RU2394552C2

RU2394552C2 - Биорассасывающиеся наполнители, образованные фосфолипидными липосомами и гиалуроновой кислотой и/или ее производными

Info

Publication number: RU2394552C2
Application number: RU2007141864/15A
Authority: RU
Inventors: Ланфранко КАЛЛЕГАРО (IT); Ланфранко КАЛЛЕГАРО; Девис ГАЛЕССО (IT); Девис ГАЛЕССО; Анна ТАЛЬЕНТИ (IT); Анна ТАЛЬЕНТИ
Original assignee: Фидия Фармачеутичи С.П.А.
Priority date: 2005-05-20
Filing date: 2006-04-21
Publication date: 2010-07-20
Also published as: AU2006246751B2; DE602006006177D1; CA2608811C; WO2006122638A1; EP1888013A1; US20120148667A1; ATE427731T1; JP2008540588A; RU2007141864A; CA2608811A1; US8263118B2; ES2325420T3; PL1888013T3; ITPD20050146A1; EP1888013B1; AU2006246751A1

Abstract

Изобретение относится к медицине и косметологии и представляет собой производные гиалуроновой кислоты, структурно организованные с униламеллярными липосомами или в них, для инъекции в качестве наполнителя мягкой ткани и/или для коррекции дефектов кожи, и/или для интеграции в синовиальную жидкость или замещения синовиальной жидкости при внутрисуставном лечении остеоартроза, где указанные производные выбраны из группы, включающей сложные эфиры, внутренние эфиры, амиды, О-сульфатированные производные, перкарбоксилированные производные и деацетилированные производные, где молекулярная масса гиалуроновой кислоты находится в диапазоне от 50000 до 3×106 Да, липосомы образованы фосфолипидами, и концентрация фосфолипида находится в диапазоне от 0,1 до 50 мг/мл. Изобретение обеспечивает сохранение заявленных наполнителей в течение длительного времени в области их применения, что значительно снижает необходимость частых введений при сохранении свойств биосовместимости, безопасности и легкости обработки. 6 н. и 6 з.п. ф-лы.

Description

Область изобретения

В настоящем изобретении описан и заявлен новый биорассасывающийся наполнитель, образованный гиалуроновой кислотой и/или ее производными, структурно организованными с фосфолипидными липосомами или в них, что увеличивает время пребывания исходного полимера in situ. Описанные здесь наполнители по существу предназначены для увеличения мягких тканей в эстетической хирургии и в лечебно-косметических средствах для кожи для коррекции дефектов в степени от незначительной до средней, но благодаря их особым свойствам они также могут использоваться в других областях применения.

Предшествующий уровень техники

Заполнение мягких тканей применяется в пластической хирургии для коррекции дефектов кожи, таких как морщины, углубления и оспины на лице. Также оно может увеличивать объем отдельных зон, таких как глубокие рубцы, губы и скулы, а также лучше определять черты и форму лица. Эти результаты получают путем инъекции наполнителей в поверхностную или глубокую дерму для увеличения объема обрабатываемой зоны, что делает ее более плотной. Кроме заполнения углублений инъекция инициирует фазу биостимуляцию клеток кожи, так что кожа сама по себе выглядит более здоровой, плотной и румяной.

Используемые вещества называют наполнителями, они многочислены и разнообразны. По существу их подразделяют на три разных типа:

- биорассасывающиеся наполнители: биосовместимые вещества, которые подвергаются постепенному и в конечном счете полному рассасыванию в организме. Наиболее часто используемыми являются коллаген (Zyderm^®, Zyplast^®) и гиалуроновая кислота (Hylaform^®, Ial System^®, Restylane^®), обеспечивающие хорошие результаты, особенно при коррекции незначительных и средних дефектов, которые наиболее часто лечат. Однако применение этих веществ ограничено, поскольку они могут проявлять аллергенность (особенно коллаген), в присутствии примесей биологического материала (такого как вирусы или белковые остатки) вследствие способа выделения, и, что более важно, они требуют частого введения для сохранения своего эффекта. Действительно, они являются веществами, особенно гиалуроновая кислота, которые быстро разрушаются под действием ферментов и свободных радикалов, физиологически присутствующих в дерме. Получаемый тургор можно поддерживать только при помощи частых бустерных инъекций продукта и, как следствие, повышением риска побочных эффектов и дискомфорта пациента;

- полупостоянные наполнители, которые сохраняются дольше после их имплантации в ткани, поскольку они образованы биорассасывающейся матрицей, которая содержит частицы, такие как полиметакрилат или акриловый гидрогель или декстран (среди имеющихся в продаже продуктов этого типа находятся Artecoll^®, Dermalive^® и Riverderm^® Intra). После рассасывания матриц небиодеградируемые частицы поддерживают определенную степень тургора, но они также могут вызвать воспалительные явления и выраженные аллергические реакции;

- постоянные наполнители, которые не рассасываются в организме. Продукты основаны на гидрогелях из полиакриламида, Gore-Tex^® или других полностью синтетических материалов, которые после имплантации постепенно окружаются капсулой соединительной ткани, которая жестко фиксирует их на месте. Если, с одной стороны, это является преимуществом, поскольку делает имплантат постоянным, то, с другой стороны, это затрудняет, но теоретически делает не невозможным, изменение эффекта или удаление имплантата в случае, если не достигается требуемый эффект. Имплантация постоянных наполнителей является хирургической процедурой, и, таким образом, риски и преимущества должны быть уравновешены, что создает дополнительное ограничение.

