SE409713B - Forfarande for separering av cefalosporin c-emnen fran polysackarid- och proteinhaltiga fororeningar - Google Patents

Description

13152a4-s i 2 cefalosporansyra. Den har en svag antibiotisk verkan, är emellertid betydelsefull som källa för cefalosporin C-kärnan, 7-aminocefalospo- ransyra (7-ACA) med följande strukturformel ___.s _, . \, O - Hïtcïäçïí CHQ I C* 11k .fc-cH -obcH /f i , O \\\\C-7/ 2 5 I C00" Den sistnämnda visas här i form av sin zwitterjon, fastän även anjonaktiva och katjonaktiva salter kan bildas och användas. Anti- biotika, såsom cefalotin och cefaloridin, framställes av 7-ACA enligt kända metoder. Olika derivat av 7-ACA kan framställas genom att 7-am1- nogruppen av 7-AGA bringas att reagera med ett lämpligt acyleringsme- del, såsom en syra, en acylhalogenid, eller vilken som helst annan aktiv form, och/eller genom att acetoxigruppen på metylkolatomen i 3-ställningen ersättas med vilken som helst av de lämpliga nukleofila grupper, som nu är väl dokumenterade i litteraturen. Det är sålunda tydligt, att cefalosporin C är ett värdefullt, medelt jäsning erhållet antibiotikum och är av särskilt intresse som utgångsmaterial vid fram- ställningen av andra, starkare antibiotika.

Såsom angivits ovan omfattar föreliggande uppfinning bl.a. ett förfarande för rening av råa cefalosporin C-ämnen, som erhållits från, eller finns närvarande i vattenhaltiga jäsningsvätskor, i par- tiellt renade Jäsningsvätskor eller i "hartseluat". Detta uppnås del- vis genom omvandling av cefalosporin C-ämnet till motsvarande N-(4- -klorbensoyl)- eller N-(2,4-diklorbensoyl)-derivat, och det uppnås så- ledes före avspjälkningen av 7-aminoadipoylgruppen från cefalosporin- C-ämnet. pg Uttrycket "cefalosporin C-ämnen" användes här för att beteckna cefalosporin C och cefalosporin C-liknande föreningar, såsom desace- tylcefalosporin C, desacetoxicefalosporin C och 3-metyltiometylcefa- losporin C, vilka vart och ett kan framställas enligt kända jäsför- faranden. _ Det råa cefalosporin C-ämne, som behandlas enligt föreliggande uppfinning, kan föreligga i vilken som helst av flera olika former och/eller reningsstadier. Det kan ha formen av ett utvunnet orenat fast ämne, som innehåller polysackarid- och proteinhaltiga förorening- ar. Cefalosporin C-ämnet kan även förefinnas i sin vattenhaltiga jäs- ningsvätska. Denna vätska kan, men behöver ej, vara en Sådan, S0m 3 7315284-5 underkastats pH-justering, behandlats med ett eller flera filtrerings- hjälpmedel och filtrerats. Oavsett detta anses en sådan filtrerad vjäsnings- eller odlingsvätska för här ifrågavarande ändamål vara en obehandlad vätska. Det vattenhaltiga medium, som innehåller cefalo- sporin C-ämnen, kan vara en koncentrerad, metanolbehandlad jäsnings- eller odlingsvätska, som sedan betecknas som partiellt behandlad väts- ka. Det cefalosporin C-ämne, som skall behandlas, kan även förefinnas i ett eluat som erhållits efter behandling av en jäsningsvätska under användning av en eller flera hartspelare i och för partiell rening av cefalosporin C-ämnet. f f Den amerikanska patentskriften 3.160.631 beskriver acylering av natriumsaltet av cefalosporin C med efterföljande förestring av den resulterande produkten. Saltet löses i vatten och behandlas med na- .triumbikarbonat och aceton vid O°C. Den resulterande blandningen behand- las med bensoylklorid i aceton. Reaktionsblandningen extraheras sedan med kloroform och surgöres, och det N-acylerade cefalosporinet C ex- traheras med metylisobutylketon. N-acyl-cefalosporin C-produkten ut- vinnes genom avdunstning av lösningsmedlet och omvandlas sedan till motsvarande metyldiester.

De amerikanska patentskrifterna 3.234.222 och 3.234.223 beskriver den generella principen med användning av en skyddande grupp för den fria aminofunktionen hos en iminoeter av cefalosporin C under upp- spjälkningen av cefalosporin C. Ehuru dessa patentskrifter som en möjlig aminoskyddande grupp för iminoetern av cefalosporin C anger bensoyl, som är substituerad med en halogenatom, anger de dock icke 4-klorbensoyl- eller 2,4-diklorbensoylgrupperna och de anger heller icke någon användning av N-acylerade derivat vid rening av råa cefalo- sporin C-ämnen. ' Den amerikanska patentskriften 3.467.654 beskriver användning av aceton i det första filtratet av cefalosporin C-jäsningsvätskan för utfällning av föroreningar ur detta, frànfiltrering av för0reningar- na, adsorption av cefalosporin C ur det renade filtratet under använd- ning av ett anjonaktivt jonbytarharts och eluering av cefalosporin C ur hartset under användning av en sur buffert.

