BG106943A

BG106943A - Използване на fsh за лечение на стерилитет

Info

Publication number: BG106943A
Application number: BG106943A
Authority: BG
Inventors: Louise DUERR-MYERS; Ernest Loumaye
Original assignee: Applied Research Systems Ars Holding N.V.
Priority date: 2000-01-27
Filing date: 2002-07-23
Publication date: 2003-02-28
Also published as: NO20023354L; JP2003520823A; HUP0204324A3; BG65915B1; IL150837A0; JP5170928B2; US20030158106A1; NO20023354D0; DE60103503D1; ES2217113T5; HRP20020630A2; WO2001054715A1; HUP0204324A2; KR20020081273A; CZ20022555A3; CN1418107A; SI1250148T2; DE60103503T2; TR200401810T4; KR100871499B1

Abstract

Изобретението се отнася до използване на FSH и/или биологично активен негов аналог за лечение на стерилитет при жени. Лекарственият препарат се прилага с първоначална доза от 100 до 600 IU, последвано от втора доза поне три дена по-късно във фазата на стимулиране. В един вариант лекарственият препарат се прилага с доза от 300 до 600 IU на всеки трети ден от първите 6 дена от фазата на стимулиране. В друг вариант първоначалната доза е в обхвата от 100 до 500 IU с втора доза, която се прилага между третия и шестия, за предпочитане четвъртия ден след първоначалната доза.

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Настоящото изобретение се отнася до използване на гонадотрофини за лечение на жени е понижена оплодителна способност и стерилни жени.

ф ПРЕДШЕСТВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Нарушена овулация имат приблизително 15-25 % от двойките на които се прави оценка за стерилност (Hull, Gynecol. Endocrinol., 1:235-245 (1987); Speroff et al., Clinical Gynecologic Endocrinology and Infertility, 5^th Edition, Baltimore, Williams and Wilkins (1994)). Повечето пациенти страдащи от стерилитет поради липса на овулация, спадат към категорията WHO група II (WHO Scientific Group Report (B Lunenfeld, Chairman), WHO Techn. Rep; Ser., 514:1-28 (1973)) и по-голяма част от тези жени са с диагноза поликистозен овариален синдром (PCOS) (Hill et al., In Gynecologic Endocrinology and Infertility, AC Wenta, CM Herbert III, GA Hill (eds.) Baltimore, Williams and Wilkins, pp 147160 (1988); Speroff et al., Clinical Gynecologic Endocrinology and Infertility, 5^th Edition, Baltimore, Williams and Wilkins (1994)). При тези пациенти като първи подход за лечение за индуцирана овулация е анти-оестроген, като кломифен цитрат, но при жени с PCOS, при които липсва овулация (около 20 % са неподатливи на кломифен) или не забременяват при повторна терапия с кломифен цитрат, алтернативният метод за лечение обикновено е чрез терапия е гонадотропин (Franks and Gilling-Smith; Curr. Opin. Obstet. Gynecol., 6:136-140 (1996); The ESHRE Capri Workshop, Hum. Reprod., 11:1775-1807 (1996)). Въпреки доказателството, че гонадотропините от урината са полезни за индуциране на овулация при пациенти с PCOS (Balasch et al., J. Assist Reprod. Genet., 13:551-556 (1996)); Hamilton-Fairley et al., Hum. Reprod., 6:1095-1099 (1991); White et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 81:3821-3824 (1996)), днес r-FSH e следващият полезен лекарствен препарат, за индуциране на ф овулация при такива жени, поради високата му ефективност (Balasch et al., (1998) (supra); Coelingh-Bennink et al., Fertil. Steril., 69:19-25(1998)).

Най-важният принцип при индукция на овулацията е да се осигури възстановяване колкото е възможно по-близко до физиологичното на цикличната функция на яйчниците; поспециално, целта е да се постигне овулация на единичен фоликул. Развитието на много фоликули е усложнение, характерно за индуциране на овулацията с екзогенни гонадотропини, особено при жени с PCOS, които са много © чуствителни към гонадотропна стимулация (Franks and GillingSmith, (1996) (supra)). Факт е, че около 75 % от предизвиканите, вследствие на медикаменти многоплодни бременности, се дължат на индуцирана овулация, докато останалите 25 % са продукт на асистирана репродуктивна техника (Levene et al., Br. J. Obstet. Gynecol., 99:607-613 (1992), Hecht. Assist. Reprod. Rev. 3:75-87 (1993); Evans et al., Am. J. Obstet Gynecol., 172:17501755 (1995); Corchia et al., Am. J. Public. Health., 86:851-854 (1996)). Освен това, PCOS е главен рисков фактор за овариален хиперстимулиращ синдром (Schenker, Hum. Reprod., 8:653-659 (1993)).

Лечението на понижена оплодителна способност и стерилитет чрез асистирани репродуктивни технологии (ART), такива като IVF и ембрио трансфер (ЕТ), изискват стимулиране на яйчниците, за да се увеличи броя на женските гамети и шанса за успешен изход от лечението (Healy et al., Lancet, 1994, 343:1539-1544). Днес стандартният режим за овариално стимулиране, включва фаза на подтискане, при която ендогенният лутеинизиращ хормон (LH) е супресиран, чрез прилагане на GnRH агонист (Гонадотрофин Освобождаващ Хормон), последвана от фаза на стимулиране, през която се развиват много фоликули (фоликулогенезис), чрез всекидневно прилагане на екзогенен Фоликул Стимулиращ хормон (FSH). Друга алтернатива е да се стартира стимулирането след спонтанна или индуцирана менструация и да се предотврати появата на ненавременно LH увеличаване, чрез прилагане на GnRH-антагонист. Когато се постигне адекватно фоликулно развитие, може да се приложи единична доза от човешки Хорион Гонадотропин от урината (u-hCG), за да се имитира увеличение на ендогенния LH и за да се провокира зреене на овоцитите (Loumaye et al., Human Reproduction Update, 1995; 1:188-199).

При стандартната терапия се прилага дневна доза от FSH, докато не се получи подходящ отговор от страна на яйчниците. Този подход включва продължително въздействие с високи нива от FSH, които могат да попречат на селекцията на доминантен зрял фоликул и да доведат до развитие на много фоликули, както на първични, така и на вторични фоликули, по време на стимулирането (Salat-Baroux et al., Submitted 1998 to Human Reproduction).

C разработването на терапии през последните няколко години, първоначалната доза от FSH за лечение чрез IVF спадна (например, първоначално се прилагат 225 Ш за първите 5 дни, последвано от адаптиране към дозата, след това по-късно се прилагат 150 Ш за първите 6 дни, с последващо адаптиране към дозата).

Постоянни, ниски дози от гонадотропини се използват широко в последното десетилетие при режим с повишаващи се дози, където първоначалната доза от FSH е 75 Ш дневно, която постепенно се увеличава (половин ампула на ден), от 1-до 2седмични интервали, като се правят опити бавно и предпазливо да се надхвърли индивидуалния FSH праг на фоликулното възстановяване (Balasch et al., J. Assist Reprod. Genet., 13:551556 (1996); Hamilton-Fairley et al., (1991) (supra); White et al., (1996) (supra); Buvat et al., Fertil. Steril., 52:553-559 (1989); Sagle et al., Fertil. Steril., 55:56-60(1991); Shoham et al., Fertil. Steril., 55:1051-1056 (1991); Homburg et al., Fertil. Steril., 63:729-733 (1995)). Обаче терапията c повишаваща се ниска доза гонадотропин, все още може да доведе до свръх стимулиране на циклите с образуване на много фоликули при пациенти с PCOS (Herman et ah, Hum. Reprod., 8:30-34 (1993)). Следователно, изключително големият брой публикации досега на изтъкнат медицински екип (Hamilton-Fairley et al., (1991) (supra); White et al., (1996) (supra)) и базирайки се на 934 цикъла на лечение, показват че в 20% от случаите лечението се прекратява, преди да завърши, което в повечето случаи е защото се развиват 3 големи фоликула. Извършват се 72% цикъла на овулация, от които при 77 % овулира само по един фоликул. Най-общо, тези данни показват, че се постига овулация на единичен, доминантен фоликул само в около 50% от първоначалните цикли на лечение с гонадотропин (Hamilton-Fairley et al., (1991) (supra); White et al., (1996) (supra)).

