PT96636A - Metodo e sistema de electrodo sensor para a determinacao electroquimica de um analito ou de uma oxidoreductase, bem como o processo para a preparacao de compostos apropriados para o efeito - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de invenção de BOEHRINGER MANNHEIM GMBH, alemã, industrial e comercial, com sede em 6800 Mannheim 31, República Federal Alemã, (inventores:

Dr. Joachim Hones e Dr. Jiirgen Schàffler, residentes na Republica Federal Alemã), para "MÉTODO E SISTEMA DE ELECTBODO SENSOR PARA A DETERMINAÇÃO ELECTROQUÍMICA DE UM ANALITO OU DE UMA OXIDOREDUCTASE".

Descrição

A invenção refere-se a um processo para a determinação electroquímica de um analito, na presença de uma oxiL doreductase e de uma substancia susceptível de redução que transfere electrões que provêm durante o curso da reacção de de terminação da oxidoreductase sobre um electrodo e, deste modo, conduzem a um sinal que é uma medida para o analito a ser deter minado, no qual a substância susceptível de redução é reduzida enzirnaticamente e é oxidada no electrodo, ou a um processo correspondente para a determinação electroquímica de uma oxidoreductase na presença de um substrato enzimático e de uma substân cia susceptível de redução, como foi caracterizada acima.

Adicionalmente a invenção refere-se a um sistema de electrodo sensor para a determinação electroquímica de um analito numa amostra contendo pelo menos dois agentes ele-ctricamente condutores, cada um dos quais está presente isolado . do outro e que podem ser postos em contacto eléctrico com a a- 1 <5 '·ΐ>

J mostra a ser examinada por meio de uma superfície electricamen-te condutora na qual pelo menos uma das superlféies electricamen te condutora contacta uma oxidoreductase e uma substância sus-ceptível de redução que é capaz de transferir electrôes entre a oxidoreductase e a superfície electricamente condutora, ou um correspondente sistema de eléctrodos sensor para a determinação de uma oxidoreductase na qual pelo menos uma das superfícies e-lectricamente condutoras contacta um substrato de oxidoreductase e uma substância susceptível de redução, como foi caracteri zada anteriormente.

Finalmente, a invenção refere-se à utiliza ção de certos compostos transportadores de electrões entre uma oxidureductase e um electrodo num sistema electroquímico.

Comparado com os métodos colorimétricos para a determinação de um analito num líquido no qual a avaliação se faz visualmente ou fotometricamente, uma correspondente determinação electroquímica oferece a vantagem de a reacção e-lectroquímica produzir corrente directamente, que pode ser con vertida numa concentração. Em contraste, o trajecto nos métodos colorimétricos é indirecto, através de uma fonte de corrente— corrente--?*· luz—> luz residual (remissão ou trans-

TrnssSb )—> corrente—> vãlor médido;

Para os métodos electroquímicos de determinação é necessário oxidar o analito a ser determinado ou con-vert-lo numa substância que possa ser oxidada por meio de métodos químicos ou enzimáticos. A oxidação electroquímica directa de um analito ou de uma substância derivada do mesmo na superfície de um electrodo exige elevadas sobrevoltagens, isto é, potenciais. Este método é muito pouco selectivo. Muitas outras substâncias que também estão presentes na amostra a examinar são igualmente oxidadas neste processo. Um tal método por conseguinte dificilmente poderá ser usado analiticamente.

Deste modo o analito oxidável ou a substância oxidável derivado do analito é habitualmente levado a reagir com um correspondente oxidorreductase e uma substânda * reductxvel cuja forma reduzida pode ser reoxidada sobre o elé- 2 -1

trodo. Neste caso o analito oxidável ou a substância oxidável derivada do analito é oxidada selectivamente pelo enzima. 0 enzima reduzido deste modo é oxidado pela substância reductível que está presentb e a substância reductível reduzida é oxidada sobre o eléctrodo. A substância reductível serve pois como um veículo de electrões desde o enzima para o eléctrodo. É por conseguinte um requisito prévio que a substância reductivel seja escolhida de modo tal que seja convertida rápida e especifi-camente pelo enzima e pelo eléctrodo.

Em "Theory and application of enzyme elec trodes in analytical and clinicai chemistry", Publisher Wiley, Nova Iorque (1980) págs. 197-310, P.W. Carr et al descrevem a reacção de glucose com oxigénio como a substância reductível catalisada enzimaticamente por glucose-oxidade, e a detecção do peróxido de hidrogénio formado no eléctrodo. Os inconvenientes deste método são as reacções secundárias do peróxido de hidrogénio que é ele próprio um forte agente oxidante e as re-aoções secundárias na superfície do eléctrodo como resultado do elevado potencial positivo utilizado. Este método requer pois uma separação prévia especial para excluir componentes interferentes na amostra a examinar. Um outro inconveniente é a exigência de oxigénio. A difusão de oxigénio do ar paraa a amostra e dentro da amostra torna-se o factor determinante da velocidade de reacção, especialmente para altas concentrações de glucose e pode pois, e3m certas circunstâncias, falsificar os resultados do método.

Um sistema de eléctrodo sensor para ad determinação de um componente de uma mistura de substâncias é descrito na Especificação EP-A-0 125 137, o qual tem pelo menos dois agentes electricamente condutores que estão, cada um presentes isoladamente um do outro e que podem ser psotos em contacto eléctrico com a amostra a ser examinada por meio de uma superffçie electricamente condutora por meio da qual uma das superfícies electricamente condutoras contacta uma oxido-reductase e um chamado "composto mediador" que transfere elec-trões entre este enzima e a superfície electricamente conduto • ra. É usada uma substância organometálica como composto media- = 3 =

dor, a qual tem pelo menos dois anéis orgânicos, cada um dos quais tem pelo menos duas duplas ligações conjugadas e emq que um átomo metálico partilha os seus electrões com cada um destes aneis. Utilizam-se ferroceno ou derivados de ferroceno, tal como na especificação EP-A-0 078 636 como os compostos mediadores preferidos. A este respeito deverá ter-se em consideração que estes compostos têm primeiramente que ser oxidados,por exemplo a um ião ferrocínio, antes de estarem aptos a aceitar electrões da oxidoreductase. Isto conduz à chamada "correntes de partida" que ocorrem mesmo na ausência de um analito que interfere evidentemente com um método amperométrico no qual a cor rente resultante é uma medida da quantidade do analito a determinar. Adicionalmente a limitada solubilidade destes compostos organometálicos é desvantajosa, uma vez que conduz a uma preferência de oxigénio, por exemplo quando são utilizadas oxi-dases tais como glucose-oxidase como a oxidoreductase, e isto conduz por conseguinte a uma corrente que é apenas limitada a uma dependência de oxigénio, especialmente para baixas concentrações de substrato enzimático. Quando se utilizam estes veículos de electrões numa forma reduzida, uma solubilidade limitada e/ou a utilização de baixas concentrações tornam-se necessárias, a fim de se obterem correntes de partida que sejam a-ceitáveis.

Os transportadores de electrões para métodos electroquímicos de determinação, que são bem conhecidos actualmente, caracterizam-se em geral pelo facto de serem reduzidos na presença do analito a ser determinado por uma oxidoreductase e são reoxidados ao composto inicial do eléctrodo. Se a concentração da substância reductível que funciona como transportador de electrões for substancialmente menor do que a concentração do analito a ser determinado, então só se podem realizar métodos cinéticos. Para a determinação do ponto final é necessário que a substância reductível que funciona como transportador de electrões esteja presente dissolvida em exces so, comparada com o analito a ser determinado, a fim de que o analito a ser determinado seja reajido completamente. Neste t • processo uma quantidade de substância reductíveml é submetida = 4 =

a reacção, sendo essa quantidade proporcional ao analito a- ser determinado. As vantagens sobre a medição cinética são, em particular, a extensa gama de linearidade da relação corrente/concentração em métodos amperométricos e a competitividade melhora da da substância reductível mais altamente concentrada, em com paraçãocom o oxigénio, quando se usam oxidases como oxidoreduc-tases. Todavia, um dos inconvenientes é o facto de para uma reacção completa, ser necessário utilizar uma substância reductível, isto é, um agente oxidante, como transportador de ele-ctrões, com um potencial que é substancialmente mais alto do que o do substracto enzimático e que, na determinação electro-química, é necessário adicionalmente utilizar um excesso de a-gente oxidante que aumenta ainda mais o potencial necessário. Contudo, os altos potenciais de trabalho favorecem reacções não específicas no electmdo, em particular quando têm que ser ensaiadas amostras que contêm uma pluralidade de componentes,para além do analito a ser determinado. A este respeito não há ainda soluções satisfatórias para a determinação electroquímica de um analito através de uma reacção redox enzimática. Há uma falta de sub£ tâncias reductíveis que funcionem como transportadores dee e-lectrões e que possam ser aplicadas universalmente, que reajam rapidamente com oxidoreductases e que exibam uma reacção não inibida nas superfícies do electrodo a baixos potenciais. 0 objecto da presente invenção foi resolver este problema. Em particular deveriam encontrar-se substâncias reductíveis que pudessem funcionar como transportadores de electrões entre uma oxidoreductase e um electrodo num sistema electroquimico. Este objectivo é alcançado pela invenção ca-racterizada nas reivindicações de patente. A invenção revela um método para a determinação electroquímica de um analito na presença de uma oxidoreductase e de uma substância reductível que transfere elec-trões que, durante o curso de reacção, são provenientes da oxidoreductase para um eléctrodo e deste modo conduzem a um sinal 5

que é medida para o analito a ser determinado, sendo a substância reduetível reduzida enzimaticamente e oxidada sobre o elé_ trodo, o qual é caracterizado pelo facto de a substância que se forma junto ao electrodo por oxidação ser diferente da substân cia reduetível usada inicialmente. A invenção revela também um método para a determinação electroquímica de uma oxidoreductase na presença de um correspondente substrato e de uma substância reduetível que seja capaz de transferir electrões da oxidoreductase para o electrodo e deste modo produza um sinal que é uma medida para o enzima a ser determinado, sendo deste modo a substância reduetível reduzida enzimaticamente e oxidada junto ao electrodo, que se caracteriza pelo facto de a substância que se formapor oxidação junto ao electrodo ser diferente da substância reduc-tível usada inicialmente.

Adicionalmente a invenção revela a utilização de uma substância que pode aceitar electrões de uma oxidoreductase com formação de uma amina aromática rica em electrões , como um transportador de electrões entre uma oxidoreductase e um electrodo num sistema electroquímico. A invenção revela, também um sistema de e-lectrodos sensor para a determinação de um analito numa amostra líquida contendo pelo menos dois agentes electricamente condutores que estão presentes isolados um do outro e que podem ser postos em contacto eléctrico com a amostra a ser examinada por meio de uma superfeie electricamente condutora, no qual pelo menos uma das superfícies electricamente condutoras contacta uma oxidoreductase e uma substância reduetível que seja capaz de transferir electrões entrre a oxidoreductase e a superfície electricamentB condutora, o qual é caracterizado pelo facto de se utilizar como substância reduetível um composto que, após redução pela oxidoreductase, é oxidada junto à superfície electricamente condutora a uma substância que é diferente da..sibs^ tância reduetível usada inicialmente.

Para alem disso, a invenção revela um sis • tema de electrodo sensor para a determinação electroquímica de = 6 =

uma oxidoreductase numa amostra líquida contendo pelo menos dois agentes electricamentre condutores que estão presentes isolados um do outro e que podem ser postos em contacto eléctrico, cada um, com a amostra a ser examinada por meio de uma superfície electricamente condutora em que pelo menos uma das superfícies condutoras contacta um substrato de oxidoredeuctase e uma subse tância reductível que é capaz de transferir electrões entre a oxidoreductase e a superfície electricamente condutora, o qual é caracrterizado pelo facto de se utilizar como substância reductível um composto que, após redução pela oxidoreductase, é oxidado junto à superfície electricamente condutora a uma sub£ tância que é diferente da substância reductível usada inicialmente .

