Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych N-acylowych pochodnych cefalospory- ny C. Nowe pochodne jak N-(4-chlorobenzoilo)- i N-(2,4-dwuchlorobenzoilo) cefalosporyna C znaj¬ duja zastosowanie w procesach oddzielania cefa- losporyny C od polisacharydowych i proteinowych zanieczyszczen, znajdujacych sie w brzeczkach fermentacyjnych.Mozna je stosowac jako zwiazki wyjsciowe w procesie rozpadu, prowadzacym do otrzymywania pochodnych typu 7-aminocefalosporyn, z których wytwarza sie antybiotyki cefalosporynowe, takie jak cefalotyma, cefalorydyna, cefaaleksyna.W procesie fermentacji otrzymuje sie cefalospo- ryne C o wzorze 3, w którym R oznacza grupe HOOC-CH(NH2)-(CH2)3, lub inaczej kwas 7-(5-ami- noadypoilo) cefalosporanowy.Zwiazek ten wykazuje slaba aktywnosc anty- biotyczna, jakkolwiek jest wazna substancja wyj¬ sciowa do wytwarzania zwiazków o szkielecie ce- falosporyny C, a w szczególnosci kwasu 7-amino- cefalosporanowego (7-ACA) o wzorze 4. We wzo¬ rze 4 kwas 7-aminocefalosporanowy wystepuje w formie jonu obojnaczego, chociaz mozliwe jest otrzymywanie i stosowanie soli aninowych i ka¬ tionowych. Antybiotyki takie jak cefalosporyna i cefalorydyna wytwarza sie z 7-ACA znanymi me¬ todami. Róznego typu pochodne 7-ACA otrzymu¬ je sie w wyniku traktowania grupy 7-aminowej kwasu 7 - aminocefalosporanowego odpowiednim srodkiem acylujacym, takim jak kwas, halogenek acylowy, lub innymi aktywnymi zwiazkami i/lub za pomoca podstawienia grupy acetoksylowej przy weglu metylowym, w polozeniu 3, jedna z od¬ powiednich nukleofilowych grup opisanych w li¬ teraturze. Stwierdzono, ze cefalosporyna C jest wartosciowym antybiotykiem otrzymanym w pro¬ cesie fermentacji i stanowi cenny material wyj¬ sciowy do wytwarzania innych bardziej aktyw¬ nych antybiotyków.Wytwarzane sposobem wedlug wynalazku nowe N-acylowe pochodne cefalosporyny C, o wzorze 2, w którym X oznacza atom wodoru lub chloru, a R oznacza atom wodoru, grupy acetoksylowa, hydroksylowa lub metylotio, sa uzyteczne do o- czyszczania surowych zwiazków typu cefalospo¬ ryny C znajdujacych sie w wodnych brzeczkach fermentacyjnych, czesciowo oczyszczonych brzecz¬ kach fermentacyjnych lub w eluatach z zywicy jonitowej.Oczyszczanie zwiazków typu cefalosporyny C po¬ lega na przeprowadzeniu ich w odpowiednie po¬ chodne N(4-chlorobenzoilo)- lub N-(2,4-dwuchlo- robenzoilo)-cefalosporyny C, które z kolei poddaje sie reakcji oddzielania grupy 7-aminoadipoilowej od czasteczki zwiazku cefalosporyny C.Okreslenie „zwiazki typu cefalosporyny C" o- znacza cefalosporyne C i podobne do cefalospo¬ ryny C zwiazki, takie jak dezacetoksycefalospo- ryna C, dezacetylocefalosporyna C, 3-metylotiome- 9157791577 3 - tylocefalosporyna C, z których kazda wytwarza sie w znanych ogólnie procesach fermentacyj¬ nych. Sposobem wedlug wynalazku do reakcji wprowadzac mozna surowy zwiazek typu cefalo- sporyny C, w kazdej z wymienionych postaci i/ 5 lub w kazdym stopniu oczyszczania, na przyklad w postaci surowego ciala stalego, zawierajacego zanieczyszczenia polischarydowe lub proteinowe lub w postaci wodnej fermentacyjnej brzeczki, przy czym pH brzeczki mozna lub nie uprzednio zmienic, dodac do roztworu fermentacyjnego je¬ den lub wiecej materialu ulatwiajacych saczenie i saczyc. T^yrn niemniej, w ten sposób przygoto¬ wana brzeczka bedzie w dalszej czesci opisu na¬ zywana brzeczka nie przerobiona. Czesciowo prze¬ robiona brzeczka jest roztwór otrzymany w wy¬ niku zatezenia brzeczki fermentacyjnej i dodania 'metanolu. Zwiazki typu cefalosporyny C mozna stosowac do dalszego przerobu w postaci eluatu z zywicy jonitowej, który otrzymuje sie stosujac do oczyszczania brzeczki jedna lub kilka kolumn wy¬ pelnionych zywica jonitowa.Sposobem wedlug opisu patentowego Stanów Zjednoczonych .Ameryki nr 3160 361, sól sodowa cefalosporyny C rozpuszcza sie w wodzie, doda¬ je do otrzymanego roztworu w temperaturze 0°C kwasny weglan sodowy i aceton oraz chlorek ben¬ zoilu w acetonie. Mieszanine reakcyjna ekstra¬ huje sie chloroformem, zakwasza i ekstrahuje pro¬ dukt w postaci pochodnej N-acylowej cefalospo¬ ryny C, ketonem metyloizobutylowym. Produkt ten, po odparowaniu rozpuszczalnika, poddaje sie reakcji estryfikacji i otrzymuje sie odpowiedni metylowy dwuester. Ogólna metoda stosowania grup zabezpieczajacych wolne grupy aminowe e- terów iminowych cefalosporyny C, w trakcie roz¬ padu czasteczki cefalosporyny C, podana jest w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ame¬ ryki nr 3234222 i 3234223. Jakkolwiek w tych o- pisach patentowych podano mozliwosc stosowania w roli grupy zabezpieczajacej grupe aminowa w eterze iminowym cefalosporyny C, grupe benzo- ilowa