RO127486B1 - Material biocompatibil poros pentru stimularea regenerării cartilajului, şi procedeu de obţinere a acestuia - Google Patents

Description

Invenția se referă la un material biocompatibil, poros, pe bază de colagen, condroitin sulfat și compuși biologic activi, din extracte vegetale de arnică și/sau urzică, incluși în lipozomi, destinat tratării defectelor țesutului cartilaginos și la un procedeu de obținere a acestuia.

Compușii utilizați în compoziția acestui biomaterial, colagenul și condroitin sulfatul, sunt constituenți naturali, care intră în compoziția cartilajului articular, respectiv, a matricei extracelulare a acestuia, caracteristică ce face ca acest produs să mimeze structura țesutului nativ. De asemenea, produsul conține compuși biologic activi (polifenoli, polizaharide), cu acțiune antiinflamatoare, incluși în nanostructuri lipozomale, biocompatibile și biodegradabile, pentru eliberarea controlată a acestora la locul aplicării. Lipozomii obținuți din fosfolipide naturale, prezente în fluidul sinovial și active în procesul de lubrifiere a articulațiilor, asigură distribuția uniformă a substanțelor active într-o matrice glicoproteică stabilizată. Materialul condiționat sub formă de matrice poroase asigură o structură tridimensională, optimă pentru stimularea creșterii și diferențierii condrocitelor, celule implicate în sinteza noului țesut cartilaginos.

Se cunoaște că țesutul cartilaginos articular este un țesut biologic hidratat, care are, ca funcții de bază, distribuirea stresului în zonele de rezistență și reducerea fricțiunii în timpul mișcării articulației. Odată lezat, cartilajul are capacitate limitată de autoregenerare, datorită lipsei vaselor de sânge și absenței celulelor nediferențiate pentru refacere (Anderson A. S., Loeser R. F., Best Practice & Research Clinical Rheumatology, 24, 15-26, 2010).

Colagenul este cea mai abundentă proteină a organismului uman, fiind componentul major al osului, cartilajului, pielii, ligamentului și al tendonului. în plus, această proteină formează o rețea structurală pentru alte țesuturi precum vasele de sânge. Unitatea de bază a structurii colagenului este o peptidă, constând din secvențe repetitive de aminoacizi GlyPro-Hyp, care se combină cu alte 12 peptide, pentru a forma structura de tip helix a colagenului. Până în prezent, au fost identificate, în organismul uman, 22 tipuri de colagen, dar cele mai răspândite sunt tipurile I, II, III și IV. Colagenul tip II este componenta principală a matricei extracelulare cârtilaginoase, iar suporturile pe bază de colagen sunt un grup atractiv de materiale cu utilizări în repararea cartilajului. Acest tip de colagen este relativ ușor de obținut din țesuturi cartilaginoase animale, induce un răspuns imun foarte scăzut, poate fi condiționat în diferite forme (burete tridimensional, hidrogel) și se amestecă ușor cu alte componente, cu agenți reticulanți (de exemplu, glutaraldehidă, carbodiimidă) sau este supus unor tratamente fizice (iradiere UV, încălzire, liofilizare), pentru a modifica proprietățile mecanice ale suportului final.

Condroitin sulfatul este un glicozaminoglican prezent în matricea extracelulară și pe suprafața celulară a țesuturilor conjunctive animale și în țesuturile cartilaginoase. în acest țesut, condroitin sulfatul face parte din structura proteoglicanilor mari, de tipul agrecanului, cu rol în menținerea elasticității matricei cartilaginoase și a proteoglicanilor mici de tipul decorinei și biglicanului, implicați în metabolismul și adeziunea condrocitelor.

