RO127486A0 - Material biocompatibil poros cu rol în stimularea regenerării cartilajului şi procedeu de obţinere - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un produs sub formă de material poros, biocompatibil şi resorbabil, şi la un procedeu de obţinere a acestuia. Produsul conform invenţiei este constituit din 30...40% lipozomi cationici, 1...10% extract de arnică şi/sau urzică, conţinând 5...20 mg/ml polifenoli şi/sau 1...10 mg/mlpolizaharide, 30...45% colagen acido-solubil de tip II şi 20...30% sulfat de condroitin, părţile fiind exprimate în greutate. Procedeul conform invenţiei constă din amestecarea a 30...60 părţi compoziţie I, constând dintr-o soluţie formată din 5...15% lipozomi în care s-au înglobat 1...10% extract de plante, cu 40...70 părţi compoziţie II, constând din 50...70% soluţie vâscoasă de colagen cu concentraţie 5...20 mg/ml, şi 30...50% soluţie apoasă de sulfat de condroitin de concentraţie 10...20 mg/ml, cele două compoziţii se amestecă, cu agitare puternică, timp de 30...60 min, gelul rezultat se liofilizează la o temperatură de -20...-40°C, se usucă la o temperatură de 20...30°C, timp de 36...72 h, materialul poros rezultat se taie la dimensiuni uniforme şi se sterilizează cu radiaţii gamma.

Description

Invenția se refera la un material biocompatibil poros pe baza de colagen, condroitin sulfat si compuși biologic activi din extracte vegetale (amica si urzica) incluși in lipozomi, destinat tratării defectelor țesutului cartilaginos (osteoartrite, artroze, inflamatii, leziuni traumatice, etc) si un procedeu de obținere a acestuia.

Compușii utilizați in compoziția acestui biomaterial, colagenul si condroitin sulfatul sunt constituenti naturali, care intra in compoziția cartilajului articular, respectiv a matricei lui extracelulare, caracteristica ce face ca acest produs sa mimeze structura țesutului nativ. De asemenea, produsul conține compuși biologic activi (polifenoli, polizaharide), cu acțiune anti-inflamatoare, incluși in nanostructuri lipozomale, biocompatibile si biodegradabile, pentru eliberarea controlata a acestora la locul aplicării. Lipozomii obținuți din fosfolipide naturale, prezente in fluidul sinovial si active in procesul de lubrifiere a articulațiilor, asigura distribuția uniforma a substanțelor active intr-o matrice glicoproteica stabilizata. Materialul condiționai sub forma de matrici poroase asigura o structura tridimensionala, optima pentru stimularea creșterii si diferențierii condrocitelor, celule implicate in sinteza noului tesut cartilaginos.

Se cunoaște ca, tesutul cartilaginos articular este un tesut biologic hidratat care are ca funcții de baza distribuirea stresului in zonele de rezistenta si reducerea fricțiunii in timpul mișcării articulației. Odata lezat, cartilajul are capacitate limitata de autoregenerare datorita lipsei vaselor de sânge si absentei celulelor nediferentiate pentru refacere (ANDERSON A.S., LOESER R.F., Best Practice & Research Clinical Rheumatology, 24, 15-26, 2010).

tV2 011- 0 0 9 1 0-1 6 -09- 2011

Colagenul este cea mai abundenta proteina a organismului uman, fiind componentul major al osului, cartilajului, pielii, ligamentului si lendonului. In plus, aceasta proteina formează o rețea structurala pentru alte țesuturi, precum vasele de sânge. Unitatea de baza a structurii colagenului este o peptida constând din secvențe repetitive de aminoacizi Gly-Pro-Hyp, care se combina cu alte 12 peptide pentru a forma structura de tip helix a colagenului. Pana in prezent, au fost identificate in organismul uman 22 tipuri de colagen, dar cele mai răspândite sunt tipurile I, II, III si

IV. Colagenul tip II este componenta principala a matricei extracelulare cartilaginoase, iar suporturile pe baza de colagen sunt un grup atractiv de materiale cu utilizări in repararea cartilajului. Acest tip de colagen este relativ ușor de obtinut din țesuturi cartilaginoase animale, induce un răspuns imun foarte scăzut, poate fi condiționat in diferite forme (burete tridimensional, hidrogel) si se amesteca ușor cu alte componente, cu agenți reticulanti (de ex., glutaraldehida, carbodiimida) sau este supus unor tratamente fizice (iradiere UV, încălzire, liofilizare) pentru a modifica proprietățile mecanice ale suportului final.

