RS66036B1 - Oligonukleotidi za indukciju ekspresije očinskog ube3a - Google Patents

Oligonukleotidi za indukciju ekspresije očinskog ube3a

Info

Publication number
RS66036B1
RS66036B1 RS20241003A RSP20241003A RS66036B1 RS 66036 B1 RS66036 B1 RS 66036B1 RS 20241003 A RS20241003 A RS 20241003A RS P20241003 A RSP20241003 A RS P20241003A RS 66036 B1 RS66036 B1 RS 66036B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
oligonucleotide
modified
conjugate
nucleosides
rna
Prior art date
Application number
RS20241003A
Other languages
English (en)
Inventor
Veronica Costa
Maj Hedtjärn
Marius Hoener
Ravi Jagasia
Mads Aaboe Jensen
Christoph Patsch
Lykke Pedersen
Søren Vestergaard Rasmussen
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=57345910&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS66036(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of RS66036B1 publication Critical patent/RS66036B1/sr

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0619—Neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0623—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/34—Allele or polymorphism specific uses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/38—Vitamins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/44—Thiols, e.g. mercaptoethanol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/13—Nerve growth factor [NGF]; Brain-derived neurotrophic factor [BDNF]; Cilliary neurotrophic factor [CNTF]; Glial-derived neurotrophic factor [GDNF]; Neurotrophins [NT]; Neuregulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/60—Transcription factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/52—Fibronectin; Laminin

