ES2363385T3 - Uso de derivados de isotiocianato como agentes antimieloma. - Google Patents

Abstract

Uso de glucomoringina y de su des-tio-glucósido que tienen las siguientes fórmulas: para la preparación de un medicamento para el tratamiento de mieloma.

Description

La presente invención se refiere al uso de glucomoringina o del correspondiente derivado de isotiocianato como agentes antimieloma.

Antecedentes de la invención

Las verduras son la fuente más importante de compuestos con actividad quimiopreventiva: entre ellos, los isotiocianatos (ITC) producidos en Brassicaceae (por ejemplo brócoli, coles de Bruselas, coliflor, etc.) han despertado actualmente un gran interés desde el primer estudio de Sidransky sobre la inhibición del crecimiento tumoral inducida por ITC [1].

En las verduras, los ITC se almacenan en forma de precursores inactivos denominados glucosinolatos (GL) y pueden liberarse tras el daño al tejido mediante hidrólisis enzimática que implica mirosinasa (MYR, E.C. 1.2.1.147), una tioglucósido glucohidrolasa que se separa físicamente de los GL en condiciones normales [2,3].

Como la microflora intestinal de mamíferos, incluyendo seres humanos, tiene actividad de tipo mirosinasa, también pueden convertirse los GL en ITC en su tracto digestivo [4,5].

Se ha notificado que los ITC son inhibidores del crecimiento tumoral en diferentes estudios preclínicos in vivo [6-8] y además estudios epidemiológicos han mostrado una relación inversa entre el consumo dietético de Brassicaceae y el riego de desarrollar cáncer de pulmón, de mama y de colon [9-11].

Los ITC tienen muchos efectos a través de los cuales muestran su acción protectora frente a la evolución del cáncer: pueden i) inducir enzimas de fase 2 como la glutatión-S-transferasa (GST) y la quinona reductasa (QR) [12-15] a través de una ruta Nrf-2, ii) provocar apoptosis y detención del ciclo celular [16-18], iii) inhibir enzimas de fase 1 y genes relacionados con NF-kB [19,20].

En los últimos años se ha estudiado exhaustivamente el sulforano, debido a su papel como agente quimiopreventivo y diversos estudios han demostrado su posible uso como compuesto quimioterápico novedoso [7,11,20].

La glucomoringina (GMG) es un elemento poco común de la familia de los glucosinolatos (GL) y presenta una característica única que consiste en un segundo residuo sacarídico en su cadena lateral. Este GL es un metabolito secundario típico presente en verduras que pertenecen al género Moringaceae que consiste en 14 especies, entre las que M. oleifera es la más ampliamente distribuida. La M. oleifera es un árbol multiuso que crece en muchas regiones tropicales o ecuatoriales. El valor medicinal de las semillas y otras partes de la planta se ha reconocido hace mucho tiempo en la medicina popular [21]. Se ha mostrado que los isotiocianatos glicosilados (GMG-ITC), que resultan de la hidrólisis con mirosinasa de GMG, presentan una amplia actividad biológica y también se ha mostrado que ejercen una actividad promotora antitumoral eficaz [22]. El GMG-ITC puede purificarse en altas cantidades partiendo de GMG pura. El GMG-ITC es un compuesto sólido, inodoro y estable a temperatura ambiente que difiere de otros ITC bioactivos naturales que son líquidos, volátiles, con olor acre.

El mieloma múltiple es una enfermedad maligna de las células plasmáticas que se caracteriza por destrucción esquelética, insuficiencia renal, anemia e hipercalciemia [23]. La edad mediana en el diagnóstico es de 68 años. El mieloma representa el 1% de todas las enfermedades malignas en la población blanca y el 2% en la población negra y el 13% y el 33% respectivamente, de todos los cánceres hematológicos [24].

Los tratamientos para el mieloma incluyen tratamiento de apoyo y quimioterapia en infusión seguido para pacientes jóvenes de quimioterapia de dosis alta y un trasplante autólogo [25]. La explotación de la comprensión de la biología de los mielomas condujo al desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos [26]. Aunque se ha realizado un gran avance en el tratamiento de mieloma con estas nuevas terapias, no existe ningún papel en la actualidad para el reemplazamiento de la cura convencional. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de nuevos, agentes más activos y/o alternativos.

