CN111214480A

CN111214480A - 吉西他滨前药

Info

Publication number: CN111214480A
Application number: CN202010140546.2A
Authority: CN
Inventors: 休·格里菲斯; 克里斯多夫·麦格根; 马格达莱纳·斯鲁萨尔克齐科; 米凯拉·塞尔皮; 瓦伦蒂娜·法拉利
Original assignee: Nucana Biomed Ltd
Current assignee: Nucana PLC
Priority date: 2014-06-25
Filing date: 2015-06-25
Publication date: 2020-06-02
Also published as: JP2017519014A; JP6970236B2; CY1123389T1; PH12016502553B1; CN106459129A; MX2016015628A; SI3160978T1; EP3757112C0; PH12016502553A1; AU2019216626B2; US10662213B2; AU2015278899B2; KR20220080220A; HRP20230584T1; DK3160978T3; TW202033204A; KR20170043479A; EP3160978A1; EA034890B1; PL3160978T3

Abstract

本发明涉及公知的肿瘤药物吉西他滨的单磷酸酯核苷酸的前药。具体地，当作为单一磷酸酯非对映异构体存在时，其涉及吉西他滨‑[苯基‑苯甲酰氧基‑L‑丙氨酰基)]‑磷酸酯，并且特别涉及相对于(R)‑非对映异构体提供显著和出人意料的溶解度增加的(S)‑磷酸酯非对映异构体。相对于(R)‑非对映异构体，(S)‑磷酸酯差向异构体也优先被吸收到环糊精溶液中。

Description

吉西他滨前药

本申请是国际申请日为2015年6月25日，中国国家申请号为201580034740.X，发明名称为“吉西他滨前药”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及公知的肿瘤药物吉西他滨的单磷酸酯的前药。具体地，当作为单一磷酸酯非对映异构体存在时，其涉及吉西他滨-[苯基(苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]磷酸酯(化学名：2'-脱氧-2',2'-二氟-D-胞苷-5'-O-[苯基(苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]磷酸酯)，特别是涉及相对于(R)-非对映异构体溶解度显著且意想不到的增加的(S)-磷酸酯非对映异构体。相对于(R)-非对映异构体，(S)-磷酸酯非对映异构体也优先吸收到环糊精溶液中。

背景技术

吉西他滨(1；商品名

)是一种有效的核苷类似物，目前已被证实可治疗乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和胰腺癌，并广泛用于治疗各种其它癌症，包括膀胱癌、胆道癌、结肠直肠癌和淋巴瘤。

吉西他滨的临床效果受到多种固有耐药机制和获得性耐药机制的限制。细胞水平的耐药取决于三个参数：(ⅰ)激活成磷酸化基团所必需的脱氧胞苷激酶的下调；(ii)核苷转运体特别是通过癌细胞摄取所需的hENT1的降低的表达，和(iii)催化酶尤其是降解吉西他滨的胞苷脱氨酶的上调。

WO2005/012327描述了吉西他滨的一系列核苷酸前药和相关的核苷药物分子。其中吉西他滨-[苯基(苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]磷酸酯(NUC-1031；2)被认为是最有效的化合物。这些前药似乎避免了很多限制吉西他滨的效果的固有耐药机制和获得性耐药机制(‘Application of ProTide Technology to Gemcitabine:A Successful Approach toOvercome the Key Cancer Resistance Mechanisms Leads to a New Agent(NUC-1031)in Clinical Development’；Slusarczyk et all；J.Med.Chem.；2014,57,1531-1542)。

NUC-1031 2制备为在磷酸酯中心差向异构的两种非对映异构体的混合物。

遗憾的是，NUC-1031 2非常亲脂，因此难溶于水(通过计算：<0.1mg/mL)，此外，可电离基团嘧啶氮和酚羟基的计算所得的pKa在适于肠胃外施用的pH范围之外。无论盐含量和pH值如何，它基本不溶于水，这对以足以实现有效治疗的高剂量递送前药的制剂的发展产生影响。它还对允许NUC-1031以成本有效的方式生产的有效的制造过程的发展产生影响。

本发明的某些实施方案的目的是提供可以配制成有效药物组合物的吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯(NUC-1031；2)形式。

本发明的某些实施方案的另一个目的是提供可以制备和储存较长时间的吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯(NUC-1031；2)形式。

本发明的某些实施方案的目的是提供比现有技术形式具有更高溶解度的吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯(NUC-1031；2)形式。

本发明的某些实施方案的目的是提供作为在磷处的单一非对映异构体的吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯(NUC-1031；2)。

本发明的某些实施方案满足一些或全部上述目的。

本发明的吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯优选具有与吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯(NUC-1031；2)基本相同的活性。然而，如果对于以这种形式使用它具有制造或治疗益处，它可以具有略低的活性，但具有本说明书中所述的其它益处。

发明内容

根据本发明，提供了吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯3:

或其药学上可接受的盐或溶剂合物。优选地，吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯3是基本上非对映异构纯的形式。

发明人已经发现了两种非对映异构体的溶解度的令人惊讶和显着的差异。(S)-差向异构体3在许多极性有机溶剂与水的混合物中具有足够的溶解度，以使其适于作为治疗剂的配制和施用。(R)-差向异构体4基本上不溶于所测量的大多数溶剂混合物中。这种溶解度的显着差异以前未被认识，并且尚未认识(S)-差向异构体的这种性质的潜在益处。在所测试的许多溶剂混合物中，(S)-差向异构体和(R)-差向异构体之间的溶解度差异超过100倍。

