JP6588764B2 - 抗腫瘍剤 - Google Patents

Description

本発明は、優れた抗腫瘍作用を発揮する抗腫瘍剤に関する。

ビタミンＣとして知られるＬ−アスコルビン酸は、抗腫瘍作用を有することが知られている。Ｌ−アスコルビン酸は、鉄などの遷移金属の還元を通し、間接的に過酸化酸素などの活性酸素種（Reactive Oxygen Species；ＲＯＳ）を発生させる。腫瘍は、一般的に、正常細胞と比較してＲＯＳに対する抵抗性が弱いことから、アスコルビン酸の投与により、腫瘍組織に対して選択的に傷害を与えることができる。そこで、悪性腫瘍の治療法として、例えば高濃度のアスコルビン酸を点滴静注する高濃度アスコルビン酸点滴療法が注目されている。

しかしながら、Ｌ−アスコルビン酸で抗腫瘍作用を期待するには高濃度で大量投与する必要があり、点滴投与にかかる時間も長く、患者に負担がかかり、治療回数の制限にも結びついている。Ｌ−アスコルビン酸よりも強い抗腫瘍作用を示し、同じように安全な抗腫瘍剤が望まれている。

そこで、従来、種々のＬ−アスコルビン酸誘導体を含む抗腫瘍剤が提案されている。例えば、特許文献１にはＯ−ベンジリデン−アスコルビン酸を抗腫瘍剤として使用できることが開示されている。また、特許文献２には、ベンジリデン部のアルデヒド基の少なくとも１位を重水素置換した５，６−Ｏ−ベンジリデン−Ｌ−アスコルビン酸を抗腫瘍剤として使用できることが開示されている。さらに、特許文献３には、５，６−（３−ニトロ）ベンジリデン−Ｌ−アスコルビン酸を抗腫瘍剤として使用できることが開示されている。

特開昭６０−１３９６１９号公報 特開平０２−０９６５２４号公報 特開平０５−００４９８５号公報

しかしながら、特許文献１〜３に記載のＬ−アスコルビン酸の誘導体では、体内における安定性に欠け、依然として十分な抗腫瘍効果を得ることが難しかった。

以上のような事情に鑑み、本発明の目的は、Ｌ−アスコルビン酸の誘導体を利用して、優れた抗腫瘍作用を発揮する抗腫瘍剤を提供することである。

本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、(i)Ｌ−アスコルビン酸の２位に結合しているヒドロキシル基が、体内で分解されてヒドロキシル基に変換されることが可能な置換基に置換されている、又は未置換であり、且つＬ−アスコルビン酸の６位に結合しているヒドロキシル基が、分岐を有するアシル基によってアシル化されている、Ｌ−アスコルビン酸のアシル化誘導体、(ii)その立体異性体、及び／又は(iii)それらの薬学的に許容される塩は、格段に優れた抗腫瘍作用を発揮し得ることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、さらに検討を重ねることにより完成したものである。

すなわち、本発明の一態様は、(i)Ｌ−アスコルビン酸の２位に結合しているヒドロキシル基が、体内で分解されてヒドロキシル基に変換されることが可能な置換基に置換されている、又は未置換であり、且つＬ−アスコルビン酸の６位に結合しているヒドロキシル基が、分岐を有するアシル基によってアシル化されている、Ｌ−アスコルビン酸のアシル化誘導体、(ii)その立体異性体、及び(iii)それらの薬学的に許容される塩よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする抗腫瘍剤である。このような態様の抗腫瘍剤は、従来のＬ−アスコルビン酸と比較して高い抗腫瘍作用を有する。また、Ｌ−アスコルビン酸の２位に置換基が結合している場合には、熱、光、酸素等に対して高い安定性を有するものとすることができる。

また、本発明の一態様では、上記Ｌ−アスコルビン酸のアシル化誘導体が、下記の一般式（１）で表される化合物、その立体異性体、又はそれらの薬学的に許容される塩であってもよい。
［式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれ炭素数１〜９の直鎖又は分岐状のアルキル基を示し、Ｒ３は体内で分解されてヒドロキシル基に変換されることが可能な置換基、又はヒドロキシル基を示す。］

さらに、本発明の一態様では、上記一般式（１）において、上記Ｒ１がＣＨ₃（ＣＨ₂）_mであり、上記Ｒ２がＣＨ₃（ＣＨ₂）_nであってもよい。ここで、ｍ及びｎは、それぞれ０〜３の整数である。このようなアシル基を有する上記アシル化誘導体を用いることにより、低量で、かつ高い抗腫瘍作用を発揮する抗腫瘍剤を提供することができる。

また、本発明の一態様では、上記一般式（１）において、上記Ｒ３が、グリコシル基及びリン酸基のうちのいずれか一方であってもよい。これにより、上記抗腫瘍剤の２位の置換基が、体内のグリコシダーゼ又はホスファターゼによって容易に分解を受け得る。したがって、当該分解によって変換された化合物、すなわち分岐を有するアシル基が結合されたアスコルビン酸及びアスコルビン酸が腫瘍組織に作用し、高い抗腫瘍作用を発揮することができる。

より具体的には、上記グリコシル基が、α−Ｄ−モノグルコピラノシル基であってもよい。

また、上記抗腫瘍剤は、静脈内投与用であってもよい。これにより、血中へ直接上記抗腫瘍剤を投与することができ、抗腫瘍効果を高めることができる。

さらに、上記静脈内投与が点滴静脈注射によるものであってもよい。これにより、所望の量の上記抗腫瘍剤を、一定時間にわたり持続的に血中へ投与することができる。

本発明によれば、優れた抗腫瘍作用を発揮する抗腫瘍剤が提供されるので、癌患者に対して新たな治療方策を提供でき、癌患者に福音をもたらすことができる。

試験例１の結果を示すグラフであり、横軸が実施例１、比較例１〜３の各薬剤の投与開始日（０日）からの経過日数、縦軸は後述する式（３）により算出した腫瘍体積を示す。 試験例２において、実施例１に係る薬剤（２−Ｏ−α−Ｄ−モノグルコシル−６−Ｏ−（２−プロピルペンタノイル）−Ｌ−アスコルビン酸：６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ）を投与した場合のＡＡ（アスコルビン酸）の量を示すグラフであり、横軸は薬剤の投与開始時（０時間）からの経過時間、縦軸は各組織サンプル及び血漿サンプル中の濃度（量）を示す。 試験例２において、実施例１に係る薬剤（６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ）を投与した場合のＡＡ−２Ｇ（２−Ｏ−α−Ｄ−モノグルコシル−Ｌ−アスコルビン酸）の量を示すグラフであり、横軸は薬剤の投与開始時（０時間）からの経過時間、縦軸は各組織サンプル及び血漿サンプル中の濃度（量）を示す。 試験例２において、実施例１に係る薬剤（６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ）を投与した場合の６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ（６−Ｏ−（２−プロピルペンタノイル）−Ｌ−アスコルビン酸）の量を示すグラフであり、横軸は薬剤の投与開始時（０時間）からの経過時間、縦軸は各組織サンプル及び血漿サンプル中の濃度（量）を示す。 試験例２において、比較例１に係る薬剤（２−Ｏ−α−Ｄ−モノグルコシル−６−Ｏ−オクタノイル−Ｌ−アスコルビン酸：６−ｓＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ）を投与した場合のＡＡの量を示すグラフであり、横軸は薬剤の投与開始時（０時間）からの経過時間、縦軸は各組織サンプル及び血漿サンプル中の濃度（量）を示す。 試験例２において、比較例１に係る薬剤（６−ｓＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ）を投与した場合のＡＡ−２Ｇの量を示すグラフであり、横軸は薬剤の投与開始時（０時間）からの経過時間、縦軸は各組織サンプル及び血漿サンプル中の濃度（量）を示す。 試験例２において、比較例２に係る薬剤（ＡＡ）を投与した場合のＡＡの量を示すグラフであり、横軸は薬剤の投与開始時（０時間）からの経過時間、縦軸は各組織サンプル及び血漿サンプル中の濃度（量）を示す。 試験例５の結果を示すグラフであり、横軸が試験開始日（０日）からの経過日数、縦軸は後述する式（３）により算出した腫瘍体積を示す。 試験例２の結果に基づいて予測される６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ（実施例１）と６−ｓＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ（比較例１）の体内の代謝パターンの違いを説明する図である。