Выбор наполнителя основан на ряде показателей, таких как требуемый эффект и его длительность, биосовместимость, безболезненность, возможная необходимость проведения предварительных тестов на аллергию и стоимость. В области биорассасывающихся наполнителей одним из ключевых факторов при выборе несомненно является долговечность имплантата. Действительно, важно выбрать продукт, который не только обладает всеми вышеуказанными свойствами, но также остается на месте инъекции длительное время, уменьшая количество введений, необходимых для сохранения эффекта. Это приводит к уменьшенному риску побочных эффектов из-за процедуры инъекции (например вздутие, опухание, жжение), и, следовательно, к меньшему дискомфорту для пациента. Ограничения известного в настоящий момент уровня техники преодолевают при помощи настоящего изобретения, в котором описан и заявлен биорассасывающийся наполнитель, на основе гиалуроновой кислоты и/или ее производных, структурно организованных с фосфолипидными липосомами или в них, что увеличивает время его пребывания и улучшает их общие характеристики.

Гиалуроновая кислота (НА) является хорошо известной молекулой: она представляет собой гетерополисахарид, состоящий из D-глюкуроновой килоты и N-ацетилглюкозамина, и присутствует практически в каждом отделе организма человека. НА играет множество физиологических ролей, начиная от механической поддержки клеток множества тканей до смазки суставов, модуляции множества биологических и физиологических процессов (включая пролиферацию, миграцию и дифференцировку клеток, опосредованные взаимодействием с ее мембранным рецептором CD44). Хорошо известен защитный эффект НА против дегенерации хряща, поврежденного болезнью или травмой. В таких ситуациях наблюдается высокая концентрация в суставной полости провоспалительных цитокинов, особенно интерлейкина-1 (IL-1), способствующего разрушению хряща и ингибирующего пролиферацию хондроцитов (van Beuningen Н.М. et al., Arthritis Rheum, 1991, 34:606-615). Различные научные эксперименты продемонстрировали, что гиалуроновая кислота способна противодействовать действию IL-1, радикально уменьшая его отрицательные эффекты, и затем оказывать восстановительное действие на хрящевую ткань в суставе, в который ее инъецировали (Stove J. et al., J. Orthop Res, 2002, 20:551-555). В суставах содержащаяся в синовиальной жидкости гиалуроновая кислота действует как вязкая смазка при медленном движении, тогда как при оживленном движении ее эластичные свойства амортизируют травмы или микротравмы, которые могут повредить сустав. В патологических ситуациях концентрация и средняя молекулярная масса НА (Balazs ЕА. et al., J. Rheumatol Suppl, 1993, 12:75-82; Belcher С. et al., Annals of the Rheumatic Disease, 1997, 56:299-307) значительно снижаются, изменяя физиологические свойства синовиальной жидкости.

Ее свойства в отношении увлажнения тканей и заживления ран также хорошо известны и в течение длительного времени использовались в лекарственных средствах для лечения ран, язв и повреждений кожи различного происхождения (например, Balasz A. et al., Cosmetics & Toiletries, 1984, 5:8-17).

Также в данной области техники известны многочисленные химические модификации, которые могут быть осуществлены с молекулой НА, такие как

солеобразование с органическими и/или неорганическими основаниями (ЕР 138572 В1);

этерификация НА спиртами алифатического, аралифатического, циклоалифатического, ароматического, циклического и гетероциклического ряда (HYAFF^®) с процентом этерификации, который может меняться в зависимости от типа и длины используемого спирта (ЕР 216453 B1);

амидирование НА аминами алифатического, аралифатического, циклоалифатического, ароматического, циклического и гетероциклического ряда (HYADD™) с процентом амидирования в диапазоне от 0,1 до 50% (ЕР 1095064 B1);

О-сульфатация НА до 4-кратной степени сульфатации (ЕР 702699 B1);

внутренняя этерификация НА с процентом этерификации, не превышающим 20% (АСР^®; ЕР 341745 B1);

деацетилирование НА: фракция N-ацетилглюкозамина деацетилирована предпочтительно до процентного содержания от 0,1 до 30% (ЕР 1313722 B1);

перкарбоксилирование НА достигается путем окисления первичного гидроксила фракции N-ацетилглюкозамина до степени перкарбоксилирования от 0,1 до 100% (HYOXX™; заявка на патент ЕР 1339753 B1).

Полимеры, полученные этими способами, сохраняют свойства биоразрушаемости, биосовместимости и легкости обработки, а также применения исходного полисахарида, но обеспечивают более хорошие механические характеристики.