podstawiona atomem chlorowca, to jednak nie podano grup 4-chlorobenzoilowej lub 2,4-dwu- chlorobenzoilowej, ani metody zastosowania N-a-- cylowych pochodnych do oczyszczania surowych zwiazków typu cefalosporyny C.W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3467654 podana jest metoda wytraca¬ nia acetonem zanieczyszczen z wyjsciowego prze¬ saczu brzeczki zawierajacego cefalosporyne C.Zanieczyszczenia te odsacza sie, a cefalosporyne C z oczyszczonego przesaczu absorbuje na zywicy amonitowej, nastepnie zwiazek eluuje sie z zy¬ wicy kwasnym buforem. W opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 3641018 i 3739002 podane sa nowe pochodne N-acylowe ce¬ falosporyny C zawierajace grupy acylowe w po¬ staci a-halogeno lub a, a-dwuhalogeno podsta¬ wionych grup alkanoilowych o 2—4 atomach we¬ gla. Pochodne te, jakkolwiek sa rozpuszczalne w organicznych rozpuszczalnikach kiedy powstaja bezposrednio z cefalosporyny zawartej w brzecz¬ ce fermentacyjnej, to z trudnoscia rozpuszczaja sie w dogodnych rozpuszczalnikach i wtedy na- 4 lezy postarac sie o ich rozpuszczenie w organi¬ cznym rozpuszczalniku.Waznym problemem jest to, ze sole cefalospo¬ ryny C, które sa materialem wyjsciowym do wy¬ twarzania kwasu 7-aminocefalosporanowego (7- -ACA) i odpowiednio antybiotyków cefalosporyny, cefalotyny i/lub cefaloglicyny, odzyskuje sie z brzeczki fermentacyjnej zanieczyszczone proteina^ mi i polisacharydami o wysokiej masie czaste¬ czkowej. Tepolisacharydowe i proteinowe produkty uboczne powstaja prawdopodobnie podczas fer¬ mentacji. Posiadaja one rozpuszczalnosc zblizona do rozpuszczalnosci soli sodowej cefalosporyny C, co utrudnia tym samym oczyszczenie soli sodo¬ wej cefalosporyny C od zanieczyszczen. Skutecz¬ nie usuwa zanieczyszczenia filtrowanie membra¬ nowe, jakkolwiek proces ten nie zostal do tej po¬ ry przystosowany do saczenia duzych objetosci fermentacyjnych roztworów produkowanych na skale przemyslowa. Oczyszczanie soli sodowej ce¬ falosporyny C na drodze krystalizacji jest równiez malo skuteczne poniewaz stosowane warunki po¬ woduja jednoczesnie wydzielanie zanieczyszczen.Zanieczyszczenia polimerowe o wysokiej masie czasteczkowej, zwane w dalszym opisie „polisa- charydynami", utrudniaja wytwarzanie antybioty¬ ków cefalosporynowych, takich jak cefalotyna. W procesie rozpadu soli sodowej cefalosporyny C do kwasu 7-aminocefalosporanowego z uzyciem chlo¬ roformu jako rozpuszczalnika konieczne jest roz¬ dzielenie fazy wodnej zawierajacej 7-ACA od fa¬ zy chloroformowej. Obecnosc polisacharydów utru¬ dnia, rozdzial, poniewaz stabilizuja one emulsje wodno-chloroformowa. Ostatnio prowadzi sie pro¬ ces rozkladu w czterowodorofuranie, dzieki czemu unika sie klopotów z emulsja, poniewaz nie za¬ chodzi koniecznosc oddzielenia fazy wodnej od organicznej. Wada procesu rozkladu prowadzone¬ go w czterowodorofuranie jest to, ze jak wykaza¬ no doswiadczalnie, otrzymany ta metoda kwas 7- -aminocefalosporynowy trudniej ulega acylowa- niu. Metoda, która znosilaby szkodliwa obecnosc „polisacharydów" w cefalosporynie C, podnosilaby wydajnosc reakcji, na przyklad otrzymywanie ce¬ falosporyny C.Najwazniejszym problemem jest znalezienie takich pochodnych zwiazków typu cefalosporyny C, których rozpuszczalnosc róznilaby sie znacznie od rozpuszczalnosci zanieczyszczen „polisacharydo- wych". Na przyklad pochodne te bylyby rozpu¬ szczalne w rozpuszczalnikach organicznych, a nie¬ rozpuszczalne w wodzie.Poszukiwanie pochodnych zwiazków typu cefa¬ losporyny C, o podanych wyzej wlasciwosciach, nie bylo latwe, a nawet nie spodziewano sie od¬ krycia tego typu pochodnych. Zsyntetyzowano i przebadano wiele N-pochodnych cefalosporyny C w celu uzyskania odpowiedniego produktu posre¬ dniego do otrzymywania kwasu 7-aminocefalospo¬ ranowego. Wiekszosc jednak otrzymywanych po¬ chodnych nie krystalizowala z wodno-organicznej mieszaniny rozpuszczalników. Na przyklad N-(p- -nitrobenzoilo) cefalosporyna C, N-(p-toluenosul- fonylo) cefalosporyna C, N-(benzenosulfonylo) ce¬ falosporyna C i N-(p-chlorobenzenosulfonylo) ce- 40 45 50 55 6091 falosporyna C w postaci wolnych kwasów nie tworza krystalicznych produktów. Nalezy dodac, ze równiez N-propionylo-, N-benzoilo- i N-chloro- acetylo- pochodne cefalosporyny C w postaci wol¬ nych kwasów nie krystalizuja z wodno-organicz- nej mieszaniny rozpuszczalników.Wynaleziono jednak pewne pochodne cefalo¬ sporyny C, które wykazuja pozadana rozpuszczal¬ nosc i które moga byc zastosowane w reakcji wytwarzania 7-ACA i/lub innych podobnych do 7-aminocefalosporyny C zwiazków.Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wy¬ twarzania nowych pochodnych zwiazków typu ce¬ falosporyny C, których rozpuszczalnosc wyraznie rózni sie od rozpuszczalnosci zanieczyszczen poli- sacharydowych, zwiazków typu cefalosporyny C i soli tych zwiazków. W szczególnosci, nowe po¬ chodne zwiazków typu cefalosporyny C rozpu¬ szczaja sie w powszechnie stosowanych rozpu¬ szczalnikach organicznych, a sa nierozpuszczalne w wodzie.Przedmiotem wynalazku jest sposób wyodreb¬ niania zwiazków typu cefalosporyny C z surowego roztworu.Metoda ta polega na przeprowadzeniu zwiazków typu cefalosporyny C w odpowiednie, wybrane pochodne, co umozliwia rzeczywiste rozdzielenie nierozpuszczalnych zanieczyszczen polisacharydo- wych od rozpuszczalnych pochodnych zwiazków typu cefalosporyny C. Proces ten pozwala, dodat¬ kowo, na uzyskanie krystalicznego osadu pochod¬ nych zwiazków typu cefalosporyny C, nie zawiera¬ jacego zanieczyszczen polisacharydowych, a rów¬ niez na przeprowadzenie tych pochodnych w kwas 7-ACA i/lub w inne 7-aminocefalosporyny.Sposobem wedlug wynalazku, ulepszona metoda oddzielenia zwiazku typu cefalosporyny C o wzo¬ rze 1, w którym M oznacza atom wodoru lub atom metalu alkalicznego, a R oznacza atom wo¬ doru, grupe acetoksylowa, hydroksylowa, metylo- tiolowa, od zanieczyszczen protoinowych i poli¬ sacharydowych polega na (A) przeprowadzeniu reakcji surowego zwiazku typu cefalosporyny C o wzorze 1, w wodnym, cieklym srodowisku zawie¬ rajacym obojetny, organiczny rozpuszczalnik do¬ brze mieszajacy sie oraz omówione wyzej zanie¬ czyszczenia, z halogenkiem 2,4-dwuchlorobenzoilu lub 4-chlorobenzoilu, z otrzymaniem pochodnej N- -acylowej zwiazku typu cefalosporyny C, rozpu¬ szczalnej w wodno-organicznym srodowisku cie¬ klym, o wzorze 2, w którym X oznacza atom wodoru, lub chloru, a R ma podane wyzej zna¬ czenie, (B) oddzieleniu zanieczyszczen polisacha¬ rydowych i proteinowych od omówionej pochod¬ nej zwiazku typu cefalosporyny C. Oddzielenie zanieczyszczen polisacharydowych i proteinowych, jak zaznaczono powyzej przeprowadza sie na wie¬ le sposobów. Jeden ze sposobów polega na obrób¬ ce wodnego roztworu zawierajacego zanieczy¬ szczenia i opisana wyzej pochodna N-acylowa zwiazku typu cefalosporyny C w ponizszy sposób.Oddziela sie nierozpuszczalne substancje z cie¬ klego, wodno-organicznego srodowiska i poddaje krystalizacji N-acylowa pochodna zwiazku typu cefalosporyny C, oraz oddziela - sie wytworzone 577 6 krysztaly N-acylowej pochodnej. Nastepnie osad N-acylowej pochodnej zwiazku typu cefalospory¬ ny C rozpuszcza sie w organicznym mieszajacym sie z woda rozpuszczalniku, zawierajacym okolo 15°/o wody i oddziela sie nierozpuszczalne sub¬ stancje z cieklej mieszaniny. Do pozostalej cie¬ klej frakcji dodaje sie wody w celu wytracenia N-acylowej pochodnej zwiazku typu cefalospory¬ ny C i oddziela osad wytraconej pochodnej N- -acylowej zwiazku typu cefalosporyny C.Inna metoda obróbki wymienionego wodnego roztworu polega na oddzielaniu nierozpuszczonych substancji z cieklego wodno-organicznego srodo¬ wiska, wykrystalizowaniu N-acylowej pochodnej zwiazku typu cefalosporyny C i oddzieleniu kry¬ sztalów N-acylowej pochodnej zwiazku typu ce¬ falosporyny C, a nastepnie rozpuszczaniu otrzy¬ manego osadu N-acylowej pochodnej zwiaz¬ ku typu cefalosporyny C w rozpuszczalniku od- powiednim do prowadzenia reakcji oddzielenia grupy 7-acylowej i oddzielenia nierozpuszczonych substancji z roztworu.Stosuje sie równiez nastepujaca metode pole¬ gajaca na oddzieleniu nierozpuszczalnych substan- cji z opisanego wodno-organicznego cieklego sro¬ dowiska, obnizeniu pH, nie zawierajacego sub¬ stancji, wodno-organicznego cieklego srodowiska do wartosci okolo 1,5—3,5; i dodaniu chinoliny do nie zawierajacego nierozpuszczalnych zanie- czyszczen wodno-organicznego cieklego srodowis¬ ka, w celu wydzielenia oczyszczonej pochodnej N-acylowej zwiazku typu cefalosporyny C w po¬ staci soli chinolinowej.Sposobem wedlug wynalazku zwiazek o wzorze 2, lub jego sól chinolinowa poddaje sie dalszej reakcji odszczepienia bocznego lancucha 7-acylo- wego z otrzymaniem 7-aminocefalosporyny.Zwiazki o wzorze 2 lub ich odpowiednie sole 40 chinolinowe wchodza równiez w zakres wynalaz¬ ku^ Sposobem wedlug wynalazku pochodne N-(4- chlorobenzoilo)- i N-(2,4-dwuchlorobenzoilo)- cefa¬ losporyny C i pokrewne zwiazki o wzorze 2 w 45 postaci ich wolnych kwasów lub w postaci soli cefalosporyny C i ich soli.W szczególnosci odkryto, ze surowe zwiazki typu cefalosporyny C, zawierajace zanieczyszczenia pochodzace. z brzeczki fermentacyjnej mozna o- 50 czyscic w podany nizej sposób. Surowy zwiazek typu cefalosporyny C przeprowadza sie w odpo¬ wiednia pochodna o wzorze 2, a nastepnie od¬ dziela sie z roztworu nierozpuszczalnego