RS60968B1

RS60968B1 - Prolekovi gemcitabina

Info

Publication number: RS60968B1
Application number: RS20200953A
Authority: RS
Inventors: Hugh Griffith; Christopher Mcguigan; Magdalena Slusarczyk; Michaela Serpi; Valentina Ferrari
Original assignee: NuCana plc
Priority date: 2014-06-25
Filing date: 2015-06-25
Publication date: 2020-11-30
Also published as: HRP20230584T1; ES2811268T3; IL272724A; AU2015278899A1; PL3160978T3; HRP20201264T1; DK3160978T3; MY183198A; CL2016003260A1; AU2019216626B2; PH12016502553B1; TW201613614A; IL272724B; SI3160978T1; SMT202000564T1; EP3160978A1; JP2017519014A; TWI758728B; CA2945938C; NZ765508A

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na formulacije gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata (hemijski naziv: 2’-Deoksi-2’,2’-difluoro-D-citidin-5’-O-[fenil (benzoksi-L-alaninil)] fosfat) kada je prisutan kao jedan fosfatni diastereoizomer i, naročito, odnosi se na (S)-fosfat diastereoizomer koji nudi izuzetno i neočekivano povećanje u rastvorljivosti u odnosu na (R)-diastereoizomer. (S)-fosfat diastereoizomer je takođe preferencijalno unet u rastvorima ciklodekstrina u odnosu na (R)-diastereoizomer.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Gemcitabin (1; u prodaji kao Gemzar®) je efikasni nukleozidni analog koji je trenutno odobren za lečenje kancera dojke, ne-sitnoćelijskog kancera pluća, kancera jajnika i kancera pankreasa i široko se upotrebljava za lečenje raznih drugih kancera uključujući kancer bešike, bilijarnog trakta, kolorektalnog kancera i limfoma.

[0003] Klinička upotrebljivost gemcitabina je ograničena nizom inherentnih i stečenih mehanizama rezistencije. Na ćelijskom nivou rezistencija zavisi od tri parametra: (i) regulaciono smanjivanje dezoksicitidin kinaze, neophodne za aktivaciju u fosforilisani oblik; (ii) smanjena ekspresija transportera nukleozida, posebno, hENT1 potrebnog za preuzimanje od strane ćelija kancera; i (iii) regulaciono povećanje katalitičkih enzima naročito citidin deaminaze koji vrši degradaciju gemcitabina.

[0004] WO2005/012327 opisuje niz derivata nukleotidnih prolekova fosfata za gemcitabin i molekule leka srodnog nukleozida. Među njima je gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfat (NUC-1031; 2) identifikovan kao posebno efikasno jedinjenje. Čini se da ovi prolekovi izbegavaju mnoge od inherentnih i stečenih mehanizma rezistencije koji ograničavaju upotrebljivost gemcitabina ("Application of ProTide Technology to Gemcitabine: A Successful Approach to Overcome the Key Cancer Resistance Mechanisms Leads to a New Agent NUC-1031) in Clinical Development"; Slusarczyk et al; J. Med. Chem.; 2014, 57, 1531-1542).

[0005] NUC-1031 2 se tipično priprema kao smeša dva dijastereoizomera, epimerna na fosfatnom centru.

[0006] Nažalost, NUC-1031 2 je izuzetno lipofilan i stoga slabo rastvorljiv u vodi (po proračunu: <0,1 mg/mL), i jonizabilni ostaci, azot pirimidina i fenolni hidroksi imaju izračunate pKa koje leže izvan pH opsega pogodnog za parenteralnu primenu. U suštini je nerastvorljiv u vodi, bez obzira na sadržaj soli ili pH, i to ima implikacije na razvoj formulacija za isporučivanje proleka u dovoljno visokim dozama za efikasno lečenje. To takođe ima implikacije na razvoj efikasnih proizvodnih postupaka koji će omogućiti da se NUC-1031 proizvede troškovno efikasno.

[0007] Cilj određenih primera izvođenja ovog pronalaska je obezbediti gemcitabin-[fenilbenzoksi-L-alaninil)]-fosfat (NUC-1031; 2) u obliku koji može biti formulisan u efikasnu farmaceutsku kompoziciju.

[0008] Takođe je cilj određenih primera izvođenja ovog pronalaska obezbediti oblik gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata (NUC-1031; 2) koji može biti pripremljen i čuvan tokom dužeg vremenskog perioda.

[0009] Cilj određenih primera izvođenja ovog pronalaska je obezbediti gemcitabin-[fenilbenzoksi-L-alaninil)]-fosfat (NUC-1031; 2) u obliku koji ima višu rastvorljivost od oblika iz stanja tehnike.

[0010] Cilj određenih primera izvođenja ovog pronalaska je obezbediti gemcitabin-[fenilbenzoksi-L-alaninil)]-fosfat (NUC-1031; 2) kao jedan diastereoizomer na fosforu.

[0011] Određeni primeri izvođenja ovog pronalaska zadovoljavaju neke ili sve od gore navedenih ciljeva.

[0012] Gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfat predmetnog pronalaska je poželjno značajno iste aktivnosti kao gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfat (NUC-1031; 2). On može, međutim, da ima neznatno nižu aktivnost, ali ima druge koristi kao što je opisano u ovoj specifikaciji ukoliko postoji proizvodna ili terapeutska korist za njegovu upotrebu u ovom obliku.

KRATAK OPIS OTKRIĆA

[0013] U skladu sa prvim aspektom predmetnog pronalaska obezbeđena je farmaceutska formulacija koja sadrži gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat 3:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili solvat, koji ima diastereoizomernu čistoću veću od 90%, i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens; pri čemu, formulacija je vodena formulacija koja takođe sadrži polarni organski rastvarač.

[0014] Pronalazači su otkrili iznenađujuću i izuzetnu razliku u rastvorljivosti dva diastereoizomera. (S)-Epimer 3 ima dovoljnu rastvorljivost u smešama određenog broja polarnih organskih rastvarača sa vodom kako bi se učinila pogodnom za formulaciju i primenu kao terapeutsko sredstvo. (R)-Epimer 4 je značajno nerastvorljiv u većini merenih smeša rastvarača. Ova izuzetna razlika u rastvorljivosti prethodno nije identifikovana i potencijalne koristi ove osobine (S)-epimera nisu identifikovane. U određenom broju testiranih smeša rastvarača razlika u rastvorljivosti između (S)-epimera i (R)-epimera je preko 100 -struka.

[0015] Iznenađujuće, (S)-epimer je takođe preferencijalno apsorbovan u rastvore ciklodekstrina u odnosu na (R)-epimer. Ovo nije zabeleženo sa drugim derivatima gemcitabin fosfata.

[0016] Formulacija može biti za parenteralnu, npr. za intravensku, subkutanu ili intramuskularnu primenu. Poželjno, formulacija je za intravensku primenu.

[0017] Formulacija može biti vodena formulacija koja izborno takođe sadrži polarni organski rastvarač. U slučaju parenteralne (npr. intravenske) primene, formulacija poželjno takođe sadrži polarni organski rastvarač.

[0018] Formulacija može takođe da sadrži ciklodekstrin.

[0019] U drugom aspektu pronalaska obezbeđena je formulacija prvog aspekta za medicinsku upotrebu.

[0020] U trećem aspektu pronalaska obezbeđena je formulacija prvog aspekta za upotrebu u lečenju kancera.

[0021] Solvat će tipično biti hidrat. Na taj način, gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat može biti u obliku soli ili hidrata. Može biti da gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat nije u obliku soli i/ili solvata (npr. hidrata). Poželjno, on je u obliku slobodne baze.

[0022] Gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat ima diastereoizomernu čistoću veću od 90%. On može imati diastereoizomernu čistoću veću od 95%, 98%, 99% ili čak 99.5%. ’Značajno diastereomerno čist’ je definisan za svrhe ovog pronalaska kao diatsreomerna čistoća veća od 90%.

[0023] Kancer može biti kancer izabran od: kancera pankreasa, kancera dojke, kancera jajnika, kancera bešike, kolorektalnog kancera, kancera pluća, kancera bešike, kancera prostate, holangiokarcinoma, kancera bubrega, cervikalnog kancera, kacera timusa, kancera nepoznatog porekla. Kancer takođe može biti limfom ili leukemija.

[0024] U ovo otkriće je uključen postupak obezbeđivanja najmanje jednog diastereoizomera gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata u značajno diastereoizomerno čistom obliku, pri čemu postupak sadrži korake:

dobijanja smeše gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfata 4 i gemcitabin-[fenilbenzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata 3;

podvrgavanje smeše tehnici odvajanja; i

pošto je odvojen, izolaciju gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfata 4 i/ili gemcitabin-[fenilbenzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata 3 u značajno diastereoizomerno čistom obliku.