От друга страна, се съобщава за схема с понижаващи се ниски дози, при която се дава голяма доза гонадотропин (150 до 225 Ш) през първите 2 или 3 дена, за да се имитира физиологична секреция на ендогенно освобождаване на FSH (Mizunuma et al., Fertil. Steril. 55:1195-1196 (1991); van Santbrink et al, Hum. Reprod. 10:1048-1053 (1995)). След това следва, или чрез подход подобен на протокола за повишаващите се дози (Mizunuma et al., (1991) (supra) или чрез прогресивно намаляване (всеки 3 дена) на дневната FSH доза до минимум 75 Ш/ден, за да се получи суб-прагова доза, приготвена за да поддържа само растежа на водещия фоликул (van Santbrink et al, (1995) (supra). Първата възможност е свързана с ниската скорост на развитие (35%) на единичен доминантен фоликул (Mizunuma et al., (1991) (supra)), тъй като последният води до монофоликулен растеж в 62% от 234 от цикъла на лечение (van Santbrink et al, (1995) (supra), но той изисква много поинтензивен контрол (Frank & Hamilton-Fairley, Ovulation induction: Gonadotropins. In Adashi EY, Rock JA, Rosenwaks Z (eds.), Reproductive Endocrinology, Surgery, and Technology, Lippincott-Raven, Philadelphia, ppi207-1223 (1996)) и трудно се постига неговата репродуктивност, поради дългия полуживот на FSH препаратите (Baird, Use of gonadotropins to induce ovulation in polycystic ovary syndrome. In Filicori M and Flamigni C (eds.) The Ovary: Regulation, Dysfunction and Treatment. Elsevier Science B.V., Amsterdam, pp. 391-401 (1996)).

Изпробвани са и други FSH режими на прилагане. Sharma et. al., (Hum. Reprod., 1987; 2:553-556) сравняват отговора на 150 IU FSH дневно и периодично, спрямо отговора на 300 IU FSH подаван периодично при пациенти, предварително лекувани с GnRH. Обаче, това изследване е проведено с относително малко пациенти и следователно, резултатите не могат да бъдат оценени като заключителни. Освен това, изследването е проведено през 1987, когато са били налични само препарати, производни на FSH от урина.

Не отдавна, Reddy et al. (1996, Abstracts of the 12^th Annual Meeting of the EHSRE) изследват безопасността и ефикасността на “user-friendly” периодичен режим с понижаващи се дози в изследване на UK мултицентър. Стимулирането с SC Gonal-F® (рекомбинантен човешки FSH) започва с първоначална доза от 450 Ш/ден в дните 1 и 3, с понижаване на 5-ия ден до 300 IU/ден. Режимът от 300 Ш давани периодично на ден, продължава докато не се удовлетворят критериите за hCG. Средната продължителност на лечение с Gonal-F® е 10 дена и средна доза 1800 Ш (еквивалентна на 24 ампули от 75 IU) и 83.7 % от пациентите достигат критериите за прилагане на hCG на 12-ия ден. Лечението води средно до 8.6 фоликули с диаметър > 14 mm от деня на прилагането на hCG. Заключението е, че може да се препоръча опростеният режим с понижаващи се дози, тъй като се комбинира висока възприемчивост на пациента и понижена консумация на гонадотропин, с фаза на бременността, сравнима с тази при конвенционалните режими. Това изследване не включва обаче, група за сравнение, получаваща обичайната IVF терапия, за да се осигури съпоставяне на получените данни.

Lolis et al (Fertil. Steril., 1995:63; 1273-1277) показват, че еднократна IM инжекция на висока доза FSH болус в ранната фоликулна фаза при нормални жени индуцира за 3 дена увеличаване на концентрациите на FSH в серума и това е адекватно за стимулиране на развитието на много фоликули. Обаче, освен доминантният, тези фоликули не са способни да поддържат продукцията на оестроген и да се развиват над определен размер в присъствие на физиологични концентрации от FSH. Когато се приложи по-силен FSH стимул чрез увеличаване на концентрациите на FSH в серума по време на средната фоликулна и късната фоликулна фаза, чрез прилагане на допълнителни дози от FSH, се наблюдава стабилно увеличаване на стойностите на серумният естрадиол (Е₂) и пропорционално увеличаване на броя на пред-овулационни фоликули.

Въпреки че тези изследвания предвиждат използване на високи дози на FSH, прилагани за по-дълги периоди от време, допуска се че прекалено голямата дневна доза от 300 IU не се компенсира (Lashen et al., J. Assist. Reprod and Genet. 1998, 15 (7): 438-443).

Необходимо е, подобряване на протоколите, отнасящи се до стимулиране на овулацията.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Съгласно първи вариант от изобретението, се осигурява използването на FSH и/или биологично-активен негов аналог, за получаване на лекарствен препарат за лечение на стерилитет при жени, като лекарственият препарат трябва да се прилага при начална доза в обхвата от 100 до 600 Ш, последвана от втора доза, поне 3 дена по-късно във фазата на стимулиране.

За удобство, справката по-долу за FSH има за цел да включва биологично-активни негови аналози.

Както се. споменава тук “фаза на стимулиране” означава да се определи точката от асистирания репродуктивен цикъл (обикновенно за подпомагане на жени с понижена оплодителна способност или стерилни жени да забременеят), при която лекарите считат че трябва да бъде индуциран фоликулогенезиса. Това може да стане след достатъчно подтискане на ендогенния LH (обикновенно чрез прилагане на GnRH агонист). Например, когато нивото на естрадиолът е 200 pmol и/или, когато не може да се визуализира фоликулен растеж, като се използва ултразвук и/или ендометриумът е тънък. Съответно, това може да бъде последвано от спонтанна или индуцирана менструация с прилагане на GnRH антагонист, за предпазване на ненавременното увеличаване на LH.

В настоящето изобретение, “стерилни”, включва жени, които не могат да имат овулация, включващи тези, с поликистозен овариален синдром (PCOS), както и тези с нормална овулация, които не могат да забременяват.

Прилагането на FSH, съгласно настоящето изобретение, може да подобри монофоликулното развитие и да намали развитието на много фоликули, като се намалява шанса за многоплодна бременност. В допълнение, такова прилагане може да доведе до по-висок шанс за забременяване. Необходими са, обаче само няколко инжекции, което е едно значително предимство за пациента. Инжекциите могат да бъдат прилагани самостоятелно и така необходимият по-малък брой инжекции, намалява шансовете за лечение, ако се пропусне някоя от инжекциите. Дори, когато инжекциите не се поставят самостоятелно, настоящото изобретение осигурява предимството, че тези инжекции не отнемат време, независимо дали пациентът ще ходи до клиниката, или докторът или сестрата до пациента.

В един вариант, FSH се прилага в доза, в обхвата от 300 до 600 Ш на всеки трети ден от първите шест дни от стимулиращата фаза. Дозата предимно е 400-500 Ш, за предпочитане 430 до 470, а най-добре около 450 IU. Този вариант може да осигури резултати, които са поне същите по отношение на развитието на фоликулите, както и при конвенционалното прилагане на 150 Ш/ден, и наистина може да доведе до по-висока степен на забременяване. Обаче, както се дискутира по-горе са необходими, няколко инжекции (2 в сравнение с 6 при стандартния режим). Съгласно този вариант от изобретението, FSH се прилага всеки трети ден от фазата на стимулиране. За предпочитане е ако прилагането е на първия и четвъртия ден, въпреки че е възможно FSH да се прилага в дните 2 и 5 или 3 и 6.

След първите 6 дни от фазата на стимулиране, FSH може да се прилага при нива, определени от лекаря, за да се постигне адекватно развитие на фоликулите. Например, FSH може да се прилага, като дневна доза от 150 Ш, ако отговорът на яйчника е адекватен или при доза от 225 Ш, ако той не е адекватен. Ако е необходимо, например тези дози могат да се увеличат с 75 Ш/дневно.

В друг вариант, първоначалната доза е в обхвата от 100 до

500 Ш, с втора доза, която ще се прилага предимно между трети и шести ден, за предпочитане четири дни по-късно.

Първоначалната доза, предимно е 200-400 Ш, за предпочитане 250-350, а най-добре около 300 Ш.

В този вариант, втората доза може да бъде в обхвата от 50 до 200 IU, за предпочитане от 70-100 Ш, а най-добре около 75 Ш. Този вариант е особено ефикасен, тъй като подпомага монофоликулното развитие и намалява развитието на много фоликули. Втората доза се повтаря предимно дневно, от 1 до 4 дни, за предпочитане 2 дни, в зависимост от това на кое ниво определено от лекаря, ще се приложи FSH, за да се постигне адекватно фоликулно развитие. Например, FSH може да се приложи, като дневна доза от 75 Ш, ако отговорът на яйчника е адекватен. Ако е необходимо, тази доза може, например да се увеличи с 37. 5 Ш FSH/ден.