zanie¬ czyszczenia. Proces otrzymywania pochodnej o 55 wzorze 2 zachodzi w wodnym srodowisku zawie¬ rajacym obojetny, rozpuszczajacy sie w wodzie organiczny rozpuszczalnik.Okreslenie obojetny rozpuszczalnik organiczny oznacza taki rozpuszczalnik, który nie reaguje z 60 halogenkami 2,4-dwuchlorobenzoilu lub 4-chloro¬ benzoilu uzywanymi do otrzymywania pochodnych zwiazków typu cefalosporyny C. Typowymi obo¬ jetnymi, mieszajacymi sie z woda rozpuszczalni¬ kami organicznymi sa, na przyklad ketony takie i65 .jak aceton, etery, * takie jak dioksan, czterowo-91677 7 dorofuran, dwuetoksyetan i nitryle, takie jak a- cetonitryl.Jako halogenki 2,4-dwuchlorobenzoilu i 4-chlo- robenzoilu korzystnie stosuje sie chlorki i brom¬ ki. W reakcji z zwiazkami typu cefalosporyny C, stosuje sie halogenki z 3—15°/o nadmiarem w wodnym srodowisku zawierajacym obojetny, mie¬ szajacy sie z woda rozpuszczalnik. W wodno-or- ganicznym, cieklym srodowisku reakcyjnym obo¬ jetny, mieszajacy sie z woda rozpuszczalnik sta¬ nowi 50°/o objetosciowych calosci. Jakkolwiek sto¬ sowac mozna mieszaniny w stosunku objetoscio¬ wym 10:1 odpowiednio wodnego i organicznego rozpuszczalnika lub organicznego rozpuszczalnika do srodowiska wodnego.Reakcje acylowania prowadzi sie przewaznie w wodnym, alkalicznym srodowisku, pozwalajacym na utworzenie soli metalu alkalicznego zwiazku typu cefalosporyny O. Uzyskuje sie to dodajac do roztworu wodorotlenek metalu alkalicznego, ko¬ rzystnie wodorotlenek sodowy. Proces acylowa¬ nia prowadzi sie korzystnie w temperaturze 20 do 0°C do temperatury pokojowej. Czynnik acy¬ lujacy dodaje sie do uprzednio przygotowanej, zalkalizowanej mieszaniny i utrzymuje temperature w wyzej podanym zakresie, a wartosc pH roz¬ tworu w zakresie -9,0—9,5. Stale pH roztworu u- trzymuje sie, w czasie dodawania srodka acy- lujacego, za pomoca dodawania odczynnika al¬ kalicznego. Jako odczynnik alkaliczny korzystnie stosuje sie trzeciorzedowa amine, taka jak trój- etyloamine, lub wodorotlenek metalu alkaliczne¬ go, taki jak wodorotlenek sodowy. Korzystnie jako czynnik alkaliczny stosuje sie wodorotlenek sodowy.W czasie wytwarzania pochodnej zwiazku typu cefalosporyny C wartosc pH mieszaniny reakcyj¬ nej obniza sie z zakresu 9,0—9,5 do okolo 5,5— 6,5.W warunkach tych pochodna zwiazku typu ce¬ falosporyny C pozostaje rozpuszczona w roztwo¬ rze, podczas gdy wiekszosc zanieczyszczen nazy¬ wanych polisacharydowymi lub polimerowymi po¬ zostaje nierozpuszczalna i moze byc usunieta.Zanieczyszczenia z pochodnych, o wzorze 2 zwia¬ zku typu cefalosporyny C usuwa sie wieloma spo¬ sobami, z których kazdy zawarty jest w ogól¬ nym sposobie wedlug wynalazku. Cecha znamien¬ na sposobu wedlug wynalazku jest wykorzysta¬ nie róznicy w rozpuszczalnosci miedzy pochod¬ nymi o wzorze 2, a zanieczyszczeniami polisa¬ charydowymi i proteinowymi. Dlatego w pocza¬ tkowym etapie oczyszczania wodnego srodowiska zawierajacego obojetny, mieszajacy sie z woda rozpuszczalnik i pochodna o wzorze 2, oddziela sie zanieczyszczenia z pochodnych zwiazku typu cefalosporyny C na drodze saczenia, dekantacji, wirowania, lub saczenia na prasach. Pochodna o wzorze 2 usuwa sie nastepnie z czesciowo oczy¬ szczonego roztworu, na przyklad za pomoca ob¬ nizenia pH mieszaniny do zakresu wartosci 1,5— 3,5. Dodanie wody ulatwia wytracenie tej pochod¬ nej, zmniejszajac jej rozpuszczalnosc w srodowis¬ ku reakcji. Pochodna o wzorze 2 mozna wyodre¬ bnic z roztworu w postaci wolnego kwasu lub w 8 postaci jej soli addycyjnej, na przyklad soli chi¬ nolinowej.Chinoiinowa sól addycyjna kwasu przygotowuje sie w prosty sposób dodajac, do mieszaniny za¬ wierajacej N-acylowa pochodna zwiazku typu ce¬ falosporyny C w postaci wolnego kwasu, równo- molowa ilosc chinoliny. Korzystny jednak nad¬ miar chinoliny, wynosi od okolo 1,5 mola do 12 moli chinoliny na mol N-acylowej pochodnej zwia¬ zku typu cefalosporyny C.W celu calkowitego usuniecia zanieczyszczen, w wyobrebnionej, w podany wyzej sposób, pochod¬ nej zwiazku typu cefalosporyny C, mozna za¬ stosowac dwie metody.Jedna z metod polega na rekrystalizacji wyo¬ drebnionej pochodnej w kontrolowanych warun¬ kach zezwalajacych na wyeliminowanie pozosta¬ lych zanieczyszczen polimerowych. Osiaga sie to rozpuszczajac pochodna w organicznych rozpusz¬ czalnikach mieszajacych sie z woda. W przypad¬ ku, gdy wystepuje ona w postaci wolnego kwasu, rozpuszcza sie ja wprost w organicznym rozpu¬ szczalniku mieszajacym sie z woda. Jezeli po¬ chodna wystepuje w postaci soli chinolinowej, to rozpuszcza sie ja w tej postaci lub przerabia w ten sposób, ze otrzymuje sie ja w rozpuszczal¬ niku w postaci wolnego kwasu.Typowymi