[0025] Uključen u ovo otkriće je postupak za obezbeđivanje najmanje jednog diastereoizomera gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata u značajno diastereoizomerno čistom obliku, pri čemu postupak sadrži korake:

dobijanja smeše 3’-zaštićenog gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfata 4 i 3’-zaštićenog gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata 3;

podvrgavanja smeše tehnici odvajanja;

pošto je odvojen, izolacije 3’-zaštićenog gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfata 4 i/ili 3’-zaštićenog gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfata 3 u značajno diastereoizomerno čistom obliku;

uklanjanja 3’-zaštitne grupe iz jednog ili oba odvojena diastereoizomera da bi se obezbedio gemcitabin-[fenilbenzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfat 4 i/ili gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat 3 u značajno diastereoizomerno čistom obliku.

[0026] 3’-zaštićeni gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfat je derivat gemcitabin-[fenilbenzoksi-L-alaninil)]-fosfata u kome 3’-hidroksi grupa prikazuje hidroksil zaštitnu grupu. Dotična zaštitna grupa mora biti takva da se čisto može ukloniti. Primeri zaštitnih grupa obuhvataju silil zaštitne grupe (npr. terc-butildimetilsilil i trietilsilil) u kom slučaju zaštitna grupa može biti uklonjena upotrebom reagensa izabranog od TFA, HF, fluorosilicijumske kiseline i tetrabutilamonijum fluorida. Alternativna zaštitna grupa bi bila karbonatna grupa (npr. tercbutilkarbonat) u kom slučaju zaštitna grupa može biti uklonjena upotrebom Bronsted-ove kiseline (npr. TFA) ili Lewis-ove kiseline (npr. ZnBr2).

[0027] Tehnika odvajanja može biti hromatografija, npr. hromatografija na koloni, preparativna hromatografija na tankom sloju ili preparativna HPLC. Tamo gde je tehnika odvajanja preparativna HPLC, ona se može izvesti upotrebom hiralne kolone, npr. one koja sadrži amilozu tris (3,5-dimetilfenilkarbamat). Primer hiralne kolone korisne u postupku prema pronalasku je Chiralpak AD™; čija stacionarna faza se sastoji od 20 µm podloge od silike na kojoj je fizički obložen amiloza tris (3,5-dimetilfenilkarbamat).

[0028] Tehnika odvajanja može biti selektivni unos u rastvor ciklodekstrina. Ova tehnika obuhvata dovođenje u kontakt smeše sa rastvorom ciklodekstrina tako da je jedan epimer apsorbovan u rastvor ciklodekstrina preferencijalno u odnosu na drugi epimer, i zatim odvajanjem rastvora ciklodekstrina od nerastvorene čvrste supstance. Rastvor ciklodekstrina može biti vodeni rastvor ciklodekstrina. Odvajanje rastvora od čvrste supstance može se postići filtracijom.

[0029] Otkriće takođe daje gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfat 4:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili solvat. Pronalazak takođe daje farmaceutsku formulaciju koja sadrži gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfat 4, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili solvat, koji imaju diastereoizomernu čistoću veću od oko 90%, i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, kao i medicinske upotrebe jedinjenja 4 i postupke za lečenje upotrebom jedinjenja 4. Gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfat može biti u značajno diastereoizomerno čistom obliku. Može biti da gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfat nije so i/ili solvat (npr. hidrat). Poželjno, on je prisutan kao slobodna baza.

[0030] Pokazano je da R-epimer ima polu-život inkubacije sa izolovanim humanim hepatičnim ćelijama koji je četiri puta od onog kod S-epimera (videti Primer 4). Duži polu-život povezan sa R-izomerom ukazuje na niži intrinzički klirens i trebalo bi da rezultuje u različitom farmakokinetičkom i farmakodinamičkom profilu u odnosu na S-izomer. Ovaj profil može da označava višu i produženu koncentraciju R-izomera u sistemskoj cirkulaciji i stoga veće izlaganje R-epimeru nego što bi se postiglo sa S-epimerom. AUC za R-izomer bi prema tome trebalo da je veća, rezultujući u većem i dužem izlaganju ostatku, na primer, za oralni put rimene gde su efekti prvog prolaza izraženiji. Ovo produženo izlaganje R-epimeru bi trebalo da omogući značajno produženo izlaganje tumora R-epimeru i može da rezultuje u većoj efikasnosti, gde će redukovani metabolizam prvog prolaza u jetri rezultovati u višim koncentracijama leka. Ova različita osobina bi takođe mogla da omogući ciljno delovanje na specifične tumore gde duži PK profil može da rezultuje u većoj efikasnosti na tumorskim mestima kojima je teško prići gde je slaba vaskulatura. Produženo izlaganje R-epimeru može da osigura adekvatnu koncentraciju leka aktivnog metabolita preko više faza ćelijskog ciklusa, uključujući ćelijsku deobu.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0031] Primeri izvođenja prema pronalasku su dodatno opisani ovde u daljem tekstu u vezi sa priloženim crtežima, u kojima:

Slika 1 prikazuje hromatogram za odvajanje jedinjenja 3 i 4 pomoću HPLC upotrebom Chiralpak AD kolone i sistema gradijenta rastvarača n-heptana/IPA

Slika 2 prikazuje strukturu jedinjenja 4 kao što je određena rentgenskom difrakcijom

Slika 3 prikazuje strukturu jedinjenja 3 kao što je određena pomoću rentgenske difrakcije Slika 4 prikazuje 31P-NMR spektar (202 MHz, D2O) NUC-1031 izomerne smeše (3.12 mM), posle dodavanja HP-β-CD u 1:2.3 molarnom odnosu.

Slika 5 prikazuje HPLC tragove NUC-1031 (3.12 mM) u MeOH (A) u H2O posle dodavanja HP-β-CD u 1:2.3 molarnom odnosu (B).

DETALJAN OPIS

[0032] Kroz celu ovu specifikaciju, izraz S-epimer ili S-dijastereoizomer odnosi se na gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat. Slično tome, kroz celu ovu specifikaciju, izraz R-epimer ili R- dijastereoizomer odnosi se na gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(R)-fosfat.

[0033] Jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu biti korišćena u lečenju ljudskog tela. Ona se mogu koristiti u lečenju životinjskog tela. Naročito, jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu biti korišćena za lečenje komercijalnih životinja kao što je stoka. Alternativno, jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu biti korišćena za lečenje životinja kućnih ljubimaca kao što su mačke, psi, itd.

[0034] Jedinjenja prema pronalasku mogu da se dobijaju, skladište i/ili primenjuju u obliku farmaceutski prihvatljive soli. Pogodne farmaceutski prihvatljive soli uključuju, ali nisu ograničene na, soli farmaceutski prihvatljivih neorganskih kiselina kao što su soli hlorovodonične, sumporne, fosforne, azotne, ugljene, borne, sulfaminske, bromovodonične kiseline, ili soli farmaceutski prihvatljivih organskih kiselina kao što su sirćetna, propionska, buterna, vinska, maleinska, hidroksimaleinska, fumarna, jabučna, limunska, mlečna, sluzna, glukonska, benzoeva, ćilibarna, oksalna, fenilsirćetna, metansulfonska, toluensulfonska, benzensulfonska, salicilna, sulfanilinska, asparaginska, glutaminska, EDTA, stearinska, palmitinska, oleinska, laurinska, pantotenska, taninska, askorbinska i valerna kiselina. Pogodne bazne soli se obrazuju od baza koje formiraju netoksične soli. Primeri uključuju soli aluminijuma, arginina, benzatina, kalcijuma, holina, dietilamina, diolamina, glicina, lizina, magnezijuma, meglumina, olamina, kalijuma, natrijuma, trometamina i cinka. Takođe mogu da se obrazuju hemi-soli kiselina i baza, na primer, soli hemisulfata, hemioksalata i hemikalcijuma. U nekim primerima izvođenja, naročito u onima gde se koristi s-epimer, jedinjenje je u obliku soli HCl soli ili soli hemioksalata.

[0035] Jedinjenja prema pronalasku mogu da postoje u vidu pojedinačnog kristalnog oblika ili u smeši kristalnih oblika, ili mogu da budu amorfne. Dakle, jedinjenja prema pronalasku, namenjena za farmaceutsku upotrebu, mogu da se primenjuju kao kristalni ili amorfni proizvodi. Mogu da se dobiju, na primer, kao čvrsta punjenja, praškovi, ili filmovi, postupcima kao što su precipitacija, kristalizacija, sušenje zamrzavanjem, ili sušenje raspršivanjem, ili sušenje uparavanjem. U ovom cilju mogu da se koriste i mikrotalasno ili radiofrekventno sušenje.

[0036] Za prethodno u tekstu pomenuta jedinjenja prema pronalasku, primenjena doza će, naravno, varirati, u zavisnosti od upotrebljenog jedinjenja, načina primene, željenog tretmana i naznačenog poremećaja. Na primer, ako se jedinjenje prema pronalasku primeni parenteralno, onda doza jedinjenja prema pronalasku može da bude u opsegu od 0.1 do 5 g/m<2>, npr. od 0.5 do 2 g/m<2>. Veličina doze jedinjenje prema pronalasku koja se koristi u terapeutske svrhe, normalno će varirati, prema dobro poznatim principima medicine, u skladu sa prirodom i ozbiljnošću stanja, starosnom dobi i polom životinje ili pacijenta, i rutom primene.