Finalmente,a invenção revela a utilização de uma substância que pode aceitar electrêfes de uma oxidoreductase com formação de uma amina aromática rica em electrões, para a produção de um sistema de electrodo sensor de acordo com a presente invenção.

Ifcrnou-se evidente que as desvantegens dos métodos conhecidos da téraica para a determinação electroquímica de um analito na presença de uma oxidoreductase e de uma substância reductível, que são causadas pelo elevado potencial que é necessário, em particular, quando se utiliza um excesso da substância reductível que funciona como o transportador de elec-trões ao analito a ser determinado, podem ser na sua maioria evitadas por uma reacção não reversível, Uma vez que se forma uma substância oxidante junto ao electrodo e que é diferente da que é usada inicialmente como substância reductível, a determinação electroquímica pode ser realizada com um potencial relativamente baixo e, deste modo, sem o risco de reacções de inrederências . A vantagem deste baixo potencial pode pois ser também utilizada quando a substância reductível, que funciona como o transportador de electrCes, é usada apenas numa pequena quantidade, em comparação com o analito a ser determinado, nomeadamente quando a substância reductível usada inicialmente assim como a substância formada por oxidação junto aos eléctro-, dos, são reduzidos pela oxidoreductase que é necessário para o = 7 = métoodo electroquímico. Se a substância reductível usada inicialmente, bem como a substância formada por oxidação junto ao electrodo, forem reduzidas pela oxidoreductase à mesma substância então a substância reductível usada inicialmente actuac co mo uma forma de armazenagem para a 2â substância reductívelque é reciclada entre oelectrodo e o enzima e que é diferente da substância reductível usada inicialmente.

As vantegens do método de acordo com a presente invenção são uma consequência do facto de poderem ser se-leccionados como substâncias reductíveis a partir das quais se forma um composto por redução enzimática, o qual pode ser oxidado a baixa tensão junto ao electrodo. Durante a oxidação no e-lectrodo há apenas ainda uma concentração negligível desta substância recem-oxidada presente. Até ao presente o composto reduzido enzimaticamente tinha que ser oxidado junto ao elétrodo, em retorno à substância reductível usada inicialmente, que já estava presente numa elevada concentração. Era necessário para este efeito um potencial positivo aumentado.

Os compostos que podem ser utilizados vantajosamente como substâncias reductíveis no âmbito da invenção são aqueles que durante a oxidação de um substrato apropriado para a oxidorreductase usada, captam electrões provenientes do enzima e formam uma amina aromática rica em electrões no processo.A este propósito entende-se por uma amina aromática rica em ele-ctróes um composto que é mais rico em electrês do que a anilna e que, devido à sua riqueza em electrões, pode ser oxidado no eléctrodo a um potencial baixo . Por exemplo, todos os derivados de anilina que transportam um ou mais substituintes +1 e/ou +M interessam, tais como resíduos hidroxi, alquilo, alcoxi ariloxi, alquiltio, ariltio , amino, monoalquilamino e dialquil-amino no anel aromático ou np azoto de anilina.

Os resíduos alquilo, alcoxi, alquiltio, monoalquilamino e dialquilamino são resíduos nos quais alquilo representa um radical de hidrocarboneto com 1 a 6 átomos de car bono, o qual pode estar ele próprio substituído por um grupo hidroxi , por um grupo amino que está substituído, se desejado, uma = 8 =

au várias vezes por alquilo com 1 a 6 átomos de carbono, P03H23 SO^H ou C02H. Os resíduos ácidos PO^, SOgH e C02H podem estar presentes tal qual ou na forma de um sal, como por exemplo um sal de amónio, alcalino ou alcalinoterroso.

Os resíduos ariloxi e ariltio são resíduos aromáticos com 6 a 10 átomos de carbono, dos quais são particularmente preferidos os resíduos fenoxi e' feniltio.

Os sais de amónio são aqueles que contem o ião amónio ΝΗ^+ ou aqueles que contêm catiões amónio que estão substituídos uma ou várias vezes por alquilo,arilo ou aralquilo. Alquilo nos radicais alquilo e aralquilo significa um radical de hidrocarboneto com 1 a 6 átomos de carbono. Ari^ lo nos radicais arilo e aralquilo significa um anel aromático tendo 6 a 10 átomos de carbono, no qual é preferível fenilo.

Um rãdical aralquilo preferido ó benzilo.

Os sais alcalinos são de preferência os sais de lítio, de sódio ou de potássio. Os sais alcalino-terrosos são de preferência os de magnésio ou cálcio.

Os derivados de anilina também abrangem compostos que transportam um grupo amino não substituído ou um grupo amino substituído uma ou várias vezes por substituintes +1 e/ou +M, tais como por exemplo alquilo, num sistema de a-nel aromático que está condensado com um ou vários anéis aromá ticos e/ou alicíclicos. A este respeito interessam como anéis aromáticos sistemas hidrocarboneto-aromáticos, bem como hetero-aromáticos. Os exemplos são aneis benzeno ou naftaleno condensados, ou um anel piridina condensado.

Os anéis alicíclicos compreendem cicloali-fáticos saturados ou insaturados com 5 a 7 átomos de carbono, de preferência 5 ou 8 átomos de carbono.

Os possíveis substituintes alquilo do grupo amino podem ser radicais de hidrocarboneto com 1 a 6 á-tomos de carbono que podem eles próprios estar substituídos por um grupo hidroxi, um grupo amino substituído, se desejado, uma ou váriasvezes por alquilo com 1 a 6 átomos de carbono = 9 =

P0^H2, s°3H e c02H* 0s radicais ácidos P0^H2, SO^H e C02H podem estar presentes tal qual ou também na forma de sal, tal como um sal de amónio, alcalino ou alcalinoterroso, para os quais se apolica também a definição dada acima.

Os exemplos de substituintes +1 e/ou +M dados anteriormente não devem ser considerados completos. Os especialistas na técnica saberão se um determinado substituin-te é um substituinte +1 e/ou +M e todos estes substituintes deverão ser considerados como possíveis substituintes nas ami-nas aromáticas ricas em electrões como sendo úteis de acordo com a presente invenção.

São particularmente preferidos como substâncias reductíveis que, quando captam electrões da oxidoreduc-tase, conduzem a uma amina aromática rica em elecrtões, que pode depois ser oxidada junto ao eléctrodo a um potencial baixo os compostos do grupo de compostos com a seguinte fórmula geral I X - R (I) na qual R representa um radical aromático rico em electrões e

X representa NO ou NHOH, e compostos com a seguinte fórmula geral II HO - N = ϊ (II) na qual Y representa um sistema quinoide que, após redução, pode-se tornar rico em electrões no estado aromático. A este respeito entende-se como radical aromático trico em electrões os radicais de alternativa enumerados acima para aminas aromáticas ricas em electrões.

Estas substâncias reductíveis de acordo com a presente invenção são reduzidas a aminas aromáticas quando aceitam electrões das oxidoreductases não são oxidados às substâncias reductíveis iniciais por oxidação no eléctrodo. 10

Como é bem conhecidos dos especialistas, os electrões são removidos do radical arilo durante a oxidação electroquímica de ami nas aromáticas ricas em electrões, resultando em radicais de sistemas quinoides. Todavia, não se formam oximas quinoides hidroxilaminas e compostos nitroso.

Os compostos oxidados electroquimieamente podem com frequência eles próprios aceitar de novo electrões das oxidoreductases e são por esta via reduzidos de regresso às aminas aromáticas ricas em electrões. É possível por isso, utilizar também substâncias reductíveis de acordo com a presente invenção numa concentração baixa, quando comparada com o analito a ser determinado. Deste modo actuam como uma forma de armazenagem para as aminas aromáticas ricas em electrões que se formam quando os electrões são capturados das oxidoreductases e podem ser reciclados como transportadores de electrões entre a oxidoreductase e o elêctrodo.

Provaram ser e&eelentes exemplos de transportadores de electrões de acordo com a presente invenção as substâncias N-(2-hidroxietil)-N’-p-nitrosofenil-piperazina, N,N-bis(2-hidroxietil)-p-nitrosoalina, o-metoxi[N,N-bis-(2-hidroxietil)]-p-nitrosoanilina, p-hideroxinitrosobenzeno, N-metil-N* *-(4-nitrosofenil)-piperazina, p-quinona dioxima, N,N-dimetil-p-nitrosoanilina, N ,N-dietil-p-nitrosoanilina, N-(4-nitrosofenil)-morfolina, N-benzil-N-(5'-carboxipentil)-p-nitrosoanilina, N,N-dimetil-4-nitroso-1-nafilamina, N,N,3-trimetil-4-nitrosoanilina, N-(2-hidroxietil)-5-nitrosoindolina, 11 Ν-(2-hidroxietil)-5-nitrosoindolina, Ν,N-bis-(2-hidroxietil)-3-cloro-4-nitrosoanilina, 2,4-dimetoxi-nitrosobenzeno, N,N-bis-(2-metioxietil)-4-nitrosoanilina, 3-metoxi-4-nitrosofenil, N-(2-hidroxietil)-6-nitroso-1,2,3,4-tetrahidroquinolina, N,N-dimetil-3-cloro-4-nitrosoanilina, N,N-bis(2-hidroxietil)-3-fluor-4-nitrosoanilina, N,N-bis-(2-hidroxietil)-3-metiltio-4-nitrosoanilina, N-(2-hidroxietil)-N-(2-(2-metoxietoxi)-etil)-4-nitrosoanilina, N-(2-hidrosxietil)-N-(3-metoxi-2-hidroxi-1-propil)-4--nitrosoanilina, N-(2-hidroxietil)-N-(3-(2-hidroxietoxi)-2-hidroxi-1-propil) -4-nitrosoanilina, N-(2-hidroxietil)-N-(2-(2-hidroxietoxi)-etil)-4-nitrosoani-lina.

Uma substância reductível particularmente preferida de acordo com a invenção é Ν,Ν-bis-(2-hidroxietil)--p-nitrosoanilina. É particularmente preferida a N-(2-hidroxi1 etil)-N-(2-(2-hidroxietoxi)-etil)-4-nitrosoanilina.

Muitos compostos de fórmula geral I podem

ser utilizados de acordo com a invenção e são bem conhecidos. São contudo novos os derivados de nitrosoanilina de fórmula geral III

na qual Ί R representa hidrogénio, alcoxi ou alquiltio, 12 (III)

R representa um radical alquilo e representa um radical hidroxialquilo ou R2 e e R são iguais ou diferentes e cada um representa um radical dialquilaminoalquilo, um radical hidroxialquilo ou alcoxialquilo substituídos, se desejado, por OH na parte alquilo, ou um radical polialcoxialquilo que está substituído , se desejado, por um resíduo hidroxi na parte alquilo, ou 3 R formam um radical alquileno interrompido por enxofre ou azoto, no qual o azoto está substituído por um radical alquilo, hidroxialquilo, hidroxialcoxialquilo, alcoxihidroxi-alquilo, dioxanilil-alquilo ou polialcoxialquilo, cada um dos quais está, ele prpprio, substituído, se desejado, na parte alquilo por um radical hidroxi ou 1 2 3 2 se R estiver na posição orto relativamente a NR R , R em 1 conjunto com R também representa um radical alquileno no qual 3 R representa então um radical hidroxialquilo ou, se o radical alquileno contiver 3 átomos de carbono, também pode represen- 1 tar se desejado, um radical alquilo, ou se R não representar 2 3 hidrogénio, R e R são iguais ou diferentes e cada um representa um radical hidroxialquilo, ou um sal deste derivado. A este propósito hidrogénio significa fluor, cloro, bromo ou iodo. São particularmente preferidos fluor e cloro.