Condroitin sulfatul este un glicozaminoglican prezent in matricea extracelulara si pe suprafața celulara a țesuturilor conjunctive animale, printre care si in țesuturile cartilaginoase. In acest tesut, condroitin sulfatul face parte din structura proteoglicanilor mari, de tipul agrecanului, cu rol in menținerea elasticitatii matricei cartilaginoase si a proteoglicanilor mici de tipul decorinei si biglicanului, implicați in metabolismul si adeziunea condrocitelor.

Nanostructurile lipidice cunoscute si sub denumirea de nanozomi sau lipozomi, datorita compoziției lor lipidice, a proprietăților fizico-chimice si a compatibilității cu organismul viu, au calitati reale de lubrifiere a articulațiilor cartilajului si de a funcționa ca transportori selectivi in procesul de eliberare controlata a medicamentelor (CASTOR T.P., Current Drug Delivery, 2, 329, 2005). Lipozomii sunt utilizați pentru introducerea in celule a substanțelor farmacologic active, deoarece ei pot capta atat compuși hidrosolubili cat si hidrofilici, in compartimentul lor intern apos, cat si substanțe hidrofobe in bistratul lipidic (TORCHILIN V.P., Nat. Rev. Drug Discov., 4, 145-160, 2005). Majoritatea cercetărilor privind interactia lipidelor cu biopolimerii sau limitat la asocierea lipozomilor cu ADN-ul (KHALIL I.A., KOGURE K., AKITA t\'2 Ο 1 1 - Ο Ο 9 1 Ο - 1 6 -09- 2011

Η., HARSHIMA Η., Pharmacol. Rev., 58, 32-45, 2006), microtubuli (RAVIV U., NEEDLEMAN D. J., LI Y., MILLER H.P., WILSON L„ SAFINYA C.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102, 11167-11172, 2005) si substanțe naturale de tip glicozaminoglicani (Brevet RO 122949 Bl, 2010).

Compușii biologic activi de origina vegetala de tipul polifenolilor si polizaharidelor prezintă proprietăți antiinflamatoare, care au la baza capacitatea acestora de a inhiba activitatea radicalilor liberi, implicați in patogeneza diferitelor procese precum inflamatia țesuturilor cartilaginoase, imbatranirea si cancerul (HAZRA B„ BISWAS S., MANDAL N„ BMC Complem. Altern. M., 8, 63-65, 2008). In condiții normale, celulele articulațiilor- sinoviocitele si condrocitele, produc radicali liberi, care sunt implicați in activarea unor cascade de semnalizare intracelulare importante (ROMAN-BLAS J.A., et al., European Joumal of Pharmacology, 623, 125-131, 2009). In condiții de poluare, producția de specii reactive de oxigen depășește activitatea antioxidanta disponibila si se produce un dezechilibru intre oxidant si antioxidant, ceea ce conduce la stress oxidativ, un eveniment catabolic care da naștere la moarte celulara si degradarea matricei extracelulare implicate in boli degenerative ale cartilajului (osteoartrita, artrita reumatoida, etc) (MIGDAL C., SERRES M., Medecine Sciences (Paris), 27, 405-412, 2011).

In ultimul deceniu, cercetările in domeniul obținerii de biomateriale pentru repararea cartilajului articular au capatat o importanta sporita datorita, pe de o parte, creșterii longevității populației, care a determinat o incidența mărită a osteoartritelor si osteoartrozelor si, pe de alta parte, accidentelor sporite survenite in rândul populației tinere.

Sunt cunoscute biomaterialele utilizate la repararea cartilajului pe baza de colagen, agaroza, alginat/chitosan (GALOIS et al., Biorheology, 41, 433-443, 2004), singuri sau in asociere cu polimeri sintetici (polietilenglicol, poliuretani, alcool polivinilic, acid poliglicolic), care actioneaza ca o rețea biocompatibila si biodegradabila in repararea cartilajului. Principalii glicozaminoglicani ai matricei extracelulare cartilaginoase - acid hialuronic si condroitin sulfat, sunt deja comercializați ca agenti condroprotectivi pentru tratamentul osteoartritei (BREVET ¢^2911-00910-1 6 -09- 2011