本発明の抗腫瘍剤は、(i)特定のＬ−アスコルビン酸（以下、ＡＡとも称する）のアシル化誘導体（以下、ＡＡ誘導体とも称する）、(ii)その立体異性体、及び(iii)それらの薬学的に許容される塩よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分として使用することを特徴とする。以下、本発明を詳細に説明する。

＜有効成分＞
(i)Ｌ−アスコルビン酸のアシル化誘導体
Ｌ−アスコルビン酸の構造式は、以下の一般式（２）で示される。

本発明で使用されるＡＡ誘導体は、Ｌ−アスコルビン酸の２位に結合しているヒドロキシル基が、体内で分解されてヒドロキシル基に変換されることが可能な置換基に置換されている、又は未置換であり、且つＬ−アスコルビン酸の６位に結合しているヒドロキシル基が、分岐を有するアシル基によってアシル化されている。

上記ＡＡ誘導体において、Ｌ−アスコルビン酸の２位に結合しているヒドロキシル基が未置換である化合物（以下、Ａｃｙｌ−ＡＡとも称する）は、体内で一部が分解を受けてＡＡに変換され得る。２位の炭素原子に置換基が置換している場合には、体内で当該置換基が分解され、後述するように、Ａｃｙｌ−ＡＡ及びＡＡに変換され得る。Ａｃｙｌ−ＡＡやＡＡは、ＲＯＳを発生させ、腫瘍組織に対して選択的に傷害を与えることができるため、本発明の抗腫瘍剤は、高い抗腫瘍作用を発揮することができる。

本発明で使用されるＡＡ誘導体において、体内で分解されヒドロキシル基に変換されることが可能な置換基とは、グルコシダーゼ、ホスファターゼ、その他の酵素により体内で分解され、ヒドロキシル基に変換されることが可能な置換基をいうものとする。

当該置換基としては、体内でヒドロキシル基に変換され得ることを限度として特に制限されないが、例えば、グリコシル基、リン酸基、スルホ基等が挙げられる。これらの置換基の中でも、好ましくはグリコシル基又はリン酸基である。本発明で使用されるＡＡ誘導体において、２位に結合しているヒドロキシル基が上記置換基で置換されている場合には、光や熱、酸素等に対するＡＡ誘導体の安定性を高めることができる。

上記グリコシル基は、糖類の１位（フルクトースの場合には２位）の水酸基の水素原子を除去して得られる残基である。上記グリコシル基を構成する糖類の種類については、特に制限されず、例えば、単糖であってもよく、また２〜６糖のオリゴ糖であってもよい。上記グリコシル基としては、好ましくは単糖類の残基が挙げられる。

上記グリコシル基として、具体的には、α−Ｄ−モノグルコピラノシル基、β−Ｄ−モノグルコピラノシル基等のグルコピラノシル基；β−Ｄ−モノガラクトピラノシル基等のガラクトピラノシル基等が挙げられる。これらのグリコシル基の中でも、より好ましくはグルコピラノシル基、さらに好ましくはα−Ｄ−モノグルコピラノシル基が挙げられる。このようなグリコシド基を使用することにより、光や熱、酸素等に対するＡＡ誘導体の安定性を高めることができるとともに、ＡＡ誘導体を容易に製造することができる。

上記リン酸基としては、例えば、モノホスホリル基、ピロホスホリル基、トリホスホリル基、及びポリホスホリル基等が挙げられる。

本発明で使用されるＡＡ誘導体において、アシル化とは、アスコルビン酸の６位のヒドロキシル基にアシル基を導入することをいう。本発明のＡＡ誘導体が分岐を有するアシル基を含むことにより、後述するように、体内においてアシル基が加水分解されにくくなり、ＡＡ以外にＡｃｙｌ−ＡＡを作用本体として機能させることができる。

本発明で使用されるＡＡ誘導体において、分岐を有するアシル基は、飽和又は不飽和のアシル基のいずれであってもよい。また、分岐を有するアシル基において、分岐の数については、特に制限されず、１個であってもよく、また２〜４個であってもよい。さらに、分岐を有するアシル基において、分岐の位置については、特に制限されず、アシル基のα位の炭素原子から分岐していてもよく、またそれ以外の炭素原子から、分岐していてもよい。

また、分岐を有するアシル基の炭素数については、特に制限されないが、例えば４〜２０、好ましくは４〜１２、より好ましくは４〜１０が挙げられる。

分岐を有するアシル基の好適な一態様として、飽和のアシル基であって、α位の炭素原子において分岐しているものが挙げられる。

また、分岐を有するアシル基の一態様として、以下の一般式（３）で示されるアシル基が挙げられる。このような構造のアシル基を含むことによって、上記ＡＡ誘導体をより好適な立体構造とすることができ、抗腫瘍作用をより一層高めることができる。

一般式（３）中、ｘは０〜２の整数、好ましくは０又は１の整数、より好ましくは０を示す。

一般式（３）中、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ、炭素数１〜９の直鎖又は分岐状のアルキル基を示す。Ｒ１及びＲ２として、好ましくは炭素数１〜５の直鎖又は分岐状のアルキル基、好ましくは炭素数１〜４の直鎖状のアルキル基、さらに好ましくは炭素数２又は３の直鎖状のアルキル基が挙げられる。Ｒ１及びＲ２は、同一の構造であってもよく、また相互に異なる構造であってもよい。

上記ＡＡ誘導体の好適な一態様として、以下の一般式（１）で示される化合物が挙げられる。このような構造のＡＡ誘導体を用いることにより、より高い抗腫瘍作用を有する抗腫瘍剤を提供することができる。

一般式（１）式中、Ｒ１及びＲ２はそれぞれアルキル基を示し、Ｒ３は、体内で分解されヒドロキシル基に変換されることが可能な置換基、又はヒドロキシル基を示す。

一般式（１）におけるＲ１の炭素数及び構造は、上記一般式（３）におけるＲ１と同様であるが、好ましくはＣＨ₃（ＣＨ₂）_mが挙げられる。ここで、ｍは、０〜３の整数、好ましくは１又は２である。