В този вариант на изобретението, се предпочита първоначалната доза на прилагане да е на третия ден, въпреки че е възможно, тя да бъде прилагана в дните - първи, втори или четвърти.

За да се провокира зреене на овоцита, след адекватното фоликулно развитие може да се приложи единична доза от иhCG или r-hCG или r-hLH. Това например може да стане, когато най-големият фоликул достигне среден диаметър поне от 18 mm; има поне два други фоликула със среден диаметър > 16 mm; и нивото на Е₂ е в приемливият обхват за броя на присъстващите фоликули.

Настоящето изобретение може да се използва за стимулиране на развитието на много фоликули, предимно преди in vitro оплождане (IVF) или вътрецитоплазмено спермално инжектиране (ICSI), въпреки че то може да стане преди естественото оплождане.

LH, FSH и hCG могат да се получат от естествени източници, например да бъдат изолирани от урина, от хипофиза или от плацента, или могат да се получат, като се използва рекомбинантна ДНК технология (виж WO 85/01959 и Loumaye et al., Human Reprod; 11:95-107, 1996). Биологично активни техни аналози, включват мутеини, пептидни аналози, непептидни аналози и химери. Примери за подходящи FSH химери са описани в WO-A-90/09800, WO-A-93/06844, WO-A91/16922 и WO-A-92/22568. За предпочитане е в настоящото изобретение да се използва човешки FSH.

Лекарственият препарат може да бъде пакетиран така, че да осигури само необходимата доза от FSH, например в разфасовка за единична доза, като фиолка. Обаче е възможно FSH да се приложи два или повече пъти през деня - разбира се при условие че тоталният FSH приложен за един ден е еквивалентен на необходимата доза - и съответно на пакетираният лекарствен препарат, т.е. в опаковка, съдържаща много дози. Тези решения се взимат от лекаря, който прилага лекарствения препарат и ще зависят от параметри, като индекс на телесно тегло на пациента (BMI), от историята на заболяването, отговор към лечението, полу-живота на лекарственият препарат и т.н.

Съединенията, които се използват в изобретението могат да бъдат формулирани за прилагане чрез който и да е от стандартните начини, често заедно с фармацевтично и/или ветеринарно приемлив носител. За предпочитане е съединенията да се формулират за парентерално прилагане.

За предпочитане е FSH да се прилага подкожно, предимно в предната абдоминална стена.

Обикновено препаратите за парентерално приложение са стерилни. Фармацевтичните формулировки, адаптирани за парентерално приложение включват водни и неводни, стерилни инжекционни разтвори, които могат да съдържат антиоксидантц, буфери, бактериостатици и разтварящи вещества, които правят препарата изотоничен с кръвта на реципиента; водни и неводни стерилни суспензии, които могат да включват суспендиращи вещества и уплътняващи вещества са също така в обхвата на изобретението.

Препаратът може да е представен, като опаковки от единични или многократни дози, например запечатани ампули и фиолки и могат да се съхраняват в замразено-изсушено (лиофилизирано) състояние, изискващо само добавяне на стерилен течен носител, например вода за инжекциите, непосредствено преди употреба. Подготвените за инжекция разтвори и суспензии могат да се приготвят от стерилни прахове, гранули и таблетки. Препаратите могат да се прилагат, чрез предварително напълнени спринцовки, чрез авто-инжектор или чрез инжектор за многократни дози.

Оралните и ентеросолвентни препарати, които могат да се приемат трябва да са стерилни и могат да представляват единична или многократно дозирана форма. Оралните препарати могат да са под формата на твърд препарат, такъв като прахове, гранули, таблетки, капсули (например твърди или меки желатинови капсули) или като таблетки със захарни обвивки, или като течни, такива като сиропи или тинктури. Ако е подходящо могат да присъстват пълнители и/или носители, и специалистите в областта на фармацевтичното приготвяне на лекарствени препарати, могат да осигурят такива допълнителни или алтернативни ексципиенти, ако е необходимо или желателно; например това могат да са ароматизиращи вещества. Всеки един препарат, който е за орално приложение, може да бъде формулиран така, че да бъде устойчив в чревния тракт, за да се подпомогне доставянето му до тънките черва и за да се избегне или смекчи каквото и да е разграждане на съединението(та), което може да стане в стомаха или в проксималната част на тънките черва. Таблетките или капсулите могат да бъдат с ентеросолвентно покритие, например чрез стандартни методи. Течните препарати могат да бъдат ефективно приготвени, така че да са устойчиви в чревния тракт, чрез включване или чрез едновременно прилагане с подходящо вещество, като триглицериди със средна по дължина верига.

Ентеросолвентните състави, различни от оралните състави, включват състави за ректално използване, които могат да бъдат под формата на супозитории. Супозиториите обикновенно включват, супозиторна база, такава като какаово масло. Отново по-специалните препарати, съдържащи активните съставки могат да се приготвят рутинно от специалистите в областта на фармацевтичното приготвяне на лекарствени препарати.

Съгласно втори вариант от изобретението се осигурява метод, включващ фоликулогенезис при жени с понижени оплодителни способности или стерилни жени, включващ прилагане на FSH и/или биологично активен аналог с първоначална доза в обхвата от 100 до 600 Ш, последвана от втора доза, поне три дена по-късно във фазата на стимулиране.

Предпочитани характеристики на всеки аспект от изобретението, както и на всеки един вариант са mutatis mutandis.

Μ

Целият патент и литературата, която се отнася до тази спецификация, са включени тук изцяло и са законосъобразни.

Изобретението ще бъде описано по-нататък със следните не-ограничаващи примери.

ПРИМЕРИ ЗА ИЗПЪЛНЕНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Пример 1

Предприето е следното изследване, за да (а) се оцени развитието на много фоликули, след прилагане на r-hFSH през интервали от 3 дни за първите шест дни от стимулирането, последвано от всекидневно прилагане от седми ден нататък, в сравнение с ежедневно прилагане от първия ден на стимулирането, като се използват ефективни крайни точки, такива като общ брой инжекции по време на фазата на стимулиране, кумулативна r-hFSH доза и продължителността на лечението с r-hFSH и (б) да покаже че алтернативният дозов режим ще доведе поне до еквивалентна клинична ефективност, оценена чрез ефективните крайни точки, такива като броя на фоликулите > 11 mm и > 14mm на седмия ден и в деня на прилагане на hCG и броя на възстановените овоцити.

Може да се направи обобщението, че пациенти допуснати до изследването са стерилни жени, които желаят да забременеят, които не са могли да забременеят най-малко една година без да се пазят от забременяване и които са удачни за ART (IVF, ICSI), при условие че те отговарят на подходящите критерии, които са описани по-подробно по-долу.

Подтискане на хипофизата се постига чрез GnRH агонист, приложен преди лечението с r-hFSH. Схемата на дозиране на г15 hFSH от първия до шестия ден от фазата на стимулиране е описана по-горе. Трябва да се отбележи че, фиксираната тотална доза от 900 IU FSH за всички пациенти се прилага от първия до шестия ден включително. Титруването на дозата е позволено, в зависимост от индивидуалния отговор от страна на яйчника (максимална дневна доза 450 Ш от седмия ден). От седмия ден нататък FSH се прилага дневно в доза, приспособена към индивидуалния отговор на яйчниците, докато фоликулното развитие се счита за адекватно (оценено чрез ултразвуково изследване на яйчниците и концентрацията на серумният естрадиол Е₂). За да се постигне крайната фаза на фоликулното зреене, преди да се образува яйцеклетката (OPU) се прилага човешки хорион гонадотропин, изолиран от урина (u-hCG) в единична доза от 5000 Ш. Ефективността включва следене на ендокринния отговор към г-hFSH, чрез кръвните проби за анализ на серумните нива на Е₂, FSH, LH и Р₄, както и чрез периодично изследване с ултразвук на яйчниците по време на фазата на стимулиране. Ефективните крайни точки включват общ брой инжекции, обща кумулативна доза и продължителност на лечението. Ефективните крайни точки включват брой фоликули > 11 mm и > 14mm на седмия ден и в деня на прилагане на hCG и броя на възстановените овоцити.

Избор на пациенти

Избрани са 68 пациента, които отговарят на всички от следните включени критерии:

• Стерилният пациент се определя, като: жена желаеща да забременее и която не е могла да забременее поне една година без да се предпазва от забременяване. Този стерилитет може да се обясни поне с една от следните причини и да отговаря на критериите за IVF-ET лечение:

- Фактор за фолопиевите тръби. Включени критерии.

