (a) výrazné polárne teliesko, (b) má ooplazmu, ktorá je okrúhla a rovnomerná, svetlo zafarbená a s homogénnou zrnitosťou).

Degeneratívne alebo atretické oocyty (neschopné života): Zaznamenávala sa prítomnosť degeneratívnych alebo atretických oocytov). Degeneratívne oocyty môžu byť v ktoromkoľvek z vyššie uvedených jadrových štádií. Degenerácia a atrézia sa môže vyskytnúť voocyte kedykoľvek počas maturácie vo folikule, od raných nezrelých štádií až po postmaturačné štádiá. Degenerácia u odsatých oocytov produkuje mnohé abnormálne morfologické aspekty, od tmavých a vakuolizovaných ooplaziem až po fragilitu podporných štruktúr, osobitne zóny pellucidy. Degeneratívny alebo atretický oocyt sa dá možno najľahšie rozoznať pre jeho nápadne abnormálne aspekty. Degeneratívny alebo atretický oocyt môže mať pod svetelným mikroskopom (a) akýkoľvek tvar alebo stav jadra (polárne teliesko, zárodočný mechúrik, bez polárneho telieska aj zárodočného mechúrika, alebo

-16nemožnosť ich identifikácie), (b) ooplazmu, ktorá je hnedá až čierna a s veľmi nepravidelným tvarom.

Počet inseminovaných oocytov: Zaznamenával sa počet inseminovaných oocytov.

Charakterizácia spermií a inseminácie: Zaznamenával sa typ inseminácie (regulárna alebo ICSI). V prípade regulárnej inseminácie sa zaznamenávala hustota pohyblivých spermatozoí vo fertilizačnej nádobe. V prípade inseminácie intracytoplazmatickou injekciou spermií (ICSI) sa zaznamenával zdroj spermatozoí (ejakulát, epididymis alebo semenník.

Fertilizácia a embryonálny vývoj: V 1. deň po OPU sa zisťovala fertilizácia a zaznamenával sa počet mono-, bi-, a multipronukleových vajíčok. V 2. deň po OPU sa zaznamenával počet deliacich sa embryí, počet vymenených embryí, vývinové štádium a morfológia každého embrya v čase prenosu, a dopad každého embrya (prenesené, zmrazené alebo vylúčené).

Použil sa nasledujúci systém stupňov:

Stupeň A: Tieto embryá mali rovnako veľké blastoméry takmer sférického tvaru s miernou refraktilitou (t.j. neboli príliš tmavé) a s neporušenou zónou. Musí sa brať do úvahy aj vzhľad blastomér, ktoré sa delia, alebo ktoré sa rozdelili asynchrónne s ostatnými, napríklad 3-, 5-, 6- alebo 7-bunkové embryá. Tieto môžu byť síce nerovnomerné, avšak sú úplne normálne.

Stupeň B: Tvar blastomér týchto embryí je nerovnomernejší alebo nepravidelnejší, s miernymi rozdielmi v refraktilite a nie vyššiu ako 10%-nú fragmentáciu blastomér.

Stupeň C: Fragmentácia u týchto embryí nepresahuje 50 % blastomér.

Ostávajúce blastoméry musia byť aspoň v prijateľnom stave (stupeň B) a musia mať refraktilitu, ktorá je spojená s viabilitou buniek; zóna pellucida musí byť neporušená.

Stupeň D: Blastoméry embryí vykazujú fragmentáciu vyššiu ako 50 %, niektoré z nich majú výrazne odlišnú refraktilitu. Všetky ostávajúce blastoméry by mali byť viabilné.

- 17Prírodný progesterón (Ultrogestan®: 3 x 200 mg/deň) sa podal vaginálnou cestou ako podpora luteálnej fázy, so začatím po OPU (ovum pick up). Liečba progesterónom pokračovala až po menštruáciu alebo, ak pacientka bola tehotná, počas aspoň prvých troch týždňov tehotenstva.

Tehotenstvo sa diagnostikovalo nasledovne: Ak pacientka nemala menštruáciu, odobrala sa vzorka krvi približne pätnásť dní odo dňa podania u-hCG, aby sa stanovila hladina hCG. Stanovenie hCG sa zopakovalo v 23. až 25 deň, ak jeho sérová koncentrácia bola > 10 IU/I. Vykonalo sa ultrazvukové vyšetrenie medzi 35. dňom a 42. dňom u-hCG u všetkých pacientiek, ktoré otehotneli, za predpokladu, že nedošlo k potratu. Zaznamenával sa počet fetálnych váčkov a fetálna srdcová aktivita. V tabuľke 2 sú zhrnuté výsledky získané počas liečby.