また、一般式（１）におけるＲ２の炭素数及び構造は、上記一般式（３）におけるＲ２と同様であるが、好ましくはＣＨ₃（ＣＨ₂）_nが挙げられる。ここで、ｎは、０〜３の整数、好ましくは１又は２である。

一般式（１）におけるＲ１がＣＨ₃（ＣＨ₂）_mであり、且つＲ２がＣＨ₃（ＣＨ₂）_nである場合には、ＡＡ誘導体をより一層効果的に所望の立体構造とすることができ、抗腫瘍作用を格段に高めることができる。

一般式（１）におけるＲ３は、体内で分解されヒドロキシル基に変換されることが可能な置換基、又はヒドロキシル基であり、その具体例については前述する通りである。Ｒ３が、上記置換基である場合には、光や熱、酸素等に対するＡＡ誘導体の安定性を高めることができるので、好適である。

(ii)Ｌ−アスコルビン酸のアシル化誘導体の立体異性体
本発明で使用されるＡＡ誘導体の立体異性体としては、具体的には、上記ＡＡ誘導体におけるＬ−アスコルビン酸の骨格部分がエリソルビン酸に置き換わった化合物が挙げられる。

(iii)Ｌ−アスコルビン酸のアシル化誘導体及び／又はその立体異性体の塩
ＡＡ誘導体及び／又はその立体異性体の塩としては、薬学的に許容されることを限度として、特に制限されないが、特に毒性の低いものが好ましい。ＡＡ誘導体及び／又はその立体異性体の塩は、無機塩基との塩であってもよく、有機塩基との塩であってもよい。

ＡＡ誘導体及び／又はその立体異性体の塩を生成させる無機塩基としては、例えば、アルカリ金属（例えばナトリウム、カリウム等）、アンモニウム、アルカリ土類金属（例えばカルシウム、マグネシウム、ストロンチウム、バリウム等）、アルミニウム塩等が挙げられる。また、ＡＡ誘導体及び／又はその立体異性体の塩を生成させる有機塩基としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ジシクロヘキシルアミン等が挙げられる。これらの中でも、無機塩基、とりわけナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウムが好適である。ＡＡ誘導体及び／又はその立体異性体の塩は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。

また、ＡＡ誘導体及び／又はその立体異性体の塩としては、例えば、Ｌ−アスコルビン酸の３位が陰イオンとなる構造であってもよいし、Ｌ−アスコルビン酸の２位に置換基を有する場合には、当該置換基が陰イオンとなる構造であってもよい。

有効成分の組み合わせ態様
本発明の抗腫瘍剤は、有効成分として、(i)ＡＡ誘導体、(ii)その立体異性体、及び(iii)それらの薬学的に許容される塩の中から、１種を単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。

有効成分の製造方法
ＡＡ誘導体、その立体異性体、及びそれらの塩は、公知の合成法に従って製造することができる。例えば、ＡＡ誘導体の場合であれば、その製造方法は、種々の方法を採り得るが、具体的には、特開２００３−３００９９４号公報に記載されている方法を参照することができる。

例えば、Ｌ−アスコルビン酸の２位にヒドロキシル基を有するＡＡ誘導体の場合であれば、その製造方法として、Ｌ−アスコルビン酸に対してアシル化剤等を用いて６位のヒドロキシル基をアシル化する方法が挙げられる。また、Ｌ−アスコルビン酸の２位に置換基を有するＡＡ誘導体の場合であれば、２位のヒドロキシル基をグリコシル化又はリン酸化等により置換基を付与した後、アシル化剤等を用いて６位のヒドロキシル基をアシル化してもよい。

グリコシル化された２−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸は、例えば、市販されているものを用いることができる。あるいは、２−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸は、公知の方法によっても得ることができる（特開平３−１３９２８８号公報、特開平３−１３５９９２号公報、特開平３−１８３４９２号公報、特開平６−２６３７９０号公報等参照）。

２−リン酸−Ｌ−アスコルビン酸も同様に、公知の方法によって得ることができ、又は市販されている２−リン酸−Ｌ−アスコルビン酸又はその塩（２−リン酸−Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム等）を用いることができる。

さらに、Ｌ−アスコルビン酸の２位に置換基を有するＡＡ誘導体の場合であれば、その製造方法として、Ｌ−アスコルビン酸の６位のヒドロキシル基をアシル化した後、２位のヒドロキシル基を置換基と置換することもできる。

これらの方法によって得られたＡＡ誘導体、その立体異性体、及びそれらの塩は、Ｌ−アスコルビン酸の脂肪酸エステルを精製するための通常の方法を適用することにより精製することができる。精製方法としては、例えば、塩析、透析、濾過、濃縮、分別沈澱、分液抽出、ゲルクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ、ガスクロマトグラフィ、親和クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、等電点電気泳動、結晶化等が挙げられる。これらは、適宜組合せて適用されてもよい。

ＡＡ誘導体及びその立体異性体の製造に用いられるアシル化剤としては、酸又は酸ハライド、酸無水物若しくは酸エステル等が挙げられる。より具体的には、アシル化剤として、２−エチルブタン酸、２−プロピルペンタン酸、２−ブチルヘキサン酸、２−エチルヘキサン酸、イソパルミチン酸、イソステアリン酸、２−ペンチルへプタン酸などのカルボン酸、酸ハライド、酸無水物、カルボン酸エステル等が挙げられる。

ＡＡ誘導体及びその立体異性体におけるアシル化は、典型的には反応系への水の侵入を遮断した非水系の化学反応により行うことができる。この場合、例えば、ピリジン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド等の有機溶剤中で、必要に応じて、ｐ−トルエンスルホン酸などの触媒を共存させて、２−グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン等にカルボン酸無水物を反応させることができる。

あるいは、ＡＡ誘導体及びその立体異性体におけるアシル化は、酵素反応によっても行うことができる。この場合は、グリコシル−Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン等とアシル化剤とを基質として適用し、これらの基質と酵素に応じた有機溶剤を適宜用いることができる。

＜腫瘍＞
本発明において腫瘍とは、悪性腫瘍及び良性腫瘍の双方を含む。本発明の抗腫瘍剤は、正常細胞と比較してカタラーゼ等の抗酸化酵素活性が低い腫瘍組織に対して有効である。

本発明の抗腫瘍剤の適用対象となる腫瘍の例としては、例えば、乳ガン、前立腺ガン、直腸ガン、肺ガン、悪性リンパ腫、大腸ガン、膵臓ガン、卵巣ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、子宮ガン、多発性骨髄腫、皮膚ガン等が挙げられる。

また、本発明の抗腫瘍剤は、ヒト、及びヒト以外の動物（例えば、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、イタチ、ブタ、イヌ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、鳥類等）に対して適宜適用することができる。

＜剤型／投与経路＞
本発明の抗腫瘍剤の剤型は特に限定されず、注射剤、散剤、錠剤、顆粒剤、粉剤、液剤、懸濁剤、カプセル剤、坐剤、外用剤、軟膏、貼付剤、点眼剤などが挙げられ、あらゆる剤型の医薬品の製剤化が可能である。

