PT99012A - Processo para a preparacao de novos derivados de 1-fenil-3-fenil-2-propino-1-ona e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

"PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE NOVOS DERIVADOS DE l-FENIL-3-«-FENIL-2-PROPINO-1-ONA E DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM”

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito âs l-fenil-3-fenil--2-propino-l'^onas, â utilização destes compostos como bloquea-dores da incorporação do cálcio em leucócitos e trombôcitos, âs composições farmacêuticas que contêm estes compostos como ingredientes activos e ao processo para a sua preparação.

ANTECEDENTES

Os leucócitos polimorfornucleares (leucócitos) propor cionam um meio de defesa fundamental contra as infecçóes microbianas. A resposta aos microrganismos invasores provoca a acti-vação dos processos celulares oxidativos (produção de radicais hidroxilo e não oxidativos (enzimas digestivas; mieloperoxida-se, elastase, etc,) de modo a destruir eficazmente os microrganismos, No entanto, a resposta dos leucócitos a um estimulo estranho pode também causar a destruição dos tecidos do hospedeiro e desempenha um papel importante na patogénese de várias situações de doença não infecciosa.

Os leucócitos possuem uma grande variedade de mecanis mos que lhes possibilitam responder a estímulos estranhos, os quais são iniciados pelos receptores da superfície celular. A -2 activação dos receptores e a activação global da célula resulta numa alteração da fisiologia celular, fazendo com que a pró pria célula se torne "ativada”, As moléculas intracelulares indicadoras da activação, designam-rse freguentemente por mensa geiros secundários, sendo os mensageiros primários, os próprios ligandos activadores extracelulares.

Um dos principais mensageiros secundários, em muitas células, é o ião cálcio CCa2+). Existem dois modos gerais segun do os guais os receptores da superfície celular geram sinais de cálcio intracelular. Um ê pela activação da fosfolipase C. Esta enzima gera trifosfato de inositol, o gual, por sua vez, liberta o cálcio armazenado na célula. Alternativamente, os receptores celulares podem abrir ou fechar os canais de iões, deixando gue o cálcio entre na célula vindo do meio extracelular. Os ca-nais de iao Ca existentes na membrana sao de dois tipos: (1) canais de cálcio sensíveis â diferença de potencial, os guais são activados guando um pegueno fluxo transitório de iões altera ligeiramente a diferença de potencial da membrana plasmãtica, ou (2) canais operados por receptores, os quais são abertos di-réctamente pelos ligandos dos receptores. 0 primeiro mecanismo actua principalmente em células sensíveis â diferença de potencial, tais como os neurõnios e as células musculares. Muitas cê lulas, tais como os leucócitos, nao são primariamente sensíveis ã diferença de potencial mas têm receptores na superfície celu-lar gue estão funcionalmente ligados a canais de iao. Ca na mem brana plasmãtica sensíveis aos receptores, A ligação com certos ligandos activa estes receptores, permitindo assim a abertura ~ 2+ dos canais e a entrada de iao Ca para o citosol, onde o mesmo vai actuar como segundo mensageiro. -3-

Quando as células são activadas, o que corresponde a um influxo de ião Ca2+, as estruturas intracelulares que se ligam ao ião Ca , respondem a estas alterações, dependendo da sua afinidade e especificidade relativas para o cálcio, Conhe-cem-rse algumas proteínas Ca -«-dependentes, A primeira proteína deste tipo, que se descobriu e caracterizou foi a troponina C que se encontrou em células do músculo esquelético com activi-dade elêctrica. Uma proteína Ca -dependente recentemente descoberta, a qual existe tanto em células sensíveis â diferença de potencial como em células sensíveis a receptores, foi a cal modulina. Dentro do número crescente de proteínas celulares, 2+ que se sabe serem reguladas pela calmodulina de um modo Ca --dependente, encontram-se algumas formas de nucleõtidos cíclicos fosfodiesterase e adenilato ciclase, assim como ATPases de pendentes da ligação do cálcio â membrana, fosforil-quinase, miosina-quinases de cadeia curta e a sua associação com os fusos do aparelho mitõtico e os feixes de filamentos de actina. Apesar de não se conhecer o número total de proteínas dependen tes do cálcio ou afectadas por enzimas Ca -dependentes, é cia ro que o cãlcio é necessário como meio de activação destes pro cessos.

Quando se activam os leucócitos, podem ocorrer deter minados eventos que são importantes na condução a estados de doença, mediados pelo cãlcio intracelular. Por exemplo, pensasse que os leucócitos, principalmente os neutrôfilos, desempenham um papel importante nos sintomas e danos dos tecidos do hospedeiro nas seguintes doenças? gota, artrite reumatõide, vas culite auto-^imune,. glomerulonefrite, doenças inflamatórias dos intestinos, síndrome de dificuldade respiratória do adulto, en- -4- fisema, asma, lesões térmicas associadas â hemólise e neoplas- mas malignos em locais de inflamação crõnica (Halecli e Gallin; 1987), Parece, portanto, ser desejável a inibição da entrada ~ 2+ „ de iao Ca nos leucócitos de modo a aliviar ou atrasar a progressão destas doenças imunolõgicas e inflamatórias, associadas â incorporação de cálcio, A entrada de Ca nos leucõcitos e a melhoria das doen çãs imunolõgicas e inflamatórias pode estender-se âs doenças associadas â pele e tecidos dêrmicos. Incluem-se na lista destas doenças inflamatórias relacionadas com a via tõpica, aquelas associadas â pele e a derme, incluindo dermatoses neutrõfi-las, dermatites crónicas/ psoriase, dermatites de contacto, der matite atõpica e seborreica e o acne, 0 cálcio ê também um importante mediador nos trombõci tos (plaquetas), onde ê sabido que o iao Ca é um mediador necessário no mecanismo intrínseco da coagulação do sangue. Por „ 2+ ~ exemplo, a necessidade de iao Ca nos processos de coagulaçao sanguínea e de formação de trombos ê bem conhecida e podem inibir-se estes processos in vitro e, em certo grau, in vivo, pela adição de agentes quelantes, tais como o EDTA, o citrato ou o oxalato, que se vão ligar ao ião Ca2+, Sabe-se que o ião Ca2+ desempenha um papel importante na cascata fibrinolítica e é um mecanismo activo através do qual se pode modular terapeuticamen te a resposta fibrinolítica.

Uma das funções primárias das plaquetas é desempenhada no local de lesão vascular onde formam agregados de coágulos para fechar a ferida. Esta resposta pode também ter vários efei tos secundários prejudiciais, por exemplo, durante a reperfusão isquêmica a formação do trombo pode conduzir â oclusão da arte-

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ria, a ponto de poder causar um enfarto do miocãrdio, Ê, portan to, desejável em multas circunstâncias inibir a incorporação de ião Ca nas plaquetas de modo a controlar a resposta trombolí- tica. A entrada de ião Ca para o citosolr através de varias formas de actáivação mediada por receptores ou pela descar-ga de quantidades armazenadas intracelularmente, estã ligada de modo crítico a certos acontecimentos intracelulares da activa- ção leucocitãria e de agregação plaquetãria, A alteração das <« 2+ vias de mobilização do iao Ca proporciona um mecanismo de modulação das respostas dos leucócitos e das plaquetas. Assim, '· „ „ 2+ compostos que inibam a mobilização do iao Ca podem reduzir os processos de doença Ca - dependentes associados â activação e inibição dos leucócitos em doenças inflamatórias e auto-imunes e nas situações envolvendo a agregação plaquetãria em certas pa tologias trombolíticas.

SUHÃRIO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito aos novos derivados da l-fenil-3-fenil-2-propino-l-ona, os quais são úteis como ini-bidores da incorporação de cálcio em (1) leucócitos associada âs doenças inflamatórias agudas e crónicas e doenças auto-imunes in cluindo (2) doenças da pele e dos tecidos dêrmicos relacionadas com as primeiras. Finalmente, a presente invenção diz respeito também ao uso dos derivados da l-fenil-3-fenil-2-propino-l-ona, no tratamento de (3) processos do sistema trombolítico dependentes do cálcio, A presente invenção diz respeito a compostos de fórmula geral; 1 -6-R, R o R, 2

1 2 R, 3 R '3 (1)

U na qual

Rif R2 e R^ representam, cada um, independentemente, um átomo de hidrogénio ou de halogêneo, um grupo alquilo ou alcoxi ou um grupo de fórmula ge- ral -N(Y,)(Yn) ou X -(Ar)-(CH_) -O- em cue Yn e Yn 12 z 2 n “12 representam, cada um, independentemente, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo C^g; Ar representa um grupo fenilo ou naftilo; n representa zero. ou o numero inteiro 1; X representa um grupo alcoxi; ou um grupo de fórmula geral -N(Y^)(Y2), na qual Y^ e Y2 tem os significados definidos antes; e Z representa zero ou o numero inteiro 1 ou 2, ou os seus sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. A presente invenção proporciona também um método para inibir a incorporação de cálcio em um paciente necessitado desse tratamento, que consiste em administrar ao paciente uma quan tidade inibidora eficaz, do ponto de vista terapêutico, de um composto de fórmula geral (1),

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA PA INVENÇÃO

Tal como aqui se utiliza a designação "grupo alquilo CM" diz respeito a um radical hidrocarbilo,de cadeia linear -7- Ιγ, ou ramificada, saturada, cgm 1 a 6 átomos de carbono. Encontram τ-se incluídos no âmbito desta designação, os grupos metilo, et^ lo, ητ-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, t-^butilo, n-^pentilo, n—hexilo e afins, A designação "grupo alco-xi C^g” diz respeito aos grupos metoxi, etoxi, propoxi e afins. Entendesse também que a designação "grupo de fórmula geral X -s(Ar)s(CH2)nsQsn especificamente inclui os grupos benziloxi, (4-metoxi)-benziloxi, (4-dimetilamino)-benziloxi e afins. 0 ter mo "halogeneo" diz respeito aos ãtomos de fluor, cloro, bromo e iodo.

Podem preparar-se os compostos de fórmula geral (1) através de procedimentos e técnicas conhecidas pelos especialis tas na matéria. No Esquema A, apresenta-se um esquema geral de síntese para preparação dos compostos de fórmula geral (1), no qual todos os símbolos, salvo indicação em contrario, têm os significados definidos antes. •«, /...

ESQUEMA A

Br

4 passo c

De um modo geral, pode preparar-se uma l-fenil-3-fe-nil^^propino-l^-ona de estrutura !>, num processo em três passos, de acordo com o Esquema A,

No passo a, pode preparar-se o 21,2'-dibromc-estireno de estrutura 2 apropriado, fazendo reagir o benzaldeído de estrutura 1 apropriado com tetrabrometo de carbono e trifenilfos-fina, no seio de um dissolvente aprôtico apropriado, tal como o cloreto de metileno.

No passo b, pode preparar^se o fenilacetileno de estrutura 3 apropriado, fazendo reagir o 2',2'-dibromo-estireno -9- U- de estrutura 2 apropriado, com uma base não nucleõfila, tal como o n-butilr-lítio, no seio de um dissolvente aprético apropria do, tal como o tetra-hidrofurano.