Гиалуроновая кислота, используемая в настоящем изобретении, может быть получена из любого источника. Например, она может быть выделена из петушиных гребней (ЕР 138572 В1) или получена посредством ферментации (ЕР 716688 В1) или технологическими средствами, и ее молекулярная масса может варьироваться от 50000 до 3000000 Да.

Тип технического раствора, описанного и заявленного в настоящем изобретении, является тем не менее абсолютно новаторским, и наполнители из НА и/или ее производных, таким образом, сохраняются в области из применения в течение длительного времени, что значительно снижает необходимость частых введений при сохранении свойств биосовместимости, безопасности и легкости обработки, а также применения исходного полисахарида. Это свойство достигают путем структурной организации гиалуроновой кислоты и/или ее производных с фосфолипидными липосомами или в них, как проиллюстрировано ниже. Липосомы представляют собой полые микросферы различного размера в диапазоне от 50 до 1000 нм, образованные одним или более двойными липидными слоями, окружающими липофильное ядро. Этой структуры можно достичь благодаря особой природе фосфолипидов, которые обладают гидрофобным хвостом и гидрофильной головой; в водной среде гидрофобные хвосты притягиваются один к другому, тогда как гидрофильные головки стремятся повернуться к воде. Результатом являются двойные липидные слои, замыкающиеся с образованием маленьких везикул, внутри которых содержится различная гидрофильная среда. Липосомы впервые были описаны в 1965 г. (Standish M.M. et al., J. Mol Biol, 1965, 13:238-252) и исследовались в качестве носителей для лекарственных средств и/или активных ингредиентов (например, Liposomes as drug carriers, Gregoriadis G. editor, New York: John Wiley & Sons, 1985: 3-18; Banerjee R., J. Biomater Appl, 2001, 16:3-21). Обычно их классифицируют на основании их размера и количества двойных липидных слоев. В общем случае, как описано, например, у Callow et al. (Cryobiology, 1985:251-267), упоминаются

мультиламеллярные везикулы: они обладают структурой, подобной луковице, где в промежутках между рядами двойных липидных слоев находятся гидрофильные слои;

униламеллярные везикулы, большие (диаметр более 1 мкм) и маленькие (диаметр менее 1 мкм): они образованы одним единственным двойным липидным слоем и заключают в себе сильно гидрофильное ядро;

олиголамеллярные везикулы, образованные несколькими двойными липидными слоями, которые заключают в себе заметно гидрофобную среду.

Также классификация возможна на основе многочисленных способов, посредством которых липосомы могут быть получены и которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Комбинации НА и фосфолипидов были описаны и как простые физические смеси (WO 91/12026), и как подходящие химические ассоциации (ЕР 581282 B1), предназначенные для применения в качестве противоревматических лекарственных средств для внутрисуставного применения, для чего заявлены смазывающие свойства рассмматриваемых липосом и полисахаридов. Также известна заявка на патент ЕР 1406571, в которой описано и заявлено применение гликозаминогликанов, инкапсулированных в фосфолипидные липосомы для внутрисуставного лечения остеоартроза.

Заявитель предполагает продемонстрировать ниже, что настоящее изобретение существенно отличается от уже известных изобретений типом используемого полисахарида, а так же способом, которым он был структурно организован.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении описан и заявлен новый биорассасывающийся наполнитель, образованный гиалуроновой кислотой и/или ее производными, структурно организованными с фосфолипидными липосомами или в них, для применения, главным образом, для заполнения мягких тканей в эстетических целях и/или для лечебно-косметических целей. Этот тип раствора позволяет увеличить время нахождения наполнителя в месте инъекции, таким образом уменьшая необходимость в повторных и частых введениях и, следовательно, значительно снижая риск нежелательных побочных эффектов и дискомфорта у пациента. Ассоциация НА-липосом достигается, как описано далее, путем обработки пленки из фосфолипидных липосом раствором НА и/или ее производных таким образом, что часть полисахарида включается в липосомы, а часть остается снаружи, окружая фосфолипидные структуры. Таким образом, создается вид макроструктуры, который немедленно обеспечивает плотность обработанной зоны и также оказывается более устойчивой к ферментативному и химическому разрушению, которое полисахарид претерпевает после введения. Для простоты вышеописанное будет определено в настоящем изобретении как "НА и/или ее производные, структурно организованные с липосомами или в них".

Таким образом, объектом настоящего изобретения является гиалуроновая кислота и/или ее производное, структурно организованные с липосомами или в них, в качестве наполнителя мягких тканей и/или для коррекции дефектов кожи.

Предпочтительно молекулярная масса гиалуроновой кислоты находится в диапазоне от 50000 до 3×10⁶ Да.

Гиалуроновая кислота и/или ее производные по настоящему изобретению, структурно организованные с липосомами или в них, могут представлять собой производные гиалуроновой кислоты, выбранные из группы, включающей соли, сложные эфиры, внутренние эфиры, амиды, О-сульфатированные производные, перкарбоксилированные производные. Предпочтительно производное гиалуроновой кислоты представляет собой гексадециламид.

В частности, концентрация гиалуроновой кислоты и/или ее производных находится в диапазоне от 0,1 до 50 мг/мл.