[0037] Očekuje se da se nivoi doziranja, učestalost doze i trajanje lečenja za jedinjenja prema pronalasku, razlikuju u zavisnosti od formulacije i kliničke indikacije, starosne dobi i komorbidnih medicinskih stanja pacijenta.

[0038] Jedinjenje prema pronalasku, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, mogu da se koriste samostalno ali će se generalno primenjivati u obliku farmaceutske kompozicije u kojoj su jedinjenja prema pronalasku, ili njihova farmaceutski prihvatljiva so, u asocijaciji sa farmaceutski prihvatljivim adjuvansom, razblaživačem ili nosačem. Konvencionalni postupci za odabir i pripremu pogodnih farmaceutskih formulacija opisani su u, na primer, "Pharmaceuticals - The Science of Dosage Form Designs", M. E. Aulton, Churchill Livingstone, 1988.

[0039] U zavisnosti od načina primene jedinjenja prema pronalasku, farmaceutska kompozicija koja se koristi kako bi se primenilo jedinjenja prema pronalasku poželjno će sadržavati od 0.05 do 99 %tež. (procenata po težini) jedinjenja prema pronalasku, poželjnije od 0.05 do 80 %tež. jedinjenja prema pronalasku, još poželjnije od 0.10 do 70 %tež. jedinjenja prema pronalasku, i još više poželjno od 0.10 do 50 %tež. jedinjenja prema pronalasku, gde se svi procenti po težini baziraju na ukupnoj kompoziciji.

[0040] U cilju oralne primene, jedinjenja prema pronalasku mogu da se mešaju sa adjuvansom ili nosačem, na primer, laktozom, saharozom, sorbitolom, manitolom; skrobom, na primer, krompirovim skrobom, kukuruznim skrobom ili amilopektinom; derivatom celuloze; vezujućim sredstvom, na primer, želatinom ili polivinilpirolidonom; i/ili lubrikantom, na primer, magnezijum stearatom, kalcijum stearatom, polietilen glikolom, voskom, parafinom, i slično, a zatim komprimuje u tablete. Ako su neophodne obložene tablete, jezgro, pripremljeno na način opisan prethodno u tekstu, mogu da budu obložene koncentrovanim rastvorom šećera, koji može da sadrži, na primer, gumi arabiku, želatin, talk i titanijum dioksid. Alternativno, tableta može da bude obložena pogodnim polimerom rastvorenim u lako isparljivom organskom rastvaraču.

[0041] Za pripremu mekih želatinskih kapsula, jedinjenja prema pronalasku mogu da se mešaju sa, na primer, biljnim uljem ili polietilen glikolom. Tvrde želatinske kapsule mogu da sadrže granule jedinjenja uz upotrebu bilo kog od prethodno pomenutih ekscipijenasa za tablete. Tvrde želatinske kapsule takođe mogu da se pune tečnim ili polu-čvrstim formulacijama jedinjenja prema pronalasku.

[0042] Tečne preparacije za oralnu primenu mogu da budu u obliku sirupa ili suspenzija, na primer, pri čemu rastvori sadrže jedinjenje prema pronalasku, a ravnoteža je šećer i smeša etanola, vode, glicerola i propilen glikola. Ovakve tečne preparacije mogu izborno da sadrže sredstva za bojenje, arome, zaslađivače (kao što je saharin), konzervanse i/ili karboksimetilcelulozu kao sredstvo za zgušnjavanje, ili druge ekscipijense poznate stručnjacima u oblasti.

[0043] U cilju parenteralne (npr. intravenske) primene, jedinjenja prema pronalasku mogu da se primene kao sterilni vodeni ili uljani rastvor. Jedinjenja prema pronalasku su veoma lipofilna. Vodene formulacije će, stoga, uobičajeno, takođe da sadrže farmaceutski prihvatljiv polarni organski rastvarač.

[0044] Pokazano je da ciklodekstrini nalaze široku upotrebu u isporuci leka (Rasheed et al, Sci. Pharm., 2008, 76, 567-598). Ciklodekstrini su familija cikličnih oligosaharida. Oni deluju kao ’molekularni kavez’ koji inkapsulira molekule leka i menja osobine tih molekula leka kao što je rastvorljivost. Ciklodekstrini sadrže (α-1,4)-vezane α-D-glukopiranozne jedinice. Ciklodekstrini mogu da sadrže 6, 7 ili 8 glukopiranoznih jedinica (označeni kao α-, β- i γ-ciklodekstrini respektivno). Ciklodekstrini korišćeni u farmaceutskim formulacijama su često β-ciklodekstrini. Viseće hidroksil grupe mogu biti alkilovane sa C1-C6supstituisanom ili nesupstituisanom alkil grupom. Primeri ciklodekstrina su α-ciklodekstrin, β-ciklodekstrin, γ-ciklodekstrin, 2-hidroksipropil-β-ciklodekstrin (HP-β-CD), sulfobutiletar β-ciklodekstrin natrijumova so, naročito metilovani β-ciklodekstrin.

[0045] Veličina doze jedinjenje prema pronalasku koja se koristi u terapeutske svrhe, normalno će varirati, prema dobro poznatim principima medicine, u skladu sa prirodom i ozbiljnošću stanja, starosnom dobi i polom životinje ili pacijenta, i rutom primene.

[0046] Očekuje se da se nivoi doziranja, učestalost doze i trajanje lečenja za jedinjenja prema pronalasku, razlikuju u zavisnosti od formulacije i kliničke indikacije, starosne dobi i komorbidnih medicinskih stanja pacijenta.

[0047] Predmetni pronalazak takođe obuhvata farmaceutski prihvatljive izotopski obeležene oblike jedinjenja 3 ili 4, pri čemu su jedan ili više atoma zamenjeni atomima koji imaju isti atomski broj, ali atomska masa ili maseni broj je različit od atomske mase ili masenog broja preovlađujućeg izotopa koji se uobičajeno nalazi u prirodi.

[0048] Primeri izotopa pogodnih za uključivanje u jedinjenja pronalaska uključuju izotope vodonika, kao što su<2>H i<3>H, ugljenika, kao što su<11>C,<13>C i<14>C, hlora, kao što je<36>Cl, fluora, kao što je<18>F, joda, kao što su<123>I i<125>I, azota, kao što su<13>N i<15>N, kiseonika, kao što su<15>O,<17>O i<18>O, fosfora, kao što je<32>P, i sumpora, kao što je<35>S.

[0049] Određena izotopski obeležena jedinjenja, na primer, ona koja inkorporiraju radioaktivni izotop, korisna su u studijama distribucije leka i/ili supstrata u tkivu. Radioaktivni izotopi tricijum, tj.3H, i ugljenik-14, tj.<14>C, su posebno korisni u ovu svrhu s obzirom na njihovu lakoću inkorporacije i spremna sredstva za detekciju.

[0050] Zamena sa težim izotopima kao što je deuterijum, tj.<2>H, može pružiti određene terapijske prednosti koje rezultiraju, od veće metaboličke stabilnosti, na primer, povećanog in vivo poluživota ili smanjenih potreba za doziranjem, i samim tim mogu biti poželjniji u nekim okolnostima.

[0051] Zamena sa izotopima koji emituju pozitron, kao što su<11>C,<18>F,<15>O i<13>N, može biti korisna u studijama pozitron emisione tomografije (Positron Emission Tomography - PET) za ispitivanje zauzetosti receptora supstrata.

[0052] Izotopski obeležena jedinjenja se mogu uopšteno pripremiti konvencionalnim tehnikama poznatim iskusnima u struci ili postupcima analognim onima opisanim upotrebom odgovarajućeg izotopski obeleženog reagensa umesto neobleženog reagensa koji je prethodno korišćen.

[0053] Postupak lečenja ili jedinjenje za upotrebu u lečenju kancera može da uključi, pored jedinjenja prema pronalasku, konvencionalnu hirurgiju ili radioterapiju ili hemioterapiju. Ta hemioterapija može da uključuje primenu jednog ili više drugih aktivnih sredstava.

[0054] Tamo gde je dodatno aktivno sredstvo primenjeno kao deo postupka za lečenje prema pronalasku, takav kombinovani tretman se može postići pomoću istovremenog, uzastopnog ili odvojenog doziranja pojedinačnih komponenti tretmana. Takvi kombinovani proizvodi koriste jedinjenja prema ovom pronalasku unutar terapeutski efikasnog opsega doza opisanog ovde u prethodnom tekstu i jedan ili više drugih farmaceutski aktivnih sredstava unutar njihovog odobrenog opsega doza.

[0055] Dakle, farmaceutske formulacije prema pronalasku mogu da sadrže drugo aktivno sredstvo.