No passo c, pode preparar-se a l-fenil-3-fenil-2-pro-pino-l-ona de estrutura' 5_, apropriada, fazendo reagir o fenil-acetileno de estrutura _3, apropriado, com uma base não nucleõ-fila, tal como o n-butil-iítio, a hexametildissilazano de lí-tio ou o dicisopropilamideto de litio, no seio de um dissolven te aprõtico apropriado, tal como o tetra-hidrofurano. Faz-se reagir o acetileto de litio correspondente com a N-metoxi-N-me tilbenzamida (reagente de Weinreb) de estrutura £, apropriada, para se obter a correspondente l-fenil-3-fenil-2-propino-l-ona de estrutura 5.

Alternativamente, pode preparar-se a l-fenil-3-fenil-^2-propino-l-ona de estrutura 5_, apropriada, combinando os passos b e c. Por exemplo, o acetileto de litio apropriado obtido do passo b pode ser utilizado directamente na reacção com a N--metoxi-N-metilbenzamida (reagente de Weinreb) de estrutura 4_, apropriada, para se obter a l-fenil-3-fenil-2-propino-l-ona de estrutura 5 correspondente.

Os compostos iniciais a utilizar nos procedimentos gerais sintéticos, representados no Esquema A, estão facilmente ao alcance dos entendidos na matéria. Por exemplo, determinadas N-metoxi-N-metilbenzamidas estio descritas em Tetrahedron Letters, 22 (.39) (.1981) 3815-18.

Os exemplos seguintes( apresentam sínteses típicas, tal como se descrevem no Esquema A. Entende-se que estes exemplos são apenas ilustrativos e não devem limitar o âmbito da presente invenção em nenhum sentido. Tal como são usados neste -10- u documentof os termos que se seguem têm os significados que se indicam; "g" refere—se a gramas? "mmole" refere-se a milimoles; "mole" refere-se a moles; "ml" refere-se a mililitros; "p,e" refere-se a ponto de ebulição; "°C" refere-se a graus Celsius; "mmHg" refere-se a mllimetros de mercúrio; "p.f." refere-se a ponto de fusão; "mg" refere-se a miligramas; njM" refere-se a micromolar; ”jig" refere-se a microgramas.

Exemplo 1 l-Fenil-3-(3,4,5-trimetoxifenil)-2-propino-ona II ...

Passo a; 3,4,5-Trimetoxi-2 ,2 -dibromoestireno

Misturam-se 3,32 g (10 mmoles) de tetrabrometo de car bono e 7 ml de cloreto de metileno e arrefece-se a mistura atê â temperatura de 0°C« Adiciona-se, gota a gota, uma solução 5,24 g de trifenilfosfina (20 mmoles) em 7 ml de cloreto de metileno e agita-se à temperatura de 0°C, durante 30 minutos. Adiciona--se, gota a gota, 0,981 g (5 mmoles) de 3,4,5-trimetoxibenzal-deído em 10 ml de cloreto de metileno. Retira-se o banho de gelo e agita-se â temperatura ambiente durante 30 minutos. Verte--se sobre gel de sílica e elui-se com uma mistura de 5% de acetato de etilo/hexano. Evapora-se o dissolvente sob vazio para obter 1,57 g do composto designado no título.

Passa b e passo c~ l-fenil-3- (3,4,5-trimetoxifenil) -2-proplno~ -1-ona

Colocam-se 1,57 g (4,46 mmoles) de 3,4,5-trimetoxi-

I I -2 ,2 -dibromoestireno em 15 ml de tetra-hidrofurano, sob atmo£ fera de argon e arrefece-se atê ã temperatura de -78°c, Adicio- -11- na-sef gota a gota, 5(85 ml de uma solução 1,6M de n-butil-lí-tio em hexano (9,36 mmoles) e agitasse durante 1 hora â temperatura de t78°C, Removesse o banho de arrefecimento e agita-se durante 1 hora â temperatura ambiente. Arrefecesse atê â tempe ratura de r78°C e adicionasse 1 ml (6,6 mmoles) de N-metoxi-N-cmetilbenzamida, Removesse o banho de arrefecimento e agita-se â temperatura ambiente durante 45 minutos. Partilha-se entre êter dietílico e âgua, separa-se a fase orgânica, seca-se e eva pora-se o dissolvente sob vazio para obter um sólido. Recrista-liza-se em uma mistura de clorofórmio/hexano (1:2) para obter 0,48 g do composto designado no titulo; p.f.; 158°-160°c.

Exemplo 2 l-fenil-3-/* 3-(4-metoxibenziloxi)fenil y-2-propino-l-ona

Passo a: 3- (4-metoxibenziloxi)-2',2'-dibromoestireno

Misturam-se 2,69 g (22 mmoles) de 3-hidroxibenzaldeí-do, 2,71 ml (20 mmoles) de cloreto de £-metoxibenzilo, 3,04 g (22 mmoles) de carbonato de potássio, 1,5 g (10 mmoles) de iode to de sódio e 60 ml de acetona. Aquece-se a mistura sob refluxo durante 16 horas, arrefece-se atê â temperatura ambiente e remo ve-se o dissolvente sob vazio para se obter um resíduo sólido. Partilha-se o resíduo entre êter dietílico e hidróxido de sódio a 6%. Separa-se a fase orgânica e remove-se, por filtração, algum sólido não dissolvido na fase orgânica. Seca-se com MgS04, filtra-se e evapora-se o dissolvente sob vazio para se obter um sólido. Suspende-se o solido.em hexano, filtra-sê e seca-se ao ar para obter 4,10 g (rendimento de 84,6%) de 3-(4-metoxibenzi-loxi)Tbenzaldeído; p.f,: 78°-81°C, -12-

Misturam-se 10,61 g (32 mmoles) de tetrabrometo de carbono e 15 ml de cloreto de metileno, coloca-se sob atmosfe ra de Srgon e arrefece-se atê a temperatura de 0QC, Adicionasse, -gota a gota, uma solução de 16,77 g (64 mmoles) de trife nilfosfina em 15 ml de cloreto de metileno e agita-se durante 30 minutos ã temperatura de 0°C, Adiciona-se, gota a gota, uma solução de 3,88 g (16 mmoles) de 3-(4-metoxibenziloxi)-benzal-deído em 15 ml de cloreto de metileno. Remove-se o banho de ge lo e agita-se durante 1 hora â temperatura ambiente. Verte-se sobre gel de sílica e elui-se com uma mistura de 5% de acetato de etilo/hexano, Evapora-se o dissolvente sob vazio para obter um solido. Faz-se uma pasta com o sólido em hexano, filtra-se e seca-se ao ar para obter 3,8 g (lâ recolha) e 0,405 g (2â re colha) do composto designado no título; p.f.; 760-79°C.

Passo b; 3-(4-metoxibenziloxi)fenilacetileno

Coloca-se sob atmosfera de ãrgon, 9 ml (22,5 mmoles) de uma solução 2,5M de n-butil-lítio em hexano e 50 ml de te-tra-hidrofurano e arrefece-se em um banho de neve carbónica/ace tona. Adiciona-se uma solução de 4,25 g (10,7 mmoles) de 3-(4-

I I -metoxibenziloxi)-2 ,2 -dibromoestireno em tetra-hidrofurano e agita-se durante 1 hora a baixa temperatura. Remove-se o banho de arrefecimento e agita-se durante 1 hora à temperatura ambien te, verte-se a solução de cor amarela sobre uma solução aguosa saturada de cloreto de amónio e extrai-se com éter dietílico. Separar a fase orgânica, seca-se com MgSQ4, filtra-se e evapora -se o dissolvente sob vazio para obter um .sólido. Recristaliza--se em uma mistura de hexano/clorofórmio para obter 1,73 g do composto designado no título? p.f.: 92 -95 C«

Passo σ; l-fenil-S-/* 3- (4-metoxfbenziloxi) fenji _7-2-propino-l-Qna Colocasse sob atmosfera de argon, 2 ml (2 mmoles) de uma solução 1M de hexametildissilazano de lítio em tetra-hidro-furano e 8 ml de tetra-hidrofurano e arrefece-se atê â temperatura de 0°C. Adiciona-se uma solução de 0,48 g (2 mmoles) de 3--(4-metoxibenziloxi)-fenilacetileno em tetra-hidrofurano e agitasse a solução de cor castanha durante 45 minutos ã temperatura de 0°C, Adiciona-se 0,4 g (.2,4 mmoles) de N-metoxi-N-metil-benzamida, remove-se o banho de arrefecimento e agita-se durante 1 hora â temperatura ambiente. Partilha-se entre êter dietí-lico e ãgua, separa-se a fase orgânica e seca-se com MgSO^. Fil tra-se e evapora-se o dissolvente sob vazio para obter um resíduo oleoso. Filtra-se através de gel de sílica e elui-se com uma mistura de 10% de acetato de etilo/hexano, para obter um sõ lido impuro. Recristaliza-se em hexano e éter dietxlico para ob ter 0,26 g (1- recolha) e 0,15 g (2- recolha) do composto desi£ nado no titulo·; p.f.s 79O-80OC.

Exemplo 3 l-Fenil-3-/* (4-benziloxi)fenil^7-2-prQpÍnQ-l-ona

Passo a:' 4-benziloxi-2', 2'1 -dibromoe st Irene

Misturam-se 3,32 g (10 mmoles) de tetrabrometo de car bono e 7 ml de cloreto de metileno, coloca-se sob atmosfera de ãrgon e arrefece-se até à temperatura de 0°C, Adiciona-se, gota a gota, uma solução de 5,24 g (20 mmoles) de trifenilfosfina em 7 ml de cloreto de metileno e agita-se durante 30 minutos â tem peratura de 0°c, Adicionasse, gota a gota, 1,06 g (5 mmoles) de 4-benziloxibenzaldeIdo em 1Q ml de cloreto de metileno. Remove- :w- -se o banho de gelo e agita-se â, temperatura ambiente durante 2 horas. Verte—se sobre gel de sílica e elui—se com uma mistura de 5% de acetato de etilo/hexano, Evapora-se o dissolvente sob vazio para obter 1,68 g (rendimento de 91%) do composto de signado no titulo.