Гиалуроновая кислота и/или ее производное структурно организовано с липосомами, образованными фосфолипидами, или в них. Предпочтительно фосфолипид представляет собой дипальмитоилфосфатидилхолин. Концентрация фосфолипида предпочтительно находится в диапазоне от 0,1 до 50 мг/мл и более, предпочтительно концентрация фосфолипида равна 5 мг/мл.

Еще одним объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая гиалуроновую кислоту и/или ее производное, структурно организованное с липосомами или в них, в качестве наполнителя мягких тканей и/или для коррекции дефектов кожи, и/или интеграции в синовиальную жидкость или замещения синовиальной жидкости при внутрисуставном лечении остеоартроза.

В частности указанная фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит фармакологически и/или биологически активные вещества.

В фармацевтических композициях для интеграции в синовиальную жидкость или замещения синовиальной жидкости при внутрисуставном лечении остеоартроза производное гиалуроновой кислоты предпочтительно представляет собой метилпреднизолоновый эфир. Более предпочтительно гиалуроновая кислота этерифицирована 6α-метилпреднизолоном до степени этерификации 45%.

Также объектом настоящего изобретения является применение фармацевтической композиции, содержащей гиалуроновую кислоту и/или ее производное, структурно организованное с липосомами или в них, для коррекции дефектов кожи и/или в качестве наполнителя мягкой ткани, и/или для интеграции в синовиальную жидкость или замещения синовиальной жидкости при внутрисуставном лечении остеоартрозных патологий.

Кроме самой гиалуроновой кислоты также применяют ее производные, полученные в результате химических модификаций путем солеобразования, неполной и/или полной этерификации, внутренней этерификации, деацетилирования, О-сульфатирования, перкарбоксилирования и амидирования. Особенно подходящими для указанных здесь задач являются амидные производные НА, в которых гиалуроновая кислота связана с аминами алифатического, аралифатического, циклоалифатического, ароматического, циклического и гетероциклического ряда, с процентом амидирования от 0,1 до 50%, тогда как оставшийся процент НА, который не был амидирован, возможно может образовывать соли с органическими и/или неорганическими основаниями. Производные, полученные таким образом (HYADD™), сохраняют свойства биосовместимости и биораспадаемости исходной молекулы, но они имеют более хорошие механические характеристики. В отношении липосом среди множества способов получения, известных в области техники, авторы изобретения выбрали для применения в получении униламеллярных липосом классическую методику липидной пленки: выбранные липиды которых будут составлять двойной слой, смешивают с органическим растворителем и затем подвергают воздействию установленных условий окружающей среды (например, установленных параметров давления или температуры) так, чтобы обеспечить испарение растворителя и образование сухой липидной пленки. Липидную пленку затем гидратируют с водной средой и/или с раствором, содержащим полимер, ассоциирующийся с липосомами. Одну часть смеси замораживают, лиофильно сушат и затем восстанавливают до исходного объема путем добавления подходящей среды. Стадия замораживания, лиофильной сушки и разведения разработаны на основе экспериментальных данных (Peer at al., Biochim Biophys Acta, 2003, 1612:76-82), которые демонстрируют, что гиалуроновая кислота и/или ее производные могут действовать в качестве криопротекторов для униламеллярных липосомных микроструктур. Как правило, когда простые, структурированные фосфолипидные суспензии лиофильно сушат и затем разбавляют, липосомы теряют свои исходные свойства и организуются в значительно более крупные мультиламеллярные везикулы, которые не подходят для целей настоящего изобретения, поскольку их структура и контролируемое высвобождение материала, который они несут, неэффективны. Присутствие в смеси, которую будут лиофильно сушить, значительных количеств полисахаридов сохраняет исходные структурные свойства липосом за счет образования стабилизирующих водородных связей и поддерживает их эффективность в качестве систем с контролируемым высвобождением после их разведения. В случае гиалуроновой кислоты и/или ее частично замещенных производных, особенно ее высокомолекулярных фракций, стабилизирующий эффект, по-видимому, сопровождается общей структурной организацией, когда значительная часть полисахарида, содержащегося в смеси, покрывает внешнюю гидрофильную поверхность двойного липидного слоя и образует мост между двумя или более липосомами. В местах, где гиалуроновая кислота растягивается от одной липосомы до другой, под микроскопом могут быть видны трубчатые структуры. В этом случае полисахаридная цепь покрыта оболочкой, образованной двойным фосфолипидным слоем, сцепленным с ней водородными связями.

Таким образом, данный тип способа структурной организации полисахарида с липосомами или в них существенно отличается от способа, описанного в уровне техники, и приводит к продукту, который немедленно оказывает уплотняющее действие в обработанной зоне, которое сохраняется в течение длительного времени, особенно за счет длительной защиты, которую обеспечивают липосомы для полисахаридной цепи. Существование препарата in situ в течение такого длительного времени также дает возможность НА продолжать оказывать свои полезные действия в отношении стимуляции и пролиферации клеток, опосредованной действием на рецептор CD44, обсуждаемым ранее, таким образом обеспечивая не только эффект наполнения, но также и биологический эффект стимуляции и регенерации кожи. Применяемая гиалуроновая кислота аналогична той, которая физиологически присутствует в организме людей и даже не требует проведения аллергических проб перед применением.