De amerikanska patentskrifterna 3.641.018 och 3.739.002 beskriver N-acylerade cefalosporin C-derivat, i vilka acylgruppen är en a-halo- gen- eller en d,a-dihalogen-C2-C¿-alkanoylgrupp. Fastän dessa derivat visar sig vara lösliga 1 organiska lösningsmedel, när de erhållits direkt ur en cefalosporin C-jäsningsvätska, visar de sig vara olösli- ga eller svårlösliga i lämpliga lösningsmedel när man försöker att 7315281: -5 Ä ånyo lösa dem i ett organiskt lösningsmedel.

Ett av de problem, som är förknippade med användningen av natrium- saltet av cefalosporin C som utgångsmaterial vid framställning av 7-aminocefalosporansyra (7-ACA) och slutligen av cefalotin- och/eller oefaloglycinantibiotika, kan tillskrivas det faktum, att vid utvin- ningen av natriumsaltet av cefalosporin C, som bildats genom jäsning, polysackarider med höga molekylvikter och proteiner finns närvarande som föroreningar. Dessa polysackarid- och proteinbiprodukter bildas sannolikt under jäsningen och har liknande löslighetsegenskaper som cefalosporin-C-natriumsaltet. Dessa löslighetsegenskaper försvårar avlägsnandet av föroreningar från cefalosporin C-ämnena. Ett sådant förfaringssätt som t.ex. membranfiltrering kunde användas med framgång för att avlägsna dessa föroreningar; detta arbetssätt är emellertid för närvarande icke anpassningsbart till filtrering av stora volymer jäsningsvätskor, som bildas vid industriell drift. Vidare är rening av cefalosporin C-natriumsaltet genom omkristallisering endast delvis framgångsrik beroende på att de använda betingelserna även medför utfällning av föroreningarna.

De polymera föroreningarna med hög molekylvikt, som här allmänt betecknas som "polysackarider", ger upphov till flera problem vid syn- tesen av cefalosporin-antibiotika, såsom cefalotin. Vid uppspjälkning av natriumsaltet av cefalosporin C till 7-ACA under användning av kloroform som lösningsmedel företas bl.a. en separering av en vatten- haltig fas (som innehåller 7-ACA) från den organiska (kloroformèfasen.

Närvaron av "polysackariderna" försvårar denna separering, då "polyf sackariderna" har en benägenhet att stabilisera en kloroform-vatten- -emulsion. Ett senare, nyligen utvecklat uppspjälkningsförfarande med tetrahydrofuran uppfanns för att kringgå svårigheten med emulsionen; detta nya förfarande baserar sin framgång på det faktum, att ingen separering mellan organisk fas och vattenhaltig fas är nödvändig. Er- farenheten visade emellertid, att tetrahvdrofuranförfarandet enbart skjuter upp problemet till det nästföljande steget, eftersom en viss svårighet fortfarande föreligger vid acyleringen av 7-AGA, som erhållits enligt tetrahydrofuranförfarandet.

Det finns således fortfarande ett behov av ett förfarande för undvikande av närvaron av skadliga mängder "polysackarider" 1 cefalo- sporin C-ämnen. Ett sådant förfarande skulle förbättra cefalosporinf omvandlingarna, exempelvis raden av upparbetningssteg från cefalospo- rin C till cefalotin. En möjlighet att lösa detta problem ligger i att finna derivat av cefalosporin C-ämnen, som har löslighetsegenska- per, vilka skiljer sig markant fràn löslighetsegenskaperna av "poly- 7315284 -5 5 sackarid"-föroreningarna, exempelvis derivat, som är lösliga i lämp- liga organiska lösningsmedel, men olösliga i vatten.

Sökandet efter ett cefalosporin C-derivat, som har dessa önskade egenskaper, har icke varit lätt, och upptäckten av ett sådant lämpligt derivat var helt oväntad. Olika N-(skyddade)-cefalosporin C-derivat framställdes och undersöktes med hänsyn till en möjlig användning som mellanprodukter vid förfarandet för framställning av 7-aminocefalo- sporansyra (7-AGA) ur cefalosporin C. De flesta av sådana undersökta ämnen bildar emellertid icke så. lätt det önskade kristallina deriva- tet ur ett system av vatten och organiskt lösningsmedel. Sålunda bil- dar exempelvis de fria syraformerna av N-(p-nitrobensoyl)-cefalospo- rin C, N-(p-toluensulfonyl)-cefalosporin C, N-(bensensulfonyl)cefalo- sporin C och N-(p-klorbensensulfonyl)cefalosporin C icke kristallina produkter. Dessutom kristalliserar de fria syraformerna av N-propio- nyl-, N-bensoyl- och N-kloracetyl-cefalosporin C icke lätt ur ett system av vatten och organiskt lösningsmedel. Emellertid upptäcktes vissa cefalosporin C-derivat, som uppvisar önskvärda löslighetsëgëñ:_""“ skaper, lämpliga för att de med fördel skall kunna användas i det enligt uppfinningen avsedda separeringsförfarandet och därmed i för- faranden för framställning av 7-ACA och/eller liknande 7-aminocefa- losporinföreningar. Dessa derivat är lösliga i vanliga organiska lösningsmedel och olösliga i vatten.