- Средна ендометриоза (Класификация на Американската асоциация за стерилитет, фаза I или II)

- Мъжки стерилитет (виж състоянията по-долу)

- Необясними • Мъжки партньор със спермален анализ в рамките на последните шест месеца с > l.OxlO⁶ подвижни сперматозоиди (степен на подвижност А и В) за ml в еякулата и степен на оплождане на овоцитите > 20% по време на който и да е от предварителните IVF опити. Ако тези критерии са съблюдавани може да се използва периодично оплождане или вътрецитоплазмено спермално инжектиране (ICSI). Ако тези критерии не са удовлетворени, пациентът може да постъпи, но само ако се използва ICSI.

• Възраст 18-38 години.

• Изключване на бременност преди започване на терапията с орален контрацептив и/или GnRH агонист.

• Спонтанен овулационен менструален цикъл от 25-35 дена.

• Ранна . фоликулна фаза (ден 2-4), серумни нива, оценени в местната лаборатория в обхвата, определен по-долу:

- FSH по-малко от 10IU/I

- LH по-малко от 13.5 IU/I

- PRL по-малко от 800IU/I • Наличие на два яйчника.

• Не повече от 3 предишни цикъла на асистирана репродуктивна технология (ART) или не повече от три предишни ART цикъла от последната клинична бременност.

• Да е имала поне един цикъл на прекъсване след последната ART и/или лечение със кломифен цитрат или гонадотрофин, преди първия ден на стимулиране (S1).

Предварително лечение

Цикъл на прекъсване агонист

Цикъл за изследване

• Без предишни цикли на асистирана репродуктивна технология (ART), показващи слаб отговор, към стимулиране с гонадотрофин (определени като: зреене на < 2 фоликула).

• Без предишна история за среден или тежък по сила овариален хиперстимулиращ синдром на (OHSS).

• Кухина на матката без аномалии, които биха могли да увредят ембрионалната имплантация, или развитието на бременността, което може да се оцени, чрез ултразвук (US), или хистероскопия (HSC) или хистеросалпингография (HSG), провеждани в рамките на 5 години преди първия ден от цикъла на стимулиране.

• Не са известни алергии или хипер чувствителност към човешки препарати от гонадотрофини.

• Нормален цервикален РАР емир (да се провежда, ако не е проведен тест за емир по време на период от 12 месеца).

и тези които не удовлетворяват следните изключени критерии:

• Каквито и да са противопоказания, за да бъдат бременни и да износват плода до термина.

• Извънматочна бременност за предишните три месеца • Клинично известни системни заболявания • Индекс на телесното тегло по-голям от 30 (изчислен като тегло на тялото (kg), разделено на височината² (т²)) • Каквито и да са други медицински състояния, които могат да повлияят на абсорбцията, разпределението, метаболизма или екскрецията на FSH.

• Анормално гинекологично кървене.

• История на злоупотреба с наркотични вещества,

лекарствени препарати или алкохол в рамките на последните пет години.

Максимум шест месеца преди да започне подтискането (GnRHa терапията), са оценени следните критерии:

Демографски данни: Дата на раждане, височина, тегло и раса.

Медицински, история на текущо приемане на лекарствени препарати и преглед при лекаря: включващ кръвно налягане, сърдечен ритъм и обща информация за здравословното състояние. Отбелязва се честотата на пушене.

История на акушеро-гинекологичните прегледи: Предишни гинекологични прегледи, включително данни от всички предишни ART цикли.

Гинекологични прегледи: гинекологични прегледи (включващи цервикален РАР емир, ако не е бил правен през последните три години).

Диагностична ултразвукова графия: Прави се тазов US преглед през ранната фоликулна фаза, като се използва ендовагинална сонда. Описание на двата яйчника включват дължината в трите плоскости, брой на фоликулите <10 mm, които присъстват в най-голямата област на яйчника, размер на всеки фоликул > 11 mm и размер на всяка яйчникова киста. Отбелязват се размерът на матката (дължина, височина и ширина) и нейният външен вида.

Лабораторен скрининг: Събират се два милилитра серум и се изпращат до местната лаборатория, за определяне на ранна фоликулна фаза (ден 2 до 4 от спонтанен цикъл), концентрации HaFSH, PRLhLH.

Анализ на спермата: Провежда се анализ на спермата на мъжкия партньор.

Пациентите се избират произволно, съгласно компютърно съставен произволен списък в две групи. 33-ма от пациентите се поставени в група 1 (150 Ш на ден) и 35 са поставени в група 2 (450 Ш, всеки 3-ти ден).

Лечение, Прилагане и Контрол

Използва се Леупрорелин ацетат (Uno-Enantone®, Takeda) като агонист за десенсибилизиране на хипофизни гонадотропни клетки. Той се прилага в доза от 0.1 ml, съдържаща 0.5 mg на ден SC в бедрото, един път дневно, като се започва през средната лутеална фаза от менструалния цикъл и завършва в деня на u-hCG инжекцията. Десенсибилизация на хипофизата е потвърдена чрез ултразвуков скенер и чрез измерване на нивото на Е₂, през ранните 10 дена след започване на лечението. Ако пациентът не е подтиснат през това време, лечението само с Леупролелин продължава за още 15 дена. Във всеки случай, подтискането се потвърждава преди започване на супер овулационното лечение.

След потвърждаване на подтискането, започва лечение с гhFSH (Gonal-F®, Serono). Gonal-F® се прилага или един път дневно, или всеки 3-ти ден ако е необходимо, както прилагането на SC абдоминално. Първоначалната фиксирана доза (в S1 ден) е 150 IU/ден, или 450 Ш FSH/3-ти ден, за 6 дни (включително).

Ha S7 (7 дни след началото на лечението с r-hFSH), дозите се приспособяват съгласно отговора на яйчниците, следен с US и серумните нива на Е₂. Във връзка с това, на SI, S5, S7 и по всяко време, пациентът и се наблюдава в центъра за контрол, включващ деня на прилагане на u-hCG, събират се кръвни проби, центрофугират се и серумът (2 ml) се използва веднага за оценка в местната лаборатория, за анализ на Е₂, Рд, LH и FSH. Правят се изследвания с ултразвук с ендовагинална сонда на същите дни, като и за измерване на Е₂. Във всеки един от тези случаи се измерват всички фоликули със среден диаметър > 11 mm.

Gonal-F® се доставя в ампули, съдържащи 150 Ш FSH, 30 mg захароза и фосфатен буфер в лиофилизирана форма. Броят на ампулите необходими за дневната доза се приготвят с вода за инжектиране и SC се инжектира веднага след това. На следващата Таблица 1 е показано необходимото специфично разреждане при приготвяне на дозата за прилагане.

Таблица 1

Доза(Ю)	Брой на 150 Ш FSH ампули	Разреден брой на ml	Обем в (ml) на инжекцията
150	1	1	1
225	2	1.33	1
300	2	1	1
375	3	1.2	1
450	3	1	1

Дозата от FSH се нагласява на 7 ден от лечението, съгласно отговора на яйчниците. В двете групи, ако отговорът на яйчниците е достатъчен, се използва доза от 150 Ш. Ако и в двете групи отговорът на яйчниците не е адекватен, се използва доза от 225 Ш. В последствие, ако дозата се увеличи, то увеличаването е само 75 Ш FSH/ден над предишната доза. Следователно, дневните дози са само: 150, 225, 300, 375 и 450 Ш FSH/ден.

Единична SC инжекция от 5000 Ш от u-hCG (Profasi®, Serono) се инжектира в деня след последната r-hFSH и прилагането на GnRH агониста, когато: най-големият фоликул достигне среден диаметър от поне 18 mm; когато присъстват поне два други фоликула със среден диаметър > 16 mm; и когато нивото на Е₂ е в приемливия обхват за броя на присъстващите фоликули. Profasi® се доставя в ампули, съдържащи 5000 Ш u-hCG и 10 mg лактоза в замразеноизсушена, прахообразна форма за SC прилагане. Една ампула от u-hCG се приготвя с 1 ml солеви разтвор за инжектиране (0.9 % NaCl) и обем от 1.0 ml се инжектира SC веднага след това.

Трийсет и четири до трийсет и осем часа след прилагането на u-hCG, овоцитите се връщат обратно или абдоминално или вагинално, като процедурата се контролира с ултразвук. След това овоцитите се оплождат in vitro и ембрионите се връщат обратно 2-3 дни след възстановяване на овоцитите. Поставят се не повече от три ембриона. Записва се следната информация:

Брой овоцити: Записва се общият брой възстановени овоцити, включително разкъсаните и неузрелите.