Липосомы образованы липидами, состоящими из гидрофильной части и липофильной части, которая может иметь одну или несколько насыщенных или ненасыщенных, линейных или разветвленных цепей природного или синтетического происхождения.

Могут быть добавлены другие элементы, такие как холестерин, которые стабилизируют липосомы в биологических жидкостях, или любой другой известный специалистам в данной области элемент, обладающий нужным эффектом.

В рассматриваемом случае наиболее часто используемыми веществами являются вещества с двумя или более боковыми липофильными цепями. Исключительно с целью иллюстрации и без каких-либо ограничений авторы изобретения могут упомянуть липофильные катионные цепи, которые содержат две насыщенные и/или ненасыщенные жирные кислоты, имеющие, например, 10-30 атомов углерода, соли жирных кислот с четвертичными аминами, четвертичные диметилдиациламины, где ацильные группы содержат 8-30 атомов углерода. Дополнительные примеры подробно описаны в литературе (включая Fasbender et al., Am. J. Physiol, 1995, 269: L45-L51; Solodin et al, Biochemistry, 1995, 34:13537-13544; Feigner et al., J. Biol Chem, 1994, 269:2550-2561; Stamatatos et al., Biochemistry, 1988, 27:3917-3925).

Из неионных цепей авторы изобретения могут упомянуть диэфиры глицерина, например, имеющие 10-30 атомов углерода, и алкоксилированные амины, примеры анионных боковых цепей, включая фосфатидиновые кислоты и отрицательно заряженные фосфолипиды, такие как дипальмитоилфосфатидилглицерин.

Примерами веществ, имеющих одну неионную цепь, являются моноглицериновые эфиры, имеющие 10-30 углеродных атомов в цепи, такие как глицерилкапрат, каприлат, гидроксистеарат, лизостеарат, ланолат, лаурат, линолат и т.д.

Липосомы также могут быть образованы производными полиоксиэтилена, к которым липофильные цепи присоединены посредством эфирных и/или сложноэфирных связей. Для иллюстрации авторы изобретения могут упомянуть цетиловый и стеариновый эфиры, и все эфиры, содержащие от 3 до 10 единиц оксиэтилена, и их производные.

Вещества, имеющие одну анионную цепь, включают жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, и отрицательно заряженные фосфолипиды с одной цепью, такие как фосфатидилсерин и фосфатидилглицерин, но не ограничиваются ими.

Наконец, липосомы могут быть образованы фосфолипидами природного или синтетического происхождения. Природные фосфолипиды включают сам фосфатидилхолин яйца, как таковой или гидрированный, а также фосфолипиды из сои или других растительных источников. Синтетические фосфолипиды включают дилауроилглицерофосфохолин (DLPC), димиристоилглицерофосфохолин (DSPC), пальмитоилолеоилглицерофосфохолин (РОРС), фосфатидилэтаноламин, дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), дипальмитоилфосфатидную кислоту (DPPA), фосфатидилсерин и их любые возможные производные. Очевидно, что существует множество возможных комбинаций, которые можно осуществить для изготовления липосом, подходящих для данной цели, и, так как они уже подробно описаны в литературе, специалист в данной области техники способен выбрать наиболее подходящую.

В соответствии с настоящим описанием и формулой изобретения структурная организация гиалуроновой кислоты и/или ее производных с липосомами или в них делает полисахарид менее открытым для атаки свободными радикалами и менее подверженным ферментативному катаболизму гиалуронидазы. Это заключение сделано после индивидуального тестирования различных препаратов НА и/или ее производных, структурно организованных с липосомами или в них. Различные препараты, приготовленные в каждом случае, характеризовали с помощью современных спектроскопических и микроскопических методов, так чтобы получить полезную структурную информацию при различном механическом и биологическом поведении. Реологические и спектроскопические определения проводили для различных препаратов, в которых липидный компонент варьировали таким образом, чтобы модулировать физико-химические характеристики полученных липосом. Концентрация выбранного фосфолипида варьируется между 0,1 и 50 мг/мл, предпочтительно между 0,5 и 10 мг/мл и наиболее предпочтительно составляет 5 мг/мл. В отношении полисахарида авторы изобретения использовали концентрации НА и/или ее производных в диапазоне от 0,1 до 50 мг/мл, предпочтительно от 5 до 15 мг/мл и еще предпочтительней составляют приблизительно 10 мг/мл.

В тестах оценивается устойчивость к разрушению под действием свободных радикалов и ферментов, а также время устойчивости in vitro.

