PT98887B - Processo para a preparacao de suspensoes de liposomas estabilizados e de composicoes detergentes contendo essas suspensoes - Google Patents

Description

Esta invenção refere-se a um processo de estabilização de liposomas em composições aquosas contra a lise de agentes tensioactivos aniónicos conhecidos de outro modo para desfazer e provocar a lise em células desses liposomas caracterizado por se utilizar certos agentes tensioactivos como agentes estabilizantes e a composições estabilizadas correspondentes bem como a um método de preparar composições detergentes contendo esses liposomas estabilizados e agentes tensioactivos aniónicos. As composições podem ser utilizadas como geles de banho e champus. Os liposomas são de preferência vesículas derivadas dos fosfolípidos naturais ou de compostos anfifílicos não iónicos sintéticos que são algumas vezes referidos como·niosomas e podem conter humectantes ou vitaminas solúveis em àgua.

processo consiste na adição de 0,1% a 40%, de preferência, entre 2% a 10% em peso de pelo menos um agente tensioactivo a uma composição aquosa contendo entre 0,1% a 50%, de preferência, entre 5% a 30% em volume de liposomas.

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Esta invenção refere-se a' um processo de ejs tabilização de liposomas contidos eia composições aquosas con tra a lise de agentes-tensioactivos aniónicos conhecidos de outro modo para desfazer e provocar a lise em células desses liposomas, caracterizado por utilizar certos agentes tensioactivos como estabilizantes e composições estabilizadas correspondentes, bem como a um método de preparar composições detergentes contendo esses liposomas estabilizados e agentes tensioactivos aniónicos.

Antecedentes da Técnica

As patentes, os jornais e revistas estão re. platos de informação acerca dos liposomas” cujo termo, tão utilizado aqui, designe vesículas estruturadas em camadas d£ rivadas de moléculas anfifxlicas aniónicas ou não iónicas.

Os liposomas podem ser unilamelares ou multilamelares. Por conseguinte, os liposomas podem ser constituídos por vesículas derivadas de fosfolípidos naturais assim como por vesjí cuias derivadas de compostos anfifílicos não iónicos sintéticos que são por vezes chamadas de niosomas.

A utilização em cosméticos destes materiais tem vindo a ganhar:importância rapidamente no mercado de cos méticos. Foram publicadas recentes sínteses de informação acercadbs liposomas, dois artigos em Maio, 1990 na publicação Cosmetics & Toiletries, Vol . 105: The Application of Liposomes to Cosmetics por Suzuki et al. na pag. 65ff e

Liposomes in Dermatological Preparations Part I por ✓

Lautenschlager na pag, 89ff, um artigo em Julho, 1990 na pu07/578913

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blicação Cosmetics & Toiletries: Liposomes in Dermatological Preparations Part II por Lautenschleger na pág. 63ff (Lautenschlager II), em Junho , 1990 na publicação Soap/ Cosmetics/Chemical Specialities: LiposomaS Cosmetics por Wendel et al. na pág. 32ff , em 1979 na publicação International Journal of Cosmetic Science , Vol. 1: Dispersions of lamellar phases of non-ionic lipids in cosmetic products por Handajani-Vila et al.-na pag. 303ff, em Janeiro/Fevereiro, 1989 na publicação Journal of the Society of Cosmetic Chemists, Vol. 40: Liposomes; From theoretical model to COjS metic tool por Strauss. 0 artigo de Strauss faz notar que os liposomas podem encapsular cosméticos solúveis em água nos seus compartimentos aquosos. Isto mostra que se adicionam detergentes e agentes tensioactivos , mas não são mais tarde removidos por diálise ou por filtração do gel para formar os liposomas (Figura 2) enquanto na pag. 56 se mostra que os agentes tensioactivos podem ser encapsulados nos lip£ somas. Outros exemplos de preparação de liposomas podem ser encontrados em patentes norte-americanas n^as. 4 438 052 de Weder et al., 4 536 324 de Fujiwara et al. (nonionic liposomes), 4 708 861 de Popescu et al., 4 853 228 de Wallacha et al. (nonionic liposomes—charged surfactants can be added to alter the ionic nature of the liposome formed), e L 4 911 928 de Wallaeh et al. e o Bulletin of the Chemical Society of Japan, Synthetic Bilayer Membranes With Anionic ffead Groups, Kunitake et al., vol. 51 n^s. 6, pág. 187'7ff, . 1978 (liposomes from synthetic anionic surfactants).

Para uso cosmético , as formulações contendo liposomas estão geralmente na forma de loções ou cremes que proporcionam uma forma de reter a estrutura em camadas dos liposomas. Liposomas, particularmente os derivados de fosfolípidos tais como a lecitina, são sensíveis a outros compostos que podem provocar a lise da estrutura em camadas formam do partículas de liposoma. A lise elimina a presença das vesículas que formam os liposomas e qualquer material cosmético tal como um humectante transportado no compartimento in2

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terior aquoso do liposoma é libertado para o meio aquoso ci£ cundante.

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Os cremes e loções de pele são geralmente deixados na pele ou cabelo e não são enxaguados. Seria de uma significante importância cosmética se os liposomas pudessem ser incluídos em produtos tais como geles de banhó e champôs para o cabelo . Estes produtos poderiam ao mesmo tempo lavar o corpo e conferir as propriedades benéficas dos liposomas à oele e cabelo ainda que um gel de banho ou um champô sejam normalmente enxaguados. Embora a literatura sobre o assunto seja um tanto contraditória neste ponto, os agentes tensioactivos aniónicos do tipo tipicamente usado em geles de banho e champôs tal como o laureto-2 sulfato de sódio actuam provocando a lise das vesículas dos liposomas. Os liposomas não são estáveis em presença de tais agentes tensioactivos e qualquer efeito benéfico que pudessem ter é reduzido ou eliminado pela lise.

A estabilidade do liposoma é particularmente im portante quando os liposomas são usados para libertar um ingrediente activo tal como um absorvedOe de humidade ou vitamina. Por exemplo, pág. 36 do artigo de Wendel et al., supra expressa liposomal liquid soaps or champoos generally cannot be formulated referindo-se aos liposomas derivados de fosfolípidos naturais? Wendel et al. vai mais longe e diz que os liposomas são quite stable in products with amphiphilic sur factants such as ethanol or ethlylene glycol. A patente norte-americana n^s. 4 752 572 de Sundberg et al. ensina que os liposomas sofrem a lise através da adição de um agente tensic activo com uma concentração de micela critica de pelo menos θ₀ 0,1 milimoles e refere como exemplos de agentes tensioactivos aniónicos utilizados·para provocar a lise dos liposomas o colato de sódio e o dodecil sulfato de sódio . A pág. 66 do artigo II de Lautenschlager expressa ...it is impossible to formulate liposomal liquid soaps or shampoos... enquanto a pág. 70 se refere a um creme estável de óleo em água contendo

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liposomas assim como 0,5% de polissorbato e 0,5% de mono-oleato de sorbitano como um exemplo de um creme liposomático estável com muito baixas proporções de emulsificadores.

A patente norte-americana n². 3 957 971 por Oleniacz ensina qua as suspensões de liposomas contendo hume ctantes por elas atraídos onde os liposomas contêm uma mistura ternária de lecitina, fosfato de dicetilo e colesterol e o humectante pode ser piroglutamato de sódio ou ácido glutâmico. Contrariamente a outros relatórios publicados, Oleniacz ensina que esses liposomas podem ser libertados de um meio contendo agentes tensioactivos aniónicos ou anfotéricos . 0 exemplo 15 dá a formulação de um champô contendo um agente tensioactivo aniónico lauril sulfato de trietanolamónio, etanol, um outro agente tensioactivo óxido de bis(2-hidroxietil) alquil amina, etanol e uma composição aquosa contendo liposomas para a qual o piroglutamato de sódio foi atraído.As instruções mostram que os quatro ingredientes são meramente misturados à temperatura ambiente enquanto se vai mantendo um pH de 5-6 até que os componentes sólidos sejam dissolvidos. Ao contrário do exemplo 13 de Oleniacz onde a estabilidade dos liposomas contendo humectantes na presença de 0,1% do volume dos vários agentes tensioactivos é manifess tada, não há nenhuma indicação de que os liposomas estáveis estivessem presentes na composição do champô resultante-r Nenhuma ordem específica é fornecida no exemplo 15 para misturar os ingredientes.

No seu artigo na Physica B 156 & 157 intitulado Neutron Small Angle Scattering of Liposomes in the Presence of Detregents na pág. 477ff, Nawroth et al. conclui que as pequenas quantidades de detergentes tais como os sais biliares ( sal taurodexicolato de sódio) podem ser incorporados nos liposomas com base em lecitina sem causarem a destruição da sua estrutura. Os liposomas são estabilizados pela carga do detergente . Os detergentes não iónicos não ajudam a estabilizar os liposomas enquanto os detergentes aniónicos e catiónicos o fazem. Neste trabalho os deter- h 07/578913

gentes foram incorporados nos liposomas durante a sua formação.

Ao contrário dos liposomas que constituem o assun to desta invenção , a patente norte-americana n². 4 885 159 de Miyake et al. dá a conhecer um cosmético para o cabelo que é uma vesícula polimérica obtida da polimerização de uma vesícula monomérica de um agente tensioactivo tendo um catião de amónio quaternário e um anião polimerizável como um contra-ião. Os produtos são feitos para oferecerem vantagens ao enxaguar o cabelo mantendo-o volumoso. Em adição a vesículas poliméricas , os agentes tensioactivos aniónicos podem também estar presentes.

Descrição Sumária da Invenção

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É um objectivo desta invenção fornecer uma forma simples de estabilização dos liposomas, particularmente aos derivados de fosfolipidos e compostos anfifílicos não-iónicos, contra o efeito de lise dos agentes tensioactivos aniónicos. Não é necessária nenhuma modificação especial dà estrutura em camadas dos liposomas pela adição de ingredientes diferentes dos comummente utilizados tais como os esterois.

Outro objectivo desta invenção é fornecer suspensões de liposomas aquosas que contenham agentes tensioactivos que não provoquem um efeito apreciável de lise e quebra dos liposomas e desse modo possibilitar o uso das composiçSes como geles de banho, champôs, detergentes ou outras funções de limpeza. Estas composições constituem um meio de colocar os liposomas em contacto com o corpo, cabelo ou outro substrato. Os próprios liposomas podem ainda conter ingredientes activos tais como humectantes solúveis em água e vitaminas os quais podem ser distribuídos pela pele e cabelo em contacto com os liposomas.

Ainda outro objectivo desta invenção é fornecer uma composição detergente contendo liposomas estabilizados com agentes tensioactivos aniónicos do tipo conhecido por ·-<·

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Mod. 71 - 20.000 «x. - 90/06 provocar a lise dos liposomas tais como lauril sulfato de s<5 dio e sulfato laureth de sódio os quais são comummente usados em geles de banho e champôs. 0 uso de tais liposomas estabilizados tem a vantagem de permitir aos formuladores usar formulações já experimentadas de geles de banho e champôs quando se deseja produtos contendo liposomas.