Зреене на ядрото на овоцита: По всяко време когато е възможно се оценява съзряването на ядрото в овоцита.

Овоцитите се класифицират като зародишно мехурче (зародишното мехурче, или ядрото на човешкия овоцит е повече или по-малко сферично по форма и обикновено съдържа едно периферно разположено ядърце. Самото зародишно мехурче е разположено централно в овоплазмата в ранните незрели овоцити и се локализира по-периферно, точно преди зародишното мехурче да се разпадне), метафаза I (овоцита в метафаза I се характеризира с липсата на връзка или с първото полярно телце или зародишното мехурче. Под светлинен микроскоп, типичната метафаза I (междинен) овоцит показва (а) че няма полярно телце и няма зародишно мехурче; (б) овоплазма, която е плътна и дори обикновено светло оцветена, но понякога леко грануларна), или метафаза II (типичната метафаза II (зрял; пред овулация) овоцит показва (а) изтласкване на първото полярно телце, (б) овоплазма, която е плътна и дори понякога светло оцветена и хомогенна по грануларност).

Дегенеративни или Атрезивни Овоцити (нежизнеспособни):

Записва се присъствието на дегенеративни или атрезирали овоцити. Дегенеративните овоцити могат да показват което и да е от състоянията на ядрото, описани по-горе. Дегенерацията и атрезията могат да се срещат в овоцита във всеки етап от процеса на зреене във фоликула, от ранните етапи на зреене до етапите след съзряването. Дегенерацията води до много анормални морфологични варианти в аспирирания овоцит, вариращи от тъмна и вакуолизирана овоплазма, до разрушаване на поддържащите структури, особено на zona pellucida. Дегенеративният или атрезирал овоцит се открива най-лесно, поради неговите много ясно очертани анормални характеристики. Под светлинен микроскоп, дегенеративния или атрезирал овоцит показва (а)различни форми на ядреното състояние (полярно телце, зародишно мехурче, нито полярно телце, нито зародишно мехурче, или не е възможно да се определи), (б) овоплазма, която е кафява до черна на цвят и много неравномерна по форма.

Брой на оплодените овоцити: Записва се броят на оплодените овоцити.

Характеристики на спермата и оплождане: Записва се типа на оплождане (регулярно или ICSI). При нормално оплождане се записва плътността и подвижността на сперматозоидите в петрито за оплождане. В случай на оплождане, чрез вътрецитоплазмена спермална инжекция (ICSI), се записва източникът на сперматозоидите (еякулат, епидидимис или тестис).

Оплождане и развитие на ембриона: На 1 ден след OPU, се оценява оплождането и броят на едно-, дву- и многопроядрените яйцеклетки се записва. На втория ден след OPU, броят на дробящите се ембриони, броят на заместените ембриони и фазата на развитие и морфологичните показатели на всеки ембрион по времето на трансфера и изхода за всеки ембрион (трансфер или отхвърляне) се документира.

Системата от категории е следната:

Категория А: Тези ембриони имат дори размер на бластомери, с почти сферичен външен вид (със средна степен на рефрактилност) и с интактна зона. Трябва да се вземе под внимание появата на бластомери, които са в процес на делене или които се делят асинхронно с техните подобни, например 3, 5, 6 или 7 клетъчни ембриони. Те могат да са, грапави, но са напълно нормални.

Категория Б: Тези ембриони са още по-грапави или са с бластомери с неравномерна форма, със средни изменения в рефрактилността и не повече от 10 % от бластомерите са фрагментирани.

Категория В: Тези ембриони показват фрагментация на © не повече от 50 % от бластомерите. Останалите бластомери трябва да са поне в нормално (Категория Б) състояние и е с рефрактилност свързана с клетъчната тяхната жизнеспособност.; zona pellucida трябва да бъде интактна.

Категория Г: Тези ембриони показват фрагментация при повече от 50 % от бластомерите, като част от тях са груб вариант на рефрактилност. Всички останали бластомери трябва да изглеждат жизнени.

Естествен прогестерон (Utrogestan ®: 3 х 200 mg/ден) се прилага по вагинален път, за да се поддържа лутеинизиращата Ф фаза, като се започва след OPU (крайната фаза на фоликулното зреене). Лечението с прогестерон продължава до менструацията или ако пациентката е бременна, поне за първите три седмици от бременността.

Бременността се диагностицира по следния начин Ако пациентът няма менструация, се събират кръвни проби, около петнадесетия ден след прилагането на u-hCG, за оценка на серумния hCG. Анализът на hCG се повтаря в дните 23-25, ако серумната концентрация е > 10 Ш/Ι. Прави се сканиране чрез ултразвук между 35 ден на прилагане на u-hCG и 42, на всички

пациентки, които са бременни, при условие, че не са абортирали спонтанно. Записва се броят на зародишните торбички и сърдечната активност на плода.

Таблица 2 обобщава оценките направени по време на лечебния период.

Таблица 2

	Тест за бременност	е₂	Ултра- звук	Серумен hCG	FSH	р₄	LH
GnRH Агонист	X
Между 10 и 25 ден от GnRH- подтискането		X	X		X	X	X
S1 (Начало на r-hFSH Лечение)		X	X		X	X	X
S5		X	X		X	X	X
S7		X	X		X	X	X
Sn		X	X		X	X	X
hCG ден		X	X		X	X	X
Ден 15-20 (ако няма Менструация)				X
Ден 23-25 *				(X)*
Ден 35-42 (бременност) **			(X)**

• Ако първият серумен hCG е > 10 Ш/1, • ** ако има бременност

Приготвят се серумни проби и се съхраняват по следния начин. За да се получат 3.5 ml серум, се вземат минимум 7 ml

венозна кръв, съгласно стандартната процедура в нужното време, дадено в таблицата по-горе. Кръвните проби се оставят, за 1 час на стайна температура, за да се съсири кръвта, центрофугират се и серумът се прехвърля в 1 аликвота от 2.5 ml (в 5.0 ml vacutainer) и 1 аликвота от 1 ml. Използва се аликвота от 2.5 ml за анализ на параметрите, веднага след приготвянето: Пробата от 1 ml се съхранява, като замразена резервна проба при - 20° С. Дълбокото замразяване на серума се извършва колкото е възможно по-скоро след центрофугирането, но в рамките на 4 часа от събирането.

ф FSH пробите се вземат по следния начин. 3 ml кръв се вземат в нужното време дадено в таблицата по-горе и се третират както е описано по-горе. Серумът се пренася като 2 аликвоти поне от 500 μΐ, една от които остава замразена резервна проба при -20° С. Методите използвани за определяне на хормони са както следва:

Е₂ : ACS 180 Chiron Chemiluminisent, ELISA

P₄ : ACS 180 Chiron Chemiluminisent, ELISA

FSH : ACS 180 Chiron Chemiluminisent, ELISA LH : ACS 180 Chiron Chemiluminisent, ELISA Ф PRL : ACS 180 Chiron Chemiluminisent, ELISA

Резултати

Резултатите от изследването са показани в таблицата подолу. Статистическият анализ се провежда чрез Serono Corporate Biometrics, като се използва SAS статистически софтуер (SAS Institute, NC, USA).

И двете групи за лечение имат сравними демографски данни. Общата кумулативна доза на FSH необходима за завършване на стимулираното лечение до голяма степен е също така сравнима. Обаче броят на инжекциите, на които пациентът трябва да се подложи, за да се постигне адекватното стимулиране показва статистически значима разлика (рстойност: 0.0001). За сравняване на контролната група за ' лечение, средният брой инжекции е 10.5 (s.d. 2.4), докато за групата за лечение с периодична доза, средният брой инжекции е 6.9 (s.d. 2.2).

Броят на обратно върнатите овоцити от двете групи за лечение е сравним, отразяващ сравним брой от оплодени Ф овоцити; Средният брой в групата-контрола е 7.7 (s.d. 5.2) в сравнение със средния брой от групата с периодичната доза от 6.9 (s.d. 3.1). Броят на замразените ембриони и жизнеспособни ембриони е статистически значим в полза на групата-контрола (р-стойности 0.0238 и 0.0319 респективно). Обаче качеството на пренесените ембриони показва тенденция за повече трансферирани ембриони за Категория А в групата с периодичната доза, въпреки че не се постига статистическа значимост с количеството пациенти лекувани досега. Обаче степента на имплантация достига статистически значително © различие в полза на групата лекувана с периодична доза (рстойност: 0.0561) със средна степен на имплантация от 18 % за тази група, спрямо средната степен на имплантация от 5 % за лечението на групата-контрола.