Tabuľka 2

	Tehot. test	e2	Ultrazvuk	Sérové hCG	FSH	p4	LH
Agonista GnRH	X
Medzi 10. a 25. dňom downregulácie GnRH-a		X	X
S1 (začiatok liečby r-hfSH)		X	X		X	x	X
S5		X	X		X	x	X
S7		X	x		x	x	X
Sn		X	x		x	x	X
Deň hCG		X	x		x	x	x
15. až 20 deň (ak bez menštruácie)				X
23. až 25. deň’				(X)‘
35. až 42 deň (tehotná)”			(X)
* ak prvá hodnota sérového	hCG je > 10 IU/

** ak pacientka je tehotná

Vzorky séra boli pripravené a uskladnené nasledovným spôsobom. Aby sa získali 3,5 ml séra, štandardným postupom sa odobralo aspoň 7 ml žilovej krvi

-18v cieľových intervaloch uvedených vo vyššej tabuľke. Vzorky krvi sa nechali zraziť 1 hodinu pri izbovej teplote, odstredili sa a sérum sa prenieslo do 1 alikvotnej časti 2,5 ml (v 5,0 ml vákuovej skúmavke), a do 1 alikvotnej časti 1 ml. Alikvotná časť s 2,5 ml sa použila na analýzu parametrov ihneď po príprave: rezervná vzorka 1 ml sa zmrazila pri teplote -20 °C. Zmrazenie séra sa uskutočnilo hneď ako to bolo možné po odstredení, avšak do 4 hodín po odobratí.

Vzorky FSH boli odoberané nasledovne: v stanovených intervaloch podľa vyššie uvedenej tabuľky sa odoberú 3 ml krvi a spracujú sa podľa opisu vyššie. Sérum sa rozdelilo do dvoch alikvotných častí aspoň po 500 μΙ, z ktorých jedna sa zmrazila na -20 °C a bola ako rezervná vzorka. Spôsoby stanovovania hormónov boli nasledovné:

E₂ : ACS 180 Chiron Chemiluminisent, ELISA

P4 : ACS 180 Chiron Chemiluminisent, ELISA

FSH : ACS 180 Chiron Chemiluminisent, ELISA

LH : ACS 180 Chiron Chemiluminisent, ELISA PRL : ACS 180 Chiron Chemiluminisent, ELISA

Výsledky

Výsledky štúdie sú uvedené v tabuľkách nižšie. Štatistickú analýzu uskutočnil Serono Corporate Biometrics s použitím štatistický software SAS (SAS Inštitúte, NC, USA).

Demografické údaje pacientiek v oboch skupinách boli podobné. Celková kumulatívna dávka FSH potrebná na dokončenie stimulačnej liečby je tiež vysoko porovnateľná. Avšak počet injekcií, ktoré pacientka musela dostať, aby sa u nej dosiahla adekvátna stimulácia, je štatisticky významne rozdielna (hodnota p = 0,0001). Pre skupinu, s kontrolnou liečbou priemerný počet injekcií je 10,5 (smerodajná odchýlka 2,4), kým pre skupinu s alternatívnou liečbou priemerný počet injekcií je 6,9 (smerodajná odchýlka 2,2).

Počet nájdených oocytov u pacientiek oboch liečených skupín je porovnateľná a odráža sa v porovnateľnom počte inseminovaných oocytov;

priemerný počet v kontrolnej skupine je 7,7 (smerodajná odchýlka 5,2), kým v skupine s alternatívnou dávkou priemer je 6,9 (smerodajná odchýlka 3,1). Počet

-19zmrazených embryí a živých embryí bol štatisticky významný v prospech kontrolnej skupiny (hodnota p = 0,0238 a 0,0319). Avšak sa ukázalo, že kvalita prenesených embryí mala trend viacerých embryí stupňa A v skupine s alternatívnou liečbou, hoci tento rozdiel u doposiaľ liečených pacientiek nedosiahol štatistickú významnosť.

’ I

Frekvencia implantácií však dosahuje štatisticky významný rozdiel v prospech skupiny s alternatívnou liečbou (hodnota p = 0,0561) s priemernou frekvenciou implantácií 18 % v tejto skupine v porovnaní s priemernou frekvenciou implantácií 5 % v kontrolnej skupine.