本発明の抗腫瘍剤の投与経路は、非経口、経口投与のいずれも可能であるが、特に静脈内投与が好ましく、さらに点滴静脈注射によるものが好ましい。またこの場合、上記抗腫瘍剤は注射剤とすることができ、例えば固形注射剤、水性注射剤、非水性注射剤、懸濁性注射剤等とすることができる。特に上記抗腫瘍剤を粉末注射剤、凍結乾燥注射剤等の固形注射剤とすることで、溶液中での分解や失活を抑制し、保存性を高めることが可能となる。

本発明の抗腫瘍剤を静脈内投与用とすることにより、消化酵素等による分解の影響を考慮する必要がなく、確実に薬剤を血中へ投与することができる。また、上記抗腫瘍剤を点滴静脈注射により投与することにより、１回あたり該抗腫瘍剤を所望の量投与することができる。

＜抗腫瘍剤：製剤化＞
本発明の抗腫瘍剤は、有効成分である(i)ＡＡ誘導体、(ii)その立体異性体、及び／又は(iii)それらの塩を、公知の製剤学的製造法に準じて製剤化することができる（第十六改正日本薬局方（平成２３年３月２４日 厚生労働省告示第６５号）参照）。

この場合、上記抗腫瘍剤は、上記有効成分のほか、必要に応じて、溶剤（希釈剤）、賦形剤、添加物等を含んでいてもよい。

溶剤（希釈剤）としては、例えば、注射用水、生理食塩液、リンゲル液等の水性溶液；植物油等の非水性溶液を用いることができる。

添加物としては、例えば、一般的に注射剤に使用される金属塩（例えば、リン酸三ナトリウム、リン酸一水素二ナトリウム、炭酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等）、ｐＨ調節剤（例えば、水酸化ナトリウム等）、薬学的に許容される安定化剤、界面活性剤、緩衝剤、可溶化剤、抗酸化剤、消泡剤、等張化剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、無痛化剤、溶解剤、溶解補助剤等が挙げられる。また、点滴静脈注射用の輸液製剤の場合は、これらの添加剤に加え、電解質類（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸マグネシウム等）、糖類（例えば、グルコース、果糖、ソルビトール、マンニトール、デキストラン等）、アミノ酸類（例えば、グリシン、アスパラギン酸、リジン等）、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１等）等の一般的に輸液に用いられる成分も用いることができる。

上記抗腫瘍剤は、最終工程において滅菌するか、無菌操作法によって製造、調製される。また上記抗腫瘍剤が固形注射剤の場合は、無菌的に固形剤を製造し、その使用前に滅菌精製水又は他の溶剤に溶解して使用することもできる。

本発明の抗腫瘍剤において、有効成分である(i)ＡＡ誘導体、(ii)その立体異性体、及び／又はそれらの塩の含有量については、後述する投与量を充足するように適宜設定すればよいが、例えば０．０１〜１００重量％とすることができる。

＜抗腫瘍剤：併用される他の抗腫瘍剤＞
本発明の抗腫瘍剤は、他の公知の抗腫瘍剤と併用することができる。当該他の抗腫瘍剤としては、例えば、ナイトロミン（Ｒ）、シクロホスファミド、メルファラン、チオテバ、カルボコン、プロテクトン（Ｒ）、ブスルファン、塩酸ニムスチン、ミトプルニトール、イホスファミド、メルカプトプリン、チオイノシン、シタラビン、ダカルバジン、フルオロウラシル、テガフール、塩酸アンシタビン、メトトレキサート、カルモフール、ＵＦＴ（Ｒ）、エノシタビン、硫酸ビンプラスチン、硫酸ピンクリスチン、硫酸ビンデシン、アクチノマイシン（Ｄ）、マイトマイシンＣ、クロモマイシンＡ３、塩酸プレオマイシン、硫酸プレオマイシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、ネオカルチノスタチン、硫酸ベブロマイシン、塩酸アクラルビシン、メビチオスタン、エピチオスタノール、クエン酸タモキシフェン、ホンパン、ビシパニール（Ｒ）、クレスチン、レンチナン、Ｌ−アスパラギナーゼ、アセグラトン、塩酸プロカルバジン、プロクスウリジン、ＭＤＳコーワ３０００（Ｒ）、エストラサイト（Ｒ）、シゾフェラン、アドリアマイシン、マイトマイシン、シスプラチン、カルボブラチン、ビンデシン、ビンクリスチン、サイクロフォスファミド、イフォマファミド、プレオマイシン、ペプレオマイシン、エトボシド、フルツロン、プロタミン、ヘパリン共存下でのアンギオスタチックステロイド（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ ｓｔｅｒｏｉｄｓ）、ペプチドグリカン複合体などのポリサッカライド、Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−ＮＨ_２（ＣＤＰＧＹＧＳＲ−ＮＨ_２）などのラミニン・ペプチド（Ｌａｍｉｎｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ）、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−（Ｒ ＧＤ）配列を含むペプチド、血小板因子−４（Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｆａｃｔｏｒ−４）、及び天然型もしくは遺伝子工学的手法で得られるインターフェロン等が挙げられる。上記の他の抗腫瘍剤は、単独で、又は２種以上の混合物として選択され得る。

＜投与量＞
本発明の抗腫瘍剤の投与量については、抗腫瘍作用を発揮できる有効量であればよく、適用対象となる腫瘍の種類や進行度、患者の年齢や体重等に応じて、適宜設定される。

例えば、本発明の抗腫瘍剤を静脈内投与用として用いる場合、その投与量は、患者の体重１ｋｇあたり、０．００２５ｍｇ〜５００ｍｇ、好ましくは０．２５ｍｇ〜１００ｍｇとすることができ、これを１回または数回に分けて投与することができる。上記抗腫瘍剤を点滴静脈注射により投与する場合は、上記量の抗腫瘍剤を約１〜５時間、好ましくは約２時間で投与することができる。また投与頻度は、好ましくは１週間に１〜５回程度とすることができる。

＜本発明の作用効果＞
本発明の抗腫瘍剤は、生体に対する安全性が高く、しかも高い抗腫瘍作用を発揮することができる。

従来の高濃度ＡＡ点滴療法では、１回の治療において、患者の体重１ｋｇあたり最大１ｇほど、総量で数十ｇのＡＡを投与していた。しかしながら、この高濃度での大量投与は、点滴投与にかかる時間も長く、患者に負担がかかり、治療回数の制限にも結びついていた。

一方、本発明の抗腫瘍剤によれば、従来の高濃度ＡＡ点滴療法と比較して１０分の１以下の少ない投与量で高い抗腫瘍作用を有するため、患者に対する負担を軽減することができる。それによって、治療回数や頻度を増加させることができるため、より高い抗腫瘍効果を得ることができる。

これに加えて、本発明の抗腫瘍剤は、Ｌ−アスコルビン酸の２位に結合しているヒドロキシル基が置換基に置換されているＡＡ誘導体を使用する場合であれば、熱、光、酸素等に対する安定性が格段に高くなり、保存時や流通時の取り扱いを容易にすることができる。