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na oligonukleotide (oligomere) koji su komplementarni i hibridizuju se sa SNHG14 nizvodno od SNORD109B, što dovodi do indukcije očinske ekspresije ubikvitin-protein ligaze E3A (UBE3A) kod životinje ili čoveka. Ovaj pronalazak se dalje odnosi na farmaceutske sastave i metode za lečenje Angelmanovog sindroma.
OSNOVNE INFORMACIJE
[0002] Angelmanov sindrom je neurogenetski poremećaj izazvan brisanjem ili inaktivacijom gena UBE3A na majčinom nasleđenom hromozomu 15q11.2. Očinska kopija gena UBE3A podleže genomskom utiskivanju i utišavanju u neuronima endogenim antisens transkriptom UBE3A, nazvanim SNHG14 (takođe poznat kao UBE3A-ATS) (Meng et al.2012 Hum Mol Genet. Vol.21 pp.3001-12). Čini se da drugi tipovi ćelija osim neurona eksprimiraju UBE3A gen i iz majčinog i iz očinskog alela.
[0003] Angelmanov sindrom karakteriše teška intelektualna i razvojna invalidnost, poremećaj spavanja, napadi, trzajući pokreti, EEG nenormalnosti, čest smeh ili osmeh i duboka govorna oštećenja.
[0004] WO 2012/064806 obelodanjuje metodu indukcije ekspresije UBE3A u ćeliji korišćenjem inhibitora topoizomeraze. Metoda se može koristiti za lečenje Angelmanovog sindroma. Nema obelodanjenja antisens oligonukleotida.
[0005] WO 2014/004572 obelodanjuje oligonukleotide sa 2'-O-metoksietil-RNK (MOE) modifikacijama koje ciljaju mišji UBE3A-ATS. Oligonukleotidi su testirani samo u testovima vezanim za miševe. U regionu nizvodno od MBII-52 snoRNK (takođe poznatog kao SNORD115) i uzvodno od UBE3A pre-mRNK ne postoji konzervacija između miša i čoveka. Oligonukleotidi koji ciljaju mišji UBE3A-ATS stoga se ne mogu translirati u oligonukleotide koji će funkcionisati kod čoveka. Ne postoji obelodanjivanje oligonukleotida koji ciljaju humani UBE3A-ATS.
PREDMET PRONALASKA
[0006] Ovaj pronalazak identifikuje nove oligonukleotide koji značajno indukuju ekspresiju humanog očinskog UBE3A u neuronskoj ekspresiji bez afekta očinskih SNORD115, SNORD116 i SNRPN transkripata.
REZIME PRONALASKA
[0007] Ovaj pronalazak se odnosi na oligonukleotide koji ciljaju nukleinsku kiselinu sposobnu da potisne ekspresiju UBE3A i da leči ili sprečava bolesti povezane sa smanjenom aktivnošću UBE3A, posebno u neuronskim ćelijama.
[0008] Shodno tome, u prvom aspektu, pronalazak obezbeđuje antisens oligonukleotide koji se sastoje od kontinuirane nukleotidne sekvence dužine od 10 do 30 nukleotida sa najmanje 98% komplementarnosti sa delom humane SNHG14 duge nekodirajuće RNK koja odgovara poziciji 25278410 do 25419462 na humanom hromozomu 15 verzije GRCh38.p2 za upotrebu u lečenju ili prevenciji Angelmanovog sindroma kod ispitanika. Ovaj region je takođe sličan SEQ ID NO: 1. Oligonukleotid je antisens oligonukleotid, poželjno sa gapmer dizajnom. Oligonukleotid je sposoban da indukuje ekspresiju UBE3A, posebno očinsku ekspresiju UBE3A u neuronu, degradacijom, smanjenjem ili uklanjanjem supresora UBE3A, posebno smanjenjem SNHG14 dugog nekodirajućeg RNK transkripta nizvodno od SNORD109B. Postiže se re-ekspresija UBE3A bez značajnog uticaja na ekspresiju SNORD115. Razgradnja ciljne nukleinske kiseline se poželjno postiže regrutovanjem nukleaze.
[0009] U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje antisens oligonukleotid sposoban da indukuje ekspresiju humanog očinskog UBE3A za upotrebu u lečenju ili prevenciji Angelmanovog sindroma kod ispitanika, pri čemu navedeni antisens oligonukleotid sadrži kontinuiranu nukleotidnu sekvencu koja je 100% komplementarna sa regionom ciljne nukleinske kiseline pozicije 1 do 55318 SEQ ID NO: 1, pri čemu je oligonukleotid ili dužine 15 do 20 nukleotida ili dužine 17 do 22 nukleotida, pri čemu oligonukleotid sadrži jedan ili više modifikovanih nukleozida, pri čemu je jedan ili više modifikovanih nukleozida 2' šećerno modifikovani nukleozid, pri čemu je jedan ili više 2' šećerno modifikovanih nukleozida nezavisno izabrano iz grupe koja se sastoji od 2'-O-alkil-RNK, 2'-O-metil-RNK, 2'-alkoksi-RNK, 2'-O-metoksietil-RNK, 2'-amino-DNK, 2'-fluoro-DNK, arabino nukleinske kiseline (ANK), 2'-fluoro-ANK i LNK nukleozida, pri čemu oligonukleotid sadrži najmanje jednu modifikovanu internukleozidnu vezu, pri čemu je navedena modifikovana internukleozidna veza fosforotioatna veza, pri čemu je oligonukleotid gapmer formule F-G-F' pri čemu svaki od regiona F i F' nezavisno se sastoji od 2, 3, 4 ili 5 modifikovanih nukleozidnih jedinica, a region G se sastoji od 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 nukleozidnih jedinica. U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje konjugat za upotrebu u lečenju ili prevenciji Angelmanovog sindroma kod ispitanika, konjugat koji se sastoji od antisens oligonukleotida iz pronalaska i najmanje jednog konjugovanog dela kovalentno vezanog za oligonukleotid.
[0010] U daljem aspektu, pronalazak pruža farmaceutske sastave koji se sastoje od oligonukleotida ili konjugata pronalaska i farmaceutski prihvatljivih razblaživača, nosača, soli i/ili adjuvansa.
[0011] U daljem aspektu, pronalazak pruža metode za in vitro indukciju ekspresije UBE3A u ciljnoj ćeliji gde je ekspresija očinskog UBE3A potisnuta, primenom oligonukleotida, konjugata ili sastava pronalaska u efikasnom iznosu u navedenoj ćeliji.
KRATAK OPIS SLIKA
[0012]
Slika 1: Gornji lanac ilustruje region SNHG14 transkripta nizvodno od SNORD109B (UBE3A-ATS) gde crna polja označavaju lokaciju testiranih mišjih oligonukleotida. Donji lanac ilustruje region kodiranja UBE3A, gde crna polja označavaju egzone. Egzon 1 se nalazi oko 160 kb. Oligonukleotidi su postavljeni u antisens regionu Egzona 9 (pozicioniran na ~ 97kb), Egzona 10 (pozicioniran na ~ 92kb), Egzona 13 (pozicioniran na ~ 77kb) i 5' kraju Egzona 16 (pozicioniran na ~60kb).
Slika 2: Prikaz sposobnosti oligonukleotida, testiranih u primeru 2, da indukuju re-ekspresiju UBE3A u kulturama humanih neuronskih ćelija. Oligonukleotidi komplementarni sa regionom humane SNHG14 duge nekodirajuće RNK između SNORD109B i regiona uzvodno od UBE3A kodirajućeg regiona (pozicija 1 do 55318 SEQ ID NO: 1) označeni su sa • nepreklapanje.
Oligonukleotidi komplementarni sa regionom humane SNHG14 duge nekodirajuće RNK koja je antisens prema UBE3A pre-mRNK (pozicija 55319 do 141053 SEQ ID NO: 1) indikovani su sa ▲preklapanje. Oligonukleotidi iz Tabele 3 sa konzervacijom na čoveka i rezus majmuna označeni su na dnu svakog crteža kao . Konzervacija između čoveka:rezus:miša je označena sa . Koncentracije oligonukleotida bile su 0,2, 1 i 5 mikroM, kao što je naznačeno na desnoj strani svakog crteža.
DEFINICIJE
Oligonukleotid
[0013] Termin „oligonukleotid“ kako se ovde koristi definisan je kako ga kvalifikovana osoba generalno razume kao molekul koji se sastoji od dva ili više kovalentno povezanih nukleozida. Takvi kovalentno vezani nukleozidi se takođe mogu nazivati molekulima nukleinske kiseline ili oligomerima. Oligonukleotidi su obično proizvedeni u laboratoriji hemijskom sintezom u čvrstoj fazi, nakon čega sledi prečišćavanje. Kada se upućuje na sekvencu oligonukleotida, upućuje se na sekvencu ili redosled nukleobaznih delova, ili njihove modifikacije, kovalentno povezanih nukleotida ili nukleozida. Oligonukleotid iz pronalaska je veštački proizveden, hemijski sintetizovan i tipično prečišćen ili izolovan. Oligonukleotid pronalaska može da sadrži jedan ili više modifikovanih nukleozida ili nukleotida.
Antisens oligonukleotidi
[0014] Termin „Antisens oligonukleotid“ koji se ovde koristi definisan je kao oligonukleotidi sposobni da moduliraju ekspresiju ciljnog gena hibridizacijom do ciljne nukleinske kiseline, posebno do kontinuirane sekvence na ciljnoj nukleinskoj kiselini. Antisens oligonukleotidi nisu u suštini dvolančani i stoga nisu siRNK. Poželjno je da su antisens oligonukleotidi ovog pronalaska jednolančani.
Kontinuirana nukleotidna sekvenca
[0015] Termin "kontinuirana nukleotidna sekvenca" odnosi se na region oligonukleotida koji je komplementaran sa ciljnom nukleinskom kiselinom. Termin se ovde koristi naizmenično sa terminom „kontinuirana sekvenca nukleobaza“ i terminom „oligonukleotidna motiv sekvenca“. U nekim otelotvorenjima svi nukleotidi oligonukleotida su prisutni u kontinuiranoj nukleotidnoj sekvenci. U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid obuhvata kontinuiranu nukleotidnu sekvencu i može, opciono, obuhvatiti dodatne nukleotide, na primer region nukleotidnog linkera koji se može koristiti za vezivanje funkcionalne grupe za kontinuiranu nukleotidnu sekvencu. Region nukleotidnog linkera može ili ne mora biti komplementaran sa ciljnom nukleinskom kiselinom.
Nukleotidi
[0016] Nukleotidi su gradivni blokovi oligonukleotida i polinukleotida, a za potrebe ovog pronalaska uključuju i prirodne i nukleotide koji se ne javljaju u prirodi. U prirodi, nukleotidi, kao što su DNK i RNK nukleotidi, obuhvataju deo šećera riboze, deo nukleobaze i jednu ili više fosfatnih grupa (kojih nema u nukleozidima). Nukleozidi i nukleotidi se takođe mogu naizmenično nazivati „jedinicama“ ili „monomerima“.
Modifikovani nukleozid
[0017] Termin „modifikovani nukleozid“ ili „modifikacija nukleozida“ kako se ovde koristi odnosi se na nukleozide modifikovane u poređenju sa ekvivalentnim DNK ili RNK nukleozidom uvođenjem jedne ili više modifikacija šećernog dela ili (nukleo)baznog dela. U poželjnom otelotvorenju, modifikovani nukleozid sadrži modifikovani deo šećera. Termin modifikovani nukleozid se ovde takođe može koristiti naizmenično sa terminom „analog nukleozida“ ili modifikovane „jedinice“ ili modifikovani „monomeri“.
Modifikovana internukleozidna veza
[0018] Termin „modifikovana internukleozidna veza“ se definiše kao generalno shvaćen od strane kvalifikovane osobe kao veza različita od fosfodiestarskih (PO) veza, koje kovalentno spajaju dva nukleozida zajedno. Nukleotidi sa modifikovanom internukleozidnom vezom se takođe nazivaju „modifikovanim nukleotidima“. U nekim otelotvorenjima, modifikovana internukleozidna veza povećava rezistentnost oligonukleotida na nukleazu u poređenju sa fosfodiestarskom vezom. Za prirodno prisutne oligonukleotide, internukleozidna veza uključuje fosfatne grupe koje stvaraju fosfodiestarsku vezu između susednih nukleozida. Modifikovane internukleozidne veze su posebno korisne u stabilizaciji oligonukleotida za in vivo upotrebu i mogu poslužiti za zaštitu od cepanja nukleaze u regionima DNK ili RNK nukleozida u oligonukleotidu iz pronalaska, na primer u regionu praznine gapmer oligonukleotida, kao i u regionima modifikovanih nukleozida.
[0019] U jednom otelotvorenju, oligonukleotid sadrži jednu ili više internukleozidnih veza modifikovanih od prirodnog fosfodiestra do veze koja je, na primer, otpornija na napad nukleaze. Otpornost na nukleazu može se odrediti inkubacijom oligonukleotida u krvnom serumu ili korišćenjem testa rezistencije na nukleazu (npr. fosfodiesteraza zmijskog otrova (SVPD)), oboje je dobro poznato u struci. Internukleozidne veze koje su sposobne da poboljšaju otpornost oligonukleotida na nukleazu nazivaju se internukleozidne veze otporne na nukleazu. U poželjnim otelotvorenjima modifikovano je najmanje 50% internukleozidnih veza u oligonukleotidu, ili njegovoj kontinuiranoj nukleotidnoj sekvenci, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80 ili kao što je najmanje 90% internukleozidnih veza u oligonukleotidu, ili njegovoj kontinuiranoj nukleotidnoj sekvenci. U nekim otelotvorenjima sve internukleozidne veze oligonukleotida, ili njihove kontinuirane nukleotidne sekvence, su modifikovane. Biće prepoznato da, u nekim otelotvorenjima, nukleozidi koji povezuju oligonukleotid pronalaska sa nenukleotidnom funkcionalnom grupom, kao što je konjugat, mogu biti fosfodiestar. U nekim otelotvorenjima, sve internukleozidne veze oligonukleotida, ili njihove kontinuirane nukleotidne sekvence, su internukleozidne veze otporne na nukleazu.
[0020] Modifikovane internukleozidne veze mogu se izabrati iz grupe koja se sastoji od fosforotioata, difosforotioata i boranofosfata. U poželjnim otelotvorenjima, modifikovane internukleozidne veze su kompatibilne sa regrutovanjem RNazeH oligonukleotida iz pronalaska, na primer fosforotioat, difosforotioat ili boranofosfat.
[0021] U nekim otelotvorenjima internukleozidna veza obuhvata sumpor (S), kao što je fosforotioatna internukleozidna veza.
[0022] Fosforotioatna internukleozidna veza je posebno korisna zbog otpornosti na nukleaze, korisne farmakokinetike i jednostavnosti proizvodnje. U poželjnim otelotvorenjima fosforotioat su najmanje 50% internukleozidnih veza u oligonukleotidu, ili njegovoj kontinuiranoj nukleotidnoj sekvenci, kao što je najmanje 60%, kao što je najmanje 70%, kao što je najmanje 80 ili kao što je najmanje 90% internukleozidnih veza u oligonukleotidu, ili njegovoj kontinuiranoj nukleotidnoj sekvenci. U nekim otelotvorenjima sve internukleozidne veze oligonukleotida, ili njihove kontinuirane nukleotidne sekvence, su fosforotioat.
[0023] U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid sadrži jednu ili više neutralnih internukleozidnih veza, posebno internukleozidnih veza izabranih između fosfotriestra, metilfosfonata, MMI, amida-3, formacetala ili tioformacetala.
[0024] Dalje internukleozidne veze su obelodanjene u WO2009/124238. U jednom otelotvorenju, internukleozidna veza je izabrana iz linkera obelodanjenih u WO2007/031091. Konkretno, internukleozidna veza može biti izabrana iz grupe koju čine -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -S-P(O)2-S-, -O-PO(R<H>)-O-, 0-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NR<H>)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHR<H>)-O-, -OP(O)2-NR<H>-, -NR<H>-P(O)2-O-, -NR<H>-CO-O-, -NR<H>-CO-NR<H>-, i/ili internukleozidni linker može biti izabran iz grupe koja se sastoji od: -O-CO-O-, -O-CO-NR<H>-, -NR<H>-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NR<H>-, -O-CH2-CH2-NR<H>-, -CO-NR<H>-CH2-, -CH2-NR<H>CO-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-SO2-CH2-, -CH2-CO-NR<H>-, -O-CH2-CH2-NR<H>-CO -, -CH2-NCH3-O-CH2-, pri čemu je R<H>izabran od vodonika i C1-4-alkil.
[0025] Veze otporne na nukleazu, kao što su fosfotioatne veze, su posebno korisne u oligonukleotidnim regionima sposobnim da regrutuju nukleazu kada formiraju dupleks sa ciljnom nukleinskom kiselinom, kao što je region G za gapmere, ili nemodifikovani nukleozidni region "headmer"-a i "tailmer"-a. Međutim, veze fosforotioata mogu takođe biti korisne u regionima za regrutovanje ne-nukleaza i/ili regionima koji povećavaju afinitet, kao što su regioni F i F' za gapmere, ili modifikovani nukleozidni region "headmer"-a i "tailmer"-a.
[0026] Međutim, svaki od projektovanih regiona može sadržati internukleozidne veze različite od fosforotioata, kao što su veze fosfodiestara, posebno u regionima u kojima modifikovani nukleozidi, kao što je LNK, štite vezu od razgradnje nukleaze. Uključivanje veza fosfodiestara, kao što su jedna ili dve veze, posebno između modifikovanih nukleozidnih jedinica ili u njihovoj blizini (obično u regionima regrutovanja ne-nukleaza) može modifikovati bioraspoloživost i/ili bio-distribuciju oligonukleotida - vidi WO2008/113832.
[0027] U jednom otelotvorenju, sve internukleozidne veze u oligonukleotidu su fosforotioatne i/ili boranofosfatne veze. Poželjno, sve internukleozidne veze u oligonukleotidu su fosforotioatne veze.
Nukleobaza
[0028] Termin nukleobaza uključuje purinski (npr. adenin i gvanin) i pirimidinski (npr. uracil, timin i citozin) deo prisutan u nukleozidima i nukleotidima koji formiraju vodonične veze u hibridizaciji nukleinskih kiselina. U kontekstu ovog pronalaska, termin nukleobaza takođe obuhvata modifikovane nukleobaze koje se mogu razlikovati od prirodnih nukleobaza, ali su funkcionalne tokom hibridizacije nukleinskih kiselina. U ovom kontekstu „nukleobaza“ se odnosi i na prirodne nukleobaze kao što su adenin, gvanin, citozin, timidin, uracil, ksantin i hipoksantin, kao i na varijante koje se ne javljaju prirodno. Takve varijante su na primer opisane u Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 i Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1.
[0029] U nekim otelotvorenjima, nukleobazni deo je modifikovan promenom purina ili pirimidina u modifikovani purin ili pirimidin, kao što je supstituisani purin ili supstituisani pirimidin, kao što je nukleobaza izabrana iz grupe koju čine izocitozin, pseudoizocitozin, 5-metil citozin, 5-tiozolo-citozin, 5-propinil-citozin, 5-propinil-uracil, 5-bromuracil 5-tiazolouracil, 2-tio-uracil, 2'tio-tiomin, inozin, diaminopurin, 6-aminopurin, 2-aminopurin, 2,6-diaminopurin i 2-hloro-6-aminopurin.
[0030] Delovi nukleobaze mogu biti označeni slovnim kodom za svaku odgovarajuću nukleobazu, npr. A, T, G, C ili U, pri čemu svako slovo može opciono uključivati modifikovane nukleobaze ekvivalentne funkcije. Na primer, u primerima oligonukleotida, delovi nukleobaze se biraju između A, T, G, C i 5-metil citozina. Opciono, za LNK gapmere mogu se koristiti 5-metil citozin LNK nukleozidi.
Modifikovani oligonukleotid
[0031] Termin modifikovani oligonukleotid opisuje oligonukleotid koji se sastoji od jednog ili više nukleozida modifikovanih šećerom i/ili modifikovanih internukleozidnih veza.
Termin "himerni" oligonukleotid je termin koji je u literaturi korišćen za opisivanje oligonukleotida sa modifikovanim nukleozidima.
Komplementarnost
[0032] Termin komplementarnost opisuje kapacitet za Watson-Crick bazno uparivanje nukleozida/nukleotida. Bazni parovi Watson-Crick su gvanin (G)-citozin (C) i adenin (A) -timin (T)/uracil (U). Podrazumeva se da oligonukleotidi mogu da sadrže nukleozide sa modifikovanim nukleobazama, na primer 5-metil citozin se često koristi umesto citozina, i kao takav termin komplementarnost obuhvata Watson Crick bazno uparivanje između nemodifikovanih i modifikovanih nukleobaza (videti, na primer, Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055 i Bergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1.
[0033] Termin „% komplementarno“ kako se ovde koristi, odnosi se na broj nukleotida u procentima kontinuirane nukleotidne sekvence u molekulu nukleinske kiseline (npr. oligonukleotida) koji su, na datom položaju, komplementarni (tj. formiraju Watson Crick bazne parove sa) kontinuiranom nukleotidnom sekvencom, na datom položaju zasebnog molekula nukleinske kiseline (npr. ciljna nukleinska kiselina). Procenat se izračunava brojanjem poravnatih baza koje formiraju parove između dve sekvence, deljenjem sa ukupnim brojem nukleotida u oligonukleotidu i množenjem sa 100. U takvom poređenju, nukleobaza/nukleotid koji se ne poravnava (formira bazni par) naziva se neusklađenost.
[0034] Termin „potpuno komplementaran“, odnosi se na 100% komplementarnost.
Hibridizacija
[0035] Termin „hibridizacija“ ili „hibridira“ kako se ovde koristi treba shvatiti kao dva lanca nukleinske kiseline (npr. oligonukleotid i ciljna nukleinska kiselina) koji formiraju vodonične veze između baznih parova na suprotnim lancima, čime se formira dupleks. Afinitet vezivanja između dva lanca nukleinske kiseline je jačina hibridizacije. Često se opisuje u smislu temperature topljenja (Tm) definisane kao temperatura na kojoj se polovina oligonukleotida dupleksuje sa ciljnom nukleinskom kiselinom. U fiziološkim uslovima Tmnije strogo proporcionalna afinitetu (Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537). Standardno stanje Gibsove slobodne energije ΔG° je tačniji prikaz afiniteta vezivanja i povezano je sa konstantom disocijacije (Kd) reakcije sa ΔG°= -RTIn (Kd), gde je R gasna konstanta, a T apsolutna temperatura. Stoga, veoma nizak ΔG° reakcije između oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline odražava snažnu hibridizaciju između oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline. ΔG° je energija povezana sa reakcijom gde su vodene koncentracije 1M, pH je 7, a temperatura 37°C. Hibridizacija oligonukleotida u ciljnu nukleinsku kiselinu je spontana reakcija, a za spontane reakcije ΔG° je manja od nule. ΔG° se može izmeriti eksperimentalno, na primer, korišćenjem metode izotermne titracione kalorimetrije (ITC) kao što je opisano u Hansen et al., 1965, Chem. Comm.36-38 i Holdgate et al., 2005, Drug Discov Today. Stručnjak u ovoj oblasti će znati da je komercijalna oprema
1
dostupna za ΔG° merenja. ΔG° se takođe može numerički proceniti korišćenjem modela najbližeg suseda kako je opisano u SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA.95: 1460-1465 koristeći odgovarajuće izvedene termodinamičke parametre koje su opisali Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 i McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405. Da bi imali mogućnost da hibridizacijom moduliraju svoju predviđenu metu nukleinske kiseline, oligonukleotidi ovog pronalaska hibridizuju se do ciljne nukleinske kiseline sa procenjenim vrednostima ΔG° ispod -10 kcal za oligonukleotide dužine 10-30 nukleotida. U nekim otelotvorenjima stepen ili jačina hibridizacije se meri standardnim stanjem Gibsove slobodne energije ΔG°. Oligonukleotidi se mogu hibridizovati sa ciljnom nukleinskom kiselinom sa procenjenim vrednostima ΔG° ispod opsega od -10 kcal, kao što je ispod -15 kcal, kao što je ispod -20 kcal i kao što je ispod -25 kcal za oligonukleotide dužine 8-30 nukleotida. U nekim otelotvorenjima oligonukleotidi se hibridizuju sa ciljnom nukleinskom kiselinom sa procenjenom vrednošću ΔG° od -10 do -60 kcal, kao što je -12 do -40, kao što je od -15 do -30 kcal ili od -16 do -27 kcal kao što je -18 do -25 kcal.
Meta
[0036] Meta se odnosi na protein koji se želi modulisati.
Ciljna nukleinska kiselina
[0037] Ciljna nukleinska kiselina je predviđena meta sa kojom se oligonukleotid iz pronalaska hibridizuje, a može, na primer, biti gen, RNK, nekodirajuća RNK, dugačka nekodirajuća RNK, mRNK i pre-mRNK, zrela mRNK ili cDNK sekvenca. U nekim otelotvorenjima, ciljna nukleinska kiselina je nekodirajuća RNK ili duga nekodirajuća RNK, ili njihova podsekvenca. Za in vivo ili in vitro primenu, oligonukleotid iz pronalaska može da smanji nivo SNHG14 transkripta nizvodno od SNORD109B i time ublaži supresiju očevog UBE3A transkripta u predviđenoj ciljnoj ćeliji. Kontinuirana sekvenca nukleobaza oligonukleotida iz pronalaska je komplementarna sa ciljnom nukleinskom kiselinom, mereno dužinom oligonukleotida, opciono sa izuzetkom jedne ili dve neusklađenosti, i opciono isključujući regione linkera na bazi nukleotida koji mogu povezati oligonukleotid sa opcionom funkcionalnom grupom kao što je konjugat.
Ciljna sekvenca
[0038] Oligonukleotid se sastoji od kontinuirane nukleotidne sekvence koja je komplementarna ili hibridizovana sa podsekvencom molekula ciljne nukleinske kiseline.
Termin „ciljna sekvenca“ koji se ovde koristi odnosi se na sekvencu nukleotida prisutnih u ciljnoj nukleinskoj kiselini koja obuhvata nukleobaznu sekvencu koja je komplementarna sa oligonukleotidom iz pronalaska. U nekim otelotvorenjima, ciljna sekvenca se sastoji od regiona na ciljnoj nukleinskoj kiselini koji je komplementaran sa kontinuiranom nukleotidnom sekvencom oligonukleotida iz pronalaska. U nekim otelotvorenjima ciljna sekvenca je duža od komplementarne sekvence pojedinačnog oligonukleotida i može, na primer, predstavljati preferirani region ciljne nukleinske kiseline koji može biti na meti nekoliko oligonukleotida pronalaska.
[0039] Oligonukleotid iz pronalaska se sastoji od kontinuirane nukleotidne sekvence koja je komplementarna sa ciljnom nukleinskom kiselinom, kao što je ciljna sekvenca.
[0040] Oligonukleotid se sastoji od kontinuirane nukleotidne sekvence od najmanje 8 nukleotida, koja je komplementarna ili hibridizovana sa ciljnom sekvencom prisutnom u ciljnom molekulu nukleinske kiseline. Kontinuirana nukleotidna sekvenca (a samim tim i ciljna sekvenca) se sastoji od najmanje 8 susednih nukleotida, kao što su 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 susednih nukleotida, kao što su od 12-25, kao što su od 14-18 susednih nukleotida.
Ciljna ćelija
[0041] Termin ciljna ćelija kako se ovde koristi odnosi se na ćeliju koja eksprimira ciljnu nukleinsku kiselinu. U nekim otelotvorenjima ciljna ćelija može biti in vivo ili in vitro. U nekim otelotvorenjima ciljna ćelija je ćelija sisara kao što je ćelija glodara, kao što je ćelija miša ili ćelija pacova, ili ćelija primata kao što je ćelija majmuna ili ljudska ćelija. U poželjnim otelotvorenjima ciljna ćelija je neuronska ćelija.
Varijanta koja se javlja u prirodi
[0042] Termin „prirodna varijanta“ odnosi se na varijante SNHG14 transkripta nizvodno od gena SNORD109B ili transkripata koji potiču iz istih genetskih lokusa kao ciljna nukleinska kiselina, ali se mogu razlikovati, na primer, zbog degeneracije genetskog koda koji uzrokuje mnoštvo kodona u dugoj nekodirajućoj RNK. Oligonukleotid iz pronalaska stoga može biti dizajniran tako da cilja ciljnu nukleinsku kiselinu i njene prirodne varijante.
Modulacija ekspresije
[0043] Termin „modulacija ekspresije“ koji se ovde koristi treba shvatiti kao opšti termin za sposobnost oligonukleotida da promeni količinu proteina UBE3A u poređenju sa količinom proteina UBE3A pre primene oligonukleotida. Alternativno, modulacija ekspresije može se odrediti pozivanjem na kontrolni eksperiment gde se oligonukleotid iz pronalaska ne primenjuje. Modulacija koju vrši oligonukleotid povezana je sa njegovom sposobnošću da redukuje, ukloni, spreči, smanji, snizi ili prekine supresiju transkripta očinskog UBE3A, npr. degradacijom ili uklanjanjem nekodirajućeg SNHG14 transkripta nizvodno od SNORD109B ili blokadom ili prevencijom aktivnosti polimeraze povezane sa SNHG14 transkriptom nizvodno od SNORD109B. Modulacija se takođe može posmatrati kao sposobnost oligonukleotida da obnovi, poveća ili poboljša ekspresiju očinskog UBE3A, npr. uklanjanjem ili blokadom inhibitornih mehanizama na koje utiče nekodirajući SNHG14 transkript nizvodno od SNORD109B.