Okrem toho, čo je klinicky najrelevantnejšie, (pozri tabuľku 5 - Biochemické a klinické tehotenstvá), rozdiel v počte biochemických tehotenstiev je vysoko štatisticky významný (hodnota p = 0,0038) v prospech skupiny s alternatívnou liečbou: priemerný počet biochemických tehotenstiev je 39,4 % v porovnaní s 8,6 % v skupine s kontrolnou liečbou. Toto viedlo opäť k takej klinickej frekvencii tehotenstva, ktorá bola štatisticky významná (hodnota p = 0,0105), v prospech pacientiek v skupine s alternatívnou liečbou: priemerná frekvencia klinických tehotenstiev bola 30,3 % v skupine s alternatívnou liečbou v porovnaní s 5,7 % v kontrolnej skupine. Tieto údaje silne naznačujú, že profil sérového FSH dosiahnutý s novým režimom vedie k lepšej kvalite a k väčšiemu počtu oocytov.

Tabuľka 3 - Súhrnná štatistika

-21 Tabuľka 4 - Rozdelenie prenesených embryí podľa stupňov

	Randomizovaná liečba
	150 IU	450 IU
Embryá podľa stupňov*	N	%	N	%
Počet embryí stupňa A	8	13,3%	19	26,8 %
Počet embryí stupňa B	38	63,3 %	39	54,9 %
Počet embryí stupňa C	14	23,3%	13	18,3%
Celkom	60	100,0%	71 ·	100,0%

* Embryá stupňa D neboli

Tabuľka 5 - Biochemické a klinické tehotenstvá

•	Randomizovaná liečba
15C	IU	45C	IU
Biochemické tehotenstvo	N	%	N	%	Hodnota p*
Áno	3	8,6 %	13	39,4 %	0,0038
Nie	32	91,4%	20	60,6 %
Celkom	35	100,0%	33	100,0%

	Randomizovaná liečba
150 IU	45C	IU
Klinické tehotenstvo	N	%	N	%	Hodnota p*
Áno Nie	2 33	5,7 % 94,3 %	10 23	30,3 % 69,7 %	0,0105
Celkom	35	100,0%	33	100,0%

* Hodnota p podľa Fisherovho exaktného textu

-22Tabuľka 6 - Súhrnná štatistika

	Gonal-F 450 každý tretí deň počas 6 dn	(včítane)
Premenná	N	Chýba	Priemer	SD	Min.	Max.
Vek (roky)	33	0	31,1	3,4-	23	38
Trvanie infertility (mesiace)	32	1	47,0	29,0	13	125
Počet predchádzajúcich ART	33	0	0,7	0,9	0	3
Kumulatívna dávka FSH (IU)	33	0	1743,2	538,3	1050	3675
Počet injekciíj-' ,·- ’ k,	33 '	Ό*.. x?	6,9*·??	2,2, ·	3 x-·	13
Počet folikulov > 14 mm	33	0	9,0	2,5	5	14
Klinické tehotenstvo? ‘ , -- ./	n = 10 (30,2 %)		' T 1' h X’ Z‘f 1 »· í- .

Tabuľka 7 - Súhrnná štatistika

	Randomizovaná liečba
150 IU	450 IU
Premenná	N	Priemer	SD	Min.	Max.	N	Priemer	SD	Min.	Max	Hodnota p*
Vek (roky)	35	31,5	4,8	20	39	33	31,1	3,4	23	38	0,7169
Trvanie infertility (mesiace)	32	50,0	33,2	12	120	32	47,0	29,0	13	125	0,7016
Počet predchádzajúcich ART	35	0,8	1,0	0	3	33	0,7	0,9	0	3	0,5629
Kumulatívna dávka FSH (IU)	35	1748,6	630,9	900	3675	33	1743,2	538,3	1050	3675	0,9700
Počét injekcií	35	10,5 X	2,4 '	6	17 ????	.33,	6,9 -	2,2 M	3	13	0,0001 ·.?:
Počet folikulov > 14 mm	35	10,1	4,0	4	21	33	9,0	2,5	5	14	0,1881
Klinické tehotenstvo - x	n = 2(5,7%)			??'X?·.	ň = 10 (30,3%)	0,0105

‘Hodnoty p z ANOVA “Hodnoty p z Fisherovho exaktného testu

Z výsledkov bude zrejmé, že injekcia 450 IU FSH každý tretí deň vedie k výsledkom, ktoré sú prinajmenšom rovnaké, čo sa týka vývoja folikulov, a môže· viesť k vyššej frekvencii tehotenstiev, avšak pri menšom počte injekcií.