Passos b e c; i-Fehi 1-3^:/ (4-benziloxi) f enil 2-propino—1-ona

Coloca-se sob atmosfera de ãrgon, uma solução de 1,68 g (4,56 nunoles) de 4-benziloxi-2',2'-dibromoestireno em 15 ml de tetra-hidrofurano e arrefece-se atê â temperatura de -78°C, Adiciona-se, gota a gota, n—butil-lítio (?????) e agita-se durante 45 minutos, â temperatura de -78°C. Remove-se o banho de arrefecimento e agita-se durante 1 hora, â temperatura ambiente, Arrefece-se a solução de cor amarela atê â temperatura de -78°C e adiciona-se 1 ml (6,6 mmoles) de N-metoxi-N-metilbenza mida. Remove-se o banho de arrefecimento e agita-se durante to da a noite, ã temperatura ambiente. Partilha-se entre éter di-etílico e agua, separa-se a fase orgânica e seca-se com MgSO^. Filtra-se e evapora-se o dissolvente sob vazio para obter um resíduo solido, Recristaliza-se em uma mistura de hexano/clorofórmio para obter 0,76 g do composto designado no titulo; p,f,í 122°-124°C,

Exemplo 4 1- (3,4,5—trimetQXifenil)-3-fenil-2—propino-i-ona A temperatura ambiente dissolvem-se 2,3 g (10 mmoles) de cloreto de 3,,4,5-trimetoxibenzoIlo e 1,10 g (11 mmoles) de cloridrato de Ν,Ό-dimetil—hidraxiamina em clorofórmio isento de etanol. Arrefece-se a solução, atê â temperatura de 0 C e adicio -15- nam-se 1,85 g (22 mmoles) de piridina, Agitasse durante 1 hora â temperatura ambiente e evaporasse o dissolvente sob vazio. Partilhasse o resíduo entre solução aquosa de cloreto de sõdio e uma mistura de êter dietílico/cloreto de metileno (1:1)» Se-parasse a fase orgânica, secasse com Na2SÇ>4 e evapora-se o dis solvente sob vazio para obter um õleo. Filtra—se o óleo através de gel de sílica, eluindo com uma mistura de 65% de acetato de etilo/hexano para obter 2,5 g de N-metoxi-N-metil-(3,4,5-trime-toxi)-benzamida.

Coloca-se sob atmosfera de argon, 3 ml (.3 mmoles) de uma solução 1M de hexametildissilazano de lítio em tetra-hidro-furano e 10 ml.de tetra-hidrofurano e arrefece-se atê a tempera tura de 0°C, Adiciona-se 0,33 ml (3 mmoles) de fenilacetileno e agita-se durante 30 minutos a temperatura de 0°C, Adiciona-se 0,76 g (3 mmoles) de N-metoxi-N-metil-(3,4,5-trimetoxi)-benzami da, remove-se o banho de arrefecimento e agita-se durante 1 hora â temperatura ambiente. Partilha-se entre éter dietílico e solução aquosa saturada de cloreto de sõdio, separa-se a fase orgânica e seca-se com MgSO^. Filtra-se e evapora-se o dissolvente sob vazio. Verte-se sobre gel de sílica e elui-se com uma mistura de 20% de acetato de etilo/hexano para obter um solido impuro. Recristaliza-se em uma mistura de hexano/acetato de eti lo para obter 0,31 g do composto designado no título; p.f.: 94° -96°C.

Exemplo 5 1-f eni1-3-feni1-2-propino-1-ona

Coloca—se sob atmosfera de argon 10 ml de uma solução

1,5M de diisopropilamideto de lítio em ciclo-hexano e 40 ml de tetrar-hidrofurano e arrefecesse atê â temperatura de 0 C, Adiciona-se, gota a gota, 1,65 ml (15 mmoles) de fenilacetileno. Removesse o banho de arrefecimento e agitasse durante 30 minutos â temperatura ambiente. Arrefece-se a solução de cor amare la atê â temperatura de 0°c e adiciona-se, gota a gota, 3,04 ml de N-metoxi-N-metilbenzamida (.20 mmoles), Remove-se o banho de arrefecimento e agita-se durante 30 minutos â temperatura ambiente. Verte-se sobre êter dietílico e âgua, separa-se a fa se orgânica e secas-se com MgS04, Filtra-se e evapora-se o dissolvente sob vazio para obter um ôleo, Purifica-se o. óleo por cromatografia em gel de sílica, usando como eluente, uma mistu ra de 2% de acetato de etilo/hexano, Purifica-se novamente por destilação (2 vezes) para obter 1,9 g do composto designado no título; p,e,; 210°C sob vazio.

Exemplo 6 l-Fenil-3-(3-benziloxífenil)-2-propino-l-ona

Passo a; 3-Benziloxi-21,21-dibromoestireno

Coloca-se sob atmosfera de ãrgon, 16,6 g (50 mmoles) de tetrabrometo de carbono e 25 ml de cloreto de metileno e arrefece-se atê â temperatura de 0°C, Adiciona-se, gota a gota, uma solução de 26,2 g (0,1 mole) de trifenilfosfina em 25 ml de cloreto de metileno e agita-se a temperatura de 0°C durante 30 minutos. Adiciona-se, gota a gota, uma solução de 5,31 g (25 mmoles) de 3-benziloxibenzaldeído em 50 ml de cloreto de metile no. Remove-se o banho de arrefecimento e agita-se durante 1 hora H temperatura ambiente. Verte-se sobre 6QQ ml de gel de síli -17- -17-

ca e elui-se com uma mistura de 5% de acetato de etilo/hexano para obter 7,4 g do composto designado no título (rendimento de 80,4%)*

Passo b; 3-benz iloxifenilacetileno

Coloca-se sob atmosfera de ãrgon 8,2 g (22,3 ramoles) de 3-benziloxi-2',2,-dibromo-estireno e 70 ml de tetra-hidrofu rano e arrefece—se até â temperatura de —70°C. Adicionam-se, gota a gota, 18,7 ml (47 mmoles) de uma solução 1,5M de n-butil_ -litio em hexano, Agita—se durante 1 hora â temperatura de -7Q°C e depois durante 1 hora à temperatura ambiente. Verte-se sobre uma mistura de éter dietílico e agua, separa-se a fase orgânica e seca-se com MgSO^. Filtra-se e evapora-se o dissolvente sob vazio. Purifica-se por cromatografia líquida preparativa, usando como eluente, uma mistura de 2% de acetato de etilo/hexano para obter 2,73 g do composto designado no título.

Passo c; l-Fenil-3-(3-benziloxifenil)-2-propino-1-ona

Coloca-se sob atmosfera de ãrgon 15 ml (15 mmoles) de uma solução 1M de hexametildissilazano em tetra-hidrofurano e 75 ml de tetra-hidrofurano e arrefece-se com um banho de gelo e ãgua. Adiciona-se, gota a gota, uma solução de 3,13 g de 3-benziloxifenilacetileno (15 mmoles) em tetra-hidrofurano. Agita-se durante 45 minutos â temperatura de 0°C e adicionam--se depois, gota a gota, 2,45 ml de N-metoxi-N-metilbenzamida (16 mmoles), Removesse o banho de arrefecimento e agita-se â temperatura ambiente durante 1 hora. Partilha-se entre éter di etílico e ãgua, separa-se a fase orgânica e seca-se com MgS04· Filtra—se e evapora-se o dissolvente sob vazio para obter um solido impuro, Recristaliza-se em uma mistura de hexano/aceta- -18- to de etilo para obter 2,67 g do .composto designado no titulo (rendimento de 57%); p,f,:‘ 75Q^77°C,

Exemplo 7 l-fenil~3-/* 3- (4-etoxibenziloxl) fenil ./^-propinc-l-cna

Passo a: 3-(4-EtoxibenzilQxi)-21 *2'-dibromo-estireno

Misturam-se 3,3 g (22 mmoles) de 4-etoxibenzáldeído, 830 mg (22 mmoles) de boro-hidreto de sodio e 25 ml de etanol absoluto, Agita-se â temperatura ambiente, até a reacçao se completar, verte-se sobre acido clorídrico diluido e extrai-se com acetato de etilo.. Separa-se a fase orgânica e extrai-se a fase aquosa com acetato de etilo (duas vezes). Reunem-se as fa ses orgânicas e seca-se com MgS04, Evapora-se o dissolvente sob vazio e purifica-se por cromatografia em gel de sílica para obter o álcool 4-etoxibenzllico.

Misturam-se 3,35 g (22 mmoles) de álcool 4-etoxiben-zílico, 2,69 g de 3-hidroxibenzaldeído (22 mmoles) 5,8 g (22 mmoles) de trifenilfosfina e 3,83 g (22 mmoles) de azodicarbo-xilato de dietilo em 25 ml de tetra-hidrofurano. Agita-se à tem peratura ambiente e sob atmosfera anidra até que a reacçao se complete. Concentra-se a solução sob vazio e dilui-se com uma pequena quantidade de éter dietllico. Filtra-se qualquer precipitado e concentra-se o filtrado sob vazio. Purifica-se por cro matografia em gel de sílica para obter o 3-(4-etoxibenziloxi)--benzaldeldo,

Misturam-r-se 1Q,61 g (32 mmoles) de tetrabrometo de carbono e 15 ml de cloreto de metileno. Coloca-se sob atmosfera de ârgon e arrefecesse até â temperatura de 0°C, Adiciona—se. -19- gota a gota, uma solução de 16,77 g (.64 mmoles) de trifenilfO£3 fina em 15 ml de cloreto de metileno e agitasse durante 30 mi-nutos â temperatura de 0 C, Adicionasse, gota a gota,, uma saiu ção de 4,10 g de 3-(4-etQxibenziloxi)—benzaldeldo (16 mmoles) em 15 ml de cloreto de metileno* Removesse o banho de gelo e agitasse durante 1 hora â temperatura ambiente* Vertesse sobre gel de sílica e eluisge com uma mistura de 5% de acetato de etilo/hexano. Evaporasse o dissolvente sob vazio para obter o composto designado no titulo.

Passo b: 3-(4-Etoxibenziloxi)fenilacetileno

Colocasse sob atmosfera de ãrgon, 9 ml de uma solução 2,5M de n-butil-litio em hexano (22,5 mmoles) e 50 ml de tetra-—hidrofurano e arrefece-se em um banho de neve carbônica/aceto— na. Adiciona-se uma solução de 4,41 g de 3-(4-etoxibenziloxi)-s2',2'-dibromo-estireno (10,7 mmoles) em tetra-hidrofurano e agita-se durante 1 hora a baixa temperatura. Remove-se o banho de arrefecimento e agita-se durante 1 hora â temperatura ambien te. Verte-se a solução sobre solução aquòsa saturada de cloreto de amónio e extrãi-se com êter dietílico. Separa-se a fase orgã nica, seca-se com MgSO^, filtra-se e evapora-se o dissolvente sob vazio para obter o composto designado no titulo.

Passo c; l-fe'nÍl-3-/’ 3-(4-etOXibenziloxi)fenil J-2-propino-1--ona

Colocam-se sob atmosfera de argon 2 ml de uma solução 1M de hexametildissilazano de lltio em tetra-hidrofurano (2 mmoles) e 8 ml de tetra-hidrofurano e arrefece-se atê â temperatura de 0°C, Adiciona-se uma solução de 0,51 g (2 mmoles) de 3-(4retoxibenziloxi)—fenilacetileno em tetra-hidrofurano e agi -20- ta-se durante 45 minutos â temperatura de 0°c„ Adiciona-se 0,4 g (2,4 mmoles) de N^metoxi-N-metilbenzamida, remove-se o banho de arrefecimento e agita-se durante 1 hora â temperatura ambien te» Partilha-se entre éter dietílico e ãgua, separa-se a fase orgânica e seca—se com MgSO^, Filtra-se e evapora-se o dissolvente sob vazio, para obter um õleo. Filtra-se através de gel de sílica e elui-se com uma mistura de !Q% de acetato de etilo/te xano para obter um sõlido impuro. Purifica-se por cromatografia em gel de sílica para obter o composto designado no título.