rozpuszczalnikami organicznymi, mie¬ szajacymi sie z woda sa, na przyklad ketony, ta¬ kie jak aceton, etery, takie jak czterowodorofu- ran, dwumetoksyetan, dwuetoksyetan, alkohole, takie jak metanol, etanol, n-propanol, alkohol izo¬ propylowy, nitryle, takie jak acetonitryl. Orga¬ niczne, mieszajac sie z woda rozpuszczalniki mo¬ ga zawierac wode, korzystnie co najmniej okolo %.W opisanych warunkach rekrystalizacji, resz¬ tkowe zanieczyszczenia pozostaja nierozpuszczalne i usuwa sie je stosujac jeden z wymienionych wyzej sposobów.Pochodna zwiazku typu cefalosporyny C wytra¬ ca sie z oczyszczonego roztworu, woda i oddziela w postaci wolnego kwasu lub w postaci soli chi¬ nolinowej. Korzystnie stosuje sie, w tym przypad¬ ku, pochodna zwiazku cefalosporyny C w po¬ staci wolnego kwasu.Inna metoda obróbki wczesniej wyodrebnionej pochodnej zwiazku typu cefalosporyny C polega, po prostu na rozpuszczeniu pochodnej, czy to w postaci wolnego kwasu, czy w postaci soli chi¬ nolinowej, w rozpuszczalniku odpowiednim do prowadzenia reakcji oddzielania N-acylowanego -aminoadypoilowego podstawnika pochodnej zwia¬ zku . typu cefalosporyny C. Resztkowe ilosci za¬ nieczyszczen pozostaja nierozpuszczone w rozpu¬ szczalniku, w którym zazwyczaj prowadzi sie re¬ akcje rozpadu. Roztworów tych rozpuszczalników, po oddzieleniu zanieczyszczen, uzywa sie bezpo¬ srednio do reakcji rozszczepienia. Te resztkowe zanieczyszczenia usuwa sie jedna z wyzej opisa¬ nych metod.Roztwór zawierajacy pochodna zwiazku typu ce¬ falosporyny C, po oddzieleniu nierozpuszczalnych zanieczyszczen, poddaje sie bezposrednio reakcji rozszczepienia bez uprzedniego wyodrebnienia po- 40 45 50 55 60WSW 9 chodnej z rozpuszczalnika. Jako odpowiednie roz¬ puszczalniki stosowane w procesie rozszczepienia, stosuje sie na przyklad, chlorowcowane weglowo¬ dory, takie jak chloroform i chlorek metylenu oraz etery takie jak czterowodorófuran lub diok- 5 san.Stwierdzono wybitnie korzystny wplyw stoso¬ wania amidów, takich jak N,N-dwumetyloforma- mid lub N,N-dwumetyloacetamid w mieszaninach z rozpuszczalnikami, w których prowadzi sie pro¬ ces rozszczepienia. Korzystnie w sposobie wedlug wynalazku, stosuje sie mieszanine chlorku mety¬ lenu i N,N-dwumetyloacetamidu.W przypadku stosowania ostatniej z opisanych wyzej metod, w której zwiazki typu cefalospory- ny C nie wyodrebnia sie przed rozszczepieniem ze srodowiska reakcji, korzystnie suszy sie pochod¬ na przed rozpuszczeniem jej w rozpuszczalniku, w którym prowadzi sie reakcje rozszczepienia.Suszenie substancji przed wprowadzeniem do sro¬ dowiska reakcji jest korzystne dlatego, ze osia¬ ga sie lepsza wydajnosc procesu rozszczepienia stosujac bezwodne warunki. Jednakze, sposobem wedlug wynalazku, suszenie substratów reakcji nie jest wymagane.Sposobem wedlug wynalazku, typu cefalospo- ryny C stosuje sie w postaci wolnego kwasu, w którym zgodnie ze wzorem 1, M oznacza atom wodoru. Zwiazek typu cefalosporyny C stosuje sie korzystnie w postaci soli metalu alkaliczne¬ go, takiego jak lit, sód lub potas. Najkorzystniej stosuje sie wyjsciowy zwiazek w postaci soli so¬ dowej.Pochodne cefalosporyny C o wzorze 2, w któ¬ rym R oznacza grupe acetoksylowa, przygotowuje sie z doskonala wydajnoscia z soli metalu alkali¬ cznego, korzystnie z soli sodowej cefalosporyny C. W przypadku, gdy sól sodowa cefalosporyny C zawiera niewielkie ilosci zanieczyszczen polisa- charydowych, to mozna ja lub jej pochodna o wzorze 2 poddac reakcji rozszczepienia do kwasu 7-aminocefalosporanowego (7-ACA) w chlorofor¬ mie bez wytworzenia emulsji. Jednakze jezeli za¬ nieczyszczenia „polisacharydami" soli sodowej ce¬ falosporyny C lub jej pochodnej jest znaczne, wytwarza sie emulsje, w przypadku prowadzenia procesu w srodowisku chloroformowym.Rekrystalizacje pochodnych cefalosporyny C o wzorze 2 przeprowadza sie w warunkach, które zapewniaja wykorzystanie róznicy w rozpuszczal¬ nosci pomiedzy zanieczyszczeniami polisacharydo- wymi, a pochodna. Otrzymana, oczyszczona po¬ chodna poddaje sie reakcji rozszczepienia do 7- ACA w chloroformie bez wytworzenie emulsji.Tak oczyszczona substancje wytwarza sie nie¬ zaleznie od ilosci zanieczyszczen polisacharydo- wyeh obecnych w wyjsciowym materiale, z któ¬ rego otrzymuje sie pochodna cefalosporyny C.Przez zastosowanie sposobu wedlug wynalazku zwieksza sie wydajnosc reakcji rozszczepiania zwiazków typu cefalosporyny C, otrzymuje sie do¬ skonalej jakosci 7-aminocefalosporyne, tak ze dalsza reakcja acylowania przebiega bez klopo¬ tów lub tylko z niewielka trudnoscia, produkty posrednie procesu wytwarzania wlasciwego anty- biotyku zawieraja tylko nieznaczne ilosci za¬ nieczyszczen, zwieksza sie