令人惊讶的是，相对于(R)-差向异构体，(S)-差向异构体也优先吸收到环糊精溶液中。这在其它吉西他滨磷酸酯衍生物中未观察到。

在本发明的第二方面，提供了包含吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯3或其药学上可接受的盐或溶剂合物，其具有大于约90％的非对映异构体纯度，和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物制剂。

该制剂可以用于胃肠外，例如用于静脉内、皮下或肌内施用。优选地，该制剂用于静脉内施用。

该制剂可以是任选还包含极性有机溶剂的水性制剂。在肠胃外(例如静脉内)施用的情况下，该制剂优选还包含极性有机溶剂。

该制剂还可以包含环糊精。

在本发明的第三方面，提供了用于医学用途的吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯3或其药学上可接受的盐或溶剂合物。

在本发明的第四方面，提供了用于治疗癌症的吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯3或其药学上可接受的盐或溶剂合物。

在本发明的第五方面，提供了用于制备治疗癌症的药物的吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯3或其药学上可接受的盐或溶剂合物。

在本发明的第六方面，提供了治疗癌症的方法，所述方法包括对有需要的受试者施用治疗有效量的吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯3，或其药学上可接受的盐或溶剂合物。

溶剂合物通常是水合物。因此，吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯可以是盐或水合物的形式。可能吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯不是盐和/或溶剂合物(例如水合物)的形式。优选地，其为游离碱的形式。

吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯可以具有大于约90％的非对映异构体纯度。其可以具有大于95％，98％，99％或甚至99.5％的非对映异构体纯度。对于本发明的目的，“基本上非对映异构纯的”被定义为大于约90％的非对映异构体纯度。

所述癌症可以是选自以下的癌症：胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、结肠直肠癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、胆管癌、肾癌、子宫颈癌、胸腺癌、未知原发位点的癌症。癌症还可以是淋巴瘤或白血病。

在本发明的第七方面，提供了以基本上非对映异构纯的形式提供吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯的至少一种非对映异构体的方法，所述方法包括以下步骤：

获得吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(R)-磷酸酯4和吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯3的混合物；

使所述混合物经受分离技术；和

一旦分离，以基本上非对映异构纯的形式分离吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(R)-磷酸酯4和/或吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯3。

在本发明的第八方面，提供了以基本上非对映异构纯的形式提供吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯的至少一种非对映异构体的方法，所述方法包括以下步骤：

获得3'-保护的吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(R)-磷酸酯4和3'-保护的吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯3的混合物；

使所述混合物经受分离技术；

一旦分离，以基本上非对映异构纯的形式分离3'-保护的吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(R)-磷酸酯4和/或3'-保护的吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯3；

从一种或两种分离的非对映异构体中除去3'-保护基，从而以基本上非对映异构纯的形式提供吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(R)-磷酸酯4和/

或吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯3。

3'-保护的吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯是吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯的衍生物，其中3'-羟基特征为羟基保护基。所述保护基团必须可被干净地移除。示例性保护基包括甲硅烷基保护基(例如叔丁基二甲基甲硅烷基和三乙基甲硅烷基)，在这种情况下，可以使用选自TFA、HF、氟硅酸和四丁基氟化铵的试剂除去保护基。另一种可选的保护基可以是碳酸酯基(例如叔丁基碳酸酯)，在这种情况下，可以使用布朗斯台德酸(例如TFA)或路易斯酸(例如ZnBr ₂)除去保护基。

分离技术可以是色谱法，例如柱色谱法、制备型薄层色谱法或制备型HPLC。当分离技术是制备型HPLC时，其可以使用手性柱进行，例如，包括直链淀粉三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的手性柱。可用于本发明的方法的手性柱的实例是Chiralpak AD^TM；其固定相由其上物理涂布有直链淀粉三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的20μm二氧化硅载体组成。

分离技术可以选择性摄取到环糊精溶液中。该技术包括使混合物与环糊精溶液接触，使得一种差向异构体优先于另一种差向异构体被吸收到环糊精溶液中，然后从未溶解的固体中分离环糊精溶液。环糊精溶液可以是环糊精水溶液。溶液与固体的分离可以通过过滤来实现。

本发明还提供吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(R)-磷酸酯4：

或其药学上可接受的盐或溶剂合物。本发明还提供了包含非对映异构体纯度大于约90％的吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(R)-磷酸酯4或其药学上可接受的盐或溶剂合物和药学上可接受的赋形剂的药物制剂，以及化合物4的医学用途和使用化合物4的治疗方法。(R)-差向异构体的这些方面对应于关于上述本发明的第三至第六方面中的化合物3所述的那些。吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(R)-磷酸酯可以是基本上非对映异构纯的形式。可能吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(R)-磷酸酯不是盐和/或溶剂合物(例如水合物)。优选地，其作为游离碱存在。