Alquilo, alcoxi ou alquiltio são radicais com 1 a 6 átomos de carbono, sendo particularmente preferidos os que possuem 1 a 3 átomos de carbono.

As definições anteriores para alquilo tam bém se aplicam à parte alquilo de radicais hidroxialquilo, dialquilaminoalquilo,hidroxialcoxi-alquilo, alcoxialquilo, polialcoxialquilo, alcoxi-hidroxialquilo e dioxanilil-alquilo.

Um radical dioxanilil-alquilo é um radical no qual um sistema de anel dioxano está ligado a um radical alquilo. É de preferência um sistema de anel 1,4-dioxano, • isto é, 13 =

-Alquil

"Um radical polialcoxialquilo é um radical a-i'qúil(alcoxi)n-alcoxi no qual n_ é 1a 10. É preferível que n tenha um valor compreendido entre 1 e 4. É particularmente preferido que n esteja situado no intervalo 1 a 3· Um radinal alquileno é uma cadeia de hidrocarboneto, linear ou ramificada- de preferência linear - saturada ou insaturada - de preferência saturada - consistindo em 2 a 5 e de preferência 2 a4 átomos de carbono, com dois pontos de ligação livres. D^thcn 2 3 do significado de um radical alquileno de R e R que:, está interrompido por enxofre ou azoto, é preferido um radical tio-morfolino ou piperazino, formado pela inclusão do átomo de azoto na fórmula geral III. 0 radical piperazino é particularmente preferido.

Dentro do significado de um radical al- 1 2 quileno formado por R e R é preferido o radical indolino ou 1,2,3,4-tetrahidroquinolino formado pela inclusão do anel aromático da fórmula geral III.

Como sal de um derivado de nitrosoani-lina de acordo com a presente invenção, de fórmula geral III, são preferidos os dos compostos ácidos fortes, em particular ácidos minerais tais como ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido azótico e ácido fosfórico. Os cloridratos são particular mente preferidos, sendo sais de ácido clorídrico.

Os seguintes novos derivados de nitroso anilina são especialmente preferidos de acordo com a presente invenção: a) 2,21-[(3-fluoro-4-nitrosofenil)-imino]-bis-etanol, b) 2,2 * -[(3-cloro-4-nitrosofe4nil)-imino]-bis-etanol, [ c) 2,2'-[(3-metoxi-4-nitrosofenil)-imino]-bis-etanol, 14 =

d) 2,2'-[ (3-metilmercapto-4-nitrosofenil)-imino]-bis--etanol, e) 2-[(2-hidroxietoxi)-etil-(4-nitrosofenil)-amino]-etanol, f) 2-[(2-metoxietoxi)-etil-(4-nitrosofenil)-amino]-etanol g) 1-[N-(2-hidroxietil)-4-(4-nitrosoanilino)]-3-metoxi-2--propanol, h) 1-[N-(2-hidroxietil)-(4-nitrosoanilino)]-3-(2-hidroxi-etoxi)-2-propanol, i) 1-metil-4-(4-nitrosofenil)-piperazina, j) 4-(4-nitrosofenil)-1-piperazino-etanol, k) 5-nitroso-1-indolino-etanol, l) l-metil-6-nitroso-1 ,2,3 3_tetrahidr0(Iuinc>1ina» m) 6-nitroso-3,4-dihidro-1(2H)-quinolino-etanol e os seus sais.

Destes são partieularmente preferidos os compostos a), d), e), f), g) eh), bem como os seus sais. 0 composto e) ou os seus sais, em particular o cloridrato,# é especialmente preferido.

Os compostos de fórmula geral III poden. ser produzidos fazendo reagir um composto de fórmula gerall 1¾

(IV) 12 4 na qual R , R e R tem os mesmos significados que nos compostos de fórmula geral III, com nitritos. Um processo anáo logo é conhecido de J.J. D’Amico et al, J. Amer. Chem. Soc. 81, 5957 (1959). É preferivelmente utilizado como nitri * to alcalino, no qual podem estar presentes como metais alcali- 15 nos lítio, sódi.o, potássio, rúbui ou césio: o nitrito de sódio e o nitrito de potássio são usados com preferência. É especial mente preferido o nitrito de sódio. A reacção tem lugar preferivelmente em meio ácido a baixa temperatura. É vantajoso que a temperatura seja inferior a 10°C, de preferência entre -10 e +5°C. É vantajoso que a reacção de um composto de fórmula geral IV com o nitrito tenha lugar em meio aquoso. 0 pH deverá de preferência ser inferior a 3, sendo particularmente preferido inferior a 2.

Numa variante preferida para a reacção adiciona-se primeiro a um meio aquoso ácido um composto de fórmula geral IV ou um seu sal, de preferência um sal com um ácido mineral tal como ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido azó-tico ou ácido fosfórico, e arrefece-se.

Seguidamente, o nitrito, de preferência numa forma dissolvida, é adicionado mantendo-se simultaneamente a mistura reactiva a uma temperatura baixa. É vantajoso que seja também utilizado um meio aquoso como dissolvente para o nitrito. Depois da adição do nitrito a mistura reactiva é man tida a uma temperatura baixa até que a reacção esteja completa. Para o tratamento da mistura reactiva esta é de preferência extraída com um dissolvente orgânico e o produto ê isolado do extracto.

Os compostos que podem ser usados de acordo com a presente invenção, como transportadores de electrões podem ser guardados e utilizados na forma oxidada. As correntes de partida são evitadas por este meio e as determinações do ponto final podem ser realizadas com um -excesso da substância transportadora de electrões. Os compostos que podem ser usados de acordo com a presente invenção como transportadores de electrões são estáveis em armazenagem e podem reagir rapidamente com oxidoreductases. São sobretudo capazes de competir com o oxigénio quando se usam oxidases e podem ser utili-. zados em excesso relativamente à concentração superoir do ana-* lito a ser determinado. É especialmente esta última propriedade 16

que é facilitada pela boa solubilidade das substâncias transportadoras de electrões de acordo com a presente invenção em meio aquoso.

Na determinação electroquímica dos a-nalitos em fluídos corporais, uma vantagem particular dos compostos que são utilizados de acordo com a presente·: invenção como substâncias veiculares de electrões é a sua propriedade de não serem reduzidos por vias não enzimáticas, ou serem-nos apenas numa forma despresível, por substâncias nos fluídos corporais que actuam por via reductora. As substâncias v¥Qicula-res de electrões de acordo com a presente invenção são oxidadas na superfície do electrodo e não são sensíveis ao oxigénio na sua forma reduzida. Com estes compostos pode utilizar-se um potencial baixo para a oxidação junto ao electrodo.

Na presente invenção uma substância a ser determinada é designada por analito. A este propósito é geralmente um componente ou uma substância de substância misturada. 0 processo de acordo com a presente invenção oferece vantagens particulares a este respeito quando se determina um analito num fluído corporal, tal como sanfeue, plasma, soroo ou urina, porque nesta situação é particularmente importante que tenha lugar uma reacção específica apenas com um compoenente do sistema biológico de múltiplos componentes. 0 método de acordo com a presente invenção para a determinação electroquímica de um analito é basea do no facto de o analito ser, ele próprio, oxidado por uma oxidoreductase e deste modo constituir um substrato enzimático correspondente, ou o analito é convertido numa ou várias reac-ções prévias, de preferência reacções enzimáticas, num composto que pode ser oxidado por uma oxidoreductase. Os ezlectrõs que se libertam durante esta oxidação são proporcionais à quantidade do analito a ser determinado. Se estes electrões forem transferidos sobre um electrodo por uma substância reductível de acordo com a presente invenção, isto conduz então a um sinal que é uma medida do analito a ser determinado. São possíveis métodos amperométricos nos quais se mede uma corrente, ou 17

potenciometria, isto é, medições de uma tensão.

Como oxidoreductase para o método de acordo com a presente invenção são preferidas oxidades, desi-drogenases não dependentes de NAD(P) ou diaforase. Por exemplo, de acordo com a presente invenção a glucose pode serde-terminada com glucose-oxidase, os lactatos com lactato-oxida-se, o glicerolfosfato por meio de glicerolfosfato-oxidase ou o colesterol por meio de colesterol-oxidase. Como desidroge-nase não depende de NAD(P), a oxidoreductase de corante de glucose pode ser usada por exemplo para a determinação de ; glicose. A diaforase, que também pode ser designada por oxidoreductase de corante NADH, também pode ser usada com vantagem para a detecção de NADH.

Nos casos em que tenha que ser determinado electroquimicamente um analito que não sirva ele próprio cõmõ substrato para uma oxidoreductase, este analito pode ser convertido por uma ou várias reacções preliminares, em particular reacções enzimáticas, num composto que seja aceite por uma oxidureductase como substrato. Por exemplo, os trigli-céridos podem ser determinados visto que são clivados porm meio de umla esterase em glicerina e radicais ácidos, sendo a glicerina com glicerol-cinase e ATP; ? este é finamente oxidado por meio de glicerol-fosfato-oxidade; os electrões que são produzidos neste último passo são transferidos por meio de uma substância transportadora de electrões de acordo com a presente invenção para um electrodo, produzindo-se deste modo uma corrente queé proporcional à quantidade de triglicéridos na amostra a analisar. 0 colesterol total pode também ser determinado por exemplo de modo análogo pela clivagem de ésteres de colesterol com colesterol-esterase e o colesterol formado deste modo é determinado por meio de colesterol-oxidase. Também neste caso a quantidade de colesterol formado deste modo e os electrões libertados na oxidação por meio de colestrol--oxidase, que são transferidos para o eléctrodo por meiod de uma substância reductível de acordo com a presente invenção, 18 =

e por conseguinte produzem uma corrente, são proporcionais à quantidade de colestrol total a determinar. 0 enzima diaforase pode ser utilizado para a determinação de NADH. Os electrões provenientes da diaforase podem também ser transferidos sobre o eléctrodo por meio da substância reductível de acordo com a presente invenção , Uma vez que muitas substâncias biológicas podem ser submetidas a reacção enzimaticamente com formação de NADH, é possível deste modo converter muitos analitos em NADH por sequên cias de reacções enzimáticas e então determinar finalmente este no eléctrodo por meio de diaforese e de uma substânccia reductível utilizada de acordo com a presente invenção. A partir do exposto deduz-se facilmente que de acordo com a presente invenção as oxidoreductases podem também ser, eviddntemente, determinadas se se empregar um correspondente composto que seja aceite como substrato enzi^ mático e uma substância reductível de acordo com a presente invenção. Deste modo, por exemplo, a glucose-oxidase pode ser determinada electroquimicamente se se puzerem em., contacto com a amostra a determinar, na presença de um correspondente sistema de electrodo 'sènsor, glucose e uma substância transportadora de electrões de acordo coma presente invenção.