Estes e outros objectivos da presente invenção sao proporcionados por um método de estabilização de uma com posição aquosa contendo liposomas contra o efeito de lise dos agentes tensioactivos aniónicos o qual é caracterizado pela adição de cerca de 0,1% a 40%, de maior preferência, de 2% a 10%, em peso relativamente ao total do peso da composição, de pelo menos um agente tensioactivo seleccionado de um grupo constituído por sulfossuccinatos alquilícos gordos em que o grupo alquilíco gordo contém entre 8 a 22 átomos de carbono, sulfatos de acilamina poliglicol-éter gordos em que o grupo acilo gordo contém entre 8 a 22 átomos de carbono, óxidos de alquil amina gordos em que o grupos alquílico gordo contém entre 7 a 26 átomos de carbono, ésteres de fosfatos alquílicos gordos em que o grupo alquílico gordo contém entre 8 a 22 átomos de carbono e sais de N-acil aminoácidos ou sais de derivados de N-acil de proteínas hidrolisadas possuindo até cerca de 2500 daltons de peso molecular médio em que a porção acilo é derivada de um ácido carboxílico possuindo entre 8 a 22 átomos de carbono por molécula até se obter uma composição aquosa contendo entre cerca de 0,1% a 50%,. de maior preferência entre 5% a 30%, em volume de liposomas relativamente ao volume total da composição, sendo a quantidade do agente tensioactivo presente a necessária para estabilizar os liposomas contra os efeitos de agentes tensioactivos aniónicos que provocam a lise, de preferência, em que a proporção dos liposomas para o agente tensioactivo presente não seja maior que 30 partes em volume dos liposomas para 1 parte em peso do agente tensioactivo .Referências a quantidades de agentes tensioactivos aqui contidas e na reivindicação referem-se à quantidade de compostos de agen- 6 07/578913

Mod. 71 · 20.000 ·*· - 90/06 tes tensioactivos activos excluindo sais inactivos e água fre quentemente encontrados em agentes tensioactivos comerciais. De preferência, os liposomas compreendem fosfolípidos ou compostos antifílicos nao-iónicos.

Esta invenção relata ainda um processo envolvendo a adição à composição aquosa contendo liposomas descrita imediatamente acima, de cerca de 0,1% a 35%, de preferência 5% a 15%, em peso relativamente ao total da composição detergente de pelo menos um agente tensioactivo aniónico o qual é conhecido por provocar a lise dos liposomas para formar uma composição detergente aquosa contendo liposomas e o tal agente tensioactivo aniónico. De preferência, o agente tensioactivo aniónico é seleccionado.de entre os constantes fi fi na seguinte fórmula R (OCH gCHg)gQ em que R é seleccionado do grupo constituído por grupos alquilícos possuindo entre 8 a 18 átomos de carbono, grupos fenilos e aralquilos possuir do entre 6 a 24 átomos de carbono, g tem um valor entre 0 a 10 e Q é seleccionado de um grupo que consiste em -C(O)OZ, -OSOgZ e -SOgZ e de preferência lauril sulfato de sódio e éter laurílico de sódio (laureth) em que g tem um valor médio entre 1 a 10 e de preferência, entre 1 a 4.

Esta invenção também se refere às composições obtidas pelos processos acima descritos.

Breve Descrição das Figuras em Anexo

Nas Figuras em anexo:

Fig.-l é um Espectrógrafo tirado através de um Fluorimetro (Fluorimeter Spectrograph) com luz visível tirado depois de adicionado o laureth-3 sulfossuccinato de dissódio a liposomas baseados em fosfolípidos contendo coran- tes aquosos.

Fig. 2 á um Espectrógrafo de Fluorimetro tira·· do depois de adicionado um agente tensioactivo aniónico, um sulfonato de alfa olefina, conhecido por provocar a lise dos liposomas e liposomas baseados em fosfolípidos contendo corai.

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tes aquosos.

Fig. 3 é um Espectrógrafo de Fluorímetro tjl rado depois de adicionado o dioctil sulfossuccinato de sódio a uma a liposoma baseados em fosfolípidos contendo corantes aquosos.

Fig. 4 é ura Espectrógrafo de Fluorímetro tirado depois de adicionado o óxido de cocamidopropilamina a liposomas baseados em fosfolípidos contendo corantes aquosos.

Fig. 5 é um Espectrógrafo de Fluorímetro tirado depois de adicionado o laureth-3 sulfossuccinato de dissódio a liposomas baseados num composto anfifílico não-iónico sintético contendo corantes aquosos.

Fig. 6 é um Espectrógrafo de Fluorímetro tirado depois de adicionado o ceteareth-2 fosfato de sódio a liposomas baseados num composto anfifílico não-iónico sintático contendo corantes aquosos.

Fig. 7 é um Espectrógrafo de Fluorímetro tirado depois de acidionado o laureth-2 sulfato de sódio a lip<^ somas baseados em fosfolípidos estabilizados com sulfossucci. nato de didodecilo para formar uma composição detergente con tendo um corante aquoso.

Fig. 8 é um Espectrógrafo de Fluorímetro tirado depois dè adicionado o laureth-2 sulfato de sódio a liposomas baseados em fosfolípidos estabilizados com laneth-5 sulfossuccinato de disódio para formar uma composição detergente contendo corantes aquosos.

Fig. 9 é um Espectrógrafo de Fluorímetro ti. rado depois de adicionado o laureth-2 sulfato de sódio a liposomas baseados em fosfolípidos estabilizados com cetereath -2 fosfato de sódio para formar uma composição detergente contendo corantes aquosos.

Fig. 10 s um Espectrógrafo de Fluorímetro tirado depois de adicionados vários agentes tensioactivos aniónicos diferentes conhecidos por provocarem a lise dos li.

posomas a liposomas baseados num composto anfifílico não-iónico sintético estabilizado com laureth-3 sulfossuccinato de

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Mod. 71 .20.000 «χ.

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dissódio contendo corantes aquosos.

Fig. 11 é uma microfotografia ampliada 400X dé liposomas multilamelares contendo corantes aquosos numa solução aquosa tampão tirada 8 dias depois da preparação.

Fig. 12 é uma microfotografia ampliada 400X de liposomas multilamelares tratados com agentes tensioactivos contendo corantes aquosos em solução detergente tirada 8 dias depois da preparação.

Fig. 13 é uma microfotografia ampliada 400X de liposomas multilamelares tratados com agentes tensioactivos contendo corantes aquosos em solução detergente tirada 6 dias depois da preparação.

Fig. 14 é uma microfotografia ampliada 400X de liposomas multilamelares tratados com agentes tensioactivos contendo corantes aquosos em solução detergente contendo um agente tensioactivo aniónico conhecido para a lise de liposomas tirada 6 dias depois da preparação.

A Melhor Forma de Executar a Invenção

As técnicas e materiais usados para preparar os liposomas e para incorporar- os vários ingredientes neces. sários são bem conhecidas por todos os peritos na matéria como foi exemplificado pelos vários artigos publicados -¾ paten tes atrás mencionados. A ciência reconhece várias classes de liposomas. A nomenclatura usada para os descrever pode ser confusa uma vezqueos liposomas podem ser descritos em fun ção do número de camadas presentes ou em função do método de preparação* A seguir vem um exemplo da nomenclatura frequentemente usada:

'</ *

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Tipo de Vesícula

Sigla

Mod. 7)-20.000 «x.· 90/08

Small, Sonicated Unilamellar 5 Large Vortexed Multilamellar

Large Unilamellar . Reverse Phase Evaporation

French Press

Diâmetro Médio microns (u)

suv	0,025 -0,05
MLV	0,05 - 10
LUV	0,1
REV	0,5
FPV	0,05

A presente invenção dá a conhecer processos para estabilização dos liposomas, a forma pela qual eles são produzidos não é decisiva para esta invenção.

Os liposomas usados nesta invenção podem ser baseados em fosfolípidos os quais por vezes são chamados de lecitinas. Eles são ésteres de ácido oleico, ácido esteárico, ácido palmítico e outros ácidos gordos com ácido glicerofósfórico e colina. As lecitinas podem ser obtidas de tecidos animais ou vegetais assim como das gemas de ovo. Exemplos específicos de fosfolípidos (incluindo a temperatura à qual as membranas puras entram.em fusão ou Tm em parênteses) que podem ser usadas para formar liposomas são; dioleio^ il fosfatidilcolina (-22°C), dilauril fosfatidilcolina (0°C) dimiristol fosfatidilcolina (23°C), dipalmitoil fosfatidilcolina (41°C), distearoil fosfatidilcolina (58°C), dimiristoil fosfatidiletanolamina (48°C), dipalmitoil fosfatidiletanolamina (60°C), diõleoil fosfatidilglicerol (-18°C), dilauril fosfatidilglicerol (4°C), dimiristoil fosfatidilglicerol (23°C), dipalmitoil fosfatidilglicerol (<41°C), distearoil fosfatidilglicerol (55°C) e ãcido dipalmitoil fosfatídico (com pH 6: 67°C. e com pH 9: 58°C.).

Exemplos de compostos anfifílicos não-iónicos úteis para produzir liposomas não-iónicos podem ser os provenientes da classe dos poliglicéridos de alquilos tais como; 6 distearato de poliglicerilo, éter 3 hidroxi-lauril de poliglicerilo e éter 2 lanolina de poliglicerilo.

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A Tm do material liposomático afecta o escoamento das substâncias activas captadas (incorporadas no int£ rior dos liposomas) para o meio aquoso exterior. Os liposomas são menos permeáveis na forma de gel (abaixo da Tm), mais ⁵ permeáveis no estado líquido cristalino (acima da Tm) e ainda mais permeáveis à temperatura éxacta da fase de transição ou fusão (à Tm). Alguma literatura diz que as REVs são mais permeáveis do que as MLVs, outra literatura diz precisamente o contrário.

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Como é conhecido na ciência, compostos tais como os esterois, é o caso do colesterol, podem ser considerados como fazendo parte do material em camadas usado para formar os liposomas. 0 esterol tem tendência a actuar como um enchimento e estabiliza as membranas do liposoma reduzindo-lhes a permeabilidade. Assim, um moderador tal como o esterol pode reduzir as movimentações dos materiais contidos no interior dos liposomas para a fase aquosa contínua onde eles são suspensos . Uma proporção molar de 50:50 é a mais es tável, no entanto um rácio de 70:10 a 70:35 fosfolípido:es2025 terol é o preferido com rácios de 70:10 a 70:20 a terem ainda maior preferência. A adição de compostos carregados tal como o fosfato de dicetilo ao material em camadas utilizado para formar os liposomas, geralmente, evita o colapso das vesículas. Nós descobrimos que os liposomas produzidos a partir de uma mistura de lecitina de ovo, fosfato de dicetilo e colesterol com um rácio molar de 7:2:2 podem ser utilizados para formar liposomas do tipo LUV a MLV adequados a serem usa dos nesta invenção e de preferência com um rácio molar entre 7:2:1 a 7:2:3-,5.

método de Schieren et al. como é referido em Biochim et Biophys. Acta, vol. 542 pp. 137-153 (1978) foi uti lizado para preparar os LUVs aquosos tal como é descrito nos exemplos. 0s MLVs são produzidos através de um método de hidratação de uma fina membrana tal como é descrito por Kinsky em Methods in Enzymology, XXXII, Biomembranes, Parte B, pp.

501-513 (1974). Outros processos para produzir liposomas se11

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rao evidentes para qualquer especialista na matéria . Da mejs ma forma outros ingredientes activos solúveis em água tais como as vitaminas, humectantes, corantes, etc., podem estar contidos nos liposomas quando eles estão a ser preparados ou incorporados na estrutura em camadas dos liposomas se forem solúveis em óleo como ficou claro na descrição dos anteceden tes da técnica. As suspensões aquosas de liposomas podem con ter cerca de 0,1% a cerca de 50% e de preferência entre 5% a 30%, em volume de liposomas baseado no volume total de liposomas da suspensão aquosa.