wydajnosc reakcji a- cylowania 7-aminocefalosporyn do wlasciwego an¬ tybiotyku. W szczególnosci stwierdzono, ze wy¬ dajnosc reakcji acylowania 7-ACA do ^efalotyny wzrosla z okolo 79tyo w obecnosci zanieczyszczen polisacharydowych do 92*/o po usunieciu tych za¬ nieczyszczen z substancji wyjsciowej 7-ACA.Podane nizej przyklady dokladniej wyjasniaja sposób wedlug wynalazku, nie ograniczajac jego zasiegu. - / Przyklad I. 60 gramów soli sodowej cefalo¬ sporyny C (128 milimoli) miesza sie z 300 ml de¬ monizowanej wody, az do chwili uzyskania calko¬ witego rozpuszczenia osadu, dodaje okolo 300 ml acetonu i chlodzi do temperatury 5°C. W czasie chlodzenia wydziela sie osad soli sodowej cefa¬ losporyny C. Za pomoca 20% wodnego roztwo¬ ru wodorotlenku sodowego, pH mieszaniny do¬ prowadza sie do wartosci 9,0—9,5. Otrzymany roz¬ twór miesza sie i utrzymujac temperature 5°C dodaje w ciagu 30—35 minut 19,7 ml chlorku 2,4- dwuchlorobenzoilu (141 milimoli, 10Q/o nadmiar).Wartosc pH mieszaniny reakcyjnej utrzymuje sie w czasie dodawania chlorku 2,4-dwuchlorobenzo- ilu w zakresie 9,0—9,5, wkraplajac, jezeli jest to konieczne, wodny 20°/o roztwór wodorotlenku so¬ dowego. Po zakonczeniu dodawania chlorku 2,4- dwuchlorobenzoilu mieszanine miesza sie w tem¬ peraturze 5°C w ciagu 10 minut, lub jezeli pH roztworu pozostawalo stale w zakresie 9,0—9,5 miesza sie tylko 2 minuty. Nastepnie mieszanine zakwasza sie stezonym kwasem solnym do war¬ tosci pH 6,5, dodaje 300 ml wody 5 do 10 g ma¬ terialu ulatwiajacego saczenie (Hyflo) i przesacza przez warstwe materialu ulatwiajacego saczenie o grubosci od 12,7 do 6,35 mm na lejku nr 3 Bu¬ chnera. Osad na lejku przeplukuje sie okolo 50 ml wody. Przesacz i popluczki laczy sie, mie¬ sza i ogrzewa do temperatury 20°C. Za pomoca stezonego kwasu solnego pH roztworu doprowa¬ dza sie do wartosci okolo 3,0, zaszczepia kryszta^ lami produktu otrzymanego w malej labolatoryj- nej próbie i doprowadza pH roztworu do warto¬ sci 2,7 stezonym kwasem «olnym. W czasie mie¬ szania roztworu w ciagu 30 minut w temperatu¬ rze 20—23°C wydziela sie N-(2j4-dwuchloróben- zoilo) cefalosporyna C w postaci oleju, którego kropelki stopniowo krystalizuja.PH roztworu doprowadza sie do wartosci 1,8 stezonym kwasem solnym, miesza w Ciagu 2 do 3 minut i dodaje 300 ml wody. Wodna mieszanine organiczna miesza sie 2—3 minuty, chlodzi do temperatury 5°C i miesza w temperaturze &—5°C w ciagu 1 godziny. Osad odsacza sie, przemywa okolo 500 ml wody i suszy w temperaturze 45°C.Otrzymuje sie 68,9 g produktu (89,1^/e).Mieszanine 20,0 g N-(2,4-dwuchlorobenzoilo) £e- falosporyny C w 180 ml czystego acetonu miesza sie do chwili uzyskania jednolitego roztworu i dodaje 9,0 ml dejonizowanej wody. Mieszanine miesza sie 10—15 minut do chwili uzyskania kla¬ rownego roztworu, dodaje 2 gramy materialu u- latwiajacego saczenie (Hyflo), 2 gramy wegla od¬ barwiajacego (Darco), miesza £&e dalej w ciagu 40 45 50 55 6091577 11 minut i przesacza przez warstwe srodka ula¬ twiajacego saczenie (1 gram), na saczku Buchnera nr 0. Przesaczanie mozna powtórzyc nie stosujac odbarwiajacego wegla, dopóki nie uzyska sie ja¬ snego przesaczu. Mala ilosc osadu przemywa sie 5 ml acetonu. Przesacz i polpuczki laczy sie, miesza z 250 ml wody dejonizowanej i schladza do temperatury 25°C. Do tak przygotowanego roz¬ tworu dodaje sie dodatkowa ilosc wody, do chwi¬ li pokazania sie trwalego zmetnienia, (okolo 75 do 110 ml), nastepnie mieszanine szczepi sie 0,50 g rekrystalizowanego produktu. Mieszanine mie¬ sza sie w ciagu 30 minut w temperaturze po¬ kojowej (23—25°C) i dodaje okolo 350 ml wody, stale mieszajac, w ciagu 40 minut. Po dodaniu calkowitej ilosci wody mieszanine chlodzi sie do temperaturze 5°C i utrzymuje w tej temperaturze w_ ciagu okolo godziny. Otrzymana mieszanine przesacza sie, osad przemywa woda i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 45°C.Otrzymuje sie 16—16,5 g N-(2,4-dwuchlorobenzo- ilo) cefalosporyny C.Przyklad II. Sól sodowa cefalosporyny C w ilosci 60 g (134 milimoli) miesza sie z 300 ml wo¬ dy, a z chwila calkowitego rozpuszczenia osadu dodaje sie 150 ml acetonu i chlodzi do tempera¬ tury 10°C. Po doprowadzeniu pH roztworu do wartosci 9,0 za pomoca 20% roztworu wodoro¬ tlenku sodowego, dodaje sie 17 ml (34 milimole) chlorku 4-chlorobenzoilu. Mieszanine reakcyjna miesza sie w ciagu 30 minut w temperaturze 10— °C i, jezeli zachodzi potrzeba, dodaje sie 20% roztwór wodorotlenku sodowego w celu utrzy¬ mania wartosci pH bliskiej 9,0. Po uplywie po¬ danego czasu dodaje sie porcjami po 800 i 250 ml, 1050 ml wody i doprowadza pH roztworu do wartosci 1,9 za pomoca stezonego kwasu solnego.Mieszanine szczepi