Modifikovani nukleozidi visokog afiniteta
[0044] Modifikovani nukleozid visokog afiniteta je modifikovani nukleotid koji, kada je ugrađen u oligonukleotid, povećava afinitet oligonukleotida za njegovu komplementarnu metu, na primer, mereno temperaturom topljenja (Tm). Modifikovani nukleozid visokog afiniteta ovog pronalaska poželjno dovodi do povećanja temperature topljenja između 0,5 do 12°C, poželjnije između 1,5 do 10°C i najpoželjnije između+3 do 8°C po modifikovanom nukleozidu. Brojni modifikovani nukleozidi visokog afiniteta su poznati u struci i uključuju, na primer, mnoge 2' supstituisane nukleozide, kao i zaključane nukleinske kiseline (LNK) (vidi npr. Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 i Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213).
Modifikacije šećera
[0045] Oligomer iz pronalaska može da sadrži jedan ili više nukleozida koji imaju modifikovani šećerni deo, tj. modifikaciju šećernog dela u poređenju sa šećernim delom riboze koji se nalazi u DNK i RNK.
[0046] Napravljeni su brojni nukleozidi sa modifikacijom šećernog dela riboze, prvenstveno sa ciljem poboljšanja određenih svojstava oligonukleotida, kao što su afinitet i/ili rezistencija na nukleazu.
1
[0047] Takve modifikacije uključuju one u kojima je struktura prstena riboze modifikovana, npr. zamenom sa prstenom heksoze (HNK, engl. HNA) ili bicikličnim prstenom, koji obično imaju biradikalni most između ugljenika C2 i C4 na prstenu riboze (LNK, engl. LNA), ili nepovezanim riboznim prstenom koji obično nema vezu između ugljenika C2 i C3 (npr. UNK, engl. UNA). Ostali nukleozidi modifikovani šećerom uključuju, na primer, bicikloheksozne nukleinske kiseline (WO2011/017521) ili triciklične nukleinske kiseline (WO2013/154798). Modifikovani nukleozidi takođe uključuju nukleozide gde se šećerni deo zamenjuje delom koji nije šećer, na primer u slučaju peptidnih nukleinskih kiselina (PNK, engl. PNA) ili morfolino nukleinskih kiselina.
[0048] Šećerne modifikacije takođe uključuju modifikacije izvršene promenom supstituentnih grupa na prstenu riboze u grupe različite od vodonika, ili 2'-OH grupu koja se prirodno nalazi u DNK i RNK nukleozidima. Supstituenti se mogu, na primer, uvesti na položajima 2', 3', 4' ili 5'. Nukleozidi sa modifikovanim šećernim delovima takođe uključuju 2' modifikovane nukleozide, kao što su 2' supstituisani nukleozidi. U stvari, glavni fokus je potrošen na razvoj 2' supstituisanih nukleozida, a utvrđeno je da brojni 2' supstituisani nukleozidi imaju korisna svojstva kada se inkorporiraju u oligonukleotide, kao što su poboljšana otpornost na nukleozide i poboljšani afinitet.
2' modifikovani nukleozidi.
[0049] Nukleozid sa šećernom modifikacijom na poziciji 2' je nukleozid koji ima supstituent različit od H ili -OH na poziciji 2' (2' supstituisani nukleozid) ili obuhvata 2' linkovan biradikal, i uključuje 2' supstituisane nukleozide i nukleozide LNK (2' - 4' premošćen biradikalom). Na primer, 2' modifikovani šećer može pružiti poboljšani afinitet vezivanja i/ili povećanu nukleaznu rezistentnost na oligonukleotid. Primeri 2' supstituisanih modifikovanih nukleozida su 2' -O-alkil-RNK, 2'-O-metil-RNK, 2'-alkoksi-RNK, 2'-O-metoksietil-RNK (MOE), 2'-amino-DNK, 2'-fluoro-RNK i 2'-fluoro-ANK (F-ANK). Za dodatne primere, vidi npr. Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443 i Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213; i Deleavey i Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937. U nastavku su ilustracije nekih 2' supstituisanih modifikovanih nukleozida.
Baza
2’F-RNK2’F-ANK
Zaključani nukleinskokiselinski nukleozidi (LNK).
[0050] LNK nukleozidi su modifikovani nukleozidi koji čine linker grupu (koja se naziva biradikalom ili mostom) između C2' i C4' prstena šećera riboze nukleotida. Ovi nukleozidi se u literaturi nazivaju i premošćena nukleinska kiselina ili biciklična nukleinska kiselina (BNK, engl. BNA).
[0051] U nekim otelotvorenjima, modifikovani nukleozid ili nukleozidi LNK oligomera pronalaska imaju opštu strukturu formule I ili II:
pri čemu je W izabran iz grupe koju čine -O-, -S-, -N(R<a>)-, -C(R<a>R<b)>-, kao što je, u nekim otelotvorenjima -O-;
B označava nukleobazni ili modifikovani nukleobazni deo;
Z označava internukleozidnu vezu sa susednim nukleozidom, ili 5'-terminalnom grupom; Z* označava internukleozidnu vezu sa susednim nukleozidom, ili 3'-terminalnom grupom; X označava grupu izabranu sa liste koja se sastoji od -C (R<a>R<b)>-, -C(R<a>)=C(R<b>)-, - C(R<a>)=N-, -O-, -Si(R<a>)2-, -S-, -SO2-, -N(R<a>)-, i >C=Z
[0052] U nekim otelotvorenjima, X se bira iz grupe koja se sastoji od: -O-,-S-, NH-, NR<a>R<b>, -CH2-, CR<a>R<b>, -C(=CH2)- i -C(=CR<a>R<b>)-
1
[0053] U nekim otelotvorenjima, X je -O-
[0054] Y označava grupu izabranu iz grupe koja se sastoji od -C(R<a>R<b>)-, -C(R<a>)=C(R<b>)-, -C(R<a>)=N-, -O-, -Si(R<a>)2-, -S-, -SO2-, -N(R<a>)-, i >C=Z
[0055] U nekim otelotvorenjima, Y je izabrano iz grupe koja se sastoji od: -CH2-, -C(R<a>R<b>)-, - CH2CH2-, -C(R<a>R<b>)-C(R<a>R<b>)-, -CH2CH2CH2-, -C(R<a>R<b>)C(R<a>R<b>)C(R<a>R<b>)-, -C(R<a>)=C(R<b>)-, i -C(R<a>)=N-.
[0056] U nekim otelotvorenjima, Y je izabrano iz grupe koja se sastoji od: -CH2-, -CHR<a>-, -CHCH3-, CR<a>R<b>-ili -X-Y- zajedno označavaju bivalentnu linker grupu (koja se takođe naziva radikalom) zajedno označavaju bivalentnu linker grupu koja se sastoji od 1, 2, 3 ili 4 grupe/atoma izabranih iz grupe koja se sastoji od -C(R<a>R<b>)-, -C(R<a>)=C(R<b>)-, -C(R<a>)=N-, -O-, -Si(R<a>)2-, -S-, -SO2-, -N(R<a>)-, i >C=Z,
[0057] U nekim otelotvorenjima, -X-Y- označava biradikal izabran iz grupa koje se sastoje od: -X-CH2-, -X-CR<a>R<b>-, -X-CHR<a>', -X-C(HCH3)-, -O-Y-, -O-CH2-, -S-CH2-, -NH-CH2-, -O-CHCH3-, -CH2-O-CH2, -O-CH(CH3CH3)-, -O-CH2-CH2-, OCH2-CH2-CH2-,-O-CH2OCH2-,-O-NCH2-, -C(=CH2)-CH2-, -NR<a>-CH2-, N-O-CH2, -S-CR<a>R<b>- i -S-CHR<a>-.
[0058] U nekim otelotvorenjima -X-Y- označava -O-CH2- ili -O-CH(CH3)-.
pri čemu se Z bira između -O-, -S- i -N(R<a>)-,
i R<a>i, kada je prisutan R<b>, svaki je nezavisno izabran između vodonika, opciono supstituisanog C1-6-alkila, opciono supstituisanog C2-6-alkenila, opciono supstituisanog C2-6-alkinila, hidroksi, opciono supstituisanog C1-6-alkoksi, C2-6-alkoksialkila, C2-6-alkeniloksi, karboksi, C1-6-alkoksikarbonila,C1-6-alkilkarbonila, formila, arila, ariloksi-karbonila, ariloksi, arilkarbonila, heteroariloksi-karbonila, heteroariloksi, heteroariloksi, heteroarilkarbonila, amino, mono- i di(C1-6-alkil)amino, karbamoila, mono-i di(C1-6-alkil)-amino-karbonila, amino-C1-6-alkilaminokarbonila, mono- i di(C1-6-alkil)-amino-C1-6-alkil-aminokarbonila, C1-6-alkilkarbonilamino, karbamido, C1-6-alkanoiloksi, sulfono, C1-6-alkilsulfoniloksi, nitro, azido, sulfanil, C1-6-alkiltio, halogena, gde aril i heteroaril mogu biti opciono supstituisani i gde dva geminalna supstituenta R<a>i R<b>zajedno mogu označavati opciono supstituisani metilen (=CH2), pri čemu svi hiralni centri, asimetrične grupe mogu se naći ili u R ili S orijentaciji.
1
pri čemu R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine: vodonik, opciono supstituisani C1-6-alkil, opciono supstituisani C2-6-alkenil, opciono supstituisani C2-6-alkinil, hidroksi, C1-6-alkoksi, C2-6-alkoksialkil, C2-6-alkeniloksi, karboksi, C1-6-alkoksikarbonil, C1-6-alkilkarbonil, formil, aril, ariloksi-karbonil, ariloksi, arilkarbonil, heteroaril, heteroariloksikarbonil, heteroariloksi, heteroarilkarbonil, amino, mono- i di(C1-6-alkil)amino, karbamoil, mono- i di(C1-6-alkil)-amino-karbonil, amino-C1-6-alkilaminokarbonil, mono- i di(C1-6-alkil)amino-C1-6-alkil-aminokarbonil, C1-6-alkilkarbonilamino, karbamido, C1-6-alkanoiloksi, sulfono, C1-6-alkilsulfoniloksi, nitro, azido, sulfanil, C1-6-alkiltio, halogen, gde aril i heteroaril mogu biti opciono supstituisani, i gde dva geminalna supstituenta zajedno mogu označiti okso, tiokso, imino, ili opciono supstituisani metilen.
[0059] U nekim otelotvorenjima R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su nezavisno izabrani iz grupe koju čine C1-6alkil, kao što su metil i vodonik.
[0060] U nekim otelotvorenjima R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su svi vodonik.
[0061] U nekim otelotvorenjima R<1>, R<2>, R<3>, svi su vodonik, a bilo R<5>i R<5*>je takođe vodonik, a drugi od R<5>i R<5*>je različit od vodonika, kao što je C1-6alkil kao što je metil.
[0062] U nekim otelotvorenjima, R<a>je ili vodonik ili metil. U nekim otelotvorenjima, kada je prisutan, R<b>je ili vodonik ili metil.
[0063] U nekim otelotvorenjima, jedan ili oba R<a>i R<b>su vodonik.
[0064] U nekim otelotvorenjima, jedan od R<a>i R<b>je vodonik, a drugi je različit od vodonika.
[0065] U nekim otelotvorenjima, jedan od R<a>i R<b>je metil, a drugi je vodonik.
[0066] U nekim otelotvorenjima, i R<a>i R<b>su metil.
[0067] U nekim otelotvorenjima, biradikal -X-Y- je -O-CH2-, W je O, a svi od R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su vodonik. Takvi LNK nukleozidi su obelodanjeni u WO99/014226, WO00/66604, WO98/039352 i WO2004/046160, i uključuju ono što je opšte poznato kao beta-D-oksi LNK i alfa-L-oksi LNK nukleozidi.
1
[0068] U nekim otelotvorenjima, biradikal -X-Y- je -S-CH2-, W je O, a svi od R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su vodonik. Takvi tio LNK nukleozidi su obelodanjeni u WO99/014226 i WO2004/046160.
[0069] U nekim otelotvorenjima, biradikal -X-Y- je -NH-CH2-, W je O, a svi od R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su vodonik. Takvi amino LNK nukleozidi su obelodanjeni u WO99/014226 i WO2004/046160.
[0070] U nekim otelotvorenjima, biradikal -X-Y- je -O-CH2-CH2- ili -O-CH2-CH2- CH2-, W je O, a svi od R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su vodonik. Takvi LNK nukleozidi su obelodanjeni u WO00/047599 i Morita et al, Bioorganic & Med.Chem. Lett.12 73-76, i uključuju ono što je opšte poznato kao 2'-O-4'C-etilen premošćene nukleinske kiseline (ENK).
[0071] U nekim otelotvorenjima, biradikal -X-Y- je -O-CH2-, W je O, a svi od R<1>, R<2>, R<3>, i jedan od R<5>i R<5*>su vodonik, a drugi od R<5>i R<5*>je različit od vodonika kao što je C1-6alkil , kao što je metil. Takvi 5' supstituisani LNK nukleozidi su obelodanjeni u WO2007/134181.
[0072] U nekim otelotvorenjima, biradikal -X-Y- je -O-CR<a>R<b>-, pri čemu je jedan ili oba od R<a>i R<b>različit od vodonika, kao što je metil, W je O, a svi od R<1>, R<2>, R<3>i jedan od R<5>i R<5*>je vodonik, a drugi od R<5>i R<5*>je različit od vodonika kao što je C1-6alkil , kao što je metil. Takvi bis modifikovani LNK nukleozidi su obelodanjeni u WO2010/077578.
[0073] U nekim otelotvorenjima, biradikal -X-Y- označava bivalentnu linkersku grupu -O-CH(CH2OCH3)-(2'O-metoksietil biciklična nukleinska kiselina - Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp.1569-81). U nekim otelotvorenjima, biradikal -X-Y- označava bivalentnu linkersku grupu -O-CH(CH2CH3)-(2'O-etil biciklična nukleinska kiselina - Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp.1569-81). U nekim otelotvorenjima, biradikal -X-Y- je -O-CHR<a>-, W je O, a svi od R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su vodonik. Takvi 6' supstituisani LNK nukleozidi su obelodanjeni u WO10036698 i WO07090071.
[0074] U nekim otelotvorenjima, biradikal -X-Y- je -O-CH(CH2OCH3)-, W je O, a svi od R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su vodonik. Takvi nukleozidi LNK su takođe poznati u struci kao ciklični MOE (cMOE) i obelodanjeni su u WO07090071.
1
[0075] U nekim otelotvorenjima, biradikal -X-Y- označava bivalentnu linkersku grupu -O-CH(CH3)-. – bilo u R- ili S- konfiguraciji. U nekim otelotvorenjima, biradikal -X-Y- zajedno označava bivalentnu linkersku grupu -O-CH2-O-CH2- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem). U nekim otelotvorenjima, biradikal -X-Y- je -O-CH(CH3)-, W je O, a svi od R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su vodonik. Takvi 6' metil LN nukleozidi su takođe poznati u struci kao cET nukleozidi, i mogu biti ili (S)cET ili (R)cET stereoizomeri, kao što je obelodanjeno u WO07090071 (beta-D) i WO2010/036698 (alfa-L).
[0076] U nekim otelotvorenjima, biradikal -X-Y- je -O-CR<a>R<b>-, pri čemu ni R<a>ni R<b>nisu vodonik, W je O, a svi od R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su vodonik. U nekim otelotvorenjima, R<a>i R<b>su oba metil. Takvi 6' di-supstituisani LNK nukleozidi su obelodanjeni u WO 2009006478.
[0077] U nekim otelotvorenjima, biradikal -X-Y- je -S-CHR<a>-, W je O, a svi od R<1>, R<2>, R<3>, R<5>and R<5*>su vodonik. Takvi 6' supstituisani tio LNK nukleozidi su obelodanjeni u WO11156202. U nekim 6' supstituisanim tio LNK otelotvorenjima R<a>je metil.
[0078] U nekim otelotvorenjima, biradikal -X-Y- je -C(=CH2)-C(R<a>R<b)>-, kao što je -C(=CH2)-CH2- , ili - C(=CH2)-CH(CH3)-W je O, a svi od R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su vodonik. Takvi vinil karbo LNK nukleozidi su obelodanjeni u WO08154401 i WO09067647.
[0079] U nekim otelotvorenjima, biradikal -X-Y- je -N(-OR<a>)-, W je O, a svi od R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su vodonik. U nekim otelotvorenjima R<a>je C1-6alkil kao što je metil. Takvi LNK nukleozidi su takođe poznati kao N supstituisani LNK i obelodanjeni su u WO2008/150729. U nekim otelotvorenjima, biradikal -X-Y- zajedno označava bivalentnu linkersku grupu -O-NR<a>-CH3- (Seth at al., 2010, J. Org. Chem). U nekim otelotvorenjima, biradikal -X-Y- je -N(R<a>)-, W je O, a svi od R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5*>su vodonik. U nekim otelotvorenjima R<a>je C1-6alkil kao što je metil.
[0080] U nekim otelotvorenjima, jedan ili oba od R<5>i R5<*>su vodonik i, kada je supstituisan, drugi od R<5>i R<5*>je C1-6alkil kao što je metil. U takvom otelotvorenju, R<1>, R<2>, R<3>, svi mogu biti vodonik, a biradikal -X-Y- može biti izabran između -O-CH2- ili -O-C(HCR<a>)-, kao što je -O-C(HCH3)-.
1
[0081] U nekim otelotvorenjima, biradikal je -CR<a>R<b>-O-CR<a>R<b>-, kao što je CH2-O-CH2-,W je O i svi od R<1>, R<2>, R<3>, R<5>i R<5* *>su vodonik. U nekim otelotvorenjima R<a>je C1-6alkil kao što je metil. Takvi LNK nukleozidi su takođe poznati kao konformaciono ograničeni nukleotidi (CRN) i obelodanjeni su u WO2013036868.
[0082] U nekim otelotvorenjima, biradikal je -CR<a>R<b>-O-CR<a>R<b>-, kao što je O-CH2-O-CH2-, W je O i svi od R<1>, R<2>, R<3>, R<5>and R<5*>su vodonik. U nekim otelotvorenjima R<a>je C1-6alkil kao što je metil. Takvi LNK nukleozidi su takođe poznati kao COC nukleotidi i obelodanjeni su u Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 200937(4), 1225-1238.
[0083] Prepoznaće se, osim ako nije navedeno, da nukleozidi LNK mogu biti u beta-D ili alfa-L stereoizoformi.
[0084] Određeni primeri nukleozida LNA prikazani su u Šemi 1.
Šema 1
α-L-oksi LNK α-L-amino LNK α-L-tio LNK ß-D-amino supstituisana LNK
6'metil ß-D-oksi LNK6'dimetil ß-D-oksi LNK 5'metil ß-D-oksi LNK
D-oksi LNK
Karb no LNK
2
[0085] Kao što je ilustrovano u primerima, u poželjnim otelotvorenjima pronalaska LNK nukleozidi u oligonukleotidima su beta-D-oksi-LNK nukleozidi.
Degradacija posredovana nukleazom
[0086] Nukleazom posredovana degradacija odnosi se na oligonukleotid sposoban da posreduje u degradaciji komplementarne nukleotidne sekvence prilikom formiranja dupleksa sa takvom sekvencom.
[0087] U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid može funkcionisati putem nukleazom posredovane degradacije ciljne nukleinske kiseline, pri čemu su oligonukleotidi pronalaska sposobni da regrutuju nukleazu, posebno i endonukleazu, poželjno endoribonukleazu (RNaza), kao što je RNaza H. Primeri dizajna oligonukleotida koji funkcionišu putem mehanizama posredovanih nukleazom su oligonukleotidi koji obično obuhvataju region od najmanje 5 ili 6 DNK nukleozida i okruženi su sa jedne ili obe strane nukleozidima koji povećavaju afinitet, na primer gapmerima, "headmer"-ima i "tailmer"-ima.
Aktivnost i regrutacija RNaze H
[0088] Aktivnost RNaze H antisens oligonukleotida odnosi se na njegovu sposobnost da regrutuje RNazuH kada je u dupleksu sa komplementarnim molekulom RNK. WO01/23613 pruža in vitro metode za određivanje aktivnosti RNazeH, koje se mogu koristiti za određivanje sposobnosti regrutovanja RNazeH. Obično se smatra da je oligonukleotid sposoban da regrutuje RNazu H ako, kada mu je data komplementarna ciljna sekvenca nukleinskih kiselina, ima početnu brzinu, merenu u pmol/l/min, od najmanje 10% ili više od 20% početne brzine utvrđene kada se koristi oligonukleotid koji ima istu baznu sekvencu kao modifikovani oligonukleotid koji se testira, ali sadrži samo DNK monomere, sa fosforotioatnim vezama između svih monomera u oligonukleotidu, i korišćenjem metodologije date u primeru 91 - 95 WO01/23613.
Gapmer
[0089] Termin gapmer koji se ovde koristi odnosi se na antisens oligonukleotid koji se sastoji od regiona RNaze H koji regrutuje oligonukleotide (praznina) koji je okružen sa 5' i 3' jednim ili više modifikovanih nukleozida (bokovi) koji povećavaju afinitet. Ovde su opisani različiti dizajni gapmera. "Headmer"-i i "tailmer"-i su oligonukleotidi koji mogu da regrutuju RNazu H gde nedostaje jedan od bokova, odnosno samo jedan od krajeva oligonukleotida sadrži modifikovane nukleozide koji povećavaju afinitet. Za "headmer"-e nedostaje 3' bok (tj.5' bok sadrži modifikovane nukleozide koji povećavaju afinitet), a za "tailmer"-e nedostaje 5' bok (tj. 3' bok sadrži modifikovane nukleozide koji povećavaju afinitet).
LNK Gapmer
[0090] Termin LNK gapmer je gapmer oligonukleotid pri čemu je najmanje jedan od modifikovanih nukleozida koji poboljšavaju afinitet nukleozid LNK.
Mešoviti krilni gapmer
[0091] Termin mešoviti krilni gapmer odnosi se na LNK gapmer gde nekodirajući regioni sadrže najmanje jedan LNK nukleozid i najmanje jedan ne-LNK modifikovani nukleozid, kao što je najmanje jedan 2' supstituisani modifikovani nukleozid, kao što su, na primer, 2'-O-alkil-RNK, 2'-O-metil-RNK, 2'-alkoksi-RNK, 2'-O-metoksietil-RNK (MOE), 2'-amino-DNK, 2'-Fluoro-RNK i 2'-F-ANK nukleozid(i). U nekim otelotvorenjima, mešoviti krilni gapmer ima jedan bok koji sadrži LNK nukleozide (npr.5' ili 3'), a drugi bok (3', odnosno 5') sadrži 2' supstituisane modifikovane nukleozide.
Konjugat
[0092] Termin konjugat kako se ovde koristi odnosi se na oligonukleotid koji je kovalentno povezan sa nenukleotidnim delom (konjugovani deo ili region C ili treći region).
[0093] Konjugacija oligonukleotida iz pronalaska sa jednim ili više nenukleotidnih delova može poboljšati farmakologiju oligonukleotida, npr. uticajem na aktivnost, ćelijsku distribuciju, ćelijski unos ili stabilnost oligonukleotida. U nekim otelotvorenjima konjugovani deo modifikuje ili poboljšava farmakokinetička svojstva oligonukleotida poboljšanjem ćelijske distribucije, bioraspoloživosti, metabolizma, izlučivanja, permeabilnosti i/ili ćelijske apsorpcije oligonukleotida. Konjugat posebno može ciljati oligonukleotid na određeni organ, tkivo ili ćelijski tip i time povećati efikasnost oligonukleotida u tom organu, tkivu ili ćelijskom tipu. Istovremeno, konjugat može poslužiti za smanjenje aktivnosti oligonukleotida u neciljnim tipovima ćelija, tkivima ili organima, npr. van ciljne aktivnosti ili aktivnosti u neciljnim tipovima ćelija, tkivima ili organima. WO 93/07883 i WO 2013/033230 obezbeđuju odgovarajuće konjugovane delove. WO 2012/143379 pruža metodu isporuke leka preko krvno-moždane barijere konjugacijom sa fragmentom antitela sa afinitetom za receptor transferina.
[0094] Oligonukleotidni konjugati i njihova sinteza su takođe prijavljeni u sveobuhvatnim pregledima autora Manoharan u Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch.16, Marcel Dekker, Inc., 2001 i Manoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103.
[0095] U jednom otelotvorenju, nenukleotidni deo (konjugatni deo) je izabran iz grupe koju čine ugljeni hidrati, ligandi receptora ćelijske površine, supstance leka, hormoni, lipofilne supstance, polimeri, proteini, peptidi, toksini (npr. bakterijski toksini), vitamini, virusni proteini (npr. kapside) ili njihove kombinacije. U nekim otelotvorenjima nenukleotidni deo je antitelo ili fragment antitela, kao što je antitelo ili fragment antitela koji olakšava isporuku preko krvno-moždane barijere, posebno antitelo ili fragment antitela koji cilja na receptor transferina.
Linkeri
[0096] Veza ili linker je veza između dva atoma koja povezuje jednu hemijsku grupu ili segment od interesa sa drugom hemijskom grupom ili segmentom od interesa preko jedne ili više kovalentnih veza. Konjugovani delovi se mogu vezati za oligonukleotid direktno ili preko veznog dela (npr. linker ili spona). Linkeri služe za kovalentno povezivanje trećeg regiona, npr. konjugovanog dela (Region C), sa prvim regionom, npr. oligonukleotidom (region A).
[0097] U nekim otelotvorenjima pronalaska konjugat ili oligonukleotidni konjugat pronalaska može opciono da obuhvata region linkera (drugi region ili region B i/ili region Y) koji je pozicioniran između oligonukleotida (region A ili prvi region) i konjugovanog dela (region C ili treći region).
[0098] Region B se odnosi na biocepive linkere koji sadrže ili se sastoje od fiziološki labilne veze koja se može cepiti u uslovima koji se obično susreću ili su analogni onima koji se susreću u telu sisara. Uslovi pod kojima fiziološki labilni linkeri prolaze kroz hemijsku transformaciju (npr. cepanje) uključuju hemijske uslove kao što su pH, temperatura, oksidativni ili reduktivni uslovi ili agensi i koncentracija soli koja se nalazi u ćelijama sisara
2
ili je analogna onima koje se susreću u ćelijama sisara. Unutarćelijska stanja sisara takođe uključuju prisustvo enzimske aktivnosti koja je normalno prisutna u ćeliji sisara, kao što su proteolitički enzimi ili hidrolitički enzimi ili nukleaze. U jednom otelotvorenju biorazgradivi linker je podložan cepanju nukleaze S1. U poželjnom otelotvorenju, linker osetljiv na nukleazu se sastoji od između 1 i 10 nukleozida, kao što su 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 nukleozida, poželjnije između 2 i 6 nukleozida i najpoželjnije između 2 i 4 povezana nukleozida koji se sastoje od najmanje dve uzastopne veze fosfodiestra, kao što su najmanje 3 ili 4 ili 5 uzastopnih veza fosfodiestra. Poželjno je da su nukleozidi DNK ili RNK.
Fosfodiestar koji sadrži biorazgradive linkere detaljnije je opisan u WO 2014/076195.
[0099] Region Y se odnosi na linkere koji nisu nužno biorazgradivi, ali prvenstveno služe za kovalentno povezivanje konjugovanog dela (region C ili treći region), sa oligonukleotidom (region A ili prvi region). Regionalni Y linkeri mogu se sastojati od lančane strukture ili oligomera ponavljajućih jedinica kao što su etilen glikol, jedinice aminokiselina ili amino alkilne grupe. Oligonukleotidni konjugati ovog pronalaska mogu biti konstruisani od sledećih regionalnih elemenata A-C, A-B-C, A-BY-C, A-Y-B-C ili A-Y-C. U nekim otelotvorenjima, linker (region Y) je amino alkil, kao što je C2-C36 amino alkilna grupa, uključujući, na primer, C6 do C12 amino alkilne grupe. U poželjnom otelotvorenju, linker (region Y) je C6 amino alkilna grupa.
Kontrola
[0100] Terminom „kontrola“ kada se koristi u vezi sa merenjima efekta oligonukleotida generalno se podrazumeva da je kontrola netretirana pojedinačna ili ciljna ćelija ili pojedinačna ili ciljna ćelija tretirana neciljnim oligonukleotidom (lažni). Međutim, to može biti i osoba koja se leči uz standardnu negu.
Lečenje
[0101] Termin „lečenje“ koji se ovde koristi odnosi se i na lečenje postojeće bolesti (npr. bolesti ili poremećaja kako je ovde navedeno) ili na prevenciju bolesti, tj. profilaksu. Stoga će se priznati da lečenje navedeno u ovom dokumentu može, u nekim otelotvorenjima, biti profilaktičko.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
Meta
[0102] Jedan aspekt pronalaska je da moduliše nivo ekspresije proteina svinja, primata ili čoveka UBE3A, posebno da bi se povećala ekspresija očinskog UBE3A u neuronskim ćelijama, posebno u ljudskim neuronskim ćelijama. Humani protein UBE3A postoji u nekoliko izoformi koje su navedene pod Uniprot nr. Q05086. Nekoliko mutacija u majčinom UBE3A genu može rezultirati Angelmanovim sindromom.
[0103] Ciljna nukleinska kiselina za oligonukleotide pronalaska je RNK, posebno dugačka nekodirajuća RNK. Duga nekodirajuća RNK koja je na meti oligonukleotida ovog pronalaska je humani SNHG14 (takođe poznat kao UBE3A-ATS sa unosnim brojem ENSG00000224078, verzija GRCh38.p2). Konkretno, ciljna nukleinska kiselina je region nizvodno od SNORD109B koji odgovara poziciji 25278410 do 25419462 na hromozomu 15 (SEQ ID NO: 1). Kod rezus majmuna (Macaca mulatta) UBE3A supresor je definisan kao region nizvodno od SNORD109A koji odgovara poziciji 4222848 do 4373084 (prednji lanac) na hromozomu 7 korišćenjem Ensembl assembly MMUL 1.0 (SEQ ID NO: 2).
[0104] U nekim otelotvorenjima, ciljna nukleinska kiselina je SEQ ID NO: 1, ili njene prirodne varijante.
[0105] U određenim otelotvorenjima ciljna nukleinska kiselina odgovara regionima koji su konzervirani između čoveka (SEQ ID NO: 1) i rezus majmuna (SEQ ID NO: 2). U određenim otelotvorenjima ciljna nukleinska kiselina odgovara regionima koji su konzervirani između čoveka (SEQ ID NO:1), rezus majmuna (SEQ ID NO: 2) i miša (SEQ ID NO: 3).
[0106] U određenim otelotvorenjima ciljna nukleinska kiselina je region koji je antisens za UBE3A pre-mRNK, ovaj region odgovara poziciji 55319 do 141053 SEQ ID NO: 1.
[0107] U određenim otelotvorenjima ciljna nukleinska kiselina je region koji je nizvodno od SNORD109B i uzvodno od regiona koji je antisens za UBE3A pre-mRNK, ovaj region odgovara poziciji 1 do 55319 SEQ ID NO: 1.
2
[0108] U nekim otelotvorenjima, ciljna nukleinska kiselina je prisutna u ćeliji, kao što je ćelija sisara, posebno ljudska ćelija in vitro ili in vivo (ciljna ćelija). U određenim otelotvorenjima ciljna ćelija je neuron, po mogućnosti ljudska neuronska ćelija.