Descripción de la invención

Se ha encontrado ahora que la glucomoringina (GMG) o su des-tio-glucósido (GMG-ITC) que tienen las siguientes fórmulas:

imagen1

están dotados de una actividad citotóxica notable frente a líneas celulares de mieloma. También se ha confirmado in vivo la actividad en modelos experimentales.

La invención se refiere por consiguiente al uso de o bien GMG o bien GMG-ITC para la preparación de un medicamento para el tratamiento de mielomas, particularmente para el tratamiento de mieloma múltiple.

Para el uso terapéutico considerado, se formulará de manera adecuada GMG o GMG-ITC en formas farmacéuticas, particularmente para la administración entérica o parenteral, según métodos bien conocidos.

Los ejemplos de composiciones adecuadas incluyen comprimidos, cápsulas, suspensiones o disoluciones estériles para la inyección intramuscular o intravenosa, y similares. Los protocolos terapéuticos y las dosis reales dependerán como siempre de varios factores, concretamente características farmacocinéticas y toxicológicas, estados del paciente (peso, sexo y edad), estadio de la enfermedad. Un médico experto determinará fácilmente el régimen de dosificación más eficaz según los métodos establecidos. Se cree que las dosis terapéuticas eficaces en seres humanos oscilarán entre 1 mg/kg/día y 30 mg/kg/día, aunque no pueden descartarse dosificaciones mayores también en vista de la toxicidad limitada de tanto GMG como GMG-ITC.

Pueden usarse la GMG y el GMG-ITC como una terapia única o en combinación con otros agentes quimioterápicos conocidos ya disponibles para el tratamiento de mieloma.

La invención se describirá ahora en más detalle en los siguientes ejemplos.

EJEMPLO 1 Aislamiento y purificación de compuestos

Se aislaron GMG y GRA respectivamente de semillas de Moringa oleifera L. (fam. Moringaceae) y Brassica oleracea

L. (fam. Brassicaceae; var. acephala; subvar. laciniata). Se purificaron ambos GL en dos etapas secuenciales, mediante intercambio aniónico y cromatografía de exclusión molecular, según métodos notificados anteriormente [27, 28]. Se caracterizaron los GL individuales mediante espectrometría de 1H y 13C-RMN y se sometió a ensayo la pureza mediante análisis de HPLC del desulfoderivado según el método ISO 9167-1 [29] dando aproximadamente el 99% basado en el valor de área máxima, pero aproximadamente el 90-92% en peso debido a sus altas propiedades higroscópicas. Se asiló la enzima MYR a partir de semillas de Sinapis alba L. según un método notificado [30] con algunas modificaciones. La disolución madre usada en el presente estudio tenía una actividad específica de ~60 unidades/mg de proteína soluble y se mantuvo a 4°C tras la dilución en H2O a 34 U/ml. Se definió una unidad de MYR como la cantidad de enzima que puede hidrolizar 1 mol/min. de sinigrina a pH 6,5 y 37°C. Se almacenó la disolución de MYR a 4°C en agua destilada estéril hasta su uso. Se produjo GMG-ITC a través de hidrólisis catalizada por mirosinasa de GMG, realizada en tampón fosfato 0,1 M pH 6,5 a 37°C. Se preparó la mezcla de reacción disolviendo 7,0 gramos de GMG pura en 350 ml de tampón y después de añadir 40 U de mirosinasa se mantuvo la disolución a 37°C durante 4-6 horas. Se confirmó la conversión total de GMG pura en GMG-ITC mediante análisis de HPLC del desulfoderivado [29], lo que permitió monitorizar la reducción hasta la desaparición completa de GMG en la mezcla de reacción. Entonces se añadió acetonitrilo a la mezcla hasta que la concentración final fue del 10% y se purificó el GMG-ITC mediante cromatografía en fase inversa, que se realizó usando una columna HR 16/10 empaquetada con LiChrospher RP-C18 (MERCK) o SOURCE 15 RPC (Amersham Biosciences), conectada a un AKTA-FPLC equipado con un colector de fracciones Frac-900 y monitor UV UPC-900 (Amersham Biosciences). Tras lavar con acetonitrilo al 10%, se llevó a cabo una elución con un gradiente hasta acetonitrilo al 60%. Se recogieron las fracciones y se analizaron usando un sistema de HPLC Hewlett-Packard modelo 1100 con una columna Inertsil ODS3 (250 x 3 mm, 5 mm). Se realizó una cromatografía con velocidad de flujo de 1 ml/min. a 30°C eluyendo con un gradiente lineal de agua (A) y acetonitrilo (B) de B desde al 30% hasta el 80% en 20 min. Se detectó la elución de GMG-ITC mediante una red de diodos, monitorizando la absorbancia a 229 nm. Se recogieron las fracciones que contenían GMG-ITC (pureza máxima > 99%), se eliminó el disolvente mediante concentración en un evaporador rotatorio, y se liofilizó la disolución final. Se caracterizó la GMG-ITC y se identificó claramente mediante 1H y 13C-RMN y técnicas de espectrometría de masas.