与分离的人肝细胞孵育时，R-差向异构体已显示具有为S-差向异构体的四倍的半衰期(参见实施例4)。与R-差向异构体相关的较长半衰期表示较低的内在清除率，并应导致与S-差向异构体不同的药代动力学和药效学曲线。该曲线可以意味着在体循环中R-差向异构体的浓度更高和更持久，因此相比于用S-差向异构体所达到的，更多地暴露于R-差向异构体。因此，R-差向异构体的AUC可以更高，导致更大和更长时间地暴露于该部分，例如，对于口服施用途径，其中首过效应更显着。这种长时间暴露于R-差向异构体可以允许肿瘤实质上延长地暴露于R-差向异构体，并且可以导致更大的功效，其中肝脏中减少的首过代谢将导致更高的药物浓度。这种不同的性质还可以允许靶向特定的肿瘤，其中更长的PK曲线可以导致在难以进入脉管系统差的肿瘤部位方面更大的功效。长时间暴露于R-差向异构体可以确保通过细胞周期的更多阶段(包括细胞分裂)的活性代谢物的足够的药物浓度。

附图说明

在下文中参考附图进一步描述本发明的实施方案，其中：

图1显示了使用Chiralpak AD柱和正庚烷/IPA梯度溶剂系统通过HPLC分离化合物3和4的色谱。

图2显示通过x-射线衍射测定的化合物4的结构。

图3显示通过x-射线衍射测定的化合物3的结构。

图4显示在以1:2.3摩尔比加入HP-β-CD之后NUC-1031异构体混合物(3.12mM)的³¹P-NMR谱(202MHz，D₂O)。

图5显示在以1:2.3摩尔比加入HP-β-CD(B)之后，在H₂O中的MeOH(A)中的NUC-1031(3.12mM)的HPLC迹线。

具体实施方式

在本说明书中，术语S-差向异构体或S-非对映异构体是指吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯。同样，在本说明书中，术语R-差向异构体或R-非对映异构体是指吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(R)-磷酸酯。

本发明的化合物可用于治疗人体。它们可以用于治疗动物体。特别地，本发明的化合物可用于治疗商业动物例如家畜。或者，本发明的化合物可用于治疗伴侣动物，例如猫、狗等。

本发明的化合物可以以药学上可接受的盐的形式获得、储存和/或施用。合适的药学上可接受的盐包括但不限于药学上可接受的无机酸如盐酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、氨基磺酸和氢溴酸的盐，或药学上可接受的有机酸例如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡萄糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲磺酸、甲苯磺酸、苯磺酸、水杨酸、磺胺酸、天冬氨酸、谷氨酸、依地酸(edetic acid)、硬脂酸，棕榈酸，油酸、月桂酸、泛酸、单宁酸、抗坏血酸和戊酸的盐。合适的碱盐由形成无毒盐的碱形成。实例包括铝、精氨酸、苄星、钙、胆碱、二乙胺、二醇胺、甘氨酸、赖氨酸、镁、葡甲胺、乙醇胺、钾、钠、氨基丁三醇和锌盐。也可以形成酸和碱的半盐，例如半硫酸盐、半草酸盐和半钙盐。在某些实施方案中，特别是适用于s-差向异构体的那些实施方案，化合物是HCl盐或半草酸盐的形式。

本发明的化合物可以以单晶形式或以晶体形式的混合物存在，或者它们可以是无定形的。因此，意在用于药物用途的本发明化合物可以作为结晶或无定形产物施用。它们可以通过例如沉淀、结晶、冷冻干燥或喷雾干燥或蒸发干燥的方法获得为例如固体塞、粉末或膜。微波或射频干燥可用于此目的。

对于本发明的上述化合物，所施用的剂量当然将随所使用的化合物，施用模式，所需的治疗和所示的病症而变化。例如，如果本发明的化合物被胃肠外施用，则本发明的化合物的剂量可以在0.1至5g/m²的范围内，例如，为0.5至2g/m²。根据众所周知的药物原理，用于本发明的化合物的治疗目的的剂量大小将根据病症的性质和严重程度，动物或患者的年龄和性别以及施用途径，而自然变化。

预期本发明化合物的剂量水平，剂量频率和治疗持续时间根据制剂和患者的临床适应症，年龄和共病态医学病症而不同。

本发明的化合物或其药学上可接受的盐可以单独使用，但通常以药物组合物的形式施用，其中本发明的化合物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的佐剂，稀释剂或载体联合。用于选择和制备合适的药物制剂的常规方法描述于例如“Pharmaceuticals-TheScience of Dosage Form Designs”，M.E.Aulton，Churchill Livingstone，1988中。

根据本发明化合物的施用方式，用于施用本发明化合物的药物组合物优选包含0.05至99％w(重量百分比)的本发明化合物，更优选0.05至80％w的本发明化合物，还更优选0.10至70％w的本发明化合物，甚至更优选0.10至50％w的本发明化合物，所有重量百分比均基于总组合物。

对于口服施用，本发明的化合物可以与佐剂或载体混合，例如乳糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇；淀粉，例如马铃薯淀粉、玉米淀粉或支链淀粉；纤维素衍生物；粘合剂，例如明胶或聚乙烯吡咯烷酮；和/或润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钙、聚乙二醇、蜡、石蜡等，然后压制成片剂。如果需要包衣片剂，可以用浓缩的糖溶液包衣如上所述制备的芯，所述浓缩的糖溶液可以含有例如阿拉伯树胶、明胶、滑石粉和二氧化钛。或者，片剂可以用溶解在易挥发的有机溶剂中的合适的聚合物包衣。