Nanostructurile lipidice cunoscute și sub denumirea de nanozomi sau lipozomi, datorită compoziției lor lipidice, a proprietăților fizico-chimice și a compatibilității cu organismul viu, au calități reale de lubrifiere a articulațiilor cartilajului și de a funcționa ca transportori selectivi în procesul de eliberare controlată a medicamentelor (Castor T. P., Current Drug Delivery, 2, 329, 2005). Lipozomii sunt utilizați pentru introducerea în celule a substanțelor farmacologic active, deoarece ei pot capta atât compuși hidrosolubili cât și hidrofilici, în compartimentul lor intern apos, cât și substanțe hidrofobe în bistratul lipidic (Torchilin V. P., Nat. Rev. Drug Discov., 4, 145-160, 2005). Majoritatea cercetărilor privind interacția lipidelor cu biopolimerii s-au limitat la asocierea lipozomilorcu ADN-ul (Khalil I. A.,

RO 127486 Β1

Kogure K., Akita H., Harshima H., Pharmacol. Rev., 58, 32-45, 2006), microtubuli (Raviv U., 1

Needleman D. J., Li Y., Miller Η. P., Wilson L., Safinya C. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 11167-11172, 2005) și substanțe naturale de tip glicozaminoglicani (RO 122949 B1, 3

2010). WO 03000191 A2 se referă la o compoziție și la o metodă pentru tratamentul artritei, care cuprinde unul sau mai mulți glicozaminoglicani în combinație cu unul sau mai mulți 5 inhibitori ai hialuronidazei.

Compușii biologic activi de origine vegetală, de tipul polifenolilor și polizaharidelor, 7 prezintă proprietăți antiinflamatoare, care au la bază capacitatea acestora de a inhiba activitatea radicalilor liberi, implicați în patogeneza diferitelor procese precum inflamația 9 țesuturilor cartilaginoase, îmbătrânirea și cancerul (Hazra B., Biswas S., Mandal N., BMC Complem. Altern. M., 8,63-65,2008). în condiții normale, celulele articulațiilor - sinoviocitele 11 și condrocitele - produc radicali liberi, care sunt implicați în activarea unor cascade de semnalizare intracelulare importante (Roman-Blas J. A., et al., European Journal of 13 Pharmacology, 623, 125-131, 2009). în condiții de poluare, producția de specii reactive de oxigen depășește activitatea antioxidantă disponibilă și se produce un dezechilibru între 15 oxidant și antioxidant, ceea ce conduce la stres oxidativ, un eveniment catabolic care dă naștere la moarte celulară și la degradarea matricei extracelulare implicate în boli 17 degenerative ale cartilajului (osteoartita, artrita reumatoidă etc.) (Migdal C., Serres M., Medecine Sciences, Paris, 27, 405-412, 2011). 19 în ultimul deceniu, cercetările în domeniul obținerii de biomateriale pentru repararea cartilajului articular au căpătat o importanță sporită, datorită, pe de o parte, creșterii 21 longevității populației, care a determinat o incidență mărită a osteoartritelorși osteoartrozelor și, pe de altă parte, accidentelor sporite, survenite în rândul populației tinere. 23

Sunt cunoscute biomaterialele utilizate la repararea cartilajului pe bază de colagen, agaroză, alginat/chitosan (Galois et al., Biorheology, 41, 433-443, 2004), singuri sau în 25 asociere cu polimeri sintetici (polietilenglicol, poliuretani, alcool polivinilic, acid poliglicolic), care acționează ca o rețea biocompatibilă și biodegradabilă în repararea cartilajului. 27 Principalii glicozaminoglicani ai matricei extracelulare cartilaginoase - acid hialuronic și condroitin sulfat - sunt deja comercializați ca agenți condroprotectivi, pentru tratamentul 29 osteoartritei (US 5914322; PrabhakarV., Sasisekharan R., Chem. Biol., 12,267-277, 2005). De asemenea, există preparate comerciale conținând acid hialuronic, precum HYALGAN 31 (Fidia S.p.A.) și SYNVISC (Biomatrix), destinate tratamentului osteoartritic prin injectare intraarticulară. Evaluarea in vitro a unui hidrogel compozit din acid hialuronic și alginat de 33 calciu a evidențiat proliferarea condrocitelor din cultură și producerea de colagen tip II. Mai mult, aceste hidrogeluri implantate într-o leziune osteocondrală de șoarece au arătat o bună 35 toleranță și o biocompatibilitate ridicată (Dausse Y. et al, Osteoarthritis & Cartilage, 11, 1628, 2003). 37