[0109] Ciljna sekvenca može biti podsekvenca ciljne nukleinske kiseline. U nekim otelotvorenjima oligonukleotid cilja podsekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od antisens regiona egzona 9, egzona 10, egzona 13, egzona 14, introna 14, egzona 15, introna15 i egzona 16 UBE3A. U nekim otelotvorenjima oligonukleotidna ili kontinuirana nukleotidna sekvenca hibridizuje ili je komplementarna sa molekulom jednolančane nukleinske kiseline, izabranim iz grupe koja se sastoji od pozicija: 55319-76274, 77483-77573, 92157-93403 i 97056-97354 SEQ ID NO: 1. U nekim otelotvorenjima oligonukleotidna ili kontinuirana nukleotidna sekvenca hibridizuje ili je komplementarna sa molekulom jednolančane nukleinske kiseline, izabranim iz grupe koja se sastoji od pozicija: 60821-60849, 77567-77583, 92323-92339 i 97156-97172 SEQ ID NO: 1.
[0110] U nekim otelotvorenjima ciljna nukleinska kiselina je region koji odgovara pozicijama 9200-9250 SEQ ID NO: 1.
[0111] U nekim otelotvorenjima ciljna nukleinska kiselina je region koji odgovara pozicijama 11505-11555 SEQ ID NO: 1.
[0112] U nekim otelotvorenjima ciljna nukleinska kiselina je region koji odgovara pozicijama 15100-15150 SEQ ID NO: 1.
[0113] U nekim otelotvorenjima ciljna nukleinska kiselina je region koji odgovara pozicijama 30590-30740 SEQ ID NO: 1.
[0114] U nekim otelotvorenjima ciljna nukleinska kiselina je region koji odgovara pozicijama 46380-46430 SEQ ID NO: 1.
Oligonukleotidi pronalaska
[0115] Pronalazak se odnosi na oligonukleotide sposobne da moduliraju ekspresiju očinskog UBE3A, posebno indukciju ili pozitivnu regulaciju očinskog eksprimiranog UBE3A u neuronskim ćelijama. Modulacija se postiže hibridizacijom sa ciljnom nukleinskom
2
kiselinom koja se nalazi na dugom transkriptu nekodirajuće RNK SNHG14 nizvodno od SNORD109B. U određenim otelotvorenjima oligonukleotid pronalaska se hibridizuje sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline SEQ ID NO: 1 sa ΔG° ispod -10 kcal, kao što je sa ΔG° između -10 do -60 kcal, kao što je -12 do -40, kao što je od -15 do -30 kcal ili -16 do -27 kcal kao što je -18 do -25 kcal.
[0116] Oligonukleotid pronalaska je antisens oligonukleotid koji cilja transkript SNHG14 svinje, rezus majmuna i/ili čoveka nizvodno od SNORD109B.
[0117] U nekim otelotvorenjima antisens oligonukleotid pronalaska je sposoban da modulira ekspresiju mete uklanjanjem, ometanjem ili smanjenjem supresora mete. Poželjno, oligonukleotidi pronalaska indukuju ekspresiju UBE3A u ćeliji, posebno očinsku ekspresiju UBE3A u neuronu, degradacijom ili uklanjanjem transkripta SNHG14 nizvodno od SNORD109B. U nekim otelotvorenjima oligonukleotidi pronalska mogu da povećaju ekspresiju UBE3A za najmanje 20% u poređenju sa nivoom ekspresije UBE3A u neuronskoj ćeliji tretiranoj fiziološkim rastvorom ili neciljanim oligonukleotidom, poželjnije za najmanje 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 80%, 100%, 120%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 210%, 220%, 230%, 240% ili 250% u poređenju sa nivoom ekspresije UBE3A u neuronskoj ćeliji tretiranoj fiziološkim rastvorom ili neciljanim oligonukleotidom. U dodatnim otelotvorenjima, oligonukleotidi pronalaska mogu da smanje nivo SNHG14 transkripta nizvodno od SNORD109B (posebno deo transkripta koji je antisens prema UBE3A pre-mRNK regionu) za najmanje 20% u poređenju sa nivoom SNHG14 transkripta nizvodno od SNORD109B u neuronskoj ćeliji tretiranoj fiziološkim rastvorom ili neciljnim oligonukleotidom, poželjnije za najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% u poređenju sa nivoom SNHG14 transkripta nizvodno od SNORD109B u neuronskoj ćeliji tretiranoj fiziološkim rastvorom ili neciljnim oligonukleotidom, bez smanjenja nivoa SNORD115 za više od 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25% ili 30% u poređenju sa nivoom SNORD115 u ćeliji tretiranoj sa fiziološkim rastvorom ili neciljajućim oligonukleotidom. SNRPN i SNORD116 transkripti se nalaze uzvodno od SNORD115 transkripta, shodno tome, ako SNORD115 transkript nije redukovan oligonukleotidom, velika je verovatnoća da SNRPN i SNORD116 transkripti takođe nisu redukovani. U daljem otelotvorenju, nivoi SNRPN i SNORD116 transkripata se ne smanjuju za više od 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%,
2
25% ili 30% u poređenju sa nivoom SNRPN i SNORD116 u ćeliji tretiranoj fiziološkim rastvorom ili neciljnim oligonukleotidom.
[0118] Ciljna modulacija se pokreće hibridizacijom između kontinuirane nukleotidne sekvence oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline. U nekim otelotvorenjima oligonukleotid pronalaska sadrži neusklađenosti između oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline. Uprkos neusklađenosti, hibridizacija sa ciljnom nukleinskom kiselinom i dalje može biti dovoljna da pokaže željenu modulaciju ekspresije UBE3A. Smanjeni afinitet vezivanja koji proizilazi iz neusklađenosti može se povoljno kompenzovati povećanim brojem nukleotida u oligonukleotidu i/ili povećanim brojem modifikovanih nukleozida koji mogu da povećaju afinitet vezivanja za metu, kao što su 2' modifikovani nukleozidi, uključujući LNK, prisutni u sekvenci oligonukleotida.
[0119] Jedan aspekt ovog pronalaska odnosi se na antisens oligonukleotid koji se sastoji od kontinuirane nukleotidne sekvence dužine od 10 do 30 nukleotida sa najmanje 98%, kao što je 100% komplementarnost sa pozicijom 25278410 do 25419462 na ljudskom hromozomu 15.
[0120] U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid sadrži kontinuiranu sekvencu koja je najmanje 98%, ili 100% komplementarna sa regionom ciljne nukleinske kiseline prikazane kao SEQ ID NO: 1, 2 ili 3.
[0121] U poželjnom otelotvorenju, oligonukleotid pronalaska, ili njegova kontinuirana nukleotidna sekvenca je potpuno komplementarna (100% komplementarna) sa regionom ciljne nukleinske kiseline prikazane kao SEQ ID NO: 1, ili u nekim otelotvorenjima može da sadrži jednu ili dve neusklađenosti između oligonukleotida i ciljne nukleinske kiseline.
[0122] U nekim otelotvorenjima, oligonukleotidna sekvenca je 100% komplementarna sa odgovarajućim ciljnim regionom nukleinske kiseline prisutnom u SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2. U nekim otelotvorenjima, oligonukleotidna sekvenca je 100% komplementarna sa odgovarajućim ciljnim regionom nukleinske kiseline prisutnom u SEQ ID NO: 1, 2 i 3.
[0123] U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid sadrži kontinuiranu nukleotidnu sekvencu dužine od 10 do 30 nukleotida sa najmanje 90% komplementarnih, kao što je 100%
2
komplementarnost, sa odgovarajućim ciljnim regionom nukleinske kiseline prisutnim u SEQ ID NO: 1, pri čemu je ciljni region nukleinske kiseline izabran iz grupe koja se sastoji od regiona A1 do A3649 u Tabeli 1
Tabela 1: Regioni SEQ ID NO 1 koji mogu biti ciljani korišćenjem oligonukleotida pronalaska
2
1
2
4
4
4
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
[0124] U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid sadrži kontinuiranu nukleotidnu sekvencu dužine od 10 do 30 nukleotida sa najmanje 90% komplementarnosti, kao što je 100% komplementarnosti, sa odgovarajućim ciljnim regionom nukleinske kiseline koji je prisutan u SEQ ID NO: 1., pri čemu je ciljni region nukleinske kiseline izabran iz grupe koju čine region B1 do B400 u tabeli 2.
Tabela 2: Regioni SEQ ID NO: 1 koji mogu biti ciljani korišćenjem oligonukleotida iz pronalaska
[0125] U određenim otelotvorenjima oligonukleotidna ili kontinuirana nukleotidna sekvenca je komplementarna sa regionom (ili podsekvencom)(ili podsekvencom) ciljne nukleinske kiseline, pri čemu je ciljni region nukleinske kiseline izabran iz grupe koja se sastoji od pozicije 1589-10889, 46089-53989 i 60789-62489 SEQ ID NO: 1.
1
[0126] U jednom otelotvorenju, oligonukleotid se sastoji od kontinuirane nukleotidne sekvence dužine od 10 do 30 nukleotida najmanje 90%, kao što je 100% komplementarna sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline pozicije 55319 do 141053 SEQ ID NO: 1.
[0127] U jednom otelotvorenju, oligonukleotid se sastoji od kontinuirane nukleotidne sekvence dužine od 10 do 30 nukleotida najmanje 90%, kao što je 100% komplementarna sa ciljnom sekvencom nukleinske kiseline pozicije 1 do 55318 SEQ ID NO: 1.
[0128] U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid se sastoji od kontinuirane nukleotidne sekvence dužine od 10 do 30 nukleotida najmanje 90% komplementarna sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline izabrane iz grupe koja odgovara pozicijama : 55319-76274, 77483-77573, 92157-93403 i 97056-97354 SEQ ID NO: 1.
[0129] U nekim otelotvorenjima oligonukleotid je kontinuirana nukleotidna sekvenca dužine od 10 do 30 nukleotida najmanje 90% komplementarna sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline izabrane iz grupe koja odgovara pozicijama: 60821-60849, 77567-77583, 92323-92339 i 97156-97172 SEQ ID NO: 1.
[0130] U nekim otelotvorenjima oligonukleotid je kontinuirana nukleotidna sekvenca dužine od 10 do 30 nukleotida najmanje 90% komplementarna sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline koja odgovara pozicijama: 5218-5240 SEQ ID NO: 1.
[0131] U nekim otelotvorenjima oligonukleotid je kontinuirana nukleotidna sekvenca dužine od 10 do 30 nukleotida najmanje 90% komplementarna sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline koja odgovara pozicijama: 5782-5803 SEQ ID NO: 1.
[0132] U nekim otelotvorenjima oligonukleotid je kontinuirana nukleotidna sekvenca dužine od 10 do 30 nukleotida najmanje 90% komplementarna sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline koja odgovara pozicijama: 8113-8139 SEQ ID NO: 1.
[0133] U nekim otelotvorenjima oligonukleotid je kontinuirana nukleotidna sekvenca dužine od 10 do 30 nukleotida najmanje 90% komplementarna sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline koja odgovara pozicijama: 9200-9250 SEQ ID NO: 1.
2
[0134] U nekim otelotvorenjima oligonukleotid je kontinuirana nukleotidna sekvenca dužine od 10 do 30 nukleotida najmanje 90% komplementarna sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline koja odgovara pozicijama: 11505-11555 SEQ ID NO: 1.
[0135] U nekim otelotvorenjima oligonukleotid je kontinuirana nukleotidna sekvenca dužine od 10 do 30 nukleotida najmanje 90% komplementarna sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline koja odgovara pozicijama: 13223-13242 SEQ ID NO: 1.
[0136] U nekim otelotvorenjima oligonukleotid je kontinuirana nukleotidna sekvenca dužine od 10 do 30 nukleotida najmanje 90% komplementarna sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline koja odgovara pozicijama: 15100-15150 SEQ ID NO: 1.
[0137] U nekim otelotvorenjima oligonukleotid je kontinuirana nukleotidna sekvenca dužine od 10 do 30 nukleotida najmanje 90% komplementarna sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline koja odgovara pozicijama: 15113-15180 SEQ ID NO: 1.
[0138] U nekim otelotvorenjima oligonukleotid je kontinuirana nukleotidna sekvenca dužine od 10 do 30 nukleotida najmanje 90% komplementarna sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline koja odgovara pozicijama: 29635-29705 SEQ ID NO: 1.
[0139] U nekim otelotvorenjima oligonukleotid je kontinuirana nukleotidna sekvenca dužine od 10 do 30 nukleotida najmanje 90% komplementarna sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline koja odgovara pozicijama: 30590-30740 SEQ ID NO: 1.
[0140] U nekim otelotvorenjima oligonukleotid je kontinuirana nukleotidna sekvenca dužine od 10 do 30 nukleotida najmanje 90% komplementarna sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline koja odgovara pozicijama: 39800-39855 SEQ ID NO: 1.
[0141] U nekim otelotvorenjima oligonukleotid je kontinuirana nukleotidna sekvenca dužine od 10 do 30 nukleotida najmanje 90% komplementarna sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline koja odgovara pozicijama: 44435-44460 SEQ ID NO: 1.
[0142] U nekim otelotvorenjima oligonukleotid je kontinuirana nukleotidna sekvenca dužine od 10 do 30 nukleotida najmanje 90% komplementarna sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline koja odgovara pozicijama: 45245-45270 SEQ ID NO: 1.
[0143] U nekim otelotvorenjima oligonukleotid je kontinuirana nukleotidna sekvenca dužine od 10 do 30 nukleotida najmanje 90% komplementarna sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline koja odgovara pozicijama: 46380-46430 SEQ ID NO: 1.
[0144] U nekim otelotvorenjima oligonukleotid je kontinuirana nukleotidna sekvenca dužine od 10 do 30 nukleotida najmanje 90% komplementarna sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline koja odgovara pozicijama: 68915-68940 SEQ ID NO: 1.
[0145] U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid sadrži ili se sastoji od 8 do 35 nukleotida dužine, kao što je od 10 do 30, kao što je od 11 do 22, kao što je od 12 do 18, kao što je od 13 do 17 ili od 14 do 16 susednih nukleotida dužine. U poželjnom otelotvorenju, oligonukleotid se sastoji ili sadrži od 15 do 20 nukleotida u dužini.
[0146] U nekim otelotvorenjima, oligonukleotidna ili kontinuirana nukleotidna sekvenca sadrži ili se sastoji od 22 ili manje nukleotida, kao što je 20 ili manje nukleotida, kao što je 18 ili manje nukleotida, kao što su 14, 15, 16 ili 17 nukleotida. Podrazumeva se da bilo koji opseg dat ovde uključuje krajnje tačke opsega. Shodno tome, ako se kaže da oligonukleotid uključuje od 10 do 30 nukleotida, uključeni su i 10 i 30 nukleotida.
[0147] U nekim otelotvorenjima, kontinuirana nukleotidna sekvenca sadrži ili se sastoji od 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 kontinuiranih nukleotida u dužini. U poželjnom otelotvorenju, oligonukleotid sadrži ili se sastoji od 16, 17, 18 ili 19 nukleotida u dužini.
[0148] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotidna ili kontinuirana nukleotidna sekvenca sadrži ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida u dužini sa najmanje 90% identičnosti, poželjno 100% identičnosti sa sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4 do 150 (vidi sekvence motiva navedene u Tabeli 3 u odeljku Primeri).
4
[0149] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotidna ili kontinuirana nukleotidna sekvenca sadrži ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida u dužini sa najmanje 90% identičnosti, poželjno 100% identičnosti sa sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4 do 818 (vidi sekvence motiva navedene u Tabeli 3 u odeljku Primeri).
[0150] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotidna ili kontinuirana nukleotidna sekvenca sadrži ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida u dužini sa najmanje 90% identičnosti, poželjno 100% identičnosti sa sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4 do 678 (vidi sekvence motiva navedene u Tabeli 3 u odeljku Primeri).
[0151] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotidna ili kontinuirana nukleotidna sekvenca sadrži ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida u dužini sa najmanje 90% identičnosti, poželjno 100% identičnosti sa sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 166, 167, 167 ili 169 (vidi sekvence motiva navedene u Tabeli 3 u odeljku Primeri).
[0152] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotidna ili kontinuirana nukleotidna sekvenca sadrži ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida u dužini sa najmanje 90% identičnosti, poželjno 100% identičnosti sa sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 570, 571, 572, 679, 680, 681, 682 i 683 (vidi sekvence motiva navedene u Tabeli 3 u odeljku Primeri).
[0153] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotid ili kontinuirana nukleotidna sekvenca sadrži ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida u dužini sa najmanje 90% identičnosti, poželjno 100% identičnosti sa sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 34, 186, 187, 188, 573, 574, 575, 576, 572, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 963, 964, 965 i 696 (vidi sekvence motiva navedene u Tabeli 3 u odeljku Primeri).
[0154] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotid ili kontinuirana nukleotidna sekvenca sadrži ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida dužine sa najmanje 90% identičnosti, poželjno 100% identičnosti sa sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 35, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 209 i 210 ili SEQ ID NO: 582, 583 i 584 (vidi sekvence motiva navedene u Tabeli 3 u odeljku Primeri).
[0155] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotid ili kontinuirana nukleotidna sekvenca sadrži ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida u dužini sa najmanje 90% identičnosti, poželjno 100% identičnosti sa sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 221, 222, 223, 224, 225, 585, 586, 587, 588, 589, 698, 699,700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717 i 718 (vidi sekvence motiva navedene u Tabeli 3 u odeljku primeri).
[0156] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotid ili kontinuirana nukleotidna sekvenca sadrži ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida u dužini sa najmanje 90% identičnosti, poželjno 100% identičnosti sa sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 236, 237, 238, 239, 240 i 590.
[0157] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotid ili kontinuirana nukleotidna sekvenca sadrži ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida u dužini sa najmanje 90% identičnosti, poželjno 100% identičnosti sa sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 241, 591 i 719 (vidi sekvence motiva navedene u Tabeli 3 u odeljku Primeri).
[0158] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotid ili kontinuirana nukleotidna sekvenca sadrži ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida u dužini sa najmanje 90% identičnosti, poželjno 100% identičnosti sa sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 46, 47, 48, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 734, 735, 736, 737, 738, 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761, 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784, 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 800, 800, 800, 800, 801, 801, 802, 803, 804, 805, 806 i 807 (vidi sekvence motiva navedene u Tabeli 3 u odeljku Primeri).
[0159] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotid ili kontinuirana nukleotidna sekvenca sadrži ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida u dužini sa najmanje 90% identičnosti, poželjno 100% identičnosti sa sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 331, 332, 638, 639, 640, 808, 809, 810, 811, 812, 813, 814 i 815 (vidi sekvence motiva navedene u Tabeli 3 u odeljku Primeri).
[0160] U nekim otelotvorenjima, antisens oligonukleotid ili kontinuirana nukleotidna sekvenca sadrži ili se sastoji od 10 do 30 nukleotida u dužini sa najmanje 90% identičnosti, poželjno 100% identičnosti sa sekvencom izabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 409, 410, 411, 642, 643, 644, 645, 646, 816, 818 i 818 (vidi sekvence motiva navedene u Tabeli 3 u odeljku Primeri).
[0161] Podrazumeva se da se kontinuirane nukleobazne sekvence (sekvence motiva) mogu modifikovati tako da, na primer, povećaju otpornost na nukleazu i/ili afinitet vezivanja za ciljnu nukleinsku kiselinu. Izmene su opisane u definicijama i u odeljku „Dizajn oligonukleotida“. U Tabeli 3 navedeni su poželjni dizajni svake sekvence motiva.
Dizajn oligonukleotida
[0162] Dizajn oligonukleotida se odnosi na šemu modifikacija nukleozidnog šećera u oligonukleotidnoj sekvenci. Oligonukleotidi pronalaska obuhvataju šećerno modifikovane nukleozide i takođe mogu da obuhvataju nukleozide DNK ili RNK. U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid se sastoji od šećerno modifikovanih nukleozida i nukleozida DNK.
Uključivanje modifikovanih nukleozida u oligonukleotid pronalaska može povećati afinitet oligonukleotida za ciljnu nukleinsku kiselinu. U tom slučaju, modifikovani nukleozidi se mogu nazvati modifikovanim nukleotidima koji poboljšavaju afinitet.
[0163] U jednom otelotvorenju, oligonukleotid se sastoji od najmanje 1 modifikovanog nukleozida, kao što su najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 11, najmanje 12, najmanje 13, najmanje 14, najmanje 15 ili najmanje 16 modifikovanih nukleozida. U jednom otelotvorenju, oligonukleotid se sastoji od 1 do 10 modifikovanih nukleozida, kao što je od 2 do 9 modifikovanih nukleozida, kao što je od 3 do 8 modifikovanih nukleozida, kao što je od 4 do 7 modifikovanih nukleozida, kao što je 6 ili 7 modifikovanih nukleozida. U nekim otelotvorenjima, najmanje 1 od modifikovanih nukleozida je zaključana nukleinska kiselina (LNK), kao što su najmanje 2, kao što su najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7 ili najmanje 8 modifikovanih nukleozida su LNK. U još daljem otelotvorenju svi modifikovani nukleozidi su LNK.
[0164] U jednom otelotvorenju, oligonukleotid pronalaska može da sadrži modifikacije, koje se nezavisno biraju između ove tri vrste modifikacija (modifikovani šećer, modifikovana nukleobaza i modifikovana internukleozidna veza) ili njihove kombinacije. Poželjno je da oligonukleotid sadrži jedan ili više šećerno modifikovanih nukleozida, kao što su 2' šećerno modifikovani nukleozidi. Poželjno je da oligonukleotid pronalaska sadrži jedan ili više 2' šećerno modifikovanih nukleozida nezavisno izabranih iz grupe koja se sastoji od 2'-O-alkil-RNK, 2'-O-metil-RNK, 2'-alkoksi-RNK, 2'-O-metoksietil-RNK, 2'-amino-DNK, 2'-fluoro-DNK, arabino nukleinske kiseline (ANK), 2'-fluoro-ANK i LNK nukleozida. Još poželjnije, jedan ili više modifikovanih nukleozida je LNK.
[0165] U daljem otelotvorenju, oligonukleotid se sastoji od najmanje jedne modifikovane internukleozidne veze. U poželjnom otelotvorenju, internukleozidne veze unutar kontinuirane nukleotidne sekvence su fosforotioatne ili boranofosfatne internukleozidne veze.
[0166] U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid pronalaska sadrži najmanje jedan modifikovani nukleozid koji je 2'-MOE-RNK, kao što su 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 102'-MOE-RNK nukleozidnih jedinica. U nekim otelotvorenjima, najmanje jedan od navedenih modifikovanih nukleozida je 2'-fluoro DNK, kao što su 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 102'-fluoro-DNK nukleozidne jedinice.
[0167] U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid pronalaska sadrži najmanje jednu LNK jedinicu, kao što su 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 LNK jedinica, kao što su od 2 do 6 LNK jedinica, kao što su od 3 do 7 LNK jedinica, 4 do 8 LNK jedinica ili 3, 4, 5, 6 ili 7 LNKA jedinica. U nekim otelotvorenjima, svi modifikovani nukleozidi su LNK nukleozidi. U daljem otelotvorenju, oligonukleotid može da sadrži i beta-D-oksi-LNK i jednu ili više sledećih LNK jedinica: tio-LNK, amino-LNK, oksi-LNK i/ili ENK u beta-D ili alfa-L konfiguracijama ili njihovim kombinacijama. U daljem otelotvorenju, sve LNK citozinske jedinice su 5-metilcitozin. U poželjnom otelotvorenju, oligonukleotidna ili kontinuirana nukleotidna sekvenca ima najmanje 1 LNK jedinicu na 5' kraju i najmanje 2 LNK jedinice na 3' kraju nukleotidne sekvence.
[0168] U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid pronalaska se sastoji od najmanje jedne LNK jedinice i najmanje jednog 2' supstituisanog modifikovanog nukleozida.
[0169] U nekim otelotvorenjima pronalaska, oligonukleotid obuhvata i 2' šećerno modifikovane nukleozide i DNK jedinice. Poželjno je da oligonukleotid obuhvata i LNK i DNK jedinice.
[0170] Poželjno, kombinovani ukupan broj LNK i DNK jedinica je 8-30, kao što je 10-25, poželjno 12-22, kao što je 12-18, još poželjnije 11-16. U nekim otelotvorenjima pronalaska, nukleotidna sekvenca oligonukleotida, kao što je kontinuirana nukleotidna sekvenca, sastoji se od najmanje jedne ili dve LNK jedinice, a preostale nukleotidne jedinice su DNK jedinice. U nekim otelotvorenjima oligonukleotid se sastoji samo od LNK nukleozida i prirodnih nukleozida (kao što su RNK ili DNK, najpoželjnije DNK nukleozidi), opciono sa modifikovanim internukleozidnim vezama kao što je fosforotioat.
[0171] U otelotvorenju pronalaska oligonukleotid pronalaska je sposoban da regrutuje RNazu H.
Dizajn Gapmer-a
[0172] U poželjnom otelotvorenju, oligonukleotid pronalaska ima dizajn ili strukturu gapmera koji se ovde takođe naziva samo "Gapmer". U gapmer strukturi, oligonukleotid sadrži najmanje tri različita strukturna regiona 5'-bok, gap (prazninu) i 3' -bok, F-G-F ' u orijentaciji 5' -> 3'. U ovom dizajnu, bočni regioni F i F' (takođe nazvani krilni regioni) obuhvataju kontinuirani modifikovanih nukleozida, koji su komplementarni sa ciljnom nukleinskom kiselinom UBE3A, dok gap region, G, obuhvata kontinuirani deo nukleotida koji su sposobni da regrutuju nukleazu, poželjno endonukleazu kao što je RNaza, na primer RNaza H, kada je oligonukleotid u dupleksu sa ciljnom nukleinskom kiselinom. Nukleozidi koji su sposobni da regrutuju nukleazu, posebno RNaza H, mogu se izabrati iz grupe koja se sastoji od DNK, alfa-L-oksi-LNK, 2'-Flouro-ANK i UNK. Regioni F i F', koji okružuju 5' i 3' krajeve regiona G, poželjno obuhvataju nukleozide za regrutovanje ne-nukleaze (nukleozide sa 3' endo strukturom), poželjno jedan ili više modifikovanih nukleozida koji poboljšavaju afinitet. U nekim otelotvorenjima, 3' bok sadrži najmanje jedan LNK nukleozid, poželjno najmanje 2 LNK nukleozida. U nekim otelotvorenjima, 5' bok sadrži najmanje jedan LNK nukleozid. U nekim otelotvorenjima, i 5' i 3' bočni regioni obuhvataju LNK nukleozid. U nekim otelotvorenjima svi nukleozidi u bočnim regionima su LNK nukleozidi. U drugim otelotvorenjima, bočni regioni mogu da obuhvataju i LNK nukleozide i druge nukleozide (mešoviti bokovi), kao što su DNK nukleozidi i/ili ne-LNK modifikovani nukleozidi, kao što su 2' supstituisani nukleozidi. U ovom slučaju gap je definisan kao kontinuirana sekvenca od najmanje 5 regrutnih nukleozida RNaze H (nukleozida sa 2' endo strukturom, poželjno DNK) okruženih na 5' i 3' kraju modifikovanim nukleozidom koji poboljšava afinitet, poželjno LNK, kao što je beta-D-oksi-LNK. Shodno tome, nukleozidi 5' bočnog regiona i 3' bočnog regiona koji su susedni gap regionu su modifikovani nukleozidi, poželjno nukleozidi koji regrutuju ne-nukleaze. U oligonukleotidima sa mešovitim bokovima gde bokovi obuhvataju DNK, 5' i 3' nukleozidi su modifikovani nukleozidi.