[0056] Jedno, ili više drugih aktivnih sredstava, mogu da budu u jednoj ili više sledećih kategorija antitumorskih sredstava:

(i) antiproliferativni/antineoplastični lekovi i njihove kombinacije, kao što su alkilirajuća sredstva (na primer ciklofosfamid, azotni iperit, bendamustin, melfalan, hlorambucil, busulfan, temozolamid i nitrozouree); antimetaboliti (na primer gemcitabin i antifolati kao što su fluoropirimidini kao 5-fluorouracil i tegafur, raltitreksed, metotreksat, pemetreksed, citozin arabinozid i hidroksiurea); antibiotici (na primer antraciklini kao što su adriamicin, bleomicin, doksorubicin, daunomicin, epirubicin, idarubicin, mitomicin-C, daktinomicin i mitramicin); antimitotička sredstva (na primer alkaloidi vinke kao vinkristin, vinblastin, vindezin i vinorelbin i taksoidi kao taksol i taksoter i inhibitori polokinaze); inhibitori proteazoma, na primer karfilzomib i bortezomib; interferonska terapija; i inhibitori topoizomeraza (na primer epipodofilotoksini kao etopozid i tenipozid, amsakrin, topotekan, mitoksantron i kamptotecin);

(ii) citostatička sredstva kao što su antiestrogeni (na primer tamoksifen, fulvestrant, toremifen, raloksifen, droloksifen i jodoksifen), antiandrogeni (na primer bikalutamid, flutamid, nilutamid i ciproteron acetat), antagonisti LHRH ili agonisti LHRH (na primer goserelin, leuprorelin i buserelin), progestogeni (na primer megestrol acetat), inhibitori aromataza (na primer kao anastrozol, letrozol, vorazol i eksemestan) i inhibitori 5αreduktaza kao finasterid;

(iii) anti-invaziona sredstva, na primer dasatinib i bosutinib (SKI-606), i inhibitori metaloproteinaza, inhibitori receptorske funkcije urokinaznog aktivatora plazminogena ili antitela na heparanazu;

(iv) inhibitori funkcije faktora rasta: na primer ti inhibitori uključuju antitela na faktore rasta i antitela na receptore faktora rasta, na primer anti-erbB2 antitelo trastuzumab [Herceptin™], anti-EGFR antitelo panitumumab, anti-erbB1 antitelo cetuksimab, inhibitore tirozin kinaza, na primer inhibitore familije epidermalnog faktora rasta (na primer inhibitori tirozin kinaze EGFR familije kao što su gefitinib, erlotinib i 6-akrilamido-N-(3-hloro-4-fluorofenil)-7-(3-morfolinopropoksi)-hinazolin-4-amin (Cl 1033), inhibitori tirozin kinaza erbB2 kao što je lapatinib); inhibitori familije faktora rasta hepatocita; inhibitori familije insulinskih faktora rasta; modulatori proteinskih regulatora apoptoze ćelija (na primer inhibitori Bcl-2); inhibitori familije trombocitnih faktora rasta kao što su imatinib i/ili nilotinib (AMN107); inhibitori serin/treonin kinaza (na primer inhibitori Ras/Raf signalnog puta kao što su inhibitori farnezil transferaze, na primer sorafenib, tipifarnib i lonafarnib), inhibitori ćelijskih signalnih puteva preko MEK i/ili AKT kinaza, inhibitori c-kit, inhibitori abl kinaze, inhibitori PI3 kinaze, inhibitori Plt3 kinaze, inhibitori CSF-1R kinaze, inhibitori kinaze IGF receptora; inhibitori aurora kinaze i inhibitori ciklin-zavisne kinaze kao što su inhibitori CDK2 i/ili CDK4;

(v) antiangiogenetska sredstva kao što su sredstva koja inhibiraju efekte faktora rasta vaskularnog endotela, [na primer, antitelo protiv faktora rasta vaskularnih endotelnih ćelija, bevacizumab (Avastin™); talidomid; lenalidomid; i, na primer, inhibitor tirozin kinaze VEGF receptora, kao što su vandetanib, vatalanib, sunitinib, aksitinib i pazopanib;

(vi) pristupi genske terapije, uključujući, na primer, pristupe zamene aberantnih gena kao što je aberantni p53 ili aberantni BRCA1 ili BRCA2;

(vii) imunoterapijski pristupi, uključujući, na primer, terapiju antitelima kao što su alemtuzumab, rituksimab, ibritumomab, tiuksetan (Zevalin®) i ofatumumab; interferoni kao što je interferon α; interleukini kao što je IL-2 (aldesleukin); inhibitori interleukina, na primer, IRAK4 inhibitori; vakcine protiv raka, uključujući vakcine za profilaksu i lečenje kao što su HPV vakcine, na primer Gardasil, Cervariks, Onkofag i Sipuleucel-T (Provenge); i modulatori toll-u sličnih receptora, na primer agonisti TLR-7 ili TLR-9; i

(viii) citotoksična sredstva, na primer fludaribin (fludara), kladribin, pentostatin (Nipent™);

(ix) steroidi kao što su kortikosteroidi, uključujući glukokortikoide i mineralokortikoide, na primer aklometazon, aklometazon dipropionat, aldosteron, amcinonid, beklometazon, beklometazon dipropionat, betametazon, betametazon dipropionat, betametazon natrijum fosfat, betametazon valerat, budesonid, klobetazon, klobetazon butirat, klobetazol propionat, kloprednol, kortizon, kortizon acetat, kortivazol, deoksikorton, dezonid, dezoksimetazon, deksametazon, deksametazon natrijum fosfat, deksametazon izonikotinat, difluorokortolon, fluklorolon, flumetazon, flunisolid, fluocinolon, fluocinolon acetonid, fluocinonid, fluokortin butil, fluorokortizon, fluorokortolon, fluokortolon kaproat, fluokortolon pivalat, fluorometolon, flupredniden, flupredniden acetat, flurandrenolon, flutikazon, flutikazon propionat, halcinonid, hidrokortizon, hidrokortizon acetat, hidrokortizon butirat, hidrokortizon aceponat, hidrokortizon buteprat, hidrokortizon valerat, ikometazon, ikometazon enbutat, meprednizon, metilprednizolon, mometazon parametazon, mometazon furoat monohidrat, prednikarbat, prednizolon, prednizon, tiksokortol, tiksokortol pivalat, triamcinolon, triamcinolon acetonid, triamcinolon alkohol i njihovi respektivni farmaceutski prihvatljivi derivati. Može da se koristi kombinacija steroida, na primer kombinacija dva ili više steroida koji su pomenuti u ovom odeljku;

(x) usmerene terapije, na primer PI3Kd inhibitori, na primer idelalisib i perifosin; ili jedinjenja koja inhibiraju PD-1, PD-L1 i CAR T.

[0057] Jedno ili više drugih aktivnih sredstva mogu takođe da budu antibiotici (na primer antraciklini kao što su adriamicin, bleomicin, doksorubicin, daunomicin, epirubicin, idarubicin, mitomicin-C, daktinomicin i mitramicin).

[0058] U čitavom opisu i patentnim zahtevima ove specifikacije, reči "sadrže" i "čine" i njihove varijacije znače "uključujući ali nije ograničeno na", i one nisu namenjene da (i ne) isključuju druge delove, aditive, komponente, cele brojeve ili korake. U čitavom opisu i patentnim zahtevima ove specifikacije, jednina obuhvata množinu osim ukoliko kontekst ne zahteva drugačije. Posebno, gde se upotrebljava neodređeni član, specifikaciju treba razumeti kao razmatranje množine kao i jednine, osim ukoliko kontekst ne zahteva drugačije.

[0059] Odlike, celi brojevi, karakteristike, jedinjenja, hemijski oblici ili grupe opisani u vezi sa posebnim aspektom, primerom izvođenja ili primerom pronalaska treba razumeti tako da su primenljivi na bilo koji drugi aspekt, primer izvođenja ili primer koji su ovde opisani osim ukoliko su sa njima nekompatibilni. Sve od odlika koje su objavljene u ovoj specifikaciji (uključujući bilo koje prateće patentne zahteve, apstrakt i crteže), i/ili svi od koraka bilo koje metode ili postupka koji su tako objavljeni, mogu se kombinovati u bilo kojoj kombinaciji, osim kombinacija gde se makar neke od takvih odlika i/ili koraka međusobno isključuju. Pronalazak nije ograničen na detalje bilo kojih prethodnih primera izvođenja. Pronalazak se proširuje na bilo koju novu ili bilo koju novu kombinaciju odlika objavljenih u ovoj specifikaciji (uključujući bilo koje prateće patentne zahteve, apstrakt i crteže), ili na bilo koju novu, ili bilo koju novu kombinaciju koraka bilo koje metode ili postupka koji su tako objavljeni.

[0060] Pažnja čitaoca je usmerena na sve naučne radove i dokumente koji su podneti istovremeno sa ili pre ove specifikacije u vezi sa ovom prijavom i koji su otvoreni za javni uvid sa ovom specifikacijom i sadržaj svih tih radova i dokumenata je obuhvaćen ovde referencom.