Depois das composições aquosas contendo lipos£ mas estarem preparadas, as seguintes classes de agentes tensioactivos são adicionadas a essas composições em quantidades determinadas entre cerca de 0,1% a 40% e de preferência , en tre cerca de 2% a 10% em peso, baseado no peso total da composição, sendo adicionado pelo menos, um dos seguintes agentes tensioactivos:

Os sulfossuccinatos alquílicos gordos em que o grupo alquílico gordo contém entre 8 a 22 átomos de carbono . As seguintes fórmulas sao exemplos dos tais agentes ten sioactivos (a) R¹ (0CH₂CH₂)_a0C(0)CH(SO₃X)CH₂C(0)0X;

(b) R²(0CH₂CH₂)_aC(0)CH(S0₃X)CH₂C(0)0Sl;

(c) R¹CC0)NHCCH₂)_b0C(0)CH(S0₃X)CH₂C(0)0X;

(d) r¹nhcco)ch(so₃x)ch₂c(o)ox em que é um grupo alquilo tendo entre 8 a 22 átomos de 2 carbono, R á um grupo alquilo tendo entre 4 a 16 átomos de carbono, X é anião tal como um metal alcalino tal como o sódio ou potássio, sulfato, metilsulfato, atilsulfato, amónio, uma amina de entre 1 a cerca de 9 átomos de carbono tal como a metilamina, etilamina, dietilamina e tri(n-propil)amina ou uma alcanolamina de entre cerca de 2 a 9 átomos de carbono tal como a monoetanolamina, dietanolamina, trietanolamina e

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j tri-isopropanolamina, a tem um valor entre 0 a 8 b tem um valor entre 1 a 4.

Exemplos de tais sulfossuecinatos e fórmula (a) são: lauril sulfossuccinato de dissódio , laureth-3 std fossuccinato de dissódio, isodecil sulfossuccinato de dissódio, deceth-ô sulfossuccinato de dissódio, estearil sulfossuccinato de dissódio, cetearil sulfossuccinato de dissódio, laneth-5 sulfossuccinato de dissódio, laureth sulfossuccinato de dissódio e laureth sulfossuccinato de dipotássio onde o número médio de grupos etoxi presentes está entre 1 e 4. 0 laureth-3 sulfossuccinato de dissódio e o laneth-5 sulfossuc cinato de dissódio foram fundidos para produzirem um melhor efeito.

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Exemplos da fórmula (b) são: dioctil sulfossuccinato de sódio, dipalmitil sulfossuccinato de sódio e djl lauril sulfossuccinato de potássio. 0 dioctil sulfossuccinato de sódio doi fundido para produzir um melhor efeito.

Exemplos da fórmula (c) são: lauramido MEA sulfossuccinato de dissódio , cocamido MIPA-sulfossuccinato de dissódio , lauramido MEA-sulfossuccinato de dissódio, miristamido MEA-sulfossuccinato de dissódio, óleamido MEA-sulfossuccinato de dissódio, oleamido MIPA-sulfossuccinato de dissódio, estearamido MEA-sulfossuccinato de dissódio, undecilenamido MEA-sulfossuccinato de dissódio β cocamido MIPAsulfossuccinato de dipotássio.

Exemplos da fórmula (d) são: lauril sulfossuccinato de dissódio. oleil sulfossuccinato de dissódio e dicarboxietil estearil sulfossuccinato de tetrassódio.

Sulfatos de acilamino poliglicol-éter gordos em que o grupo acilo gordo contém entre 8 a 22 átomos de car bono podem ser utilizados. A seguinte fórmula dá exemplos de tais agentes tensioactivos:

(e) TrC(O)NH(CH₂CH₂O)_cSO₃X 3 Λ em que R é um grupo alquilo tendo entre 8 a 16 átomos de

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carbono e c tem um valor entre 1 a 6.

Exemplos da fórmula (e) são: dulfato de

TEA-PEG-3 cocamida e sulfato de sódio-PEG-5 estearamida.

Os óxidos de alquil amina gordos em que o grupo alquilo contém entre 7 a 26 átomos de carbono podem ser utilizados . A seguinte fórmula dá exemplos de tais agen tes tensioactivos:

(f) R³R⁴R⁴N->0;

CH₂ R-

N->0 ;

CH,

CH, (h) R⁵C(0)NH(CH₂)_dR⁴R⁴N->0 em que R⁴ e um grupo alquilo tendo entre 1 a 4 átomos de car bono ou -Cpí₂fOH, E'é um grupo alquilo tendo entre 7 a 26 átomos de carbono, d tem um valor entre 1 a 5 e f tem um valor de 2 ou 3.

Exemplos da fórmula, (f) são: óxido de co camida, óxido de lauramida, óxido de miristamina, óxido de estearamina, óxido de laur(dietil)amina e óxido de behen(dimetil)amina .

Exemplos da fórmula (g) são; óxido de coco-mor f olina, 'óxido de N-lauril-morfolina e óxido de N-esteji ril-morfolina.

Exemplos da fórmula (h) são: óxido de cocamidopropilamina, óxido de lauramidopropilamina,'óxido de caprilamidopropil(dietil)amina, óxido de capramidoetil(diraet'il)amina, óxido de lauramidopropil(dietil)amina, óxido de estearamidopropilamina e óxido behenilamidopropll(dimetil)amida.

- 14 ’ ’’*¹J;ΓπΓ53W.*D'·''y

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Ésteres de fosfatos alquílicos gordos em que o grupo alquílico gordo contém entre 8 a 22 átomos de carbono podem ser utilizados . A seguinte fórmula dá exemplos de tais agentes tensioactivos:

(i) (R¹(OCH₂CH₂)_a0)_e^(0)(O2)(O3)₂._e

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em que Z é -H ou X, e tem um valor médio entre 1 e 2.

Exemplos da fórmula (i) são: céteareth-2 fosfato de sódio, fosfato de DEA-oleth-1, fosfato de DEA-oleth-3, lauretb-8 fosfato de sódio, di(oleth-2) fosfato de sódio, laureth-4 fosfato de sódio, lauril fosfato de potássio e deceth-2 fosfato de sódio.

Sais de N-acil aminoácidos, de preferência de áci. do aspártico ou ácido glutãmico, ou sais de derivados N-acil de proteínas hidrolisadas possuindo até cerca de 2500 dalton3 de peso molecular médio eia que a porção acilo é derivada de um ácido carboxílico tendo entre 8 a 22 átomos de carbono por molécula podem ser utilizados.

Exemplos de tais sais são: lauroil glutamato de sódio, N-cocoil-L-glutamato de monotrietanolamina, N-miristoil-L-glutamato de sódio, decoil glutamato de potássio, cocoil glutamato de sódio, estearoil glutamato de sódio, lauroil aspartato de potássio , estearoil aspartato de sódio, lauróil aspartato de sódio, glutamato de TEA-lauroil,lau-v roil“I*-lisina, ácido 2-octildodecil diéster N-lauroil-L-.glutâmico e capriloil aspartato de potássio.

Exemplos de tais proteínas hidrolisadas são: proteína animal coco-hidrolisada de potássio, proteína animal TEA-coco-hidrolisada, proteína animal TEA-abietoil hidrolisa da, TEA-lauroil de colagénio aminoácidos e proteína animal undecilenoil hidrolisada de potássio.

A estabilização da suspensão de liposomas , que pode opcionalmente conter por captação e/ou por incorporação nas membranas (e.g., materiais lipofílicos podem ser transportados por uma membrana lípida para o interior aquoso dos

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J e outros propósitos de limpeza.

Exemplos de tais agentes tensioactivos anióni-

riormente a qual inclui agentes tensioactivos como ò lauril sulfato de sódio , lauril sulfato de amónio, laureth-2 sul. fato de sódio, cocoil sulfato de sódio, estearil sulfato de sódio, miristeth-4 sulfato de sódio e semelhantes . Destes os agentes tensioactivos mais importantes comercialmente são o lauril sulfato de sódio e o laureth sulfato de sódio em que o g tem um valor médio entre 1 a 10 e de preferência entre 1 a 4.

Outros agentes tensioactivos aniónicos tais c£ mo os da fórmula acima podem incluir benzenossulfonatos de alquilo lineares, em que o grupo alquilo é octilo, dodecilo, tetradecilo, hexadecilo ou octadecilo tal como o dodecil ben zenossuldonato de sódio. Outros agentes tensioactivos anióni^ cos são os sulfonatos de olefina C8 - G25 tal como o sulfona to olefina de sódio C14 - C16 e sulfonato olefina de sódio C16 - C18; sulfonatos de parafina CIO - C20 , possuindo en-* tre cerca de 10 a 20 de preferência 10 a 15 átomos de carbono tal como os sulfonatos primários de parafina produzidos por longa reacçao em cadeia entre alfa olefinas e bissulfitos (e.g., bissulfito de sódio) ou sulfonatos de parafina tendo os grupos sulfonatos distribuídos ao longo da cadeia de parafina tal como os produtos produzidos por reacção da cadeia de parafina com anidrido sulfuroso e oxigénio com luz ultravioleta seguida pela neutralização com hidróxido de sódio ou outra base adequada a fornecer um anião como um contra-ião; e fenil ethoxamer sulfato de alquil C8 - C9 , tal como nonoxinol-4 sulfato de sódio, octoxinol-2 etano sulfona^ to de sódio e nonoxinol-4 sulfato de amónio.

Um ou mais destes agentes tensioactivos anióni.

cos causadores do efeito de lise podem ser empregados no pr£ cesso da presente invenção pela adição entre cerca de 0,1 a 35% de preferência entre 5% a 15%, em peso do total da composição detergente de um ou mais agentes tensioactivos anió17

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liposomas em vez de serem captados) ingredientes activos tai:: como vitaminas, corantes e humectantes, entre outros, é consumada muito simplesmente pela adição de um ou mais dos agen tes tensioactivos acima referidos à suspensão de liposomas à temperatura ambiente e com agitação. A composição pode ser agitada por um período de minutos a horas à temperatura ambiente depois da adição estar completa ainda que a estabilização da suspensão de liposomas se manifeste muito rapidamen te.

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Aplicabilidade Industrial

A suspensão de liposomas estabilizada pode então ser utilizada como gel de banho, champô para o cabelo ou composição detergente seum quantidade suficiente dos agentes tensioactivos acima descritos se encontrar presente para conferir as propriedades de limpeza à composição.

Outros ingredientes podem ser adicionados à com posição desde que sejam compatíveis com os liposomas presentes tal como pode ser detectado pela simples adição desses ingredientes à suspensão de liposomas estabilizada. Assim, outros ingredientes tais como corantes, agentes espessantes, preservativos, ingredientes que provocam a opacidade e outros semelhantes podem também ser incluídos nas suspensões estabilizadas e liposomas pelo processo descrito na presente invenção >

•••4^ ; As suspensões estabilizadas de liposomas podem também ser utilizadas como um ingrediente adicionado às formulações de champôs e geles de banho as quais contâm agentes tensioactivos aniónicos os quais de outro modo quebrariam a integridade da estrutura em camadas dos liposomas presentes na composição e através do efeito de lise destruiriam as suas vesículas naturais. Estes tipos de agentes tensioactivos aniónicos estão geralmente incluídos na classe de agentes tensioactivos aniónicos que são facilmente aproveitáveis comercialmente e têm sido largamente utilizados nas formulações de champôs e geles de banho assim como para detergentes

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nicos, às suspensões de liposomas estabilizadas previamente preparadas. A adição do agente tensioactivo às suspensões es. tabilizadas de liposomas é feita com agitação e pode ser fei^ ta à temperatura ambiente com agitação mantida até que a com posição detergente resultante seja homogénea. 0 resultado do processo é uma composição detergente a qual pode ser utiliza, da como um gel de banho ou outra composição detergente.