Problema pe care o rezolvă invenția constă în realizarea unui material biocompatibil, poros, pentru stimularea regenerării cartilajului și a unui procedeu de obținere a acestuia. 39 Materialul biocompatibil, poros, pentru stimularea regenerării cartilajului, conform invenției, este constituit din 30...40% lipozomi cationici, cu diametrul mediu cuprins între 50 41 și 200 nm, 1...10% extract de plante, ales între arnică și/sau urzică, conținând 5...20 mg/ml polifenoli și/sau 1...10 mg/ml polizaharide, 30...45% colagen tip II acido-solubil, cu greutatea 43 moleculară medie 300...330 kDa și conținut în colagen mai mare de 85% și 20...30% condroitin sulfat cu greutatea moleculară medie de 15...40 kDa și conținut în acizi uronici de 45 minimum 27%, părțile fiind exprimate în greutate.

RO 127486 Β1

Procedeul de obținere a produsului definit în revendicarea 1, caracterizat prin aceea că se amestecă 30...60 părți compoziție I, constând dintr-o soluție formată din 5...15% lipozomi cationici cu diametrul cuprins între 50 și 200 nm în care s-a înglobat 1...10% extract de plante, ales între arnică și/sau urzică, cu 40.. .70 părți compoziție 11, constând din 50.. .70% soluție vâscoasă de colagen tip II nedenaturat cu concentrație 5...20 mg/ml și greutate moleculară medie de 300...350 kDa, și 30...50% soluție apoasă de sulfat de condroitin de concentrație 10...20 mg/ml cu greutatea moleculară medie de 15...25 kDa și un conținut de acizi uronici de 30%, cele două compoziții se amestecă cu agitare puternică, timp de 30...60 min, la temperaturi sub 30°C, gelul rezultat se liofilizează prin înghețare la o temperatură de -2O...-4O°C, și uscare la o temperatură de 2O...3O°C, timp de 36...72 h, materialul poros rezultat se taie la dimensiuni uniforme și se sterilizează cu radiații gamma.

Produsul, având în compoziție principalele componente ale țesutului cartilaginos (colagen tip II, condroitin sulfat, lipozomi) și substanțe naturale cu efect antiinflamatoar (polifenoli, polizaharide), este eficient în refacerea țesutului cartilaginos în procesele inflamatorii, reumatismale și leziuni traumatice.

Produsul conform invenției reprezintă un material poros, biocompatibil și resorbabil, constituit din 30...40% lipozomi cationici, cu diametrul mediu cuprins între 50 și 200 nm,

1.. .10% extract de plante, ales între arnică și/sau urzică, conținând 5...20 mg/ml polifenoli și/sau 1...10 mg/ml polizaharide, 30...45% colagen tip II acidosolubil, cu greutatea moleculară medie 300...330 kDa și conținut în colagen mai mare de 85% și 20...30% condroitin sulfat cu greutatea moleculară medie de 15...40 kDa și conținut în acizi uronici de minimum 27%, părțile fiind exprimate în greutate.

Procedeul de obținere a produsului, conform invenției, constă în aceea că se realizează un biomaterial poros, prin amestecarea a 30...60 părți compoziție I, constituită dintr-o soluție de 5...15% lipozomi cationici, cu un diametru cuprins între 50 și 200 nm, în care s-au înglobat 1...10% extract apos de plante alese între arnică și urzică, cu un conținut de 5...20 mg/ml polifenoli și/sau 1 ...10 mg/ml polizaharide, cu 40...70 părți compoziție II, reprezentând un amestec din 50...70% soluție vâscoasă de colagen tip II nedenaturat, de concentrație 5...20 mg/ml, cu greutate moleculară medie 300...350 kDa, și o soluție apoasă de 30...50% condroitin sulfat de concentrație 10...20 mg/ml cu greutatea moleculară medie

