JP2011509955A - 抗骨髄腫薬としてのイソチオシアネート誘導体の使用 - Google Patents

Abstract

要約
本発明は、骨髄腫治療のための薬剤を調製するための、以下の式（Ｉ、ＩＩ）を有するグルコモリンギンおよびそのデスチオグルコシドの使用に関する。

Description

本発明は、抗骨髄腫薬としてのグルコモリンギンまたは対応するイソチオシアネート誘導体の使用に関する。

発明の背景
植物は、化学的予防活性を有する最も重要な化合物源である。この中で、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）（例えば、ブロッコリー、芽キャベツ、カリフラワーなど）において産生されるイソチオシアネート（ＩＴＣ）は、ＩＴＣに誘発された腫瘍増殖阻害についてのＳｉｄｒａｎｓｋｙの最初の研究［１］以来、現在、多くの興味を引きつけている。

植物において、ＩＴＣは、グルコシノレート（ＧＬ）と呼ばれる不活性な前駆物質の形で貯蔵され、ミロシナーゼ（ＭＹＲ、Ｅ．Ｃ．１．２．１．１４７）（通常の条件下でＧＬから物理的に単離されるチオグルコシドグルコヒドロラーゼ）が関与する酵素加水分解による組織損傷後に、放出させることができる［２、３］。

ヒトを含む哺乳動物の腸管微生物叢は、ミロシナーゼ様の活性を有するので、ＧＬは、これらの消化管においてもＩＴＣへ変換させることができる［４、５］。

ＩＴＣは、様々な生体内前臨床試験において、腫瘍増殖の阻害因子であると報告されており［６−８］、その上、疫学調査により、アブラナ科の食事摂取と、肺癌、乳癌および結腸癌の発症リスクとの間に反比例の関係があることが示された［９〜１１］。

ＩＴＣは、癌の進行に対する防御作用を示す多くの作用を有する。すなわち、ＩＴＣは、ｉ）Ｎｒｆ−２経路を通り、グルタチオンＳ転移酵素（ＧＳＴ）およびキノン還元酵素（ＱＲ）のような第二相酵素を誘発することができ［１２〜１５］、ｉｉ）細胞周期停止およびアポトーシスを引き起こすことができ［１６〜１８］、ｉｉｉ）第一相酵素およびＮＦ−κＢ関連遺伝子を阻害することができる［１９、２０］。

スルホラファンは、化学的予防薬としての役割により、近年広範囲に研究され、様々な研究により、新規な化学療法の化合物としてのその潜在的使用が実証された［７、１１、２０］。

グルコモリンギン（ＧＭＧ）は、グルコシノレート（ＧＬ）群の中では珍しい一員であり、その側鎖に第２の糖残基を含有する特異な特徴を示す。このＧＬは、１４種類から成るワサビノキ（Ｍｏｒｉｎｇａｃｅａｅ）属に属する植物（この中では、Ｍ．オレイフェラ（Ｍ．ｏｌｅｉｆｅｒａ）が最も広く分布している）において存在する、典型的な二次代謝産物である。Ｍ．オレイフェラは、多くの熱帯または赤道地域で成長する多目的な樹木である。この植物の種子および他の部分の医療価値が、民間療法において長い間認識されてきた［２１］。ＧＭＧのミロシナーゼ加水分解から生じるグリコシル化イソチオシアネート（ＧＭＧ−ＩＴＣ）は、広範囲の生物活性を表すことが示され、効果的な抗腫瘍促進活性を発揮することも示された［２２］。ＧＭＧ−ＩＴＣは、純ＧＭＧから出発して、多量に精製することができる。ＧＭＧ−ＩＴＣは、液体で揮発性で刺激臭を有する他の天然の生物活性なＩＴＣとは異なり、室温で固体、無臭および安定な化合物である。

多発性骨髄腫は、形質細胞の悪性疾患であり、骨格破壊、腎不全、貧血および高カルシウム血により特徴付けられる［２３］。診断時の年齢中央値は、６８歳である。骨髄腫は、白人人口では全ての悪性疾患の１％、黒人人口では２％を占め、全ての血液癌の中では、それぞれ１３％および３３％を占める［２４］。