Освен това и клинично най-сходните (виж Таблица 5Биохимични и Клинични бременности), разликата в броя на биохимичните бременности е с висока статистическа значимост (р-стойност: 0.0038) в полза на групата лекувана с периодична доза: среден брой на биохимични бременности 39.4 %, спрямо само 8.6 % в контролната група за лечение. Това води до степен на клинична бременност, която отново е статистически значима (р-стойност: 0.0105) в полза на групата лекувана с периодична доза: средна степен на клинична бременност от 30.3 % за групата с периодична доза, спрямо 5.7 % за контролно лекуваната група. Тези данни допускат до голяма степен, че серумният FSH профил постигнат с новия режим води независимо до по-високо качество, повече жизнеспособни овоцити.

Таблица 3 - Обобщена Статистика

Р-СТОЙНОСТ* 1

0.7169 ]

0.7016

0.5629 1

0.9700

ф ф ф ©

0.3872

0.1881

60600

| 0.4727 1

| 0.3531 |

0.0238

0.0319

0.3238

0.1446

0.7414

0.6979

Липсват данни

1 0.0561 |

Произволно лечение |

□ о <п тГ

£ S

00 ГС

125

сс

3675

40

00

40

гс

се

гс

сс

©

£ © ©

3Ξ X

ГС СЧ

о

1050

сс

ш

in

сс

СС

©

ф

-

ф

©

© ©

SD |

СС

29.0

0.9 П

538.3 ί

СЧ СЧ

2.9

2.5

3.9

се

04

©

-

9Ό

0.97 1

i 86Ό

0.75

000

ГС ©

Средно |

СС

47.0 i

0.7 · |

1743.2

1 6.9 1

10.2

9.0

8.5

σ> 4D

q rc

0.4

2.6 | ________________________________________________________1

2.2

0.58

00

0.39

00Ό

| 18.0%

Липсващи |

о

-

о

ф

©

ф

©

ф

©

ф

©

Ζ

сс ГС

32 1.

сс ГС

ГС

сс ГС

33

сс СС

££

ГС гс

СС гс

гс гс

³³

гс ГС

33

сс СС

сс сс

□ Ф <п

ό co

39 1

120

3675

г-

сч

26

04

тг

©

сч

гС

сч

сс

сч

©

£ © ©

Мин. |

Ο сч

сч

©

006

ЧО

тГ

ф

©

ф

©

—

©

ф

©

© ©

SD |

00

33.2

О

630.9

сч

3.7

4.0

6.3

СЧ tn

q сс

2.7

ГС

90

0.64

1.05

0.73

00Ό

| 0.2

Средно J

31.5 I

50.0

1 θ·8 J

1748.6

<п ф

601

10.1

10.7 _ 1

Г;

I 3.7

1П

3.8

2.0 1

0.27

1.27

0.47 | 1

00Ό

| 5.0%

Липсващи 1

©

гс

©

ф

о

ф

©

о

ф

Ф

ш

ID

1П

ш

1П

<п

Ζ

Ш m

сч сс

Ш гс

rc

«п сС

<п

<п сс

tn rc

«п СС

»п ГС

ш сс

30

I Параметри I

1 Възраст (години) 1

Продължителност на стерилитет (месеци)

Брой предишни ART

Кумулативна FSH доза IU

I Брой инжекции

Брой фоликули >=11 mm

Брой фоликули > = 14 mm

Брой възстановени овоцити

I Брой оплодени овоцити

| Брой 2 PN овоцити

Брой замразени ембриони

Брой жизнеспособни ембриони

Брой пренесени ембриони

Брой ембриони Категория А

Брой ембриони Категория Б

Брой ембриони Категория В

Брой ембриони Категория Г

| Степен на имплантация

CL *

стойности от ANOVA

Таблица 4-Разпределение на Категориите на пренесените ембриони

	Произволно лечение
150 Ш	450 Ш
Класификация на ембрионите*	N	%	N	%
Брой ембриони Категория А	8	13.3%	19	26.8 %
Брой ембриони Категория Б	38	63.3 %	39	54.9 %
Брой ембриони Категория В	14	23.3 %	13	18.3%
Общо	60	100.0%	71	100.0%

* Няма ембрион в категория Г

Таблица 5 - Биохимични и Клинични Бременности

	Произволно лечение
150 Ш	450 Ш
Биохимична Бременност	N	%	N	%	Р-стойност *
Да	3	8.6 %	13	39.4 %	0.0038
Не	32	91.4%	20	60.6 %
Общо	35	100.0%	33	100.0 %

	Произволно лечение
150 Ш	450 Ш
Клинична Бременност	N	%	N	%	Р-стойност *
Да	2	5.7 %	10	30.3 %	0.0105
Не	33	94.3 %	23	69.7 %
Общо	35	100.0 %	33	100.0%

Р-стойности от теста на Fisher

Таблица 6 - Обща статистика

	Gonal- F 450 Ш всеки 3-ти ден за 6 дни (включително)
Параметри	N	Липсват	Средна Стойност	SD	Минимум	Максимум
Възраст (година)	33	0	31.1	3.4	23	38
Продължителност На стерилитет (месеци)	32	1	47.0	29.0	13	125
Брой предишни ART	33	0	0.7	0.9	0	3
Кумулативна FSH Доза (IU)	33	0	1743.2	538.3	1050	3675
Брой инжекции	33	0	6.9	2.2	3	13
Брой фоликули > = 14 mm	33	0	9.0	2.5	5	14
Клинична бременност	η =10 (30.3%)

Таблица 7 - Обща статистика

	Произволно лечение
150	ш	4501	и
Параметри	N	Сред- но	SD	Мин.	Макс	N	Средно	SD	Мин.	Макс	Р-ст-т*
Възраст (година)	35	31.5	4.8	20	39	33	31.1	3.4	23	38	0.7169
Продължителност На стерилитет (месеци)	32	50.0	33.2	12	120	32	47.0	29.0	13	125	0.7016
Брой предишни ART	35	0.8	1.0	0	3	33	0.7	0.9	0	3	0.5629
Кумулативна FSH Доза (Ш)	35	1748.6	630.9	900	3675	33	1743.2	538.3	1050	3675	0.9700
Брой инжекции	35	10.5	2.4	6	17	33	6.9	2.2	3	13	0.0001
Брой фоликули > = 14 mm	35	10.1	4.0	4	21	33	9.0	2.5	5	14	0.1881
Клинична бременност**	η = 2 (5.7%)	η = 10(30.3%)	0.0105

* р-стойности от ANOVA * * р-стойности от теста на Fisher

От резултатите се вижда, че инжекцията от 450 Ш от FSH всеки 3-ти ден, дава поне същите резултати по отношение на фоликулното развитие и може да доведе до по-голяма степен на забременяване. Обаче са необходими няколко инжекции.

Пример 2

Следният пример сравнява подготовката на яйчниците и хормоналните нива след стимулиране на яйчниците при пациенти с поликистозен овариален синдром (PCOS), като се използват рекомбинантен - фоликулостимулиращ хормон (гFSH) в два последователни цикъла, съгласно два различни режима с ниска доза гонадотропин, според класически протокол с повишаващи се дози и модифициран протокол с понижаващи се дози. Последният протокол се използва също така при жени с нормална овулация, на които при първия цикъл се прилага вътрематочно оплождане.

Материали и методи

Във всички експерименти са включени 30 стерилни жени. Десет от тях (Група 1) имат PCOS и се изследват в двадесет цикъла на лечение. Средната възраст на пациентите (± SE) е 31.8 ± 1.2 години и тяхната средна продължителност на стерилност е 4.1 ± 1.5 години. Те са с олигоменореа и аменореа, средното основно съотношение на LH/FSH е 2.8 ± 0.35, и техните средни основни нива на андростенедион и свободен тестостерон респективно са 305 ± 36 ng/dl (нормални стойности 60-200 ng/dl) й 7.76 ± 3.81 % (нормални стойности 0.3-3.8 %). Техният среден индекс на телесно тегло е 26.4 ±1.6 и всички те имат ултразвукова картина на поликистозни яйчници (Adams et al., Br. Med. J. 293:355-359 (1986)). Активността на ендогенния естроген е очевидна при тези пациенти със средни основни нива на оестрадиола 93.7 ± 10.1 pg/ml и с позитивен отговор на теста за прогестин (нормално спиране на кървенето след лечение с орална доза медроксипрогестерон ацетат, орално приложен 10 mg дневно за 5 дни) при всяка една от тях. Преди да се индуцира овулация в пациентите, са записани параметрите на семенната течност при нормалния мъжки партньор, нормалната хистеросалпингограма или лапароскопия и липсата на хирургична намеса и/или възпалително заболяване в тазовата област. При всички тях липсва овулация с кломифен - цитрат или не забременяват поне след три цикъла на овулация при това лечение, при дози £_200 mg/ден за пет дни.