[0061] Sledeće skraćenice se upotrebljavaju u ovoj specifikaciji:

DMF - N,N-dimetilformamid DMSO -dimetilsulfoksid

IPA – izopropil alkohol NMP - N-metilpiroldinon

PEG – polietilen glikol TBDMS - terc-butildimetilsilil

TFA – trifluorosirćetna kiselina

Primer 1

[0062] (R) i (S) izomeri su odvojeni pomoću HPLC pod sledećim uslovima:

Oprema: Agilent 1200™ serija sa DAD detektorom

Stopa protoka: 1.0 mL/min

Kolona: Chiralpak AD™; 250 x 4.6 mm ID (normalna faza)

Temperatura: sredine

Veličina čestica: 20 µm

Punjenje: rastvoreno u MeOH; 10g/L

Rastvarač: n-heptan/IPA 10 ->50% IPA

Hromatogram je prikazan na slici 1. (S)-epimer eluiran na 8.6 min i (R)-epimer eluiran na 10.3 minuta.

[0063] Postupci i materijali za karakterizaciju: Proton (1H), ugljenik (13C), fosfor (31P) i fluor (19F) NMR spektri snimljeni su na Bruker Avance 500 spektrometru na 25°C. Spektri su automatski kalibrisani do pika deuterisanog rastvarača i svi<13>C NMR i<31>P NMR su protondekuplovani. Čistoća krajnjih jedinjenja je verifikovana da bude >95% HPLC analizom upotrebom Varian Polaris C18-A (10 μM) kao analitičke kolone sa gradijentnom elucijom H2O/MeOH od 100/0 do 0/100 za 35 min. HPLC analiza sprovedena je pomoću Varian Prostar (LC Workstation-Varian prostar 335 LC detektor).

2’-dezoksi-2’,2’-difluoro-D-citidin-5’-O-[fenil(benziloksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat 3

[0064]

(ES+) m/z, pronađeno: (M Na<+>) 603,14. C25H27F2N4O8NaP potrebno: (M+) 580,47.

<31>P NMR (202 MHz, MeOD): δP3,66

<1>H NMR (500 MHz, MeOD): δH7,58 (d, J = 7,5 Hz, 1H, H-6), 7,38 - 7,32 (m, 7H, ArH), 7,26 -7,20 (m, 3H, ArH), 6,24 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H-1’), 5,84 (d, J = 7,5 Hz, 1H, H-5), 5,20 (AB sistem, JAB= 12,0 Hz, 2H, OCH2Ph), 4,46 - 4,43 (m,1H, H-5’), 4,36 - 4,31 (m, 1H, H-5’), 4,25 -4,19 (m, 1H, H-3’), 4,07 - 4,00 (m, 2H, H-4’, CHCH3), 1,38 (d, J = 7,2 Hz, 3H, CHCH3).

<19>F NMR (470 MHz, MeOD): δF- 118,0 (d, J = 241 Hz, F), - 120,24 (široko d, J = 241 Hz, F).

<13>C NMR (125 MHz, MeOD): δC174.61 (d, 3JC-P= 5,0 Hz, C=O, estar), 167,63 (C-NH2), 157,74 (C=O baza), 152,10 (d, 2JC-P= 7,0 Hz, C-Ar), 142,40 (CH-baza), 137,22 (C-Ar), 130,90, 129,63, 129,39, 129,32, 126,32 (CH-Ar), 124,51 (d, 1JC-F= 257 Hz, CF2), 121,47, 121,43 (CH-Ar), 96,67 (CH-baza), 85,92 (široki signal, C-1’), 80,31 (C-4’), 71,27 (očigledno t,<2>JC-F= 23,7 Hz, C-3’), 68,03 (OCH 2

2Ph), 65,73 (d, JC-P= 5,30 Hz, C-5’), 51,66 (CHCH3), 20,42 (d, 3JC-P= 6,25 Hz, CHCH3).

[0065] HPLC na reverznim fazama, eluiranjem sa H2O/MeOH od 100/0 do 0/100 za 35 min, pokazala je jedan pik dijastereoizomera sa tR= 22,53 min.

2’-dezoksi-2’,2’-difluoro-D-citidin-5’-O-[fenil(benziloksi-L-alaninil)]-(R)-fosfat 4

[0066] (ES+) m/z, pronađeno: (M Na<+>) 603,14. C25H27F2N4O8NaP potrebno: (M+) 580,47.<31>P NMR (202 MHz, MeOD): δP3,83

<1>H NMR (500 MHz, MeOD): δH7,56 (d, J = 7,5 Hz, 1H, H-6), 7,38 - 7,31 (m, 7H, ArH), 7,23 -7,19 (m, 3H, ArH), 6,26 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H-1’), 5,88 (d, J = 7,5 Hz, 1H, H-5), 5,20 (s, 2H, OCH2Ph), 4,49 - 4,46 (m, 1H, H-5’), 4,38 - 4,34 (m, 1H, H-5’), 4,23 - 4,17 (m, 1H, H-3’), 4,07 -4,01 (m, 2H, H-4’, CHCH3), 1,38 (d, J = 7,2 Hz, 3H, CHCH3).

<19>F NMR (470 MHz, MeOD): δF- 118,3 (d, J = 241 Hz, F), - 120,38 (široko d, J = 241 Hz, F).

<13>C NMR (125 MHz, MeOD): δC174,65 (d, 3JC-P= 5,0 Hz, C=O, estar), 167,65 (C-NH2), 157,75 (C=O baza), 152,10 (d, 2JC-P= 7,0 Hz, C-Ar), 142,28 (CH-baza), 137,50 (C-Ar), 130,86, 129,63, 129,40, 129,32, 126,31 (CH-Ar), 124,50 (d, 1JC-F= 257 Hz, CF2), 121,44, 121,40 (CH-Ar), 96,67 (CH-baza), 85,90 (široki signal, C-1’), 80,27 (C-4’), 71,30 (očigledno t,<2>JC-F= 23,7 Hz, C-3’), 68,02 (OCH2Ph), 65,50 (C-5’), 51,83 (CHCH3), 20,22 (d, 3JC-P= 7,5 Hz, CHCH3).

HPLC na reverznim fazama, eluiranjem sa H2O/MeOH od 100/0 do 0/100 za 35 min, pokazala je jedan pik dijastereoizomera sa tR= 21,87 min.

[0067] Podaci rentgenske difrakcije su takođe dobijeni za dva izomera i dobijene slike su prikazane na Slikama 2 i 3. Odgovarajući difrakcioni podaci i metodologija su obezeđeni u Tabelama 1 do 4 niže.

Tabela 1. Podaci o kristalu i rafinisanje strukture za (R)-epimer 4.

Identifikaciona šifra shelx

Empirijska formula C25H27F2N4O8P

Težina formule 580.47

Temperatura 296(2) K

Talasna dužina 1.54184 Å

Kristalni sistem monoklinički

Prostorna grupa C 2

Dimenzije jedinične ćelije a = 19.2280(3) Å α= 90°.

b = 10.22330(10) Å β= 97.966(2)°

c = 13.6911(2) Å γ = 90°.

Zapremina 2665.34(6) Å3

Z 4

Gustina (izračunata) 1.447 Mg/m<3>

Koeficijent apsorpcije 1.541 mm-1

F(000) 1208

Veličina kristala 0.584 x 0.095 x 0.051 mm<3>

Teta opseg za sakupljanje podataka 3.259 do 73.477°.

Opsezi indeksa -23<=h<=23, -12<=k<=12, -17<=l<=13

Sakupljene refleksije 9684

Nezavisne refleksije 5150 [R(int) = 0.0239]

Kompletnost do teta = 67.684° 99.9 %

Ispravka apsorpcije polu-empirijska od ekvivalenata

Maks. i min. transmisija 1.00000 i 0.61719

Postupak rafinisanja najmanji kvadrati potpune-matrice na F2

Podaci / ograničenja/ parametri 5150 / 549 / 437

Podobnost na F21.065

Finalni R indeksi [I>2sigma(I)] R1 = 0.0646, wR2 = 0.1759

R indeksi (svi podaci) R1 = 0.0681, wR2 = 0.1793

Apsolutni strukturni parametar 0.039(10)

Ekstinkcioni koeficijent n/a

Najveći dif. pik i rupa 0.477 i -0.917 e.Å<-3>

Tabela 2. Atomske koordinate (x 104) i ekvivalentni parametri izotropskog premeštanja (Å2x 103) za (R)-epimer 4.