以下、本発明を実施例等に基づき、さらに説明する。但し、本発明は、以下に示す実施例に限定されて解釈されるものではない。

［実施例１：６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ］
実施例１として、Ｌ−アスコルビン酸の２位に結合しているヒドロキシル基がα−Ｄ−モノグルコピラノシル基に置換されており、且つ６位に結合しているヒドロキシル基が２−プロピルペンタノイル基によってアシル化されているＡＡ誘導体を準備した。すなわちこの誘導体は、２−Ｏ−α−Ｄ−モノグルコシル−６−Ｏ−（２−プロピルペンタノイル）−Ｌ−アスコルビン酸であり、以下、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇと称する。なお、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇは、上記の一般式（１）において、Ｒ１及びＲ２が、いずれもＣＨ₃（ＣＨ₂）₂であり、且つＲ３がα−Ｄ−モノグルコピラノシル基である化合物に該当する。

６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇは、田井章博他著、「Synthesis and Characterization of 6-O-Acyl-2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic Acids with a Branched-acyl Chain」、Chemical and Pharmaceutical Bulletin、Vol.51(2)、p.175-180 を参照して以下のように製造した。

まず、Mestres R., Palomo C.著、Synthesis, 1981年発行, p.218-220を参照し、酸無水物を準備した。すなわち、ジフェニルホスホクロライド（50 mmol）を２−プロピルペンタン酸（100 mmol）とトリエチルアミン（100 mmol）とを含むジクロロメタン溶液に加え、この混合物を１５分間、室温で攪拌した。この溶液を冷水で洗浄し、分離された有機相に無水硫酸ナトリウムを加え、乾燥させた。溶媒の留去によって、２−プロピルペンタン酸無水物を得た。得られた酸無水物を¹Ｈ−ＮＭＲにより同定し、２−プロピルペンタン酸無水物であることを確認した。

続いて、ピリジン（40 ml）に、２−Ｏ−α−Ｄ−モノグルコシル−Ｌ−アスコルビン酸（11.8 mmol、株式会社林原生物化学研究所製）（以下、ＡＡ−２Ｇと称する）と、上記２−プロピルペンタン酸無水物（23.6 mmol）との混合物を、60℃で２時間攪拌し、反応物を減圧下で濃縮した。さらに、得られた油性の残渣を80 mlの水に溶かし、等量の酢酸エチルで分液した。

続いて、分液された水相から、ゲル濾過クロマトグラフィによって６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇを精製した。まず、上記水相をカラム（Sephadex LH-20 column (径4.0×31 cm)、ＧＥヘルスケア製）に負荷し、メタノール／水／酢酸混合液（40:59:1, v/v）を用いて溶出した。そして、ベンゼン−イソプロパノール（4:1, v/v）を用いて再結晶させ、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇを得た。得られた物質を¹Ｈ−ＮＭＲ及び¹³Ｃ−ＮＭＲにより同定し、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇであることを確認した。

［実施例２：６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ］
実施例２として、Ｌ−アスコルビン酸の２位に結合しているヒドロキシル基が置換されておらず、且つ６位に結合しているヒドロキシル基が２−プロピルペンタノイル基によってアシル化されているＡＡ誘導体を準備した。すなわちこの誘導体は、６−Ｏ−（２−プロピルペンタノイル）−Ｌ−アスコルビン酸であり、以下、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡと称する。なお、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡは、上記の一般式（１）において、Ｒ１及びＲ２が、いずれもＣＨ₃（ＣＨ₂）₂であり、且つＲ３がヒドロキシル基である化合物に該当する。

６−ｂＯｃｔａ−ＡＡは、田中広義他著、「Pharmaceutical Studies on Ascorbic Acid Derivatives. I. Syntheses of Esters of Ascorbic Acid and Their Physicochemical Propaties」、薬学雑誌、Vol. 86、p.376-383、1966年を参照して以下のように製造した。

アスコルビン酸（29.0 mmol）に濃硫酸（60 ml）を加え、溶解させた後、２−プロピルペンタン酸（29.0 mmol）を加え、この混合物を２４時間、３０℃で撹拌した。この溶液を氷水で希釈し、酢酸エチルを加え、分離された有機相を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。この有機相に硫酸ナトリウムを加え脱水し、減圧下で濃縮した。この濃縮物から６−ｂＯｃｔａ−ＡＡをクロマトグラフィーによって以下に示す条件で精製した。まず、上記濃縮物をカラム（TOYOPEARL HW-40C column（径4.0×35 cm）、TOSOH製）に負荷し、メタノール／水／蟻酸混合液（40:59.5:0.5, v/v）を用いて溶出した。そして、酢酸エチル−ジイソプロピルエーテルを用いて再結晶させ、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡを得た。得られた物質を¹Ｈ−ＮＭＲにより同定し、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡであることを確認した。

［比較例１：６−ｓＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ］
比較例１として、Ｌ−アスコルビン酸の２位に結合しているヒドロキシル基がα−Ｄ−モノグルコピラノシル基に置換されており、且つ６位に結合しているヒドロキシル基がオクタノイル基（Ｃ₇Ｈ₁₅ＣＯ−）によってアシル化されているＬ−アスコルビン酸のアシル化誘導体を準備した。すなわちこの誘導体は、２−Ｏ−α−Ｄ−モノグルコシル−６−Ｏ−オクタノイル−Ｌ−アスコルビン酸であり、以下、６−ｓＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇと称する。

酸無水物として無水カプリン酸を用いた以外は、実施例１と同様に６−ｓＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇを製造した。得られた物質を¹Ｈ−ＮＭＲ及び¹³Ｃ−ＮＭＲにより同定し、６−ｓＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇであることを確認した。

［比較例２：ＡＡ］
比較例２として、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム塩（以下、ＡＡと称する）を準備した。ＡＡは、製品名Ｌ−アスコルビン酸ナトリウムを和光純薬工業株式会社から購入した。

［比較例３：ＡＡ−２Ｇ］
比較例３として、ＡＡ−２Ｇ（株式会社林原生物化学研究所製）を準備した。

以下の試験例１及び試験例２では、実施例１及び比較例１〜３の薬剤、以下の試験例３では、実施例１の薬剤、以下の試験例４では、実施例１及び比較例３の薬剤、以下の試験例５では、実施例１、２、比較例２及び３の薬剤を用いて、それぞれ行った。

＜試験例１：抗腫瘍作用の検証＞
（使用細胞）
本試験例では、マウス結腸癌由来細胞（Colon-26）を用いた。当該細胞は、いずれも37℃、5％ CO₂気相下、10% Fetal bovine serum （FBS、lot. AVH77993、HyClone製）含有RPMI-1640培地（Corning製）中で２，３日毎に継代培養を行った。RPMI-1640培地には、100 U/ml ペニシリンＧと100 mg/ml ストレプトマイシン（ナカライテスク製）を添加した。

（使用動物）
本試験例では、Balb/cマウス（４週齢、メス）及びCDF1マウス（４週齢、オス）を用いた。Balb/cマウスは、日本クレア株式会社より購入し、CDF1マウスは、日本エスエルシー株式会社より購入した。これらの動物は、試験前、自由飼育で餌（CE-2、日本クレア株式会社製）と水道水を与え、動物舎（室温20+/-5℃、湿度40〜70%、6時〜19時：明条件、19時〜6時：暗条件）にて飼育した。