Ett ändamål med uppfinningen är således att åstadkomma ett för- bättrat förfarande för separering av cefalosporin C-ämnen från po- lysackarid- och proteinhaltiga föroreningar under bildning av utval- da cefalosporin C-derivat, Den härvid skeende omvandlingen av cefa- losporin C-ämnena till dessa utvalda derivat möjliggör tack vare olika löslighetsegenskaper ett lätt avskiljande av bl.a. "polysac- karid"-föroreningar från derivaten av cefalosporin C-ämnen. Det förbättrade förfarandet möjliggör dessutom kristallisering av deri- vaten av cefalosporin C-ämnen, som är fria från förorenande "poly- sackarider", och upparbetning av derivaten till att bilda 7-AGA och/eller andra 7-aminocefalosporiner.

Närmare bestämt ger föreliggande uppfinning ett förbättrat förfarande för separering av ett cefalosporin C-ämne med formeln I 0 s _ H e - H N-cH- cH -c-NH-cH-crf * 2 1 ( 2); , i QHQ (I) coon/I c -N\ JC-CHQ-R Of \\\\C 4! n731s2s@-s 6 vari varje M betecknar väte eller en alkalimetall, och R betecknar väte eller acetoxi, från polysackarid- och proteinhaltiga förorening- ar, vilket förfarande innebär att nämnda separering utföres genom bildning och isolering av cefalosporin C-ämnet i form av nedanstående N-acylcefalosporin C med formeln II, i det att a) det orenade cefalosporin C-ämnet i formeln I i vatten, som innehåller aceton och innehåller nämnda föroreningar, bringas att reagera med en 2,H-diklorbensoylhalogenid eller en Ä-klorbensoylha- logenid, varvid bildas nämnda N-acylcefalosporin C med formeln II \ i f S c1\/_/E\>ø<;-NH-<:H-(cHgë-Él-NH-cu-CK ctna , (II) .\ i . x ooH _t~ h., _ _ O, \C//c 0112 R toon _______________________ . vari X betecknar väte eller klor och R har ovan angivna betydelser, vilken förening är löslig i det vätskeformiga mediet av vatten och aceton; b) olösliga ämnen avskiljes från det vätskeformiga vatten- acetonmediet; c) man sänker pH-värdet av det vätskeformiga och från olös- liga ämnen fria vatten-acetonmediet till omkring pH 1,5-3,5 i och för kristallisering av N-acylcefalosporin C-ämnet; d) N-acylcefalosporin C-ämnet separeras; e) det separerade N-acylcefalosporin C-ämnet löses i ett vätskeformigt vatten-acetonlösningsmedel, som innehåller upp till omkring 15% vatten; f) olösliga ämnen avskiljes från den vätskeformiga blandning- en, som erhållits i steg e); g) den Vätskeformiga fraktionen från steg f) behandlas med vatten i och för utfällning av N-acylcefalosporin C-ämnet; och h) det utfällda N-acylcefalosporin C-ämnet separeras från den vätskeformiga blandningen.

Vid den fortsatta upparbetningen behandlas föreningen med formel II eller ett kinolinsaltdflávat därav så att 7-acylsídokedjan spjälkas och föreningen med 7-aminocefalosporinkärnan bildas.

Föreningar med formeln II eller deras motsvarande kinolinsal- ter är antagligen nya. 7315284-5 7 Enligt uppfinningen upptäcktes, att N-(ü-klorbensoyl)- och N- (2,U-diklorbensoyl)-derivaten av cefalosporin C-ämnena med ovan angivna formel II i form av sina fria syror, eller kinolinsalter av dessa, har egenskaper som skiljer sig markant från dem av cefalo- sporin C-ämnen och deras motsvarande salter. Det har speciellt upptäckts, att orena cefalosporin C-ämnen, som innehåller förore- ningar härrörande från jäsningsvätskor, kan renas enligt ovan angiv- na följd av arbetssteg. ~ 2,N-diklorbensoylhalogeniden eller Ä-klorbensoylhalogeniden är företrädesvis bromiden eller kloriden och mest föredras kloriden. Éalogeniden bringas i allmänhet i omkring 5-15 mol% överskott att reagera med cefalosporin C-ämnet i det aceton- och vattenhaltiga mediet.

Acetonen och vattnet användes vanligen i inbördes ungefär lika stor volym. En blandning, som innefattar ett överskott av antingen vattnet eller acetonen av upp till omkring 10:l, räknat på volym- basis, kan emellertid också användas.

Acyleringen kan genomföras med tillsats av en alkalimetall- hydroxid, speciellt natriumhydroxid, till reaktionsblandningen. Acy- leringen genomföras företrädesvis vid en temperatur av mellan om- kring 0°C och omkring rumstemperatur, och acyleringsmedlet sättes till den förut beredda alkaliska blandningen, som under tillsätt- ningen hålles vid den önskade reaktionstemperaturen och vid ett al- kaliskt pH, som i allmänhet ligger mellan omkring 9,0 och omkring 9,5. pH-värdet upprätthålles under tillsättningen av acyleringsmed- let genom ytterligare tillsats av ett alkaliskt reagens efter behov.