U(eq) je definisan kao jedna trećina traga ortogonalizovanog Uij tenzora

x y z U(eq)

N(1) 746(2) 9565(4) 4120(3) 35(1)

C(1) 1373(2) 10267(5) 4426(4) 40(1)

C(2) 779(3) 12200(5) 4030(4) 40(1)

C(3) 131(3) 11526(5) 3717(4) 45(1)

C(4) 141(3) 10216(5) 3785(4) 39(1)

C(5) 723(2) 8163(4) 4257(4) 33(1)

C(6) 1301(2) 6686(5) 5412(3) 34(1)

C(7) 1730(2) 6675(4) 4553(3) 33(1)

C(8) 1228(3) 7319(5) 3735(4) 37(1)

C(9) 1755(3) 6761(6) 6387(4) 43(1)

C(10) 1727(3) 3180(6) 7861(5) 50(1)

C(11) 1763(4) 2447(7) 7027(5) 61(2)

C(12) 1751(4) 1097(8) 7088(7) 75(2)

C(13) 1724(5) 533(8) 7970(9) 94(3)

C(14) 1685(6) 1247(9) 8799(8) 97(3)

C(15) 1693(5) 2625(8) 8758(6) 78(2)

P(1) 1047(1) 5375(1) 7561(1) 43(1)

F(1) 1535(2) 7981(3) 3064(2) 54(1)

F(2) 828(2) 6372(3) 3227(2) 54(1)

N(2) 792(3) 13496(4) 3968(4) 53(1)

N(3) 1370(2) 11570(4) 4362(4) 44(1)

O(1) 1897(2) 9608(4) 4734(4) 54(1)

O(2) 868(2) 7849(4) 5276(3) 42(1)

O(3) 1921(2) 5414(4) 4294(3) 42(1)

U(eq) je definisan kao jedna trećina traga ortogonalizovanog Uij tenzora x y z U(eq) O(4) 1354(2) 6700(4) 7211(3) 48(1) O(5) 1755(2) 4556(4) 7796(3) 51(1) O(6) 514(2) 4743(5) 6869(4) 63(1) N(4) 789(3) 5715(6) 8600(5) 69(1) O(7) 595(5) 5712(9) 10681(7) 76(1) O(8) 1614(5) 4778(9) 10851(7) 73(1) C(16) 1339(8) 6191(13) 9486(10) 72(1) C(17) 1345(8) 7650(14) 9611(10) 75(1) C(18) 1162(8) 5543(19) 10418(11) 73(1) C(19) 1420(3) 4227(5) 11796(4) 74(1) C(20) 1213(3) 2833(5) 11556(4) 74(1) C(21) 1737(3) 1889(5) 11701(4) 74(1) C(22) 1562(3) 570(5) 11626(4) 74(1) C(23) 863(3) 195(5) 11406(4) 73(1) C(24) 339(3) 1139(5) 11261(4) 74(1) C(25) 514(3) 2458(5) 11336(4) 74(1) N(4A) 789(3) 5715(6) 8600(5) 69(1) O(7A) 643(8) 6651(15) 10878(10) 71(1) O(8A) 1156(10) 4892(18) 10491(12) 73(1) C(16A) 1034(13) 6570(20) 9296(16) 72(1) C(17A) 797(12) 7900(20) 9187(16) 74(2) C(18A) 945(13) 6100(20) 10317(17) 72(1) C(19A) 974(5) 4324(9) 11444(7) 74(1) C(20A) 986(5) 2873(9) 11442(7) 74(1) C(21A) 1654(5) 2345(9) 11684(7) 74(1) C(22A) 1747(5) 996(9) 11687(7) 74(1) C(23A) 1172(5) 176(9) 11448(7) 74(1) C(24A) 504(5) 704(9) 11206(7) 74(1) C(25A) 411(5) 2052(9) 11203(7) 74(1) Tabela 3. Podaci o kristalu i rafinisanje strukture za (S)-epimer 3.

Identifikaciona šifra shelx

Empirijska formula C25.29 H26.44F2N4.14O8P

Težina formule 585.44

Temperatura 293(2) K

Talasna dužina 1.54184 Å

Kristalni sistem monoklinički

Prostorna grupa P 21

Dimenzije jedinične ćelije a = 11.3844(3) Å α= 90°.

b = 34.8283(7) Å β= 111.282(4)° c = 15.1260(6) Å γ = 90°.

Zapremina 5588.5(3) Å3

Z 8

Gustina (izračunata) 1.392 Mg/m<3>

Koeficijent apsorpcije 1.477 mm-1

F(000) 2434

Veličina kristala 0.249 x 0.072 x 0.042 mm<3>

Teta opseg za sakupljanje podataka 3.135 do 73.481°.

Opsezi indeksa -13<=h<=12, -42<=k<=42, -17<=l<=18 Sakupljene refleksije 43816

Nezavisne refleksije 21792 [R(int) = 0.0582]

Kompletnost do teta = 67.684° 100.0 %

Ispravka apsorpcije polu-empirijska od ekvivalenata

Maks. i min. transmisija 1.00000 i 0.62509

Postupak rafinisanja najmanji kvadrati potpune-matrice na F2 Podaci / ograničenja/ parametri 21792 / 2 / 1478

Podobnost na F21.022

Finalni R indeksi [I>2sigma(I)] R1 = 0.0628, wR2 = 0.1597

R indeksi (svi podaci) R1 = 0.0921, wR2 = 0.1794

Apsolutni strukturni parametar 0.031(13)

Ekstinkcioni koeficijent n/a

Najveći dif. pik i rupa 0.513 i -0.413 e.Å<-3>

Tabela 4. Atomske koordinate (x 104) ekvivalentni parametri izotropskog premeštanja (Å<2>x 103) za (S)-epimer 3.

U(eq) je definisan kao jedna trećina traga ortogonalizovanog Uij tenzora

x y z U(eq)

C(1) -2481(7) 1599(2) 6585(6) 35(2)

C(2) -4079(6) 1825(2) 7037(5) 36(2)

C(3) -3292(7) 2138(2) 7558(6) 40(2)

C(4) -2138(7) 2159(2) 7573(6) 40(2)

C(5) -417(6) 1916(2) 7113(6) 37(2)

C(6) 1520(6) 2176(2) 7885(6) 37(2)

C(7) 1182(7) 2311(2) 6853(6) 41(2)

C(8) -198(7) 2183(2) 6399(6) 42(2)

C(9) 2187(7) 2464(2) 8638(6) 40(2)

C(10) -428(7) 3331(2) 8699(6) 42(2)

C(11) -661(8) 3061(2) 9279(7) 52(2)

C(12) -1894(8) 2980(2) 9149(8) 53(2)

C(13) -2880(8) 3159(3) 8495(7) 59(2)

C(14) -2631(9) 3426(4) 7913(9) 71(3)

C(15) -1403(9) 3517(3) 8012(7) 61(2)

C(16) 3026(7) 3528(2) 8008(6) 44(2)

C(17) 4074(8) 3825(2) 8156(7) 52(2)

C(18) 3226(7) 3213(2) 7405(6) 46(2)

C(19) 2875(10) 3054(3) 5787(8) 65(3)

C(20) 4128(8) 3142(2) 5690(6) 46(2)

C(21) 4412(9) 3504(2) 5462(6) 48(2)

C(22) 5504(9) 3580(3) 5340(7) 59(2)