U.S. 5914322; PRABHAKAR V, SASISEKHARAN R., Chem. Biol., 12, 267-277, 2005). De asemenea, exista preparate comerciale conținând acid hialuronic, precum HYALGAN (Fidia S.p.A.) si SYNVISC (Biomatrix) destinate tratamentului osteoartritic prin injectare intraarticulara. Evaluarea in vitro a unui hidrogel compozit din acid hialuronic si alginat de calciu a evidențiat proliferarea condrocitelor din cultura si producerea de colagen tip II. Mai mult, aceste hidrogeluri implantate intr-o leziune osteocondrala de șoarece au aratat o buna toleranta si o biocompatibilitate ridicata (DAUSSE Y. et al, Osteoarthritis & Cartilage, 11, 16-28, 2003).

Prezenta invenție isi propune realizarea unui produs avand in compoziție principalele componente ale țesutului cartilaginos (colagen tip II, condroitin sulfat, lipozomi) si substanțe naturale cu efect anti-inflamatoar (polifenoli, polizaharide), eficient in refacerea țesutului cartilaginos in procesele inflamatorii, reumatismale si leziuni traumatice.

Produsul, conform invenției, reprezintă un material poros, biocompatibil si resorbabil, constituit din 30...40% lipozomi cationici, cu diametrul mediu cuprins intre

50...200 nm, 1...10% extract de plante ales intre amica si/sau urzica, conținând 5...20 mg/ml polifenoli si/sau 1...10 mg/ml polizaharide, 30...45% colagen tip II acidosolubil, cu greutatea moleculara medie 300...330 kDa si continui in colagen mai mare de 85% si 20...30% condroitin sulfat cu greutatea moleculara medie de 15...40 kDa si continui in acizi uronici de minim 27%, părțile fiind exprimate in greutate.

Procedeul de obținere al produsului, conform invenției, consta in aceea ca se realizează un biomaterial poros prin amestecarea a 30...60 parti compoziție I constituita dintr-o soluție de 5...15% lipozomi cationici, cu un diametru cuprins intre

50.. .200 nm in care s-au înglobat 1...10% extract apos de plante alese intre amica si urzica, cu un continui de 5...20 mg/ml polifenoli si/sau 1...10 mg/ml polizaharide, cu

40.. .70 parti compoziție II reprezentând un amestec din 50...70% soluție vascoasa de colagen tip II nedenaturat, de concentrație 5...20 mg/ml, cu greutate moleculara medie

300.. .350 kDa si o soluție apoasa de 30...50% condroitin sulfat de concentrație 10...20 mg/ml cu greutatea moleculara medie 15...25 kDa si un continui in acizi uronici de 30%. Soluția de lipozomi din compoziția I se obține prin amestecarea

0^1011-00910-1 6 -09- 2011

fosfatidilcolina:dioleilfosfatidiletanolamina:colesterol:stearilamina, in raportul de greutate 4:2:3:1, dizolvate in prealabil in 200...500 ml amestec de cloroform si metanol (95:5, parti in volume), solventi ce se evapora ulterior la vid. înainte de amestecarea cu compoziția II, compoziția I conținând extracte vegetale înglobate in soluția de lipozomi se depozitează la temperatura camerei, timp de 6...9 ore si se omogenizează prin sonicare, intr-un sonicator tip baie, la temperatura de 37 °C, in

3.. .5 reprize a cate 30..60 min, urmata de sonicarea la un sonicator tip sonda, 4...6 reprize a cate 10 secunde. In vederea obținerii unor structuri omogene de soluții lipozomi-extracte vegetale, cu diametrul mai mic de 200 nm, compoziția I se centrifugheaza la 2000...5000 rpm, timp de 5...10 min si se filtrează prin filtrul Millipore de 0,22 pm. îndepărtarea extractelor vegetale neasociate se face prin centrifugare la 10000 ...15000 rpm, timp de 30...60 min, după care precipitatele lipozomale se spala de 2 ori cu tampon fosfat salin pH 7,4. Colagenul tip II, utilizat in compoziția II, se obține din cartilaj traheal bovin, prin extracție cu pepsina, in soluție de acid acetic 0,1...0,5M, la 4 °C, timp de 48...72 ore si se purifica prin precipitare cu o soluție de clorura de sodiu 0,7M urmata de o dializa excesiva fata de apa distilata. Compoziția I se adauga peste compoziția II si se amesteca prin vortexare puternica timp de 30...60 min, la temperaturi sub 30 °C, după care amestecul obtinut sub forma de gel se liofilizează prin înghețare la -20..-40 °C si uscare la +20...30 °C, timp de

36.. .72 ore. Materialul poros obtinut se taie la dimensiuni uniforme (diametrul 4...6 mm si grosime 3 mm), se ambaleaza in pungi de polietilena si se sterilizează prin expunere la radiații gamma, la doze de 15...20 kGy.