（がん病態モデルマウスの作製）
Colon-26細胞をセミコンフルエントになるまで培養した後、0.05％トリプシン溶液（Trypsin-EDTA、ＳＩＧＭＡ製）で剥離した。剥離した細胞を、FBSを含まないRPMI-1640培地を用いて1.0×10⁶ cells/50 μlの細胞数となるように調整した。調整した細胞溶液を、イソフルラン（和光純薬工業株式会社製）麻酔下のBalb/cマウス（５週齢、メス）の背部に皮下注射した。さらに、固形化したColon-26細胞を2 mm角に剃刀で切り出し、移植針を用いてCDF1マウス（５週齢、オス）の背部皮下に移植した。移植後、腫瘍長径が0.8cm前後まで生育したマウスをがん病態モデルマウスとした。

（薬剤の投与）
実施例１、比較例１〜３の各薬剤をPBS（DPBS(-)10ｘ、SIGMA製）で調整した。このとき、マウスの体重に鑑み、投与量が実施例１及び比較例１は0.17 mmol/kg、比較例２，３は1.7 mmol/kgとなるように調整した。すなわち、実施例１及び比較例１は比較例２，３の10分の１のモル濃度に調整した。比較例２以外の各薬剤は水酸化ナトリウムでｐＨを中性付近に調整し、フィルター濾過を行った。調整した各薬剤を、がん病態モデルマウスに尾静脈投与した。投与は隔日で計４回行い、投与液量は、マウス体重20 g当たり100 μlとした。なお、陰性対照（Control）として、薬剤を含有していない上記PBSをがん病態モデルマウスに同様に投与した。

（腫瘍体積の測定）
腫瘍体積は、薬剤の投与後、毎日ノギスで計測した。なお、腫瘍体積は、以下の（３）式によって算出した。
腫瘍体積（mm^３）=（ａ×ｂ²）／２ ・・・（３）
（但し、ａ＝長径（mm） ｂ＝短径（mm））

（結果）
図１は、試験例１の結果を示すグラフであり、横軸が各薬剤の投与開始日（０日）からの経過日数、縦軸は上記式（３）により算出した腫瘍体積を示す。また、データは、いずれも、平均値+/-標準誤差を表す。

図１に示すように、陰性対照（Control）に対して、実施例１及び比較例２は投与開始２日後から、比較例１，３は投与開始４日後から、腫瘍体積が有意に小さかった。比較例２のＡＡは、実際に高濃度ＡＡ点滴療法に用いられるものであるが、実施例１の６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇは、投与開始約２日後から比較例２よりも腫瘍体積が小さく、ＡＡの１０分の１以下の濃度で、高い腫瘍の成長抑制効果を有することが確認された。

一方で、比較例１、３は、いずれも、実施例１及び比較例２よりも腫瘍の成長抑制効果が低かった。特に比較例１の６−ｓＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇは、実施例１の６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇとアシル基の構造のみ異なるものであるが、抗腫瘍作用については実施例１より劣ることが確認された。

続いて、実施例１、比較例１及び２を用いて、各薬剤の体内動態の検討を行った。

＜試験例２：体内動態の検討＞
（サンプルの採取）
上述の試験例１で説明したがん病態マウス（6〜7週齢、オス）に対し、実施例１、及び比較例１，２に係る薬剤を尾静脈投与した。各薬剤の調整は、試験例１と同様に行った。投与から１５，３０，６０，１８０，３６０分後に、イソフルラン（和光純薬工業株式会社製）麻酔下で解剖を行い、血漿（全血）、腫瘍、肝臓、腎臓を採取した。なお、血漿は、ヘパリン（和光純薬工業株式会社製）でコートしたシリンジを用いて心臓採血し、得られた血液を遠心分離（4℃、10,000 g、10分）し、遠心分離後の上清を血漿サンプルとした。なお、採取した各組織サンプル及び血漿サンプルは、分析まで-80℃で凍結保存した。

（ＨＰＬＣによる分析）
続いて、ＨＰＬＣ（High performance liquid chromatography：高速液体クロマトグラフィ）を用いて各組織サンプル及び血漿サンプル中に含まれる６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ及び６−sＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ（以下、６−ｂＯｃｔａ−、及び６−sＯｃｔａ−をまとめて６−Ａｃｙｌ−とも称する）、６−Ａｃｙｌ−ＡＡ、ＡＡ並びにＡＡ−２Ｇを定量した。

まず、凍結保存した各組織サンプル（血漿を除く）100 mgに対し、400 μlの抽出溶媒（87.5%アセトニトリル（和光純薬工業株式会社製）、250 mg/L ジチオスレイトール（ナカライテスク株式会社製）を含む）を加え、ホモジネートにより抽出した。血漿サンプルは100 μlに対し400 μlの抽出溶媒を加えた。これらの各サンプル抽出液を遠心分離し（4℃、10,000 g、10分）、回収した上清を分析に用いた。

ＨＰＬＣの各分析条件を、以下に示す。
［６−Ａｃｙｌ−ＡＡ−２Ｇ及び６−Ａｃｙｌ−ＡＡの分析条件］
機器：L-2130形ポンプ、L-2420型検出器、L-2300形カラムオーブン及びD-2500形クロマトインテグレータ（以上、株式会社日立ハイテクノロジーズ製）
カラム：Inertsil Ph分析カラム、粒子径5 μm、4.6 mm (I.D)×250 mm（ジーエルサイエンス株式会社製）
移動相：MeOH/H₂O/HCOOH＝55/44.5/0.5
波長：240 nm
カラム温度：40℃
流速：0.7 ml/min
注入量：10 μl
［ＡＡ−２Ｇ及びＡＡの分析条件］
機器：L-7100形ポンプ、L-7420形UV-VIS検出器、L-7300形カラムオーブン及びD-2500形クロマトインテグレータ（以上、株式会社日立ハイテクノロジーズ製）
カラム：Inertsil HILIC分析カラム、粒子径5μm、4.6 mm (I.D)×250 mm（ジーエルサイエンス株式会社製）
移動相：アセトニトリル/66.7 mM 酢酸アンモニウム＝85/15
波長：260 nm

（結果）
図２〜７は、本試験例の結果を示すグラフであり、いずれも、横軸は薬剤の投与開始時（０時間）からの経過時間、縦軸は各組織サンプル及び血漿サンプル中の各物質の濃度（量）を示す。なお、上記各グラフのデータは、ｎ＝４における平均値+/- 標準誤差を示している。

また、図２，３，４は、実施例１に係る薬剤（６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ）を投与した結果を示し、図２はＡＡの量、図３はＡＡ−２Ｇの量、図４は６−ｂＯｃｔａ−ＡＡの量を示す。図５，６は、比較例１に係る薬剤（６−ｓＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ）を投与した結果を示し、図５はＡＡの量、図６はＡＡ−２Ｇの量を示す。図７は比較例２に係る薬剤（ＡＡ）を投与した際のＡＡの量を示す。