Príklad 2

Nasledujúci príklad porovnáva výkon vaječníkov a hladiny hormónov po stimulácii vaječníkov u pacientiek s polycystickým ovariálnym syndrómom (PCOS) s použitím rekômbinantného folikuly stimulujúceho hormónu (r-FSH) v dvoch následných cykloch podľa dvoch rôznych režimov s nízkymi dávkami gonadotropínov, podľa klasického chronického protokolu so zvyšujúcimi sa (step-up)

-23dávkami a podľa modifikovaného protokolu so znižujúcimi sa (step-down) dávkami.

Tento druhý protokol sa používa aj u normálne ovulujúcich žien s prvým cyklom vnútromaternicovej inseminácie.

I

Materiály a metodiky

Do štúdie sa zaradilo 30 primáme infertilných žien. Z nich 10 (skupina 1) mali diagnózu PCOS a boli študované v 20 liečebných cykloch. Priemerný vek (± stredná chyba priemeru) pacientiek bol 31,8 ± 1,2 rokov a priemerné trvanie ich infertility bol

4,1 ±1,5 rokov. Lekára navštívili s oligomenoreou alebo amenoreou, priemerný bazálny pomer LH/FSH bol 2,8 ± 0,35 a priemerné bazálne hladiny androstenediónu a voľného testosterónu mali 305 ± 36 ng/dl (normálne hodnoty sú 60 až 200 ng/dl) a 7,76 ± 3,81 % (normálne hodnoty sú 0,3 až 3,8 %). Priemerný index telesnej hmotnosti mali 26,4 ± 1,6 a vaječníky všetkých pacientiek mali podľa ultrasonografického vyšetrenia vzhľad ako polycystické vaječníky (Adams a spol., Br. Med. J. 293: 355-359 (1986)). Aktivita endogénneho estrogénu bola u týchto pacientiek dokázaná priemernými hladinami estradiolu na úrovni 93,7 ± 10,1 pg/ml a pozitívnou reakciou na progestínový test (normálne vynechanie krvácania po liečbe ústnym medroxyprogesterón acetátom, 10 mg denne počas 5 dní) u každej z nich. Pred indukciou Ovulácie sa u týchto pacientiek zisťovali parametre semena zdravého mužského partnera, normálny hysterosalpingogram alebo laparoskopia, a neprítomnosť predchádzajúceho chirurgického zákroku v oblasti panvy a/alebo zápalového ochorenia v oblasti panvy. Všetky pacientky buď nemohli ovulovať po liečbe klomiféncitrátom alebo nepočali po najmenej troch ovulačných cykloch s touto liečbou pri dávke < 200 mg/deň počas 5 dní.

Pacientky s PCOS boli liečené podkožné s r-FSH (Gonal-F, Serono S.A.,

Madrid, Španielsko) podľa štandardného protokolu s nízkymi dávkami, ktorú publikovali Balasch a spol. (J. Assist. Reprod. Genet. 13:551-556 (1996)) v prvom študovanom liečebnom cykle a potom modifikovaným režimom s klesajúcimi dávkami v druhom cykle s gonadotropínom. Časový interval medzi liečebnými cyklami u každej ženy bol 1 až 3 mesiace, liečba s r-FSH sa začala na 3. deň spontánneho cykly alebo indukovaného krvácania z maternice. Nakoľko cieľom na

-24porovnanie bola odozva maternice a hladiny hormónov, avšak nie tehotenstvo, do súčasnej štúdie bolo zaradených 10 po sebe idúcich pacientiek s diagnózou PCOS, ktoré v prvom cykle liečby neotehotneli.

Chronický režim s nízkou stúpajúcou dávkou pozostával z podávania počiatočnej dávky 75 IU r-FSH denne a dávka v prípade potreby bola zvyšovaná o 37,5 IU. Prvý vzostup v dennej dávke sa uskutočnila po 14 dňoch liečby iba vtedy, ak po ultrazvukovom vyšetrení (t.j. žiadne folikuly s priemerom > 10 mm) sa u vaječníkov nezistila nijaká odozva. V prípade potreby sa dávky upravili po ďalších 7 dňoch. Tento postupný vzostup pokračoval dovtedy, kým sa ultrazvukovým vyšetrením nezistila aktivita vaječníkov; potom sa pokračovalo s rovnakou dávkou (t.j. s prahovou dávkou) až kým folikul nedosiahol priemer > 17 mm.