В тестах на устойчивость к ферментам различные препараты подвергали воздействию системы Сu²⁺/аскорбат, которая может продуцировать ОН радикалы (имитируя условия воспаленной ткани), а также были проведены вискозиметрические измерения по времени. В общем, начиная с препаратов гиалуроновой кислоты и/или ее производных, либо структурно организованных с липосомами или в них, либо свободно находящихся в растворе, с аналогичной исходной вязкостью, первые из них демонстрировали значительно более постоянное сохранение вязкости. При воздействии ферментативной атаки бычьей гиалуронидазой те же самые препараты, как правило, подтверждали вышеуказанное. Препараты НА и/или производных, структурно организованных с липосомами или в них, действительно претерпевали меньшую потерю динамической вязкости по сравнению с соответствующими препаратами НА и/или свободными производными в растворе.

Все это объясняет увеличенное время пребывания in situ и, следовательно, более длительный уплотняющий эффект, наблюдаемый для подкожного имплантата, описанного и заявленного здесь.

Исследования времени пребывания также проводили на модели in vivo: подходящие препараты НА и/или производных, приготовленные согласно настоящему изобретению и свободные в растворе, вводили в суставы кролика. Это место было выбрано из-за высокой концентрации гиалуронидазы в синовиальной жидкости. Таким образом, препараты подвергались действию экстремальной ситуации с точки зрения разрушения полисахаридной части. В случае липосомного препарата результаты продемонстрировали максимальные концентрации экзогенной НА на 1 сутки после введения с возвращением к исходным значениям через 3 суток и повышением значений на 7-е и 14-е сутки, демонстрируя постоянную тенденцию, типичную для системы высвобождения. Напротив, препараты, содержащие НА и/или свободные производные в растворе, постепенно и быстро разрушались ферментом, приводя за короткое время к ликвидации экзогенного избытка.

Из анализа результатов можно видеть, что липосомные структуры дают продукту возможность оставаться in situ благодаря комбинации эффектов, а именно

- действию механического типа: образующаяся макроструктура последовательно замедляет катаболическое действие ферментов и свободных радикалов, активирующихся сразу после введения продукта;

- экранирующему действию: липосомы становятся мишенью циркулирующих свободных радикалов, и до того как полисахаридная часть внутри липосом также может быть разрушена под действием гиалуронидазы, сами липосомы должны быть уничтожены;

- пролонгированному присутствию НА и/или ее производных в зоне имплантации; нахождение НА и/или ее производных за пределами и внутри липосом обеспечивает возможность длительного взаимодействия с рецептором CD44 и, следовательно, более последовательную стимулирующую активность в отношении миграции и пролиферации фибробластов, составляющих кожу.

Это способствует значительному улучшению внешнего вида обработанной зоны, которая выглядит более розовой, более гладкой и обновленной.

Таким образом, все вышесказанное демонстрирует, что биорассасывающийся наполнитель, образованный НА и/или ее производным, структурно организованным с фосфолипидными липосомами или в них, таким образом, что полисахарид находится как внутри, так и снаружи липосомы, обеспечивает возможность

- немедленного проявления эффекта уплотнения и клеточной стимуляции благодаря полисахариду, находящемуся снаружи липосом;

- пролонгированного присутствия in situ после подкожной инъекции продукта

и, таким образом, преодолевает ограничения, известные из уровня техники, в области пластической хирургии и лечебной косметики дефектов кожи с использованием наполнителей для мягких тканей.

Результаты, полученные на суставе кролика, кроме того, предполагают дополнительное важное применение продукта, которое является предметом настоящего изобретения. Действительно, если полисахарид представляет собой имеющую среднемолекулярную (от 500000 до 750000 Да) или высокомолекулярную (более 1500000 Да) гиалуроновую кислоту или ее производное, предпочтительно неполный метилпреднизолоновый эфир гиалуроновой кислоты со средней молекулярной массой (для простоты HYC141), полученный препарат при введении путем инъекции в артритный сустав, эффективно использует

- смазывающий эффект липосом;

- противовоспалительный эффект благодаря фармакологическому действию производного кортизона;

- эффект увеличения вязкости НА и/или ее производными;

- защитный эффект НА и/или ее производных в отношении целостности суставного хряща, опосредованный ингибиторным действием IL-1, как указано выше;

- эффект включения в состав и/или замещения синовиальной жидкости, изменяющийся в результате болезни сустава.

Полисахарид, модифицированный производным кортизона, осуществляет немедленное действие благодаря его концентрации за пределами липосомной структуры, а также замедленное действие благодаря его постепенному высвобождению из липосом при их разрушении. Таким образом, механический и фармакологический эффект заявленной композиции усиливается благодаря длительному нахождению препарата в суставной полости, как продемонстрировано в описанных выше тестах.

Таким образом, также в данной заявке получают продукт, который значительно отличается от уже известного и который особенно подходит для применения при заболеваниях суставов артрозного типа.

Принимая во внимание особенные свойства липосом, также можно объединять описанные здесь композиции с биологически и/или фармакологически активными веществами.

Для подтверждения вышесказанного и исключительно в описательных целях авторы изобретения ниже приводят несколько примеров получения препаратов на основе НА и/или ее производных, структурно организованных с фосфолипидными липосомами или в них.

1. Получение препаратов, содержащих фосфолипидные липосомы и натриевую соль среднемолекулярной гиалуроновой кислоты

1.1. Получение липосом.