Uma característica especial do método de acordo com a presente invenção é o facto de a substância reductível utilizada para transferir electrões de uma oxi-dorreductase para o electrodo ser estável em armazenagem na sua forma oxidada e adicionalmente ser rapidamente solúvel em água, o que é particularmente importante para a determinação de analitos em fluídos corporais, tais como sangue,soro e urina. As substâncias reductíveis capazes de ser utilizadas de acordo com a persente invenção reagem rapidamente com oxi-dorreductases e são capazes de competir muito bem com o oxigénio, em partieular em reacções com oxidases. Devido à sua solubilidade podem ser usadas muito bem para métodos com ponto final amperométrico nos quaisse exige um .Excesso relativamente â mais alta concentração de analito a determinar. Uma vez 19 =

que as substâncias reductíveis capazes de serem usadas de acordo com a presente invenção são reduzidas não enzimaticamente apenas numa quantidade desprezível nos fluídos corporais por agentes redutores que estão ali presentes, são xidadas rapidamente na superfície do electrodo e são dificilmente sensíveis ao oxigénio na sua forma reduzida, estas substâncias são bastante adequadas à determinação electroquímica específica,sem interferências dos analitos. Além disso a determinação electroquímica específica dos analitos sem interferências é sobretudo uma consequência do facto de as substâncias reductíveis capazes de ser utilizadas de acordo com a presente invenção exigirem apenas um fraco potencial de eléctrodo. 0 método de acordo com a presente invenção para a determinação electroquímica de um analito não está limitado a qualquer dispositivo electroquímico particular. Por exemplo, podem ser utilizados para o efeito os mais modernos sistemas de electrodo sensor. Em princípio, para a determinação de um analito numa amostra líquida são apropriados os sistemas de eléctrodo sensor que contêm pelo menos dois agentes electricamente condutores como eléctrodos, que estão presentes isolados um do outro e que podem ser postos em contacto eléc-trico, cada um, com a amostra a ser determinada por meio de uma superfície electricamente condutora. A este propósito é concebível que apenas sejam usados dois eléctrodos, nomeadamente um eléctrodo de serviço e um eléctrodo de referência.É também possível uma disposição de medida sem um eléctrodo de referência, isto é, apenas um electrodo de serviço e um contra-eléctrodo. Neste a tensão é normalmente mantida constante externamente. É também.' possível a utilização de três eléctrodos, designadamente um eléctrodo de referência, um eléctrodo de serviço e um contraeléctrodo. Os sistemas de electrodo sensor correspondentes são conhecidos na téanica, por exemplo de G. Henze e R. Neeb, "Elektrochemische Analytik", Spbinger-Ver-lag (1986). É importante para a determinação electroquímica de um analito que (pelo menos) um eléctrodo, isto # • é, uma superfície electricamente condutora, contacte com uma 20

oxidorreductase e uma substância reductível que seja capaz de transferir electrões entre a oxidorreductase e a superfície electricamente condutora. A estè propósito é concebível que todos os reagentes requeridos estejam em solução conjuntamente com a amostra a ser examinada ou que uma parte dos reagentes de preferência a oxidorreductase e/ou a substância reductível que transfere os electrões, estejam imobilizadas sobre um eléc-trodo e o restante esteja presente na solução, ou que todos os reagentes necessários para a determinação estejam imobilizados sobre um eléctrodo. Em princípio não é decisivo para o funcionamento de um sistema de electrodo sensor se o electrodo de serviço contacta a oxidorreductase e a substância reductível que funciona como veículo de electrões na qualidade de substâncias dissolvidas, ou se estas substâncias são aplicadas aoe eléc trodo como substâncias sólidas e que, se desejado, se dissolvem em contacto com a amostra líquida a ser determinada, ou mesmo se se mantém imobilizadas sobre o eléctrodo depois do contacto com a amostra líquida a ser determinada.

Cabe aqui salientar que a descrição.·', anterior se aplica analogamente à determinação de uma oxidorreductase. Deve ser tomado em consideração o facto de o sistema de electrodo sensor contactar um substrato de oxidorreductase e uma substância reductível de acordo com a presente invenção. A parte este facto, as indicações dadas para a determinação de um analito apiicam-se de forma correspondente neste caso.

As figuras anexas ilucidam melhor ai invenção. Elas mostram: A fig. 1 na parte a), um esquema da função da substância reduc tível capaz de ser usada de acordo com a presente invenção em métodos de acordo com a presente invenção e sistemas de electrodo sensor quando a concentração da substância veicular de e-lectrões é maior ou igual que a concentração do analito a ser determinado. A fig. 1 na parte b), um esquema da função das substâncias que transportam electrões nos métodos da técnica actual e nos sis- § , temas de eléctrodo sensor da técnica actual. 21

Μ A fig. 2 na parte a), um esquema da função das substâncias reductíveis capazes de ser usadas de acordo com a presente invenção em métodos de acordo com a presente invenção e sistemas de eléctrodos sensor quando a concentração da substância que transfere electrões é muito menor do que a concentração doa ana lito a ser determinado. A fig. 2 na parte b), um esquema da função de substâncias que transferem electrões em métodos da técnica actual e em sistemas de eléctrodo sensor da técnica actual. A fig. 3: um sistema de eléctrodo sensor para a realização do método de acordo com a presente invenção no qual as substâncias requeridas estão presentes em solução. A fig. 4: um sistema de eléctrodo sensor para a realização do método de acordo com a presente invenção que está previsto para ser um sensor descartável. A fig. 5: um diagrama de valores obtidos a partir de ciclovol-tamogramas para densidade de corrente anódica máxima a diferentes concentrações de glucose utilizando N,N-bis-(2-hidroxi-etil)-p-nitrosoanilina com a substância de transferência de e-lectrões num ensaio electroquímico de glucose de acordo com a presente invenção. A fig. 6: um diagrama mostrando a relação entre a densidade do corrente e a concentração de NADH num ensaio de NADH de a-cordo com a presente invenção. A fig. 7: ciclovoltamogramas para N-(2-hidroxietil)-N’-p--nitrosofenilpiperazina e N,N-bis-(2-hidroxietil)-p-nitroso-anilina. A fig. 8: diagrama de dependência de densidade da corrente com a concentração de glucose de acordo com o método de acordo com a presente invenção, com N-metil-Nf-(4-nitrosofenil)-piperazina como substância de transferência de electrões, na persença e na ausência de electrões, na presença e na ausência de oxigénio atmosférico. A fig. 9: diagrama de dependência da densidade de corrente de 22

concentração de glucose de acordo com métodos da técnica actu-al, com tetratiafulvaleno como substância de transferênçia de electrões na presença e na ausência de oxigénio atmosférico. A fig. 10: diagrama da dependência da densidade de corrente com a concentração de LDH de acordo com o método da presente invenção, com N,N-bis-(2-hidroxietil)-p-nitrosoanilina como substância de transferência de electrões a diferentes instantes depois do inicio da reacção de determinação com lactato--desidrogenase. A fig. 11: curvas corrente-tempo para o método de acordo com a presente invenção com um eléctrodo descartável de acordo com a fig. 4 para a detecção de glucpose. A fig. 12: diagrama de dependência de corrente sobre a concentração de glucose de acordo com o método de acordo com appre-sente invenção com um eléctrodo descartável de acordo com a fig. 4 após 10 segundos de tempo de reacção.

Nas figs. 1 e 2, mostram-se as diferenças de acordo com a presente invenção (A) e o método da técnica ac-tual (B) no caso da utilização de um excesso da substância que transfere electrões relativamente ao analito a ser determinado (fig. 1) e quando se usa uma quantidade muito reduzida das subs tância que transfere electrões comparada com a concentração de analito (fig. 2). De acordo com o método da técnica actual de armonia com a fig. 1b) a substância de transferência de elec ctrões (E .) é convertida na forma de redução (E ,) na presença do analito a ser determinado ou de uma substância derivada do analito ¢) que ® oxidada enzimaticamente a (S ). 0 veículo de electrões reduzido (E ,) é oxidado no elé trodo de regresso à substância reductível usada inicialmente (E .) libertando electrões.

OX I

Em contraste, de harmonia com o método de acordb com a presente invenção e de acordo com a fig. 1a), a substância reductível que funciona como o transportador de elec trões (EQX i) é convertida na forma reduzida (Ere^) nao oxidação enzimática do analito a ser determinado, ou de uma subs- = 23 =

tância derivada do anilito (S ,) a (S ). Na oxidação anódi-ca junto ao eléctrodo forma-se então uma forma oxidada da substância transportadora de electrões (E 0) que é diferente da substância reductível usada inicialmente (EQX · Como resultado da ausência completa de E _ no início da oxidação electroquímica, a Ered pode ser oxidada a um potencial parti_ cularmente baixo. A substância reductível que transfere electrões de acordo com a presente invenção (E ,,) pode ser esco-

O X I lhida de modo que seja suficiente um potencial relativamente baixo par a oxidação anódica da forma reduzida que se forma en-zimaticamente (E ,). Pode evitar-se por e4ste meio reacções de interferência simultâneas que ocorrem quando outras substân cias também presentes nas amostras a examinar são oxidadas quando são aplicadas aos eléctrodos potenciais mais elevados e conduzem deste modo a uma corrente e, consequentemente, a um re sultado falsamente positivo. No método da técnica actual de a-cordo com a fig. lb) é necessário um potencial mais elevado do que o da substância reductível utilizada inicialmente (E 1) por causa do excesso de Eqx ^ para reoxidar a forma reduzida da substância veicular de electrões formada enzimaticamente (W·

Se a substância reductível que funciona como substância veicular de electrões (EQx -j) estiver presente numa quantidade que é menor do que o analito a ser determinado ou de uma substância derivada do analito a ser determinado (S .), então, de acordo com o método da técnica ac-tual (fig. 1b) a substância reductível pode ser reciclada entre o eléctrodo e o enzima, uma vez que a forma reduzida da (E .) é oxidada anodicamente de retorno à substância reductí-red vel usada inicialmente (E 1).

Ο Λ I

De acordo com o método de harmonia com a presente invenção (fig. 2a) se a forma oxidada da substância veicular de electrões formada junto ao eléctrodo (E „) for

O X reduzida pelo enzima reduzido, bem como a substância reductível usada inicialmente (EQX ^), então (EQX^ ) pode servir por e- xemplo como uma forma estável de armazenagem para o sistema transportador de electrões ΕΛ 0/E ,. r ox 2 red = 24 =

Em princípio podem ser utilizados para o método de acordo com a presente invenção todos os sistemasd de electrodo sensor que sejam também apropriados para a realização dos métodos da técnica actual. Assim, pode ser utilizadou um sistema de eléctroda sensor de acordo com a fig. 3, tal como o que é conhecido de G. Henze e R. Neeb. "Electrochemische Analytik", Springer Vergag (1986).