まず、図２，３，５，６の結果より、実施例１及び比較例１に係る薬剤（６−Ａｃｙｌ−ＡＡ−２Ｇ）を投与した場合、各組織サンプル及び血漿サンプルからＡＡ及びＡＡ−２Ｇが検出された。これにより、実施例１及び比較例１に係る薬剤は、いずれも、α−グルコシダーゼやエステラーゼによって体内で分解され、ＡＡ及びＡＡ−２Ｇに変換されていることが確認された。

また、図４に示すように、実施例１に係る薬剤を投与した場合、肝臓、腎臓及び血漿中から６−ｂＯｃｔａ−ＡＡが検出された。一方で、図示はしないが、比較例１に係る薬剤を投与した場合は、いずれの組織及び血漿からも６−ｓＯｃｔａ−ＡＡは検出されなかった。また、図３及び図６を参照し、比較例１に係る薬剤を投与した場合に検出された各組織からのＡＡ−２Ｇの量は、実施例１に係る薬剤を投与した場合よりも多かった。これにより、実施例１に係る６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇは、アシル基よりも先にα−Ｄ−モノグルコピラノシル基が分解されやすいが、比較例１に係る６−ｓＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇは、α−Ｄ−モノグルコピラノシル基よりも先にアシル基が分解されやすいことが示唆された。

また、図２Ａ、図５Ａ及び図７に示すように、腫瘍中のＡＡの量については、いずれも、薬剤の投与後一度投与時初期値より減少し、その後初期値に回復する傾向が見られた。これは、薬剤の作用により腫瘍が酸化ストレスを受け、その酸化ストレスに対応して腫瘍内在性のＡＡが消費されて減少し、その後遊離したＡＡが取り込まれて増加したものと考えられる。

さらに、図２Ａ、図５Ａ及び図７の腫瘍組織の結果を比較すると、実施例１の投与群のＡＡ減少量は、比較例１，２の投与群のＡＡ減少量よりも大きかった。さらに、比較例１の投与群における腫瘍中のＡＡの量は、３時間程度で初期値まで回復しているのに対し、実施例１の投与群における腫瘍中のＡＡの量は、６時間経過しても完全に回復していなかった。

＜試験例３：α-グルコシダーセによる６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇの分解産物の検証＞
（実験方法）
６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇを基本培地(100 U/ml ペニシリンＧ、100 μg/ml ストレプトマイシン、10％ FBSを含むRPMI-1640)で20 mMの濃度に調整した。96穴プレートに新鮮な基本培地を80 μl分注し、10 μlのサンプル（終濃度2 mM）及び10 μlのα-グルコシダーセ（微生物由来、東洋紡績株式会社製）（終濃度8 U/ml、0分は基本培地）を添加し、37℃、5％ CO₂気相下でインキュベーションした。インキュベーション開始から15分、30分、及び60 分後に、80 μlずつ回収し、320 μlの除タンパク質剤(アセトニトリル/超純水 = 87.5/12.5, 250 mg/L ジチオトレイトールを含む)を加え、遠心分離 （4℃, 10,000 g, 10 min）後、上清を回収した。回収した上清について、試験例２に示す条件でＨＰＬＣ分析を行い、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ、ＡＡ、及びＡＡ−２Ｇの各濃度の測定を行った。

（結果）
表１に、経時的に６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ濃度及び６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ濃度を測定した結果を示す。表１から明らかなように、α−グルコシダーセにより６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇが経時的に加水分解され、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡが増加していった。ＡＡ及びＡＡ−２Ｇは、本条件ではほとんど検出されなかった。

以上の結果から、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇはα−グルコシダーセによる加水分解を受けて６−ｂＯｃｔａ−ＡＡを生成することが確認された。

＜試験例４：In vitroにおける6-bOcta-AA-2Gの抗腫瘍作用の検証＞
（試薬・器具類）
RPMI-1640培地（フェノールレッド含有）はSIGMAより購入し、100 U/mlのペニシリンＧと100 μg/ml ストレプトマイシン（共にSIGMA）を添加したものを用いた。RPMI-1640培地（フェノールレッド非含有）はSIGMAより購入し、100 U/mlのペニシリンと100 μg/ml ストレプトマイシン（共にSIGMA）、1％ L-グルタミン（SIGMA）を添加したものを使用した。FBSはHyClone（lot: AVH77993）より購入した。10％ FBSを含むRPMI-1640培地を基本培地とした。

その他の試薬・器具の入手元は以下の通りである。
アスコルビン酸ナトリウム(AA-Na)、calcein-AM solution (1 mg/ml DMSO)：和光純薬工業株式会社
α-グルコシダーゼ（微生物由来）：東洋紡績株式会社
DPBS (-) 10x、0.05% Trypsin-EDTA 、Triton X-100：SIGMA
96穴平底マルチプレート（Cat. No.167008）：Nunc
フィルター (0.20 μm): Sartorius stedim（東京）

また、上記以外の試薬は、すべて市販の特級又はそれに準ずるものを用いた。

（使用細胞）
マウス結腸由来がん細胞（Colon-26）

（実験方法）
Calcein-AMをDPBS（Dulbecco's phosphate-buffered saline）(-)で100 μMに調製し、-20℃で凍結保存した。使用時にDPBS (-)で20倍希釈し、5 μM calcein-AM溶液とした。６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ又はＡＡ−２Ｇをフェノールレッド非含有の基本培地で規定の濃度に希釈し、サンプルとした。培地は0.1 N NaOHでｐＨを中性付近に調製し、無菌化でフィルター滅菌して使用した。

Colon-26細胞はいずれも37℃、5％ CO₂気相下、基本培地中で約3日ごとに継代培養した。継代時はセミコンフルエントになるまで培養した後、0.05%トリプシン溶液で剥離して細胞浮遊液を得た。得られた細胞を96穴平底マルチプレートに1.0 × 10⁴ cells/wellの密度で播種した。24時間培養後、培養上清を除去し、80 μlの新鮮な基本培地、サンプル（６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ又はＡＡ−２Ｇの終濃度2 mM、コントロール群は基本培地）及び10 μlのα-グルコシダーゼ（終濃度8 U/ml、未処理群は基本培地）を添加し、24時間、37℃、5％ CO₂気相下でインキュベーションした。インキュベーション後、培地を除去し、5 μM calcein-AM溶液を100 μl/wellで添加し、37℃、5% CO₂気相下で30分間インキュベーションした。その後、0.6% Triton X-100含有DPBS (-)を20 μl/wellで添加し、5分間プレートシェイク(約1,000 rpm)後、Varioskanマイクロプレートリーダー（Thermo）にて蛍光強度を測定した（Ex.: 485 nm, Em.: 527 nm）。コントロールの蛍光強度を100％生存率とし、細胞生存率を算出した。

（結果）
表２に、各条件でのColon-26細胞の細胞生存率を示す。表２に示すように、Colon-26細胞に対して、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ添加だけでは細胞毒性を示さなかった。一方、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇと同時にα-グルコシダーゼを添加したところ、有意な細胞生存率の低下が認められた。比較対照のAA-2Gも単独添加では細胞毒性を示さず、α-グルコシダーゼの同時添加により有意な細胞生存率の低下を示した。

以上の結果と前記試験例３の結果を踏まえると、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２ＧによるColon-26細胞に対する細胞毒性は、α-グルコシダーゼによって２位のグルコースが加水分解されて６−ｂＯｃｔａ−ＡＡとなり、これが抗腫瘍作用を示したと考えられる。

