RU2480217C2 - Применение производных изотиоцианата в качестве противомиеломных средств - Google Patents

Abstract

Предложено применение глюкоморингина и его дезтиогликозида формул (I, II), соответственно, для получения лекарственного средства для лечения миеломы. Показана высокая цитотоксическая активность GMG, GMG-ITC против опухоли миеломы по сравнению с клеточными линиями другого типа опухолей, также активность подтверждена на экспериментальных моделях in vivo. 3 з.п. ф-лы, 4 табл.

Description

Настоящее изобретение относится к применению глюкоморингина или соответствующего производного изотиоцианата в качестве противомиеломных средств.

Предыдущий уровень техники

Овощи являются наиболее важным источником соединений с хемозащитными свойствами, среди них изотиоцианаты (ITC), вырабатываемые в крестоцветных (например, в брокколи, брюссельской капусте, цветной капусте и прочее), в последнее время вызывают большой интерес в связи с первым исследованием Sidransky о ITC- индуцируемом ингибировании роста опухоли [1].

В овощах изотиоцианаты сохраняются в форме неактивных предшественников, называемых глюкозинолатами (GL), и могут быть выделены после разрушения тканей под действием ферментативного гидролиза с участием мирозиназы (MYR, E.C. 1.2.1.147), тиогликозид глюкогидролазы, которая в нормальных условиях физически отделена от GL [2, 3].

Поскольку микрофлора кишечника млекопитающих, включая человека, обладает активностью, схожей с мирозиназной, GL также могут быть превращены в изотиоцианаты в пищеварительном тракте [4, 5].

Изотиоцианаты, как сообщалось, являются ингибиторами роста опухолей в различных предклинических испытаниях, проведенных in vivo [6-8], и, более того, эпидемиологические исследования показали обратную зависимость между употреблением в пищу крестоцветных и риском развития рака легких, груди и кишечника [9-11].

Изотиоцианаты обладают множеством эффектов, посредством которых они проявляют свое защитное действие против прогрессирования рака: они могут i) индуцировать ферменты фазы 2, такие как глутатион-S-трансферазу (GST) и хинон-редуктазу (QR) [12-15] через Nrf-2 путь, ii) вызывать приостановку клеточного цикла и апоптоз [16-18], iii) ингибировать ферменты фазы 1 и NF-kB связанные гены [19, 20].

В последние годы интенсивно изучается сульфорафан из-за его роли, как хемозащитного средства, и различные исследования продемонстрировали его потенциальное применение в качестве нового химиотерапевтического соединения [7, 11, 20].

Глюкоморингин (GMG) является необычным представителем семейства гликозинолатов (GL) и обладает уникальным свойством, заключающимся в наличии второго сахаридного остатка в боковой цепи. Этот GL является обычным вторичным метаболитом, присутствующим в овощах, принадлежащих роду Моринга (моринговые, Moringaceae), который состоит из 14 видов, среди которых наиболее широко распространена моринга масличная (М. oleifera), которая является деревом многостороннего использования, которое произрастает во многих тропических и экваториальных областях. Лечебная ценность семян и других частей растения давно признана в народной медицине [21]. Гликозилированные изотиоцианаты (GMG-ITC), представляющие собой результат гидролиза GMG мирозиназой, как было показано, обладают широкой биологической активностью, и также, как было показано, проявляют промотирующую противоопухолевую активность [22]. GMG-ITC можно очистить в большом количестве, начиная с чистого GMG. GMG-ITC является твердым соединением без запаха и стабилен при комнатной температуре, в отличие от других природных биологически активных ITC, которые являются жидкими, летучими, с острым запахом.

Множественная миелома является злокачественным заболеванием клеток плазмы, которая характеризуется разрушением скелета, почечной недостаточностью, анемией и гиперкальцемией [23]. Средний возраст при диагнозе составляет 68 лет. Миелома насчитывает 1% от всех злокачественных заболеваний у белого населения и 2% у чернокожего населения и 13% и 33%, соответственно, от числа раковых заболеваний в гематологии [24].