Neste sistema um electrodo de serviço (1), um contraeléctrodo (2) e um eléctrodo de referência (3) são imersos na amostra líquida a ser determinada (4). Podem ser utilizados para os eléctrodos os materiais correntes. Os electrodos de serviço e os contraeléctrodos (1, 2) podem consis^ tir por exemplo, vantajosamente, em metais nobres ou estes metais são utilizados para a promoção dos eléctrodos. Os materiais preferidos para o eléctrodo de serviço e o contraeléctrodo (1,2) são por exemplo ouro e platina. 0 eléctrodo de referência (3) também pode ser construído a partir de sistemas con vencionais para o efeito. 0 sistema prata/cloreto de prata é por exemplo o preferido. 0 eléctrodo de referência (3) está ligado vantajosamente através de uma ponte salina, por exemplo uma solução de cloreto de potássio, com o restante sistema de eléctrodos (1, 2) na amostra líquida a ser determinada (4). A oxidorreductase ou o sistema de oxidor reductase (consoante se pretende determinar no analito ou uma oxidorreductase) para o método de acordo com a presente invenção , e a substância reductível que funciona como transportador de electrões, podem ser dissolvidas na amostra a ser determinada (4) ou podem estar localizadas, total ou parcialmente, sobre4 o eléctrodo de serviço (1). A maneira como os eléctrodos são ligados electricamente aos outros depende do sinal e-léctrico a medir e do modo como têm que ser controlados e é evi^ dente para os especialistas na técnica. A construção de um eléctrodo descartável que pode ser usado por exemplo para a detecção de glucose está representada na fig. 4. Os eléctrodos requeridos e os seus con dutores anecxo são montados sobre um material veicular isola- = 25

-do (8) por exemplo uma folha de policarbonato. Os métodos adequados podem ser por exemplo métodos de impressão por serigra-fia, impressão por jacto de tinta, métodos de revestimento e evaporação ou técnicas de películas delgadas. Na fig. 4 (5) re presenta o eléctrodo de serviço, (55) representa os condutores eléctricos anexos, (6) representa um eléctrodo de referên cia com o seu condutor (66), e (7) representa o contraeléctro-do com um correspondente condutor (77). Podem ser usados materiais electricamente condutores bem conhecidos para os eléctro-dos e os condutores anexos.Pastas de impressão de grafite comer ciaais podem ser utilizadas por exemplo, para produzir os con-ductores eléctricos dos eléctrodos..Os eléotrodos na sua maior parte contêm metais nobres, tais como prata, ouro ou platina. No sistema de eléctrodo sensor de acordo com a presente invenção de harónia com a fig. 4, o eléctrodo de serviço contém os restantes são necessários para a realização da determinação e-lectrbquimicamente de um analito ou de uma oxidorreductase.

Para a determinação da glucose, trata-se por exemplo de gluco-se-oxidase, uma substância reductível de transferência de ele-ctrões de acordo com a presente invenção, uma substância tampão que optimiza o valor do pH da amostra a examinar pela reac-ção enzimática, bem como, se desejado, um detergente e um agente de intumescência a "fim de se obter a consistência necessária para a produção de um eléctrodo com um material que torne a mistura condutora e a fim de tornar a mistura trabalhável na forma de pasta. 0 pé de grafite pode ser por exemplo adicionado como substância que torna o material condutor. 0 eléctrodo de referência (6) e o contraeléctrodo (7) assim como os condutores respectivos (66) e (77), podem ser produzidos por exemplo a partir de pastas condutoras de prata comerciais que contêm cloreto de prata em pé. Um sistema de eléctrodo sensor de acordo com a fig.4 pode ser produzido com um tamanho de cerca de 10 x 30 mm. A solução a ser examinada pode ser aplicada para ser aplicada às superfícies do eléctrodo ou aparelho de ensaio pode ser impresso no líquido a ser examinado, de modo que as su perfícies do eléctrodo cobertas com o líquido. Na medição am-* perométrica pode então ser aplicado um potencial aos eléctrodos = 26

e podemedir-se uma corrente que é proporcional ao analito a ser determinado.

Para isso a corrente entre o contraeléc-trodo (7) e o eléctrodo de serviço (5) é medida e regulada de tal modo que seja mantida uma tensão pré-determinada entre o eléctrodo de referência (6) e o eléctrodo de serviço (5). A medição da tensão entre o eléctrodo de serviço (5) e o electro do de referência (6) é realizada à corrente 0 a fim de quea as resistências dos condutores não inbèrfiram. Se as exigências da precisão dos potenciais de eléctrodo foram muito baixos, então podem dispersar-se as medições de medição âc.çorrente 0,ou o eléctrodo de referência (6) pode ser utilizado simultaneamente como contraeléctrodo (7). A invenção é elucidade mais pormenorizadamente através dos exemplos seguintes.

Exemplo 1:

Teste de glucose É utilizado um sistema de eléctrodo sen sor de acordo com a fig. 3. 0 eléctrodo de serviço (1) consis 2 te num arame de ouro com uma área de 0.1 cm . 0 contraelêc- 2 trodo (2) e um arame de platina com uma área de 0,1 cm e o electrodo de referência (3) é um sistEma de prata/cloreto de prata da Orion Research Inc. Company (Bostõn, Massachusetts, USA).

Um recipiente de reacção tem uma solução de 0.1 mol/litro de tampão de fosfato de potássio e 0,1 mol/litro de cloreto de potássio, pH 7,0; 10 mmol/litro de N,N-bis-(2-hidroxietil)-p-nitrosoanilina e glucose a uma concentração compreendida entre 0 100 mmol/litro. A reacção de determinação é iniciada por adição de glucose-oxidase (EC 1.1.3.4) à mistura reacção e a subsequente mistura. A glucose-oxidase é adicionada numa quan tidade tal que a concentração na mistura reactiva seja de 0,5 mg/ml (125 U/ml (115 U/ml). Decorrido 1 minuto depois da adição de glucose-oxidase é medido o ciclovoltamograma a uma = 27 =

taxa de varrimento de 100 mV/s exoom um potenciostato (modelo 273 EG & G, Princeton Applied Research. Princeton, New Jersey USA). As correntes doprimeiro máximo de oxidação são avaliadas em 150 mV. Os resultados obtidos estão representados na fig. 5. As medições correspondentes 5 minutos depois da adição de glucose-oxidase ou quando o oxigénio é excluido (sob atmosfera de argon) não resultam em alterações significativas. 0 resultado é uma dependência linear do máxmo de densidade de corrente anódica com a concentração de glucose, até concentração de glucose de cerca de 30 mmol/li-tro, como se pode ver pelo diagrama de acordo com a fig. 5.

Para uma concentração de glucose superior a 30 mmol/litro a N,N-bis-(2-hidroxietil)-p-nitrosonoanilina utilizada como subs £ância que transfere electrões é completamente convertida na correspondente fenilenodiamina. Concentrações mais altas do que 30 mmol/litro de glucose não conduzem, por conseguinte, a pm aumento posterior de corrente, Uma vez que são necessárias 2 moléculas de glucose para produzir 1 molécula de fenilenodia mina e apenas cerca de dois terços da glucose total estão pre sentes na forma e estão por conseguinte disponíveis para conversão completa que se verificou ser de 10 mmol/litro da substância transportadora de electrões por 30 mmol/litro de glucose corresponde exactamente à estequiometria teórica. São obtidos resultados comparáveis quando se usa glucose-corante-oxidorreductase (EC 1.1.99.17)em vez de glucose-oxidase (EC 1.1.3.4) em 0,1 mmol/litro de tam pão tris, 0,1 mol/litro de cloreto de potássio, pH 7,0 com adição de 1 % de albumina de soro de bovino.

Exemplo 2:

Teste de NADH A construção e a disposição de medição são as mesmas que foram descritas no exemplo 1. 0 recipiente de reacção contém 0,1 mol/litro de tampão de fosfato de potássio, 0,1 mol/litro de cloreto de potássio, pH 7,0, 10 mmol/ /litro de N,N-bis-(2-hidroxietil)-p-nitrosoanilina e NADH a = 28 =

concentrações compreendidas entre 0 e 10 mmol/litro. A emissão é iniciada por adição a mistura de diaforase (NADH s corante-oxidorreductase) de microorganis-mos e a mistura do enzima com a mistura reactiva. 0 enzima é adicionado numa quantidade tal que a concentração do enzima na mistuyra reactiva seja de 0,2 mg/ml (3U/ml). As medições da densidade de corrente após 1 minuto de tempo de reacção conduzem à relação linear densidade de corrente-concentração representada na fig. 6.

Exemplo 3s

Determinação de lactatos

Os lactatos podem também ser determinados utilizando a mesma construção experimental e a mesma substância transportadora de electrões do exemplo 1. Utiliza-se lac-tato-oxidase (EC 1.1.3.2) como enzima e 0,1 mol/litro dettam-pão de citrato, 0,1 mol/litro de cloreto de potássio, pH 5,5 como tampão.

Exemplo 4:

Determinação de fosfato de glicerol 0 fosfato de glicerol pode ser determinado analogamente quando no exemplo 1 o enzima glucose-oxidase é substituído por oxidase de glicerofosfato (EC 1.1.3.21) e o tampão é substituído por 0,1 mol/litro de tampão tris, 0,1 mol/litro de cloreto de potássio, pH 8,0.

Exemplo 5 s

Determinação de colesterol 0 colesterol pode ser determinado analogamente ao exemplo 1, quando neste exemplo 1 a glucose-oxidase é4 substituída por colesterol-oxidase de Streptomyces (EC 1.1.3.6), o aceitante de electrões é substituído por 10 mmol/ /litro de N-metilN’-(4-nitrosofenil)-piperazina e o tampão I substituído por 0,1 mol/litro de tampão de fosfato de potássio, 0,1 mol/litro de cloreto de potássio, pH 5,5 com 2% de Triton ; x iooR. = 29 =

Exemplo 6:

Substâncias reductíveis de acordo com a presente invenção que transferem electrões

Os compostos mencionados no Quadro 1 a seguir são levados a reagir a uma concentração de 10 mmol/litro em tampão de fosfato de potássio 0,1 mol/litro de cloreto de potássio, pH 7,0 com 50 mmol/litro de glucose e 0,5 mg/ml de glucose-oxidase (125 U/ml. Neste caso utiliza-se uma disposição de medição como é descrito no exemplo 1. 0 correspondente ciclovoltamograma fornece os potenciais de pico em mV, contra um eléctrodo normal de hidrogénio, da substância transportadora de electrões reduzida com glucose-oxidase e glucose.

No quadro 1 a relação das correntes de oxidação ao potencial do pico de oxidação mais elevado é apre_ sentado após 1 minuto e após 10 minutos como medida· da taxa de conversão.

Quadro 1

Veículo de electrões potenciais de picoa taxa de conversão N-(2-hidroxietil- Ν’-ρ-nitrosofenil- piperazina 340 97 N,N-bis-(2-hidroxi-etil)-p-nitroso-anilina 210 94 o-metoxi[N,N-bis-(2-hidroxietil)]-p--nitrosoanilina 170 35 p-nitrosofenil 220 62 p-quinona 250 35 = 30 = ,,ί';-"' Quadro 1 (continuação) c cl Veículo de electrões Potenciais de pico tasa de conversão N,N-dimetil-4-nitroso-1-naftil- amina 175 N,N,3-trimetil-4- nitrosoanilina 220 N-(2-hidroxietil)-5-nitrosoanilina 80 N ,N-bis(2-hidroxi-etil)-3-cloro-4- nitrosoanilina 315 2,4-dimetoxi-nitro- sobenzeno 130 N, N-bis-(2-metoxi-etil)-4-nitroso- anilina 245 3-metoxi-4-nitroso- fenol 140 N-(2-hidroxietil)-6-nitroso-1,2,3,4-tetra--hidroquinolina 95 N,N-dimetil-3- cloro-4-nitroso- anilina 275 25 56 86 72 95 68 30 82 27 = 31

I

Quadro 1 (continuação) a b

Veículo de electrões potenciais de pico taxa de conversão N,N-bis-(2-hidroxi- 260 74 etil)-3-fluor-4- -nitrosoanilina N,N-bis-(2-hidroxi- 195 21 etil)-3-metiltio-4- -nitrosoanilina N-(2-hidroxietil-N--2-(2-metoxietoxi)-etil)-4-nitroso-anilina N-(2-hidroxietil)-N- (3-metoxi-12-hidroxi-1-propil)-4-nitrosoanilina N-(2-hidroxietil-N-(3-(2-hidroxi-etoxi-2-hidroxi-1--propil)-4-nitroso-anilina 225 225 210 65 65 54 a: primeiro potencial de pico do transportador de electrões reduzido com glucose-oxidase e glucose em mV contra Ag/AgCl b) corrente do primeiro máximo no ciclovoltamograma a 1 minuto de tempo de reacção, quando comparado com a corrente a 10 minutos de tempo de reacção, em %. . _4 c) concentração 5 x 10 mol/litro. = 32 =

Os ciclovoltamogramas para N-(2-hidroxi-etil)-N,-p-nitrosofenil-piperazina e N,N-bis~(2-hidroxietil)--p-nitrosoanilina estão representados na fig. 7. Os ciclovol-tamogramas foram medidos com 10 mmol/litro de glucose a fim de evitar interferências por reacções de glucose residual quando se registavam os ciclovoltamogramas.