Region F
[0173] Region F (5' bok ili 5' krilo) pričvršćen na '5 kraj regiona G obuhvata, sadrži ili se sastoji od najmanje jednog modifikovanog nukleozida kao što je najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7 modifikovanih nukleozida. U jednom otelotvorenju region F obuhvata ili se sastoji od 1 do 7 modifikovanih nukleozida, kao što su od 2 do 6 modifikovanih nukleozida, kao što su od 2 do 5 modifikovanih nukleozida, kao što su od 2 do 4 modifikovana nukleozida, kao što su od 1 do 3 modifikovana nukleozida, kao što su 1, 2, 3 ili 4 modifikovana nukleozida. U daljem otelotvorenju, dodatni nukleozidi mogu biti vezani za '5 kraj regiona F, što predstavlja region D koji se poželjno sastoji od 1, 2 ili 3 nukleozidne jedinice, kao što su nukleozidi DNK. Region D može da preuzme funkciju biorazgradivog (B) linkera opisanog u definiciji „Linkeri “.
[0174] U nekim otelotvorenjima, modifikovani nukleozidi u regionu F imaju 3' endo strukturu.
[0175] U jednom otelotvorenju, jedan ili više modifikovanih nukleozida u regionu F su 2' modifikovani nukleozidi.
[0176] U daljem otelotvorenju, jedan ili više 2' modifikovanih nukleozida u regionu F izabrani su između 2'-O-alkil-RNK jedinica, 2'-O-metil-RNK, 2'-amino-DNK jedinica, 2'-fluoro-DNK jedinica, 2'-alkoksi-RNK, MOE jedinica, LNK jedinica, arabino nukleinskih kiselina (ANK) i 2'-fluoro-ANK jedinica.
[0177] U jednom otelotvorenju pronalaska svi modifikovani nukleozidi u regionu F su LNK nukleozidi. U daljem otelotvorenju, LNK nukleozidi u regionu F su nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od oksi-LNK, tio-LNK, amino-LNK, cET i/ili ENA, bilo u beta-D ili alfa-L konfiguracijama ili njihovim kombinacijama. U poželjnom otelotvorenju region F ima najmanje 1 beta-D-oksi LNK jedinicu, na 5' kraju kontinuirane sekvence.
Region G
[0178] Region G (gap region) poželjno obuhvata, sadrži ili se sastoji od najmanje 4, kao što je najmanje 5, kao što je najmanje 6, najmanje 7, najmanje 8, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 11, najmanje 12, najmanje 13, najmanje 14, najmanje 15 ili najmanje 16 uzastopnih nukleozida koji mogu da regrutuju gorenavedene nukleaze, posebno RNazeH. U daljem otelotvorenju, region G obuhvata, sadrži ili se sastoji od 5 do 12, ili od 6 do 10 ili od 7 do 9, kao što je 8 uzastopnih nukleotidnih jedinica sposobnih za regrutovanje gore pomenute nukleaze.
[0179] Nukleozidne jedinice u regionu G, koje su sposobne za regrutovanje nukleaze, nalaze se u otelotvorenju izabranom iz grupe koja se sastoji od DNK, alfa-L-LNK, C4' alkilovane DNK (kao što je opisano u PCT/EP2009/050349 i Vester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett.18 (2008) 2296 - 2300), nukleozidi izvedeni iz arabinoze kao što su ANK i 2'F-ANK (Mangos et al. 2003 J. AM. Chem. Soc.125, 654-661), UNK (otključana nukleinska kiselina) (kao što je opisano u Fluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039). UNK je otključana nukleinska kiselina, obično tamo gde je uklonjena veza riboze između C2 i C3, formirajući otključani "šećerni" ostatak.
[0180] U još jednom otelotvorenju, najmanje jedna nukleozidna jedinica u regionu G je nukleozidna jedinica DNK, kao što je od 1 do 16 DNK jedinica, kao što su 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 DNK jedinica, poželjno od 2 do 13 DNK jedinica, kao što je od 4 do 12 DNK jedinica, poželjno od 5 do 11, ili od 10 do 16, 11 do 15 ili 12 do 14 DNK jedinica. U nekim otelotvorenjima, region G se sastoji 100% od DNK jedinica. U poželjnom otelotvorenju G se sastoji od, najpoželjnije 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 DNK jedinica.
[0181] U daljim otelotvorenjima, region G može se sastojati od mešavine DNK i drugih nukleozida koji mogu da posreduju u cepanju RNaze H. Region G se može sastojati od najmanje 50% DNK, poželjnije 60%, 70% ili 80% DNK, a još poželjnije 90% ili 95% DNK.
1
[0182] U još jednom otelotvorenju, najmanje jedna nukleozidna jedinica u regionu G je alfa-L-LNK nukleozidna jedinica, kao što je najmanje jedna alfa-L-LNK jedinica, kao što su 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ili 9 alfa-L-LNK jedinica. U daljem otelotvorenju, region G obuhvata najmanje jednu alfa-L-LNK koja je alfa-L-oksi-LNK jedinica. U daljem otelotvorenju, region G obuhvata kombinaciju DNK i alfa-L-LNK nukleozidnih jedinica.
[0183] U nekim otelotvorenjima veličina kontinuirane sekvence u regionu G može biti duža, kao što su 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 nukleozidnih jedinica.
[0184] U nekim otelotvorenjima, nukleozidi u regionu G imaju 2' endo strukturu.
Region F'
[0185] Region F' (5' bok ili 5' krilo) pričvršćen na '3 kraj regiona G obuhvata, sadrži ili se sastoji od najmanje jednog modifikovanog nukleozida kao što je najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7 modifikovanih nukleozida. U jednom otelotvorenju region F' obuhvataju ili se sastoje od 1 do 7 modifikovanih nukleozida, kao što su od 2 do 6 modifikovanih nukleozida, kao što su od 2 do 4 modifikovana nukleozida, kao što su od 1 do 3 modifikovana nukleozida, kao što su 1, 2, 3 ili 4 modifikovana nukleozida. U daljem otelotvorenju, dodatni nukleozidi vezani za '3 kraj regiona F', što predstavlja region D' koji se poželjno sastoji od 1, 2 ili 3 nukleozidne jedinice, kao što su nukleozidi DNK. Region D' može da preuzme funkciju biorazgradivog (B) linkera opisanog u odeljku „Linkeri “.
[0186] U nekim otelotvorenjima, modifikovani nukleozidi u regionu F' imaju 3' endo strukturu.
[0187] U poželjnom otelotvorenju, modifikovani nukleozidi u regionu F' su LNK.
[0188] U daljem otelotvorenju, modifikovani nukleozidi u regionu F' izabrani su između 2' -O-alkil-RNK jedinica, 2'-O-metil-RNK, 2'-amino-DNK jedinica, 2'-fluoro-DNK jedinica, 2' -alkoksi-RNK, MOE jedinica, LNK jedinica, arabino nukleinska kiselina (ANK) i 2'-fluoro-ANK jedinica.
[0189] U jednom otelotvorenju pronalaska svi modifikovani nukleozidi u regionu F' su LNK nukleozidi. U daljem otelotvorenju, LNK nukleozidi u regionu F' su nezavisno izabrani iz
2
grupe koja se sastoji od oksi-LNK, tio-LNK, amino-LNK, cET i/ili ENK, bilo u beta-D ili alfa-L konfiguracijama ili njihovim kombinacijama. U poželjnom otelotvorenju region F' ima najmanje 2 beta-D-oksi LNK jedinice, na 3' kraju kontinuirane sekvence.
Regioni D i D'
[0190] Region D i D' mogu se prikačiti na 5' kraj regiona F, odnosno 3' kraj regiona F'.
[0191] Region D ili D' može nezavisno da sadrži 1, 2, 3, 4 ili 5 dodatnih nukleotida, koji mogu biti komplementarni ili nekomplementarni sa ciljnom nukleinskom kiselinom. U tom smislu, oligonukleotid pronalaska može u nekim otelotvorenjima da sadrži kontinuiranu nukleotidnu sekvencu sposobnu da modulira metu koja je okružena na 5' i/ili 3' kraju dodatnim nukleotidima. Takvi dodatni nukleotidi mogu poslužiti kao biocepivi linkeri osetljivi na nukleazu (videti definiciju linkera). U nekim otelotvorenjima, dodatni nukleotidi na 5' i/ili 3' kraju su povezani sa fosfodiestarskim vezama, a mogu biti DNK ili RNK. U drugom otelotvorenju, dodatni nukleotidi na 5' i/ili 3' kraju su modifikovani nukleotidi koji mogu, na primer, biti uključeni radi poboljšanja stabilnosti nukleaze ili radi lakše sinteze. U jednom otelotvorenju oligonukleotida iz pronalaska, on obuhvata region D i/ili D' pored kontinuirane nukleotidne sekvence.
[0192] Gapmer oligonukleotid ovog pronalaska može se predstaviti sledećim formulama: F-G-F'; posebno F1-7-G4-12-F'1-7
D-F-G-F', posebno D1-3-F1-7-G4-12-F'1-7
F-G-F'-D', posebno F1-7-G4-12-F'1-7-D'1-3
D-F-G-F'-D', posebno D1-3-F1-7-G4-12-F'1-7-D'1-3
[0193] Poželjni broj i vrste nukleozida u regionima F, G i F', D i D' su gore opisani. Dizajn pojedinačnog oligonukleotida takođe može imati dubok uticaj na svojstva oligonukleotida u njegovoj upotrebi za modulaciju ekspresije UBE3A.
[0194] U nekim otelotvorenjima oligonukleotid je gapmer koji se sastoji od 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 nukleotida u dužini, pri čemu se svaki od regiona F i F' nezavisno sastoji od 2, 3 ili 4 modifikovane nukleozidne jedinice komplementarne delu humane SNHG14 duge nekodirajuće RNK koja je antisens prema UBE3A pre-mRNK (ciljna nukleinska kiselina), a region G se sastoji od 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 nukleozidnih jedinica, sposobnih da regrutuju nukleaze kada su u dupleksu sa ciljnom nukleinskom kiselinom.
[0195] U daljim otelotvorenjima, oligonukleotid je gapmer, pri čemu se svaki od regiona F i F' nezavisno sastoji od 2, 3, 4 ili 5 modifikovanih nukleozidnih jedinica, kao što su nukleozidne jedinice koje sadrže 2'-O-metoksietil-ribozni šećer (2'-MOE) ili nukleozidne jedinice koje sadrže 2'-fluoro-deoksiribozni šećer i/ili LNK jedinice, a region G se sastoji od 9, 10, 11, 12,13, 14 ili 15 nukleozidnih jedinica, kao što su DNK jedinice ili drugi nukleozidi koji regrutuju nukleaze kao što je alfa-L-LNK ili mešavina DNK i nukleozida koji regrutuju nukleaze.
[0196] U daljem specifičnom otelotvorenju, oligonukleotid je gapmer, pri čemu se svaki od regiona F i F' sastoji od po dve LNK jedinice, a region G se sastoji od 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 nukleozidnih jedinica, poželjno DNK jedinica. Specifični projekti gapmera ove prirode uključuju 2-10-2, 2-11-2, 2-12-2, 2-13-2, 2-14-2 i 2-15-2.
[0197] U daljem specifičnom otelotvorenju, oligonukleotid je gapmer, pri čemu se svaki od regiona F i F' nezavisno sastoji od tri LNK jedinice, a region G se sastoji od 10, 11, 12,13, 14 ili 15 nukleozidnih jedinica, poželjno DNK jedinica. Specifični projekti gapmera ove vrste uključuju 3-10-3, 3-11-3, 3-12-3, 3-13-3, 3-14-3 i 3-15-3.
[0198] U daljem specifičnom otelotvorenju, oligonukleotid je gapmer, pri čemu se svaki od regiona F i F' sastoji od po četiri LNA jedinice, a region G se sastoji od 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 nukleozidnih jedinica, poželjno DNK jedinica. Specifični gapmer projekti ove vrste uključuju 4-10-4, 4-11-4, 4-12-4, 4-13-4, 4-14-4 i 4-15-4.
[0199] Specifični dizajni gapmera ove prirode uključuju F-G-F' dizajne izabrane iz grupe koja se sastoji od praznine sa 10 nukleozida i nezavisno 1 do 4 modifikovana nukleozida u krilima, uključujući 1-10-1, 2-10-1, 1-10-2, 1-10-3, 3-10-1, 1-10-4, 4-10-1, 2-10-2, 2-10-3, 3-10-2, 2-10-4, 4-10-2, 3-10-3, 3-10-4, 4-10-3 i 4-10-4 gapmere.
[0200] Specifični dizajni gapmera ove prirode uključuju F-G-F' dizajne izabrane iz grupe koja se sastoji od praznine sa 11 nukleozida i nezavisno 1 do 4 modifikovana nukleozida u
4
krilima, uključujući 1-11-1, 2-11-1, 1-11-2, 1-11-3, 3-11-1, 1-11-4, 4-11-1, 2-11-2, 2-11-3, 3-11-2, 2-11-4, 4-11-2, 3-11-3, 3-11-4, 4-11-3 i 4-11-4 gapmere.
[0201] Specifični dizajni gapmera ove prirode uključuju F-G-F ' dizajne izabrane iz grupe koja se sastoji od praznine sa 12 nukleozida, uključujući 1-12-1, 2-12-1, 1-12-2, 1-12-3, 3-12-1, 1-12-4, 4-12-1, 2-12-2, 2-12-3, 3-12-2, 2-12-4, 4-12-2, 3-12-3, 3-12-4, 4-12-3 i 4-12-4 gapmere.
[0202] Specifični dizajni gapmera ove prirode uključuju F-G-F ' dizajne izabrane iz grupe koja se sastoji od praznine sa 13 nukleozida i nezavisno 1 do 4 modifikovana nukleozida u krilima, uključujući 1-13-1, 1-13-2, 1-13-3, 3-13-1, 1-13-4, 4-13-1, 2-13-1, 2-13-2, 2-13-3, 3-13-2, 2-13-4, 4-13-2, 3-13-3, 3-13-4, 4-13-3 i 4-13-4 gapmere.
[0203] Specifični dizajni gapmera ove prirode uključuju F-G-F' dizajne izabrane iz grupe koja se sastoji od praznine sa 14 nukleozida i nezavisno od 1 do 4 modifikovana nukleozida u krilima, uključujući 1-14-1, 1-14-2, 2-14-1, 1-14-3, 3-14-1, 1-14-4, 4-14-1, 2-14-2, 2-14-3, 3-14-2 2-14-4, 4-14-2, 3-14-3, 3-14-4 i 4-14-3 gapmere.
[0204] Specifični dizajni gapmera ove prirode uključuju F-G-F' dizajne izabrane iz grupe koja se sastoji od praznine sa 15 nukleozida i nezavisno 1 do 4 modifikovana nukleozida u krilima, uključujući 1-15-1, 1-15-2, 2-15-1, 1-15-3, 3-15-1, 1-15-4, 4-15-1, 2-15-2, 2-15-3, 3-15-2 2-15-4, 4-15-2, 3-15-3, 3-15-4 i 4-15-3 gapmere.
[0205] Specifični dizajni gapmera ove prirode uključuju F-G-F' dizajne izabrane iz grupe koja se sastoji od praznine sa 16 nukleozida i nezavisno od 1 do 4 modifikovana nukleozida u krilima, uključujući 1-16-1, 1-16-2, 2-16-1, 1-15-3, 3-16-1, 1-16-4, 4-16-1, 2-16-2, 2-16-3, 3-16-2 2-16-4, 4-16-2, 3-16-3, 3-16-4 i 4-16-3 gapmere.
[0206] U nekim otelotvorenjima F-G-F' dizajn je izabran između 2-10-4, 3-10-3 i 4-10-2.
[0207] U nekim otelovljenjima F-G-F' dizajn je izabran između 2-11-4, 3-11-2, 3-11-3 i 4-11-2.
[0208] U nekim otelotvorenjima F-G-F' dizajn je izabran između 2-12-2, 2-12-3, 2-12-4, 3-12-2, 3-12-3 i 4-12-2.
[0209] U nekim otelotvorenjima F-G-F' dizajn je izabran između 2-13-2, 2-13-3, 2-13-4, 3-13-3 i 4-13-2.
[0210] U nekim otelotvorenjima F-G-F' dizajn je izabran između 2-14-2, 2-14-4, 3-14-3 i 4-14-2.
[0211] U nekim otelotvorenjima F-G-F' dizajn je izabran između 2-15-2 i 2-16-2.
[0212] U nekim otelotvorenjima F-G-F' dizajn je izabran iz dizajna navedenih u Tabeli 3.
[0213] U svim slučajevima F-G-F' dizajn može dalje uključivati region D i/ili D', koji može imati 1, 2 ili 3 nukleozidne jedinice, kao što su DNK jedinice. Poželjno, nukleozidi u regionu F i F' su modifikovani nukleozidi, dok su nukleotidi u regionu G poželjno nemodifikovani nukleozidi.
[0214] U svakom dizajnu, preferirani modifikovani nukleozid je LNK.
[0215] U drugom otelotvorenju, sve internukleozidne veze u praznini u gapmeru su fosforotioatne i/ili boranofosfatne veze. U drugom otelotvorenju, sve internukleozidne veze u bokovima (F i F' region) u gapmeru su fosforotioatne i/ili boranofosfatne veze. U drugom poželjnom otelotvorenju, sve internukleozidne veze u D i D' regionu u gapmeru su fosfodiestarske veze.
[0216] Za specifične gapmere kao što je ovde obelodanjeno, kada su ostaci citozina (C) označeni kao 5-metil-citozin, u različitim otelotvorenjima, jedan ili više C prisutnih u oligonukleotidu mogu biti nemodifikovani C ostaci.
[0217] Dalji dizajni gapmera obelodanjeni su u WO2004/046160 i WO2007/146511.
[0218] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid se bira iz grupe oligonukleotidnih jedinjenja u Tabeli 3.
[0219] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid se bira iz grupe oligonukleotidnih jedinjenja sa CMP-ID-NO: 4_1 do 150_2.
[0220] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid se bira iz grupe oligonukleotidnih jedinjenja sa CMP-ID-NO: 4_1 do 678_1.
[0221] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid se bira iz grupe oligonukleotidnih jedinjenja sa CMP-ID-NO: 4_1 do 818_1 (vidi oligonukleotidne sekvence navedene u Tabeli 3 u odeljku Primeri).
[0222] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid je oligonukleotidno jedinjenje sa CMP-ID-NO: 155_1 ili 165_1.
[0223] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid se bira iz grupe oligonukleotidnih jedinjenja sa CMP-ID-NO: 169_52, 169_50 ili 169_56.
[0224] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid se bira iz grupe oligonukleotidnih jedinjenja sa CMP-ID-NO: 172_1, 272_1, 572_7, 572_6 ili 572_5.
[0225] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid je oligonukleotidno jedinjenje sa CMP-ID-NO: 175_1.
[0226] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid je oligonukleotidno jedinjenje sa CMP-ID-NO: 178_1.
[0227] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid se bira iz grupe oligonukleotidnih jedinjenja sa CMP-ID-NO: 573_8, 186_1 ili 187_1.
[0228] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid je oligonukleotidno jedinjenje sa CMP-ID-NO: 186_1.
[0229] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid se bira iz grupe oligonukleotidnih jedinjenja sa CMP-ID-NO: 200_1, 204_1, 206_1, 35_2 ili 209_1.
[0230] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid se bira iz grupe oligonukleotidnih jedinjenja sa CMP-ID-NO: 585_1, 585_8, 586_9, 586_5, 586_8, 586_4 ili 586_6.
[0231] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid je oligonukleotidno jedinjenje sa CMP-ID-NO: 233_1.
[0232] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid je oligonukleotidno jedinjenje sa CMP-ID-NO: 237_8 ili 590_13.
[0233] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid je oligonukleotidno jedinjenje sa CMP-ID-NO: 220_1.
[0234] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid se bira iz grupe oligonukleotidnih jedinjenja sa CMP-ID-NO: 591_1, 592_2, 592_4 ili 241_9.
[0235] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid se bira iz grupe oligonukleotidnih jedinjenja sa CMP-ID-NO: 597_4, 598_4, 39_1 ili 602_1.
[0236] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid je oligonukleotidno jedinjenje sa CMP-ID-NO: 39_1.
[0237] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid je oligonukleotidno jedinjenje sa CMP-ID-NO: 611_7.
[0238] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid je oligonukleotidno jedinjenje sa CMP-ID-NO: 271_1 ili 278_1.
[0239] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid se bira iz grupe oligonukleotidnih jedinjenja sa CMP-ID-NO: 616_4, 621_2, 621_1, 622_3, 622_5, 622_4, 624_3, 624_5, 287_1, 625_6, 626_7, 626_8, 626_9, 48_1, 631_6, 631_1, 303_1, 304_6 ili 304_10.
[0240] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid je oligonukleotidno jedinjenje sa CMP-ID-NO: 636_8.
[0241] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid se bira iz grupe oligonukleotidnih jedinjenja sa CMP-ID-NO: 638_8, 639_5, 331_1 ili 640_4.
[0242] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid se bira iz grupe oligonukleotidnih jedinjenja sa CMP-ID-NO: 359_1, 361_1, 361_5, 362_1 ili 641_5.
[0243] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid se bira iz grupe oligonukleotidnih jedinjenja sa CMP-ID-NO: 378_1, 379_1, 399_1.
[0244] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid se bira iz grupe oligonukleotidnih jedinjenja sa CMP-ID-NO: 403_1, 405_1, 642_12, 642_13, 644_3 ili 646_16.
[0245] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid je oligonukleotidno jedinjenje sa CMP-ID-NO: 85_1 ili 425_5.
[0246] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid je oligonukleotidno jedinjenje sa CMP-ID-NO: 116_1.
[0247] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid je oligonukleotidno jedinjenje sa CMP-ID-NO: 123_1 ili 124_1.
[0248] Za određena otelotvorenja pronalaska, oligonukleotid je oligonukleotidno jedinjenje sa CMP-ID-NO: 126_2.
Način proizvodnje
[0249] U daljem aspektu, pronalazak pruža metode za proizvodnju oligonukleotida pronalaska, koje se sastoje od reakcije nukleotidnih jedinica i time formiranja kovalentno povezanih susednih nukleotidnih jedinica sadržanih u oligonukleotidu. Poželjno, metoda koristi hemiju foforamidita (vidi na primer Caruthers et al, 1987, Methods in Enzymology vol. 154, pages 287-313). U daljem otelotvorenju, metoda se dalje sastoji od reakcije kontinuirane nukleotidne sekvence sa konjugacionim delom (ligandom). U daljem aspektu, predviđena je metoda za proizvodnju sastava pronalaska, koja se sastoji od mešanja oligonukleotida ili konjugovanog oligonukleotida pronalaska sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem, rastvaračem, nosačem, solju i/ili adjuvansom.
Farmaceutski sastav
[0250] U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutske sastave koji se sastoje od bilo kog od gore navedenih oligonukleotida i/ili oligonukleotidnih konjugata i farmaceutski prihvatljivog razblaživača, nosača, soli i/ili adjuvansa. Farmaceutski prihvatljiv razblaživač uključuje fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom (PBS), a farmaceutski prihvatljive soli uključuju, ali nisu ograničene na, soli natrijuma i kalijuma.
[0251] WO 2007/031091 pruža odgovarajuće i poželjne primere farmaceutski prihvatljivih razblaživača, nosača i pomoćnih sredstava. Odgovarajuće doze, formulacije, putevi primene, sastavi, oblici doziranja, kombinacije sa drugim terapijskim agensima, formulacije predlekova takođe su date u WO2007/031091.
[0252] Oligonukleotidi ili oligonukleotidni konjugati pronalaska mogu se mešati sa farmaceutski prihvatljivim aktivnim ili inertnim supstancama za pripremu farmaceutskih sastava ili formulacija. Sastavi i metode za formulaciju farmaceutskih sastava zavise od niza kriterijuma, uključujući, ali ne ograničavajući se na, put primene, obim bolesti ili dozu koja se primenjuje.
[0253] U nekim otelotvorenjima, oligonukleotid ili oligonukleotidni konjugat pronalaska je predlek. Konkretno, u pogledu oligonukleotidnih konjugata, konjugovani deo se otcepi od oligonukleotida nakon što se predlek isporuči na mesto delovanja, npr. ciljnu ćeliju.
Primene
[0254] Oligonukleotidi pronalaska mogu se koristiti kao istraživački reagensi za, na primer, terapiju i profilaksu.
[0255] U istraživanjima, takvi oligonukleotidi se mogu koristiti za specifičnu modulaciju sinteze proteina UBE3A u ćelijama (npr. in vitro ćelijske kulture) i eksperimentalnim životinjama, čime se olakšava funkcionalna analiza mete ili procena njegove korisnosti kao mete za terapijsku intervenciju. Ciljna modulacija se postiže degradacijom ili inhibicijom modulatora gena ili iRNK koja proizvodi protein.
[0256] Za terapiju, životinje ili ljude, za koje se sumnja da imaju bolest ili poremećaj, koji se mogu lečiti modulacijom ekspresije UBE3A.
[0257] Ovde opisane su metode za lečenje ili sprečavanje bolesti, koje se sastoje od primene terapijski ili profilaktički efikasne količine oligonukleotida, oligonukleotidnog konjugata ili farmaceutskog sastava pronalaska na ispitaniku koji boluje od ili je podložan bolesti.
[0258] Pronalazak se odnosi na oligonukleotid, sastav ili konjugat kako je ovde definisano za upotrebu kao medikament.
[0259] Oligonukleotid, oligonukleotidni konjugat ili farmaceutski sastav prema pronalasku se obično primenjuje u efikasnoj količini.
[0260] Pronalazak takođe pruža upotrebu oligonukleotida ili oligonukleotidnog konjugata pronalaska kako je opisano za proizvodnju leka za lečenje poremećaja kako je ovde navedeno, ili za metodu lečenja poremećaja kako je ovde navedeno.
[0261] Bolest ili poremećaj, kao što je ovde navedeno, povezan je sa ekspresijom UBE3A. U nekim otelotvorenjima bolest ili poremećaj mogu biti povezani sa mutacijom u majčinom UBE3A genu. U nekim otelotvorenjima, ciljna nukleinska kiselina je regulator očinskog gena UBE3A.
[0262] Metode pronalaska se poželjno koriste za lečenje ili profilaksu bolesti izazvanih nenormalnim nivoima i/ili aktivnošću UBE3A. Bolest naročito može biti uzrokovana smanjenim nivoima i/ili aktivnošću proteina UBE3A.
[0263] Pronalazak se dalje odnosi na upotrebu oligonukleotida, oligonukleotidnog konjugata ili farmaceutskog sastava kako je ovde definisano za proizvodnju leka za lečenje nenormalnih nivoa i/ili aktivnosti UBE3A, posebno niskih nivoa i/ili aktivnosti UBE3A.
1
[0264] Pronalazak se odnosi na oligonukleotide, oligonukleotidne konjugate ili farmaceutske sastave za upotrebu u lečenju Angelmanovog simdroma.
Primena
[0265] Oligonukleotidi ili farmaceutski sastavi ovog pronalaska mogu se primenjivati lokalno (kao što je, na kožu, inhalacijom, oftalmološki ili ušno) ili enteralno (kao što je, oralno ili kroz gastrointestinalni trakt) ili parenteralno (kao što je, intravensko, subkutano, intramuskularno, intracerebralno, intracerebroventrikularno ili intratekalno).
[0266] U poželjnom otelotvorenju, oligonukleotidi ili farmaceutski sastavi ovog pronalaska primenjuju se parenteralnim putem, uključujući intravensku, intraarterijsku, subkutanu, intraperitonealnu ili intramuskularnu injekciju ili infuziju, intratekalnu ili intrakranijalnu, npr. intracerebralnu ili intraventrikularnu primenu. U jednom otelotvorenju, aktivni oligonukleotid ili oligonukleotidni konjugat se primenjuje intracerebralno ili intracerebroventrikularno. U drugom otelotvorenju, aktivni oligonukleotid ili oligonukleotidni konjugat se primenjuje intratekalno.
[0267] Pronalazak takođe pruža upotrebu oligonukleotida ili oligonukleotidnog konjugata pronalaska kako je opisano za proizvodnju leka, pri čemu je lek u obliku doziranja za intratekalnu primenu.
[0268] Pronalazak takođe predviđa upotrebu oligonukleotida ili oligonukleotidnog konjugata pronalaska kako je opisano za proizvodnju leka, pri čemu je lek u obliku doziranja za intracerebralnu ili intraventrikularnu primenu.
[0269] Pronalazak takođe pruža upotrebu oligonukleotida ili oligonukleotidnog konjugata pronalaska kako je opisano za proizvodnju leka, pri čemu je lek u obliku doziranja za intracerebroventrikularnu primenu.
C. Kombinovane terapije
[0270] U nekim otelotvorenjima oligonukleotid, oligonukleotidni konjugat ili farmaceutski sastav pronalaska je za upotrebu u kombinovanom tretmanu sa drugim terapijskim agensom. Terapijski agens može biti, na primer, antikonvulzivni lek.
2
PRIMERI
Materijali i metode
[0271]
Tabela 3: Spisak oligonukleotida ili susednih sekvenci nukleobaza komplementarnih sa SEQ ID NO: 1 (sekvence motiva označene sa SEQ ID NO), dizajni oligonukleotida napravljeni od njih, kao i specifična oligonukleotidna jedinjenja (označena sa ID BR. JED.) dizajnirana na osnovu sekvence motiva.
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
21
21
21
21