骨髄腫治療としては、補助的治療および静注化学療法が挙げられ、若年患者には、これに続いて高用量化学療法および自己移植も挙げられる［２５］。骨髄腫の生物学についての理解を活用することが、新たな治療的手法の開発につながる［２６］。この新たな治療法を用いる骨髄腫の治療では大幅な進展があったが、現在、標準療法の代用の役割はない。したがって、新規の、より活性のある、かつ／または代替となる薬剤が依然として必要とされている。

Sidransky H,Ito N,Verney E.(1966),J Natl Cancer Inst.1966 Nov;37(5):677-86 Fenwick,G.R.,Heaney,R.K.& Mullin,W.J.(1983),CRC Crit.Rev.Food Sci.Nutr.18:123-201 Fahey.J.W.,Zalcmann,A.T.& Talaly,P.(2001), Phytochemisty 56:5-51. Shapiro TA,Fahey JW,Wade KL,Stephenson KK,Talalay P.(1998),Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.1998 Dec;7(12):1091-100 Getahun SM,Chung FL.(1999),Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.1999May;8(5):447-51 Zhang Y,Talalay P.(1994),Cancer Res.1994 Apr 1;54(7Suppl):1976s-1981s.Review. Hecht SS.(2000),Drug Metab Rev.20 Aug-Nov;32(3-4):395-411.Review Conaway,C.C.,Yang,Y.-M.& Chug,F.-L.(2002),Curr.Drug Metab.3:233-255 Fowke JH,Chung FL,Jin F,Qi D,Cai Q,Conaway C,Cheng JR,Shu XO,Gao YT,Zheng W.(2003),Cancer Res.2003 Jul 15;63(14):3980-6. Zhao B,Seow A,Lee EJ,Poh WT,Teh M,Eng P,Wang YT,Tan WC,Yu MC,Lee HP.(2001),Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.2001 Oct;10(10):1063-7 Conaway CC,Wang CX,Pittman B,Yang YM,Schwartz JE,Tian D, Mclntee EJ,Hecht SS,Chung FL.(2005),Cancer Res.Sep 15;65(18):8548-57. Steinlellner,H.,Rabot,S.,Freywald,C.,Nobis,E.,Scharf,G.Chabicvsky,M.,Knasmu ller, S.& Kassie,F.(2001),Mutat.Res.480-481:285-297. Talalay,P.& Fahey,J.W.(2001),J.Nutr. 131:3027S-3033S. Brooks,J.D.,Paton,V.G & Vidanes,G.(2001),Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.10:949-954 McWalter GK,Higgins LG,McLellan LI,Henderson CJ,Song L,Thornalley PJ,Itoh K,Yamamoto M,Hayes JD.(2004),J Nutr Dec:134(12Suppl):3499S-3506S. Xu C,Shen G,Chen C,Gelinas C,,Kong AN.(2005),Oncogene.Jun 30;24(28):4486-95 Heiss E,Herhaus C,Klimo K,Bartsch H,Gerhauser C.(2001),J Biol Chem.2001 Aug 24;276(34):32008-15. Anwar F.,Latif S.,Ashraf M.,Gilani A.H.(2007),Phytother Res 21 17-25. Guevara A.P.,Vargas C.,Sakurai H.,Fujiwara Y.,Hashimoto K.,Maoka T.,Kozuka M.,Ito Y.,Tokuda H.,Nishino H.(1999),Mutation Research 440:181-188. yle RA,Raikumar SV(2004).,Doldman L.,Ausiello DA.,eds.Cecile texbooks of medicine.22nd ed.Philadelphia: W.B.Saunders:1184-95. Longo PL(2001).,Braunwald E,Kasper D,Faucci A.eds Harrison'sprinciples of internal medicine,15th edn,vol.1:727-33. yle RA,Raikumar SV(2004).,N Engl J Med,351:1860-73. Sirohi B.,Powles R.(2004),The Lancet,vol 363:875-887. Barillari J,Gueyrard D,Rollin P,Iori R.(2001), Fitoterapia 72,760-764. Barillari J,Canistro D,Paolini M,Ferroni F,Pedulli GF,Iori R,Valgimigli L.(2005),J.Agric.Food Chem.53,2475-2482. EEC Regulation No1864/90(1990) Enclosure VIII.Offic.Eur.Commun.L170:27-34 Pessina A,Thomas RM,Palmieri S,Luisi PL.(1990),Arch.Biochem.Biophys.280;383-389.