Det alkaliska reagenset kan företrädesvis vara en tertiär amin, såsom trietylamin, eller en alkalimetallhydroxid, såsom natrium- hydroxid. Företrädesvis är det alkaliska reagenset natriumhydroxid.

Sedan derivatet av cefalosporin C-ämnet bildats, sänkes reak- tionsblandningens pH företrädesvis från omkring 9,0-9,5, som upp- rätthölls under acyleringen, till omkring 5,5-6,5. Under dessa be- tingelser stannar derivatet av cefalosporin C-ämnet i lösning, medan en större andel eller huvuddel av föroreningarna, som omväxlande betecknas som "polysackarider" eller "polymera föroreningar", för- blir olösliga och lätt kan avlägsnas.

Föroreningarna avskiljes från derivatet II av cefalosporin C- ämnet enligt vilken som helst av olikartade metoder och förlopps- följder, som var och en är en del av hela reningsförfarandet enligt uppfinningen. Det väsentliga hos uppfinningen ligger i upptäckten 731528l|~5 8 av skillnaden mellan löslíghetsegenskaperna hos å ena sidan derivat II av cefalosporin C-ämnen och å andra sidan de polysackarid- och proteinhaltíga föroreníngarna.

En första behandling av det aceton- och vattenhaltiga medium, som innehåller derivatet II jämte föroreningar, kan sålunda t.ex. innebära separering av föroreningar från derivatet av cefalosporin C-ämne medelst exempelvis filtrering, dekantering, centrifugering eller filterpressbehandling.

Derivatet II utvinnas sedan ur den partiellt renade lösningen genom sänkning av blandningens pH till ett surare område, nämligen omkring pH 1,5-3,5. Avskiljandet av derivatet kan underlättas genom att vatten sättes till blandningen med sänkt pH i och för minskning av derivatets löslighet i mediet. Derivatet II kan isoleras som sådant, det vill säga som fri syra, eller som ett additionssalt av denna, t.ex. som kinolinsalt av derivatet II.

Kinolinsyraadditionssaltet är lätt att framställa genom att kinolin helt enkelt sättes till den blandning, som innehåller N-acyl- derivatet av cefalosporin C-ämnet som fri syra. En ekvimolär mängd kinolin räknat på cefalosporin C-ämnet är tillräcklig. Företrädes- vis användes emellertid ett överskott, vanligtvis av omkring 1,5- 12 mol kinolin, per mol N-acylcefalosporin C-ämne.

För att ytterligare föroreningar, som kan finnas närvarande, skall avlägsnas, löses det sålunda utvunna derivatet av cefalosporin C-ämnet i ett vätskeformigt vatten-acetonlösningsmedel, innehållande upp till omkring 15% vatten, i och för omkristallisering. Om deri- vatet föreligger i form av sitt kinolinsalt, kan det lösas som det är eller det kan så behandlas, att det i lösningsmedlet föreligger i form av sin motsvarande fria syra.

Vid denna omkristallisering förblir resterande mängder av föroreningar olösliga och är lätta att avlägsna enligt någon av ovan angivna metoder. Derivatet av cefalosporin C-ämnet utfälles ur den så renade lösningen genom tillsats av vatten och isoleras i form av sin fria syra eller sitt kinolinsalt. När denna speciella arbets- följd användes, föredrar man att cefalosporin C-ämnets derivat har formen av fri syra.

De cefalosporin C~ämnen, vilka användes såsom utgângsmaterial, vidförfarandet enligt uppfinningen kan föreligga som fri syra, i vilket fall M i formeln I betecknar väte. Alternativt och företrä- desvis föreligger cefalosporin C-ämnet som alkalimetallsalt, t.ex. 731528lr-5 9 litium-, natrium- eller kaliumsalt. na vid förfarandet enligt uppfinningen är sådana, att cefalosporin C-ämnet som utgångsmaterial föreligger i form av natriumsalt.

Cefalosporin C-derivat med formeln II, vari R betecknar acet- oxi, kan framställas i utmärkt utbyte ur alkalimetallsaltet, före- trädesvis natriumsaltet, av cefalosporin C. När natriumsaltet av cefalosporin C innehåller relativt litet "polysackarid"-förorening, kan det eller dess derivat med strukturformeln II spjälkas till 7-AGA i kloroform utan att besvärliga emulsioner bildas. Om emel- lertid "polysackarid"-halten i natriumsaltet av cefalosporin C eller dess orenade derivat med formeln II är förhållandevis stor, upp- Mest föredras, att betingelser- står betydande problem med emulgering efter uppspjälkningen i ett klo- roformmedium. Omkristallisering av cefalosporin C-derivatet II under användning av betingelser, som utnyttjar löslighetsskillnaderna mellan derivatet och "polysackarid"-föroreningarna, ger emellertid ett materi- al, som kan uppspjälkas till 7-ACA i kloroform utan betydande svårig- heter på grund av emulsionsbildning. Ett sådant material erhålles oavsett mängden "polysackarid" som finns närvarande i det cefalosporin C-utgàngsmaterial, av vilket cefalosporin C-derivatet erhållits.