PCOS пациентите се лекуват с s.c.r-FSH (Gonal-F, Serano S.A., Madrid, Spain) съгласно стандартен протокол с понижаващи се дози, съобщен предварително (Balasch et al., J. Assist Reprod. Genet., 13:551-556 (1996)) при изследване на техния първи цикъл на лечение и след това чрез модифициран режим на понижаващи се дози във втория цикъл на лечение с гонадотропин. Интервалът от време между циклите на лечение при всяка жена е от един до три месеца. r-hFSH терапията започва на третия ден от спонтанния цикъл или от индуцираното маточно кървене. Тъй като целта е да се сравняват подготовката на яйчниците и хормоналните нива, а не фазата на бременност, в настоящото изследване са включени 10 последователни PCOS пациенти, които не са забременяли през първия цикъл на лечение.

Постоянният режим с повишаваща се ниска доза, включва прилагане на начална доза от 75 Ш r-FSH на ден и ако е необходимо повишаване с 37.5 Ш. Първото увеличаване на дневната доза става след 14 дена от терапията и то само ако няма доказателство за отговор на яйчника чрез изследване с ултразвук (няма фоликул по-голям от 10 mm в диаметър). Ако е необходимо следващата доза се коригира, след период от седем дни. Това постепенно увеличаване продължава, докато има активност на яйчника, изследвана с ултразвук; след това, продължава същата доза (т.е. праговата доза), докато диаметърът на фоликула не стане по-голям от 17 mm.

Ако се използва модифицирания протокол с постепенно понижаване на дозата, пациентите получават 4 ампули (300 IU) от r-FSH на третия ден от цикъла и следващите три дена не се прилага лечение (четвърти до шести ден от цикъла). Терапията с r-FSH се възстановява отново на седмия ден от цикъла, чрез прилагане на една ампула на ден от r-FSH след като се проведе подходящо ултразвуково сканиране на яйчниците. Тази доза се поддържа до деветия ден от цикъла (една седмица след като лечението е започнало) и след това протоколът е абсолютно същия, като този използван с повишаващи се ниски дози. Следователно всяка жена може сама да контролира изследването на подготовката на яйчниците и хормоналните нива. Използването на същият протокол за лечение, приложен към различни гонадотропинови препарати при същите пациенти, както е направено преди това от Balasch et al., Hum. Reprod., 10:1678-1683 (1995); Balasch, et. al., J. Assist Reprod. Genet., 15:552-559 (1998); Couzinet et al., J. Clin. Endocrnol., Metab., 66:552-556 (1988); Shoham et al., Fertil. Steril., 56:10481053 (1991) изглежда е по-подходящ за модела на изследването, когато целите са да се сравняват подготовката на яйчниците и хормоналните нива, а не фазата на бременност.

Модифицираният протокол с понижаващи се дози е анализиран също така при 20 нормални жени с овулаторен стерилитет (Група 2), имащи нормална морфология на яйчниците, определена чрез вагинална ултразвукова диагностика. Първият интравагинален цикъл на оплождане е свързан с лечение на яйчниците с гонадотропин, поради необяснимия стерилитет или понижената мъжка оплодителна способност, след като е диагностицирана чрез хистеросалпингограма или лапароскопия на отворените фалопиеви тръби. Средната възраст на пациентите в група 2 е 32.9 ± 2.0 години и тяхната средна продължителност на стерилитет е 5.3 ± 1.2 години.

Отговорът на яйчниците и в двете групи от пациенти се контролира чрез вагинално ултразвуково сканиране и чрез измервания на оестрадиол. В допълнение на това изследване се измерват нивата на серумния прогестерон в средната част на жълтото тяло (седем дена след инжектиране на hCG), съответно във всички цикли на лечение за пациентите от група 1. Това е направено, като се използват замразени серумни проби, съхранявани при - 20 ⁰ С, които са изследвани на един път. Хормоните се измерват, като се използват наличните в търговската мрежа китове, съгласно съобщените преди това методи (Balasch et al., Hum. Reprod., 11:2591-2594 (1996)). Концентрациите на оестрадиола и прогестерона в серума се оценяват, чрез директен радиоимунологичен анализ (bioMerieux, Marcy l’Etoile, France за оестрадиол; Immunotech International, Marseille, France за прогестерон). За оестрадиола коефициенти, получени от вътрешният анализ и от отделните анализи на вариациите са респективно < 4.5 % и < 5.5 % ,а първият за прогестерона е 6.5 %.

Проведени са серии от ултразвуково сканиране, за да се определи фоликулния растеж и евентуално промените в диаметъра на яйчниците. Даван е hCG (Profasi; Serono SA 10,000 IU i. m.) за да се индуцира овулация, когато водещият фоликул достигне размер > 17 mm. Ултразвукови сканирания се провеждат при 5 mHz с вагинален трансдюсер, прикрепен към Aloka sector scanner (модел SSD-620, Aloka, Tokyo).

Данните са анализирани чрез SPSS статистически софтуер, чрез използване на Wilcoxon matched-pairs signed-ranks тест или ако е необходимо чрез chi-square тест. Резултатите са представени, като средни стойности със SE.

Резултати

Всички лекувани с гонадотропин цикли, включени в настоящия пример са овулационни, съгласно данните от ултразвуковия анализ, записите за основната телесна температура, за продължителността на лутеалната фаза и за пациентите от група 1, а също така и концентрацията на серумния прогестерон в средната част на жълтото тяло > от 10 ng/ml.

Сред PCOS пациентите (група 1) има една текуща бременност и един спонтанен аборт през първите три месеца с модифицирания подход с понижаващи се дози. Сравнителните резултати от двете r-FSH лекувани жени са сумирани в Таблици I и II. Общото количество FSH използвано за индуциране на овулация в PCOS пациенти е по-високо с метода на понижаващите се дози, независимо от факта, че и двете: средната продължителност на лечението и праговата доза са сходни и при двата подхода. Обаче, скоростта на многофоликулните цикли (т.е. водещ фоликул > от 17 mm и 2 или повече вторични фоликула), обаче скоростта на много фоликулните цикли е значително по-висока, с протокола с повишаващите се дози, докато монофоликулните цикли (т.е. само един фоликул се развива и достига диаметър > 17 mm) са

получени в повече от 80 % от лекуваните цикли с метода на понижаващите се дози (Таблица I). Данните от фоликулната динамика и оестрадиолните нива през време на r-FSH лечението и в двете изследвани групи са показани в Таблица II. Селективно възстановяване на овоцити се провежда в два многофоликулни цикъла, преди инжектиране на HCG в последната лекувана група. При тези възстановявания се получават респективно четири и три овоцита (5 от тях незрели), но според желанието на двойките е предприето in vitro оплождане. Според крайното фоликулно развитие, серумните нива на оестрадиола в деня на прилагане на HCG са 71 % повисоки, по протокола с повишаващи се концентрации (разликата показва тенденция за статистическа значимост, Р = 0.1), докато серумния прогестерон от средната част на жълтото тяло е значително по-висока (Р < 0.05) (Таблица I).

За пациентите в група 2, при които е предприето стимулиране на яйчниците с гонадотропин при вътрематочни цикли на оплождане, дните за лечение с гонадотропин и броят на използваните ампули от r-FSH съответно са 6.1 ± 1.2 и 9.0 ± 1.4. Дневната ефективна (прагова) доза е 75 Ш (1 ампула) за всеки цикъл на лечение. Приблизително 15/20 (75 %) от циклите за лечение са еднофоликулни, докато вторичен фоликул, съпровождащ водещият фоликул в деня на прилагане на HCG, се наблюдава в останалите 5 случая (25 % от двойно фоликулните цикли), но не се получава многофоликулно развитие. Средните серумни нива на оестрадиол на 4 ден от третирането и на деня на прилагане на HCG инжекцията са респективно 89.8 ± 14.7 pg/ml и 271 ± 29.7 pg/ml. Има три единствени случая на бременност (> 14 седмица от

бременността) от 20 цикъла на лечение, две от които са станали по време на еднофоликулните цикли.