Exemplo 8 1-Fenil—3-·/* 3- (4-(dimetilamino)benziloxl)fenil ^/-2-propino-l-ona

Passo a; 3-(4-(Dimetilamlno)benzjloxi)-2',21-dibromo-estireno

Misturam-se 3,3 g de 4-dimetilaminobenzaldeído (22 mmoles), 830 mg de boro-hidreto de sõdio (22 mmoles) e 25 ml de. etanol absoluto. Agita-se, â temperatura ambiente até que a reacção se complete. Verte-se sobre ácido'clorídrico diluído e extrai-se com acetato de etilo. Separa-se a fase orgânica e ex trai-se novamente a fase aquosa com acetato de etilo (duas vezes) , Reunem-se as fases, orgânicas e seca-se com MgSO^, Evapora-se o dissolvente sob vazio e purifica-se por cromatografia em gel de sílica para obter o álcool 4-(dimetilamino)-benzíli-co.

Misturam-se 3,35 g (22 mmoles) de álcool 4-(dimetilamino) -benzilico, 2,69 g (22 mmoles) de 3-hidroxibenzaldeído, 5,8 g de trifenilfosfina (.22 mmoles) e 3,83 g de azodicarboxi-lato de dietilo (22 mmoles) em 25 ml de tetra-hidrofurano. Agi ta-se â temperatura ambiente sob atmosfera anidra, até que a -21- -21-

reacção se complete, Concentrasse a, solução sob vazio e diluísse com uma pequena quantidade de êter dietílico, Filtra-se qualquer precipitado e concentrasse o filtrado sob vazio, Puri ficasse por cromatografia em gel de sílica para obter o 3-(4-sdimetilamino)-benziloxi)-benzaldeído.

Misturamsse 10f61 g (32 mmoles) de tetrabrometo de carbono e 15 ml de cloreto de metileno. Coloca-se sob atmosfera de àrgon e arrefecesse atê a temperatura de 0°C. Adicionasse, gota a gota, uma solução de 16,77 g (64 mmoles) de trife-nilfosfina em 15 ml de cloreto de metileno e agita-se durante 30 minutos â temperatura de 0°C, Adiciona-se gota a gota, 4,10 g (16 mmoles) de 3—(4s(dimetilamino)-benziloxi)-benzaldeído em 15 ml de cloreto de metileno. Remove-se o banho de gelo e agi-ta-se durante 1 hora à temperatura ambiente,. Verte-se sobre gel de sílica e elui-se com uma mistura de 5% de acetato de etilo/te xano. Evapora-se o dissolvente sob vazio para obter o composto designado no título.

Passo b; 3-· (4- (dimetilamino) benziloxi) fenilàcetileno

Colocam-se sob atmosfera de ãrgon, 9 ml de uma solução 2,5M de n-butil-lítio em hexano (22,5 mmoles) e 50 ml de tetra-hidrofurano e arrefece-se em um banho de neve carbónica/ acetona. Adiciona-se uma solução de 4,41 g (10,7 mmoles) de 3-- (4-(dimetilamino)-benziloxi)-2',2'-dibromo-estireno em tetra--hidrofurano e agita-se durante 1 hora a baixa temperatura. Re move-se o banho de arrefecimento e agita-se durante 1 hora â temperatura ambiente. Verte-se a solução sobre uma solução aquo sa saturada de cloreto de amónio e extrai-se com éter dietílico. Separa-se a fase orgânica, seca-se com HgSO^, filtra-se e evapo ra-^se o dissolvente sob vazio para obter o composto designado -22- u no titulo.

Passo c; l-fenll~3-/ 3^(4- (dimetllamino)benziloxi) feni 1 _/- -2-propino-l-ona

Colocam-se sob atmosfera de ãrgon 2 ml de uma solução 1M de hexametildissilazano de lítio (2 mmoles) em tetra-hidro-furano e 8 ml de tetra-hidrofurano e arrefece-se até â temperatura de Q°C, Adiciona-se uma solução de 0,51g (2 mmoles) de 3--(4-(dimetilamino) -benziloxi) -fenilacetileno. em tetra-hidrofu-rano e agitasse durante 45 minutos ã temperatura de 0°C, Adicio na-se 0,4g (2,4 mmoles) de N-metoxi-N-metilbenzamida, remove-se o banho de arrefecimento e agita-se durante 1 hora ã temperatura ambiente. Partilha-se entre éter dietilico e agua, separa-se a fase orgânica e seca-se com MgSO^. Filtra-se e evapora-se o dissolvente sob vazio para obter um óleo. Filtra-se através de gel de sílica e elui-se com uma mistura de 10% de acetato de etilo/hexano para obter um solido impuro. Purifica-se por cro-matografia em gel de sílica para obter o composto designado no título.

Alternativamente, podem preparar-se compostos de fórmula geral (1) de acordo com o procedimento representado no Esquema B, no qual todos os símbolos, salvo indicação em contra rio, tem os significados definidos antes. « * « / 4 « «

Esquema, B

De um modo geral, pode preparar-se a l-fenil-3-fenil--2-propino-l-ona de estrutura 5, através de um processo em dois passos, partindo do composto fenilacetilenico de estrutura 3, apropriado (Esquema A),

No passo a, pode preparar-se oofcf (fenil)-etinil J--benzenometanol de estrutura 6^ apropriado, fazendo reagir primeiramente o composto fenilacetilênico de estrutura 3^ apropriado, com uma base não nucleõfila, tal como o n-butil-lítio, o he xametildissilazano de lítio ou o diisopropilamideto de lítio, no seio de um dissolvente aprõtico apropriado, tal como o tetra ^hidrofurano. Pode fazer-se reagir o acetileto de lítio correspondente com o benzaldeído de estrutura apropriado, para se -24- w obter o o(^£ (fenil)-etinil/^benzenometanol de estrutura' 6/ apropriado.

No passo b; pode oxidar-se o#'-/" (fenil)-etinil /-ben zenometanol de estrutura £ apropriado, para se obter a 1-fenil--r3-fenil-2-prapino-l-ona de estrutura £ correspondente, através de procedimentos e técnicas conhecidos pelos entendidos na matéria, Por exemplo, pode oxidar-se o¢(-/ (fenil)-etinil/-ben-zenometanol de estrutura £, apropriado, para se obter a 1-fenil-T3-fenil-2-propino-l-ona de estrutura £, correspondente através de uma oxidação de Swern (dimetilsulfoxido, cloreto de oxalilo, e trietilamina), uma oxidação com o dicromato de piridlnio no seio de um dissolvente aprõtico apropriado, tal como o cloreto de metileno, ou através de uma oxidação com manganato de bãrio no seio de um dissolvente aprõtico apropriado, tal como o cloreto de metileno.

Os compostos iniciais usados no procedimento geral de síntese representado no Esquema B estão ao alcance dos entendidos na matéria.

Os exemplos que se seguem apresentam sínteses típicas, tal como se descrevem no Esquema B, Entende-se que estes exemplos são apenas ilustrativos e não devem limitar o âmbito da presente invenção, em nenhum sentido.

Exemplo 9 1-(4^Dimetilaminofeni1)-3-(3-benz iloxjfenjl)-2'-propino-1-ona

Passo a; l-(4-dimetilamino) j/-/ (3-benz jloxifenil)etinií^benze-nometanol

Colocam-se sob atmosfera de ârgon 3ml (3 mmoles) de -25- -25-

uma solução 1M de Iiexajnetildissilaza.no de lítio em tetra-hidro-furano e arrefece-geatê â temperatura de 0°C, Adiciona-se 0,62g (3mmoles) de 3-benziloxifenilacetileno., (Ver Exemplo 6} em 2Gml de tetra-hidrofurano e agitasse durante 1 hora â temperatura de 0°C« Remove-se o banho de gelo e agitasse durante 1 hora ã tem peratura ambiente. Verte-se sobre êter dietílico e água, separa-se a fase orgânica e evapora-se o dissolvente sob vazio. Fil tra-se através de gel de sílica eluindo com uma mistura de 25% de acetato de etilo/hexano. Evapora-se o dissolvente sob vazio para obter Q,58g do composto designado no título.

Passo b: 1-(4-dimetilaminofenil)-3-(3-benziloxifenil)-2-propi-no-l-ona

Mistura-se 0,55g de 1-(4-dimetilamino) ní-r (3-benzilo xifenil)-etinil ,7-benzenometanol (l,5mmole), 0,75g de dicromato de piridínio (2mmoles) e 15 ml de cloreto de metileno. Agita-se durante 4 horas à temperatura ambiente. Dilui-se com lOOml de eter dietílico e filtra-se o solido. Evapora-se o dissolvente e cristaliza-se o õleo residual em uma mistura de hexano/êter. Re cristaliza-se em uma mistura de hexano/clorofõrmio para obter 0,lg do composto designado no titulo; p.f. ; 134°-136°C.

Exemplo 10 1- (3-benziloxifenil)-3-(3-benziloxjfenil)-2-propino-l-ona

Passo a; 1- (3-benzilQxi) -<(-/* (3-benziloxifenil)etinil ./-benze· nometanol

Coloca-se sob atmosfera de ãrgon 1,5 irflL de uma solução 1M de hexametildissilazano de lltio em tetra-hidrofurano -26- -26-

(1,5 miaole) e arrefeceste a 0°c, Adicicna^e Q,31g Cl,5 mmole) de 3-benziloxifenilacetileno (ver Exemplo 6} em 10 ml de tetra-hidro-furano e agitasse durante 1 hora à temperatura de 0QC, Adicionasse uma solução de 0,32g (l,5mmole) de 3-benziloxibenzaldeído em tetra--hidrofurano. Remove-se o banho de gelo e agita-se durante 1 hora â temperatura ambiente. Verte-se sobre êter dietílico e agua, separa--se a fase orgânica e evapora-se o dissolvente sob vazio. Filtra-se através de gel de sílica eluindo com uma mistura de 25% de acetato de etilo/hexano. Evapora-se o dissolvente sob vazio para obter Q,44g do composto designado no título . 399E-175

Passo b: 1-(3-benziloxifenil)-3-(3-benziloxifenil)-2-propino-l-ona

Misturam-se 0,44g de 1-(3-benziloxi) -o(-£ (3-benziloxife-nil)-etinil /-benzenometanol (l,5mmole), 0,78g de dicromato de pi-ridínio (2mmoles) e 15ml de cloreto de metileno. Agita-se durante 4 horas â temperatura ambiente. Dilui-se com lOOml de éter dietíli co e filtra-se o sólido que se obtém. Evapora-se o dissolvente e purifica-se por cromatografia em gel de sílica para obter 0,2g do composto designado no título.