V modifikovanom protokole s klesajúcou dávkou pacientky dostávali 4 ampuly (300 IU) r-FSH na 3. deň cyklu a počas ďalších 3 dní sa nepodávala nijaká liečba (4. až 6. deň cyklu). Liečba s r-FSH sa opäť začala na 7. deň cyklu podaním 1 ampuly r-FSH denne po náležitom ultrazvukovom vyšetrení vaječníkov. Táto dávka sa udržiavala až po 9. deň cyklu (t.j. 1 týždeň od začatia liečby) a protokol bol potom presne taký istý ako bol protokol v režime s nízkymi stúpajúcimi dávkami. Každá žena bola takto v štúdii na odpoveď vaječníkov a hladín hormónov svojou vlastnou kontrolou. Použitie rovnakého liečebného protokolu aplikovaného na rôzne gonadotropínové liečivá u tej istej pacientky ako to publikovali Balasch a spol., Hum. Reprod. 10:1678-1683 (1995); Balasch a spol., J. Assist. Reprod. Genet. 15:552559 (1998); Couzinet a spol., J. Clin. Endocrinol. Metab. 66:552-556 (1988); Shoham a spol., Fertil. Steril. 56:1048-1053 (1991) sa zdá byť najvhodnejším študijným plánom v prípade, ak cieľom na porovnanie je odpoveď vaječníkov a hladiny hormónov, avšak nie tehotenstvo.

Modifikovaný protokol s klesajúcimi dávkami bol testovaný aj u 20 normálne ovulačné infertilných žien (skupina 2), u ktorých bola morfológia vaječníkov po vyšetrení vaginálnou ultrasonografiou normálna. Zúčastnili sa prvého vnútromaternicového inseminačného cyklu v súvislosti s ovariálnou gonadotropínovou liečbou kvôli nevysvetlenej infertilite alebo mužskej subfertilite potom, ako bola hysterosalpinogramom alebo laparoskopicky stanovená diagnóza patentových túb.

-25Priememý vek pacientiek v skupine 2 bol 32,9 ± 2,0 rokov, a infertilita u nich trvala priemerne 5,3 ± 1,2 rokov.

Odpoveď vaječníkov v oboch skupinách pacientiek bola monitorovaná vaginálnym ultrazvukovým skenovaním a stanovovaním hladín estradiolu. Okrem toho sa pre túto štúdiu retrospektívne stanovovali sérové hladiny progesterónu v strednej luteálnej fáze (7 dní po injekcii HCG) vo všetkých liečebných cykloch u pacientiek skupiny 1. Toto sa uskutočnilo s použitím zmrazených vzoriek séra skladovaných pri -20 °C, ktoré sa vyšetrili naraz. Hormóny sa stanovovali s použitím komerčne dostupných súprav podľa vyššie uvedených spôsobov (Balasch a spol., Hum. Reprod. 11:2591-2594 (1996)). Koncentrácie estradiolu a progesterónu v sére boli stanovené priamym rádioimunoesejom (estradiol: bioMériéux, Marcy ľEtoile, Francúzsko; progesterón: Immunotech International, Marseille, Francúzsko). U estradiolu vnútrotestové a medzitestové variačné koeficienty boli < 4,5 % a < 5,5 % a u progesterónu vnútrotestový variačný koeficient bol 6,5 %.

Vykonalo sa sériové ultrazvukové skenovanie, aby sa stanovil folikulárny rast a prípadné zmeny priemeru vaječníkov. Podalo sa 10 000 IU hCG (Profasi; Serono

S.A.) vnútrosvalovo na indukovanie ovulácie, ak hlavný folikul dosiahol priemer > 17 mm. Ultrasonické vyšetrenie na vykonalo s použitím 5 mHz vaginálneho transduktora napojeného na sektorový skener Aloka (model SSD-620, Aloka, Tokio).

Údaje sa analyzovali štatistickým softwarom SPSS s použitím Wicoxonovho párového testu a testu χ². Výsledky sú vyjadrené ako priemery so strednou chybou priemeru SE.