本発明の説明
ここで、以下の式：

を有するグルコモリンギン（ＧＭＧ）またはそのデスチオグルコシド（ＧＭＧ−ＩＴＣ）は、骨髄腫の細胞株に対する顕著な細胞毒性を備えることが分かった。この活性は、また実験モデルにおける生体内でも確認された。

したがって、本発明は、骨髄腫の治療、特に多発性骨髄腫の治療のための薬剤を調製するための、ＧＭＧまたはＧＭＧ−ＩＴＣのいずれかの使用に関する。

熟考の上での治療的使用のために、ＧＭＧまたはＧＭＧ−ＩＴＣは、よく知られた方法に従って、特に、腸内または非経口投与のための剤形に適切に調合されるであろう。

適切な組成物の例としては、錠剤、カプセル、筋内または静脈内注射のための滅菌溶液もしくは懸濁液などが挙げられる。実際の用量および治療プロトコルは、従来通り数種の因子、すなわち薬物動態学的および毒物学的特性、患者の条件（体重、性別および年齢）、疾患の段階（ｓｔａｄｉａｔｉｏｎ）に依存するであろう。熟練した開業医は、確認された方法に従って、最も有効な投薬計画を容易に決定するであろう。ヒトの治療有効量は、ＧＭＧおよびＧＭＧ−ＩＴＣ両方の制限毒性を考慮して、より高用量もまた除外できないが、１ｍｇ／Ｋｇ／１日〜３０ｍｇ／Ｋｇ／１日の間で変動するであろうと考えられる。