[0272] Dizajn se odnosi na gapmer dizajn, F-G-F', gde svaki broj predstavlja broj uzastopnih modifikovanih nukleozida, npr.2' modifikovanih nukleozida (prvi broj = 5' bok), nakon čega sledi broj DNK nukleozida (drugi broj = region praznine), nakon čega sledi broj modifikovanih nukleozida, npr.2' modifikovanih nukleozida (treći broj = 3' bok), kojima opciono prethode ili slede dalji ponovljeni regioni DNK i LNK, koji nisu nužno deo kontinuirane sekvence koja je komplementarna sa ciljnom nukleinskom kiselinom. Za neke oligonukleotide u Tabeli 3 bokovi su mešoviti bokovi, takvi bokovi počinju i završavaju se sa 2' modifikovanim nukleozidima, u ovim slučajevima region praznine je broj iznad 5 koji se ne nalazi na 5' ili 3' terminalu u projektu.
[0273] Za oligonukleotidna jedinjenja velika slova predstavljaju beta-D-oksi LNK nukleozide, mala slova predstavljaju DNK nukleozide, sva LNK C su 5-metil citozin, a 5-metil DNK citozini su predstavljeni sa "e", sve internukleozidne veze su fosforotioatne internukleozidne veze.
[0274] Oligonukleotidi sa EX-EX indikacijom kao Start na SEQ ID NO: 1 su egzon-egzon premošćavajući oligonukleotidi dizajnirani da budu komplementarni preko egzon-egzon spojeva SNHG14-023 (ENST00000554726). Oligonukleotidi prvenstveno obuhvataju egzon2 i egzon3 (tj. komplementarni su sa regionom u egzonu2 i regionom u egzonu 3).
Sinteza oligonukleotida
[0275] Sinteza oligonukleotida je opšte poznata u struci. Nadalje je protokol koji se može primeniti. Oligonukleotidi ovog pronalaska možda su proizvedeni neznatno različitim metodama u pogledu aparature, podrške i korišćenih koncentracija.
[0276] Oligonukleotidi se sintetišu na univerzalnim nosačima uridina korišćenjem fosforamiditnog pristupa na MerMade12 ili Oligomaker DNA/RNA sinthesizer-u na skali od 1-4 µmol. Na kraju sinteze, oligonukleotidi se otcepljuju od čvrstog nosača koristeći vodeni amonijak 5-16 sati na 60°C. Oligonukleotidi su prečišćeni pomoću HPLC reverzne faze (RP-HPLC) ili ekstrakcijom čvrste faze i karakterisani su pomoću UPLC, a molekulska masa je dalje potvrđena pomoću ESI-MS.
21
Izduženje oligonukleotida:
[0277] Kuplovanje β-cijanoetil-fosforamidita (DNK-A (Bz), DNK-G (ibu), DNK-C (Bz), DNK-T, LNK-5-metil-C (Bz), LNK-A (Bz), LNK-G (dmf), LNK-T ili amino-C6 linkera) vrši se korišćenjem rastvora od 0,1 M 5'-O-DMT-zaštićenog amidita u acetonitrilu i DCI (4,5-dicijanoimidazola) u acetonitrilu (0,25 M) kao aktivatoru. Za završni ciklus može se koristiti fosforamidit sa željenim modifikacijama, npr. C6 linker za priključenje konjugovane grupe ili konjugovane grupe kao takve. Tiolacija za uvođenje fosfortioatnih veza vrši se korišćenjem ksantan hidrida (0,01 M u acetonitrilu/piridinu 9:1). Fosfordiestarske veze se mogu uvesti korišćenjem 0,02 M joda u THF/Piridin/voda 7:2:1. Ostali reagensi su oni koji se obično koriste za sintezu oligonukleotida.
Prečišćavanje putem RP-HPLC:
[0278] Sirova jedinjenja su prečišćena preparativnom RP-HPLC na koloni Phenomenex Jupiter C1810µ 150x10 mm. Kao puferi se koriste 0,1 M amonijum acetat pH 8 i acetonitril pri brzini protoka od 5 ml/min. Sakupljene frakcije su liofilizovane da bi se dobilo prečišćeno jedinjenje tipično u vidu čvrste supstance bele boje.
Skraćenice:
[0279]
DCI: 4,5-dicijanoimidazol
DCM: Dihlorometan
DMF: Dimetilformamid
DMT: 4,4'-Dimetoksitritil
THF: Tetrahidrofuran
Bz: Benzoil
Ibu: Izobutiril
RP-HPLC: Reverzno fazna tečna hromatografija visokih performansi
Tmogled
[0280] Oligonukleotidni i dupleksi RNK mete su razblaženi do 3 mM u 500 ml vode bez RNaze i pomešani sa 500 ml 2xTmpufera (200mM NaCl, 0,2mM EDTA, 20mM Nafosfata, pH 7,0). Rastvor je zagrejan na 95°C 3 min, a zatim ostavljen da se žari na sobnoj temperaturi 30 min. Temperatura topljenja (Tm) dupleksa je merena na spektrofotometru
21
Lambda 40 UV/VIS opremljenom sa Peltier temperaturnim programerom PTP6 koristeći softver PE Templab (Perkin Elmer). Temperatura se povećava sa 20°C na 95°C, a zatim se spušta na 25°C, snimajući apsorpciju na 260 nm. Prvi derivat i lokalni maksimumi i topljenja i žarenja su korišćeni za procenu Tmdupleksa.
Priprema ćelijskih kultura primarnih kortikalnih neurona miša
[0281] Kulture primarnih kortikalnih neurona pripremljene su iz mozga mišjih embriona starosti 15 dana u skladu sa standardnom procedurom. Ukratko, ploče za kulturu su obložene poli-L-lizinom (50 µg/ml poli-L-lizina, 10 mM Na-tetraborat, pH 8 pufer) tokom 2-3 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su oprane sa 1xPBS pre upotrebe. Sakupljeni mozgovi mišjih embriona su secirani i homogenizovani žiletom i potopljeni u 38 ml disekcionog medijuma (HBSS, 0,01 M Hepes, penicilin/streptomicin). Zatim je dodato 2 ml tripsina i ćelije su inkubirane 30 minuta na 37°C i centrifugirane. Ćelije su rastvorene u 20 ml DMEM (+ 10% FBS) i propuštene kroz špric za dalju homogenizaciju. Nakon toga je usledilo centrifugiranje na 500 o/min tokom 15 minuta. Ćelije su rastvorene u DMEM (+10% FBS) i zasejane u pločama sa 96 bunara (0,1 × 10^6 ćelija/bunaru u 100 µl). Neuronske ćelijske kulture bile su spremne za upotrebu odmah nakon setve.
Skrining oligonukleotida u ćelijskim kulturama primarnih kortikalnih neurona miša [0282] Ćelije su kultivisane u hranljivoj podlozi (Gibco Neurobasal medijum, dodatak B27, Glutamax, Pencillin-streptomycin) u pločama sa 96 bunara i inkubirane oligonukleotidima 3 dana u željenim koncentracijama. Ukupna RNK je izolovana iz ćelija, a efikasnost obaranja izmerena je qPCR analizom pomoću qScript<™>XLT One-Step RT-qPCR ToughMix<®>, Low ROX<™>kompleta iz Quanta Bioscience (95134-500). Komercijalni TaqMan testovi kompanije Thermo Fisher Scientific korišćeni su za merenje Ube3a_ATS uključujući GAPDH za normalizaciju.
Generisanje humanih primarnih neuronskih ćelijskih kultura
[0283] Sve ćelijske linije u bilo kojoj opisanoj vremenskoj tački inkubirane su na 37°C, koncentraciji 5% CO2 i 95% relativne vlažnosti.
Kultura humanih pluripotentnih matičnih ćelija (hiPSC)
[0284] Uzorci cele ljudske krvi dobijeni su od pacijenata sa dijagnozom Angelmanovog sindroma. Naknadne kulture primarnih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PMCS)
21
obogaćene su za eritroblaste. iPSC linije specifične za pacijenta generisane su reprogramiranjem eritroblasta sa CytoTune-iPS Sendai kompletom za reprogramiranje (Thermo Fisher Scientific). Izvedene iPSC linije su održavane u uslovima bez napajanja koristeći Matrigel (Corning) kvalifikovan za hESC u mTESR1 (STEMCELL Technologies) uz dnevnu zamenu medija. Po dostizanju konfluencije, kolonije su disocirane u ćelijski klaster veličine 50 - 200 µm pomoću Gentle Cell Dissociation Reagent (STEMCELL Technologies) i subkultivirane u odnosu 1:10 - 1:20 u prisustvu 10 µM Y-27632 (Calbiochem).
Diferencijacija u neuronske progenitorske ćelije (NPC)
[0285] Nakon indukcije neuronske diferencijacije, ćelije izvedene iz iPSC održavane su u bazalnom medijumu sastavljenom od jednakih zapremina DMEM-a:F12 Glutamax medium i Neurobasal medium (Gibco, Invitrogen), dopunjen sa 1x B27 (Gibco, Invitrogen), 1x N2 (Gibco, Invitrogen), 0,1 mM beta-merkaptoetanola (Gibco, Invitrogen) i naznačenim suplementima.
[0286] Neuronske progenitorske ćelije (NPC) izvedene su iz hiPSC dvostrukom SMAD inhibicijom i u skladu sa objavljenim procedurama sa blagim modifikacijama (Chambers et al. Nat Biotechnol. Vol.3 pp.275-80, Boissart et al., 2013 Transl Psychiatry. 3:e294).
HiPSCs su disocirani sa Accutase (Innovative Cell Technologies Inc.) u monoćelijsku suspenziju i resuspendovani u osnovnom medijumu dodatno dopunjeni sa 10 µM Y-27632 (Calbiochem), 5 ng/ml FGF (Peprotech), 10 µM SB-431542 (Calbiochem) i 100 nM LDN (Calbiochem). Monoćelijska suspenzija je prebačena na ploče AggreWell800 (STEMCELL Technologies) omogućavajući formiranje agregata koji sadrže 8000 ćelija. Nakon 5 dana neuronski agregati su prebačeni na ploče obložene poli-L-ornitinom (Sigma) i lamininom (Roche) i ostavljeni da formiraju neuronske rozete pod kontinuiranom dualnom SMAD inhibicijom (SB-431542 i LDN) u osnovnom medijumu dopunjenom sa FGF. Neuronske rozete su selektivno izolovane korišćenjem STEMdiff<™>Neural Rosette Selection Reagent (STEMCELL Technologies), ponovo zasejane na posude obložene poli-L-ornitinom i sa Laminin521 (BioLamina) i ekspandirane u osnovnom medijumu dopunjenom sa 10 ng/ml FGF (Peprotech), 10 ng/ml EGF (RnD) i 20 ng/ml BDNF (Peprotech). Kada su dostigle konfluenciju, ćelije su enzimski disocirane sa 0,05% tripsina/EDTA (Gibco, Invitrogen) i subkultivirane. Kontinuirano pasažiranje u osnovnom medijumu dopunjenom sa FGF, EGF i BDNF dovodi do stabilne neuronske progenitorske ćelijske linije (NPC linija) u okviru 10 do
22
20 pasaža. Stabilna neuronska progenitorska ćelijska linija definisana je svojim kapacitetom za samoobnavljanje i eksprimiranjem markera specifičnih za razvojni stadijum Sox2 i Nestin. Nakon specifičnih stimulansa, NPC se diferenciraju u neuronske (MAP2 , Tau+, HuC/D+) i astroglijalne (GFAP+) potomke (Dunkley et al., 2015 Proteomics Clin Appl. Vol.7-8 pp.684-94).
NPC kultura
[0287] Uslovi za NPC kulturu su prethodno opisani i korišćeni su sa blagim modifikacijama (Boissart et al., 2013 Transl Psychiatry.3:e294). Ukratko, ćelije su održavane u posudama obloženim sa Laminin521 (BioLamina) i kultivisane u osnovnom medijumu [sastavljenom od jednakih zapremina DMEM:F12 Glutamax medium i Neurobasal medium (Gibco, Invitrogen), dopunjene sa 1x B27 (Gibco, Invitrogen), 1x N2 (Gibco, Invitrogen), 0,1 mM beta-merkaptoetanola (Gibco, Invitrogen)] i dopunjene sa 10 ng/ml FGF (Peprotech), 10 ng/ml EGF (RnD) i 20 ng/ml BDNF (Peprotech).
Diferencijacija u neuronsku ćelijsku kulturu
[0288] Da bi se indukovala neuronska diferencijacija NPC, ćelije su disocirane sa 0,05% tripsin/EDTA (Gibco, Invitrogen) u monoćelijsku suspenziju i zasejane u posude obložene sa Laminin521 (BioLamina) pri gustini od 12.000 ćelija/cm2 i održavane u osnovnom medijumu dopunjenom sa 200 ng/ml Shh (Peprotech), 100 ng/ml FGF8 (Peprotech) i 100 µM fosfata askorbinske kiseline (Sigma) u periodu od 7 dana. Nakon toga, ćelije su presejane u bazalnom medijumu dopunjenom sa 20 ng/ml BDNF (Peprotech), 10 ng/ml GDNF (Peprotech), 0,5 mM cAMP (BIOLOG Life Science) i 100 µM fosfata askorbinske kiseline (Sigma) pri gustini od 45000 ćelija/cm2 i diferencirane u periodu od 21 dan.21. dana diferencijacije, diferencirane neuronske kulture su presejane na format ploče kompatibilne sa skriningom. Presejavanje je izvršeno disocijacijom kultura sa Accutase (Innovative Cell Technologies Inc.) u monoćelijsku suspenziju. Ćelije su zasejane pri gustini od 200.000 ćelija/cm2 u prisustvu 10 µM Y-27632 (ćelijski permeabilan, reverzibilan, inhibitor Rho kinaza iz Calbiochem-a) u mikrotitarske ploče sa 384 bunara za završni test skrininga oligonukleotida. Neuronske kulture su dalje diferencirane tokom dodatnih 7 dana u bazalnoj sredini dopunjenoj sa 20 ng/ml BDNF (Peprotech), 10 ng/ml GDNF (Peprotech), 0,5 mM cAMP (BIOLOG Life Science) i 100 µM fosfata askorbinske kiseline (Sigma). Medijum za diferencijaciju se menjao dva puta nedeljno. Nakon ukupnog perioda diferencijacije od 35 dana, neuronske ćelijske kulture su bile spremne za tretman oligonukleotidima.
Skrining oligonukleotida u kulturama humanih neuronskih ćelija - sistem sa 384 bunara [0289] Za skrining, osnovni rastvori oligonukleotida su prethodno razblaženi do naznačenih koncentracija vodom u mikrotitarskoj ploči sa 384 bunara (kompaund ploča). Raspored ploče je poslužio kao šablon za obradu. Dva mikrolitara razblaženja oligonukleotida iz svakog bunara preneta su sa kompaund ploče na odgovarajuću ploču kulture. Rukovanje svim tečnostima obavljeno je u sterilnim uslovima u laminarnom protoku pomoću poluautomatizovanog laboratorijskog robotskog sistema (Beckmancoulter). Neuronske ćelijske kulture su inkubirane sa oligonukleotidima 5 dana bez promene medija. Nakon toga, neuronske kulture su lizirane i obrađene za qPCR test sa RealTime Ready Cell lizom i RNK Virus Master kompletom (Roche). Rukovanje tečnošću izvršeno je pomoću poluautomatskog laboratorijskog robotskog sistema (Beckmancoulter). Uzorci su analizirani pomoću Lightcycler480 PCR sistema u realnom vremenu (Roche).
[0290] Aktivnost oligonukleotida procenjena je pomoću qPCR monitoringa obilnosti transkripta UBE3A korišćenjem sledećih prajmera i sondi
UBE3a-Sense: Ushodni prajmer: ATATGTGGAAGCCGGAATCT (SEQ ID NO: 837), Nishodni prajmer: TCCCAGAACTCCCTAATCAGAA (SEQ ID NO: 838), Unutrašnja sonda obeležena bojom FAM: ATGACGGTGCTATACCAGG (SEQ ID NO: 839)
[0291] RT-qPCR je multipleksiran sa PPIA (peptidilprolil izomeraza A) kao kućnim genom za normalizaciju. PPIA prajmeri i sonda označeni bojom VIC kupljeni su od Thermo Fisher Scientific (test ID Hs99999904_m1). Svaka ploča uključuje neciljani oligonukleotid (lažni) kao negativnu kontrolu (TTGaataagtggaTGT (SEQ ID NO: 846)) i referentni oligonukleotid ID BR. JED.: 41_1, što rezultira pozitivnom regulacijom UBE3A mRNK.
[0292] Selektivnost oligonukleotida je verifikovana kontraskriningom za SNORD 115 transkript, koji se nalazi uzvodno od SNORD109B na hromozomu 15. Ekspresija SNORD115 je praćena sa qPCR pomoću sledećih prajmera i sonde
Ushodni prajmer: GGGTCAATGATGAGAACCTTAT (SEQ ID NO: 840),
Nishodni prajmer GGGCCTCAGCGTAATCCTATT (SEQ ID NO: 841),
Unutrašnja sonda obeležena bojom FAM: TTCTGAAGAGAGGTGATGACTTAAA (SEQ ID NO: 842)
[0293] RT-qPCR je multipleksiran sa PPIA (Thermo Fisher Scientific) nakon tretmana oligonukleotidima.
[0294] Smanjenje SNHG14 transkripta nizvodno od SNORD109B (takođe nazvanog UBE3A supresor) izmereno je pomoću RT-qPCR korišćenjem sledećih prajmera i sonde Ushodni prajmer: ATCCGAGGCATGAATCTCAC (SEQ ID NO: 843),
Nishodni prajmer: CAGGCCAAAACCCTTGATAA (SEQ ID NO: 844),
Unutrašnja sonda obeležena bojom FAM: TTGCTGAGCATTTTTGCATC (SEQ ID NO: 845)
[0295] RT-qPCR je multipleksiran sa PPIA (Thermo Fisher Scientific).
[0296] Podaci su predstavljeni kao prosečni % ekspresije u odnosu na lažno prikazivanje na svim pločama i normalizovani na referentni oligonukleotid kako bi se objasnile varijacije od ploče do ploče.
Skiring oligonukleotida u humanim neuronskim ćelijskim kulturama – sistem sa 96 bunara
[0297] Za skrining, osnovni rastvori oligonukleotida su prethodno razblaženi do naznačenih koncentracija vodom u mikrotitarskim pločama sa 96 bunara (kompaund ploča). Raspored ploče je poslužio kao šablon za obradu. Dva mikrolitra razblaženja oligonukleotida iz svakog bunara preneta su sa kompaund ploče na odgovarajuću ploču kulture. Rukovanje svim tečnostima obavljeno je u sterilnim uslovima u laminarnom protoku pomoću poluautomatizovanog laboratorijskog robotskog sistema (Beckmancoulter). Neuronske ćelijske kulture su inkubirane sa oligonukleotidima 5 dana bez promene medija. Nakon toga, neuronske kulture su lizirane i RNK prečišćena pomoću kompleta za prečišćavanje RNK Pure Link Pro96 (12173011A) LifeTechnologies. Rukovanje tečnošću izvršeno je pomoću poluautomatizovanog laboratorijskog robotskog sistema (Beckmancoulter). qPCR analiza Ube3a i Ube3a-ATS izvršena je na ViiA<™>7 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific koristeći qScriptTM XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix Low ROX, iz Quanta (95134-50).
[0298] Korišćeni su sledeći prajmeri i sonde:
22
qPCR UBE3a-Sense:
Ushodni prajmer: ATATGTGGAAGCCGGAATCT (SEQ ID NO: 697),
Nishodni prajmer: TCCCAGAACTCCCTAATCAGAA (SEQ ID NO: 698), Unutrašnja sonda obeležena bojom FAM: ATGACGGTGCTATACCAGG (SEQ ID NO: 699)
[0299] qPCR SNHG14 transkript nizvodno od SNORD109B (takođe nazvan UBE3A supresor): Komercijalno dostupan prajmer i set sondi iz ThermoFisher-a: Hs01372957_m1. Ovi prajmeri pojačavaju sekvencu raspona egzon-egzon od 87 bp u Genbank transkriptu AF400500.1
QPCR GAPDH transkript:
[0300] Komercijalno dostupan prajmer i set sondi iz Termofisher-a: Simbol gena: sa sledećim detaljima testa: RefSeq: NM_002046.3, Lokacija egzona sonde:3, Veličina amplikona: 122 bp. Odgovarajući ID TaqMan testa: Hs99999905_m1.
[0301] RT-qPCR za Ube3a i Ube3a-ATS je multipleksiran sa GAPDH kao kućni gen za normalizaciju. Svaka ploča uključuje neciljani oligonukleotid (lažni) kao negativnu kontrolu (TTGaataagtggaTGT (SEQ ID NO: 846)) i referentni oligonukleotid ID BR. JED.: 21_1, što rezultira pozitivnom regulacijom UBE3A mRNK. Štaviše, panel oligosa koji ne ciljaju Ub3a ili SNHG14 transkript nizvodno od SNORD109B (takođe nazvan UBE3A supresor) uključen je za praćenje šuma testa i rizika od detekcije lažnih pozitivnih rezultata. Onu su nasumično raspoređeni po pločama.
Kontrolni oligonukleotidi:
[0302]
Primer 1 - Aktivnost oligonukleotida u primarnim neuronskim ćelijskim kulturama miša
[0303] Oligonukleotidi koji ciljaju deo SNHG14 duge nekodirajuće RNK koji je antisens prema UBE3A pre-mRNK (pozicija 55319 do 141053 SEQ ID NO: 1) testirani su na njihovu sposobnost da smanje SNHG14 dugi nekodirajući RNK transkript koji sprečava ekspresiju UBE3A (takođe nazvanu UBE3A supresor ili UBE3A-SUP u tabeli podataka) i njihovu sposobnost da indukuju ponovnu ekspresiju UBE3A mRNK u kulturama primarnih kortikalnih neuronskih ćelija miša, dobijeno kako je opisano u odeljku „Materijali i metode“ prethodno. Koncentracija oligonukleotida bila je 5 mikroM.
[0304] Skrining oligonukleotida je izvršen u skladu sa protokolom za skrining u kulturama ćelija kortikalnih neurona miša opisanim u odeljku „Materijali i metode“. Rezultati su prikazani u Tabeli broj 4.
Tabela 4: Aktivnost oligonukleotida u primarnim kulturama neuronskih ćelija miša.
22
22
Primer 2 – Aktivnost oligonukleotida u kulturama humanih neuronskih ćelija [0305] Oligonukleotidi koji ciljaju humani SNHG14 u regionu nizvodno od SNORD109B koji odgovara poziciji 25278410 do 25419462 na hromozomu 15 (SEQ ID NO: 1) testirani su na kulturama humanih neuronskih ćelija dobijenim od pacijenta (vidi protokol u odeljku „Materijali i metode“). Analizirana je sposobnost oligonukleotida da redukuju SNHG14 transkript u regionu nizvodno od SNORD109B (takođe nazvan UBE3A supresor ili UBE3A-SUP u tabeli podataka), bez uticaja na ekspresiju SNORD115. Dalje, analizirana je sposobnost da se indukuje re-ekspresija UBE3A mRNK.
[0306] Skrining oligonukleotida izvršen je u skladu sa protokolom za skrining oligonukleotida u kulturama humanih neuronskih ćelija, opisanim u odeljku „Materijali i metode“ prethodno.
22
[0307] Rezultati su prikazani u tabeli 5. Ekspresija UBE3A mRNK je izmerena za sva jedinjenja, dok obaranje UBE3A supresora i održavanje nivoa SNORD1115 nisu analizirani za sva jedinjenja.
Tabela 5: Aktivnost oligonukleotida u kulturama humanih neuronskih ćelija dobijenih od pacijenta
22
22
2
21
22
[0308] Od 187 testiranih jedinjenja, približno 90% je pokazalo re-ekspresiju UBE3A u poređenju sa lažnim oligonukleotidom pri koncentraciji od 5 mikroM. Broj oligonukleotida sposobnih da indukuju re-ekspresiju UBE3A je veći u regionu između pozicije 1 do 55318 SEQ ID NO: 1 (ne-preklapajući region) nego u regionu komplementarnom sa regionom kodiranja UBE3A (preklapajući region). Slika 2 prikazuje distribuciju oligonukleotida prema njihovom položaju na hromozomu 15 u odnosu na ekspresiju mRNK UBE3A u odnosu na lažni oligonukleotid.
[0309] Za oligonukleotide gde je SNORD115 testiran ne postoji značajna negativna regulacija u poređenju sa lažnim pri 1 i 5 mikroM.
Primer 3 - Aktivnost oligonukleotida koji ciljaju SNHG14 transkript u regionu nizvodno od SNORD109B i uzvodno od regiona antisens prema UBE3A pre-mRNK [0310] Položaji ciljanja oligonukleotida 4806-54939 SEQ ID NO: 1 testirani su na kulturama humanih neuronskih ćelija dobijenih od pacijenta (videti protokol u odeljku „Materijali i metode“). Sposobnost oligonukleotida da redukuje SNHG14 transkript u regionu nizvodno
2
od SNORD109B (takođe nazvan UBE3A supresor ili UBE3A-SUP u tabeli podataka. Dalje, analizirana je sposobnost da se indukuje re-ekspresija UBE3A mRNK.
[0311] Skrining oligonukleotida je izvršen prema protokolu za skrining oligonukleotida u kulturama humanih neuronskih ćelija, opisanom u odeljku „Materijali i metode“ - „Skrining oligonukleotida u kulturama humanih neuronskih ćelija - sistem sa 96 bunara“
[0312] Rezultati su prikazani u Tabeli 6.
Tabela 6: Aktivnost oligonukleotida u kulturama humanih neuronskih ćelija dobijenih od pacijenta.
2 4
2
2
2
2
2
24
24
24
24
24
24
24
2
21
22
Primer 4 - Aktivnost oligonukleotida koji ciljaju SNHG14 transkript u regionu antisens prema UBE3A pre-mRNK
[0313] Položaj ciljanja oligonukleotida 55337-136214 SEQ ID NO: 1 testirani su na kulturama humanih neuronskih ćelija dobijenih od pacijenta (videti protokol u odeljku „Materijali i metode“). Sposobnost oligonukleotida da smanje SNHG14 transkript u regionu nizvodno od SNORD109B (takođe nazvan UBE3A supresor ili UBE3A-SUP u tabeli podataka). Dalje, analizirana je sposobnost da indukuje re-ekspresiju UBE3A mRNK.
2
[0314] Skrining oligonukleotida izvršen je prema protokolu za skrining oligonukleotida u kulturama humanih neuronskih ćelija, opisanom u odeljku „Materijali i metode“ - „Skrining oligonukleotida u kulturama humanih neuronskih ćelija - sistem sa 96 bunara“
[0315] Rezultati su prikazani u tabeli 7.
Tabela 7: Aktivnost oligonukleotida u kulturama ljudskih neuronskih ćelija dobijenih od pacijenta.
2 4
2
2
2
2
2
2
Primer 5 - Aktivnost oligonukleotida koji ciljaju SNHG14 transkript u regionu nizvodno od SNORD109B i uzvodno od regiona antisens prema UBE3A pre-mRNK [0316] Položaj ciljanja oligonukleotida 5224-51257 SEQ ID NO: 1 testirani su na kulturama humanih neuronskih ćelija dobijenih od pacijenta (videti protokol u odeljku „Materijali i metode“). Sposobnost oligonukleotida da redukuju SNHG14 transkript u regionu nizvodno od SNORD109B (takođe nazvan UBE3A supresor ili UBE3A-SUP u tabeli podataka). Dalje, analizirana je sposobnost da indukuje re-ekspresiju UBE3A mRNK.
[0317] Skrining oligonukleotida izvršen je prema protokolu za skrining oligonukleotida u kulturama humanih neuronskih ćelija, opisanom u odeljku „Materijali i metode“ - „Skrining oligonukleotida u kulturama humanih neuronskih ćelija - sistem sa 96 bunara“ sa sledećim modifikacijama:
UBE3a-Sense Prajmer
Koristeći komercijalno dostupne prajmere i sondu kompanije ThermoFisher:
Hs00166580_m1 pojačavajući sekvencu od 94 bp u poziciji 838 refseq ID NM_000462.3.
[0318] Svaka ploča uključuje PBS kontrole (umesto na neciljanom oligonukleotidu) i pozitivni kontrolni oligonukleotid ID BR. JED.: 271_1, što rezultira pozitivnom regulacijom UBE3A mRNK. Dodatni kontrolni oligonukleotidi nisu uključeni.
[0319] Podaci su predstavljeni kao prosečan % ekspresije u odnosu na kontrole PBS na svim pločama i normalizovani na pozitivni kontrolni oligonukleotid za upravljanje varijacijama između ploča u nivoima efikasnosti. Rezultati su prikazani u Tabeli 8.
2 1
Tabela 8: Aktivnost oligonukleotida u kulturama humanih neuronskih ćelija dobijenih od pacijenta.
2 2
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2 Primer 6 - Aktivnost oligonukleotida koji obuhvataju egzon-egzon
[0320] Oligonukleotidi dizajnirani da budu komplementarni preko egzon-egzon spojeva SNHG14-023 (ENST00000554726) testirani su na njihovu sposobnost da redukuju transkript SNHG14 u regionu nizvodno od SNORD109B (takođe nazvanom UBE3A supresor ili UBE3A-SUP u tabeli podataka). Dalje, analizirana je sposobnost da indukuje re-ekspresiju UBE3A mRNK. Oligonukleotidi prvenstveno premošćavaju egzon2 i egzon3 (tj. komplementarni su sa regionom u egzonu2 i regionom u egzonu 3).
[0321] Skrining oligonukleotida izvršen je u skladu sa protokolom za skrining oligonukleotida u kulturama humanih neuronskih ćelija, opisanim u odeljku Primer 5.
[0322] Rezultati su prikazani u tabeli 9.
Tabela 9: Aktivnost oligonukleotida u kulturama humanih neuronskih ćelija dobijenih od pacijenta.
2
Primer 7 - Testiranje in vitro efikasnosti i potencije odabranih oligonukleotida [0323] Na osnovu skrininga u prethodnim primerima 2 do 5, izabrana su 52 oligonukleotida za testiranje potencije i efikasnosti.
[0324] Skrining oligonukleotida u ćelijama dobijenim od humanog AS pacijenta izveden je kao što je opisano u odeljku Materijali i metoda „Skrining oligonukleotida u kulturama humanih neuronskih ćelija - sistem sa 96 bunara“ sa sledećim modifikacijama:
Za UBE3a-Sense prajmer komercijalno dostupne prajmere i sondu kompanije ThermoFisher: korišćen je Hs00166580_m1 koji amplifikuje sekvencu od 94 bp u poziciji 838 refseq ID NM_000462.3.
[0325] Svaka ploča uključuje PBS kontrole (umesto na neciljanom oligonukleotidu) i uključeni su oligonukleotidi pozitivne kontrole ID BR. JED.: 186_1 i 39_1 identifikovani su u prethodnom skriningu. Dodatni kontrolni oligonukleotidi opisani u odeljku o materijalima i metodi nisu uključeni. Koncentracije oligonukleotida u testu bile su od 31,6 µM do 1 nM korišćenjem desetostrukog polu-log razblaženja. Svi oligonukleotidi su testirani u 5 nezavisnih eksperimenata u 5 različitih nedelja. U procesu kontrole kvaliteta podataka neke
2
ploče su uklonjene iz analize ako su to bila očigledna odstupanja, npr. nije detektovan PCR proizvod. Nakon ove filtracije iza svake prijavljene vrednosti stoji najmanje tri nezavisna eksperimenta.
[0326] EC50 (re-ekspresija UBE3A mRNK) i IC50 (smanjenje SNHG14 transkripta u regionu nizvodno od SNORD109B, koji se u tabeli podataka naziva i UBE3A supresor ili UBE3A-SUP) određeni su nakon fitovanja krive korišćenjem 4-parametarskog sigmoidnog modela doza-odgovor. Fitovanje je izvršeno pomoću fit mehanizma dostupnog u softveru Biobook od IDBS (XLfit). Iz fitovanja krive određena je maksimalna dostižna pozitivna regulacija UBE3A (UBE3A Max Up) i maksimalni dostižni nokdaun UBE3A-SUP (UBE3A-SUP Max Kd). Oboje je prikazano kao % kontrole (ćelije tretirane PBS-om). Rezultati su prikazani u Tabeli 10, vrednosti se navode kao geometrijske sredine svakog biološkog replikata.
Tabela 10: Vrednosti EC50 i IC50 oligonukleotida i maksimalna pozitivna regulacija UBE3A i nokdaun UBE3A supresora.
2
2
21
22