15.. .25 kDa și un conținut în acizi uronici de 30%. Soluția de lipozomi din compoziția I se obține prin amestecarea de fosfatidilcolină:dioleilfosfatidiletanolamină:colesterol:stearilamină, în raportul de greutate 4:2:3:1, dizolvate în prealabil în 200...500 ml amestec de cloroform și metanol (95:5, părți în volume), solvenți ce se evaporă ulterior la vid. înainte de amestecarea cu compoziția II, compoziția I, conținând extracte vegetale, înglobate în soluția de lipozomi, se depozitează la temperatura camerei, timp de 6...9 h și se omogenizează prin sonicare, într-un sonicatortip baie, la temperatura de 37°C, în 3...5 reprize a câte 30..60 min, urmată de sonicarea la un sonicator tip sondă, 4...6 reprize a câte 10 s. în vederea obținerii unor structuri omogene de soluții lipozomi-extracte vegetale, cu diametrul mai mic de 200 nm, compoziția I se centrifughează la 2000...5000 rpm, timp de 5...10 min și se filtrează prin filtrul Millipore de 0,22 pm. îndepărtarea extractelor vegetale neasociate se face prin centrifugare la 10000...15000 rpm, timp de 30...60 min, după care precipitatele lipozomale se spală de 2 ori cu tampon fosfat salin pH 7,4. Colagenul tip II, utilizat în compoziția II, se obține din cartilaj traheal bovin, prin extracție cu pepsină, în soluție de acid acetic 0,1...0,5M, la 4°C, timp de 48...72 h și se purifică prin precipitare cu o soluție de clorură de sodiu 0,7 M, urmată de o dializă excesivă față de apă distilată. Compoziția I se adaugă peste compoziția II și se amestecă prin vortexare puternică timp de 30...60 min, la temperaturi sub 30°C, după care amestecul obținut sub formă de gel se liofilizează prin înghețare la -20.. ,-40°C și uscare

RO 127486 Β1 la +20...30°C, timp de 36...72 h. Materialul poros obținut se taie la dimensiuni uniforme 1 (diametrul 4...6 mm și grosimea 3 mm), se ambalează în pungi de polietilenă și se sterilizează prin expunere la radiații gamma, la doze de 15...20 kGy. 3

Prin aplicarea invenției, se obțin următoarele avantaje:

- suportul compozit obținut prezintă o eficiență mare în tratarea afecțiunilor 5 cartilaginoase (afecțiuni inflamatorii, reumatismale, tratarea cartilajului lezat etc.) conținând în compoziția sa biopolimeri care se găsesc, în mod natural, în țesutul cartilaginos. 7 înglobarea principiilor active cu acțiune antiinflamatoare în structurile lipozomale cationice permite redarea controlată și prelungită a acestora la locul aplicării; 9

- datorită structurii sale poroase, produsul realizează un contact strâns cu zona lezată, facilitând, astfel, influxul celulelor din țesutul neafectat înconjurător și proliferarea 11 acestora;

- produsul obținut poate servi și ca matrice suport pentru celulele cartilajului 13 (condrocite), oferind acestora o rețea tridimensională, asemănătoare matricei extracelulare, condiție esențială pentru menținerea fenotipului celular;15

- suportul este biocompatibil și biodegradabil în timp, asigurând, astfel, substratul ideal pentru formarea de țesut nou, în timp ce produsul este degradat;17

- produsul este stabil în timp, nu creează antigenicitate în contact cu organismul;

- procedeul de obținere este fezabil și nu necesită instalații cu grad ridicat de 19 complexitate.

Se prezintă, în continuare, două exemple de realizare a invenției.21

Exemplul 1. într-un vas de inox, prevăzut cu agitator, cu un volum util de 10 I, se prepară compoziția lipidică prin amestecarea a patru lipide: 60 g fosfatidilcolină, 30 g23 dioleilfosfatidil-etanolamină, 20 g colesterol și 15 g stearilamină, dizolvate în prealabil în 0,500 I amestec de cloroform și metanol (95:5, raport de volume). îndepărtarea solvenților 25 organici în care s-au dizolvat lipidele se realizează prin evaporare la vid, în atmosferă inertă de azot, într-un vas de sticlă cu fund rotund. Peste soluția lipidică din vasul din sticlă, se 27 introduc 0,1 I extract apos de arnică, cu un conținut de 6 mg/ml polifenoli și 5 mg/ml polizaharide, și se amestecă la temperatura camerei, sub agitare continuă. Pentru a facilita 29 procesul de includere, emulsia rezultată se incubează la temperatura camerei, timp de 7 h și se omogenizează într-un sonicator tip baie, la 37°C, în 3 reprize a câte 30 min fiecare, 31 urmată de sonicarea la un sonicator tip sondă, în 4 reprize a câte 10 s fiecare. Suspensia se răcește la temperatura de 5°C, într-o baie de gheață, timp de 30 min și se centrifughează 33 la 2000 rpm, timp de 10 min.