对于软明胶胶囊的制备，本发明的化合物可以与例如植物油或聚乙二醇混合。硬明胶胶囊可以含有使用上述片剂赋形剂的化合物颗粒。也可将本发明化合物的液体或半固体制剂填充入硬明胶胶囊中。

用于口服应用的液体制剂可以是糖浆或悬浮液的形式，例如含有本发明化合物的溶液，其余是糖以及乙醇、水、甘油和丙二醇的混合物。任选地，这样的液体制剂可以含有着色剂、调味剂、甜味剂(例如糖精)、防腐剂和/或羧甲基纤维素作为增稠剂或本领域技术人员已知的其它赋形剂。

对于肠胃外(例如静脉内)施用，本发明的化合物可以作为无菌水性或油性溶液施用。本发明的化合物是非常亲脂性的。因此，含水制剂通常还含有药学上可接受的极性有机溶剂。

已经显示环糊精在药物递送中具有广泛的应用(Rasheed等人，Sci.Pharm.，2008,76,567-598)。环糊精是环状寡糖的家族。它们充当“分子笼”，其封装药物分子并改变那些药物分子的性质，例如溶解性。环糊精包含(α-1,4)-连接的α-D-吡喃葡萄糖单元。环糊精可以含有6,7或8个吡喃葡萄糖单元(分别称为α-，β-和γ-环糊精)。用于药物制剂中的环糊精通常是β-环糊精。侧挂羟基可以用C₁-C₆取代或未取代的烷基烷基化。环糊精的实例是α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、磺丁基醚β-环糊精钠盐、部分甲基化的β-环糊精。

根据公知的药物原理，用于本发明化合物的治疗目的的剂量大小将根据病症的性质和严重程度，动物或患者的年龄和性别以及施用途径自然地变化。

预期本发明化合物的剂量水平、剂量频率和治疗持续时间根据制剂和患者的临床指征、年龄和共病态医学病症而不同。

本发明还包括化合物3或4的所有药学上可接受的同位素标记形式，其中一个或多个原子被具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于自然界中通常存在的主要同位素的原子质量或质量数的原子替换。

适合包括在本发明化合物中的同位素的实例包括氢的同位素，例如²H和³H，碳的同位素，例如¹¹C、¹³C和¹⁴C，氯的同位素，例如³⁶Cl，氟的同位素，例如¹⁸F，碘的同位素，例如¹²³I和¹²⁵I,，氮的同位素，例如¹³N和¹⁵N，氧的同位素，例如¹⁵O、¹⁷O和¹⁸O，磷的同位素，例如³²P和硫的同位素，例如³⁵S。

某些同位素标记的化合物，例如掺入放射性同位素的那些可用于药物和/或底物组织分布研究。放射性同位素氚，即³H，和碳-14，即¹⁴C，鉴于其易于掺入和现成的检测手段，特别可用于此目的。

用更重的同位素例如氘，即²H，进行的取代可以提供由更大的代谢稳定性例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求带来的某些治疗优势，因此在一些情况下可能是优选的。

用正电子发射同位素(例如¹¹C、¹⁸F、¹⁵O和¹³N)的取代可用于正电子发射断层(PET)研究以检测底物受体占据。

同位素标记的化合物通常可以通过本领域技术人员已知的常规技术或通过类似于使用适当的同位素标记的试剂代替之前使用的非标记试剂所描述的那些方法的方法制备。

除了本发明的化合物之外，用于治疗癌症的治疗方法或化合物可以涉及常规外科手术或放射疗法或化疗。这种化疗可以包括施用一种或多种其它活性剂。

当另外的活性剂作为本发明的治疗方法的一部分施用时，这种组合治疗可以通过各个治疗组分的同时，相继或分开配量来实现。这种组合产品使用在上文所述的治疗有效剂量范围内的本发明化合物和在其批准的剂量范围内的一种或多种其它药物活性剂。

因此，本发明的药物制剂可以包含另一种活性剂。

一种或多种其他活性剂可以是一种或多种以下类别的抗肿瘤剂：

(i)抗增殖/抗肿瘤药及其组合，例如烷化剂(例如环磷酰胺、氮芥、苯达莫司汀(bendamustin)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥、白消安(busulphan)、替莫唑胺(temozolamide)和亚硝基脲)；抗代谢药(例如吉西他滨和抗叶酸药如氟嘧啶如5-氟尿嘧啶和喃氟啶、雷替曲塞、甲氨蝶呤、培美曲塞、阿糖胞苷和羟基脲)；抗生素(例如蒽环类药物如阿霉素、博来霉素、多柔比星、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素-C、更生霉素和光神霉素)；抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱如长春新碱、长春花碱、长春地辛和长春瑞滨和紫杉烷类如紫杉醇和泰素帝和polo激酶(polokinase)抑制剂)；蛋白酶体抑制剂，例如卡非佐贝和硼替佐米；干扰素治疗；和拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶、拓扑替康、米托蒽醌和喜树碱)；

(ii)细胞静止素如抗雌激素(例如他莫昔芬，氟维司群，托瑞米芬，雷洛昔芬，屈洛昔芬和碘氧芬(iodoxyfene))，抗雄激素(例如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特和乙酸环丙孕酮)，LHRH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)，孕激素(例如醋酸甲地孕酮)，芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、伏罗唑和依西美坦)和5α-还原酶抑制剂如非那雄胺；