Os compostos que se seguem podem preparar-se por processos análogos aqueles que se descrevem nos Exemplos 1 a 10: l-fenil-3-(3,4,5-trietoxifenil)-2-propino-l-ona; l-fenil-3-/ 4-(4-metoxibenziloxi)fenil /-2-propino-l-ona; l-fenil-3-/" (3-benziloxi)fenil /-2-propino-l-ona; 1-(3,4,5-trietoxifenil)-3-fenil-2-propino-l-ona; l-(4-dimetilaminofenil)-3-(4-benziloxifenil)-2-propino-l-ona; 1-(3-benziloxifenil)-3-(4-benziloxifenil)-2-propino-l-ona,

Um aspecto da presente invenção proporciona uKfmêtodo para inibir a incorporação, de cálcio nos leucócitos. Tal como aqui se usa, -27- -27-

o termo "inibição" diz respeito a qualquer processo segundo, o qual se retardaf interrompe, impede ou termina a incorporação de cálcio nos leucócitos, o que não determina necessariamente uma eliminação total do influxo de cálcio para o interior das células ou tecidos afectados.

As designações "cálcio” e "ião cálcio (Ca )" podem usar-se indiferentemente no presente documento, para referir o elemento cálcio e os seus estados iõnicos que possam estar de algum modo envolvidos nos processos celulares dos leucócitos. Além disso, considera-se que a inibição da incorporação de cál cio nos leucócitos, por compostos de fórmula geral (1), pode afectar um ou mais estados elementares do cálcio e não deve ser limitada a qualquer forma iónica do cálcio e/ou â sua asso ciação com qualquer contra-ião específico; por exemplo, cloreto de cálcio, carbonato de cálcio, fluoreto de cálcio, etc., são compostos conhecidos que se consideram dentro da definição de "cálcio", tal como aqui se usa. A incorporação de cálcio nos leucócitos ê um dos acon tecimentos indicadores da sua activação e funciona como um mensageiro secundário para a célula. Muitas vezes, a incorporação de cálcio está dependente de um mensageiro primária, como por exemplo, a ligação de um ligando ao seu receptor na superfície celular. A ligação de ligandos aos seus receptores pode servir 2+ 2+ para abrir os canais de Ca , permitindo a entrada de Ca para o citosol onde o mesmo funcionará como,mensageiro secundário.

Quando as células estão activadas, o que corresponde a um influ 2+ xo de Ca , podem desencadear-se determinados acontecimentos que contribuem ou conduzem a doenças baseadas em reacções infla matõrias ou reacções imunolõgicas. -28

Os leucócitos englobam uma classe de células do sistema imunolôgico que são. histológica e bioquimicamente distintas das outras células do sistema imunolôgico* Tal como são re feridos neste documento, os leucócitos englobam cinco classes principais de células; neutrôfilos, basofilos, eosinôfilos ma-crófagos e linfócitos, Dentro destas classes de células, podem existir ainda classificações de tipos celulares, por exemplo, pode entender—se ainda, que os neutrôfilos incluem os leucócitos polimorfonucleares, Todas as classes principais de leucócitos se relacionam na medida em que têm origem em uma célula pro genitora mielóide, Embora o termo "neutrófilo" seja aqui utilizado, com um sentido lato, ele usa-se para exemplificar a acção dos leucócitos assim como de todas as células que derivam de cé lulas-mãe mielõides, e não se pretende que este facto constitua qualquer limitação ao uso ou administração de compostos de fórmula geral (1) que possam ser causadores ou sintomáticos da acção de qualquer tipo particular de leucócitos ou células do sistema imunolôgico.

Além disso, a acção de um leucócito, por um processo que consiste em limitar ou parar a captação de cálcio para atin gir a cura num processo de doença, não e limitada pelo facto de a doença ser consequência de múltiplos tipos de células ou teci^ dos e englobar um complexo de interacções celulares e tecidula-res. Um dos aspectos da presente invenção ê a inibição da incor poração de cálcio nos leucócitos, sendo o efeito resultante da inibição numa modulação benéfica das funções fagocitãrias dos leucócitos, Entende-se, portanto, ainda que as células leucoci-tãrias podem ser classificadas através da função que ê inibida, por exemplo, poder-se-ia usar o termo fagôcito ou células com -29- w- funções fagoclticas, como um grupo, ou subgrupo de células, en globando as células aqui designadas por leucócitos.

Os leucócitos respondem a uma grande variedade de pa talogias inflamatórias ou imunolõgicas. Durante estes estados, a activação dos receptores, ou a activação celular em geral, resulta numa alteração da fisiologia celular, na qual o leucócito se torna activado. Frequentemente, o termo "activação” ê usado para referir o processo ou estado dos leucócitos que se tornaram activados que podem ser caracterizados pela resposta celular â incorporação de cálcio quando se tornam activadas ou mantêm o estado de activação. A activação de mecanismos celulares oxidativos e não oxidativos, que resultam da activação do leucócito, desempanha um papel importante no desenvolvimento de vários processos de doença imunolõgicas. Fazendo parte do sistema de defesa da célula, incluindo os sintomas adversos e os danos tecidulares do hospedeiro, a activação dos leucócitos participantes ê parcialmente dependente do cálcio. Os processos de doença não infec-ciosos nos quais se pensa que os leucócitos, principalmente os neutrõfilos, desempenham um papel importante nos sintomas e danos tecidulares do hospedeiro incluem: gota, artrite reumatói-de, vasculite imunolõgica, glumerulonefrite, dermatose neutrõ-fila, doenças inflamatórias do intestino, enfarte do miocárdio, sindroma de dificuldade respiratória no adulto, enfisema, asma, lesóes térmicas associadas â hemôlise e neoplasmas malignos em locais de inflamação crónica. (Malech e Gallin; 1987).

Em várias doenças imunolõgicas, tais como a gota, ar trite imunolõgica, vasculite imunolõgica e certas formas de glumerulonefrite, verifica-se que os neutrõfilos se acumulam nas regiões articulares e contribuem para a destruição da arti- -30- -30-

culação e do tecido mole* Embora vários processos estejam enyol vidos na fisiopatologia destas doenças, o recrutamento de neu-trôfilos para a ârea em questão, estã bem documentado e pode ser responsável por uma grande parte dos aspectos histopatolô-gicos observáveis destas doenças, A este respeito, vãrios estudos de sistemas modelo demonstraram clararaente que os processos não oxidativos, os quais resultariam da activação dos neutrôfi los, particularmente a libertação da elastase e outras enzimas proteolxticas e glicoliticas, pode lesionar directamente os te eidos do hospedeiro.

Uma grande variedade de lesões dermatológicas estão associadas â infiltração de neutrôfilos nos tecidos dêrmicos e epidérmicos da pele. Incluídos nas doenças de pele, nas quais os neutrôfilos participam na progressão da doença, estão formas de dermatose psoriasiforme, dermatoses neutrõfilas associadas aos vasos sanguíneos, tais como as que se verificam no síndroma de Sweet e na doença de Behcet,, e pioderma gangrenoso. Nestes processos de doença, os neutrôfilos vão aumentar e manter os sintomas inflamatórios, aumentar as lesões nos tecidos e podem assim evitar a cura.

Diversas outras doenças, tais como as doenças inflamatórias do intestino e o enfarte do miocãrdio, estão relacionadas com um defeito na função dos neutrôfilos dentro de um de terminado orgão. Estudos em animais sugerem que anomalias na circulação dos neutrôfilos nos intestinos, resultam muna acti-vação anormal destas células. Do mesmo modo, demonstrou-se que os neutrôfilos se deslocam para o local do enfarte, nos tecidos miocãrdicos, desempenhando um papel importante no aumento das lesões dos tecidos apôs um enfarte do miocãrdio. -31- ! A patogenese de varias perturbações respiratórias, in cluindo α sindroma de dificuldade respiratória do adulto (SDRA), enfisema e asma, foi associada â infiltração de neutrófilos e agravamento da doença. As lesões oxidativas dos tecidos pulmonares, mediadas pelos neutrófilos, podem ser um componente importante da patogênese destas perturbações respiratórias. E ain da, a acumulação de neutrófilos com a libertação de elastase, pode ter um papel importante na destruição de tecidos que ocorre no enfisema e nas ultimas fases da resposta inflamatória na asma alérgica. A resposta alérgica, durante a qual os neutrôfi los libertam os seus constituintes, pode resultar da libertação de histamina pelos mastõcitos. A activação dos neutrófilos pode intervir na patogenese geral destas doenças relacionada com a activação do comple mento. Ê bem conhecido que o complemento pode mediar a activação dos neutrófilos com produção concomitante de radicais hidro xilo, A produção de radicais hidroxilo a partir da activação dos neutrófilos pode ser responsável pela fragilidade dos eri-trõcitos e pela hemôlise intravascular associada â activação do complemento. 0 termo "inflamação", tal como aqui se utiliza, refere-se a vim processo que frequentemente envolve leucócitos do sistema imunológico, sendo o processo envolvido numa "patologia inflamatória". Clinicamente, os principais sinais de inflamação podem incluir um ou mais dos seguintes sintomas vermelhidão, intumescência, calor, dor, perda de função e febre. No entanto, certos acontecimentos celulares que acompanham a inflamação incluem, activação dos leucócitos, marginalização e emigração dos leucócitos, e exsudação de leucócitos. Considera-se também que, em qualquer patologia na qual existia um estado in -32 -32

flamatõrio precoce ou latente, os leucócitos podem participar nas suas causas subjacentes ou intervir na perpetuação ou expan são do estado de doença ou patologia, Assim, os processos que envolvam uma patologia respiratória, são aqui considerados como envolvendo leucócitos do sistema imunolõgico e, como tal, podem ser classificados como "doenças imunologicas” e patologias me-diadas por leucócitos, possíveis de ser tratadas com compostos de formula geral (1), Considerasse também que os compostos, de acordo com a presente invenção, que afectam a incorporação de cãlcio nos leucócitos, podem ser potencialmente benéficos na melhoria das patologias que envolvem inflamação e/ou doenças imunologicas. O desenvolvimento de métodos, como os que se incluem na presente invenção, para cancelar as respostas dos neutrõfi-los ou para inactivar os metabolitos oxidativos e o conteúdo dos grânulos dos neutrõfilos serio úteis para limitar a destrui ção de tecidos nestas doenças inflamatórias não-infecciosas.

As plaquetas (trombõcitos) são células sanguíneas não nucleadas, que derivam de megacariocitos existentes na medula óssea. As plaquetas sao também necessárias para a coagulação do sangue e ajudam a reparar rupturas nas paredes dos vasos sanguji neos, A resposta das plaquetas para formar coágulos e reparar danos no tecido vascular pode também ter vários efeitos secundários prejudiciais; por exemplo, durante a reperfusão isquêmi ca, a formação de trombos e a agregação plaquetãria associada podem eventualmente levar â oclusão da artéria. Ê bem sabido que a oclusão das artérias e veias pode conduzir ao aparecimen*-to de um enfarte do miocárdio. Sabe-se também que o cãlcio ê necessário para o processo de coagulação do sangue e para a for mação de trombos; por exemplo, a modulação da resposta de coagu -33- -33-

lação pelo EDTA e por outros agentes quelantes que se ligam ao cálcio está bem estabelecida nesta área. Subentende-se, portan to, que a inibiçáo da incorporação de cálcio nas plaquetas pode resultar ela própria, num meio viável para modular a acti-vação plaquetária terapeuticamente, a qual inclui a libertação de mediadores vasoactivos e a formação de agregados plaquetã-rios, quando se administram os compostos a um doente que necessita dos mesmos.