în vederea obținerii unor structuri omogene, cu particule cu diametrul mai mic de 35 200 nm, soluția obținută după sonicare și centrifugare se filtrează prin filtrul Millipore de 0,22 pm. îndepărtarea extractelor vegetale neasociate se face prin centrifugare la 37 13000 rpm, timp de 60 min, după care precipitatele lipozomale se spală de 2 ori cu tampon fosfat salin, pH 7,4. Sarcina pronunțat negativă a principiilor active folosite (polifenoli, 39 polizaharide) a permis o includere în lipozomi cu randament ridicat, peste 82%.

Separat, într-un vas de inox, prevăzut cu agitator, cu un volum util de 201, se obține 41 colagenul tip II, din cartilaj traheal bovin mărunțitîn prealabil, prin extracție cu pepsină, în soluție de acid acetic 0,5M, la 4°C, timp de 48 h. Soluția de colagen sub formă de gel se 43 purifică prin precipitare cu o soluție de clorură de sodiu 0,7 M, după care se dializează excesiv față de apă distilată, pentru îndepărtarea urmelor de sare. Soluția de colagen astfel 45 obținută, de concentrație 10 mg/ml, se amestecă cu o soluție de condroitin sulfat 5 mg/ml, cu greutatea moleculară medie 15 kDa și conținut în acizi uronici30%, prin agitare continuă, 47 în raport de combinare soluție de colagen:condroitin sulfat 1:1 (raport de volume).

RO 127486 Β1

Compoziția obținută din extracte vegetale înglobate în lipozomi se adaugă peste amestecul de colagen și condroitin sulfat, în raportul de combinare 1:1 (v/v) și se vortexează puternic timp de 30 min, pentru o bună omogenizare. Amestecul obținut, sub formă de gel, se liofilizează prin înghețare la -40°C și uscare la +20°C, timp de 48 h.

Materialul poros, obținut după liofilizare, se taie la dimensiuni de 6x3 mm, se ambalează în pungi de polietilenă și se sterilizează prin expunere la radiații gamma, la doze de 15 kGy.

Exemplul 2. Se utilizează același procedeu și instalație ca la exemplul 1, cu deosebirea că amestecul de lipozomi și extracte vegetale (compoziția I) se prepară din 100 g compoziție lipidică și 50 g extract apos de urzică. Amestecul de cloroform și metanol din compoziția lipidică se evaporă la vid, iar peste soluția de lipozomi se adaugă 50 g extract apos de urzică, cu un conținut de 20 mg/ml polifenoli și 10 mg/ml polizaharide. După depozitarea compoziției I la temperatura camerei, timp de 9 h, se realizează sonicarea, cu ajutorul unui sonicator tip baie, la 37°C, în 5 reprize a câte 40 min fiecare. în urma centrifugării și filtrării acestui amestec, conform exemplului 1, se obțin structuri lipozomale, cu diametrul de 150 nm, în care sunt înglobați polifenolii și polizaharidele din extractul de urzică. După îndepărtarea excesului de componente vegetale prin centrifugare la 15000 rpm, timp de 10 min și spălare cu tampon fosfat salin, pH 7,4, se realizează amestecarea compoziției I cu 500 g compoziție II (amestec colagen tip II și condroitin sulfat), preparată conform exemplului 1. Soluția vâscoasă, omogenă, obținută se condiționează sub formă solidă, prin liofilizare (temperatura de înghețare -35°C și temperatura de uscare +30°C), timp de 36 h. Produsul spongios, obținut după liofilizare, se ambalează etanș în pungi de polietilenă, se sterilizează prin expunere la radiații gamma, la o doză de 18 kGy.

Produsul obținut, conform exemplelor de mai sus, a fost testat din punct de vedere al biocompatibilitatii atât in vitro, cât și in vivo.