Таблица 1

Параметър	Повишаваща	Понижаваща	Р
Брой цикли на лечение, изискващи RFSH	10	10
Дни на лечение (брой)\|	15.7 ±2.0	14.6 ± 2.0	Незначително
Ампули (брой)	16.6 ±2.8	19.1 ±2.2	<0.05
Ш	1245 ±217	1436±167	<0.05
Прагова доза	87. 5 ±8.8	86.2 ±8	Незначително
Фоликулно развитие на HCG ден
Монофоликулни цикли (%)	60	80	} <0.05
Бифоликулни цикли (%)	0	20^а)
Многофоликулни цикли(%)	40	0
Естрадиол на HCG ден (pg/ml)	474 ± 90	277 ± 38	незначително
Прогестерон в средната част на жълтото тяло (pg/ml)	19.2 ±2.1	16.4 ± 1.9	<0.05

Стойностите са осреднени ± SE

NS = незначително ^a) Два цикъла имат един вторичен фоликул, с размери съответно и 15 mm в диаметър.

Таблица II

Параметър	Ден на лечение	Повишаваща	Понижаваща	Р
Растящи фоликули (> 11 mm)	4	-	0	-
8	1.1 ±0.2	0.2 ±01.	<0.05
Оестрадиол (pg/ml)	4		58.7 ±8.9
8	106.7 ±30.2	69.1 ±8.8	<0.01

Стойностите са осреднени ± SE

Обсъждане

Настоящият пример показва значително по-висок процент (80 %) на монофоликулни цикли и 100% от моно или бифоликулни цикли, и отсъствие на многофоликулно развитие. Този факт, заедно с по-ниските нива на серумен оестрадиол в деня на прилагане на hCG, означава намалени шансове за многоплодна бременност и хиперстимулиране на яйчниците.

Произволно изследване сравняващо режимите с повишаващи се ниски дози (18 пациента) и тези със понижаващи се дози (17 пациента) показва съответно 56 % и 88 % от монофоликулни цикли в първата и последната схеми на лечение (van Sanbrink and Fauser, J. Clin. Endocrinol. Metab.,

82:3597-3602 (1997)). Това е произволно изследване, където на пациентите, които по общо мнение имат същата ендокринна аномалия, им се прилагат произволно един от двата подхода на лечение. Обаче, PCOS е хетерогенно състояние с отчетливи ендокринни характеристики. FSH прагът варира при отделните пациенти, което допуска различия в аномалиите (Fauser et al., Endocr. Rev., 18:71-106 (1997); Baird, (1996) (supra)).

Следователно, както се дискутира по-горе, използването на същият гонадотропен препарат, приложен при различните протоколи на лечение при един и същи пациент, изглежда че е по-подходящ модел за изследване, когато целите са да се сравняват подготовката на яйчниците и хормоналните нива, а не фазата на бременност. В настоящият пример всяка жена контролира самостоятелно промените в активността на яйчниците и хормоналните промени. Използването на самостоятелен контрол от всяка жена изключва какъвто и да е пренасящ ефект от предишния цикъл, който може да повлиява тези резултати, тъй като всеки PCOS пациент е получил найнапред повишаващи се дози. В допълнение, интервалът от време между циклите на лечение при всяка жена е от 1 до 3 месеца.

В изследването на van Santbrink and Fauser (van Santbrink and Fauser (1997) (supra)), се използва постепенно понижаваща се доза, след като е дадена стандартната първоначална доза от гонадотропин. Обаче, в настоящия пример се използва период на постепенно намаляване. Постепенното намаляване е възможно, тъй като полуживота на r-FSH е около 36 часа (Le Cotonnec et al., (1994) (supra); Le Cotonnec et al., Fertil. Steril., 61: 669-678 (1994)). Допуска се, че постепенното понижаване може да избегне циклите на предразположение за развитие на овариална хиперстимулация, което показва, че съобщеното намаляване на серумните FSH концентрации предпазва от понататъшното развитие на фоликули със среден размер, докато големите фоликули продължават да зреят (van Santbrink et al., (1995) (supra)). Обаче, известно е също така, че по време на постепенното понижване, може да стане внезапно понижаване на концентрацията на оестрадиол, което води до спиране на цикъла (Sher et al., Hum. Reprod., 10:3107-3109 (1995); Aboulghar et al., Hum. Reprod., 13 (Abstract Book 1):243-244 (1998)). Това e наблюдавано, както при индуциране на овулацията, при жени без овулация, а също така и по време на контрола на овариалната хперстимулация. Следователно, за да се избегне спирането, в настоящия пример се прилага висока първоначална доза, за да се наподоби естествения цикъл, като по този начин се подпомага възстановяването на фоликулите, като по-късно следва малко, постепенно увеличаване, ако е необходимо, което може да е критично за определяне на фоликулното съзряване (Franks and Hamilton-Fairley, (1996) (supra)).

По-голяма част от жените, на които е приложено лечение за вътрематочно оплождане имат овулация и се подчертава, че интензивността, според протоколите, използвани за суперовулация при цикли за вътрематочно оплождане е сходна със степента на многоплодна бременност (te Velde and Cohlen Ν. Engl. J. Med., 340:224-226 (1999)). Така, меки режими на гонадотропинова овариална стимулация, при които могат да се постигнат приемливи успешни степени, но с нисък процент на получаване на близнаци или не-високо организирани бременности (Balasch et al., Hum. Reprod., 9:1863-1866 (1994); Cohlen et al., Hum. Reprod., 13:1553-1558 (1998)) са били препоръчани (te Velde and Cohlen, (1999) (supra)). Режимът на понижаващи се дози, приложен към жени с нормална овулация, съгласно настоящото изобретение, представя нов подход в това отношение. 100 % степен на монофоликулни/бифоликулни цикли, получени при жените от Група 2 допълва понататъшните доказателства, които показват ползата от този * подход, когато многофоликулното развитие е нежелателно при индуцирана овулация.

В заключение, физиологичния подход с понижаващи се дози за индукция на овулация при PCOS пациенти, може да бъде по-подходящ за получаването на монофоликулни цикли, в сравнение с подхода с повишаващите се дози. Също така, този модифициран подход изглежда е полезен за получаване на развитие на един фоликул при жени с нормална овулация, които се подлагат на стимулиране на яйчниците при цикли на вътрематочно оплождане.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. Използването на FSH и/или биологично активен негов аналог за получаване на лекарствен препарат, за лечение на стерилитет при жени, като лекарствения препарат се прилага с първоначална доза в обхвата от 100 до 600 Ш, последвана от втора доза, поне 3 дена по-късно във фазата на стимулиране.
2. Използването, съгласно Претенция 1, където лекарственият препарат се прилага с доза в обхвата от 300 до 600 Ш на всеки трети ден от първите шест дни от фазата на стимулиране.
3. Използването съгласно Претенция 2, където дозата е в обхвата от 400 до 500 Ш.
4. Използването съгласно Претенция 3, където дозата е в обхвата от 430 до 470 Ш.
5. Използването съгласно Претенция 4, където дозата е около 450 Ш.
6. Използването, съгласно която и да е от Претенции от 2 до 5, където лекарственият препарат се прилага в дните 1 и 4, дните 2 и 5 или дните 3 и 6 от фазата на стимулиране.
7. Използването съгласно Претенция първоначалната доза е в обхвата от 100 до 500 Ш.
8. Използването съгласно Претенция първоначалната доза е в обхвата от 200 до 400 Ш.
9. Използването съгласно Претенция първоначалната доза е в обхвата от 200 до 400 Ш.
10. Използването съгласно Претенция първоначалната доза е около 300 Ш.

1,

7,

8,

9, където където където където
11. Използването, съгласно която и да е от Претенции от 7 до 10, където втората доза, се прилага между 3 и 6 ден след първоначалната доза.
12. Използването, съгласно Претенция 11, където втората доза, се прилага 4 дена след първоначалната доза.
13. Използването, съгласно която и да е от Претенции от 7 , до 9, където втората доза е в обхвата от 50 до 200IU.
14. Използването, съгласно Претенция 13, където втората доза е в обхвата от 70 до 100 Ш.
15. Използването, съгласно Претенция 14, където втората доза е около 75 IU.
16. Използването, съгласно която и да е от Претенции от 7 до 15, където втората доза се повтаря всеки ден от 1 до 4 дни, за предпочитане 2 дена.
17. Използването, съгласно която и да е от Претенции от 7 до 16, където първоначалната доза се прилага на ден 1, 2, 4 или за предпочитане на 3 ден от фазата на стимулиране.
18. Използването, съгласно която и да е предшестваща Претенция, където FSH е рекомбинантен FSH (r-FSH).
19. Използването, съгласно която и да е предшестваща Претенция, където FSH е човешки FSH (hFSH).