Препарат получают классическим методом липидной пленки.

150 мг дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC) помещают в стеклянную колбу объемом 100 мл, солюбилизируют в 10 мл хлороформа и быстро встряхивают. Органический растворитель затем удаляют, используя роторный испаритель при низком давлении, при температуре в диапазоне от 20 до 30°С, до получения тонкой фосфолипидной пленки на внутренней поверхности колбы. Остаток хлороформа удаляют путем выпаривания в вакууме при комнатной температуре в течение примерно 12 часов. Пленку DPPC затем регидратируют, добавляя 10 мл 0,2 М фосфатного буферного раствора (PBS), рН 7,4, при энергичном перемешивании. Полученная суспензия претерпевала 6 циклов замораживания-оттаивания, с погружением колбы сначала в жидкий азот, а затем в термостатируемую баню при 50°С. Полученный препарат затем продавливали 10 раз через поликарбонатные фильтры с размером пор 200 нм.

1.2. Структурирование НА (молекулярная масса (ММ) 720000 Да)

300 мг натриевой соли гиалуроновой кислоты ферментативного происхождения растворяют в течение 2-4 ч в 15 мл 0,2 М фосфатного буферного раствора, рН 7,4, при комнатной температуре. Затем смешивают раствор гиалуроновой кислоты и суспензию фосфолипидов и к полученной смеси добавляют 5 мл 0,2 М фосфатного буферного раствора (PBS), рН 7,4, до конечной концентрации 5 мг/мл DPPC и 10 мг/мл натриевой соли гиалуроновой кислоты. Смесь аккуратно перемешивают в течение приблизительно 30 минут и наконец инкубируют в термостате при 50°C в течение 48 часов.

Фиксированную аликвоту данной смеси замораживают в течение 2-4 часов при температуре -80°C и затем лиофильно сушат в течение 48-72 часов. Твердый образец доводят до исходного объема путем добавления деионизованной воды и растворения после недолгого аккуратного перемешивания.

2. Получение препарата, содержащего фосфолипидные липосомы и высокомолекулярную натриевую соль гиалуроновой кислоты

2.1 Получение липосом. Липосомы готовят, как описано в п.1.1.

2.2 Структурирование НА (ММ 1800000 Да)

300 мг натриевой соли гиалуроновой кислоты ферментативного происхождения растворяют в течение 2-4 ч в 15 мл 0,2 М фосфатного буферного раствора (PBS), рН 7,4, при комнатной температуре. Затем смешивают раствор гиалуроновой кислоты и суспензию фосфолипидов и в полученный раствор добавляют 5 мл 0,2 М фосфатного буферного раствора (PBS), рН 7,4, до конечной концентрации 5 мг/мл DPPC и 10 мг/мл натриевой соли гиалуроновой кислоты. Смесь аккуратно перемешивают в течение приблизительно 30 минут и наконец инкубируют в термостате при 50°C в течение 48 часов.

3. Получение препарата, содержащего фосфолипидные липосомы и неполный метилпреднизолоновый эфир натриевой соли среднемолекулярной гиалуроновой кислоты

3.1 Получение липосом.

Липосомы получают, как описано в п.1.1.

3.2 Структурирование метилпреднизолонового эфира НА

150 мг метилпреднизолонового эфира натриевой соли гиалуроновой кислоты (ММ гиалуроновой кислоты 720000 Да), в котором приблизительно 45% карбоксигрупп этерифицированы 6α-метилпреднизолоном, а оставшиеся 55% находятся в форме натриевой соли, растворяют в течение 2-4 ч в 15 мл 0,2 М фосфатного буферного раствора (PBS), рН 7,4, при комнатной температуре. Затем смешивают раствор эфира гиалуроновой кислоты и суспензию фосфолипидов и в полученный раствор добавляют 5 мл 0,2 М фосфатного буферного раствора (PBS), рН 7,4, до конечной концентрации 16 мМ DPPC и 5 мг/мл эфира натриевой соли гиалуроновой кислоты. Смесь аккуратно перемешивают в течение примерно 30 минут и наконец инкубируют в термостате при 50°C в течение 2 часов.

4. Получение препарата, содержащего фосфолипидные липосомы и неполный гексадециламид натриевой соли среднемолекулярной гиалуроновой кислоты

4.1 Получение липосом

Липосомы получают, как описано в п.1.1.

4.2 Структурирование амидного производного НА

120 мг амида натриевой соли гиалуроновой кислоты (ММ гиалуроновой кислоты 720000 Да), полученной посредством ферментации, в которой приблизительно 3% карбоксигрупп амидированы гексадециламином, а оставшиеся 97% находятся в форме натриевой соли, гидратируют в течение 2-4 ч в 15 мл 0,2 М фосфатного буферного раствора, рН 7,4, при комнатной температуре и приготовленную таким образом суспензию автоклавируют в течение 10 мин при Т=121°C. Затем смешивают раствор амида гиалуроновой кислоты и суспензию фосфолипидов и к полученному раствору добавляют 5 мл 0,2 М фосфатного буферного раствора (PBS), рН 7,4, до конечной концентрации 16 мМ DPPC и 4 мг/мл амида натриевой соли гиалуроновой кислоты.