ＧＭＧおよびＧＭＧ−ＩＴＣは、単独療法として、または骨髄腫の治療にすでに利用可能な、他の既知の化学療法剤と組み合わせて使用してもよい。

本発明を、ここで、以下の例でより詳細に説明する。
例１ 化合物の単離および精製
ＧＭＧおよびＧＲＡは、それぞれ、モリンガ・オレイフェラＬ．（Ｍｏｒｉｎｇａ ｏｌｅｉｆｅｒａ Ｌ．）（カラシノキ科）およびブラッシカ・オレラケアＬ．（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．）（アブラナ科；変種ａｃｅｐｈａｒａ；亜種ｌａｃｉｎｉａｔａ）種子からそれぞれ単離された。両ＧＬは、以前に報告された方法［２７、２８］に従って、アニオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによる、２つの連続ステップで精製した。個々のＧＬは、¹Ｈ ＮＭＲ分光法および¹³Ｃ ＮＭＲ分光法によって特徴付け、精製物を、ＩＳＯ ９１６７−１法［２９］に従って、脱スルホ化誘導体のＨＰＬＣ分析によって分析すると、ピーク面積値基準の収量が約９９％であったが、これらは吸湿性が高いため、重量基準で約９０〜９２％であった。酵素ＭＹＲは、報告された方法［３０］にいくつかの変更を加えて、シロガラシＬ．（Ｓｉｎａｐｉｓ ａｌｂａ Ｌ．）の種子から単離した。本試験で使用した貯蔵液は、可溶性タンパク質の比活性度が約６０単位／ｍｇであり、Ｈ₂Ｏ中で３４Ｕ／ｍｌに希釈した後、４℃で保存した。１ＭＹＲ単位は、ｐＨ６．５および３７℃において、シニグリンを１μモル／分で加水分解できる酵素量として規定した。ＭＹＲ溶液は、使用するまで滅菌蒸留水中、４℃で保管した。ＧＭＧ−ＩＴＣは、ミロシナーゼ触媒によるＧＭＧの加水分解を介して生成させた（３７℃において、ｐＨ６．５の０．１Ｍリン酸バッファー中で行った）。反応混合物は、７．０グラムの純ＧＭＧを３５０ｍＬのバッファー中で溶解した後、４０Ｕのミロシナーゼを加え、溶液を３７℃で４〜６時間保存して調製した。純ＧＭＧのＧＭＧ−ＩＴＣへの完全な変換は、脱スルホ化誘導体のＨＰＬＣ分析によって確認し［２９］、これにより、我々は、反応混合物中におけるＧＭＧの完全消失まで、還元を監視することができた。次に、アセトニトリルを、最終濃度が１０％になるまで混合物に加え、ＧＭＧ−ＩＴＣを逆相クロマトグラフィーによって精製した（この操作は、Ｆｒａｃ−９００フラクションコレクターおよびＵＶモニターＵＰＣ−９００（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｅｎｃｅｓ）を備え付けたＡＫＴＡ−ＦＰＬＣに接続した、ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ ＲＰ−Ｃ１８（ＭＥＲＣＫ）またはＳＯＵＲＣＥ１５ ＲＰＣ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を充填したＨＲ１６／１０カラムを使用して行った）。アセトニトリル１０％で洗浄後、溶出を、６０％のアセトニトリルまで勾配をかけて行った。画分を収集し、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ３カラム（２５０ｘ３ｍｍ、５ｍｍ）を有する、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄモデル１１００ ＨＰＬＣシステムを用いて分析した。クロマトグラフィーは、３０℃において、流速１ｍＬ／分で、水（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）の直線勾配を、２０分間でＢの３０％から８０％かける溶出により行った。ＧＭＧ−ＩＴＣの溶出は、２２９ｎｍにおける吸収を監視しながら、ダイオードアレイで検出した。ＧＭＧ−ＩＴＣ（ピーク純度＞９９％）を含有する画分を収集し、溶媒をロータリーエバポレーター内での濃縮により除去し、最終溶液を凍結乾燥した。ＧＭＧ−ＩＴＣを、¹Ｈ ＮＭＲおよび¹³Ｃ ＮＭＲ、ならびに質量分析法により特徴付け、明白に同定した。
例２ 生物学的結果
試験管内データ：
表１は、グルコモリンギンに対するＨ４６０ヒト肺腫瘍細胞株の感受性を示す。ミロシナーゼ存在下のＧＭＧの濃度増大は、細胞毒性作用をもたらす。

一連のヒト腫瘍細胞株に対するモリンガ由来のイソチオシアネート（ＧＭＧ−ＩＴＣ）の細胞毒性。同表において参照基準としてＩＴＣのスルホラファン（ＧＲＡ）で得られた値を次の表２で報告する。

表中で報告したデータから、骨髄腫細胞株は、異なる腫瘍型の他の腫瘍細胞株と比べて、ＩＴＣの細胞毒性が高いことが明確に示されている。
生体内試験
表３では、皮下注射で移植したヒト骨髄腫の腫瘍細胞株を有するＳＣＩＤマウスに生体内投与したＧＭＧ−ＩＴＣの抗腫瘍活性を報告する。

ヒト卵巣癌Ａ２７８０においてＧＭＧ−ＩＴＣを試験すると、以下の表４に報告する通り、抗腫瘍活性は低かった。

[参考文献]

Claims (4)

1. 骨髄腫治療のための薬剤を調製するための、以下の式：
   

   

   を有するグルコモリンギンおよびそのデスチオグルコシドの使用。
2. 前記薬剤がグルコモリンギンである、請求項１に記載の使用。
3. 前記薬剤がグルコモリンギンのデスチオグルコシドである、請求項１に記載の使用。
4. 前記骨髄腫が多発性骨髄腫である、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。