Výsledky

Všetky gonadotropínmi liečené cykly zahrnuté do tejto štúdie boli ovulačné podľa ultrasonografických údajov, záznamov bazálnej telesnej teploty, dĺžky luteálnej fázy, a u pacientiek skupiny 1 aj podľa sérovej koncentrácie progesterónu v strednej luteálnej fáze > 10 ng/ml.

Medzi pacientkami s diagnózou PCOS (skupina 1) bola jedna s pokračujúcim tehotenstvom a jedna pacientka so spontánnym potratom v prvom trimestri, ktoré dostávali modifikovanú liečbu s klesajúcimi dávkami. Kontrolné výsledky dvoch

-26modalít s liečbou r-FSH v tejto skupine žien sú zhrnuté v tabuľke I a II. Celkové množstvo FSH, ktoré sa použilo na indukciu ovulácie u pacientiek s diagnózou PCOS bolo vyššie s použitím spôsobu s klesajúcimi dávkami, napriek tomu, že priemerné trvanie liečby a aj prahová dávka boli u oboch spôsobov podobné. Frekvencia multifolikulárnych cyklov (t.j. hlavný folikul > 17 mm a dva alebo viaceré sekundárne folikuly) však boli významne vyššie v protokole so stúpajúcimi dávkami, kým unifolikulárne cykly (t.j. iba jeden folikul vyvinutý do priemeru >17 mm) sa získali až u 80 % liečebných cyklov s použitím spôsobu s klesajúcimi dávkami (tabuľka I). Údaje dynamiky folikulov a hladín estradiolu počas liečby s r-FSH v oboch študovaných skupinách sú uvedené v tabuľke II. Selektívne vyhľadávanie oocytov sa uskutočnilo y dvoch multifolikulárnych cykloch pred injekciou HCG u tejto druhej skupiny. Získali sa štyri a tri oocyty (z nich 5 bolo nezrelých), ävšäk poľa preferencií daných párov sa nepokúsilo o in vitro fertilizáciu.

V súlade s finálnym folikulárnym vývojom boli sérové hladiny estradiolu v deň injekcie HCG o 71 % vyššie v protokole so stúpajúcimi dávkami (rozdiel ukazoval trend k štatistickej významnosti, p = 0,1), avšak hladina sérového progesterónu v strednej luteálnej fáze bola významne (p < 0,05) vyššia (tabuľka I).

U pacientiek v skupine 2, ktoré vo vnútromaternicových inseminačných cykloch dostávali gonadotropínovú stimuláciu vaječníkov, počet dní gonadotropínovej liečby a počet použitých ampúl r-FSH bol 6,1 ± 1,2 a 9,0 ± 1,4. Denná efektívna (prahová) dávka bola 75 IU (1 ampula) na každý liečebný cyklus. Až 15/20 (75 %) liečebných cyklov boli unifolikulárne, kým sekundárny folikul sprevádzajúci hlavný folikul v deň injekcie HCG sa pozoroval v ostávajúcich 5 prípadoch (25 % bifolikulámych cyklov), avšak nezískal sa nijaký multifolikulárny vývoj. Priemerné sérové hladiny estradiolu na 4. deň liečby a v deň injekcie HCG boli 89,8 ± 14,7 pg/ml a 271 ± 29,7 pg/ml. Vyskytli sa tri pokračujúce tehotenstvá (> 14 týždňov tehotenstva) medzi 20 liečebnými cyklami, dve z nich sa vyskytli počas unifolikulárnych cyklov.

-27Tabuľka I

Parameter	Stúpajúce dávky	Klesajúce dávky	P
Počet liečebných cyklov	10	10
Potrebné r-FSH
Počet dní liečby	15,7 ±2,0	14,6 ±2,0	NS
Počet ampúl	16,6 ±2,8	19,1 ±2,2	<0,05
IU	1245 ±217	1436±167	<0,05
Prahová dávka	87,5 ±8,8	86,2 ± 8	NS
Folikulárny vývoj v deň injekcie HCG
Unifolikulárne cykly (%)	60	80	<0,05
Bifolikulárne cykly (%)	0	20^	<0,05
Multifolikulárne cykly (%)	' 40	0	<0,05
Estradiol v deň injekcie HCG (pg/ml)	474 ± 90	277 ± 38	NS
Progesterón strednej luteálnej fázy (pg/ml)	19,2 ±2,1	16,4 ± 1,9	<0,05

Hodnoty znamenajú priemer ± stredná chyba priemeru SE

NS = štatisticky nevýznamný ^a) V dvoch cykloch bol iba jeden sekundárny folikul s priemerom 14 a 15 mm.