＜試験例５：がん病態モデルマウスを用いたＡＡ誘導体の抗腫瘍効果の検討＞
（使用動物）
本試験例では、CDF1マウス（7週齢、メス）を用いた。CDF1マウスは、日本エスエルシー株式会社より購入した。CDF1マウスは、試験前、自由飼育で（CE-2、日本クレア株式会社製）と水道水を与え、動物舎（室温20+/-5℃、湿度40〜70%、6時〜19時：明条件、19時〜6時：暗条件）にて飼育した。

（がん病態モデルマウスの作製）
固形化したマウス結腸由来がん細胞Colon-26細胞を約2 mm角に剃刀で切り出し、移植針を用いてCDF1マウス（7週齢、メス）の背部皮下に移植した。移植後、腫瘍体積が約200 mm³に生育したマウスをがん病態モデルマウスとした。この時点での腫瘍体積及び体重を指標とし、統計解析システムEXSAS 7.6（株式会社アームシステック）を用いて、層別無作為化割付を行い、５群（１群当たり９匹）に割りつけた。

（薬剤の投与）
がん病態モデルマウスに対して、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ、ＡＡ、及びＡＡ−２Ｇの投与を行った。がん病態モデルマウスに投与する各薬剤は、PBS（DPBS(1×)、gibco製）で希釈した。このとき、マウスの体重を鑑みて投与量が、ＡＡ及びＡＡ−２Ｇは1.7 mmol/kg、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ及び６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇは0.17 mmol/kgとなるように調整した。すなわち、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ及び６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２ＧはＡＡ及びＡＡ−２Ｇの10分の1のモル濃度に調整した。ＡＡ以外の薬剤は水酸化ナトリウムでｐＨを中性付近に調整し、フィルター濾過を行った。調整した各薬剤を、がん病態モデルマウスに尾静脈投与した。投与は隔日で計4回（１、３、５、及び７日目）行い、投与量は、マウス体重20 g当たり100 μlとして、計８日間飼育を行った。なお、陰性対照（Control）として、薬剤を含有していない生理食塩液をがん病態モデルマウスに前記と同条件で投与した。

（腫瘍体積の測定）
腫瘍体積は、２日毎にノギスで計測した。なお、腫瘍体積の算出方法は、前記試験例１の場合と同様である。

（結果）
図８は、試験例５の結果を示すグラフであり、横軸が試験開始日（０日）からの経過日数、縦軸は腫瘍体積を示す。また、データは、いずれも、平均値+/-標準誤差を表す。

図８から明らかなように、ＡＡ−２Ｇ及びＡＡを投与した場合には、コントロールと同程度に腫瘍体積の増加が認められたが、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ及び６−ｂＯｃｔａ−ＡＡを投与した場合には、コントロールに比べて、腫瘍体積の増加を抑制できていた。すなわち、本結果からも、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ及び６−ｂＯｃｔａ−ＡＡには、優れた抗腫瘍効果があることが確認された。

＜考察＞
まず、試験例１の結果より、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇは、比較例１〜３に係る各薬剤と比較して、腫瘍の成長抑制効果が非常に高いことが確認された（図１参照）。特に、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇは、ＡＡ及びＡＡ−２Ｇの１０分の１のモル濃度に関わらず、より高い腫瘍の成長抑制効果を有することが確認された。

また、試験例２の結果より、アシル基の構造によって、体内における分解パターンが異なることが示唆された。

更に、試験例４及び５の結果より、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡであっても、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇと同様に、抗腫瘍作用を発揮することが確認された。

図９は、試験例１〜５の結果に基づいて予測される６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ（実施例１）と６−ｓＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇ（比較例１）の体内の分解パターンの違いを説明する図である。同図に示すように、直鎖型のアシル基を有する６−ｓＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇは、まずエステラーゼによりＡＡ−２Ｇに変換され、続いてα−グルコシダーゼによりＡＡに変換される。ＡＡ−２Ｇ自体は抗腫瘍作用を有しないことから、６−ｓＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇの抗腫瘍作用の作用本体は、ＡＡのみと考えられる。一方、分岐を有するアシル基を有する６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇは、まずα−グルコシダーゼにより６−ｂＯｃｔａ−ＡＡに変換され、その後、エステラーゼによりＡＡに変換される。

これにより、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇは、ＡＡのみならず、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡも作用本体として機能し、体内で強力な抗腫瘍作用を発揮する。これは、分岐を有するアシル基に基づく立体障害によって６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇがエステラーゼによる分解を受けにくくなり、相対的にα―グルコシダーゼによる分解を受けやすくなるためと考えられる。

一方、試験例２において、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇの投与群の腫瘍におけるＡＡ減少量が大きいのは、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇが、他の薬剤と比較して腫瘍組織に対し多くの酸化ストレスを与えることができるためであると考えられる。さらに、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇの投与群の腫瘍におけるＡＡ量の回復時間が比較例１，２の投与群よりも長いのは、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇの投与群において血漿中に遊離しているＡＡ量が比較例１，２の投与群よりも少ないためであると考えられる（図２Ｂ，図５Ｂ参照）。すなわち、６−ｂＯｃｔａ−ＡＡ−２Ｇは、ＡＡまで加水分解されるスピードが緩やかであり、長時間にわたって６−ｂＯｃｔａ−ＡＡが抗腫瘍作用を発揮し続けると考えられる。

すなわち、本発明に係る抗腫瘍剤は、分岐を有するアシル基が立体障害によって分解を受けにくく、Ａｃｙｌ−ＡＡが体内で長時間にわたり強力な抗腫瘍作用を発揮することができるため、より低濃度で高い高腫瘍作用を発揮することができる。したがって、例えば本発明の抗腫瘍剤を点滴療法に用いた場合、従来の高濃度ＡＡ点滴療法よりも低濃度の薬剤で少量投与で行うことができ、患者に対する負担を軽減することができる。これにより、投与頻度を高め、抗腫瘍効果をより高めることができると考えられる。

Claims (5)

1. (i)下記一般式（１）で示されるＬ−アスコルビン酸のアシル化誘導体、
   (ii)その立体異性体、及び
   (iii)それらの薬学的に許容される塩
   よりなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とし、前記Ｌ−アスコルビン酸のアシル化誘導体と抗がん多糖類との結合体を含有しない、抗腫瘍剤。
   ［式中、Ｒ₁及びＲ₂はそれぞれ炭素数１〜９の直鎖又は分岐状のアルキル基を示し、Ｒ₃はヒドロキシル基又はグリコシル基を示す。］
2. 前記Ｒ₁がＣＨ₃（ＣＨ₂）_mであり、前記Ｒ₂がＣＨ₃（ＣＨ₂）_nである（但し、ｍ及びｎは、それぞれ０〜３の範囲に含まれる整数を示す。）、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
3. 前記Ｒ₃が、ヒドロキシル基又はα−Ｄ−モノグルコピラノシル基である、請求項１又は２に記載の抗腫瘍剤。
4. 静脈内投与用である、請求項１〜３のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
5. 前記静脈内投与が点滴静脈注射によるものである、請求項４に記載の抗腫瘍剤。