Tal como aqui se utiliza, o termo "paciente” diz res peito a um animal de sangue quente, tal como um mamífero, que esteja afectado com determinado estado de doença imunológica. Entende-se que os cães, gatos, ratos, murganhos, cavalos, bovinos, ovelhas e os seres humanos, são exemplos de animais dentro do âmbito do significado deste termo.

Pensa-se que os compostos de fórmula geral (1) exercem a sua actividade inibidora da incorporação de cálcio nos leucócitos e nas plaquetas, proporcionando assim alívio dos me canismos dependentes do cálcio envolvidos na imunorregulação, incluindo as doenças inflamatórias e imunológicas. No entanto, entende-se que a presente invenção não está limitada por qualquer teoria ou mecanismo proposto, em particular para explicar a sua eficácia na sua aplicação final. Entende-se também que o uso da designação "compostos de fórmula geral (1)” inclui todos os seus radicais que incluem derivados (la), (lb), (lc) e (ld).

Tal como ê conhecido pelos entendidos na matéria, vá rios estados de doença em determinadas doenças inflamatórias e imunológicas são caracterizados por um acontecimento que conduziu â incorporação de cálcio nos leucócitos. Tal como aqui se usa, o conceito de "acontecimento que conduziu â incorporação -34 de cãlcio nos leucócitos”,· pode dizer respeito quer aos aconte cimentas iniciais que levaram ã patologia inicial, quer aos acontecimentos associados com a manutenção da patologia inflamatória ou imunolõgica. Ê ainda conhecido pelos entendidos na matéria que certas doenças cardiovasculares se caracterizam por acontecimentos que conduzem â incorporação de cãlcio nas plaquetas e tais acontecimentos podem também dizer respeito quer aos acontecimentos iniciais que conduziram à patologia quer a eventos associados â manutenção do estado de doença cardiovascular,

Mais concretamente, a presente invenção proporciona um método para tratar um paciente afectado por uma doença dependente do cãlcio a nível dos leucócitos, podendo estes estados de doença ser, mas sem limitarem a estes; uma doença infla matória ou uma doença imunolõgica, consistindo o referido meto do em administrar ao paciente uma quantidade eficaz, inibidora da incorporação de cãlcio de um composto de fórmula geral (1).

Uma quantidade terapêutica eficaz inibidora da incor poração de cãlcio, de um composto de fórmula geral (1), refere -se a uma quantidade que ê eficaz no controlo da activaçio dos leucócitos envolvidos num estado de doença imunolõgica. Preten de-se que a expressão '"controlo da activação”, diga respeito a todos os processos nos quais possa haver um atraso, interrupção, impedimento ou paragem da progressão da doença imunolõgica e não indica necessariamente a eliminação total de todos os sinto mas da doença.

Além disso, como ê do conhecimento dos especialistas na matéria., certas doenças cardiovasculares são caracterizadas por eventos que conduzem â incorporação do cãlcio nas plaquetas, -35- podendo esses eventos referir^se que?: aos eventos iniciais con ducentes ã patologia quer aos eventos associados â manutenção do estado de doença, A presente invenção proporciona também um método para o tratamento de um paciente afectado com um estado de doença dependente do cálcio, a nível das plaquetas podendo estes estados de doença incluir, mas sem se limitarem a: doenças car diovasculares, o qual consiste em administrar ao paciente uma quantidade eficaz, inibidora da incorporação de cálcio, de um composto de formula geral (1),

Uma quantidade inibidora da incorporação de cálcio, terapeuticamente eficaz, de um composto de formula geral (1), refere·'·se a uma quantidade que ê eficaz no controlo da função plaquetãria envolvida no estado de doença cardiovascular. A designação "controlo da função plaquetãria envolvida no estado de doença cardiovascular", diz respeito a todos os processos, nos quais possa haver um atrazo, interrupção, impedimento ou paragem da progressão da doença cardiovascular e não indica necessariamente a eliminação total de todos os sintomas da doença.

Uma quantidade inibidora, terapeuticamente eficaz, quer numa doença imunologica quer numa patologia cardiovascular, pode ser prontamente determinada pelo médico assistente, como pessoa entendida na matéria, pelo uso de técnicas convencionais e pela observação de resultados obtidos em circunstâncias análogas. Ao determinar a dose terapeuticamente eficaz, o médico que faz o diagnóstico considera um determinado numero de factôres, que incluem; a espécie do mamífero, o seu tamanho, idade e estado de saúde; a doença específica envolvida; o grau de desenvolvimento ou a gravidade da doença; a resposta indivi- -36 dual do paciente; o composto administrado; o modo de administração; a biodisponibilidade caracteristica da preparação administrada; o regime de dosagem seleccionado; o uso de medicação concomitante; e outras circunstâncias relevantes.

Admite-se que a quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de fórmula geral CD esteja compreendida entre cerca de 0,1 miligrama por quilograma de peso do corpo, por dia (mg/kg/dia) e 100 mg/Kg/dia, As quantidades preferíveis variam entre 0,5 e 10 mg/Kg/dia,.

Ao efectuar o tratamento de um paciente afectado por um estado de doença anteriormente descrito, pode administrar-*-se um composto de fórmula geral (1) , sob qualquer forma ou mo do que torne o composto biodisponível em quantidades eficazes, incluindo as vias oral e parentérica, Por exemplo, os compostos de fórmula geral (1) podem ser administrados por via oral, sub--cutãnea, intramuscular, endovenosa, transdêrmica, intranasal, rectal, tópica, etc. Geralmente prefere-se a administração oral. Os técnicos de preparação de formulações podem rapidamente seleccionar a forma e o modo de administração adequados, dependendo das características particulares do composto seleccionado, do estado de doença a tratar, e de outras ciscunstâncias relevantes.

Os compostos podem ser administrados isoladamente ou sob a forma de uma composição farmacêutica, em associação com veículos e excipientes aceitáveis sob o ponto de vista farmacêu tico, cujas proporções e natureza são determinados pela solubilidade, pelas propriedades químicas do composto seleccionado, pela via de administração escolhida e pela pratica farmacêutica convencional, Os compostos de acordo com a presente invenção, embora eficazes por si mesmos, podem ser formulados e adminis- -37- trados sob a forma dos seus sais de adição de acido, aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, por razoes de estabilidade, con veniencia de cristalização, maior solubilidade, etc.

Num outro aspecto, a presente invenção proporciona também composições farmacêuticas, que contêm uma quantidade efi caz de um composto de formula geral Cl) em mistura ou outra for ma de associação, com um ou mais veículos ou excipientes aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. A expressão "quantidade eficaz, inibidora da incorporação de cálcio” aplica-se a compos tos de formula geral (1) para referir quantidades inibidoras eficazes apropriadas para inibir a incorporação de cálcio nos leucócitos, podendo essa inibição destinar-se a tratar um paciente que sofra de uma doença imunológica ou de uma doença inflamatória. Por outro lado, a expressão "quantidade eficaz, ini bidora da incorporação, de cálcio” aplica-se também a compostos de fórmula geral (1) para referir quantidades inibidoras eficazes apropriadas para inibir a incorporação de cálcio nas plaque tas, podendo essa inibição destinar-se a tratar um paciente que sofra de uma doença associada ao sistema cardiovascular.

As composições farmacêuticas são preparadas de modo conhecido na técnica farmacêutica. 0 veículo ou excipiente pode ser um material sólido, semi-sõlido, ou líquido que sirva como veículo ou meio para o ingrediente activo. Os veículos ou excipientes adequados são bem conhecidos na técnica. A composição farmacêutica pode estar adaptada para administração oral, paren térica ou tópica e pode ser administrada ao paciente sob a forma de comprimidos, cápsulas, supositórios, soluções, suspensões, etc.

Os compostos de acordo com a presente invenção podem -38- -38-

ser administrados oralmente, por exemplo com um diluente inerte ou com um veiculo comestível. Podem ser acondicionados em cãpsu las de gelatina ou incluídos em comprimidos. Para efeitos de ad ministração oral, podem incorporar-se os compostos em excipien-tes, utilizando-se sob a forma de comprimidos, trociscos, cãpsu las, elixires, suspensões, xaropés, hóstias, gomas de mascar e afins. Estas preparações devem conter pelo menos 4% do composto de acordo com a presente invenção, o ingrediente activo, percen tagem esta que pode variar, dependendo da forma farmacêutica em particular, podendo apropriadamente variar entre 4% e 70% do pe so da unidade da forma farmacêutica, A quantidade de composto presente nas composições e tal que se obtêm uma dosagem apropriada, De acordo com a presente invenção, preferem-se as composições e preparações produzidas de modo a que uma unidade de dosagem oral contenha 5,0 a 300 miligramas de um composto de acordo com a presente invenção.

Os comprimidos, pastilhas, capsulas, trociscos e afins podem também conter um ou mais dos seguintes adjuvantes; agre-gantes, tais como a celulose microcristálina, goma de tragacan-ta ou gelatina; excipientes, tais como o amido ou a lactose; agentes desagregantes, tais como o ãcido alglnico, Primogel, amido de milho e afins; lubrificantes, tais como o estearato de magnésio ou o Sterotex; agentes deslizantes, tais como o diõxi-do de silicio coloidal; e podem adicionar-se agentes edulcoran-tes, tais como a sacarose ou a sacarina, ou aromatizantes, tais como a hortelã-pimenta, o salicilato de metilo ou aroma de laranja.

Quando a unidade de dosagem ê uma capsula, esta pode conter, alem dos materiais anteriormente mencionados, um velcu- -39- -39-

lo liquido tal como q polietilenoglicol ou um 6leo gordo. Outras formas de unidade de dosagem podem conter outros materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem,, por exemplo, como revestimentos. Assim, os comprimidos ou as pílulas podem ser revestidos com açúcar, gcma-laca ou outros agentes de reves timento entérico. Um xarope pode conter, alem dos compostos da presente invenção, sacarose, como agente edulcorante, e determinados conservantes, corantes e aromas. Os materiais que se usam na preparação, destas composições, devem ser puros do ponto de vista farmacêutico e não tóxicos, nas quantidades usadas.

Para efeitos de administração parentêrica, podem incorporar-se os compostos de acordo com a presente invenção, em uma solução ou suspensão. Estas preparações devem conter pelo menos 0,1% de um composto de acordo com a presente invenção, percentagem esta que pode variar entre 0,1% e 50% do peso da preparação. A quantidade de composto, de acordo com a presente invenção, existente nestas composições ê tal que se obtém uma dosagem apropriada. De preferência, as composições e preparações de acordo com a presente invenção são preparadas de modo a que a unidade de dosagem parentêrica contenha 5,0 a 100 miligra mas do composto da presente invenção.