Como seria desejável por todos os especialistas na matéria, a composição final deveria conter um nível suficiente de liposomas de forma a conferir um efeito be. néfico ao corpo ou cabelo sencontacto fosse possível através desta composição.

Os seguintes Exemplos’ são fornecidos para mostrar os vários aspectos da presente invenção sem abandonar o objectivo e espírito da invenção. A menos que seja indicado de outro modo, todos os componentes e percentagens ut. lizados nos Exemplos são em peso. Nos seguintes Exemplos, os processos e testes utilizados foram os seguintes:

Produção de LUVs: Produziram-se dois tipos diferentes de liposomas contendo 5(6)-carboxifluorescinas como corantes marcadores pela modificação do processo de Schieren et al. referido anteriormente. Um tipo utiliza a lecitina de ovo como o mais'importante composto lípido·aniónico: fosfaditil colina de ovo (de gema de ovo congelada): fosfato de'dicetilo: colesterol com um rácio molar de '7:2:2 (daqui por diante referido como ”LUV-EPCs). 0 outro tipo de LUV utiliza como quantidade mais importante um composto anfifílico não-iónico diestearato de poligliceril-6 (6G-2-S de Capital City Produ£ ts Company): fosfato de dicetilo:colesterol com um rácio molar de 7:2:2 (daqui por diante referido como LUV-PGDs).

Componentes da membrana (fosfaditil colina fecro(59,61 miligramas-”mg) ou diestearato de poligliceril-6 fosfato de dicetil (11,85 mg): colesterol (7,14 mg) com um rácio molar de 7:2:2) foram dissolvidos em cerca de 25 mililitros (ml) de clorofórmio com a adição de uma quantidade mi nima de metanol (i.e., Uma quantidade suficiente para dissoJL

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ver o fosfato de dicetilo: cerca de 2ml), ráduz-se a pressão secando a 45°C. durante pelo menos duas horas. A membrana se. ca resultante foi então dissolvida em 35 ml de éter de petró leo (fervendo de 35°C a 60°C), a solução foi dissolvida ao meio e cada metade foi absorvida para uma seringa estanque de gás. Cada seringa foi colocada dentro de uma seringa de êmbolo e cada solvente misturado foi injectado com uma frequência entre 0,1 a 0,2 ml por minuto para dentro de um dos dois recipientes com revestimento isolador de gás contendo 4 ml de uma solução aquosa com uma função de captação com um peso molar de 0,05 aminometano de tris(hidroximetil) (TRIS com pH de 7,4 contendo 5(6)-carboxifluorescinas com um peso molar de 0,01 onde a solução foi regulada para 290 mOsm/Kg H2O utilizando cloreto de sódio antes do uso. A solução com função de captação foi mantida no ponto de ebulição do solvente (60°C) ou acima dele. Depois da conclusão da injecção, a suspensão de liposoma foi sujeita a um turbilhão por um mi. nuto e depois deixada estar a uma temperatura ambiente fresca (cerca de 22°C). 0 corante nao captado foi removido por cromatografia de gel através da passagem da suspensão por uma coluna dé SEPHADEX G25.

Produção de MLVs: Estes liposomas contendo 5(6)-carboxifluorescinas foram-utilizados nos-Exemplos 22-24.'Estes liposomas empregaram distearil fosfatidil colina como o,mais importante composto lípido aniónico; distearil fosfatidil colina (25 mg): fosfato de dicetilo (4,92 mg): colesterol (2,97 mg) com um rácio molar de 7:2:2 (daqui em diante referid como MLV-DPCs), MLV-DPCs foram produzidas através de uma fina membrana, processo que é a seguir descrito: 0 processo de preparação utilizado foi inicialmente igual ao utilizado na preparação dos LUV-EPCs onde os componentes da mem brana foram dissolvidos em clorofórmio com uma quantidade mínima de metanol e secos a 45°G durante 2 horas para produzir uma membrana seca. Uma solução especial com função de captação foi utilizada para obter melhores microfotografias:

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gramas de glucose foram adicionadas a 100 ml de uma solução aquosa tampão com pH 7,4 contendo 5(6)-carboxifluorescinas de peso molar 0,01 e TRIS de peso molar 0,05 . Três mili metros desta solução captante foram.adicionados por cada 25 miligramas de diestearil fosfatidil colina num balão de evaporação. 0 balão de vidro foi aquecido em água a 60°C e o conteúdo foi agitado suavemente. Logo que a membrana seca fi cou hidratada , detectar-se uma suspensão cremosa e o conteú do foi agitado mais vigorosamente durante 15 minutos, a suspensão de liposomas resultante foi então arrefecida à temperatura ambiente e utilizada nos Exemplos seguintes sem avançar no processo.

Espectrografos de Fluorímetro : Para determinar· a estabilida de das suspensões aquosas de liposomas, um corante solúvel em água —5(6)-carboxifluorescina da Eastman Kodak Company— o qual não tem vindo a ser incorporado na estrutura em camadà’s dos liposomas foi encapsulado no interior aquoso dos liposomas servindo assim como um marcador. Este processo para a determinação da integridade da suspensão de liposomas tem vindo a ser discutida em certa literatura é o caso do artigo de Ralston et al. em Biochim. Biophys. Acta, Vol. 649, pp 133-137 (1981). A excitação e emissão de comprimentos de onda das 5(6)-carboxifluorescinas é da ordem dos 492 nanometros (nm) e 520 nm, respectivamente.. · ' ‘

Para se obter Espectrografos de Fluorímetro do tipo apresentado nas Figuras 1 e 2, a Intensidade Fluores cente da suspensão de liposomas foi medida a 520 nm utilizan do um detector de fluorescência Perkin Elmer 65OS com o qual foi feito um interface com um Personal Computer IBM para gerar um Espectrógrafo de Fluorímetro cobrindo um período de tempo arbitrário até que nenhum aumento significativo de fluorescência fosse observado, tipicamente um período de tem po de 150 a 180 segundo . Desde que a 5(6)-carboxifluorescina seja fortemente dependente do pH, quaisquer agentes tensioactivos e soluções tampão entram em contacto com as suspensões de liposomas que estejam ajustadas a um pH de 7,4.

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Em adição, a osmolalidade das soluções foi ajustada a 290 mOsm/Kg H2O para prevenir alterações das concentrações de 5(6)-carboxifluorescina devidas à actividade osmótica das membranas dos liposomas.

máximo de intensidade fluorescente de uma suspensão de liposomas foi determinada por um completo efeito de lise de uma amostra de liposomas pela introdução de um aliquota (geralmente 25 microlitros) da suspensão de liposomas contendo corante de captação em 4 ml de uma solução a 1% de dodecil sulfato de sódio. Para os liposomas baseados em compostos anfifílicos não-iónicos, o octoxinol-9 foi utilizado em lugar do dodecil sulfato de sódio. Para determinar 0 mínimo de intensidade fluorescente, um aliquota da suspensão de liposomas com o mesmo volume foi adicionado a 4 ml de uma solução tampão isotónica com um pH de 7,4. Um nível de intensidade fluorescente de 50% indicado nos Espectrógrafos de Fluorimetro foi calculado como sendo a falsa intensidade fluorescente equidistante entre o máximo e o mínimo dos valo, res da intensidade fluorescente obtidos pela suspensão de M posomas.

Os Espectrógrafos de Fluorimetro das suspensões de liposomas em presença de agentes tensioactivos.específicos foram feitos através da adição de um aliquota de 25 microlitros de corantes contendo liposomas para ser testado, a 4 ml de uma solução de agentes tensioactivos para ò deseja do teste de concentração à temperatura ambiente (cerca de 22°C) depois de adicionados, foram imediatamente transferidos para uma cuvette do.fluorimetro. Todas as soluções de agentes tensioactivos foram ajustadas pára serem isotónicas com cloreto de sódio, para serem soluções tampão foram ajustadas com TRIS de peso molar 0,05 e foram também ajustadas a um pH de 7,4 com ácido clorídrico . A lise dos liposomas ocorreu muito rapidamente à temperatura ambiente. A suspensão de liposomas foi considerada estável na presença de um agente tensioactivo se a leitura feita do equilíbrio (tipicamente chega aos 10-20 segundos e normalmente depois dos 60 segun¥

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»/ dos após a adição do alíquota à solução contendo o agente tensioactivo) da intensidade fluorescente não‘excedesse 50% do nível de intensidade fluorescente para aquela suspensão de liposomas.

Os Espectrógrafos representam o desenvolvimento extraordinário da intensidade fluorescente.’ Quando inicialmente preparado, cada suspensão contendo corantes possui uma certa fluorescência intrínseca que é a mínima intensidade fuorescente. Na adição dos liposomas a uma solução de agentes tensioactivos que interactua com a membrana dó liposoma sem lhe provocar a lise, observa-se um pequeno aumento na in tensidade fluorescente. Esse momento em que se dá o escoamen to do corante é bem conhecido dos formuladores das preparaçães de liposomas utilizadas para a libertação de drogas.

Tal escoamento não foi considerado como indicativo da lise do liposoma a menos que excedesse os 50% de intensidade fluo rescente descrita acima. Aquele nível foi determinado como um máximo arbitrário para além do qual a interacção.agente tensioactivo-liposoma seria considerada- destrutiva. A compatibilidade dos liposomas com os agentes tensioactivos testados é indicada por um ou mais dos seguintes factores: A fluorescência não excede os 50% da intensidade fluorescente a qualquer concentração vantajosa de agentes tensioactivos, decresce em níveis de intensidade fluorescente- como a concen tração de agentes tensioactivos é aumentada e o desenvolvimento da fluorescência extraordinária é desprezível. PIG^!. 1 mostra um Espectrógrafo de Fluorimetro o qual exibe todos esses factores. Durante este trabalho, a¹'adição de agentes, tensioactivos foi geralmente orientada para um decréscimo na intensidade fluorescente para além do valor inicial. Tal decréscimo pode ser devido à ligação-do agente tensioactivo à membrana do liposoma de tal modo que a membrana se torne estanque e contraia , provocando a eliminação de água do interior do liposoma e consequentemente provoque um aumento da concentração do corante e desta forma uma redução na intensidade fluorescente porque o corante se extingue a altas con- 22

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Mod. 71 - 20.000 ·χ. - 90/08 centrações.

Em todos .os seguintes exemplos, os agentes ten sioactivos utilizados foram de qualidade industrial e nenhum ensaio foi feito para os purificar.

, .Exemplos 1-3

Os Exemplos 1 e 2 ilustram a compatibilidade com LUV-EOCs dos agentes tensioactivos sulfossuccinatos alquílicos gordos, laureth-3 sulfossuccinato de dissódio, como é mostrado na Fig. 1, quando são comparados com o Exemplo 3 onde o efeito de lise de um agente tensioactivo aniónico, um sulfonato dé alfa olefina, é mostrado na Fig.' 2.