U(eq) je definisan kao jedna trećina traga ortogonalizovanog Uij tenzora x y z U(eq) C(23) 6360(9) 3281(3) 5425(8) 67(3) C(24) 6068(10) 2917(3) 5643(9) 73(3) C(25) 4979(10) 2851(3) 5777(7) 62(2) N(1) -1680(6) 1893(2) 7097(5) 36(1) N(2) -3652(6) 1572(2) 6561(5) 38(1) N(3) -5247(6) 1787(2) 7003(6) 50(2) N(4) 3092(6) 3390(2) 8954(5) 44(2) O(1) -2035(5) 1369(2) 6152(5) 49(1) O(2) 360(5) 2074(1) 7991(4) 39(1) O(3) 1997(5) 2165(2) 6434(5) 50(2) O(4) 1475(5) 2819(1) 8445(4) 39(1) O(5) 805(5) 3441(1) 8776(4) 41(1) O(6) 2374(5) 3056(2) 10168(4) 43(1) O(7) 3851(6) 2925(2) 7682(5) 51(1) O(8) 2644(6) 3304(2) 6471(5) 57(2) P(1) 1979(2) 3167(1) 9166(1) 38(1) F(1) -960(4) 2496(2) 6274(4) 56(1) F(2) -474(5) 2023(2) 5530(4) 62(1) C(26) -2061(6) 6176(2) 4177(5) 33(1) C(27) -3538(6) 5940(2) 4770(6) 35(2) C(28) -2710(7) 5634(2) 5256(6) 38(2) C(29) -1565(7) 5637(2) 5238(6) 38(2) C(30) 84(6) 5918(2) 4754(5) 32(1) C(31) 1757(6) 5545(2) 4799(6) 34(2) C(32) 2320(6) 5811(2) 5667(5) 34(2) C(33) 1125(7) 6014(2) 5697(6) 38(2) C(34) 2224(7) 5144(2) 4906(6) 35(2) C(35) 882(8) 4453(2) 6664(7) 50(2) C(36) 404(11) 4719(4) 7049(10) 78(3) U(eq) je definisan kao jedna trećina traga ortogonalizovanog Uij tenzora x y z U(eq) C(37) -867(11) 4722(4) 6911(10) 88(4) C(38) -1658(11) 4449(4) 6353(11) 91(4) C(39) -1148(11) 4166(4) 5937(10) 84(4) C(40) 101(10) 4166(3) 6074(9) 69(3) C(41) 4806(7) 4794(2) 7341(6) 43(2) C(42) 6103(8) 4628(3) 7868(8) 59(2) C(43) 4987(7) 5214(3) 7111(7) 48(2) C(44) 5647(11) 5817(3) 7891(9) 71(3) C(45) 7060(10) 5779(2) 8217(8) 60(2) C(46) 7713(12) 5808(4) 7623(9) 79(3) C(47) 8991(14) 5754(5) 7926(10) 98(4) C(48) 9642(12) 5675(4) 8866(10) 82(3) C(49) 9007(11) 5644(3) 9451(9) 74(3) C(50) 7752(11) 5689(3) 9171(8) 67(3) N(5) -1179(5) 5908(2) 4744(5) 34(1) N(6) -3210(5) 6187(2) 4213(5) 35(1) N(7) -4662(6) 5986(2) 4836(5) 43(2) N(8) 4159(6) 4572(2) 6488(5) 41(1) O(9) -1723(5) 6398(1) 3670(4) 40(1) O(10) 423(4) 5538(1) 4567(4) 36(1) O(11) 3246(5) 6065(2) 5588(4) 41(1) O(12) 2070(5) 4969(1) 5727(4) 37(1) O(13) 2175(5) 4448(2) 6814(4) 43(1) 0(14) 2253(5) 4294(1) 5142(4) 41(1) 0(15) 5126(5) 5327(2) 6402(4) 47(1) 0(16) 5079(6) 5439(2) 7854(5) 59(2) P(2) 2638(2) 4552(1) 5976(1) 36(1) F(3) 848(4) 5870(2) 6437(3) 53(1) F(4) 1260(4) 6399(1) 5827(4) 52(1) U(eq) je definisan kao jedna trećina traga ortogonalizovanog Uij tenzora x y z U(eq) C(51) 1164(6) 6520(2) 10539(5) 33(2) C(52) -905(6) 6744(2) 9936(6) 35(2) C(53) -566(7) 7031(2) 9380(6) 40(2) C(54) 599(7) 7038(2) 9410(6) 36(2) C(55) 2751(6) 6779(2) 9946(5) 32(1) C(56) 4386(6) 7140(2) 9914(5) 32(1) C(57) 4124(6) 6867(2) 9056(5) 34(2) C(58) 2905(7) 6665(2) 9004(5) 34(2) C(59) 4765(6) 7544(2) 9783(6) 35(2) C(60) 1742(7) 8055(2) 7650(7) 47(2) C(61) 1252(10) 7835(3) 6826(8) 68(3) C(62) 84(11) 7676(4) 6616(10) 82(3) C(63) -591(8) 7726(3) 7205(9) 64(3) C(64) -89(8) 7946(2) 7989(8) 54(2) C(65) 1092(8) 8113(2) 8209(7) 52(2) C(66) 5145(7) 7905(2) 7409(6) 41(2) C(67) 6043(9) 8071(3) 6954(7) 53(2) C(68) 5468(8) 7483(2) 7619(6) 42(2) C(69) 5155(10) 6864(3) 6889(8) 60(2) C(70) 6264(9) 6846(2) 6585(7) 53(2) C(71) 6155(10) 6982(3) 5686(8) 59(2) C(72) 7172(12) 6977(3) 5408(9) 71(3) C(73) 8315(12) 6830(3) 5991(10) 75(3) C(74) 8438(12) 6699(4) 6868(10) 81(3) C(75) 7418(11) 6703(3) 7169(8) 67(3) N(9) 1491(5) 6777(2) 9943(5) 34(1) N(10) -10(5) 6508(2) 10508(5) 35(1) N(11) -2054(6) 6705(2) 9902(5) 41(2) N(12) 5259(6) 8126(2) 8254(5) 41(1) U(eq) je definisan kao jedna trećina traga ortogonalizovanog Uij tenzora x y z U(eq) O(17) 2023(4) 6309(1) 11077(4) 39(1) O(18) 3243(4) 7154(1) 10110(4) 35(1) O(19) 5136(5) 6622(1) 9151(4) 39(1) O(20) 3850(4) 7708(1) 8941(4) 37(1) O(21) 2929(5) 8222(2) 7826(4) 46(1) O(22) 4481(5) 8389(1) 9527(4) 41(1) O(23) 6271(6) 7362(2) 8322(4) 49(1) O(24) 4745(6) 7264(2) 6883(5) 53(2) P(3) 4158(2) 8129(1) 8706(1) 36(1) F(5) 1915(4) 6800(2) 8253(3) 50(1) F(6) 2937(5) 6285(1) 8908(4) 53(1) C(76) 3540(7) 11117(2) 8649(6) 35(2) C(77) 1484(7) 10884(2) 8173(6) 39(2) C(78) 1778(7) 10570(2) 7671(6) 40(2) C(79) 2942(7) 10551(2) 7677(5) 35(2) C(80) 5100(7) 10796(2) 8131(5) 35(2) C(81) 6303(6) 10530(2) 7384(6) 35(2) C(82) 6961(7) 10396(2) 8421(6) 40(2) C(83) 6006(7) 10527(2) 8865(6) 41(2) C(84) 6246(7) 10233(2) 6633(6) 39(2) C(85) 3528(7) 9348(2) 6559(6) 38(2) C(86) 2822(8) 9666(2) 6114(7) 48(2) C(87) 1628(8) 9720(2) 6144(7) 48(2) C(88) 1173(9) 9470(3) 6643(9) 67(3) C(89) 1910(11) 9160(4) 7098(11) 94(5) C(90) 3074(10) 9099(3) 7046(9) 71(3) C(91) 7615(8) 9178(2) 7289(7) 49(2) C(92) 8505(9) 8866(2) 7193(9) 64(3) C(93) 8450(7) 9499(3) 7889(6) 47(2) U(eq) je definisan kao jedna trećina traga ortogonalizovanog Uij tenzora

x y z U(eq)

C(94) 9666(9) 9667(3) 9478(7) 62(3)

C(95) 10946(8) 9549(3) 9561(6) 50(2)

C(96) 11759(10) 9775(3) 9326(8) 61(2)

C(97) 12923(11) 9654(4) 9378(10) 84(4)

C(98) 13298(11) 9271(4) 9690(10) 84(4)

C(99) 12498(11) 9039(3) 9906(8) 70(3)

C(100) 11361(10) 9177(3) 9876(8) 63(3)

N(13) 3848(5) 10818(2) 8143(5) 34(1)

N(14) 2369(6) 11140(2) 8647(5) 38(1)

N(15) 343(6) 10931(2) 8180(5) 48(2)

N(16) 6823(6) 9309(2) 6359(5) 44(2)

O(25) 4392(5) 11344(2) 9089(4) 46(1)

O(26) 5042(5) 10633(1) 7266(4) 39(1)

O(27) 8180(5) 10544(2) 8843(5) 51(2)

O(28) 5706(5) 9886(1) 6841(4) 39(1)

O(29) 4702(5) 9262(1) 6535(4) 39(1)

O(30) 4937(5) 9639(1) 5117(4) 41(1)

O(31) 8836(5) 9768(2) 7578(5) 50(1)

O(32) 8700(6) 9428(2) 8821(5) 62(2)

P(4) 5510(2) 9535(1) 6125(1) 36(1)

F(7) 5347(5) 10213(1) 8974(4) 55(1)

F(8) 6542(5) 10684(2) 9723(4) 61(1)

C(101) 6810(20) 9411(8) 10080(20) 93(8)

C(102) 6300(20) 9155(6) 9290(15) 83(7)

N(17) 7140(30) 9630(9) 10710(20) 148(12)

Primer 2

[0068] Rastvorljivost NUC-1031 i njegovih diastereomera je određena u opsegu farmaceutski prihvatljivih sistema rastvarača. Prihvaćeni protokol je bio kao što sledi:

Mala zapremina, 1-2 mL, svakog sistema rastvarača je pripremljena i dodata je težina dotičnog jedinjenja. Rastvori su mešani približno 4 časa i zatim 0.45 mL je filtrirano kroz membranu. Koncentracija dotičnog jedinjenja u filtratu je zatim određena pomoću HPLC analize.

[0069] Na bazi režima doziranja gemcitabina korišćenog u lečenju kancera pankreasa, doza NUC-1031 podešena prema molekulskoj težini bi bila oko 3200 mg, koja se daje kao infuzija jednom nedeljno. Kao indikacija nivoa potrebne rastvorljivosti, uzimajući fiktivan cilj od 500 mL infuzione zapremine, potrebna rastvorljivost NUC-1031 bi bila >6 mg/ml u infuzionoj tečnosti. Međutim, ovaj nivo rastvorljivosti je samo indikacija i donje rastvorljivosti još uvek daju efikasne terapije.