Exemplo 7í

Comparação de uma substância transportadora de electrões de acordo com a presente invenção com uma de acordo com a técnica actual a) Numa construção experimental como é descrita no exemplo 1 utiliza-se N-metil-Nf-(4-nitrosofenil)-piperazina a uma _Ii concentração de 10 mol/litro num tampão de fosfato pH 7,0. A medição de ciclovoltamogramas a concentrações de glucose compreendidas entre 0 e 3 mmol/litro revelau uma dependência da densidade de corrente com a concentração de glucose, como se mostra na fig. 8. Para baixas concentrações vê-se que o oxigéneo atmosféric,p tem uma influência que pode ser evitada por medições em atmosfera de argon. É obtido o mesmo resultado que se obtém utilizando o árgon como gás de protecção quando a substância transportadora de electrões é utilizada a uma concentra- -2 ção mais alta (10 mol/litro). A influencia da medição pelo oxigénio também pode ser evitada pela utilização de glucose-desidrogenase em vez de glucose-oxidase. b) Quando se usa tetratiafulvaleno como substância transpor tadora de electrões de acordo com a técnica actual, em vez de N-metil-N'-(4-nitrosofenil)-piperazina como substância transportadora de electrões de acordo com a presen te invenção, a dependência da densidade decorrente em relação à concentração de glucose I a que está representada na fig. 9. 0 tetratiafulvaleno mostra uma interferência de oxigénio substancialmente maior do que no caso da substância transportadora de electrões de acordo com a presente invenção. Adicionalmente medem-se densidades de = 33 =

0 tetratiafulvaleno e muito escassamente - -4 solúvel. Para se obter uma concentração de 10 mol/litro num tampão de fosfato a pH 7,0, tem-se que utilizar comoa agen te detergente 2,5$ de Tween 20 . Não é possível devido à sua fraca solubilidade, o ajustamento para concentrações de tetratiafulvaleno muito superioes, como é possível no caso de substância transportadora de lectrões de acordo com a presente invenção, para se reduzir a interferência do oxigénio.

Exemplo 8

Determinação enzimática a) Teste de lactato-desidrogenase São preparadas as seguintes soluções, ana logamente à disposição de ensaio de acordo com o exemplo 1: . tampão de fosfato de sódio 0,1 mol/litro, cloreto de potássio 0,1 mol/litro, pH 9,0; . . .10 mmol/litro de N,N-bis-(2-hidroxietil)-p-nitrosoanilina; . 0,1 mol/mitro de D,L-lactato (sal de sódio) . 1 U/ml de diaforase de microorganismos . 10 mmol/litro NAD+. A corrente é medida a um potencial constante de 75 mV contra prata/cloreto de prata, mantendo-se simultaneamente uma agitação vigorosa (agitador magnétrico, 1000 rotações por, minuto). É iniciada pela adição de lactato-desidrogenase (EC 1.1.1.27). São adicionadas quantidades diferentes de lactato-desidrogenase e realizam-se as medições em cada caso após 100, 200, 300, 400, 500 e 600 segundos. As curvas corrente/tempo obtidas estão representadas na fig. 10. As actividades LDH que figuram nas ordenadas foram determinadas de acordo com o teste de redução de piruvato convencional. b) Teste da glucose-desidrogenase

Pode ser realizado um teste para glucose- = 34 = -desidrogenase dependente de NAD analogamente à descrição em a) em 0,1 mol/litro de tampão de fosfato de potássio, 0,1 mol/litro de cloreto de potássio, pH 7,0 com' 10 mmol/litro de NAD+, 10 mmol/litro do transportador de electrões de acordo com a invenção, 1 U/ml de diaforase e 0,1 mol/litro de glucose.

Podem determinar-se em conformidade oxi-dases, diaforase ou desidrogsnase não dependentes de NAD.

Exemplo 9

Sistema de eléctrodo descartável para a detecção de glucose

Um sistema de eléctrodo sensor de acordo com a fig. 4 é produzido montando o eléctrodo de serviço (5), o eléctrodo de referência (6), o contraeléctrodo (7) e osc condutores (55,66, 77) sobre uma folha de policarbonato (8) por meio de impressão por serigrafia, utilizando pastas de impressão apropriadas. Os condutores consistem em pasta de impressão de grafite comercial (Acheson 421 SS, Deutsche Acheson Colloids Ulm, Alemanha). 0 eléctrodo de referência (6) e o contraelé-trodo (7) consistem em pasta condutora de prata comercial que é misturada com 20% eml peso de cloreto de prata em pó (Acheson SS 24566, Deutsche Acheson Colloids, Ulm, Alemanha).

Para o eléctrodo de serviço (5) misturam--se 3 moles/ litro de N,N-bis-hidroxietil-p-nitrosoanilina, 500 KU glucose-oxidase (glucose-oxidase, grau de pureza II, Bsefrin-ger Mannheim GmBH, Mannheim, Alemanha) por 100 g de mistura 30% em peso de pó de grafite (UF 296/97, Graphitwerke Kropf-muhl, Alemanha) e 4 % em peso de etilenoglicol que são homogeneizados a 2% em peso numa mistura intumescente de hidroxietil-celulose (Natrosol 250 g, Hercules BV, Rijswijk, Holanbda em 0,05 mol/litro de tampão de fosfato de sódio (pH 7,0). As á-.-reas dos eléctrodos são: 2 2 para o eléctrodo de serviço (5): 4 x 6 mm = 24 mm 2 para o eléctrodo de referência (6): 1 x 1,5 mm + , r- 2 = 1,5 mm e 2 2 para o contraeléctrodo (7)í 1 x 1,5 mm = 1,5 mm 0 sistema de eléctrodo sensor conduzido = 35 =

por impressão por serigrafia é imerso numa solução de medição que contém 0,05 mol/litro de tampão de fosfato de sódio (pH 7,0) p,1 mol/litro de cloreto de sódio e 0 a 45 mmol/litro de glucose, de modo que as superfícies dos eléctrodos fiquem cobertas pelo líquido a ser examinado. Registam-se as curvas cor rente/tempo, que se mostram na fig. 11, a 200 mV de potencial contra o eléctrodo de referência de prata/cloreto de prata integrado (6). Um gráfico dos valores da corrente após 10 segundos de tempo de medição fornece a curva de calibração que se mostra na fig. 12, que revela a dependência da corrente relativamente à concentração de glucose.

Exemplo 10

Produção de 2,2,-[(4-nitrosoaril)-imino]-bis-etanois 2 mol de [N,N-bis-( ,Α-hidroxietilani-lina ) ( es seus anáologos substituídos por arilo) são adicionados às porções, mantendo-se simultaneamente uma agitação vigorosa, a uma mistura de 200 ml de água e 400 ml de ácido cio rídrico concentrado, num balão de três tabuladuras de 4 litros, equipado com agitador, termómetro e fonil de carga. A solução resultante é arrefecida a 0°C com um banho de arrefecimento e adiciona-se gota a gota uma solução de 148 g (2,1 mol) de nitri^ to de sódio em 200 ml de água, a 0 a 2°C agitando-se simultânea mente. Mantém-se a agitação por mais 3o minutos a 0°C, a maior parte do composto de nitroso cristalino que tem uma cor amarela a esverdeada é removida por aspiração e o bolo de filtração é lavado duas vezes com 200 ml de ácido clorídrico semiconcentra-do arrefecido por gelo, Para a purificação o produto bruto é dissolvido em 900 ml de água, adiciona-se 400 ml de ácido clorídrico ao concentrado, mantendo-se simultaneamente uma agitação vigorosa, prolonga-se a agitação por 30 minutos à temperatura ambiente e depois por mais 30 minutos mediante arrefecimen po por gelo. Op produto cristalino obtido é subsequentemente dissolvido em 580 ml de água à qual se adicionaram 265 ml de ácido clorídrico concentrado, e agita-se 30 minutos à temperatura ambiente e mais 30 minutos mediante arrefecimento por ge-. lo.. Os cristais que se formam são removidos por aspiração, = 36 = h

são lavados três vezes com 150 ml de acetona arrefecido por gelo de cada vez, duas vezes com 200 ml de éter dietílico de cada vez e finalmente secam-se em vácuo à temperatura ambiente. Deste modo obtêm-se os seguintes compostos: a) cloridrato de 2,2t-[4-nitrosofenil)-imido]-bis-etanol rendimento 32,8/¾ do valor teórico, cristais verdes; p.f. 160°C (decomposição).

Utilizando os correspondentes análogos substituídos por arilo obtêm-se, de modo idêntico, os seguintes compostos: ' b) cloridrato de 2,2,-[(3-fluoro-4-nitrosofenil)-imino]-bis--etanol rendimento: 26,5% do valor teórico, cristais amarelos: p,f. 140°C (decomposição), TLC: sílica-gel 60 (Merck)-fase móvel: acetato de etilo/metanol = 5:1, Rf = 0,59 a partir de 3-fluor-N,N-bis-[2-hidroxietil]-anilina (Chem. Abstr. 57, 13922 [1962]) c) cloridrato de 2,2t-[(3-cloro-4-nitrosofenil)-imino]-bis--etanol rendimento: 21 % do valor teórico, cristais amarelos; p.f. 154°C (decomposição). TLC: sílica-gel 60 (Merck) - - fase móvel: cloreto de metileno/metanol = 5:1,

Rf = 0,72 a partir de 3-cloro-N,N-bis[2-(hidroxietil]-anilina (M. Freifelder, G.R. Stone, J.Org. Chem. 26_, 1499 ( 1961 ) d) cloridrato de Z^^CCS-metoxi-^l-nitrosofeniD-imino]--bis-etanol rendimento: 52% do valor teórico, cristais de cor ocre; p.f. 145-146°C (decomposição) TLC: sílica-gel 60 (Merck)- - fase móvel: cloreto de metileno/metanol = 5:1, Rf = = 0,4 a partir de 3-metoxi-N,N-bis-[2-hidroxietil]-anilina = 37 =

(M. Freifelder et al., J. Org. Chem. 26_, 1499 ( 1961 )) e) cloridrato de 2,2t-[(3-metilmerGapto-4-nitrosofenil)--imino]-bis-etanol rendimentpo: 5993 % do valor teórico, cristais vermelho acastanhados; p.f. 148°C (decomposição). TLC: sílica-gel 60 (Merck) - fase móvel: acetato de etilo/metanol = = 0,53 a partir de 3-metilmercapto-N,N-bis-[2-(hidroxietil)]--anilina (obtido de: dissolvem-se 0,1 mol de 3-metil-mercaptoanilina em 50 ml de ácido acético 4N e 0,35 mol de etileno e agita-se 12 horas à temperatura ambiente. Adiciona-se um excesso de hidrogenocarbonato de sódio em solução, extrai-se com cloreto de metileno e purifica-se por cromatografia de coluna com sílica gel 60 (Merck) - - fase móvel: tolueno/acetona = 5:2, Rf = 0,18, rendimento 25)5, óleo incolor). f) cloridrato de 2-[metil-(3-cloro-4-nitrosofenil)-amino]--etanol rendimento: 15W do valor teórico, cristais amarelos; p.f. 147°C (decomposição), TLC: sílica-gel 60 (Merck) - - fase móvel: cloreto de metileno/metanol = 19:1,

Rf = 0,34 a partir de 2-[metil-(3-clorofenil)-amino-etanol obtido de 2-[(3-clorofenil)-amino]-etanol por fervura durante 3 horas com iodeto de metilo na presença de 105¾ de soda cáustica; purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel 80 (Merck) - fase móvel: tolueno/acetona = = 5:2, Rf = 0,39,rendimento 25 %, óleo incolor).