No Exemplo 1, LUV-EPCs foram preparados como foi descrito acima e aliquotas foram adicionados a soluções de agentes tensioactivos contendo 0,125%, 1,25% e 5,0%,'respectivamente, de laureth-3 sulfossuccinato de dissódio obtidas através de SURFAGENE S30 de GHEM-Y, G.m.b.H. da Alemanha com 40% de agentes tensioactivo activo, utilizando o procedi, mento descrito acima na rubrica Espectrógrafos de.Fluorimetro” tendo sido cada um dos Espectrógrafos de Fluorimetro re gistados. Os resultados são mostrados na Fig. 1 onde o mínimo de intensidade fluorescente dos LUV-EPCs utilizados anteriormente à adição do agente tensioactivo era cerca de 8,7 Fig. 1 mostra que o valor do equilíbrio da intensidade fluorescentè foi cerca de 8,1 depois dos 60 segundos- com riais òu menos o mesmo valor para a concentração de agente tensioacti vo activo,!,25%► A uma concentração de 5,0% de agente tensio activo activo, a intensidade fluorescente rapidamente' alcançou um equilíbrio a um valor de cerca de 7,1 depois cerca de 40 segundos. Em todos os casos, o valor do equilíbrio de cada concentração de.agente tensioactivo testada foi inferior a 50% de intensidade fluorescente para o LUV-EPCs na ausência dos agentes tensioactivos testados e foi assim estável na presença do laureth-3 sulfossuccinato de dissódio.

Exemplo 2 foi feito da mesma forma do Exemplo 1 e utilizado o. mesmo agente tensioactivo, mas de um fa23 07/578913

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bricante diferente : laureth-3 sulfossuccinato de dissódio obtido em REWOPOL SBFA.30 de Rewo Chemische Werke G.m.b.H. da Alemanha contendo 40% de agentes tensioactivo activo. 0 valor de 50% de intensidade fluorescente para o LUV-EPCs foi ' cerca de 8,7. As concentrações de laureth-3 sulfossuccinato de dissódio medidas e a sua intensidade fluorescente de equi líbrio depois dos 60 segundos listada em parênteses foram as seguintes: 0,125% (7,8); 1,25% (7,7); 3,75%; (7,1) e 5,0% (6,7). Isto essencialmente confirma o resultado no Exemplo 1 mostrando que o LUV-EOCs foi estável em presença deste . agente tensioactivo.

Exemplo 3 foi feito da mesma forma que o Exeç. pio 1 e os Espectrógrafos de Fluorimetro foram recordados on de os níveis activos de sulfonatos de alfa olefina agente tensioactivo aniónico, sulfonato de sódio C14-C16 olefina, obtidos na ELFAN OS46 de Akzo Ghemicals BV da Holanda conten do 37% de agente tensioactivo activo, foram de 0,125%,

0,625%, 1,25% e 3,75%, respectivamente. Em todos os níveis de agentes tensioactivos testados, os agentes tensioactivos aniónicos causadores da lise utilizados neste Exemplo provocaram a lise numa quantidade substancial de liposomas presen tes como é mostrado na Fig. 2 pelo facto de que o equilíbrio da intensidade fluorescente para cada amostra testada se situava entre cerca, de 10;l e 10,4 o que é significativamente superior ao nível de 50%· de intensidade fluorescente de cerca de 8/7 . Quando outros agentes tensioactivos aniónicos do tipo comummente utilizado em champôs e geles de banho tal como o lauril sulfato de sódio, o laureth sulfato de sódio contendo uma média de‘entre 0,5 a 8 grupos de óxido de etileno por molécula e 1 benzeno^- sulfonato alquilo linear onde o grupo al quilo contem cerca de 12 átomos de carbono são testados, obtêm-se resultados do mesmo tipo descrito na Fig. 2.

Assim o LUV-EPCs foram estáveis em presença do agente tensioactivo sulfossuccinato alquílico gordo, laureth-3 sulfossuccinato , enquanto o agente tensioactivo aniónico sulfonato de alfa olefina provoca a lise de uma quantidade

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significativa do mesmo tipo dos LUV-EPCs não tratados.

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Exemplos 4-9

4~ >

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Estes Exemplos domonstram a compatibilidade dos LUV-EPCs com várias classes de agentes tensioactivos. ·

Exemplo 4 foi preparado da mesma forma que o exemplo 1 utilizando um ácido gordo de sulfossuccinato de alquilolamido, lauramido MEA sulfossuccinato de dissódio obtido em REWOPOL SBL 203 da Rewo Chemische Werke G.m.b.H. contendo 40% de agente tensioactivo activo. 0 valor de 50% de intensidade fluorescente para o LUV-EPCs foi cerca de 8,7. As concentrações de lauramido MEA sulfossuccinato de dissódio activo medidas e o seu equilíbrio de intensidade fluorejs cendo depois de 60 segundo listado em parênteses foram os s£ guintes; 0,125% (7,6); 1,25% (5,0); e 5,0% (4,5). Este agente tensioactivo foi compatível com o LUV-EPCs.

Exemplo 5 foi preparado da mesma forma que o Exemplo 1 utilizando um sulfossuccinato de di-alquilo, dio etilo sulfossuccinato de sódio, obtidos na EMPIMIN 0T da Albright & Wilson Ltd. de Inglaterra contendo 60% de agente tensioactivo activo. 0 valor de 50% de intensidade fluorescente para o LUV-EPCs foi cerca de 8,2 como é mostrado na Fig. 3. As concentrações de dioctilo sulfossuccinato de sódio activo medidas e o seu equilíbrio de intensidade fluores cente depois dos 60 segundos listado em parênteses foram os seguintes: 0,092% (7,1)· 0,125% (6,9); 0,185% (6,8); 0,462%. (6,4); 2,78% (5,6) e 3,7% (6,0) . Este agente tensioactivo foi compatível com os LUV-EPCs.

Exemplo 6 foi preparado da mesma.: forma que o Exemplo 1 utilizando sulfato de acilamina poliglicol-éter gordos, cocamido sulfato de TEA-PEG-3 obtidos na GENAPOL AMS de Hoecbst AG da Alemanha contendo 40% de agente ten sioactivo activo. 0 valor de 50% de intensidade fluorescente para o LUV-EPCs foi cerca de 8,7. As concentrações de cocamido sulfato de TEA-PEG-3 sulfossuccinato de sódio activo

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seu equilíbrio de intensidade fluorescente desegundos listado em parênteses foram as seguin(8,2); O_(>625% (8,3); 1,25% (8,0); 3,75% (7,3) e

Este agente tensioactivo foi compatível com os )

5..-

medidas e o pois dos 60 tes: 0,125% 5,0% (6,8).

LUV-EPCs .

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Exemplo 7 foi preparado da mesma forma que o Exemplo 1 utilizando um óxido de alquil amina gordo, óxido de cocamidopropilamina, obtidos na REWOMINOXID B204 de Rewo Chemische Werke G.m.b.H. contendo 35% de agente tensioactivo activo. 0 valor de 50% de intensidade fluorescente para o LUV-EPCs foi cerca de 8,7 como pode ser visto na Fig. 4. As concentrações de óxido de cocamidopropilamina medidas e o equilíbrio de intensidade fluorescente depois dos 60 segundos listado em parênteses foram os seguintes: 0,125% (9,8); 0,25% (8,8); 0,625% (8,8); 1,25% (8,7); 3,75% (8,0) e 5,0% (7,6). Este agente tensioactivo não foi compatível com os LUV-EPCs em concentrações até cerca de 1,25%, mas inesperadamente, foi compatível com os LUV-EPCs a altas concentrações. Assim para· funcionar como um estabilizador, este óxido de amina tem que ser utilizado em concentrações que excedam 1,25%.

Exemplo 8 foi preparado da mesma forma que o .Exemplo 1 utilizando um sal de N-acil aminoácido, laurôil glutamato de sódio, obtido, como.AMISOFT LS-:1X de Ajinomoto USA, Inc. de Teaneçk, NJ contendo 93% de agente t.ensioactivo activo. 0 valor de 50% de intensidade fluorescente para o LUV-EPCs foi cerca de 8,7. As concentrações de lauroil glutamato de' sódio medidas e o equilíbrio de. intensidade fluorescente depois dos 6Q segundos listado em parênteses foram as seguintes: 0,125% (6,7); 1,25% (6,3); 3,75/% (5,8) è 5,0% (6,1). Este agente tensioactivo foi compatível com os LUV-EPCs.

Exemplo 9 foi preparado da mesma forma que o . Exemplo 1 utilizando um sal de derivado de N-acil de proteína hidrolisada (i.e., o sal depotássio de um ácido/proteína gordo condensado), proteína animal de potássio coco-hidroli- 63.848

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sada, obtidos na REWOTEIN CPK de Rewo Chemische Werke G.m.b.I' contendo 25% de agente tensioactivo activo.·Ό valor de 50% de .inter. sidade fluorescente para LUV-EPCs foi cerca da 8,7. As concentrações de agente tensioactivo de proteína animal de potáf sio coco-hidrolisadas activas medidas e o equilíbrio de intensidade fluorescente depois dos 60 segundos listado em parênteses foram os seguintes: 0,086% (7,4); 0,43% (7,5); 0,86° (7,1); 2,59% (6,8) e 3,45%.(6,6). Este agente tensioactivo foi compatível com os LUV-EPCs.

Exemplos 10 - 13

Estes Exemplos demonstram a compatibilidade dos LUV-PGDs não-iónicos com as várias classes de agentes tensioactivos.

Exempla 10 foi preparado da mesma forma que o Exemplo 1 utilizando o mesmo agente tensioactivo, laureth-3 sulfossuccinato de dissódio obtido na SURFAGENE S30, mas substituindo pelos LUV-PGDs os LUV-EPCs utilizados no Exemplo 1. 0 valor de 50% de intensidade fluorescente para o LUV-PGDs foi cerca de 5,7 como pode ser visto na Fig. 5.As concentrações do agente tensioactivo laureth-3 sulfossuccinei to de dissódio activo medidas e o equilíbrio de intensidade fluorescente depois dos 60 segundo listado em parênteses foram os seguintes: 0,5% (4,6); 2,5% (4,6) e 5,0% (4,5). Este agente tensioactivo foi compatível com os LUV-PGDs.

Exemplo 11 foi preparado da mesma forma que o Exemplo 9, mas os LUV-PGDs substituíram os LUV-EPCs utilizados no Exemplo 9. O valor de 50% de intensidade fluorescente para o LUV-PGDs foi cerca de 5,7 . As concentrações do agente tensioactivo activo sal de potássio de ácido/proteína gordo condensado medidas e o equilíbrio de intensidade fluorescente depois dos 60 segundos listado em parênteses foram os seguintes: 0,345% (3,6); 1,725% (3,7) e 3,45% (4,1) Este agente tensioactivo foi compatível com os LUV-PGDs.

Exemplo 12 foi preparado da mesma forma que o Exemplo 6, mas os LUV-PGDs substituíram os LUV-EPCs

I

utilizados no Exemplo 6. 0 valor de 50% de intensidade fluorescente para o LUV-PGDs foi cerca de 5,7. As concentrações do agente tensioactivo activo cocamida sulfato de TEA-PEG-3 medidas e o equilíbrio de intensidade fluorescente depois dos 60 segundos listado em parênteses foram os seguintes: 0,5% (4,5) e 5% (4,6). Este agente tensioactivo foi compatíjMod. 71 * 20.000 «χ.. 90/06 vel com os LUV-PGDs.