Ytterligare fördelar som uppnås med användningen av cefalosporin C-ämnenas_derivat är följande: l. Ökade utbyten från cefalosporin C-ämnen vid spjälkningen till 7-aminocefalosporiner. 2. Utmärkt kvalité av de framställda 7-aminocefalosporinerna, så att problem vid den efterföljande acyleringsreaktionen begrän- sas till ett minimum eller helt undvikes. _ 3. Minskade mängder föroreningar i mellanprodukterna, som fram- ställts i arbetsföljden för framställning av det slutliga antibiotikumet. 4. Ökade utbyten vid acyleringen av 7-aminocefalosporinerna till det slutliga antibiotikumet. Det har speciellt upptäckts, att utbytet vid acylering av 7-ACA till cefälotin ökar från omkring 79%, när den gemomföres 1 närvaro av "polysackarid"-föroreningar, till om- kring 92%, när sådana föroreningar 1 huvudsak avlägsnats från 7-ACA- -utgàngsmaterialet.

Uppfinningen àskàdliggöres ytterligare i följande detaljerade exempel, vilka icke är avsedda att begränsa uppfinningens ram.

Exempel l. 60 g (128 mmol) natriumsalt av cefalosporin C i 300 ml avJoniserat vatten omröres, tills upplösningen är fullständig. Omkring 300 ml aceton tillsättes. Blandningen omröres och avkyles till 5°C, varvid_en_fällning av natriumsaltet_av cefalosporin C separerar. 7315284-5 10 Blandningens pH justeras till mellan 9,0 och 9,5 genom tillsats av en 20-procentig natriumhydroxid-vattenlösning. Till den resulterande lösningen, som hålles vid omkring 500, sättes 19,7 ml (141 mmol , 10% överskott) 2,4-diklorbensoylklorid under omrörning under en tid av 50-55 minuter. Under tillsättningen av 2,4-diklorbensoylkloriden hål- les blandningens pH vid 9,0-9,5 genom tillsats efter behov av en 20- procentig natriumhydroxid-vattenlösning. Efter avslutad tillsätt- ning av 2,4-diklorbensoylklorid omröres blandningen 10 minuter vid 5°C eller tills pH-värdet under 2 minuter håller sig i huvudsak kon- stant vid 9,0-9,5. Blandningen surgöres sedan med koncentrerad salt- syra till pH 6,5. Den resulterande blandningen behanflas med 500 ml vatten och därefter med 5-10 g av ett filterhjälpmedel ("Hyflo", re- gistrerat varumärke). Blandningen filtreras genom filterhjälpmedlet (omkring 6-15 mm tjockt på en Büchnertratt av storlek 5). Fällningen sköljes med omkring 50 ml vatten. Filtratet och sköljningsvätskan slås ihop, omröres och värmes till 20°C. Koncentrerad saltsyra till- sättes i och för justering av blandningens pH till omkring 5,0. Lös- ningen ympas med kristaller av produkten, som erhållits från ett li- tet laboratorieprov, och pH Justeras till 2,7 med koncentrerad salt- syra. Blandningen omröres 50 minuter vid 200-2500, under vilken tid N-(2,4-diklorbensoyl)cefalosporin C kristalliserar (först separerar det som olja och sedan stelnar oljedropparna). Blandningen surgöres med koncentrerad saltsyra till pH 1,8, omröres omkring 2-5 minuter, och 500 ml vatten tillsättes. Den vatten och organiskt lösningsmedel innehållande blandningen omröres 2-5 minuter, avkyles till 500 och omröres en timme vid O-500. Produkten avfiltreras, sköljes med om- kring 500 ml vatten och vakuumtorkas vid 4500. 68,0 g produkt erhål- les (89,l % utbyte).

En blandning av 20,0 g av N-(2,4~diklorbensoyl)cefalosporin C-produkten i 180 ml aceton (laboratoriefkvalitet) omröres, tills en homogen blandning erhållits, och 9,0 ml avjoniserat vatten tillsättes sedan. Blandningen omröres, tills produkten lösts (omkring l-15 minu- ter). Till den resulterande lösningen sättes 2 g filterhjälpmedel ("Hyflo", registrerat varumärke) och 2 g avfärgningsträkol (Darco).

Blandningen omröres 5 minuter och filtreras sedan genom en filterdyna (omkring l g i en Büchnertratt av storlek 0). Filtreringen kan uppre- pas under utelämnande av avfärgningskolet, tills filtratet är klart.