Exemplo 11

Cloridrato de 2-[(2-hidroxietoxi)-etil-(4-nitrosofenil)-amino]--etanol A) 2-[(2-hidroxietil)-etil-(fenil)-amino]-etanol = 38 =

o<

CH4CH2OCH2CH2OH CH2CH20H 146 g (0,8 mol) de 2-(2-anilinoetoxi)-etanol (obtido fazendo reagir anilina com 2-(2-cloroetoxi)-etanol, rendimento 54%, óleo incolor, pe.^ 131-133°C) é dissolvido em 500 ml de ácido acético 4 N, é arrefecido com um banho de arrefecimento a 0°C agitando-se simultaneamente e adioionam-se depois, gota a gota, 70,5 g, isto é, cerca de 79 ml (1,6 mol) de óxido de etileno gota a gota durante 5 minutos a 0-10°C. Depois de se deixar repousar durante 12 horas à temperatura ambiente adicionam-se 500 ml de água, neutraliza-se sob agitação ea adi^ ciona-se cuidadosamente um total de 200 g de hidrogenocarbo-nato de sódio em pequenas porções. Seguidamente a base na for ma livre é extraída com 500 ml de cloreto de metileno, é agitada de novo 3 vezes com 250 ml de cloreto de metileno de cada vez, as fases orgânicas são combinadas, secam-se com sulfato de sódio, isolam-se por aspiração e conc entram-se em vácuo. Obtêm-se 178,2 g do produto. TLC sílica-gel 60 (Merck) - fase móvel: tolueno/acetona =5:2, Rf= 0,18. B) cloridrato de 2-[2-hidroxietoxi)-etil-(4-nitrosofenil)--amino]-etanol

xHCl

Uma mistura de 280 ml de ácido clorídrico concentrado e 140 ml de água é introduzida num baláo de 2 litros, de 3 tubuladuras, equipado com agitador, funil de carga et ter mómetro, arrefece-se até -5°C com um banho de arrefecimento . de ger. seco, adicionam-se gota a gota 178 g (0,79 mol) da = 39 =

substância obtida segundo A) durante 10 minutos a uma temperatura constante e agita-se durante mais 15 minutos. Adiciona-se depois uma solução de 6o g. (0,87 mol) de nitrito de sódio em 120 ml de água à solução anterior a 0°C, ficando a solução com uma cor vermelho escuro a acastanhado, e agita-se por mais 30 minutos a 0°C, Seguidamente dilui-se por adição de 500 ml de água (pH da mistura reactiva 1,4) e adicionam-se 218 ml de amónia concentrada, gota a gota, arrefecendo-se . simultaneamente ®om gelo até ao máximo de 15°C, a pH 9. A base de nitroso libertada é extraída 5 vezes com 400 ml de n-buta-nol e o dissolvente é eliminado por destilação em evaporador rotativo. Obtêm-se 212,8 g de um óleo verde escuro. Este é misturado com uma mistura de 250 ml de tolueno/acetona = 1:1 a fim de remover produtos inorgânicas, a parte insolúvel é removida por aspiração e é lavada com 50 ml de toluneo/acetona = = 1:1. Ficam como resíduo 18,4 g de um produto inorgânico. 0 filtrado é purificado cromatograficamente numa coluna de sílica gel 60 /7,5 cm de diâmetro, nível de enchimento 90 cm, fluí do de separação tolueno/acetona = 1:1). Obtêm-se 155 g da base de nitroso, um óleo verde escuro. Este é dissolvido em 600 ml de acetona e é levado a reagir gota a gota com 250 ml de ácido clorídrico etérico saturado. Após agitação durante. 30 minutos, arrefecendo-se simultaneamente com gelo, os cristais que se formam são aspirados, são lavados 3 vezes com. 100 ml de acetona e secam-se em vácuo, à temperatura ambiente cçm pentóxido difosfórieo. Obtêm-se 159,9 g do composto (= 69,6$ do rendimento teórico) do composto de título; p.f. 118°C, TLC: sílica-gel 60 (Merck) - fase móvel: tolueno/acetona = = 1:1, Rf = 0,14.

Exemplo 12

Os compostos adiante são produzidos de modo analogo ao do Exemplo 11: = 40 =

I cloridrato de 1-[N,N-(2-hidroxietil)-(4-nitrosoanilino)]--3-(2-hidroxietoxi)-2-propanol

xHCl OH rendimento: 10,5$ do valor teórico, cristais alaranjados, p.f. 104°C (decomposição); TLC - sílica gel 60 (Merck) -- fase móvel: tolueno/metanol = 5:1, Rf = 0,13 a partir de 1-[N,N-(2-hidroxietil)-(anilino)]-3-(2-hidro-xietoxi)-2-propanol

OH (este é obtido de 1-[N-(anilino)]-3-(2-hidroxietoxi)-2--propanol

que é obtido a partir de anilina com 1-cloro-3-(2-hidroxietoxi )-2-propanol - rendimento: 21,5$, óleo incolor, TLC: sílica-gel 60 (Merck) - fase móvel: toleuno/acetona = 5:2, Rf = 0,6) por reacção com óxido de etileno na presença de ácido 4 N. Obtêm-se 71 $ de um óleo incolor, TLC: sílica-gel 60 (Merck) - fase móvel : tolueno/acetona 5:2, Rf = 0,43 cloridrato de 1-[N-(2-hidroxietil)-(4-nitrosoanilino)]-3--metoxi-2-propanol

OH X HC1 5'

rendimento: 44,5y5 de cristais amarelos claros, pf. 122°C (decomposição). TLC: sílica-gel 60 (Merck) - fase móvel: cloreto de metileno/metanol = 49*1, Rf: 0,5 a partir de (+)-3-[N-(2-hidroxietil)-anilino]-1-metoxi-2-pro-panol (Patente Imperial Alemã 603 808 (1933) - Friedlãnder 21, 295) (pe.11 212-214°C). c) 2-[(2-metoxietoxi)-etil-(4-nitrosofenil)-amino[-etanol 0=N-i Í_V'\

CH2CH20H CH2CH20CH2CH20CH 3 rendimento: 25$ do valor teórico, resina castanha escura,TLC: sílica-gel 60 (Merck) - fase móvel: cloreto de metileno/metanol = 19:1, Rf = o,49> cloreto de metileno/metanol =5:1,

Rf = 0,49; cloreto /metileno = Rf = 0,77 (através do clori-drato higroscópioo amorfo com NH^); a partir de 2-[(2-metoxietoxi)-etil-(fenil)-aminoetanol (A)

pH2CH20H ch2ch2och2ch2och3 (A) que é obtido a partir de anilina e de 2-metoxietoxi-cloroeta-no (aquecimento durante 1 hora a 90°C e separação por cromato-grafia de coluna através de sílica-gel 60 (Merck) com tolueno/ /acetato de etilo = 5:1. A N-(2-metoxietoxi-etil)-anilina as^ sim formada (Rf = 0,69,óleo incolor)

ch2ch2och2ch2och3 transformar-se em (A) com um óleo incolor, TLC: sílica-gel 60 (Merck) - fase móvel: tolueno/acetona = 5:1, Rf = 0,31, com = 42 =

óxido de etileno e ácido acético 4N. d) 2-[2-(2-metoxi)-etoxi)-etil)etoxi)-4-(nitroso-fenil)- -amino]-etanol

CHoCH_0H / 2 CH2CH2QCH2CH20CH2CH206H2CH20CH3 rendimento 63% do valor teórico, óleo verde, TLC: sílica-gel 60 (Merck) - fase móvel: tolueno/acetona = 1:5, Rf = 0,64 a partir de 2-[2-(2-(2-(2-metoxi)-etoxi)-etoxi)-etil)-4--(fenil)-amino]-etanol. 0 composto de partida foiproduzido do seguinte modo: 20,5% do rendimento teórico de um óleo amarelo, Rf = 0,5

CH2CH20CH2CH20CH2CH20CH2CH2C1 é obtido a partir de anilinase de éter dietilglicol-bis-(2--cloroetílico) (Perry, Hibbert Can. J. Res. 1j4, 81 ( 1936) por aquecimento a 140°C durante 4 horas e separação subsequente por cromatografia de coluna em sílica-gel 60 (Merck) com tolueno/ /acetato de etilo = 2:1. A sua reacção com óxido de etileno em ácido acético 4N produz quase quantitativamente

com um óleo amarelado, TLC: sílica-gel 60 (Merck) - fase móvel: : cloreto de metileno/metanol = 19:1, Rf* = 0,61.

Utilizando NaOCH^ em metanol (aqueci- = 43 =

mento durante 24 horas ao refluxo, evaporação, adição de água, tomado em acetato de etilo e purificação subsequente do produto bruto por cromatografia de coluna sobre sílica gel 60 (Merck) com tolueno/acetona = 5:2) obtém-se com 51,3% do rendimento teórico o produto na forma de um óleo incolor, Rf = = 0,21.

Exemplo 13

Tris-cloridrato de N-(4-nitrosofenil)-N-[(2-dietllamino)-etil]--Ν,Ν’-άχβίϋ-1,2-etano-diamina 0=N'

ch2ch2n(c2h5)2 ch2ch2n(c2h5)2 x HC1 p.f. 125°C (decomposição) TLC: sílica-gel 60 (Merck) - fase móvel : isopropanol/acetato de n-butilo/água/amónia concentrada = 50:30:15:5, Rf = 0,56 a partir de N-[di-(2-dietilamino)etil]-anilina.

Exemplo 14

Produção de 4-(4-nitrosofenil)-piperazinas 1-N-substituídas

R a) dicloridrato de 1-metil-4-(4-nitrosofenil)-piperazina

0=N

N-CH, x 2HC1 17,62 g (0,1 mol) de 1-metl.l-4-fenil-piperazina (40,1 % do = 44 =

- rendimento teórico, pe.Q 82-84°C, Rf = 0,31, que é obtida como um lqiuido incolor a partir de 0,3 moles de 1-fenil-piperazina por aquecimento a 150°C durante 4 horas com 0,2 moles de fosfato de trimetilo, isolamento por adição de soda cáustica e extracção com éter dietílico e purificação por cro-amtografia de coluna em sílioa-gel 60 Merck com cloreto de me-tileno/metanol = 5:1, (de acordo com Stewart et al, J. Org. Chem. 1_3, 134 (1948) são dissolvidos numa mistura de 20 ml de ácido clorídrico concentrado e 10 ml de água, seguidamente adi-ciona-se gota a gota uma solução de 8 g (0,12 mol) de nitrito de sódio em 16 ml de água a 0-2°C, durante 15 minutos, e agita-se durante mais 30 minutos a 10°C Adiciona-se à mesma temperatura 60 ml de amónia aquosa concentrada, mantendo-se o arrefecimento, dilui-se por adição de 100 ml de água e a solução castanha avermelhada (pH 9) é extraída 3 vezes agitando com 100 ml de cloreto de metileno de cada vez, a fase orgânica é seca com sulfato de sódio, é aspirada e evaporada. 0 resíduo (20,6 g de cristais verde-musgo) é tomado em 40 ml de metanol e submetido a reacção cpm 20 ml de ácido clorídrico etérico saturado mediante arrefecimento. Obtêm-se 15,8 g de título depois da remoção por aspiração e lavagem 2 vezes com 20 ml de éter, pf. 187-189°C (decomposição), TLC: sílica-gel 60 (Merck) -fase móvel: cloreto de metileno/metanol = 5:1, Rf = 0,72.