Prezenta invenție prezintă următoarele avantaje:

suportul compozit obtinut prezintă o eficienta mare in tratarea afecțiunilor cartilaginoase (afecțiuni inflamatorii, reumatismale, tratarea cartilajului lezat, etc) conținând in compoziția sa biopolimeri care se găsesc, in mod natural, in tesutul cartilaginos. înglobarea principiilor active cu acțiune antiimflamatoare in structurile lipozomale cationice permite redarea controlata si prelungita a acestora la locul aplicării.

0,-2 Ο 1 1 - Ο 09 1 Ο - 1 6 -09- 2011 • Datorita structurii sale poroase, produsul realizează un contact strâns cu zona lezata facilitând, astfel, influxul celulelor din tesutul neafectat înconjurător si proliferarea acestora.

• Produsul obtinut poate servi si ca matrice suport pentru celulele cartilajului (condrocite) oferind acestora o rețea tridimensionala, asemanatoare matricei extracelulare, condiție esențiala pentru menținerea fenotipului celular.

• Suportul este biocompatibil si biodegradabil in timp asigurând, astfel, substratul ideal pentru formarea de tesut nou in timp ce produsul este degradat.

• Produsul este stabil in timp, nu creeaza antigenicitate in contact cu organismul.

• Procedeul de obținere este fezabil si nu necesita instalații cu grad ridicat de complexitate.

Exemplul 1.

Intr-un vas de inox, prevăzut cu agitator, cu un volum util de 10 1, se prepara compoziția lipidica prin amestecarea a patru lipide: 60g fosfatidilcolina, 30g dioleilfosfatidil-etanolamina, 20g colesterol si 15g stearilamina, dizolvate in prealabil in 0,500 1 amestec de cloroform si metanol (95:5, raport de volume). îndepărtarea solventilor organici in care s-au dizolvat lipidele se realizează prin evaporare la vid, in atmosfera inerta de azot, intr-un vas de sticla cu fund rotund. Peste soluția lipidica din vasul de sticla se introduc 0,1 1 extract apos de amica, cu un continui de 6 mg/ml polifenoli si 5 mg/ml polizaharide si se amesteca la temperatura camerei, sub agitare continua. Pentru a facilita procesul de includere, emulsia rezultata se incubeaza la temperatura camerei, timp de 7 ore si se omogenizează intr-un sonicator tip baie, la 37 °C, in 3 reprize a cate 30 minute fiecare, urmata de sonicarea la un sonicator tip sonda, in 4 reprize a cate 10 secunde fiecare. Suspensia se răcește la temperatura de 5 °C, intr-o baie de gheata, timp de 30 minute si se centrifugheaza la 2000 rpm, timp de 10 minute.

In vederea obținerii unor structuri omogene, cu particule de diametrul mai mic de 200 nm, soluția obtinuta după sonicare si centrifugare se filtrează prin filtrul Millipore de 0,22 μηι. îndepărtarea extractelor vegetale neasociate se face prin centrifugare la 13000 rpm, timp de 60 minute, după care precipitatele lipozomale se /^-2 0 1 1 - 0 0 9 1 0 -- ο_η

6 -09- 2011 ’ spala de 2 ori cu tampon fosfat salin, pH 7,4. Sarcina pronunțat negativa a principiilor active folosite (polifenoli, polizaharide) a permis o includere in lipozomi cu randament ridicat, peste 82%.

Separat, intr-un vas de inox, prevăzut cu agitator, cu un volum util de 20 1, se obține colagenul tip II, din cartilaj traheal bovin maruntit in prealabil, prin extracție cu pepsina, in soluție de acid acetic 0,5M, la 4 °C, timp de 48 ore. Soluția de colagen sub forma de gel se purifica prin precipitare cu o soluție de clorura de sodiu 0,7M, după care se dializeaza excesiv fata de apa distilata, pentru îndepărtarea urmelor de sare. Soluția de colagen astfel obtinuta, de concentrație 10 mg/ml, se amesteca cu o soluție de condroitin sulfat 5 mg/ml, cu greutatea moleculara medie 15 kDa si continui in acizi uronici 30%, prin agitare continua, in raport de combinare soluție de colagenxondroitin sulfat 1:1 (raport de volume).