Exemplo 13 foi preparado da mesma forma que o Exemplo 1, mas os LUV-PGDs substituíram ps LUV-EPCs utilizados no Exemplo 1 e os agentes tensioactivos utilizados foram o éster de fosfato alquílico gordo, o ceteareth-2 fosfato de sódio obtidos na CRODAFOS CS2N da Croda Chemicals Ltd. de Inglaterra contendo 99% de agente tensioactivo activo. 0 valor de 50% de intensidade fluorescente para os LUV-PGDs foi cerca de 5,7 como foi mostrado na Fig. 6. As concentrações do agente tensioactivo activo ceteareth-2 fosfato de sc5 dio medidas e o equilíbrio de intensidade fluorescente depois dos 60 segundos listado em parênteses foram os seguintes: 0,5% (4,0); 2,5% (3,4) e 5% (3,1). Este agente tensio20 activo foi compatível com os LUV-PGDs.

Exemplos 14 - 18

Nesta série de Exemplos, a preparação de compo sições detergentes contendo suspensões de liposomas estabihi zadas na presente invenção com um agente tensioactivo an.ióni_ co que tipicamente é σ causador da lise dos liposomas, laureth-2 sulfato de sódio, foi demonstrado com dados referentes à estabilidade dos liposomas em tais composições.

No Exemplo 14, LUV-EPCs foram estabilizados com várias quantidades de laureth-3 sulfossuccinato de dissódio (SURFAGENE S30) como descrito no Exemplo 1. Espectrógrafos de Fluoríraetro das composições estabilizadas foram preparadas como no Exemplo 1. 0 mínimo de intensidade fluorescente dos LUV-EPCs foi 6,7 e o valor de 50% de intensidade fluorescente para os LUV-EPCs foi cerca de 8,7 como foi mostrado na Fig. 7. As concentrações do agente tensioactivo

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'30 activo laureth-3 sulfossuccinato de dissódio medidas e o equilíbrio de intensidade fluorescente depois dos 60 segundos listado em parênteses foram os seguintes: 0,125% (8,1); 1,25% (8,1) e 5% (7,1). Este agente tensioactivo foi compati ve.1 corn os LUV-E<PCs.

A seguir, 4 ml da suspensão de liposomas estabilizada acima referida com 5% de agente tensioactivo activo laureth-3 sulfossuccinato de dissódio foi adicionada a 1 ml de uma solução contendo 5% de laureth-2 sulfato de sódio activo para obter uma composição detergente contendo liposomas estabilizados sobre a qual um Espectrógrafo de FluoriSmetro foi imediatamente aplicado após a preparação para se obter um equilíbrio de intensidade fluorescente de 6,8. A mesma composição detergente permaneceu à temperatura ambiente (22°C) por um período de 48 horas e o equilíbrio da inten sidade fluorescente diminuiu para 5,0 como é mostrado na Fig. 7. Este decréscimo na intensidade fluorescente abaixo do valor mínimo de fluorescência para os LUV-EPCs fez pensar ser possivelmente devido à carga conferida aos liposomas que por sua vez lhes foi conferida através da estabilização com laureth-3 sulfossuccinato de sódio seguida pela subsequente adição do excesso de electrólito na forma de laureth-2 sulfa to de sódio causando uma redução global do volume livre do sistema . 0 inesperado resultado foi o facto de os liposomas terem sido estabilizados pelo laureth-3 sulfossuccinato de .dissódio de forma a ficarem estáveis em presença do laureth -2 sulfato de sódio o qual de outro modo seria de esperar que provocasse a lise dos liposomas e a libertação do coran te contido no seu interior.

No Exemplo 15, LUV-EPCs foram estabilizados com várias quantidades de laureth-5 sulfossuccinato de dissódio obtido como REWOPOL SBFA50 de Revo Chemische Werke G.m.b.H. a 40% de concentração de agente tensioactivo activo como descrito no Exemplo 14. Espectrógrafos de Fluorímetro das composições estabilizadas foram preparadas como no Exemplo 14. 0 valor de 50% de intensidade fluorescente dos

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LUV-EPCs foi cerca de 8,7 . As concentrações do agente tensij^ activo activo laureth-5 sulfossuccinato de dissódio medidas e o equilíbrio de intensidade fluorescente depois dos 60 segundos listado era parênteses foram os seguintes: 0,125% (8,0¹ 1,25% (7,2); 3,75% (7,7) e 5% (7,4). Este agente tensioactivo foi compatível com os LUV-EPCs.

A seguir, 4 ml da suspensão de liposomas estabilizada com 5% de agente tensioactivo activo laureth-5 sulfossuccinato de dissódio foi adicioando a 1 ml de uma solução contendo 5% de laureth-2 sulfato de sódio activo para obter uma composição detergente contendo liposomas estabilizados sobre a qual um Espectrógarfo de Fluorímetro foi imediatamenta aplicado após a preparação para se obter um equilíbrio de intensidade fluorescente de 7,3. A mesma composição detergente permaneceu à temperatura ambiente (22°C) por um período de 48 horas e o equilíbrio da intensidade fluores. cente diminuiu, para um valor inferior a 1.

No Exemplo 16, LUV-EPCs foram estabilizados com várias quantidades de laneth-5 sulfossuccinato de dissódio obtido como REWOLAN E de Rewo Chemische Werke G.m.h.H. a 50% de concentração de agente tensioactivo activo como descrito no Exemplo 14. Espectrógrafos de Fluorímetro das composições estabilizadas foram preparados como no Exemplo 14. 0 valor de 50% de* intensidade fluorescente dos LUV-EPCs foi cerca de 8,7 como é mostrado na Fig.' 8. As concentrações do agente tensioactivo activo laneth-5 sulfossuccinato de dissódio medidas e o equilíbrio de intensidade fluorescente depois dos 60 segundo listado em parênteses foram os seguintes: 0,125% (7,4); 1,25% (6,3); 3,75%. (4,4) e 5% (4,3). Este agente tensioactivo foi compatível com os LUV-EPCs.

A seguir, 4 ml da suspensão de liposomas estabi^ lizada com 5% de agente tensioactivo activo Tanreth-3 sulfossuccinato de dissódio foi adicionado a 1 ml de uma solução contendo 5% de laureth-2 sulfato de sódio activo para obter uma composição detergente contendo liposomas estabilizados sobre a qual um Espectrógrafo de Fluorímetro foi imediatamen _ sn 63.848

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te aplicado após a preparação para se obter um equilíbrio de intensidade fluorescente de 3,9 . A mesma composição detergente permaneceu à temperatura ambiente (22°C) por um período de 48 horas e o equilíbrio da intensidade fluorescente diminuiu para cerca de 2,1.

No Exemplo 17, LUV-EPCs foram estabilizados com várias quantidades de sulfato de TEA-PEG-3 cocamido obtido como GENAPOL AMS da Hoechst AG da Alemanha e contendo 40% de agente tensioactivo activo como descrito no Exemplo 6. Os Espectrógrafos de Fluorímetro foram preparados como no Exemplo 6. 0 valor de 50% de intensidade fluorescente para os LUV-EPCs foi cerca de 8,7. As concentrações do agente tensioactivo sulfato TEA-PEG-3 cocamido medidas e o seu equilíbrio de intensidade fluorescente depois de 60 segundos listada em parênteses foram os seguintes: 0,125% (8,2); 0,625% (8,3); 1,25% (8,0); 3,75% (7,3) e 5% (6,9). Isto confirma os resultados encontrados no Exemplo 6.

A seguir, 4 ml de suspensão de liposomas estabilizados com 5% de‘agente tensioactivo activo sulfato de TTE'A-PEG-3 cocamido foi adicionada a 1 ml de uma solução con tendo 5% de laureth-2 sulfato de sódio activo para obter uma composição detergente contendo liposomas estabilizados à qual tim Espectrógráfo de Fluorímetro foi imediatamente tirado após a preparação para se obter ura equilíbrio de intensidade fluorescente de 6,9. A mesma composição detergente permaneceu a temperatura ambiente (22°C) por um período de 72 horas e o equilíbrio da intensidade fluorescente foi achado a cerca de 3,4 , houve pois um decréscimo.

No Exemplo 18, LUV-EPCs foram estabilizadas com várias porções de éster de fosfato alquilíco gordo, ceteareth-2 fosfato de sódio, obtido como CRODAFOS CS2N da Croda Chemicals Ltd. contendo 99% de agente tensioactivo activo como descrito no Exemplo 13, mas LUV-EPCs foram utilizados neste Exemplo 18. Espectrógrafos de Fluorímetro das composições estabilizadas foram preparados como no Exemplo 13. 0 valor de 50% de intensidade fluorescente para os LUV-EPCs

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Mod. 71 - 20.000 «x. - 90/08 foi cerca de 8,7 como é mostrado na Fig. 9. As concentrações do agente tensioactivo activo ceteareth-2 fosfato de sódio medidas e o seu equilíbrio de intensidade fluorescente depois dos 60 segundos listada em parênteses foram os seguintes: 0,125% (8,9), 0,625% (8,2); 1,25% (8,1); 3,75% (7,3) e

5% (6,8). Este agente tensioactivo não foi compatível com os LUV-EPCs para concentrações até cerca de 0,125%, mas .inesperadamente é compatível com os LUV-EPCs a altas concentrações. Assim, para ser de facto um estabilizador, este agente tensioactivo de fosfato deve ser utilizado em concentrações que excedem os 1,25%.

A seguir, 4 ml de suspensão de liposomas estabili' zada com 5% de ceteareth-2 fosfato de sódio agente tensioactivo activo foi adicionada a 1 ml de uma solução contendo 5% de laureth-2 sulfato de sódio activo para obter uma composição detergente contendo liposomas estabilizados à qual um Espectrógrafo de Fluorímetro foi tirado imediatamente após a preparação para obter um equilíbrio da intensidade fluorescente de 6,7. A mesma composição detergente permaneceu à temperatura ambiente de (22°C) por um período de 48 horas e o equilíbrio da intensidade fluorescente foi encontrado a 6,5, houve pois ura decréscimo.

Exemplos 19 — 21

Nestes Exemplos, as composições detergentes contendo LUV-PGDs estabilizados com 5% de laureth-3 sulfossucci nato de dissódio e cadà um dos três diferentes agentes tensioactivos aniónicos que provocam tipicamente a lise dos liposomas são ilustradas tão bem quanto a estabilidade dos LUV-PGDs em presença dos tais agentes tensioactivos aniónicos.

As suspensões de liposomas estabilizadas utilizadas nos Exemplos 19-21 foram feitas de acordo com o mesmo procedimento descrito no Exemplo 10 para as suspensões estabilizadas com 5% de laureth-3 sulfossuccinato de dissódio (SULFAGENE S30). Os LUV-PGDs ficaram a estabilizar à temperatura ambiente durante 30 minutos depois da adição dos _ on

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LUV-PGDs a 5% da solução de laureth-3 sulfossuccinato de dis^ sódio antes das seguintes composições serem feitas.

exemplo 19 foi preparado pela adição de uma suspensão de liposomas estabilizada descrita acima a 5% de uma solução aquosa isotónica e tampão de laureth-2 sulfato ds sódio numa relação de 1:1 volume:volume base e um Espectrógrafo de Fluorímetro da composição detergente resultante foi feito. Como é mostrado na Fig. .10 o nível de 50% de intensidade fluorescente dos LUV-PGDs foi cerca de 5,7 enquanto a composição detergente do Exemplo 19 tinha um equilíbrio de intensidade fluorescente de 4,4 como é mostrado na Fig.

indicando que aqueles LUV-PGDs estabilizados eram estáveis em presença do laureth-2 sulfato de sódio.

Exemplo 20 foi preparado da mesma forma que o Exemplo 19, mas o agente tensioactivo aniónico utilizado foi o sulfonato de alfa olefina usado no Exemplo 3 comparativo, ELFAN 0S46 de Akzo Chemicals BV. A composição detergente do Exemplo 20 teve uma intensidade fluorescente de eqilíbrio de 4,8 como é mostrado na Fig. 10 indicando que aqueles LUV-PGDs eram estáveis em presença de sulfonato de alfa olefina.