Evaluarea efectului antiinflamator al variantelor de produs s-a realizat pe un model experimental in vitro, utilizând culturi primare de condrocite umane, tratate cu peroxid de hidrogen, pentru inducerea de leziuni celulelor. Expunerea celulelor la peroxid de hidrogen produce apoptoza celulelor, peroxidarea lipidică inhibă sinteza de componente ale matricei extracelulare. în acest context, s-au investigat viabilitatea celulară, proliferarea celulară și morfologia celulelor lezate și crescute în prezența produsului realizat, comparativ cu doi martori (celule netratate și celule tratate cu peroxid de hidrogen). Rezultatele obținute prin metode cantitative (spectrofotometrie) și calitative (microscopie optică) au demonstrat că produsul realizat a avut o acțiune antiinflamatoare crescută, evidențiată prin favorizarea proliferării și viabilității celulelor și păstrarea morfologiei normale a condrocitelor în cazul tratării acestora cu variantele de produs, comparativ cu celulele tratate numai cu peroxid de hidrogen care au prezentat o viabilitate redusă și o morfologie modificată.

Biocompatibilitatea in vivo a produsului poros a fost demonstrată pe animale de laborator (șobolani Wistar) cărora li s-au implantat subcutanat probe din produs. La 5 zile și la 6 săptămâni de la implantarea subcutanată, s-a recoltat implantul, împreună cu țesutul înconjurător, care a fost procesat pentru microscopie optică. Observațiile histologice au arătat că la 5 zile de la implantare, în jurul produsului poros, se formează un țesut de granulație, care conține celule inflamatorii și vase de sânge ce apar, în mod normal, în urma unei leziuni tisulare. La 6 săptămâni de la implantare, s-a evidențiat formarea unei capsule conjunctive fibroase, care înconjoară produsul. Studiile histologice au demonstrat că pe toată perioada implantării, materialul poros a fost bine tolerat de țesutul gazdă și nu a determinat efecte adverse, aspect care demonstrează o bună biocompatibilitate.

Claims (3)

Revendicări 1

1. Material biocompatibil, poros, pentru stimularea regenerării cartilajului, 3 caracterizat prin aceea că este constituit din 30...40% lipozomi cationici, cu diametrul mediu cuprins între 50 și 200 nm, 1...10% extract de plante, ales între arnică și/sau urzică, 5 conținând 5...20 mg/ml polifenoli și/sau 1 ...10 mg/ml polizaharide, 30...45% colagen tip II acidosolubil, cu greutatea moleculară medie 300...330 kDa și conținut în colagen mai mare 7 de 85%, și 20...30% condroitin sulfat cu greutatea moleculară medie de 15...40 kDa și conținut în acizi uronici de minimum 27%, părțile fiind exprimate în greutate. 9

2. Procedeu de obținere a produsului definit în revendicarea 1, caracterizat prin aceea că se amestecă 30.. .60 părți compoziție I, constând dintr-o soluție formată din 5... 15% 11 lipozomi cationici cu diametrul cuprins între 50 și 200 nm, în care s-a înglobat 1...10% extract de plante, ales între arnicăși/sau urzică, cu 40...70 părți compoziție II, constând din 50...70% 13 soluție vâscoasă de colagen tip II nedenaturat cu concentrație 5...20 mg/ml și greutate moleculară medie de 300...350 kDa și 30...50% soluție apoasă de sulfat de condroitin de 15 concentrație 10...20 mg/ml cu greutatea moleculară medie de 15...25 kDa și un conținut de acizi uronici de 30%, cele două compoziții se amestecă cu agitare puternică, timp de 30...60 17 min, la temperaturi sub 30°C, gelul rezultat se liofilizează prin înghețare la o temperatură de -2O...-4O°C, și se usucă la o temperatură de 2O...3O°C, timp de 36...72 h, materialul poros 19 rezultat se taie la dimensiuni uniforme și se sterilizează cu radiații gamma.

3. Procedeu de obținere a produsului definit în revendicarea 1, caracterizat prin 21 aceea că soluția de lipozomi cationici din compoziția I se obține prin amestecarea fosfatidilcolinei:dioleilfosfatidiletanolaminei:colesterolului:stearilaminei, în raportul de greutate 23 4:2:3:1.