sie krysztalami N-(4-chloro- benzoilo) cefalosporyny C i chlodzi w kapieli lo¬ dowej, a nastepnie pozostawia na noc w lodówce w temperaturze okolo 5°C. Krystaliczny osad od¬ sacza sie, przemywa woda i suszy pod zmniej¬ szonym cisnieniem w temperaturze 40°C. Otrzy¬ muje sie 55,7 g krystalicznej N-(4-chlorobenzo- ilo) cefalosporyny C. Czesciowo oczyszczony, w opisany wyzej sposób, osad N-(4-chlorobenzoilo) cefalosporyny C, oczyszcza sie dodatkowo w spo¬ sób analogiczny do podanego w przykladzie I.Przyklad III. Do mieszaniny 11,8 g (20 mili¬ moli) N-(2,4-dwuchlorobenzoilo) cefalosporyny C w 150 ml chloroformu wolnego od amylenu dodaje sie 5,70 ml (48 milimoli) chinoliny i 8,80 ml (95 milimoli) N,N-dwumetyloacetamidu. W ten sposób temperatura przygotowanej mieszaniny podnosi sie do 28°C. Po obnizeniu temperatury mieszaniny do 15°C dodaje sie w jednej porcji 9,60 ml (135 milimoli) chlorku acetylu. Temperatura podnosi sie ponownie do 23°C. Osad N-(2,4-dwuchloroben- zoilu) cefalosporyny C rozpuszcza sie w trakcie 40 minutowego mieszania w temperautrze okolo 24—25°C. Mieszanine schladza sie nastepnie do temperatury -35°C, dodaje 26 ml (162 milimole) N,N-dwuetyloaniliny, ponownie schladza sie do temperatury -25°C i dodaje 9,8 g pieciotlenku fosforu (47 milimoli). 12 W ten sposób otrzymana mieszanine reakcyj¬ na kolejno, miesza sie w temperaturze -15°C w ciagu 30 minut, chlodzi do temperatury -40°C do¬ daje 34 ml glikolu propylenowego, miesza w cia¬ gu 1,5—2 godzin w temperaturze 0°C, chlodzi do temperatury -15°C i dodaje 100 ml wody z lodem.Faze wodna oddziela sie od fazy organicznej, a nastepnie ekstrahuje 20 ml wody. Za pomoca ste¬ zonego kwasu solnego, pH polaczonych faz wod¬ nych doprowadza sie do wartosci 3,5, a wydzie¬ lony osad odsacza sie, przemywa kolejno woda, metanolem, acetonem i suszy. Otrzymuje sie 4,8— ,0 g kwasu 7-aminocefalosporanowego.Przyklad IV. W sposób analogiczny do opi¬ sanego w przykladzie I, sól sodowa dezacetoksy- cefalosporyny C, zwiazku o wzorze 1, w którym R oznacza atom wodoru, rozpuszcza sie w mie¬ szaninie wody z acetonem, traktuje chlorem 2,4- dwuchlorobenzoilu i otrzymuje kwas N-(2,4-dwu- chlorobenzoilo) - dezacetoksycefalosporanowy. Po¬ chodna te oczyszcza sie w sposób analogiczny do opisanego w przykladzie I. Oczyszczony kwas pod¬ daje sie dzialaniu pieciotlenku fosforu w obecno¬ sci pirydyny i otrzymuje imino-chlorek, na imi- nochlorek dziala sie alkoholem lub alkanodiolem i otrzymuje imino-eter w wyniku reakcji którego z woda odrywa sie lancuch boczny i powstaje kwas 7-aminodezacetoksycefalosporanowy (7-ADC A). Zwiazek o takiej budowie cefalosporynowej opisano w patencie Stanów Zjednoczonych Ame¬ ryki nr 3124576. Ze zwiazku tego wytwarza sie, stosujac znane sposoby acylowania, antybiotyki cefalosporynowe takie jak cefaleksyne i cefrady- ne.Przyklad V. Jeden litr wyciagu, o wartosci pH 5,5, z zywicy jonitowej zawierajacego 48,2 mg/ ml (wedlug metody UV) lub 38,46 mg/ml cefa¬ losporyny C (wedlug metody nikotynamidowej) chlodzi sie do temperatury +6°C. Po dodaniu do mieszaniny 200 ml acetonu temperatura podnosi sie do +10°C, a pH roztworu osiaga odpowiednio wartosc 5,9.Nastepnie pH mieszaniny doprowadza sie do wartosci 9,5 dodajac 22 ml 25% wodnego roz¬ tworu wodorotlenku sodowego, a wytworzona sól sodowa cefalosporyny C acyluje sie w ciagu po¬ nad 20 minut za pomoca 31,4 ml (224 milimole) chlorku 2,4-dwuchlorobenzoilu, równoczesnie do¬ dajac 53 ml 25% wodnego roztworu wodorotlen¬ ku sodowego w celu utrzymania pH roztworu w poblizu wartosci 9,5. Pod koniec reakcji tempera¬ tura roztworu wzrasta do 22°C. Do mieszaniny reakcyjnej, której pH doprowadza sie do wartosci ,0 za pomoca 20 ml 25% roztworu kwasu siar¬ kowego, dodaje sie 20 g materialu ulatwiajacego saczenie i saczy. Po obnizeniu pH przesaczu do wartosci 3,4 za pomoca 45 ml 25% wodnego roz¬ tworu kwasu siarkowego, dodaje sie wolno w cia¬ gu ponad 10 minut 28,4 ml (336 milimoli) chino¬ liny, równoczesnie wkraplajac 27 ml 25% wodnego roztworu kwasu siarkowego, w celu utrzymania pH roztworu w zakresie 3,3—3,5. Otrzymana mie¬ szanine szczepi sie, wczesniej wytworzona na ma¬ la skale, sola chinolinowa Nr(2,4-dwuchlorobenzo- ilo) cefalosporyna C i miesza w temperaturze po- 40 45 50 55 6091 577 13 14 kojowej w ciagu 30 minut, a w temperaturze 5°C w ciagu 165 minut. Nastepnie mieszanine odsacza sie, a osad na saczku przemywa 1 litrem wody.Otrzymuje sie, po suszeniu pod zmniejszonym ci¬ snieniem w temperaturze 40°C„ 73 g (95,6% wy- 5 dajnosci) soli chinolinowej N-(2,4-dwuchlorobenzo- ilo) cefalosporyny C o czystosci 87,1%.Przyklad VI. Mieszanine 14,7 g soli chinoli¬ nowej