Compoziția, obtinuta din extracte vegetale înglobate in lipozomi, se adauga peste amestecul de colagen si condroitin sulfat, in raportul de combinare 1:1 (v/v) si se vortexeaza puternic timp de 30 minute, pentru o buna omogenizare. Amestecul obtinut, sub forma de gel, se liofilizează prin înghețare la -40 °C si uscare la +20 °C, timp de 48 ore.

Materialul poros, obtinut după liofilizare, se taie la dimensiuni de 6x3 mm, se ambaleaza in pungi de polietilena si se sterilizează prin expunere la radiații gamma, la doze de 15 kGy.

Exemplul 2

Se utilizează același procedeu si instalație ca la exemplul 1, cu deosebirea ca amestecul de lipozomi si extracte vegetale (compoziția I) se prepara din lOOg compoziție lipidica si 50g extract apos de urzica. Amestecul de cloroform si metanol din compoziția lipidica se evapora la vid, iar peste soluția de lipozomi se adauga 50g extract apos de urzica, cu un continui de 20 mg/ml polifenoli si 10 mg/ml polizaharide. După depozitarea compoziției I la temperatura camerei, timp de 9 ore, se realizează sonicarea, cu ajutorul unui sonicator tip baie, la 37 °C, in 5 reprize a cate 40 minute fiecare. In urma centrifugării si filtrării acestui amestec, conform exemplului 1, se obțin structuri lipozomale, cu diametrul de 150 nm, in care sunt înglobați

0,1 011-00910-1 6 -09- 2011 polifenolii si polizaharidele din extractul de urzica. După îndepărtarea excesului de componente vegetale prin centrifugare la 15000 rpm, timp de 10 minute si spalare cu tampon fosfat salin, pH 7,4, se realizează amestecarea compoziției I cu 500g compoziție II (amestec colagen tip II si condroitin sulfat), preparata conform exemplului 1. Soluția vascoasa omogena obtinuta se condiționează sub forma solida, prin liofilizare (temperatura de înghețare -35 °C si temperatura de uscare +30 °C), timp de 36 ore. Produsul spongios, obtinut după liofilizare, se ambaleaza etanș in pungi de polietilena, se sterilizează prin expunere la radiații gamma, la o doza de 18 kGy.

Produsul obtinut, conform exemplelor de mai sus, a fost testat din punct de vedere al biocompatibilitatii atat in vitro cat si in vivo.

Evaluarea efectului anti-inflamator al variantelor de produs s-a realizat pe un model experimental in vitro, utilizând culturi primare de condrocite umane, tratate cu peroxid de hidrogen pentru inducerea de leziuni celulelor. Expunerea celulelor la peroxid de hidrogen produce apoptoza celulelor, peroxidarea lipidica, inhiba sinteza de componente ale matricei extracelulare. In acest context, s-au investigat viabilitatea celulara, proliferarea celulara si morfologia celulelor lezate si crescute in prezenta produsului realizat, comparativ cu doi martori (celule netratate si celule tratate cu peroxid de hidrogen). Rezultatele obținute prin metode cantitative (spectrofotometrie) si calitative (microscopie optica) au demonstrat ca produsul realizat a avut o acțiune antiinflamatoare crescută, evidențiata prin favorizarea proliferării si viabilității celulelor si pastrarea morfologiei normale a condrocitelor in cazul tratării acestora cu variantele de produs, comparativ cu celulele tratate numai cu peroxid de hidrogen care au prezentat o viabilitate redusa si o morfologie modificata.