Лечение миеломы включает поддерживающую терапию и инфузионную химиотерапию, за которой для более молодых пациентов следует химиотерапия высокими дозами и аутогенная трансплантация [25]. Развитие понимания биологии миелом ведет к разработке новых терапевтических подходов [26]. Несмотря на то что с этими новыми способами лечения был достигнут основной прогресс в лечении миеломы, в настоящее время не существует претендента на замещение основного метода лечения. Таким образом, в настоящее время существует потребность в новых, более активных и/или альтернативных средствах.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Было обнаружено, что глюкоморингин (GMG), его дезтиогликозид (GMG-ITC), имеющие следующие формулы:

наделены значительной цитотоксической активностью против миеломных клеточных линий. Активность также была подтверждена in vivo на экспериментальных моделях.

Изобретение, соответственно, касается применения либо GMG, либо GMG-ITC для изготовления лекарственного препарата для лечения миелом, в особенности для лечения множественной миеломы. Для рассматриваемого терапевтического применения GMG или GMG-ITC будет подходящим образом включен в состав рецептур лекарственных форм, в частности для энтерального или парентерального применения в соответствии с известными способами.

Примеры подходящих композиций включают таблетки, капсулы, стерильные растворы или суспензии для внутримышечной или внутривенной инъекции и т.п. Фактические дозы и терапевтические протоколы будут, как обычно, зависеть от нескольких факторов, а именно: фармакокинетических и токсикологических свойств, состояния пациента (вес, пол и возраст), стадии заболевания. Практикующие специалисты в данной области легко определят наиболее эффективную схему приема лекарственного средства в соответствии с устоявшимися методами. Полагают, что эффективные терапевтические дозы для человека будут меняться в интервале между 1 мг/кг/в день и 30 мг/кг/в день, хотя, с точки зрения ограничений по токсичности, нельзя исключать и более высокие дозы как GMG, так и GMG-ITC.

GMG и GMG-ITC можно применять в качестве монотерапии или в комбинации с другими известными химиотерапевтическими средствами, уже доступными для лечения миеломы.

Теперь изобретение будет описано более подробно в следующих примерах.

Пример 1: Выделение и очистка соединений

GMG и GRA выделяли, соответственно, из семян моринги масличной (Moringa oleifera L.) (семейство моринговые) и капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) (семейство крестоцветные; вид acephala; подвид laciniata). Оба GL очищали в двух последовательных стадиях, анионообменной хроматографией и эксклюзионной хроматографией размеров, в соответствии с описанными ранее методами [27, 28]. Отдельные GL характеризовали ¹H и ¹³C-ЯМР спектроскопией и чистоту анализировали ВЭЖХ анализом десульфопроизводного согласно методу ISO 9167-1 [29], с выходом примерно 99% на основании величины площади пика, но примерно 90-92% по массе из-за их высокой гигроскопичности. Фермент MYR выделяли из семян горчицы белой (Sinapis alba L.) в соответствии с описанным методом [30] с некоторыми модификациями. Используемый для данного исследования запасный раствор обладал специфической активностью 60 ед./мг растворимого белка и хранился при 4°C после разбавления Н₂О до 34 ед./мл. Одну единицу активности MYR определяли как количество фермента, способное гидролизовать 1 мкмоль/мин синигрина при pH 6,5 и 37°C. Раствор MYR хранили при 4°C в стерильной воде до использования. GMG-ITC получали посредством катализируемого мирозиназой гидролиза GMG, проводимого в 0,1 M фосфатном буфере pH 6,5 при 37°C. Реакционную смесь готовили растворением 7,0 граммов чистого GMG в 350 мкл буфера, и, после того как добавляли 40 ед. мирозиназы, раствор выдерживали при 37°C в течение 4-6 часов. Полную конверсию чистого GMG в GMG-ITC подтверждали ВЭЖХ анализом десульфопроизводного [29], что позволяло следить за реакцией до полного исчезновения GMG из реакционной смеси. К смеси затем добавляли ацетонитрил до конечной концентрации 10% и очищали GMG-ITC хроматографией с обращенной фазой, которую проводили, используя HR 16/10 колонку, заполненную LiChrospher RP-C18 (MERCK) или SOURCE 15 RPC (Amersham Biosciences), подсоединенную к жидкостному хроматографу высокого разрешения AKTA-FPLC, с подсоединенным к нему коллектором фракций Frac-900 и УФ-монитором UPC-900 (Amersham Bioscences). После промывки 10% ацетонитрилом проводили элюирование в градиенте до 60% ацетонитрила. Фракции собирали и анализировали, используя ВЭЖХ систему Hewlett-Packard Model 1100 с lnertsil ODS3 колонкой (250×3 мм, 5 мм). Хроматографию проводили при скорости протока 1 мл/мин при 30°C путем элюирования в линейном градиенте воды (A) и ацетонитрила (B) от 30% B до 80% за 20 мин. Элюирование GMG-ITC детектировали диодной матрицей, регистрируя поглощение при 229 нм. Фракции, содержащие GMG-ITC (чистота пика >99%), собирали, растворитель удаляли концентрированием на роторном испарителе и конечный раствор лиофильно высушивали. GMG-ITC характеризовали и однозначно идентифицировали методами ¹H- и ¹³C-ЯМР и масспектрометрией.