Exemplo 21 foi preparado da mesma forma que o Exemplo 19, mas o agente tensioactivo aniónico utilizado era o sulfonato de alquilbenzeno. linear e o sulfonato de TEA-dodecilbenzeno obtido como UANSA TS60 de Albright & Wilson Ltd. da Inglaterra contendo 60% de agente tensioacti vo activo. A composição detergente do Exemplo 21 teve um equilíbrio de intensidade fluorescente de 5,4 como é mostrado na Fig. 10 indicando que aqueles LUV-PGDs eram estáveis em presença do sulfonato de TEA-dodecilbenzeno.

Exemplos 22 - 25

Estes Exemplos mostram composições detergentes para lavagem facial incluindo suspensões de liposomas contendo corantes estabilizados (MLV-DPCs). 0 Exemplo 24 air da inclui um agente tensioactivo aniónico, o laureth-2 sul33

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Mod. 71 - 20.000 ·χ. -90/08 fato de sódio, conhecido por provocar a lise dos liposomas para mostrar a estabilidade dos MLV-DPCs na composição deter gente.

A Fig. 11 é uma microfotografia ampliada 400X visível à luz dos MLV-DPCs depois do tratamento^- com uma porção estabilizante (1,25%) de SURFAGENE S30 pela adição de

I ml de 5% de SURFAGENE S30 a 3 ml de MLV-DPCs (daqui por diante MLV-DPCs tratados). As manchas brilhantes na Fig.

II representam vesículas de liposomas contendo corante de adaptação. As microfotografias aqui incluídas foram feitas com um tempo de exposição extra de 1 minuto para captar suficiente luz afim de melhor registar no filme colorido e observaram-se alguns borrões devido ao movimento dos liposomas durante o período de exposição.

A composição detergente do Exemplo 22 foi fei. ta por adição de 1,67 partes em volume de MLV-DPCs tratados energicamente a 12,5 partes de SULFAGENE S30 (laureth-3 sulfossuccinato de dissódio) seguido por 20 partes de GENAPOL AMS (sulfato de TEA-PEG-3 cocamido) para obter o Exemplo 22. Aquela composição detergente foi amadurecida 8 dias à temperatura ambiente e a microfotografia ampliada 400X e visível à luz mostrada na Fig. 12 foi tirada como descrito para a Fig. 11. A Fig. 12 mostra claramente a presença de vesículas contendo corante e assim os liposomas foram estáveis nesta composição por aquele período de tempo.

Nos Exemplos 22-24, nenhuma quantidade adici£ nal de água foi adicionada à formulação e os MLV-DPCs com sacarose foram utilizados (como descrito anteriormente) para obter composições com alva viscosidade que melhor mostrariam a presença dos liposomas fotograficamente desde relativamente longo tempo de exposição necessário para obter uma microfotografia ampliada 400X. As formulações dos Exemplos 22-24 foram também preparados utilizando MLVs os quais não incluíam sacarose. Cada formulação exibia liposomas, quando diluídos com água desionizada até 100 ml de volume. No entan to, os liposomas tendem a mover-se nas tais composições de_ Ο Λ

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\s tergentes aquosas, na extensão em que as microfotografias ampliadas tiradas com um tempo de exposição registaram uma microfotografia borrada.

Exemplo 23 foi preparado da mesma forma que o Exemplo 22 (adições feitas pela ordem listada), mas tendo a seguinte fórmula: (a) 1,67 partes por volume dos MLV-DPCs (b) 10 partes de SURFAGENE S30 (laureth-3 sulfossuccinato de dissódio), (c) 17,5 partes de GENAPOL AMS (sulfato de TEA-PEG-3 cocamído), e (d) 3 partes de EMPILAN CDE (conteúdo activo DEA cocamido de Albright & Wilson Ltd. a 100%) para obter o Exemplo 23. A Fig. 13 é uma microfotografia ampliada 400X visível à luz do Exemplo 23 depois de 6 dias à temperatura ambiente mostrando o mesmo tipo de resultados da Fig. 12 e confirmando que aquelas vesículas estavam presentes no Exemplo 23.

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OJz-gmplo 24 foi preparado da mesma forma que o Exemplo 22 (adições feitas pela ordem listada), mas tendo a fórmula seguinte^: (a) 1,67 partes por volume de MLV-DPCs tratados , (b) 22,5 partes de SURFAGENE S30 (laureth-3 sulfossuccinato de dissódio), (c) 11,11 partes de laureth-2 sulfato de sódio adicionado como uraa solução de conteúdo activo a 28% e (d) 6,67 partes de REWOTEIN GPT (proteína ani mal TEA-coco-hidrolizada de Rewo Chemische Werke G.m.b.H. a 255 de conteúdo activo) para obter o Exemplo 24. A Fig.

• ,W· é uma microfotografia ampliada 400X à luz visível do Exem í

pio 24 depois de 6 dias à temperatura ambiente mostrando o mesmo tipo de -resultados da Fig. 12. Se bem que a Fig. 14 está algo borrada devido ao tempo de exposição utilizado, is to confirma que aquelas vesículas estavam presentes no Exemplo 24 apesar da presença de um agente tensioactivo aniónico causador de lise.

Exemplo 25

Neste Exemplo comparativo testou-se, o efeito nos

MLV-DPCs de um agente tensioactivo comercial combinado reco, mendado para a utilização em forlumações de um champô suave.

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Na Patent Cooperation Treaty International Publication N².

W0 90/01921 de Wallach publicado em 8 de Março de 1990 (a patente norte-americana n². 4 942 038 publicada em 17 de Julho , 1990 é a origem da aplicação), vesículas lípidas pou co lamelares são utilizadas para encapsular humectantes para adição a champôs ou cremes que devem ser enxaguados. Os Exem pios 2 e 3 de Wallach citam champôs que são baseados numa arte de um agente tensioactivo anfotérico, cocamidopropil hidroxi-sultaina, por 10 partes de um agente tensioactivo comercial combinado da Miranol, Inc. de Dayton, NJ vendido sobre a denominação MS-1 o qual segundo o relatório do fabricante é composto por 19,4% de laureato de PEG-80 sorbitano, 17,2% de trideceth sulfato de sódio (70%), 5,0% de distearato de PEG-150 , 5,2% de cocamidopropil hidroxi-sulta_;i na, 10,6% de lauranfodiacetato, 2,0% de laureth-13 carboxila^ to de sódio, 0,1% de Quaternio 15 e 40,5% de água . 0 trideceth sulfato de sódio é um agente tensioactivo aniónico do tipo conhecido por provocar a lise dos liposomas . Wallach diz que as vesículas pouco lamelares contendo humectantes permanecem estáveis na formulação do champô.

Neste Exemplo , 20 microlitros de MLV-DPCs contendo corante foram adicionados à temperatura ambiente a 2 ml de MS-1 agente tensioactivo combinado. A solução muda instantaneamente; para um amarelo brilhante e a intensidade fluorescente aumenta bruscamente. Isto indicou que os lipos£ mas túnham sofrido o efeito de lise, libertando desse modo o corante encapsulado nos MLV-DPCs. Um exame por microscópio ampliando 400X confirmou que essencialmente nenhum liposoma estava presente.

Exemplo 26

Neste Exemplo , o bom estado da pele conferido pelos liposomas tratados de acordo com o processo da presente invenção e aplicados a uma solução detergente para lavagem facial foi determinado pela utilização um isótopo radioactivo.

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Suspensões aquosas de liposomas foram preparadas misturando 25 miligramas de dipalmitoil fosfatidilcolina e 3 miligramas de colesterol em clorofórmio. Uma pequena quantidade de dipalmitoil fosfatidilcolina e tritiada (Hg) colesterol C14 foram adicionados à solução de clorofórmio an tes que se desse a evaporação da mistura até à secura. Os liposomas são formados por agitação muito cuidadosa de 3ml de uma solução tampão aquosa isotónica TRIS com um pH de 7,4 num balão de vidro contendo a mistura seca. Os liposomas maiores que se formam pela agitação suave foram agitados uti. lizando um agitador de sonda de modo ondulatório durante 15 minutos com um mínimo de arrefecimentp. Era esperado que aqueles SUVs teriam sido produzidos, mas isto pode não ser confirmado devido à radioactividade da suspensão de liposomas e ao pequeno tamanho das vesículas . A suspensão de liposoraas contendo um isótopo radioactivo foi tratada pela adi. ção de 1 ml de SURFAGENE S30 aquoso a 3ml daquela suspensão de liposomas contendo um isótopo radioactivo para obter sus pensão de liposomas A”.

A experiência empregou duas soluções, uma foi a composição de controle a qual foi preparada misturando 1 ml de suspensão de liposomas A com 1 ml da solução tampão à temperatura ambiente.· A outra solução (composição teste) foi preparada misturando , à temperatura ambiente, 1 ml da suspensão de liposomas A com 1 ml de uma solução de agentes tensioactivos tendo a seguinte composição:’(a) 25 partes de SURFAGENE S30, (b) 13,33 partes de REWOTEIN CPK e (c) água desionizada suficiente para obter 100 partes em volume da solução de agentes tensioactivos.

Um mililitro de composição controle foi aplicada a 30 centímetros quadrados de pele de cadáver humano s esfregada durante 1 minuto. Um mililitro de composição tes te foi aplicada a diferentes secções de 30 centímetros quadrados de pele de cadáver humano e esfregada durante 1 minuto . A solução foi removida de cada secção de pele e círcu37

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Mod. 71 * 20.000 ·*. · 90/06 los de 25 milímetros (mm) de diâmetro de pele por punção a períodos de tempo de 6, 16 e 32 minutos da aplicação da composição à pele. Cada círculo de 25 mm foi. enxaguado por 15 segundos em três lavagens com água consecutivas (i.e., o tempo de lavagem total foi de 45 segundos). Uma punção de 6 mm de diâmetro foi removida e o restante foi dissolvido em 1 ml de SOLUENE 350 (uma solução alcalina para dissolução de tecidos da Packard Instrument Company of Dovners Grove,

IL a 60°C. A radioactividade do tecido dissolvido foi medida num contador de cintilação utilizando INSTA-GEL de Packard como o càntilador e ácido acético para controlar a quimiluminescência da amostra. Dados das punções de 6 mm (apontadas para a determinação da penetração das suspensões de liposomas) foram considerados inconclusivos devido a difi culdades no manuseamento das biopsias.

Os seguintes dados foram obtidos através do contador de cintilações nas soluções obtidas dos círculos de pele de 25 mm:

Composição	Tempo	Tritio	Carbono 14	H3/C14
·· ·	(min.)	(dpm/%1)	(dpm/%1)
Controle	0	4644600	•3416100	1,36
Controle	6	20777/2,81%	16094/2,95%	1,29
Controle	16	27424/3,70%	21396/3,93%	1,28
Controle	32	7660/1,03%	15125/2,78%	0,51
Teste	0 .	4259500	3141500	1,36
Teste	6	10358/1,53%	7846/1,57%	1,32
Teste	16	11278/1,66%	9012/1,80%	1,25
Teste	32	29445/4,34%	23663/4,72%	1,24
1. A primeira entrada	é desintegrações por minuto	(dpm) e
a segunda	entrada é a	percentagem	de dpm relativa	à dpm para
tempo = 0	minutos.
	Baseado	na admissão	de que aqueles	liposomas

estavam presentes em cada composição , os dados acima mos63.848

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tram que houve um aumento na quantidade de radioactividade a qual adere à pele à medida que o tempo passa. A grande variação no rácio H3/C14 para o ponto dos 32 minutos para a composição de controle indica uma quebra da estrutura dos 1± posomas , o rácio permaneceria rélativaménté constante se o dipalmitoil fosfatidilcolina tritiado (H3) colesterol G14 permaneçam associados uns com os outros, i.e., os liposomas permaneçam estáveis. 0 rácio H3./C14 para a composição teste permaneceu essencialmente constante e isso é a evidência de que os liposomas passaram para a pele apesar daquela composição teste conter agentes tensioactivos e ter sido enxaguada.