Biocompatibilitatea in vivo a produsului poros a fost demonstrata pe animale de laborator (șobolani Wistar) carora li s-au implantat subcutanat probe din produs. La 5 zile și la 6 săptămâni de la implantarea subcutanată s-a recoltat implantul împreună cu țesutul înconjurător, care a fost procesat pentru microscopie optica. Observațiile histologice au arătat că, la 5 zile de la implantare, în jurul produsului poros se formează un țesut de granulație, care conține celule inflamatorii și vase de sânge ce <\-2 Ο 1 1 - Ο Ο 9 1 Ο - - ί/

6-09- 2011 apar, în mod normal, în urma unei leziuni tisulare. La 6 săptămâni de la implantare, sa evidențiat formarea unei capsule conjunctive fibroase care înconjoară produsul. Studiile histologice au demonstrat că pe toată perioada implantării, materialul poros a fost bine tolerat de țesutul gazdă și nu determină efecte adverse, aspect care demonstrează o bună biocompatibilitate.

Claims (3)

1. REVENDICĂRI

   1. Produsul, conform invenției, reprezintă un material poros, biocompatibil si resorbabil, constituit din 30...40% lipozomi cationici, cu diametrul mediu cuprins intre

   50...200 nm, 1...10% extract de plante ales intre amica si/sau urzica, conținând 5...20 mg/ml polifenoli si/sau 1... 10 mg/ml polizaharide, 30...45% colagen tip II acido-slubil, cu greutatea moleculara medie 300...330 kDa si continui in colagen mai mare de 85% si 20...30% condroitin sulfat cu greutatea moleculara medie de 15...40 kDa si continui in acizi uronici de minim 27%, părțile fiind exprimate in greutate.
2. 2. Procedeul de obținere al produsului, conform invenției, consta in aceea ca se realizează un biomaterial poros prin amestecarea a 30...60 parti compoziție I constituita dintr-o soluție de 5...15% lipozomi cationici, cu un diametru cuprins intre

   50.. .200 nm in care s-au înglobat 1...10% extract apos de plante alese intre amica si urzica, cu un conținut de 5...20 mg/ml polifenoli si/sau 1 ...10 mg/ml polizaharide, cu

   40.. .70 parti compoziție II reprezentând un amestec din 50...70% soluție vascoasa de colagen tip II nedenaturat, de concentrație 5...20 mg/ml, cu greutate moleculara medie

   300.. .350 kDa si o soluție apoasa de 30...50% condroitin sulfat de concentrație 10...20 mg/ml cu greutatea moleculara medie 15...25 kDa si un continui in acizi uronici de 30%. Soluția de lipozomi din compoziția I se obține prin amestecarea fosfatidilcolina:dioleilfosfatidiletanolamina:colesterol:stearilamina, in raportul de greutate 4:2:3:1, dizolvate in prealabil in 200...500 ml amestec de cloroform si metanol (95:5, parti in volume), solvenți ce se evapora ulterior la vid. înainte de amestecarea cu compoziția II, compoziția I conținând extracte vegetale înglobate in soluția de lipozomi se depozitează la temperatura camerei, timp de 6...9 ore si se omogenizează prin sonicare, intr-un sonicator tip baie, la temperatura de 37 °C, in
3. 3.. .5 reprize a cate 30..60 min, urmata de sonicarea la un sonicator tip sonda, 4...6 reprize a cate 10 secunde. In vederea obținerii unor structuri omogene de soluții lipozomi-extracte vegetale, cu diametrul mai mic de 200 nm, compoziția I se centrifugheaza la 2000...5000 rpm, timp de 5...10 min si se filtrează prin filtrul Millipore de 0,22 pm. îndepărtarea extractelor vegetale neasociate se face prin centrifugare la 10000 ...15000 rpm, timp de 30...60 min, după care precipitatele /^“201 1-00910-1 6 -09- 2011 lipozomale se spala de 2 ori cu tampon fosfat salin pH 7,4. Colagenul tip II, utilizat in compoziția II se obține din cartilaj traheal bovin, prin extracție cu pepsina, in soluție de acid acetic O,1...O,5M, la 4 °C, timp de 48...72 ore si se purifica prin precipitare cu o soluție de clorura de sodiu 0,7M urmata de o dializa excesiva fata de apa distilata. Compoziția I se adauga peste compoziția II si se amesteca prin vortexare puternica timp de 30...60 min, la temperaturi sub 30 °C, după care amestecul obtinut sub forma de gel se liofilizează prin înghețare la -20..-40 °C si uscare la +20...30 °C, timp de

   36...72 ore. Materialul poros obtinut se taie la dimensiuni uniforme (diametrul 4...6 mm si grosime 3 mm), se ambaleaza in pungi de polietilena si se sterilizează prin expunere la radiații gamma, la doze de 15...20 kGy.