Tabuľka II

Parameter	Dni liečby	Stúpajúce dávky	Klesajúce dávky	P
Rastúce folikuly (> 11 mm)	4	-	0	-
	8	1,1 ±0,2	0,2 ±0,1	<0,05
Estradiol (pg/ml)	4	-	58,7 ±8,9	-
	8	106,7 ±30,2	69,1 ±8,8	<0,01

Hodnoty znamenajú priemery ± stredná chyba priemeru SE

-28Diskusia

Súčasný príklad ukazuje výrazne vysokú incidenciu (80 %) monofolikulárnych cyklov, 100 % incidenciu mono- alebo bifolikulárnych cyklov, a neprítomnosť multifolikulárneho vývoja. Toto spolu s nízkymi sérovými hladinami estradiolu v deň injekcie HCG naznačuje zníženú pravdepodobnosť mnohopočetných tehotenstiev a hyperstimulácie vaječníkov.

Randomizovaná štúdia, ktorá porovnávala režimy s nízkymi stúpajúcimi dávkami (18 pacientiek) a klesajúcimi dávkami (17 pacientiek) ukázali 56 % a 88 % monofolikulárnych cyklov v prvom a v druhom liečebnom pláne (van Sanbrink a Fauser, J. Clin. Endocrinol. Metab. 82:3597-3602 (1997)). Bola to randomizovaná štúdia, v ktorej pacientky s predpokladanou rovnakou endokrinologickou abnormalitou dostávali náhodne jeden z dvoch liečebných modalít. PCOS je však heterogénny stav s rozdielnymi endokrinnými vlastnosťami. Prah FSH je u každej pacientky iný, čo naznačuje rozdielne abnormality (Fauser a spol., Endocr. Rev. 18:71-106 (1997); Baird (1996) (pozri vyššie)). Preto, ako to bolo diskutované vyššie, použitie rovnakého gonadotropínového liečiva aplikovaného v rôznych liečebných protokoloch u toho istého pacienta sa zdá byť vhodnejším študijným plánom, ak cieľom na porovnanie je odozva vaječníkov a hladiny hormónov a nie tehotenstvo. V súčasnom príklade každá žena má vlastnú kontrolu ovariálnej aktivity a hormonálnych zmien. Použitie každej ženy ako vlastnej kontroly vylučuje akýkoľvek prenosný účinok z predchádzajúceho cyklu, ktorý by mohol ovplyvňovať tieto výsledky, pretože každá pacientka s diagnózou PCOS dostala najprv režim so stúpajúcimi dávkami. Okrem toho, časový interval medzi liečebnými cyklami u každej ženy bol 1 až 3 mesiace.

V štúdiu van Santbrinka a Fausera (van Santbrink a Fauser (1997) (pozri vyššie)), po podaní konvenčnej počiatočnej dávky gonadotropínu sa začalo postupné znižovanie dávky. V súčasnom príklade sa však využilo obdobie doznievania. Doznievanie je vhodné, pretože polčas r-FSH je približne 36 h (Le Cotonnec a spol. (1994) (pozri vyššie); Le Cotonnec a spol., Fertil. Steril. 61:669678 (1994)). Bolo navrhnuté, že doznievanie môže zachrániť cykly náchylné na vznik ovariálnej hyperstimulácie, čiže ukazuje, že výrazný pokles koncentrácií sérového FSH zabraňuje ďalšiemu vývoju stredne veľkých folikulov, kým veľké

-29folikuly pokračujú v dozrievaní (van Santbrink a spol. (1995) (pozri vyššie)). Je však známe aj to, že počas doznievania sa môže vyskytnúť náhly pokles koncentrácie estradiolu, ktorý vedie k zastaveniu cyklu (Sher a spol., Hum. Reprod. 10:3107-3109 (1995); Aboulghar a spol., Hum. Reprod. 13 (Abstrakty 1):243-244 (1998)). Tpto sa

I I pozorovalo ako pri indukcii ovulácie u anovulačných žien, tak aj počas kontrolovanej ovariálnej hyperstimulácie. Preto aby sa predišlo zastaveniu, v súčasnom príklade sa použila vysoká počiatočná dávka, aby sa napodobnil prirodzený cyklus a podporil sa folikulárny vývoj, po ktorej neskôr v prípade potreby nasledovali malé postupné prírastky, ktoré môžu byť dôležité pre determináciu folikulárnej maturácie (Franks a Hamilton-Fairley (1996) (pozri vyššie)).