Claims (32)

Patentni zahtevi
1. Antisens oligonukleotid za upotrebu u lečenju ili prevenciji Angelmanovog sindroma kod ispitanika, pri čemu antisens oligonukleotid obuhvata kontinuiranu nukleotidnu sekvencu dužine od 10 do 30 nukleotida sa 100% komplementarnosti sa pozicijom 25278410 do 25419462 na humanom hromozomu 15 (SEQ ID NO:1), pri čemu je antisens oligonukleotid sposoban da indukuje ekspresiju humanog očinskog UBE3A.
2. Konjugat za upotrebu u lečenju ili prevenciji Angelmanovog sindroma kod ispitanika, konjugat koji se sastoji od antisens oligonukleotida i najmanje jednog konjugatnog dela kovalentno vezanog za oligonukleotid, pri čemu antisens oligonukleotid sadrži kontinuiranu nukleotidnu sekvencu dužine od 10 do 30 nukleotida sa 100% komplementarnosti sa pozicijom 25278410 do 25419462 na humanom hromozomu 15 (SEQ ID NO:1), pri čemu je antisens oligonukleotid sposoban da indukuje ekspresiju humanog očinskog UBE3A.
3. Farmaceutski sastav za upotrebu u lečenju ili prevenciji Angelmanovog sindroma kod ispitanika, farmaceutski sastav koji sadrži
(a) antisens oligonukleotid koji se sastoji od kontinuirane nukleotidne sekvence dužine od 10 do 30 nukleotida sa 100% komplementarnosti sa pozicijom 25278410 do 25419462 na humanom hromozomu 15 (SEQ ID NO:1), pri čemu antisens oligonukleotid može da indukuje ekspresiju humanog očinskog UBE3A; ili
(b) konjugat koji se sastoji od antisens oligonukleotida iz tačke (a) i najmanje jednog konjugovanog dela kovalentno vezanog za oligonukleotid;
i farmaceutski prihvatljiv razblaživač, rastvarač, nosač, so i/ili adjuvans.
4. In vitro metoda za indukciju ekspresije UBE3A u ciljnoj ćeliji gde je ekspresija očinske UBE3A potisnuta, navedena metoda se sastoji od primene u efikasnoj količini navedenoj ćeliji
(a) antisens oligonukleotida koji se sastoji od kontinuirane nukleotidne sekvence dužine od 10 do 30 nukleotida sa 100% komplementarnosti sa pozicijom 25278410 do 25419462 na humanom hromozomu 15 (SEQ ID NO:1), pri čemu antisens oligonukleotid može da indukuje ekspresiju humanog očinskog UBE3A; ili
2
(b) konjugata koji se sastoji od antisens oligonukleotida iz tačke (a) i najmanje jednog konjugovanog dela kovalentno vezanog za oligonukleotid; ili
(c) farmaceutskog sastava koji se sastoji od antisens oligonukleotida iz tačke (a) ili konjugata iz tačke (b) i farmaceutski prihvatljivog razblaživača, rastvarača, nosača, soli i/ili adjuvansa.
5. Oligonukleotid za upotrebu prema zahtevu 1, konjugat za upotrebu prema zahtevu 2, farmaceutski sastav za upotrebu prema zahtevu 3 ili metoda prema zahtevu 4, pri čemu je kontinuirana nukleotidna sekvenca komplementarna sa regionom ciljne nukleinske kiseline SEQ ID NO: 1.
6. Oligonukleotid za upotrebu prema zahtevu 1 ili zahtevu 5, konjugat za upotrebu prema zahtevu 2 ili zahtevu 5, farmaceutski sastav za upotrebu prema zahtevu 3 ili zahtevu 5, ili metoda prema zahtevu 4 ili zahtevu 5, pri čemu je kontinuirana nukleotidna sekvenca 100% komplementarna sa regionom ciljne nukleinske kiseline pozicije 1 do 55318 SEQ ID NO: 1.
7. Oligonukleotid za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1, 5 i 6, konjugat za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2, 5 i 6, farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od zahteva 3, 5 i 6, ili metoda prema bilo kom od zahteva 4 do 6, pri čemu je kontinuirana nukleotidna sekvenca komplementarna sa podsekvencom ciljne nukleinske kiseline, pri čemu je podsekvenca izabrana iz grupe koja se sastoji od regiona navedenih u tabeli 1 ili 2.
8. Oligonukleotid za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 i 5 do 7, konjugat za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2 i 5 do 7, farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od zahteva 3 i 5 do 7, ili metoda prema bilo kom od zahteva 4 do 7, pri čemu oligonukleotid sadrži ili se sastoji od 17 do 22 nukleotida u dužini ili 15 do 20 nukleotida u dužini.
9. Oligonukleotid za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 i 5 do 8, konjugat za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2 i 5 do 8, farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od zahteva 3 i 5 do 8, ili metoda prema bilo kom od zahteva 4 do 8, pri čemu se oligonukleotid sastoji od 20 nukleotida u dužini.
10. Oligonukleotid za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 i 5 do 9, konjugat za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2 i 5 do 9, farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od zahteva 3 i 5 do 9, ili metoda prema bilo kom od zahteva 4 do 9, pri čemu oligonukleotid sadrži jedan ili više modifikovanih nukleozida.
11. Oligonukleotid za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 i 5 do 10, konjugat za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2 i 5 do 10, farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od zahteva 3 i 5 do 10, ili metoda prema bilo kom od zahteva 4 do 10, pri čemu se 5-metil citozin koristi umesto citozina u oligonukleotidu.
12. Oligonukleotid za upotrebu, konjugat za upotrebu, farmaceutski sastav za upotrebu, ili metoda prema zahtevu 10 ili zahtevu 11, pri čemu je jedan ili više modifikovanih nukleozida 2' šećerno modifikovan nukleozid.
13. Oligonukleotid za upotrebu, konjugat za upotrebu, farmaceutski sastav za upotrebu ili metoda prema zahtevu 12, pri čemu jedan ili više 2' šećerno modifikovanih nukleozida je nezavisno izabran iz grupe koja se sastoji od 2'-O-alkil-RNK, 2'-O-metil-RNK, 2'-alkoksi-RNK, 2'-O-metoksietil-RNK, 2'-amino-DNK, 2'-fluoro-DNK, arabino nukleinske kiseline (ANK), 2'-fluoro-ANK i LNK nukleozida.
14. Oligonukleotid za upotrebu, konjugat za upotrebu, farmaceutski sastav za upotrebu, ili metoda prema bilo kom od zahteva 10 do 13, pri čemu je jedan ili više modifikovanih nukleozida 2'-O-metoksietil-RNK nukleozid.
15. Oligonukleotid za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 i 5 do 14, konjugat za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2 i 5 do 14, farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od zahteva 3 i 5 do 14, ili metoda prema bilo kom od zahteva 4 do 14, pri čemu oligonukleotid sadrži najmanje jednu modifikovanu internukleozidnu vezu.
16. Oligonukleotid za upotrebu, konjugat za upotrebu, farmaceutski sastav za upotrebu ili metoda prema zahtevu 15, pri čemu je modifikovana internukleozidna veza fosforotioatna internukleozidna veza.
2
17. Oligonukleotid za upotrebu, konjugat za upotrebu, farmaceutski sastav za upotrebu ili metoda prema zahtevu 16, pri čemu najmanje 60% internukleozidnih veza u oligonukleotidu su fosforotioatne internukleozidne veze.
18. Oligonukleotid za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 i 5 do 17, konjugat za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2 i 5 do 17, farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od zahteva 3 i 5 do 17, ili metoda prema bilo kom od zahteva 4 do 17, pri čemu je oligonukleotid sposoban da regrutuje RNazu H.
19. Oligonukleotid za upotrebu, konjugat za upotrebu, farmaceutski sastav za upotrebu ili metoda prema zahtevu 18, pri čemu oligonukleotid je gapmer.
20. Oligonukleotid za upotrebu, konjugat za upotrebu, farmaceutski sastav za upotrebu, ili metoda prema zahtevu 18 ili zahtevu 19, pri čemu oligonukleotid je gapmer formule 5'-F-G-F' -3', pri čemu region F i F' nezavisno obuhvataju 1 do 7 modifikovanih nukleozida, a G je region između 6 i 16 nukleozida koji su sposobni da regrutuju RNazuH.
21. Oligonukleotid za upotrebu, konjugat za upotrebu, farmaceutski sastav za upotrebu ili metoda prema zahtevu 20, pri čemu modifikovani nukleozidi su 2' šećerno modifikovani nukleozidi nezavisno izabrani iz grupe koja se sastoji od 2'-O-alkil-RNK, 2'-O-metil-RNK, 2'-alkoksi-RNK, 2'-O-metoksietil-RNK, 2'-amino-DNK, 2'-fluoro-DNK, arabino nukleinske kiseline (ANK), 2'-fluoro-ANK i LNK nukleozida.
22. Oligonukleotid za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 i 5 do 21, konjugat za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2 i 5 do 21, farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od zahteva 3 i 5 do 21, ili metoda prema bilo kom od zahteva 4 do 21, pri čemu oligonukleotid je gapmer formule F-G-F' pri čemu se svaki od regiona F i F' nezavisno sastoji od 2, 3, 4 ili 5 modifikovanih nukleozidnih jedinica i region G se sastoji od 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 nukleozidnih jedinica.
23. Oligonukleotid za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 i 5 do 20, konjugat za upotrebu prema bilo kom od zahteva 2 i 5 do 22, farmaceutski sastav za upotrebu prema bilo kom od zahteva 3 i 5 do 22, ili metoda prema bilo kom od zahteva 4 do 22,
2
pri čemu oligonukleotid je gapmer formule F-G-F', pri čemu se svaki od regiona F i F' nezavisno sastoji od 2, 3, 4 ili 5 jedinica šećera 2'-O-metoksietil-riboza (2' -MOE), a region G se sastoji od 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 DNK jedinica.
24. Oligonukleotid za upotrebu, konjugat za upotrebu, farmaceutski sastav za upotrebu ili metoda prema bilo kom od zahteva 20 do 23, pri čemu se svaki od regiona F i F' nezavisno sastoji od 5 nukleozidnih jedinica šećera 2'-O-metoksietil-riboza (2'-MOE), a region G se sastoji od 10 jedinica nukleozida DNK.
25. Antisens oligonukleotid sposoban da indukuje ekspresiju humanog očinskog UBE3A za upotrebu u lečenju ili prevenciji Angelmanovog sindroma kod ispitanika, pri čemu navedeni antisens oligonukleotid sadrži kontinuiranu nukleotidnu sekvencu koja je 100% komplementarna sa regionom ciljne nukleinske kiseline pozicije 1 do 55318 SEQ ID NO: 1, pri čemu je oligonukleotid ili dužine 15 do 20 nukleotida ili dužine 17 do 22 nukleotida, pri čemu oligonukleotid sadrži jedan ili više modifikovanih nukleozida, pri čemu je jedan ili više modifikovanih nukleozida 2' šećerno modifikovani nukleozid, pri čemu je jedan ili više 2' šećerno modifikovanih nukleozida nezavisno izabrano iz grupe koja se sastoji od 2'-O-alkil-RNK, 2'-O-metil-RNK, 2'-alkoksi-RNK, 2'-O-metoksietil-RNK, 2'-amino-DNK, 2' -fluoro-DNK, arabino nukleinske kiseline (ANK), 2'-fluoro-ANK i LNK nukleozida, pri čemu oligonukleotid sadrži najmanje jednu modifikovanu internukleozidnu vezu, pri čemu je navedena modifikovana internukleozidna veza fosforotioatna veza, pri čemu je oligonukleotid gapmer formule F-G-F' pri čemu svaki od regiona F i F' nezavisno se sastoji od 2, 3, 4 ili 5 modifikovanih nukleozidnih jedinica, a region G se sastoji od 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 nukleozidnih jedinica.
26. Konjugat za upotrebu u lečenju ili prevenciji Angelmanovog sindroma kod ispitanika, konjugat koji sadrži antisens oligonukleotid i najmanje jedan konjugovani deo koji je kovalentno vezan za oligonukleotid, pri čemu antisens oligonukleotid sadrži kontinuiranu nukleotidnu sekvencu koja je 100% komplementarna sa regionom ciljne nukleinske kiseline pozicije 1 do 55318 SEQ ID NO: 1, pri čemu je oligonukleotid ili dužine 15 do 20 nukleotida ili dužine 17 do 22 nukleotida, pri čemu oligonukleotid sadrži jedan ili više modifikovanih nukleozida, pri čemu jedan ili više modifikovanih nukleozida je 2' šećerno modifikovani nukleozid, pri čemu je jedan ili više 2' šećerno
2
modifikovanih nukleozida nezavisno izabrano iz grupe koja se sastoji od 2'-O-alkil-RNK, 2'-O-metil-RNK, 2'-alkoksi-RNK, 2'-O-metoksietil-RNK, 2'-amino-DNK, 2'-fluoro-DNK, arabino nukleinske kiseline (ANK), 2'-fluoro-ANK i LNK nukleozida, pri čemu oligonukleotid sadrži najmanje jednu modifikovanu internukleozidnu vezu, pri čemu navedena modifikovana internukleozidna veza je fosforotioatna veza, pri čemu oligonukleotid je gapmer formule F-G-F' pri čemu svaki od regiona F i F' nezavisno se sastoji od 2, 3, 4 ili 5 modifikovanih nukleozidnih jedinica, a region G se sastoji od 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 nukleozidnih jedinica.
27. Farmaceutski sastav u lečenju ili prevenciji Angelmanovog sindroma kod ispitanika, farmaceutski sastav koji se sastoji od
(i) antisens oligonukleotida koji sadrži kontinuiranu nukleotidnu sekvencu koja je 100% komplementarna sa regionom ciljne nukleinske kiseline pozicije 1 do 55318 SEQ ID NO: 1, pri čemu oligonukleotid je dužine ili 15 do 20 nukleotida ili dužine 17 do 22 nukleotida, pri čemu oligonukleotid sadrži jedan ili više modifikovanih nukleozida, pri čemu jedan ili više modifikovanih nukleozida je 2' šećerno modifikovan nukleozid, pri čemu jedan ili više 2' šećerno modifikovanih nukleozida je nezavisno izabrano iz grupe koja se sastoji od 2'-O-alkil-RNK, 2'-O-metil-RNK, 2'-alkoksi-RNK, 2'-O-metoksietil-RNK, 2'-amino-DNK, 2'-fluoro-DNK, arabino nukleinske kiseline (ANK), 2'-fluoro-ANK i LNK nukleozida, pri čemu oligonukleotid sadrži najmanje jednu modifikovanu internukleozidnu vezu, pri čemu navedena modifikovana internukleozidna veza je fosforotioatna veza, pri čemu oligonukleotid je gapmer formule F-G-F' pri čemu se svaki od regiona F i F' nezavisno sastoji od 2, 3, 4 ili 5 modifikovanih nukleozidnih jedinica, a region G se sastoji od 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 nukleozidnih jedinica; ili
(ii) konjugata koji se sastoji od antisens oligonukleotida iz tačke (i) i najmanje jednog konjugovanog dela kovalentno vezanog za oligonukleotid;
i farmaceutski prihvatljivog razblaživača, rastvarača, nosača, soli i/ili adjuvansa.
28. In vitro metoda za indukciju ekspresije UBE3A u ciljnoj ćeliji gde je ekspresija očinske UBE3A potisnuta, navedena metoda se sastoji od primene u efikasnoj količini na navedenu ćeliju
(i) antisens oligonukleotida koji sadrži kontinuiranu nukleotidnu sekvencu koja je 100% komplementarna sa regionom ciljne nukleinske kiseline na poziciji 1 do 55318
2
SEQ ID NO: 1, pri čemu je oligonukleotid dužine ili 15 do 20 nukleotida ili dužine 17 do 22 nukleotida, pri čemu oligonukleotid sadrži jedan ili više modifikovanih nukleozida, pri čemu je jedan ili više modifikovanih nukleozida 2' šećerno modifikovanih nukleozida, pri čemu je jedan ili više 2' šećerom modifikovanih nukleozida nezavisno izabran iz grupe koju čine 2'-O-alkil-RNK, 2'-O-metil-RNK, 2'-alkoksi-RNK, 2'-O-metoksietil-RNk, 2'-amino-DNK, 2'-fluoro-DNK, arabino nukleinska kiselina (ANK), 2'-fluoro-ANK i LNK nukleozidi, pri čemu oligonukleotid sadrži najmanje jednu modifikovanu internukleozidnu vezu, pri čemu pomenuta modifikovana internukleozidna veza je fosforotioatna veza, pri čemu oligonukleotid je gapmer formule F-G-F' pri čemu svaki od regiona F-G-F i F' se nezavisno sastoji od 2, 3, 4 ili 5 modifikovanih nukleozidnih jedinica i region G se sastoji od 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 nukleozidnih jedinica; ili |
(ii) konjugata koji se sastoji od antisens oligonukleotida iz tačke (i) i najmanje jednog konjugovanog dela kovalentno vezanog za oligonukleotid; ili
(iii) farmaceutskog sastava koji se sastoji od antisens oligonukleotida iz tačke (i) ili konjugata iz tačke (ii) i farmaceutski prihvatljivog razblaživača, rastvarača, nosača, soli i/ili adjuvansa.
29. Metoda prema bilo kom od zahteva 4 do 24 i 28, pri čemu je ekspresija UBE3A povećana za najmanje 40% u poređenju sa kontrolom.
30. Metoda prema bilo kom od zahteva 4 do 24, 28 i 29, pri čemu je nivo SNHG14 transkripta nizvodno od SNORD109B smanjen za najmanje 30% u poređenju sa kontrolom.
31. Metoda prema bilo kom od zahteva 4 do 24 i 28 do 30, pri čemu je ciljna ćelija neuronska ćelija.
32. Metoda prema bilo kom od zahteva 4 do 24 i 28 do 31, pri čemu ekspresija SNORD115 nije značajno pogođena u poređenju sa kontrolom.
2
RS20241003A 2015-11-12 2016-11-11 Oligonukleotidi za indukciju ekspresije očinskog ube3a RS66036B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15194367 2015-11-12
EP16189502 2016-09-19
EP23152543.7A EP4220360B9 (en) 2015-11-12 2016-11-11 Oligonucleotides for inducing paternal ube3a expression