Den mindre mängden fällning sköljes med upp till 20 ml aceton. Filtra- tet och sköljvätskorna slås ihop och omröres tillsammans med 250 ml av- joniserat vatten. Blandningen avkyles till 2500, och avjonßærat vatten tillsättes, tills ett första spår av grumlighet stannar kvar (sedan 7315284-5 ll omkring 75-110 ml vatten tillsatts). Blandningen ympas sedan med 0,50 g omkristalliserad produkt. Blandningen omröres 50 minuter vid rums- temperatur (25-25°C). Omkring 550 ml vatten tillsättes under omrörning under en tid av 40 minuter. Efter avslutad vattentillsättning avkyles blandningen och hålles en timme vid 500. Den resulterande blandningen filtreras, tvättas med vatten och torkas i vakuum vid 4500. Utbytet av N-(2,4-diklorbensoyl)cefalosporin C är 16-16,5 Q. Smältpunkt 156- l4l°C (sönderdelning).

Exempel 2. 60 g (154 mmol) natriumsalt av cefalosporin C omrördes i 500 ml vatten, tills det lösts. Omkring 150 ml aceton tillsattes, och lösningen omrördes och avkyldes tiD.10°C. Lösningens pH justerades till 9,0 med en vattenhaltig 20-procentig natriumhydroxidlösning, och 17 ml (154 mmol) 4-klorbensoylklorid tillsattes. Blandningen omrördes 30 minuter vid l0-l5°C, under vilken tid vattenhaltig 20-procentig na- triumhydroxidlösning tillsattes i tillräcklig mängd för att halla blandningens pH vid ungefär 9,0. Omkring 1050 ml vatten tillsattes se- dan i en portion av 800 ml och en portion av 250 ml,och blandningens pH Justerades till 1,9 med koncentrerad saltsyra.Blandningen ympades msikristaller av N-(4-klorbensoyl)cefalosporin C och avkyldes på ett isbad. Blandningen kyldes (omkring 5°C)över natten. Det kristallina ämnet i blandningen avfiltrerades, sköljdes med vatten och torkades i vakuum vid 4000. Den kristallina N-(4-klorbensoyl)cefalosporin C-pro- dukten vägde 55,7 g.

Detta partiellt renade N-(Ä-klorbensoyl)cefalosporin C renas yt- terligare genom omkristallisering enligt det i exempel l åskàdliggjor- da förfaringssättet. Smältpunkt 155-14000 (sönderdelning).

Exempel 5. ll,8 g (20 mmol) N-(2,4-diklorbensoyl)cefalosP0P1n C OMPÖP- des i 150 ml av amylen-inhiberad kloroform. Till denna blandning sat- tes 5,7O ml (48 mmol) kinolin och 8,80 ml (95 mmol) N,N-dimetylacet- amid. Blandningens temperatur steg till omkring 2800. Blandningen av- kylaos till 15°c,ooh 9,60 m1(135 mmol) oootyikiorio tillsattes snabbh- Blandningens temperatur steg till 2300. Blandningen omrördes M0 minu- ter vid omkring âfl-2500, under vilken tid N-(2,4-diklorbensoyl)cefalo- sporin C löstes. Blandningen avkyldes sedan till -5500, och 26 ml (162 mmol) N,N-dietylanilin tillsattes. Blandningen kyldes igen till -2500, och 9,8 g (47 mmol) fosforpentaklorid tillsattes. Blandningen omrördes 50 minuter vid -1500 och avkyldes till -HOOC, och 54 ml pro- pylenglykol tillsattes. Den resulterande blandningen omrördes 1,5-2 timmar vid o°c ooh ovkyidos till -15°c, ooh 100 mi is ooh vatten tiil- sattes. Den vattenhaltiga fasen skildes från den organiska fasen, och 1315234-s 12 den organiska fasen extraherades med 20 ml vatten. De vattenhaltiga faserna slogs ihop och deras pH justerades till 3,5 med koncentrerad ammoniumhydroxid. Ett fast ämne föll ut och avfiltrerades, tvättades i angiven ordningsföljd med vatten, metanol och aceton samt torkades.

Den gav 4,8-5,0 g 7-aminocefalosporansyra.

Exemgel 4.

Enligt förfarandet i exempel l löses natriumsaltet av desacetoxi- cefalosporin C (en förening med formeln I, vari R betecknar väte) i en vatten-aceton-blandning och behandlas med 2,4-diklorbensoylklorid, varvid N-(2,4-diklorbensoyl)desacetoxicefalosporin C-syra bildas. Det- ta derivat renas enligt det i exempel l angivna förfarandet. Den re- nade syraprodukten bildar efter behandling med fosforpentaklorid i närvaro av pyridin iminokloriden; iminokloriden behandlas med en alko- hol eller alkandiol och bildar iminoetern; iminoetern behandlas med vatten, varvid sidokedjan spjälkas och 7-aminodesacetoxicefalosporan- syra (7-ACA) bildas. Denna sistnämnda förening av cefalosporinkärnan omnämnes i den amerikanska patentskriften 5.124.576 och kan användas för en enligt kända acyleringsförfaranden verkställd framställning av cefalosporin-antibiotika, såsom cefalexin och cefradin.

Exemgel 5. l liter cefalosporin C-haltigt eluat från harts (enligt UV-bestäm- ning innehållande 48,2 mg/ml och enligt nikotinamidmetoden innehållan-' de 58,46 mg/ml) med pH 5,5 avkyldes till +6°C. Till blandningen sattes 200 ml aceton, och temperaturen steg till l0°C och pH-värdet till 5,9.