Os compostos de fórmula geral (1) de acordo com a pre sente invenção podem também ser administrados por via tópica e, neste caso, o veículo pode apropriadamente consistir em uma solução, um unguento ou um gele, A base, pode compreender, por exemplo, um ou mais, dos seguintes? petrolatura, lanolina, polie tilenoglicÓis, cera de abelha, óleo mineral, diluentes, tais como agua e ãlcool, emulsionantes e estabilizantes. As formulações tópicas podem ter uma concentração de um composto de fórmula ge- -40- -40-

ral (1) ou de um seu sal aceitável do ponto de vista farmacêutico, compreendida entre 0,1 e 10% (p/v) (peso por unidade de volume),

As soluções ou suspensões podem também incluir um ou mais dos seguintes adjuvantes; diluentes estireis, tais como água para injectãveis, solução salina, óleos fixos, polietile-noglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros dissolventes sintéticos; a.gentes anti-bacterianos tais como o álcool benzi-lico ou metilparabeno; anti-oxidantes, tais como o ácido ascõr bico ou o bissulfito de sódio; agentes guelantes, tais como o ácido etilenodiaminatetcaaciticQ?' tampões, tais como acetatos, citratos ou fosfatos; e agentes para ajustar a tonicidade, tais como o cloreto de sódio ou a dextrose. A preparação parentérica pode acondicionar-se em ampolas, seringas descartáveis ou recipientes multidose, de vidro ou plástico..

No presente documento, entende-se que os termos que se seguem e as abreviaturas usadas são. sinónimos entre si; leucócitos polimorfonucleares (LPMN) , ácido /*4-(2-hidroxietil)-1--piperazina-etanossulfónico (HEPES), factor multiplicativo de gravidade usado para exprimir a força centrífuga exercida duran te a centrifugação (x g), mililitros (ml), graus Celsius (°C), ião cálcio (Ca ), nanometros (nm), dimetilsulfóxido (DMSO), ácido etileno-bis-(oxietilenonitrilo)-tetraacetico (EGTA), gramas (g), miligramas (mg), nanogramas (ng), molar (M), milimolar (mM) , micromolar (jiM) , zimozan opsonisado (OZ) , acetato de for-bol-miristato (AFM), formil-metionil-leucil-fenilalanina (fMLP), leucotrieno B4 (LTB^),

Frequentemente representam-se os compostos por uma abreviatura de três letras "MDL”, um espaço seguido de cinco ou -41- seis dígitos, Aqui, consideram—se as seguintes representações; 1—fenil—3—/* 3—(4 metoxibenziloxi) -fenil ./-2-propino—1-ona (MDL 100,225)? l-fenil—3^(4-piridinil)—2-propino—1-ona (MDL 101,098) 1-(4-rdimetilaminofenil) -3—(4-piridinil) -2-propino-l-ona (MDL 102,175)? 1—fenil-3-/r (4-benziloxijfenil ,7-2-propino-1-ona (MDL 101,097); l-(.4-dimetilaminofenil) -3- (4—piridinil)-2-propeno-l--ona (MDL 101,240)? 1—fenil—3-(4-piridinil)-2-propeno-l-ona (MDL 29,355) ? 1- (4-dietilaminofenil)-3—(4-quinolinil) -2-propino-l-ona (MDL 102,387).

Pode determinar-se por ensaios in vitro, a resposta dos leucócitos a estímulos de activação, através da medição do cálcio intracelular ou através dat medição dos factores liberta dos, tais como o anião superóxido, e a mieloperoxidase. Pode ainda determinar-se a resposta dos leucócitos â estimulação in vivo, através de modelos animais de edema, tais., como o modelo do edema da orelha do rato, induzido pelo óleo de mostarda e o modelo de edema da pata do rato, induzido pela carragenina. A Requerente desenvolveu um método para utilizar os compostos da presente invenção nos ensaios que se seguem, com vista à de terminação da sua utilidade.

Materiais

Ratos Sprague-Dawley (150-250 gramas) provenientes de Harlan Sprague-Dawley (Indianapolis, IN). Suplementaram-se os sais equilibrados de Hanks (SSHE) (Gibco, Grand Island, NY) com HEPES 20 mM e ajustaram-se a pH 7,4. Caseinato de sódio da ICN Biochemical (Cleveland, OH), Fura—2/AM obtido na Molecular Probes (Eugene, OR), lonomicina adquirida a Cal Biochem. (San Diego, CA). Superóxido -dismutase da DDI Pharmaceuticals (Moun

í -42- -42-

tain View, CA)t Todos os outros reagentes sao da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), Todos os reagentes adquiridos foram usados tal como se receberam.

Isolamento de Leucócitos polimorfonucleares (LPMN)

Obtiveram-se LPMN de rato a partir de exsudados resultantes da injecção de 6 ml de caseinato de sódio a 8% na cavida de peritonial. Dezoito horas após a injecçao mataram-se os ratos por inalação de dioxido de carbono e lavou-se a cavidade pe ritonial com uma solução salina de Hanks equilibrada (SSHE). Apôs concentração dos LPMN por centrifugação, removeram-se os eritrócitos contaminantes por lise hipotônica. Lavaram-se os LPMN duas vezes por centrifugação (.400 x g durante 10 minutos) e suspenderam-se novamente em SSHE, A viabilidade celular foi superior a 90% por exclusão de Azul de Tripano e mais de 90% das células eram LPMN por coloração de Wright-Giemsa.

Medição do Gâldo Intracelular

Obtiveram-se os níveis de cálcio intracelular usando Fura-2 como indicador fluorescente (Grynkiewicz et al,, 1985), Introduziu-se o Fura-2 nos LPMN sob a forma de éster acetoxime tílico (Fura-2/AM), usando o método de Korchak et al.f (1988).

O

Concretamente, incubaram-se 1 x 10 LPMN/ml em SSHE com Fura-2/ /AM lOjaM, durante 10 minutos a 37 c. Diluiu-se a suspensão celular dez vezes com SSHE e incubou-se novamente durante 20 minu tos, Centrifugaram-se as células (400 x g durante 8 minutos a 25°C) e ressuspenderam-se os LPMN (1 x 10^ células/ml) em SSHE contendo 1% de albumina de soro de bovino. Armazenaram-se as células ã temperatura ambiente e usaram-se dentro de 3 horas. -43- -43-

Fizeram-se as determinações dos níveis de cálcio intracelular usando, um espectro fluorometro com duplo comprimento de onda (Photon Technology International, New Brunswick, NJ), Agitou-se magneticamente 2 ml de suspensão de LPMN (1 r 10 ce-lulas/ml) a temperatura de 37°C, Antes da activação pri-incuba-ram-se as células com os compostos durante 15 minutos ã tempera tura de 37°C, Quando se dissolveram os compostos em DMSQ e se adicionaram directamente, o DMSO nunca excedeu os 0,3% da suspensão celular final. A variação total de volume, com a adição dos compostos, veículos e estímulos, nunca excedeu os 3%. Calibraram—se as concentrações intracelulares de cálcio, estabelecendo um nível máximo de cálcio nas células, com a adição de io nomicina 7 jiM aos LPMN em SSHE contendo 1% de albumina de soro de bovino. Seguiu-se um tratamento com EGTA 20 mM durante 1 hora para obter um nível mínimo de cálcio. Usou-se o método de Gryn-kiewiez et al., (1985) para quantificar os níveis de cálcio intracelular assumindo um de 240 nM para o Fura-2. Cada experiência foi efectuada e repetida em três ocasiões diferentes e o padrão das variações de cálcio ê representativo destas experiências.

Libertação da Mieloperoxidase (MPO)

Determinou-se a libertação de MPO usando a oxidação da o-dianisidina, catalisada pèlà MPO. As experiências foram levadas a cabo em placas de microtitulação com 96 cavidades (Webster e Henson, 1978), Em cada cavidade, incubou-se uma alí ~ 7 quota de 50 microlitros (jil) de uma suspensão de LPMN (2 x 10 células/ml em SSHE) com 50 ^il de SSHE, contendo o veículo (EMSO a 0,3%) ou o inibidor, durante 30 minutos â temperatura de 37°c, A concentração final de DMSO nunca excedeu 0,3% e foi constante durante cada experiência* Para activar os LPMN, adicionaram -se 50 jx 1 de um dos seguintes compostos, durante 30 minutos â temperatura de 37°C: N-formil*Met-Leu,Phe (fMLF; 0,1 JM] i acetato de farbol-miristato (AFM, 200 ng/ml)? zimozan opsonisado de soro de rato (OZ; 2,6 mg/ml, preparado pelo método de Ward et al*, 1983)* Adicionaram-se os estímulos em 50 jil de SSHE, que também continham os compostos ou veículo, como adequado, para evitar alterar a concentração do inibidor. Terminou-se a activação celular pela centrifugação das placas a 600 x g duran te 5 minutos a 22°C. Retiraram-se alíquotas de 100 jil do sobre-nadante de cada cavidade e transferiram-se para uma placa de mi crotitulação com 96 cavidades de fundo chato, para o ensaio da MPO. Adicionou-se a cada alíquota de sobrenadante 100 jil de uma solução recente contendo 50 jil de tampão de fosfato de sódio 0,2 M (pH 6,2) , 25 jxl de O-dianisidina 3,9 mM e 25 jil de perõxi do de hidrogénio 0,015 M. Obtiveram-se os brancos usando a mesma solução, sem o perõxido de hidrogénio. Agitaram-se as placas e depois incubaram-se durante 15 minutos, na ausência de luz, â temperatura ambiente. Mediram-se as absorvâncias das amostras a 450 nM.

Produção de Anião Superóxido (ASO)

Mediu-se a produção de anião superóxido através de um método comparável ao de Leslie (1987), usando placas de mi-crotitulação, e levado a cabo na presença de catalase (Arthur et al,, 1987), Incubaram-se alíquotas de 50 ml de uma suspensão de LPMN de rato (2 x 1Q7 cêlulas/ml em SSHE), com 50 Jil de SSHE contendo o veículo (DMSO 0,3%) ou o composto, durante 30 minu- -45- U' tos, a 37°c como acima descrito. Adicionou-se a cada amostra, ' 100 jil de tampão contendo 5,98 mg/ml de citocromo C (Sigma Tipo III) e 0,1 mg/ml de catalase, mais os compostos, guando apro priados, Preparou-se um branco para a medição espectrofotomê-trica, contendo células não estimuladast na presença de citocromo C, catalase e SQD, Para activar os LPMN adicionaram-se 75 jil de AFM ou OZ para atingir a concentração final de activa dor celular (mais veículo ou inibidor como se descreveu ante-riormente para a libertação de MPO) e incubaram-se as células durante 60 minutos â temperatura de 37°C, Terminou-se a activa ção por centrifugação a 600 x g durante 5 minutos, a 4°C. Trams feriram-se alíquotas de 200 jil de sobrenadante para uma segunda placa de microtitulação de cavidades com fundo chato e mediram--se espectrofotometricamente a 550 nm.