Смесь аккуратно перемешивают в течение приблизительно 30 мин и наконец инкубируют в термостате при 50°C в течение 48 часов.

Фиксированную аликвоту данной смеси замораживают в течение 2-4 часов при температуре -80°C и затем лиофильно сушат в течение 48-72 часов. Твердый образец доводят до исходного объема путем добавления деионизованной воды и растворения после быстрого аккуратного перемешивания.

5. Получение препарата, содержащего фосфолипидные липосомы и низкомолекулярную О-сульфатированную натриевую соль гиалуроновой кислоты

5.1 Получение липосом.

Липосомы получают, как описано в п.1.1.

5.2 Структурирование О-сульфатированного производного НА

300 мг сульфатированной натриевой соли гиалуроновой кислоты (ММ гиалуроновой кислоты 170000 Да), в которой примерно 75% гидроксильных групп сульфатированы, а оставшиеся 25% остаются неизмененными в форме гидроксильных групп, растворяют в течение 2-4 ч в 15 мл 0,2 М фосфатного буферного раствора (PBS), рН 7,4, при комнатной температуре. Затем смешивают раствор сульфатированной гиалуроновой кислоты и суспензию фосфолипидов и к полученной суспензии добавляют 5 мл 0,2 М PBS, рН 7,4, до конечной концентрации 16 мМ DPPC и 10 мг/мл сульфатированной гиалуроновой кислоты. Смесь аккуратно встряхивают в течение приблизительно 30 минут и наконец инкубируют в термостате при 50°С.

Фиксированную аликвоту данной смеси замораживают в течение 2-4 часов при температуре -80°C и затем лиофильно сушат в течение 48-72 часов. Твердый образец доводят до исходного объема путем добавления деионизованной воды и растворения после быстрого аккуратного встряхивания.

Данное изобретение описано таким образом, что становится очевидным, что эти способы могут быть модифицированы различными способами. Такие модификации не должны рассматриваться как отклонения от сущности и цели изобретения, и любая модификация, которая покажется специалисту в данной области техники очевидной, входит в объем следующей формулы изобретения.

Claims

1. Производные гиалуроновой кислоты, структурно организованные с униламеллярными липосомами или в них, для инъекции в качестве наполнителя мягкой ткани и/или для коррекции дефектов кожи, и/или для интеграции в синовиальную жидкость или замещения синовиальной жидкости при внутрисуставном лечении остеоартроза, где указанные производные выбраны из группы, включающей сложные эфиры, внутренние эфиры, амиды, О-сульфатированные производные, перкарбоксилированные производные и деацетилированные производные, где молекулярная масса гиалуроновой кислоты находится в диапазоне от 50000 до 3·10⁶ Да, липосомы образованы фосфолипидами, и концентрация фосфолипида находится в диапазоне от 0,1 до 50 мг/мл.

2. Производные гиалуроновой кислоты, структурно организованные с униламеллярными липосомами или в них, по п.1, где производное гиалуроновой кислоты представляет собой гексадециламид.

3. Производные гиалуроновой кислоты, структурно организованные с униламеллярными липосомами или в них, по п.1, где концентрация производного гиалуроновой кислоты находится в диапазоне от 0,1 до 50 мг/мл.

4. Производные гиалуроновой кислоты, структурно организованные с униламеллярными липосомами или в них, по п.1, где фосфолипид представляет собой дипальмитоилфосфатидилхолин.

5. Производные гиалуроновой кислоты, структурно организованные с униламеллярными липосомами или в них, по п.4, где концентрация фосфолипида составляет 5 мг/мл.

6. Фармацевтическая композиция, содержащая производные гиалуроновой кислоты, структурно организованные с униламеллярными липосомами или в них, по любому из пп.1-5, в качестве наполнителя мягких тканей и/или для коррекции дефектов кожи и водный растворитель.

7. Применение фармацевтической композиции по п.6 для коррекции дефектов кожи.

8. Применение фармацевтической композиции по п.6 в качестве наполнителя мягких тканей.

9. Фармацевтическая композиция для интеграции в синовиальную жидкость или замещения синовиальной жидкости при внутрисуставном лечении остеоартроза, содержащая производные гиалуроновой кислоты по п.1, структурно организованные с униламеллярными липосомами или в них, выбранные из группы, включающей сложные эфиры, внутренние эфиры, амиды, О-сульфатированные производные, перкарбоксилированные производные и деацетилированные производные и водный растворитель.

10. Фармацевтическая композиция по п.9, где производное гиалуроновой кислоты представляет собой метилпреднизолоновый эфир.

11. Фармацевтическая композиция по п.10, где гиалуроновоя кислота этерифицирована 6α-метилпреднизолоном до уровня 45%.

12. Применение фармацевтической композиции по любому из пп.10-11 в качестве интегрируемого элемента/заместителя синовиальной жидкости при внутрисуставном лечении остеоартрозных патологий.