Blandningens pH justerades till 9,5 genom tillsats av 22 ml 25-procen- tig vattenhaltig natriumhydroxid. Det resulterande cefalosporin C, natriumsaltet, acylerades under en tid av 20 minuter genom tillsats av 51,4 ml (224 mmol) 2,4-diklorbensoylklorid. Blandningens pH hölls vid omkring 9,5 genom samtidig tillsats av 55 ml 25-procentig vatten- haltig natriumhydroxid. Vid slutet av tillsättningen hade temperaturen av reaktionsblandningen stigit till 2200. Blandningens pH justerades till 5,0 genom tillsats av 20 ml 25-procentig vattenhaltig svavelsyra.

Till blandningen sattes 20 g filterhjälpmedel, och den resulterande blandningen filtrerades. Filtratets pH sänktes till 5,4 genom till- sats av 45 ml 25-procentig vattenhaltig svavelsyra. Till den då erhåll- na surgjorda blandningen sattes långsamt under 10 minuter 28,4 ml (336 mmol) kinoiin, och biananingens pH hölls under tiiisäuzningen vid 5,5-5,5 genom samtidig tillsats av 27 ml 25-procentig vattenhaltig svavelsyra. Den resulterande blandningen ympades med N-(2,4-diklor- bensoyl)cefalosporin C, kinolinsalt, som framställts tidigare i liten 7315284-s 13 skala. Blandningen omrördes sedan 50 minuter vid rumstemperatur och 165 minuter vid 5°C. Blandningen filtrerades sedan och filterkakan tvättades med l liter kallt vatten. Kakan torkades vid 4000 i en vakuumugn och gav 75 g (95,6 % utbyte) N-(2,4-diklorbensoyl)cefalo- sporin C, kinolinsalt (renhetsgrad 87,1 %).Smä1tpunkt 75-8200.

Exempel 6.

Till en blandning av 100 ml aceton, 15 ml N,N-dimetylacetamid och 2 ml kinolin sattes l4,7 g N-(2,4-diklorbensoyl)cefalosporin C, kino- linsalt, som erhållits enligt exempel 5. Blandningen omrördes omkring 50 minuter, och 2 g filterhjälpmedel tillsattes. Den resulterande blandningen filtrerades, och vikten av den torkade filterkakan var \ 2,72 g. Filtratet indunstades till en liten volym och överfördes till en standard-uppspJälkningsanordning under tillsättning av 150 ml metylenklorid. lO ml acetylklorid tillsattes, och blandningens temperatur steg från 22° till 26°C. Blandningen omrördes 20 minuter och avkyldes till -l5°C, och 26 ml N,N-dietylanilin tillsattes.

Till blandningen, som hölls vid omkring ~l5°C, sattes 9,8 g fosforpen- taklorid, och blandningen omrördes 75 minuter. 25 ml propylenglykol tiiieettee, een tienaningene temperatur steg från -15° till +2°o.

Blandningen omrördes 2,5 timmar vid omkring +5°C. Sedan sattes till blandningen 100 ml isvatten. Blandningen omrördes 10 minuter, den vattenhaltiga och den organiska fasen skildes från varandra och pH- värdet hos den vattenhaltiga fasen höjdes från 0,7 till 3,5 genom tillsats av 15,5 ml koncentrerad ammoniumhydroxid. Den vattenhaltiga blandningen omrördes omkring 30 minuter och filtrerades sedan. Fil- terkakan tvättades med 25 ml kall, 50-procentíg vattenhaltig metanol och därefter med 50 ml kall metanol. Filterkakan torkades i vakuum vid 4000 över natten och gav 2,75 g 7-aminocefalosporansyra.

Exempel 7. _ Man beredde en blandning av 50 g orenat cefalosporin C (enligt Uvqspektralanalys innehållande 85,5 mmol = 55,4 g aktivt material) i 500 ml vatten. Blandningen omrördes l0 minuter vid rumstemperatur.

Till blandningen sattes 100 ml aceton, och den resulterande bland- gningens pH var 7,8. Blandningens pH justerades till 9,5 genom till- sats av 6 ml 25-procentig vattenhaltig natriumhydroxid. Det resulte- rande cefalosporin C, natriumsaltet, acylerades genom tillsats av 24 ml (171 mmol) 2,4-diklorbensoylklorid. Tillsatsen skedde under en tid av 20 minuter, och blandningens temperatur steg till 29°C. Under tillsättningen hölls blandningens pH vid omkring 9,5 genom tillsats av 25 ml 25-procentig vattenhaltig natriumhydroxid. Den resulterande a 7315284-5 lü blandningen omrördes omkring 10 minuter, medan pH stannade vid om- kring 9,5. Blandningens pH justerades till 5,0 genom tillsats av 3 ml 5-procentig vattenhaltig svavelsyra. Till den resulterande blandningen sattes 10 g filterhjälpmedel, och blandningen filtrerades. Filtratet var grumligt och dess pH sänktes till 3,5 genom tillsats av 25-procen- tig vattenhaltig svavelsyra. Till den resulterande blandningen sattes -långsamt 25 ml (212 mmol) kinolin, och blandningens pH hölls under tillsättningen vid 3,3-3,5 genom samtidig tillsats av 25-procentig vattenhaltig svavelsyra. Den slutliga blandningens pH var 3,3. Bland- ningen ympades genom tillsats av kristaller av N-(2,4-diklorbensoyl)ce-A falosporin C, kinolinsalt. Blandningen omrördes 20 minuter vid rums- temperatur samt 30 minuter i ett-isbad. Blandningen filtrerades, och filterkakan tvättades med 1,5 liter isvatten. Den resulterande kakan torkades 40 timmar i vakuum vid 4000 och gav 58 g (8l,0 % utbyte) N-(2,4-diklorbensoyl)cefalosporin C, kinolinsalt (renhetsgrad 94,1 %)¿ : smäitpunkt 75-82°c .