(iii)抗侵入剂，例如达沙替尼和博舒替尼(SKI-606)，和金属蛋白酶抑制剂，尿激酶纤溶酶原激活物受体功能抑制剂或类肝素酶抗体；

(ⅳ)生长因子功能的抑制剂：例如此类抑制剂包括生长因子抗体和生长因子受体抗体，例如抗erbB2抗体曲妥单抗[赫赛汀^TM]，抗EGFR抗体帕尼单抗，抗erbB1抗体西妥昔单抗，酪氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的抑制剂(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂，例如吉非替尼、厄洛替尼和6-丙烯酰胺基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)-喹唑啉-4-胺(CI 1033)、erbB2酪氨酸激酶抑制剂如拉帕替尼)；肝细胞生长因子家族的抑制剂；胰岛素生长因子家族的抑制剂；细胞凋亡的蛋白质调节器的调节剂(例如Bcl-2抑制剂)；血小板衍生生长因子家族的抑制剂如伊马替尼和/或尼罗替尼(AMN107)；丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂(例如Ras/Raf信号传导抑制剂如法尼基转移酶抑制剂，例如索拉非尼、替吡法尼和洛那法尼)，细胞通过MEK和/或AKT激酶信号传导的抑制剂，c-kit抑制剂，abl激酶抑制剂，PI3激酶抑制剂，Plt3激酶抑制剂，CSF-1R激酶抑制剂，IGF受体，激酶抑制剂；极光激酶抑制剂和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂如CDK2和/或CDK4抑制剂；

(v)抗血管生成剂，例如抑制血管内皮生长因子的作用的那些，[例如抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗(Avastin^TM)]；沙利度胺；来那度胺；和例如，VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂如凡德他尼、瓦他拉尼、舒尼替尼、阿西替尼和帕唑帕尼；

(vi)基因治疗方法，包括例如替代异常基因如异常p53或异常BRCA1或BRCA2的方法；

(vii)免疫治疗方法，包括例如抗体治疗，例如阿仑珠单抗、利妥昔单抗、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)

和奥法木单抗；干扰素如干扰素α；白细胞介素如IL-2(阿地白介素)；白细胞介素抑制剂，例如IRAK4抑制剂；癌症疫苗，包括预防和治疗疫苗，例如HPV疫苗，例如加德西、希瑞适(Cervarix)、Oncophage和Sipuleucel-T(普罗文奇(Provenge))；和toll样受体调节剂，例如TLR-7或TLR-9激动剂；和

(viii)细胞毒性剂，例如氟达拉滨(fludara)、克拉屈滨、喷司他丁(Nipent^TM)；

(ⅸ)类固醇例如皮质类固醇，包括糖皮质激素和盐皮质激素，例如阿氯米松(aclometasone)、二丙酸阿氯米松、醛固酮、安西奈德、倍氯米松、二丙酸倍氯米松、倍他米松、二丙酸倍他米松、倍他米松磷酸钠、戊酸倍他米松、布地奈德、氯倍他松、丁酸氯倍他松、丙酸氯倍他索、氯泼尼醇(cloprednol)、可的松、醋酸可的松、可的伐唑(cortivazol)、去氧皮甾酮、地奈德、去羟米松(desoximetasone)、地塞米松、地塞米松磷酸钠、地塞米松异烟酸酯、二氟可的松、氟氯奈德(fluclorolone)、氟甲松、氟尼缩松、氟轻松、醋酸氟轻松(fluocinolone acetonide)、氟轻松醋酸酯(fluocinonide)、氟可丁(fluocortin butyl)、氟可的松、氟可龙(fluorocortolone)、氟可龙己酸酯、氟可龙三甲基乙酸酯、氟米龙、氟泼尼定、醋酸氟泼尼定、氟氢缩松、氟替卡松、丙酸氟替卡松、哈西奈德、氢化可的松、醋酸氢化可的松、丁酸氢化可的松、醋丙氢可的松、氢化可的松丁丙酸酯、戊酸氢化可的松、艾可米松、醋丁艾可米松、甲泼尼松、甲基强的松龙、莫米松、帕拉米松、糠酸莫米松一水合物、泼尼卡酯、泼尼松龙、泼尼松、替可的松、新戊酸替可的松、曲安西龙(triamcinolone)、曲安奈德(triamcinolone acetonide)、曲安西龙醇和它们各自的药学上可接受的衍生物。可以使用类固醇的组合，例如两种或更多种本段落中提及的类固醇的组合；

(x)靶向治疗，例如PI3Kd抑制剂，例如伊达利塞(idelalisib)和哌立福辛；或抑制PD-1，PD-L1和CAR T的化合物。

一种或多种其它活性剂也可以是抗生素。

在本说明书的整个说明书和权利要求书中，词语“包括”和“含有”及其变体意味着“包括但不限于”，并且它们不旨在(并且不)排除其他部分、添加剂、组分、整数或步骤。在本说明书的整个说明书和权利要求书中，单数包括复数，除非上下文另有要求。特别地，在使用不定冠词时，除非上下文另有要求，否则说明书应被理解为考虑复数以及单数。

结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应理解为可应用于本文所述的任何其它方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。在本说明书(包括任何所附权利要求，摘要和附图)中公开的所有特征，和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤可以以任何组合进行组合，除了其中至少一些这样的特征和/或步骤是相互排斥的组合。本发明不限于任何前述实施方案的细节。本发明延伸到本说明书(包括任何所附权利要求，摘要和附图)中公开的特征的任何新颖的一个或任何新颖的组合，或如此公开的任何方法或过程的步骤的任何新颖的一个或任何新颖的组合。