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS66036B1 true RS66036B1 (sr) 2024-11-29

Family

ID=57345910

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210241A RS61529B9 (sr) 2015-11-12 2016-11-11 Oligonukleotidi za indukovanje ekspresije paternalnog ube3a
RS20241003A RS66036B1 (sr) 2015-11-12 2016-11-11 Oligonukleotidi za indukciju ekspresije očinskog ube3a

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210241A RS61529B9 (sr) 2015-11-12 2016-11-11 Oligonukleotidi za indukovanje ekspresije paternalnog ube3a

Country Status (30)

Country Link
US (9) US10494633B2 (sr)
EP (5) EP4220360B9 (sr)
JP (7) JP6751142B2 (sr)
KR (4) KR102482440B1 (sr)
CN (5) CN116064539A (sr)
AU (4) AU2016352836B2 (sr)
CA (1) CA3004799C (sr)
CL (3) CL2018001189A1 (sr)
CO (1) CO2018004550A2 (sr)
CR (3) CR20180264A (sr)
DK (2) DK4220360T3 (sr)
ES (2) ES2991800T3 (sr)
FI (1) FI4220360T3 (sr)
HK (2) HK1258309A1 (sr)
HR (2) HRP20241138T1 (sr)
HU (2) HUE067905T2 (sr)
IL (3) IL300119A (sr)
LT (2) LT4220360T (sr)
MA (1) MA67580B1 (sr)
MX (4) MX2018004978A (sr)
PE (2) PE20210451A1 (sr)
PH (1) PH12018501005A1 (sr)
PL (2) PL4220360T3 (sr)
RS (2) RS61529B9 (sr)
RU (1) RU2742007C2 (sr)
SG (1) SG11201803951QA (sr)
SI (2) SI4220360T1 (sr)
UA (1) UA125963C2 (sr)
WO (3) WO2017081223A1 (sr)
ZA (1) ZA201802494B (sr)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2744987C (en) 2008-12-02 2018-01-16 Chiralgen, Ltd. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
CA2767253A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Ontorii, Inc. Novel nucleic acid prodrugs and methods of use thereof
KR102279458B1 (ko) 2009-09-11 2021-07-21 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 헌팅틴 발현의 조절
WO2012039448A1 (ja) 2010-09-24 2012-03-29 株式会社キラルジェン 不斉補助基
WO2013012758A1 (en) 2011-07-19 2013-01-24 Ontorii, Inc. Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
PL3461895T3 (pl) 2012-06-25 2021-01-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulacja ekspresji ube3a-ats
JP6268157B2 (ja) 2012-07-13 2018-01-24 株式会社Ｗａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｊａｐａｎ 不斉補助基
KR102712879B1 (ko) 2012-07-13 2024-10-04 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 제어
US10144933B2 (en) 2014-01-15 2018-12-04 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having immunity induction activity, and immunity induction activator
JPWO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
EP4137572A1 (en) 2014-01-16 2023-02-22 Wave Life Sciences Ltd. Chiral design
US10400243B2 (en) 2014-11-25 2019-09-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of UBE3A-ATS expression
SI4220360T1 (sl) 2015-11-12 2024-10-30 F. Hoffmann - La Roche Ag Oligonukleotidi za indukcijo očetovske ekspresije UBE3A
PT3717646T (pt) * 2017-12-01 2025-07-28 Texas A & M Univ Sys Tratamento antisense da síndrome de angelman
WO2019157531A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified compounds and uses thereof
CN108795935B (zh) * 2018-05-23 2022-06-21 中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心) 日本血吸虫SjELAV-like 1基因的siRNA及其应用
AU2019344006B2 (en) 2018-09-21 2025-11-27 University Of Connecticut Compositions and methods to restore paternal UBE3A gene expression in human Angelman Syndrome
CN113316722A (zh) * 2019-01-17 2021-08-27 豪夫迈·罗氏有限公司 E3泛素连接酶(ube3a)蛋白质靶标
AU2020225687A1 (en) * 2019-02-20 2021-08-19 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Phosphonoacetate gapmer oligonucleotides
CN113728104B (zh) 2019-03-29 2023-10-27 Ionis制药公司 用于调节ube3a-ats的化合物和方法
WO2020237130A1 (en) * 2019-05-22 2020-11-26 The University Of North Carolina At Chapel Hill Ube3a genes and expression cassettes and their use
EP3976765A1 (en) 2019-05-28 2022-04-06 F. Hoffmann-La Roche AG Method to generate monocytic progenitor cells
TW202204607A (zh) * 2020-04-16 2022-02-01 英商羅斯林科技有限公司 誘導性多功能幹細胞(iPSC)之誘導
WO2021249993A1 (en) * 2020-06-09 2021-12-16 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Guanosine analogues for use in therapeutic polynucleotides
JPWO2022158487A1 (sr) 2021-01-21 2022-07-28
WO2023217890A1 (en) 2022-05-10 2023-11-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Antisense oligonucleotides targeting cfp-elk1 intergene region
WO2024227765A2 (en) 2023-05-04 2024-11-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides capable of upregulating glucocerebrosidase expression
WO2025100980A1 (ko) * 2023-11-08 2025-05-15 한국과학기술원 Ube3a를 표적으로 하여 발현증강을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 이의 용도
WO2025125542A1 (en) 2023-12-15 2025-06-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Intrathecal dosage method
WO2025217466A1 (en) * 2024-04-11 2025-10-16 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Dosing regimens for antisense treatment of angelman syndrome

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4373084A (en) 1981-07-07 1983-02-08 E. I. Du Pont De Nemours And Company Sulfur-modified polypropylene ether glycols, a method for preparing them, and polyurethanes prepared therefrom
AU2916292A (en) 1991-10-24 1993-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6617162B2 (en) 2001-12-18 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of estrogen receptor alpha expression
DE69829760T3 (de) 1997-09-12 2016-04-14 Exiqon A/S Bi- und tri-zyklische - nukleosid, nukleotid und oligonukleotid-analoga
US6238921B1 (en) 1998-03-26 2001-05-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of human mdm2 expression
WO2000040749A2 (en) * 1999-01-06 2000-07-13 Genenews Inc. Method for the detection of gene transcripts in blood and uses thereof
NZ513402A (en) 1999-02-12 2003-06-30 Sankyo Co Novel nucleosides and oligonucleotide analogues
JP2002543214A (ja) 1999-05-04 2002-12-17 エクシコン エ／エス Ｌ−リボ−ｌｎａ類縁体
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
CA2396460A1 (en) 1999-12-02 2001-06-07 Myriad Genetics, Inc. Protein-protein interactions
US6300132B1 (en) 1999-12-17 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of telomeric repeat binding factor 2 expression
WO2001092582A1 (en) * 2000-06-01 2001-12-06 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Haplotypes of the ube3a gene
US20030087855A1 (en) 2001-09-13 2003-05-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of protein kinase R expression
EP2221376B1 (en) * 2001-06-21 2012-11-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
US20050124572A1 (en) * 2002-06-17 2005-06-09 Freier Susan M. Compositions and their uses directed to signal tranducers
JP2006507808A (ja) 2002-08-14 2006-03-09 ファルマシア・コーポレーション Ｎａｖ１．３発現のアンチセンス調節
US20040132063A1 (en) * 2002-09-25 2004-07-08 Gierse James K. Antisense modulation of microsomal prostaglandin E2 synthase expression
EP1569661B1 (en) 2002-11-18 2009-09-09 Santaris Pharma A/S Antisense design
EP1670901A4 (en) * 2003-08-29 2007-09-05 Wisconsin Alumni Res Found METHOD FOR IN VITRO DIFFERENTIATION OF NEURAL STEM CELLS, MOTOR NEURONES AND DOPAMINE NEURONES FROM EMBRYONAL PRIMATIVE STEM CELLS
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
US8288354B2 (en) 2005-12-28 2012-10-16 The Scripps Research Institute Natural antisense and non-coding RNA transcripts as drug targets
US7399845B2 (en) 2006-01-27 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
JP5825754B2 (ja) 2006-05-05 2015-12-02 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ａｐｏｂの発現を調節するための化合物および方法
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
CN101490074B (zh) 2006-05-11 2013-06-26 Isis制药公司 5’-修饰的双环核酸类似物
US8580756B2 (en) 2007-03-22 2013-11-12 Santaris Pharma A/S Short oligomer antagonist compounds for the modulation of target mRNA
PE20090064A1 (es) 2007-03-26 2009-03-02 Novartis Ag Acido ribonucleico de doble cadena para inhibir la expresion del gen e6ap humano y composicion farmaceutica que lo comprende
DK2170917T3 (da) 2007-05-30 2012-10-08 Isis Pharmaceuticals Inc N-Substituerede bicycliske nukleinsyreanaloge med aminomethylenbro
ES2386492T3 (es) 2007-06-08 2012-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos carbocíclicos
ATE538127T1 (de) 2007-07-05 2012-01-15 Isis Pharmaceuticals Inc 6-disubstituierte bicyclische nukleinsäureanaloga
WO2009067647A1 (en) 2007-11-21 2009-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic alpha-l-bicyclic nucleic acid analogs
WO2009090182A1 (en) 2008-01-14 2009-07-23 Santaris Pharma A/S C4'-substituted - dna nucleotide gapmer oligonucleotides
DK2285819T3 (da) 2008-04-04 2013-12-02 Isis Pharmaceuticals Inc Oligomere forbindelser omfattende neutralt bundne, terminale bicykliske nukleosider
DK2356129T3 (da) 2008-09-24 2013-05-13 Isis Pharmaceuticals Inc Substituerede alpha-L-bicykliske nukleosider
US8642334B2 (en) * 2009-02-17 2014-02-04 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Methods of neural conversion of human embryonic stem cells
US9012421B2 (en) 2009-08-06 2015-04-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
CN102762718B (zh) * 2009-10-13 2015-06-17 干细胞技术公司 用于分化干细胞的重量克分子渗透压浓度控制
US8940708B2 (en) 2009-12-23 2015-01-27 Curna, Inc. Treatment of hepatocyte growth factor (HGF) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to HGF
WO2011156202A1 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2 '-amino and 2 '-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
EP2593547B1 (en) 2010-07-14 2017-11-15 CuRNA, Inc. Treatment of discs large homolog (dlg) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to dlg
CN103167883B (zh) 2010-07-19 2016-08-03 F·C·贝内特 肌强直性营养障碍蛋白激酶(dmpk)表达的调节
KR20160033798A (ko) * 2010-08-19 2016-03-28 에프. 호프만-라 로슈 아게 체세포의 유도된 재프로그래밍된 신경 줄기 세포 (ｉｒｎｓｃｓ) 로의 전환
US9714427B2 (en) 2010-11-11 2017-07-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for unsilencing imprinted genes
EP2640853B1 (en) 2010-11-17 2018-12-26 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of alpha synuclein expression
WO2012135621A2 (en) * 2011-03-30 2012-10-04 Cellular Dynamics International. Inc Priming of pluripotent stem cells for neural differentiation
BR112013026423A2 (pt) 2011-04-20 2016-11-29 Roche Glycart Ag método e construtos para a passagem de pendente do ph da barreira sangue-cérebro
US10023861B2 (en) 2011-08-29 2018-07-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
HK1198766A1 (en) 2011-09-07 2015-06-05 玛瑞纳生物技术有限公司 Synthesis and uses of nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers
EP2850092B1 (en) 2012-04-09 2017-03-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
PL3461895T3 (pl) 2012-06-25 2021-01-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulacja ekspresji ube3a-ats
US20150291958A1 (en) 2012-11-15 2015-10-15 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Anti apob antisense conjugate compounds
WO2014077693A1 (en) 2012-11-16 2014-05-22 Academisch Ziekenhuis Leiden H.O.D.N. Lumc Means and methods for reducing an effect of aging in a mammalian cell
ES2939807T3 (es) * 2014-03-21 2023-04-27 Fujifilm Cellular Dynamics Inc Producción de neuronas dopaminérgicas del mesencéfalo y métodos para su utilización
SI4220360T1 (sl) 2015-11-12 2024-10-30 F. Hoffmann - La Roche Ag Oligonukleotidi za indukcijo očetovske ekspresije UBE3A
JP2020528739A (ja) 2017-06-28 2020-10-01 ユニヴァーシティ オブ サウス フロリダ アンジェルマン症候群の遺伝子治療法のための改変ｕｂｅ３ａ遺伝子
PT3717646T (pt) 2017-12-01 2025-07-28 Texas A & M Univ Sys Tratamento antisense da síndrome de angelman
EP3743116B1 (en) 2018-01-26 2024-07-10 F. Hoffmann-La Roche AG Radiolabelled oligonucleotides and process for their preparation
CN113728104B (zh) 2019-03-29 2023-10-27 Ionis制药公司 用于调节ube3a-ats的化合物和方法

Also Published As

Publication number Publication date
US10718753B2 (en) 2020-07-21
CA3004799C (en) 2024-05-14
RU2018119315A3 (sr) 2020-03-26
JP2023052630A (ja) 2023-04-11
ES2852998T4 (es) 2024-04-25
CA3004799A1 (en) 2017-05-18
JP7066609B2 (ja) 2022-05-13
EP4220360A2 (en) 2023-08-02
US20190154664A1 (en) 2019-05-23
US20200057052A1 (en) 2020-02-20
AU2023200410A1 (en) 2023-02-23
DK3374509T3 (da) 2021-02-15
ZA201802494B (en) 2024-01-31
CL2018001189A1 (es) 2018-08-31
UA125963C2 (uk) 2022-07-20
PE20210451A1 (es) 2021-03-08
US20200348286A1 (en) 2020-11-05
AU2023200410B2 (en) 2024-10-31
PL4220360T3 (pl) 2024-12-16
EP3374509B1 (en) 2020-12-16
US10739332B2 (en) 2020-08-11
JP2021191262A (ja) 2021-12-16
HUE067905T2 (hu) 2024-11-28
RS61529B9 (sr) 2024-04-30
EP4220360B9 (en) 2024-10-16
US10494633B2 (en) 2019-12-03
KR20250121139A (ko) 2025-08-11
JP6751142B2 (ja) 2020-09-02
HK1258434A1 (zh) 2019-11-08
AU2020203573B2 (en) 2022-07-07
US20220146496A1 (en) 2022-05-12
JP2018533362A (ja) 2018-11-15
SI3374509T1 (sl) 2021-04-30
US12259380B2 (en) 2025-03-25
IL281211B2 (en) 2024-01-01
RU2018119315A (ru) 2019-12-13
HUE053197T2 (hu) 2021-06-28
ES2991800T3 (es) 2024-12-04
WO2017081223A1 (en) 2017-05-18
IL258488A (en) 2018-05-31
IL300119A (en) 2023-03-01
JP7279000B2 (ja) 2023-05-22
IL258488B (en) 2021-03-25
KR102185465B1 (ko) 2020-12-03
AU2020203573A1 (en) 2020-06-18
JP2018533954A (ja) 2018-11-22
RS61529B1 (sr) 2021-04-29
CO2018004550A2 (es) 2018-11-22
FI4220360T3 (fi) 2024-08-27
US20170191064A1 (en) 2017-07-06
US11320421B2 (en) 2022-05-03
EP3374509A1 (en) 2018-09-19
EP3798307A1 (en) 2021-03-31
CN108291226A (zh) 2018-07-17
SG11201803951QA (en) 2018-06-28
KR102840652B1 (ko) 2025-08-04
JP2021003113A (ja) 2021-01-14
CN116064539A (zh) 2023-05-05
WO2017081254A1 (en) 2017-05-18
AU2022211910B2 (en) 2024-06-13
PH12018501005A1 (en) 2019-01-28
LT3374509T (lt) 2021-03-10
MA67580B1 (fr) 2024-09-30
ES2852998T3 (es) 2021-09-14
MX2022016381A (es) 2023-01-30
RU2742007C2 (ru) 2021-02-01
US20250116656A2 (en) 2025-04-10
US20230296587A1 (en) 2023-09-21
US11852627B2 (en) 2023-12-26
NZ741585A (en) 2024-01-26
PE20181157A1 (es) 2018-07-19
JP2019500851A (ja) 2019-01-17
AU2016352836B2 (en) 2020-06-25
KR102482440B1 (ko) 2022-12-29
MX2022016377A (es) 2023-01-30
EP3374498A1 (en) 2018-09-19
CL2020000889A1 (es) 2020-08-28
CR20200118A (es) 2021-04-21
CR20180264A (es) 2018-08-06
CN108350431A (zh) 2018-07-31
CN116064540A (zh) 2023-05-05
CL2021002159A1 (es) 2022-03-11
CN108350432A (zh) 2018-07-31
JP2025024060A (ja) 2025-02-19
HK1258309A1 (zh) 2019-11-08
MX2022016376A (es) 2023-01-30
EP4220360B1 (en) 2024-06-26
PL3374509T3 (pl) 2021-05-04
MX2018004978A (es) 2018-07-06
CR20220077A (es) 2023-04-11
BR112018007633A2 (pt) 2018-11-06
WO2017081250A1 (en) 2017-05-18
EP4220360A3 (en) 2023-08-23
HRP20210227T1 (hr) 2021-03-19
IL281211A (en) 2021-04-29
AU2016352836A1 (en) 2018-04-26
US20190310244A1 (en) 2019-10-10
LT4220360T (lt) 2024-09-10
KR20230008233A (ko) 2023-01-13
US20240085402A1 (en) 2024-03-14
IL281211B1 (en) 2023-09-01
US20190144824A1 (en) 2019-05-16
KR20180070611A (ko) 2018-06-26
SI4220360T1 (sl) 2024-10-30
CN108291226B (zh) 2022-11-04
KR20200137027A (ko) 2020-12-08
EP3374499A1 (en) 2018-09-19
HK1253325A1 (zh) 2019-06-14
AU2022211910A1 (en) 2022-11-10
HRP20241138T1 (hr) 2024-11-22
DK4220360T3 (da) 2024-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7279000B2 (ja) 父方ｕｂｅ３ａの発現を誘導するオリゴヌクレオチド
CA3103756A1 (en) Oligonucleotides for modulating scn9a expression
JP2025179845A (ja) Ａｔｘｎ２発現を制御するためのオリゴヌクレオチド
JP7281474B2 (ja) Ｔｍｅｍ１０６ｂ発現を調節するためのオリゴヌクレオチド
JP7499267B2 (ja) Ａｔｘｎ２発現を調節するためのオリゴヌクレオチド
CN118318042A (zh) 用于调节载脂蛋白e4表达的寡核苷酸
HK40090600A (zh) 用於诱导父本ube3a表达的寡核苷酸
HK40090602A (zh) 用於诱导父本ube3a表达的寡核苷酸
JP2021510295A (ja) Ｇｓｋ３ｂ発現を調節するためのオリゴヌクレオチド
EP3568477A1 (en) Antisense oligonucleotides for modulating rela expression
HK1253325B (en) Oligonucleotides for inducing paternal ube3a expression
BR112018007633B1 (pt) Oligonucleotídeos para indução de expressão de ube3a paterna
BR122021008010B1 (pt) Oligonucleotídeos para indução de expressão de ube3a paterna,conjugado, composição farmacêutica, uso dos mesmos e método para induçãode expressão de ube3a em uma célula alvo onde expressão de ube3a paterna ésuprimida
HK40060810A (en) Oligonucleotides for modulating atxn2 expression
HK40043583A (en) Oligonucleotides for modulating atxn2 expression
US20190338286A1 (en) Antisense oligonucleotides for modulating rel expression
CN111615558A (zh) 用于调节erc1表达的寡核苷酸
JP2022512877A (ja) Ｔｉａ１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
HK40040901A (en) Oligonucleotides for modulating scn9a expression
WO2019038228A1 (en) OLIGONUCLEOTIDES FOR MODULATION OF TOM1 EXPRESSION
HK1262526A1 (en) Antisense oligonucleotides for modulating htra1 expression