Exempel 8.

Till en blandning av 150 ml metylenklorid, 15 ml N,N-dimetylaceta- I mid och 2 ml kinolin sattes 14,7 g N-(2,4-diklorbensoyl)cefalosporin C, kino1insa1t,som erhållits enligt exempel 7. Blandningen omrördes omkring 30 minuter. Sedan sattes till blandningen 2 g filterhjälpme- del, och blandningen filtrerades. Den torkade filterkakan, som erhölls, vägde 3,51 g. Filtratet överfördes sedan till en standard-uppspjälk- ningsanordning, och 10 ml acetylklorid tillsattes, under vilken tid temperaturen steg från 18° till 24°C. Blandningen omrördes 20 minu- _ter, avkyldes till -10°C, och 26 ml N,N-dietylanilin tillsattes.

Blandningens temperatur hölls under tillsättningen vid omkring -6°C. 9,8 g fosforpentaklorid tillsattes, och blandningen omrördes 50 minu- ter vid omkring -l5°C. 25 ml propylenglykol tillsattes, och blandning- ens temperatur steg från -l5° till +l1°C. Blandningen avkyldes till omkring 5°C och omrördes 2 timmar. Sedan sattes till blandningen 100 ml isvatten, och blandningen omrördes 10 minuter, separerade i en vattenhaltig och en organisk fas, och den vattenhaltiga fasens pH höjdes från 0,9 till 3,4 genom tillsats av 12 ml koncentrerad ammonium- hydroxid. Blandningen omrördes 30 minuter och filtrerades. Filter- kakan tvättades med 25 ml kall 50-procentig vattenhaltig metanol och därefter med 50 ml kall metanol. Filterkakan torkades i vakuum vid 4000 över natten och gav 3,36 g 7-aminocefalosporansyra.

Claims (1)

1. 7315284-s 15 P a t e n t k r a v Förfarande för separering av ett cefalosporin C-ämne med formeln: o c///,/ s\\\ H2N-cH-(cH2)3-c-NH-ïH- H one coon bc__N.\A ////9-cH2-R 0' \\\ /// COOM (I) vari varje M betecknar väte eller en alkalimetall, och R be- tecknar väte eller acetoxi, från polysackarid- och protein- haltiga föroreningar, k ä n n e t e c k n a t a v att nämnda separering utföres genom bildning och isolering av cefalosporin C-ämnet i form av nedanstående N~acylcefalos- porin c med formeln II, 1 det att a) det orenade cefalosporin C-ämnet med formeln I i vatten, som innehåller aceton och innehåller nämnda förore- ningar, bringas att reagera med en 2,4-diklorbensoylhalogenid eller en 4-klorbensoylhalogenid för att bilda nämnda N-acyl- cefalosporin C med formeln II: 0 0 S f' r| / \\__ c1.«f š>~é-NH-cH-(cH2)3- -NH-CH-ca ~\cn2 . "14 V : - \ I x coon p-~ .e /// c-cH2-R (Ef) o '~\C- i coon vari X betecknar väte eller klor och R har ovan angivna be- tydelser, vilken förening är löslig i det vätskeformiga vat- ten-acetonmediet; b) olösliga ämnen avskiljes från det vätskeformiga vat- ten-acetonmediet; c) man sänker pH-värdet av det vätskeformiga och från olösliga ämnen fria vatten-acetonmediet till omkring pH 1,5- 3,5 i och för kristallisering av N~aeylcefalosporin C-ämnet; d) N-acylcefalosporin C~ämnet separeras; 7315284-5 16 e) det separerade N-acylcefalosporin C-ämnet löses i ett vätskeformigt vatten-acetonlösningsmedel, som innehåller upp till omkring 15 % vatten; f) olösliga ämnen avskiljes från den vätskeformiga blandningen, som erhållits 1 steg e); g) den vätskeformiga fraktionen från steg f) behand- las med vatten 1 och för utfällning av N-acylcefalosporin C-ämnet; och h) det utfällda N-acylcefalosporin C-ämnet separeras från den vätskefofmiga blandningen. ÅNFÖRDA PUBLIKATIONER: Sverige patentansökníngarna 3 254/73, 9 001/73, 372 274 (CO7d 99/24)