读者的注意力指向与本申请所关联的本说明书同时或先于本说明书提交的，并且用本说明书对公众公开的所有论文和文献，并且所有这些论文和文献的内容通过引用并入本文。

在本说明书中使用以下缩写：

DMF-N,N-二甲基甲酰胺 DMSO-二甲基亚砜

IPA-异丙醇 NMP-N-甲基吡咯烷酮

PEG-聚乙二醇 TBDMS-叔丁基二甲基甲硅烷基

TFA-三氟乙酸

实施例1

在以下条件下通过HPLC分离(R)和(S)同分异构体：

设备：Agilent 1200^TM系列，带DAD检测器

流速：1.0mL/min

柱：Chiralpak AD^TM；250x 4.6mm ID(正相)

温度：环境

粒径：20μm

进料：溶于MeOH；10g/L

溶剂：正庚烷/IPA 10->50％IPA

色谱图如图1所示。(S)-差向异构体在8.6分钟洗脱，(R)-差向异构体在10.3分钟洗脱。

表征方法和材料：在Bruker Avance 500光谱仪上在25℃下记录质子(¹H)，碳(¹³C)，磷(³¹P)和氟(¹⁹F)NMR光谱。将光谱自动校准到氘代溶剂峰，并且所有¹³C NMR和³¹PNMR都是质子去耦的。通过HPLC分析，使用Varian Polaris C18-A(10μM)作为分析柱，在35分钟内进行从100/0至0/100的H₂O/MeOH梯度洗脱，证实最终化合物的纯度>95％。HPLC分析通过Varian Prostar(LC Workstation-Varian prostar 335LC检测器)进行。

2'-脱氧-2′,2′-二氟-D-胞苷-5'-O-[苯基(苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯3

(ES+)m/z，实测值：(M+Na⁺)603.14。C₂₅H₂₇F₂N₄O₈NaP理论值：(M⁺)580.47。

³¹P NMR(202MHz,MeOD):δ_P 3.66

¹H NMR(500MHz,MeOD):δ_H 7.58(d,J＝7.5Hz,1H,H-6),7.38–7.32(m,7H,ArH),7.26–7.20(m,3H,ArH),6.24(t,J＝7.5Hz,1H,H-1’),5.84(d,J＝7.5Hz,1H,H-5),5.20(AB系统,J_AB＝12.0Hz,2H,OCH₂Ph),4.46–4.43(m,1H,H-5’),4.36–4.31(m,1H,H-5’),4.25–4.19(m,1H,H-3’),4.07–4.00(m,2H,H-4’,CHCH₃),1.38(d,J＝7.2Hz,3H,CHCH₃)。

¹⁹F NMR(470MHz,MeOD):δ_F–118.0(d,J＝241Hz,F),–120.24(宽d,J＝241Hz,F)。

¹³C NMR(125MHz,MeOD):δ_C 174.61(d,³J_C-P＝5.0Hz,C＝O,酯),167.63(C-NH₂),157.74(C＝O基),152.10(d,²J_C-P＝7.0Hz,C-Ar),142.40(CH-基),137.22(C-Ar),130.90,129.63,129.39,129.32,126.32(CH-Ar),124.51(d,¹J_C–F＝257Hz,CF₂),121.47,121.43(CH-Ar),96.67(CH-基),85.92(宽信号,C-1′),80.31(C-4′),71.27(明显t,²J_C–F＝23.7Hz,C-3′),68.03(OCH₂Ph),65.73(d,²J_C–P＝5.30Hz,C-5’),51.66(CHCH₃),20.42(d,³J_C–P＝6.25Hz,CHCH₃)。

反相HPLC，用H₂O/MeOH从100/0至0/100在35分钟内洗脱，显示非对映异构体的一个峰，t_R＝22.53min。

2'-脱氧-2′,2′-二氟-D-胞苷-5'-O-[苯基(苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(R)-磷酸酯4。

³¹P NMR(202MHz,MeOD):δ_P 3.83

¹H NMR(500MHz,MeOD):δ_H 7.56(d,J＝7.5Hz,1H,H-6),7.38–7.31(m,7H,ArH),7.23–7.19(m,3H,ArH),6.26(t,J＝7.5Hz,1H,H-1’),5.88(d,J＝7.5Hz,1H,H-5),5.20(s,2H,OCH₂Ph),4.49–4.46(m,1H,H-5’),4.38–4.34(m,1H,H-5’),4.23–4.17(m,1H,H-3’),4.07–4.01(m,2H,H-4’,CHCH₃),1.38(d,J＝7.2Hz,3H,CHCH₃).

¹⁹F NMR(470MHz,MeOD):δ_F–118.3(d,J＝241Hz,F),–120.38(宽d,J＝241Hz,F).