Tabela 5 prikazuje rastvorljivost epimerne semeše gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfata 2 u opsegu rastvarača pogodnih za intravensku primenu.

Tabela 6 prikazuje rastvorljivost dva gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-fosfatna epimera 3 i 4 u opsegu smeša rastvarača/vode.

[0070] Kao što se može videti iz Tabele 6, (R)-epimer 4 je značajno nerastvorljiv u 10% smešama polarnih organskih rastvarača u vodi. (S)-epimer 3, sa druge strane, pokazuje značajno poboljšanu rastvorljivost. Kod 50% smeša polarnog organskog rastvarača u vodi, (S)-epimer 3 može biti preko 100 puta rastvorljiviji od (R)-epimera 4. (S)-epimer može na taj način da obezbedi potencijalno veoma pogodnu i efikasnu terapiju.

Primer 3

[0071] Da bi se procenio diferencijalni unos (R)- i (S)-epimera u ciklodekstrin, beleženi su<31>P NMR spektri smeše izomera NUC-1031 posle tretmana sa HP-β-CD u D2O.

[0072] NMR studije. 1H NMR (500 MHz) i 31P NMR (202 MHz) su beleženi na Bruker Avance 500 MHz spektrometru na 25°C. Hemijska pomeranja (δ) su navedena u delovima na milion (ppm) u odnosu na interni D2O (δ 4.9 1H NMR) ili eksterni 85 % H3PO4(δ 0.00 31P NMR). HPLC i NMR studije su izvedene na sobnoj temperaturi.

[0073] HPLC studije. Analiza, analitička tečna hromatografija visokog učinka (HPLC) je izvedena upotrebom ThermoScientific sistema. Reverzno-fazne HPLC analize su izvedene na SCIENTIFIC Hypersil Gold C18, 5µ, 150 x 4.6 mm eluiranjem sa H2O/CH3CN od 90/10 do 0/100 za 30 min na stopi protoka od 1mL/min i na talasnoj dužini detekcije od 280 nm. Vremena zadržavanja NUC-1031 epimera (rastvorenih u MeOH) su zabeležena respektivno na 13.58 min za (S)-epimer 3 i na 13.44 min za (R)-epimer 4 pod ovim uslovima (Sl.5A).

[0074] 2.36 mg smeše izomera NUC-1031 (1:1.1 (S):(R)) je izmereno i prebačeno u NMR epruvetu. 13.3 mg HP-β-CD je zatim rastvoreno u 1.3 mL deuterijum oksida i ovo je bio rastvor koji dodat u NMR epruvetu (1:2.3 molarni odnos NUC1031: HP-β-CD) (NAPOMENA: nije sva čvrsta supstanca rastvorena u rastvoru).

[0075] 31P NMR spektar pokazuje da je HP-β-CD sposoban da pojača rastvorljivost NUC-1031 (S)-epimera 3 (4.14 Hz) u odnosu na (R)-epimer (4.00 Hz), sa zabeleženim odnosom (S)- i (R)-epimera u rastvoru od 6.6:1 u korist (S)-epimera (Sl.4).

[0076] 0.5 mL D2O rastvora iz NMR studije razblaženo je u 1 mL dodavanjem 0.5 mL vode (1.15 mg/mL). 20 mL ovog rastvora injektirano je u HPLC.

[0077] HPLC analiza razblaženog NMR uzorka potvrdila je da je (S)-epimer 3 unet u rastvor bolje od (R)-epimera 4, sa zabeleženim odnosom (S)- i (R)-epimera u rastvoru od 5:1 u korist (S)-epimera, što je uglavnom u saglasnosti sa NMR podacima (Sl.5B).

[0078] Slične studije izvedene sa drugim derivatom gemcitabin fosfata nisu pokazale razliku između unosa (S)- i (R)-epimera tog derivata u rastvor ciklodekstrina.

Primer 4

[0079] Na klirens i biodostupnost većine lekova snažno utiče njihov metabolizam prvog prolaza u jetri. Moguće je proceniti relativnu hepatičku "metaboličku stabilnost" in vitro inkubacijom jedinjenja sa kroprezerviranim hepatocitima i određivanjem početne naspram finalne količine test jedinjenja u inkubacionim smešama.

[0080] Sledeći postupak je HPLC-MS/MS analiza koja koristi sakupljenu humani krioprezerviranu suspenziju hepatocita.

Matrica za analizu

[0081]

Humani hepatociti: mešanog pola i pul od 10

Finalna gustina ćelija: 1 milion (10<6>) vijabilnih ćelija/mL

Eksperimentalni protokol

[0082] Sakupljeni krioprezervirani hepatociti su odmrznuti, isprani i resuspendovani u Krebs-Heinslet puferu (pH 7.3). Reakcija je započeta dodavanjem test jedinjenja (1 µM finalna koncentracija) u ćelijsku suspenziju i inkubirana u finalnoj zapremini od 100 µL na ploči od 96 bunarčića sa ravnim dnom u trajanju od 0 minuta i 120 minuta, respektivno, na 37°C/5 % CO2. Reakcija je zaustavljena dodavanjem 100 µL acetonitrila u inkubacionu smešu. Uzorci su zatim pažljivo mešani i kratko na mućkalici za ploču, prebačeni potpuno u 0.8 mL ploču od 96 bunarčića sa dnom oblika slova V i centrifugirani na 2550 xg u trajanju od 15 minutas na sobnoj temperaturi. Svaki supernatant (150 µL) je prebačen u providnu klaster epruvetu, a zatim je izvedena HPLC-MS/MS analiza na „Thermo Electron triple-quadrupole“ sistemu.

[0083] Ova analiza je modifikovana za određivanje polu-života. U ovom slučaju, vremenske tačke za uzorkovanje su 0, 30, 60, 90 i 120 minuta.

Referentna jedinjenja

[0084] Četiri referentna jedinjenja (1 µM) su testirana istovremeno sa test jedinjenjima. Propranolol je relativno stabilan sa humanim hepatocitima, pri čemu su flurazepam, nalokson i terfenadin relativno nestabilni sa humanim hepatocitima.

Analitički postupci

[0085] Uzorci analizirani preko (RP)HPLC-MS/MS upotrebom izabranog reakcionog monitoringa (SRM). HPLC uslovi se sastoje od HP1100 binarne pumpe sa autosemplerom, C-12 mešanog-režima, 2 x 20 mm kolone i gradijent.

Analiza podataka

[0086] Površine ispod pika koje odgovaraju testiranom jedinjenju su beležene pomoću HPLC-MS/MS. Metabolička stabilnost, izražena kao procenat preostalog testiranog jedinjenja, je izračunata poređenjem površina ispod pika test jedinjenja posle 2 časa prema vremenu nula. U slučaju određivanja polu-života, polu-život je procenjen iz nagiba početnog linearnog opsega logaritamske krive preostalog testiranog jedinjenja (%) naspram vremena, pretpostavljajući kinetiku prvog reda.

[0087] Rezultati su prikazani u Tabeli 7.

era

epi

dvaeše

i sera

epi, era

epiSseren i kl

ičke

rinzint

zuje ika pr7ela ab T

Claims

Patentni zahtevi 1. Farmaceutska formulacija koja sadrži gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat 3:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili solvat, koji ima diastereoizomernu čistoću veću od 90% i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens; pri čemu je formulacija vodena formulacija koja takođe sadrži polarni organski rastvarač.
2. Farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevom 1, naznačena time što je formulacija pogodna za parenteralnu primenu.
3. Farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 2, naznačena time što je formulacija pogodna za intravensku primenu.
4. Farmaceutska formulacija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačena time što formulacija dodatno sadrži ciklodekstrin.
5. Farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što je formulacija pogodna za oralnu primenu.
6. Farmaceutska formulacija prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačena time što je gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat 3 u obliku slobodne baze.
7. Farmaceutska formulacija prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačena time što gemcitabin-[fenil-benzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat 3 ima diastereoizomernu čistoću veću od 95%.
8. Farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 7, naznačena time što gemcitabin-[fenilbenzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat 3 ima diastereoizomernu čistoću veću od 98%.
9. Farmaceutska formulacija prema patentnom zahtevu 8, naznačena time što gemcitabin-[fenilbenzoksi-L-alaninil)]-(S)-fosfat 3 ima diastereoizomernu čistoću veću od 99.5%.
10. Farmaceutska formulacija prema bilo kom porethodnom patentnom zahtevu, za upotrebu u lečenju kancera.
11. Farmaceutska formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, naznačena time što kancer je izabran od: kancera pankreasa, kancera dojke, kancera jajnika, kancera bešike, kolorektalnog kancera, kancera pluća, kancera bešike, kancera prostate, holangiokarcinoma, kancera bubrega, cervikalnog kancera, kancera timusa, kancera nepoznatog primarnog porekla, limfoma ili leukemije.