Exemplo 27

Neste Exemplo , a formulação do champô do Exemplo 15 da patente norte-americana n^a. 3 957 971 de Oleniacz foi preparada para determinar se os liposomas estavam presen tes no champô. Oleniacz descreve um humectante carregado con tido no liposoma de um champô contendo um agente tensioactivo óxido de amina em adição a um agente tensioactivo aniónico conhecido por provocar a lise dos liposomas, lauril sulfa to de trietanolamónio. 0 Exemplo 15 de Oleniacz diz que (t)he shampoo is prepared by merely mixing the four components together at room temperature, maintaining the pH between 5 and 6, until the solid csoraponents· have dissolved . Assim, aoccontrário da presente invenção, Oleniacz não reconhece que pode haver uma ordem crítica de mistura se alguém pretender estabilizara os liposomas com um agente tensioactivo , Oleniacz reconhece que certos agentes tensioactivos podem servir para estabilizar as suspensões de liposomas da forma descoberta por nós.

Os liposomas foram preparados de acordo com os ensinamentos do Exemplo 1 de Oleniacz na sua patente de uma mistura de ovo, lecitina, fosfato de dicetilo e colesterol num rácio molar de 7:2:2 a qual foi dissolvida em clorofórmio e numa quantidade mínima de metanol . Os componentes da

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Mod. 71 - 20,000 ·χ. - 90/08 membrana foram secos e reduzidos a uma fina película. Os liposomas foram formados pela hidratação da película com uma solução aquosa de peso molar 0,135 piroglutamato de sódio e 5(6)-carboxifluorescina aquosa de peso molar 0,01 para obter uma concentração de aditivos de peso molar 0,145. 0 que agora foi exposto para apoiar a demonstração da existência e in tegridade de quaisquer liposomas presentes pelos processos descritos acima. Depois da preparação, a suspensão de liposomas foi deixada num refrigerador a 5°C, durante a noite.

pH da suspensão de liposomas resultante foi cerca de 7,0 e nenhuma tentativa foi feita para ajustar a níveis entre

5-6 porque para baixos valores de pH, os liposomas são menos estáveis e o corante é menos solúvel.

No dia seguinte, a suspensão de liposoma foi colocada numa membrana de diálise por 5 horas era que os 800 ml de uma solução aquosa de cloreto de sódio de peso molar 0,145 circundante foi mudada 4 vezes . Este procedimento foi necessário para remover o corante mesmo que o Exemplo 15 de Oleniacz diz que nenhuma diálise da suspensão de liposomas foi utilizada . Ao fim deste tempo, o corante não atraído não tinha sido suficientemente removido, mas o procedimento de diálise foi terminado para seguir o exemplo 1 de Oleniacz enquanto se continuava removendo o mais possível do corante do ãàdo externo aquoso. A suspensão de liposomas continha 0,0602 gramas de componentes sólidos do amterial liposomático em 50 ml de solução- aquosa de piroglutamato de sódio (0,12% peso/volume).

processo microscópico esnecíf içado por Oleniacz é o da polarização cruzada, de luz. Com este processo, os liDosomas são claramente observados na suspensão removida do recipiente de diálise com uma ampliação de 400X. A polarização com cruzamento de luz apenas mostra objectos com estrutu ras moleculares ordenadas, tal como a estrutura em camadas das membranas liposomáticas . Os liposomas aparecem como bri lhantes pontos redondos contra o fundo negro. Como forma de controle, as microfotografias ampliadas 400X das formulações _ /,n _

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descritas acima foram tiradas antes que a suspensão de liposomas seja adicionada a outros tipos de estruturas moleculares comummente encontradas em emulsões que podem facilmente parecer idênticas aos liposomas.

Sesde que Oleniacz não especificou qualquer ojr dem particular de adição, duas formulações foram preparadas utilizando diferentes ordens de adição. A primeira ordem ds adição (champô 1) dos ingredientes foi a ordem listada no Exemplo 15: 20% de SIPON LT-6 (40% de lauril sulfato de tri£ tanolamónio de Alcolac. Ltd. do Quebec, Canadá); 20% de 95% de etanol; 5% de AROMOX C/12 (50% de óxido de bis(2-hidroxi£ til cocamina de Akzo, Chemical Dívision de Chicago, IL); e 55% de suspensão aquosa de liposomas preparada como referido acima. 0 (champô 2) foi preparado pela adição de SIPON LT-6 ao AROMOX C/12 e separadamente adicionado o etanol à suspensão de liposomas . Os agentes tensioactivos foram então adicionados à suspensão de etanol/liposomas.

Uma composição detergente (detergente 1”) da presente invenção foi preparada pela adição de 45% de uma solução aquosa contendo 25% de SURFAGENE S30 e 13,33% de REWOTEIN CPK a 55% da suspensão de liposomas preparada acima

Os resultados do acima referido examinados microscopicamente com uma ampliação de 400X através da polarização com luz visível foram as estruturas que aparentaram ser liposomas abundantes e claramente visíveis em ambas as suspensões de liposomas e no detergente 1. 0 exame de Champôs 1 e 2 mostraram alguns pontos extremamente brilhantes em cada formulação que podem ou não ter sido liposomas, mas o número de pontos brilhantes em cada foi muito inferior ao visto na suspensão de liposomas e no detergente 1. Um exame microíotográfico da suspensão de liposomas depois da adição do etanol, mas sem outros agentes tensioactivos, mostrou a presença de pontos brilhantes muito pequenos os quais podem ter representado materiais cristalinos. Os componentes da so lução aquosa dos champôs 1 e 2 assim como os do detergente 1 foram examinados como controle antes da adição da suspen- 41

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80/06 - n· ΟΟΟ’Οδ · (Z 'poW são de liposomas. Nenhuns pontos brilhantes do tipo visto na suspensão de liposomas foram observados. 0 controle foi necessário porque os materiais cristalinos líquidos podem aparecer como pontos brilhantes na polarização por cruzamento de luz e emulsões não contendo liposomas podem também conter tais materiais os quais podem induzir em erro quanto à presença de liposomas.

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕESl⁵. - Processo para a estabilização de liposomas suspensos numa composição aquosa contra o efeito da lise de agentes tensioactivos aniónicos caracterizado por se adicionar entre 0,1% a 40% em peso com base no peso total da composição de pelo menos um agente tensioactivo seleccionado de entre o grupo que consiste em sulfossuccinato alquílicos gordos em que o grupo alquílico gordo contém entre 8 a 22 átomos de carbono, sulfatos de acilamino poliglicol-éter gordos em que o grupo acilo gordo contém entre 8 a 22 átomos de carbono, óxidos de alquil amina gordos em que o grupo alquílico gordo contém entre 7 a 26 átomos de carbono, ésteres de fosfatos alquílicos gordos em que o grupo alquílico gordo contém entre 8 a 22 átomos de carbono e sais de N-acil amino ácidos oxi sais de derivados de N-aril de proteínas hidrolisa das possuindo até cerca de 2500 daltons de peso molecular médio em que a porção acilo é derivada de um ácido carboxílico possuindo entre 8 a 22 átomos de carbono por molécula até se obter uma composição aquosa contendo entre cerca de 0,1% a 50% em volume de liposomas com base no volume da composição total, sendo a quantidade do agente tensioactivo presente a necessária para estabilizar os liposomas contra os efeitos de agentes tensioactivos aniónicos que provocam a lise .

   j

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2. 2§. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agente tensioactivo ser pelo menos um agente tensioactivo seleccionado do grupo que consiste em:

   (a) R¹(OCH₀CH₉) OC(O)CH(SO_qX)CH₉C(O)OX;

   (b) S (OCH₂CH₂)_aC(0)GH(SO₃X)CH₂G(0)0R ;

   (c) R¹C(O)NH(CH₂)_bOG(O)GH(SO₃X)CH₂C(O)OX;

   (d) R¹NHC(0)CH(S0₃X)CH₂C(0)0xX;

   (e) R³C(0)NH(CELCH₉0) SO-,Χ;

   Λ t í íi Li C ú (f) R R R N->0;

   CH₂ CRr

   R' (?) 0

   N ->0;

   ch₂ CH

   Mod. 71 - 20.000 «χ.

   ,4«4, (h) R^JC(0)NH(CH₂)_dVRⁿN->0;

   (i) (R¹(0CH₂GH₂)_a0)_QP(0) (OZ) (0H)₂__e; a (j) . sais de N-acil aminoácidos ou sais de derivados de

   N-acil de proteínas hidrolisadas possuindo até cer ca de 2500 daltons de peso molecular médio em que a porção acilo é derivada de um ácido carboxílico possuindo entre 8 a 22 átomos de carbono por. molécula em que R^* é um grupo alquilo possuindo entre 8 a 22 átomos 2 , de carbono, R e um grupo alquilo possuindo entre 4 a 16 átomos de carbono, R é um grupo alquilo possuindo entre 8 a 18 átomos de carbono, R⁴ é um grupo alquilo possuindo entre 1 a 4 átomos de carbono ou -C^H^OH, R^ 4 _Um grupo alqu; lo possuindo entre 7 a 26 átomos de carbono, X é um anião,

   Z é -H ou X, a tem um valor compreendido entre 0 3 8, b tem um valor compreendido entre 1 e 4, c tem um valor compreendi do entre 1 e 6 , d tem um valor compreendido entre 1 e 5, e tem um valor médio compreendido entre 1 e 2 e f tem um valor de 2 ou 3.

   63.848

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   J-

   Mod. 71 - 20.000 «x. 20
3. 3⁹. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os liposomas serem constituídos por, pe. lo manos, um fosfolípido ou um composto anfifílico não iónico,
4. 4⁹. - Processo para a preparação de uma compo sição detergente contendo liposomas e agentes tensioactivos aniónicos que provocam a lise de liposomas caracterizado por se adicionar ^!à suspensão aquosa de liposomas estabilizados preparada de acordo com a reivindicação 1, entre cerca de 0,1 a 35% em peso da composição detergente total de, pelo menos, um agente tensioactivo aniónico conhecido por provoca: a lise dos liposomas.
5. 5^ã. - Processo de acordo com a reivindicação

   4, caracterizado por o agente tensioactivo adicionado ser £ seleccionado de entre os de fórmula geral R (0CH₉CH₉) Q em 6 z z z g que R é seleccionado do grupo que consiste em grupos alquílicos possuindo entre 8 a 18 átomos de carbono, grupos fenilos e aralquilos possuindo entre 6 a 24 átomos de carbono, g tem um valor médio compreendido entre 0 a 10 e Q é seleccionado de entre -C(O)OZ, -OSO^Z e -SO^Z .
6. 6^S. - Processo de acordo com as reivindicações 4 e 5 caracterizado por o agente tensioactivo utilizado se encontrar numa quantidade compreendida entre 5% a 15% em peso.