EJEMPLO 2 Resultados biológicos Datos in vitro: La tabla 1 muestra la sensibilidad de la línea de célula tumoral de pulmón humana H460 frente a glucomoringina. El

aumento de la concentración de GMG en presencia de mirosinasa da como resultado un efecto citotóxico.

% de crecimiento de células con respecto al control

0

Tratamiento en 24 h Recuperación en 24 h Recuperación en 48 h

Controles

100 100 100 100

GMG (100 M)

100 98 100 100

GMG (7,5 M) + MYR (0,19 U)

100 75 72 80

GMG (10 M) + MYR (0,19 U)

100 63 51 69

GMG (15 M) + MYR (0,19 U)

100 33 20 24

GMG (20 M) + MYR (0,19 U)

100 28 17 8

La actividad citotóxica del isotiocianato derivado de Moringa (GMG-ITC) en un conjunto de líneas de células tumorales humanas. En la misma tabla los valores obtenidos con el sulforafano ITC (GRA) como un patrón de 10 referencia se notifican en la siguiente tabla 2.

Líneas celulares

Recuento celular (24 h) (CI50 (M)

GMG-ITC

GRA

H460 wt

29 ± 0,8 29 ± 0,5

H460 S5

18 ± 6,7 19 ± 1

MCF7 

27 ± 5,7 27 ± 4

MCF7 NEO

20 ± 4,4 26 ± 4

HL60

15 ± 1 16 ± 1

HCT116 p53 +/+

12 ± 0,3 17 ± 2,3

HVT116 p53 -/

13 ± 0,25 18 ± 5,3

A2780

15 ± 3 18 ± 1

RPMI-8226

6 ± 1 8 ± 0,2

Los datos notificados en la tabla muestran claramente que los ITC son más citotóxicos en líneas celulares de mieloma en comparación con otras líneas de células tumorales de un tipo de tumor diferente.

15 Estudios in vivo

En la tabla 3 se notifica la actividad antitumoral del GMG-ITC administrado in vivo en ratones SCID que portan líneas de células tumorales de mieloma humanas trasplantadas por vía subcutánea.

20

Compuesto

Programa de Dosis % de TWI

tratamiento

(mg/kg/iny.)

GMG

v.o. q5dx2 400 62

GMG-ITC

i.p q5dx2w 20 70

Cuando se sometió a prueba el GMG-ITC en el carcinoma ovárico humano A2780 la actividad antitumoral fue baja, tal como se notifica en la tabla 4 a continuación.

Compuesto

Programa de Dosis % de TWI

tratamiento

(mg/kg/iny.)

GMG-ITC

i.p q5dx2w 20 46

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Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   1. Uso de glucomoringina y de su des-tio-glucósido que tienen las siguientes fórmulas:

   imagen1

   5

   para la preparación de un medicamento para el tratamiento de mieloma.
2. 2. Uso según la reivindicación 1, en el que el medicamento es glucomoringina.

   10 3. Uso según la reivindicación 1, en el que el medicamento es des-tio-glucósido de glucomoringina.
3. 4. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el mieloma es mieloma múltiple.