N-(2,4-dwuehlorobenzoilo) cefalosporyny C, otrzymanej w sposób opisany w przykladzie V, 10 w 100 ml acetonu, 15 ml N,N-dwumetyloacetami- du i 2 ml chinoliny miesza sie w ciagu 30 mi¬ nut i dodaje 2 g materialu ulatwiajacego sacze¬ nie. W ten sposób otrzymana mieszanine przesa¬ cza sie, osad na saczku wazy 2,72 g. Przesacz 15 zateza sie do malej objetosci i. przenosi do stan¬ dardowego urzadzenia do rozszczepiania wraz z 150 ml chlorku metylenu. Po dodaniu 10 ml chlor¬ ku acetylu temperatura mieszaniny podnosi sie z 22°C do 26°C. Mieszanine miesza sie, schladza do 20 -15°C, dodaje 26 ml N,N-dwuetyloaniliny, 9,8 g pieciotlenku fosforu i stale w temperaturze 15°C miesza w ciagu 75 minut. Po uplywie tego czasu dodaje sie 25 ml glikolu propylowego i tempera¬ tura mieszaniny podnosi sie z -15°C do +2°C. 25 Mieszanine miesza sie w ciagu 2,5 godzin w tem¬ peraturze +5°C, nastepnie dodaje 100 ml wody z lodem i miesza jeszcze dodatkowo w ciagu 10 mi¬ nut. Wartosc pH fazy wodnej po oddzielaniu od fazy organicznej podnosi sie z 0,7 do 3,5 za po- 30 moca 15,5 ml stezonego wodorotlenku amonowe¬ go. Wodny roztwór miesza sie w ciagu okolo 15 minut, a nastepnie przesacza. Osad na saczku przemywa sie kolejno 25 ml zimnego 50% wodne¬ go roztworu metanolu, 50 ml zimnego metanolu 35 i suszy przez noc pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 40°C. Otrzymuje sie 2,73 g produk¬ tu w postaci kwasu 7-aminocefalosporynowego.Przyklad VII. Mieszanine 50 g surowej cefa¬ losporyny C w 500 ml wody, zawierajaca 85,5 *o milimoli (35,4 g) aktywnej substancji (metoda UV), miesza sie 10 minut w temperaturze pokojowej i dodaje 10 ml acetonu. PH mieszaniny podnosi sie z wyjsciowej wartosci 7,8 do wartosci 9,5 wkraplajac 6 ml 25% wodnego roztworu wodoro- 45 tlenku sodowego. Wytworzona w podany wyzej sposób sól sodowa cefalosporyny C poddaje sie acylowaniu wprowadzajac do roztworu, w cia¬ gu ponad 20 minut, 24 ml (171 milimoli) chlorku 2,4-dwuchlorobenzoilu i równoczesnie, w celu u- 50 trzymania wartosci pH roztworu równej 9,5, do¬ daje sie 25^ ml 25% wodnego roztworu wodoro¬ tlenku sodowego. Temperatura roztworu wzrasta do 29°C. Mieszanine miesza sie dodatkowo 10 smi- nut, a nastepnie obniza sie wartosc pH z 9,5 do 55 ,0 za pomoca 3 ml 25% wodnego roztworu kwasu siarkowego, dodaje 10 g materialu ulatwiajacego saczenie i mieszanine saczy. Wartosc pH metne¬ go przesaczu doprowadza sie do 3,5 za pomoca % wodnego roztworu kwasu siarkowego. Do 60 otrzymanej mieszaniny dodaje sie zwolna 25 ml (212 milimoli) chinoliny, utrzymujac jednoczesnie pH roztworu w zakresie 3,3—3,5 za pomoca 25% wodnego roztworu kwasu siarkowego. Wartosc pH roztworu po zakonczeniu dodawania chinoliny wy- 65 nosi 3,3. Roztwór zaszczepia sie krysztalami soli chinolinowej N-(2,4-dwuchlorobenzoilo) cefalospo¬ ryny C, nastepnie miesza w temperaturze poko¬ jowej w ciagu 20 minut i chlodzi lodem, stale mieszajac w ciagu 30 minut. Mieszanine przesacza sie, a osad na saczku przemywa 1,5 litra lodowa¬ tej wody i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 40°C w ciagu 40 godzin. Otrzymu¬ je sie 58 g soli chinolinowej N-(2,4-dwuehloro- benzoilo) cefalosporyny C (81,0% wydajnosci, 94,1% czystosci).Przyklad VIII. Mieszanine 14,7 g soli chino¬ linowej N-(2,4-dwuchlorobenzoilo) cefalosporyny C, otrzymanej w sposób opisany w przykladzie VII, w 150 ml chlorku metylenu, 15 ml N,N-dwu- metyloacetamidu i 2 ml chinoliny miesza sie w ciagu okolo 30 minut.Do mieszaniny reakcyjnej dodaje sie 2 g ma¬ terialu ulatwiajacego saczenie i saczy. Pozostaly, suchy osad wazy 3,51 g. Przesacz przenosi sie do standardowego urzadzenia do rozszczepiania i do¬ daje 10 ml chlorku acetylu. Temperatura roztworu podnosi sie wtedy z 18°C do 24°C. Mieszanine miesza sie w ciagu 20 minut, chlodzi do -10°C i dodaje 26 ml N,N-dwuetyloaniliny.W czasie dodawania N,N-dwuetyloaniliny tem¬ peratura roztworu podnosi sie do okolo -6°C.Nastepnie dodaje sie 9,8 g pieciotlenku fosforu, miesza 50 minut w temperaturze -15°C i do¬ daje 25 ml glikolu propylenowego. Temperature podnosi sie z -15°C do -11°C. Mieszanine chlodzi sie nastepnie okolo 5°C, miesza w ciagu 2 godzin, dodaje 100 ml wody z lodem i miesza w ciagu minut. -Faze wodna oddziela sie od organicznej.Za pomoca 12 ml stezonego wodorotlenku amono¬ wego podnosi sie pH fazy wodnej z wartosci 0,9 do 3,4. Mieszanine miesza sie 30 minut odsacza, a uzyskany osad przemywa kolejno 25 ml zimne¬ go 50% wodnego roztworu metanolu i 50 ml zi¬ mnego 50% wodnego roztworu metanolu i 50 ml zimnego metanolu. Osad suszy sie pod zmniejszo¬ nym cisnieniem w temperaturze 40°C w ciagu no¬ cy i otrzymuje 3,36 g kwasu 7-aminocefalospo- ranowego. PL PL