Prevažná väčšina žien dostávajúcich liečbu vnútromaternicovej inseminácie ovuluje a bolo zdôraznené, že intenzita protokolov stimulácie vaječníkov použitých na superovuláciu počas cyklov vnútromaternicovej inseminácie súvisí s frekvenciou mnohopočetných tehotenstiev (te Velde a Cohlen, N. Engl. J. Med. 340:224-226 (1999)). Režimy miernej stimulácie vaječníkov gonadotropínmi, ktoré môžu dosiahnuť prijateľnú úspešnosť avšak nízky podiel dvojčiat a nijaké tehotenstvá vyššieho rádu (Balasch a spol., Hum. Reprod. 9:1863-1866 (1994); Cohlen a spol., Hum. Reprod. 13:1553-1558 (1998)), sú obhajované (te Velde a Cohlen (1999) (pozri vyššie)). Režim s klesajúcimi dávkami aplikovaný normálne ovulujúcim ženám podľa vynálezu znamená v tomto ohľade nový prístup. 100%-ná frekvencia monofolikulárnych/bifolikulárnych cyklov získaných u žien skupiny 2 poskytuje ďalší dôkaz na podporu užitočnosti tohto prístupu, keď multifolikulárny vývoj nie je v indukcii ovulácie žiadúci.

Fyziologický prístup s klesajúcimi dávkami k indukcii ovulácie u pacientiek s diagnózou PCOS môže byť vhodnejší na dosiahnutie monofolikulárnych cyklov ako prístup só stúpajúcimi dávkami. Zdá sa tiež, že tento modifikovaný prístup je užitočný pri dosiahnutí unifolikulárneho vývoja u normálne ovulujúcich žien, ktoré dostávajú stimuláciu vaječníkov v cykloch vnútromaternicovej inseminácie.

Claims (19)

1. Použitie FSH a/alebo jeho biologicky aktívneho analógu na výrobu lieku na liečenie infertility u žien, pričom počiatočná dávka liečiva je medzi 100 až 600 IU, po ktorej nasleduje druhá dávka aspoň o 3 dni neskôr v stimulačnej fáze.

2. Použitie podľa nároku 1, kde dávka liečiva je medzi 300 až 600 IU každý tretí deň počas prvých 6 dní stimulačnej fázy.

3. Použitie podľa nároku 2, kde dávka je medzi 400 až 500 IU.

4. Použitie podľa nároku 3, kde dávka je medzi 430 až 470 IU.

5. Použitie podľa nároku 4, kde dávka je približne 450 IU.

6. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 5, kde liečivo sa podáva v 1.

a 4. deň, v 2. a 5. deň, alebo v 3. a 6. deň stimulačnej fázy.

7. Použitie podľa nároku 1, kde počiatočná dávka je medzi 100 až 500IU.

8. Použitie podľa nároku 7, kde počiatočná dávka je medzi 200 až 400IU.

9. Použitie podľa nároku 8, kde počiatočná dávka je medzi 200 až 400IU.

10. Použitie podľa nároku 9, kde počiatočná dávka je približne 300 IU.

11. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 7 až 10, kde druhá dávka sa podáva tri až šesť dní po počiatočnej dávke.

12. Použitie podľa nároku 11, kde druhá dávka sa podáva štyri dni po počiatočnej dávke.

13. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 7 až 9, kde druhá dávka je medzi 50 až 200 IU.

14. Použitie podľa nároku 13, kde druhá dávka je medzi 70 až 100 IU.

15. Použitie podľa nároku 14, kde druhá dávka je približne 75 IU.

16. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 7 až 15, kde druhá dávka sa opakuje denne 1 až 4 dni, výhodne 2 dni.

17. Použitie podľa ktoréhokoľvek z nárokov 7 až 16, kde počiatočná dávka sa podáva v 1., 2., 4. alebo výhodne v 3. deň stimulačnej fázy.

18. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde FSH je rekombinantné FSH (r-FSH).

19. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde FSH je ľudský FSH (hFSH).