Exemplo 11

Efeito de Vários Estímulos do Cálcio Intracelular dos LPMN

Introduziu-se Fura-2 em LPMN de rato, estimularam-se com fMLF e seguiram-se os níveis de cálcio intracelular, como se mostra na Figura 1« 0 péptido guimiotãctico fMLF produziu uma resposta bifãsica com um primeiro pico atingindo um máximo apôs 30 segundos e um segundo pico atingindo um máximo cerca de 100 segundos apôs ter sido dado o estímulo peptídico. A resposta bifãsica é consistente com aquelas observadas por Korchak et al,, (1986) para os neutrôfilos humanos, nos quais o pico da resposta corresponde a uma libertação precoce de cálcio intracelular, tal como a que seria produzida a partir de uma resposta com LTB^.. A segunda fase da resposta, -46 correspondendo ao segundo pico, cerca de 1QQ segundos apõs a estimulação, está associada a um influxo do cálcio extracelu lar, típico de ma resposta induzida pela Concanavalina A. A resposta bifâsica ê interpretada pelos entendidos na matéria com o significado de gue a primeira fase ê a libertação do cálcio intracelular e a segunda fase corresponde ao influxo de cálcio extracelular. A pré-incubação de LPMN com MDL 101,097, demonstrada na Figura, resultou:'na supressão selectiva, dependente da concentração da segunda onda das variações do cálcio intracelular. A inibição do segundo pico da resposta por compostos de fórmula geral (1), tal como é representado pelas activida-des de MDL 101,097, pode ser vista como a inibição da incorpo ração de cálcio nos LPMN tratados. No entanto, em concentrações elevadas (>100 jm) os compostos começam a afectar a primeira fase (dados não apresentados). A resposta do controlo, onde não se incluem compostos de fórmula geral (1), nos estímulos com fMLF, apresenta a resposta bifâsica observada. 47

Ο Ο Ο Ο Τ Ο Ο ÍM Ο Tempo (segundos)

χ ![++Βθ]

Exemplo 12 ίγ.

Efeito do's compostos sobre 'a libertação da,: enzima do LPMN do rato e sobre a, produção de aniSo superõxido 2+

Isolaram-se LPMN de rato em SSHE contendo Ca „ Tal como se resume no Quadro abaixo#, o estimulo dos LPMN do rato com fMLF, na presença de citocalasina B ou com zimozan opsoni sado ou com ionomicina resulta na libertação de mieloperoxida se (fMLF/MPO, OZ/MPO e ION/MPO; colunas 2, 4 e 6 respectivamen te), A adição de MDL 102,175 demonstra uma inibição dose-depen dente em ambas as respostas, nas concentrações dadas. Similarmente, AFM e QZ resultam numa produção de anião superõxido, a qual e inibida de um modo dose-dependente pela adição de MDL 101,098 (AFM/ASO e QZ/ASO; colunas 8 e 10, respectivamente).

Estes dados são também consistentes com o efeito que seria observado se fosse suprimido o cálcio extracelular dos LPMN de rato (dados não apresentados). EFEITO DOS ESTÍMULOS NA INIBIÇÃO DE MPO E ASO DOS LPMN DO RATO PELO MDL 101,098 1 CONC(uM) MDL101,098 2 fMLF/MPO 3 SEM 4 OZ/MPO 5 SEM 6 ION/MPO 7 SEM 8 AEM/SQÊ 9 SEM 10 OZ/ASO 11 SEM 100 96,2 1,8 97,2 4,5. 88,4 4,1 97,2 . 2,3 115,0 10,1 30 80,8 . 9,0 92,2 1,1 12,7 2,7 70,0 . 10,3 61,5 8,3 10 34,9 5,7 48,7 8,6 . 5,7 2,5 29,1 5,8 . 20,3 5,0 3 7,5 6,1 14,7 7,7 0,0 1,3 -4,3 · 10,6 -7,5 6,6 1 2,9 .4,4. 5,4 . . 10.,9.-. . -2,8 0,7 [-20,7 . 7,9 -18,0 3,9 * . SEM - Standard Error of the mean (Erro-padrão da média) para as experiências anteriores

Exemplo 13

Edema da orelha do' murganho induzido pêlo oleo de mostarda

Dividiram-se aleatoriamente em grupos murganhos machos Charles River CD-I, pesando 3Q a 60 gramas. Antes da apli cação de 20 jil de õleo de mostarda (.isotioclanato a 10% em ace tona) na orelha direita, receberam uma dose; 30 minutos antes da aplicação, no caso da administração intraperitonial, e 1 ho ra antes da aplicação., .no caso da administração, por via oral. Apôs 30 minutos, sacrificaram-se os ratos e fez-se uma biõpsia circular, com 8 milímetros de diâmetro, em cada orelha e pesou -se o material recolhido, A diferença entre os pesos da orelha esquerda (controlo) e da orelha direita (tratada) foi expressa em percentagem de aumento. Os resultados do Teste do Edema da Orelha do Murganho Induzido pelo Ôleo de Mostarda apresentam--se no Quadro abaixo. EDEMA DA ORELHA DO MURGANHO INDUZIDO PELO ÕLEO DE MOSTARDA COMPOSTO DOSE (mg/kg) VIA DE ADMINISTRAÇÃO %INIBIÇÃO MDL 100,225 100 i.p. 60,9 ± 11,7 30 33,4 í 14,6 10 25,3 + 17,8 Exemplo 14

Edema da Pata do Rato induzido pela Carragenina

Usaram-se ratos machos Sprague Dawley de Charles River pesando 90 a 100 g cada um. Induziu-se a inflamação na pa-

ta traseira esquerda, com Q,05 ml de uma solução de carrageni na a 1%, injectada na superfície plantar da pata* Λ pata traseira direita foi injectada com um volume igual de solução sa lina. Administraram-se os fãrmacos 1 hora antes da injecção na pata 75 mg/kg via i^p* Cl ml/100 gramas). Três horas após a in jecção de carragenina mediu-se a diferença no volume da pata de controlo e da pata inflamada. Cada pata foi mergulhada em um recipiente com mercúrio e registou-se o volume deslocado.

As patas foram unifermente mergulhadas no mercúrio atê â linha de inicio do pelo. Usou-se um transductor da pressão venosa, acoplado a um registador, para medir os pequenos volumes de mercúrio deslocado. Cada grupo de medidas consiste na média calculada de quatro ratos, cada um com tris medições separadas. Os resultados do Teste do Edema da Pata do Rato Induzido pela Carragenina, são apresentados no Quadro abaixo. %Inibição 24,3% ± 10,3% EDEMA DA PATA DO RATO INDUZIDO PELA CARRAGENINA Compostos Via de administração i.p. MDL 100,225

Claims (13)

1

REIVINDICAÇÕES ^ 1.- Processo para a preparação de compostos de fór mula geral

R1 Ri

(D na qual Rl' R2 e R3 rePresentam' cada um, independente- 2

mente, um átomo de hidrogénio ou de halogineo, um grupo alquilo g ou alcoxi g ou um grupo de fórmula geral -NÍY^)^) ou X%-(Ar) - (CH^h-O- em que e Y2 representam, cada um, independentemen te, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo Cl-6; Ar representa um grupo fenilo ou naftilo; n representa zero ou o número inteiro 1; X representa um grupo alcoxi C1_g ou um grupo de fórmula geral -N(Y.) (Y_); e 1 Δ z representa zero ou o número inteiro 1 ou 2, ou dos seus sais aceitáveis em farmácia, caracterizado pelo fac to de: (a) se fazer reagir um composto de fórmula geral

R^, R2 e R^ têm os significados definidos antes, com tetrabrometo de carbono e trifenilfosfina no seio de um dissolvente aprótico apropriado para se obter um composto de fórmula geral 3

na qual Rl' R2 e R3 ^111 os s;*-9n;i-fíca<^os definidos antes, (b) se fazer reagir o composto resultante de fórmula geral 2 com uma base não nucleófila, no seio de um dissolvente aprótico apropriado para se obter um composto de fórmula geral

na qual R^, R2 e R3 têm os significados definidos antes ; e (c) se fazer reagir o composto resultante de fórmula geral 3 com uma base não nucleófila como, por exemplo, n-butil-lítio no seio de um dissolvente aprótico apropriado e de se fazer reagir depois o correspondente acetileto de Ixtio com um composto de fórmula geral 4

R3 4 na qual R^, R2 e R^ têm os significados definidos antes.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de l-fenil-3-(3,4,5-trimetoxifenil)-2-propino-l--ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de l-fenil-3-[3-(4-metoxibenziloxi)fenil]-2-pro-pino-l-ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de l-fenil-3-[(4-benziloxi)fenil]-2-propino-l-ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos. 5

5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de 1-(3,4,5-trimetoxifenil)-3-fenil-2-propino-l--ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

6. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de l-fenil-3-fenil-2-propino-l-ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

7. - Processo de acordo cora a reivindicação 1, para a preparação de l-fenil-3-(3-benziloxifenil)-2-propino-l-ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

8. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de 1-(4-dimetilaminofenil)-3-(3-benziloxifenil)-2--propino-1-ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

9. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de 1-(3-benziloxifenil)-3-(3-benziloxifenil)-2-pro pino-l-ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos. 6

10. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de 1-fenil-[3-(4-etoxibenziloxi)fenil]-2-propino--1-ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos ini ciais correspondentemente substituídos.

11. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de 1-fenil-[3-(4-(dimetilamino)benziloxi)fenil]-2--propino-l-ona, caracterizado pelo facto de se utilizarem compostos iniciais correspondentemente substituídos.

12. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para o tratamento de doenças dependentes do cálcio presente nos leucócitos ou nas plaquetas como, por exemplo, doenças imunitárias tais como artrite reumatóide ou vasculite imunitária ou doenças inflamatórias tais como dermato ses neutrófilas ou doenças cardiovasculares tais como enfarte de miocárdio, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico, de um composto de fórmula geral (1) preparado pelo processo de acordo com as reivindicações 1 a 11, com acção inibidora da captação do cálcio nos leucócitos ou nas plaquetas, ou de um seu sal aceitável em farmácia com um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. 7

13.- Método para o tratamento de doenças dependentes do cálcio presente nos leucócitos ou nas plaquetas como, por exemplo, doenças imunitárias tais como artrite reumatóide ou vasculite imunitária ou doenças inflamatórias tais como der matoses neutrõfilas ou doenças cardiovasculares tais como enfarte de miocárdio, caracterizado pelo facto de se administrar, diariamente, a um doente uma quantidade eficaz sob o ponto de vista terapêutico, compreendida entre 0,1 e 100 mg/Kg do peso do corpo desse doente, de um composto de fórmula geral (1) preparado pelo processo de acordo com as reivindicações 1 a 11 com acção inibidora da captação do cálcio nos leucócitos ou nas pia quetas, ou de um seu sal. O Agente Oficial da Propriedade Industrial

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