Пример 2: Биологические результаты

Данные in vitro:

В таблице 1 представлена чувствительность клеточной линии H460 опухоли легкого человека к глюкоморингину. Возрастание концентрации GMG в присутствии мирозиназы приводит к цитотоксическому эффекту.

Таблица 1
	% клеточного роста по отношению к контролю
	0	24 ч обработки	24 ч восстановления	48 ч восстановления
Контроли	100	100	100	100
GMS (100 мкл)	100	98	100	100
GMS (7,5 мкл)+ MYR (0,19 ед.)	100	75	72	80
GMS (10 мкл) + MYR (0,19 ед.)	100	63	51	69
GMS (15 мкл) + MYR (0,19 ед.)	100	33	20	24
GMS (20 мкл) + MYR (0,19 ед.)	100	28	17	8

Цитотоксическая активность выделенного из моринги изотиоцианата (GMG-ITC) на панель клеточных линий опухолей человека. В той же таблице 2 приведены величины, полученные с ITC сульфораном (GRA) в качестве референсного стандарта.

Таблица 2
Клеточные линии	Количество клеток (24 ч) IC50 (мкМ)
	GMG-ITC	GRA
H460 wt	29±0,8	29±0,5
H460 S5	18±6,7	19±1
MCF7 п	21±5,7	27±4
MCF7 NEO	20±4,4	26±4
HL60	15±1	16±1
HCT116 p53 +/+	12±0,3	17±2,3
HCT116 p53 -/-	13±0,25	18±5,3
A2780	15±3	18±1
PRMI-8226	6±1	8±0,2

Данные, представленные в таблице, ясно показывают, что ITC является более цитотоксичным к миеломным клеточным линиям, по сравнению с другими клеточными линиями другого типа опухолей.

Исследования in vivo

В таблице 3 представлена противоопухолевая активность GMG-ITC, вводимого in vivo мышам с синдромом тяжелого комбинированного иммунодефицита (SCID mice) с трансплантированными подкожно клеточными линиями миеломы человека.

Таблица 3
Соединение	Курс лечения	Доза (мг/кг/инъекц.)	TWI %
GMG	p.o. q5d×2	400	62
GMG-ITC	i.p. q5d×2w	20	70

Когда GMG-ITC тестировали на клеточной линии A2780 рака яичника человека, противоопухолевая активность была низкой, как показано в таблице 4 ниже.

Таблица 4
Соединение	Курс лечения	Доза (мг/кг/инъекц.)	TWI %
GMG-ITC	i.p. q5d×2w	20	46

Claims (4)

1. Применение глюкоморингина и его дезтиогликозида, имеющих следующие формулы:

для получения лекарственного средства для лечения миеломы.

2. Применение по п.1, в котором лекарственным средством является глюкоморингин.

3. Применение по п.1, в котором лекарственным средством является глюкоморингин дезтиогликозид.

4. Применение по любому из пп.1-3, в котором миелома представляет собой множественную миелому.