¹³C NMR(125MHz,MeOD):δ_C 174.65(d,³J_C-P＝5.0Hz,C＝O,酯),167.65(C-NH₂),157.75(C＝O基),152.10(d,²J_C-P＝7.0Hz,C-Ar),142.28(CH-基),137.50(C-Ar),130.86,129.63,129.40,129.32,126.31(CH-Ar),124.50(d,¹J_C–F＝257Hz,CF₂),121.44,121.40(CH-Ar),96.67(CH-基),85.90(宽信号,C-1′),80.27(C-4′),71.30(明显t,²J_C–F＝23.7Hz,C-3′),68.02(OCH₂Ph),65.50(C-5’),51.83(CHCH₃),20.22(d,³J_C–P＝7.5Hz,CHCH₃)。

反相HPLC，用H₂O/MeOH从100/0至0/100在35分钟内洗脱，显示非对映异构体的一个峰，t_R＝21.87min

还获得两种异构体的X射线衍射数据，所得图像显示于图2和图3中。相应的衍射数据和方法提供于下表1至4中。

表1.(R)-差向异构体4的晶体数据和结构精修。

识别码shelx

经验式C₂₅H₂₇F₂N₄O₈P

式量580.47

温度296(2)K

波长

晶系单斜

空间群C 2

晶胞尺寸

α＝90°。

β＝97.966(2)°。

γ＝90°。

体积

Z 4

密度(计算值)1.447Mg/m3

吸收系数1.541mm^-1

F(000)1208

晶体尺寸0.584×0.095×0.051mm³

数据收集的θ范围3.259至73.477°。

索引范围-23<＝h<＝23，-12<＝k<＝12，-17<＝1<＝13

衍射点收集9684

独立衍射5150[R(int)＝0.0239]

完整性θ＝67.684°99.9％

吸收校正来自等效物的半经验

最大和最小传输1.00000和0.61719

精修方法 F²上的全矩阵最小二乘法

数据/约束/参数5150/549/437

F²上的拟合优度1.065

最终R指数[I>2sigma(I)]R1＝0.0646，wR2＝0.1759

R指数(所有数据)R1＝0.0681，wR2＝0.1793

绝对结构参数0.039(10)

消光系数n/a

最大差异峰和孔0.477和

表2.(R)-差向异构体4的原子坐标(x 104)和等效各向同性位移参数

U(eq)被定义为正交化Uij张量的轨迹的三分之一。

表3.(S)-差向异构体3的晶体数据和结构精修。

识别码shelx

经验式C_25.29H_26.44F₂N_4.14O₈P

式量585.44

温度293(2)K

波长

晶系单斜

空间群P2₁

晶胞尺寸

α＝90°。

β＝111.282(4)°。

γ＝90°。

体积

Z 8

密度(计算值)1.392Mg/m3

吸收系数1.477mm-1

F(000)2434

晶体尺寸0.249x 0.072x 0.042mm³

数据收集的θ范围3.135to 73.481°。

索引范围-13<＝h<＝12,-42<＝k<＝42,-17<＝l<＝18

衍射点收集43816

独立衍射21792[R(int)＝0.0582]

完整性θ＝67.684°100.0％

吸收校正来自等效物的半经验

最大和最小传输1.00000and 0.62509

精修方法F²上的全矩阵最小二乘法

数据/约束/参数21792/2/1478

F²上的拟合优度1.022

最终R指数[I>2sigma(I)]R1＝0.0628,wR2＝0.1597

R指数(所有数据)R1＝0.0921,wR2＝0.1794

绝对结构参数0.031(13)

消光系数n/a

最大差异峰和孔0.513和

表4.(S)-差向异构体3的原子坐标(x 104)和等效各向同性位移参数(

103)U(eq)被定义为正交化Uij张量的轨迹的三分之一。

实施例2在一系列药学上可接受的溶剂系统中测定NUC-1031及其非对映异构体的溶解度。采用的方案如下：

制备小体积，1-2mL的每种溶剂体系，并加入一定量的所述化合物。将溶液搅拌约4小时，然后0.45μL膜过滤。然后通过HPLC测定确定滤液中所述化合物的浓度。

基于用于治疗胰腺癌的吉西他滨剂量方案，NUC-1031的分子量调整剂量为约3200mg，每周一次输注。作为所需溶解度水平的指示，采用500mL输注体积的名义目标，NUC-1031的所需溶解度在输注液中将>6mg/ml。然而，这种溶解度水平仅仅是一种指示，并且较低的溶解度仍然可以提供有效的疗法。

表5显示了吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯2差向异构体混合物在适于静脉内施用的一系列溶剂内的溶解度。

表6显示了两种吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-磷酸酯差向异构体3和4在一系列溶剂/水混合物中的溶解度。

从表6可以看出，(R)-差向异构体4基本上不溶于极性有机溶剂在水中的10％混合物中。另一方面，(S)-差向异构体3显示出显着改善的溶解度。在极性有机溶剂在水中的50％混合物中，(S)-差向异构体3可以比(R)-差向异构体4的溶解度高100倍以上。因此，(S)-差向异构体可提供潜在的非常方便和有效的疗法。

实施例3

为了评价(R)-和(S)-差向异构体进入环糊精的差异摄取，记录了在D₂O中用HP-β-CD处理后的NUC-1031异构体混合物的³¹P NMR谱。

NMR研究。在Bruker Avance 500MHz光谱仪上在25℃下记录¹H NMR(500MHz)和³¹PNMR(202MHz)。化学位移(δ)以相对于内部D₂O(δ4.9 ¹H NMR)或外部85％H₃PO₄(δ0.00 ³¹PNMR)的百万分之一(ppm)引用。HPLC和NMR研究都在室温下进行。