Analogamente preparam-se os seguintes compostos ; b) dicloridrato de 4-(4-nitrosofenil)-1-piperazino-etanol

N-CH2CH20H x 2HC1 a partir de 2-(4-fenil-piperazino)-etanol (Kremer, J. Amer. Chem. Soc. f[8, 379 ( 1963)) como cristais cinzentos claros: purificado por recristalização em metanol/água = 7:1, pf. 170--173°C (decomposição) TLC: sílica-gel 60 (Merck)- fase móvel: : cloreto de metileno/metanol = 5:1, Rf = 0,67. = 45 = c) dicloridrato de 3-[4-(4-nitrosofenil)-1-iperazinil]-1,2--propanodiol 0=Nh

N-CHoCHCHo0H Ί OH x 2HC1 a partir de 1-fenil-4-(2,3-dihidroxipropil)-piperazina (H. Howell et al, J. Org. Chem. 27, 1711 (1962)) como cristaisv ver des , pf. 163°C (decomposição)-TLC: sílica-gel 60 (Merck) fase móvel: acetato de etilo/metanol = 2:1, Rf = 0,41. d) dicloridrato de 4-(4-nitrosofenil)-*<-(metoximetil)-pipe-razino-1-etanol

x 2HC1 a partir de 1-fenil-4-(2-hidroxi-3-metoxipropil)-piperazina (H. Howell et al, J. Org. Chem. 27, 1711 (1962)) como cristais amarelos, pf. 162°C (decomposição) - TLC: sílica-gel 60 (merck) -fase móvel: cloreto de metileno/metanol = 19:1, Rf= 0,51. e) dicloridrato de 2-[2-[4-(4-nitrosofenil)-1-piperazinil]--etoxi]-etanol 0=N-

7 \N / \\_/ N-CH2CH20CH2CH20CH3 x 2HC1 a partir de 2-[2-[4-(fenil)-1-piperazinil]-etoxi-etanol (obtido a partir de 2 moles de 1-fenilpiperazina e 1-[2-cloroetoxi] -2-metoxietano (este último de acordo com a Patente Americana 2 837 574) como cristais verdes, pf. 134°C (decomposição)-TLC: sílica-gel 60 (Merck)-fase móvel: acetato de etilo/metanol = = 5:1, Rf = 0,31. = 46

f) dicloridrato de 1-(1,4-dioxanilil)-metil-4-(4-nitroso-fenil)-piperazina

x 2HC1 a partir de 1-(1,4-dioxanilil)-metil-4-(fenil)-piperazina (obtida por aquecimento de 1-cloro-3-(/*-hidroxietoxi)-2-pro-panol (M. S. Kharash, W. Nudenberg, J. Org. Chem. 8, 189 (1943) durante 5 horas com 1-fenilpiperazina a 130UC, extracção com acetato de etilo e evaporação.Purificação por cromatografia de coluna em sílica-gel 60 (Merck)-fase móvel:tolueno/acetona = =5:2) na forma de cristais amarelos esverdeados, pf. 166°C (decomposição), TLC: sílica-gel 60 (Merck)-fase móvel:tolueno/metanol = 5:1. Rf = 0,69.

Exemplo 15

Nitroso-heterociolos a) cloridrato de 5-nitroso-1-indolinoetanol

x HC1 0 composto nitroso é obtido a partir de 1- -indolinoetanol (obtido por aquecimento de 1 mol de indolina com 1 mol de 2-cloroetanol na presença de 1 mol de carbonato de potássio finamente moído, ao refluxo, produzindo 63,8% de rendimento teórico de um óleo incolor, pe.Q ^ 128-130°C, TLC: :sílica-gel 60 (Merck)-fase móvel: tolueno/acetona = 5:2, Rf= =0,42) e é isolado como base depois da adição de amónia com cloreto de metilenoi É convertido no cloridrato com ácido clo- o

rídrico etéreo. Obtêm-se cristais castanhos claros, p.f.180 C = 47 = TLC: sílica-gel 60 (Merck)-fase móvel : cloreto de metileno/me tanol = 5:1, Hf = 0,51 b) Cloridrato de 1-metil-6-nitroso-1,2,3,4-tetrahidroquino

0=N x HC1

CH 3 0 composto de título é preparado a partir de 1-metil-1,2,3,^-tetrahidroquinolina (obtida a partir de 1,2,3,4-tetrahidroquinolina por aquecimento com fosfato de tri metilo (de acordo com Huisgen et al, Chem. Ber. 92, 203 (1959). 0 produto bruto é produzido de maneira habitual analogamente aos exemplos 10 e 11 e é purificado sobre sílica-gel 60 (Merck) com isopropanol/acetato de n-butilo/água = 5:3«2. O composto de título é obtido dissolvendo este em acetona após adição de ácido clorídrico etéreo, pf. 123-124°C (decomposição) TLCtsíli-ca-gel 60, fase móvel: isopropanol/acetato de n-butilo/água= = 5:3:2, Rf = 0,7. c) cloridrato de 6-nitroso-3,^-dihidro-1(2H)-quinolino-etanol

0=N

x HC1 ch2ch2oh 0 composto de título é obtido a partird de 2— (3,4-dihidro-2H-quinolino-1-il)-etanol (Zaheer et al, Ind;i.an J. Chem. 1_, 479 (1963), pe^ 140-144°C). O produto bruto é puri ficado por cromatografia de coluna sobre sílica-gel 60 (Merck) fase móvel:cloreto de metileno/metanol = 19:1. Obtém-se o com- = 48 =

Claims (1)

1. I I

   eESsrrrv»' posto de título com 10,5% do rendimento teórico, na forma de cristais de cor oore, por precipitação do cloridrato a partir de isopropanol em ácido clorídrico etéreo e recristalização em etanol, pf. 193—195°C (decomposição), TLC: sílica-gel 60 (Merck) -fase móvel: cloreto de metileno/metanol = 19:1, Hf = 0,36. = REIVINDICAÇÕES = - 1S _ Método para a determinação electroquímica de um analito na presença de uma oxireductase e de uma substância re-ductível que transfere electrões libertados durante o curso da reacção de determinação, da oxidorreductase para um eléctrodo,e deste modo conduz a um sinal que é uma medida para o açalito a ser determinado, no qual a substância reductível é reduzidae en-zimaticamente e oxidada no elêctrodo , caracterizado por a subs^ tância que se forma no elêctrodo por oxidação ser diferente da substância reductível usada inicialmente. - 2â - Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a substância reductível usada inicialmente, bem como a substância que se forma no elêctrodo por oxidação, serem reduzidas pela e oxidoreductase. - 3S - Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 e 2, caracterizado por o composto usado como substância reductível ser um composto que aceita electrões produzidos durante o curso da reacção de determinação pela oxidoreductase, formando deste modo uma amida aromática rica em electrões. _ l|ã _ Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por ser usado como substância reductível um composto do grupo de composto de fórmula geral I X - R (I) = 49 =

   na qual R representa um resíduo aromático rico em electrões e X representa NO ou NHOH, e compostos de fórmula geral II HO - N = Y (II) na qual Y representa um sistema quinoide que se pode tornar rico em electrões no estado aromático que se forma por redução. - 5* - Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se usar como oxidoreductase uma oxi-dase, uma desidrogenase ou diaforase não dependentes de NAD(P). - 6^ - Método para a determinação electroquímica de uma oxidoreductase na presença de um correspondente substrato enzi mático e de uma substância reductível que seja capaz de transferir electrões da oxidoreductase para um eléctrodo e, deste modo, conduzir a um sinal que é uma medida para o enzima a ser determinado, sendo deste modo a substância reductível reduzida enzimaticamente e oxidada junto ao eléctrodo, caracterizado por a substância que se forma por oxidação no eléctrodo ser di^ ferene da substância reductível usada inicialmente. - 7® - Sistema de eléctrodo sensor para a determinação electroquímica de um analito numa amostra líquida contendo pelo menos dois agentes electricamente condutores que estão presentes isolados um do outro e que podem ser r,postos, cada um, em contacto eléctrico com a amostra a ser examinada por meio de uma superfície electricamente condutora na. qual pelo menos uma das superfícies electricamente condutoras contacta uma oxidore ductase e uma substância reductível que é capaz de transferir electrões entre a oxidoreductase e a superfície electricamente condutora, caracterizado por se utilizar como substância reduc-• tível um composto que, depois da redução pela oxidoreductase,é . oxidado na superfície electricamente condutora a uma substância 50 =

   que é diferente da substância reductível usada inicialmente. - 8s - Sistema de electrodo sensor de acordo com a rei_ vindicação 7» caracterizado por a substância reductível usada inicialmente, como o composto formado na superície electrica-mente condutora por oxidação, serem reduzidos pela oxidoreduc-tase. - 9* - Sistema de electrodo sensor para a determinação electroquímica de uma oxidoreductase numa amostra líquida contendo pelo menos dois agentes electricamente condutores que estão presentes isolados um do outro e que podem cada um, ser pos_ tos em contacto eléctrico a ser examinado por meio de uma super fície electricamente condutora na qual pelo me4nos uma das superfícies electricamente condutoras contacta um substratod de òxidorereductase e uma substância reductível que é capaz de transferir eléctrSes entre a oxidoreductase e a superfície elec tricamente condutora, caracterizado por se utilizar como substância reductível um composto que,, após redução pela oxidoreductase, é oxidada na superfície electricamente condutora a uma substância que é diferente da substância reductível usada inicialmente . - 10â - do Processo para a preparação de umcomposto derisra-de nitrosoanilina de fórmula geral III

   (III) na q>ual 1 R representa hidrogénio, halogéneo, alcoxi ou alquiltio, 2 r R representa um resíduo de alquilo e „3 representa um . '.resíduo de hidroxialquilo ou K 2 *3 R e R são iguais ou diferentes e representam um resíduo de dialquilaminor.lquilo, um resíduo de hidroxialquilo oud de alcoxialquilo substituído, se desejado, por OH na parte al 51 t quilo, ou um resíduo de polialcoxialquilo que está substituído se desejado, por um resíduo hidroxi na parte alquilo ou 2 3 R e RJ formam um resíduo alquileno interrompido por enxofre ou azoto e que está substituído por um resíduo alquilo, hidro-xialquilo, hidroxialcoxialquilo, alcoxihidroxialquilo , dioxanil lil-alquilo ou polialcoxialquilo, cada um dos quais está ele próprio substituído, se desejado, na parte alquilo por um res_í duo hidroxi, ou 1 2 3 2 se R estiver na posição orto relativamente a NR R , R con- Ί juntamente com R representa também um resíduo alquileno em 3 , que R representa então um resíduo hidroxialquilo ou, se o resíduo alquileno contiver 3 átomos de carbono, representa tam- frém, se desejado, um resíduo alquilo, ou se R não represen- 2 3 tar hidrogénio, R e RJ são iguais ou diferentes e cadau um re presenta um resíduo hidroxialquilo, ou de um seu sal deste composto , caracterizado por se fazer reagir com um nitrito um composto de fórmula geral IV

   (IV) 12 3 na qual R , R e R têm os significados anteriormente indicados. A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente alemão apresentado em 3 de Fevereiro de 1990, sob o No. P 40 03 194.2. Lisboa, 1 de Fevereiro de 199.1.

   = 52