HPLC研究。使用ThermoScientific系统进行分析高效液相色谱(HPLC)分析。反相HPLC分析在SCIENTIFIC Hypersil Gold C18,5μm，150×4.6mm上进行，用H₂O/CH₃CN从90/10至0/100在30分钟内以1mL/min的流速洗脱，且检测波长为280nm。在这些条件下，在对应(S)-差向异构体3的13.58分钟处和对应(R)-差向异构体4的13.44分钟处分别观察到NUC-1031差向异构体(溶解在MeOH中)的保留时间(图5A)。

称重2.36mg NUC-1031同分异构体混合物(1:1.1(S):(R))并转移到NMR管中。然后将13.3mg的HP-β-CD溶解在1.3mL的氧化氘中，且这是加入到NMR管中的溶液(1:2.3摩尔比NUC1031:HP-β-CD)(注意：不是所有的固体溶解在溶液中)。

³¹P NMR光谱显示HP-β-CD能够增强NUC-1031(S)-差向异构体3(4.14Hz)相对于(R)-差向异构体(4.00Hz)的溶解度，观察到(S)-和(R)-差向异构体在溶液中的比例为6.6:1，有利于(S)-差向异构体(图4)。

通过加入0.5mL水将0.5mL来自NMR研究的D₂O溶液稀释至1mL(1.15mg/mL)。将20μL的该溶液注入HPLC中。

稀释的NMR样品的HPLC分析证实，(S)-差向异构体在3比(R)-差向异构体4更好地吸收到溶液中，观察到(S)-和(R)-差向异构体在溶液中的比例为5:1，有利于(S)-差向异构体，与NMR数据大致一致(图5B)。

用另一种吉西他滨磷酸酯衍生物进行的类似研究显示该衍生物的(S)-和(R)-差向异构体吸收到环糊精溶液中没有差异。

实施例4

大多数药物的清除率和生物利用度受到它们在肝脏中的首过代谢的强烈影响。可以通过将化合物与冷冻保存的肝细胞孵育并测定孵育混合物中测试化合物的初始对最终量来估计体外的相对肝“代谢稳定性”。以下程序是使用合并的人类冷冻保存的肝细胞悬浮液的HPLC-MS/MS测定。

测定基质

人肝细胞：混合性别和10人库

最终细胞密度：1百万(10⁶)个活细胞/mL

实验方案

将汇集的冷冻保存的肝细胞解冻、洗涤并重悬于Krebs-Heinslet缓冲液(pH7.3)中。通过将测试化合物(1μM终浓度)加入到细胞悬浮液中并在平底96孔板上以100μL的终体积在37℃/5％CO₂下分别孵育0分钟和120分钟来引发反应。通过向孵育混合物中加入100μL乙腈来终止反应。然后将样品在板振荡器上轻轻地短暂混合，完全转移至0.8mL V型底96孔板，并在室温下以2550xg离心15分钟。将每种上清液(150μL)转移至干净的集束管，随后在Thermo Electron三重四极杆系统上进行HPLC-MS/MS分析。

修改该测定用于半衰期测定。在这种情况下，采样时间点为0、30、60、90和120分钟。

参照化合物

与测试化合物同时测试四种参照化合物(1μM)。普萘洛尔与人肝细胞相对稳定，而氟西泮、纳洛酮和特非那定与人肝细胞相对不稳定。

分析方法

使用选择的反应监测(SRM)通过(RP)HPLC-MS/MS分析样品。HPLC条件由具有自动进样器的HP1100二元泵、C-12混合模式、2×20mm柱和梯度组成。

数据分析

通过HPLC-MS/MS记录对应于测试化合物的峰面积。代谢稳定性，表示为剩余的测试化合物的百分比，通过比较测试化合物在2小时至时间0的峰面积来计算。在半衰期测定的情况下，假设一级动力学，根据剩余的测试化合物(％)对时间的对数曲线的初始线性范围的斜率估计半衰期。

结果示于表7。

表7显示S差向异构体，R差向异构体和两种差向异构体的混合物的内在清除率。

Claims

1.一种药物制剂，其包含非对映异构体纯度大于90％的吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯3：

或其药学上可接受的盐或溶剂合物，以及至少一种药学上可接受的赋形剂，其中所述制剂是还包含极性有机溶剂的水性制剂。

2.根据权利要求1所述的药物制剂，其中所述制剂用于肠胃外施用。

3.根据权利要求2所述的药物制剂，其中所述制剂用于静脉内施用。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物制剂，其中所述制剂还包含环糊精。

5.根据权利要求1所述的药物制剂，其中所述制剂用于口服施用。

6.根据前述权利要求中任一项所述的药物制剂，其中所述吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯3是游离碱的形式。

7.根据前述权利要求中任一项所述的药物制剂，其中所述吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯3的非对映异构体纯度大于95％。

8.根据权利要求7所述的药物制剂，其中所述吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯3的非对映异构体纯度大于98％。

9.根据权利要求8所述的药物制剂，其中所述吉西他滨-[苯基-苯甲酰氧基-L-丙氨酰基)]-(S)-磷酸酯3的非对映异构体纯度大于99.5％。

10.根据前述权利要求中任一项所述的药物制剂用于制备治疗癌症的药物的用途。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述癌症选自：胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、结肠直肠癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、胆管癌、肾癌、子宫颈癌、胸腺癌、未知原发位点的癌症、淋巴瘤或白血病。