HUT59756A

HUT59756A - Method and sensing electrode system for electromechanical detecting analite or oxidoreductase, as well as the application of the compounds suitable for said detection

Info

Publication number: HUT59756A
Application number: HU91367A
Authority: HU
Inventors: Joachim Hoenes; Juergen Schaeffler
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1990-02-03
Filing date: 1991-02-01
Publication date: 1992-06-29
Also published as: JPH04213051A; IE910343A1; AU2108692A; FI910498A; EP0441222A2; ATE146524T1; NO910394L; JP2708281B2; CN1026248C; US5122244A; DE4003194A1; PT96636A; CS26191A2; AU7018391A; EP0441222A3; KR940008083B1; PL288920A1; MX24356A; CN1054666A; NZ236931A

Description

A találmány valamilyen analitnak egy oxidoreduktáz és egy redukálható anyag jelenlétében történő elektrokémiai meghatározásra szolgáló eljárásra vonatkozik. Ezen meghatározási reakció során az oxidoreduktázból eredő elektronok egy elektródra jutnak át és igy egy jelet eredményeznek, ami mértéke a meghatározni kívánt analitnak. Emellett a redukálható anyag redukálva és az elektródon oxidálva lesz. A találmány vonatkozik a megfelelő eljárásra, melynek célja egy oxidoreduktáz elektrokémiai meghatározó se. valamilyen enzimszubsztrátum és a fentiekben jellemzett redukálható anyag jelenlétében.

Ezenkívül a találmány vonatkozik még egy olyan szenzorelektrócL-rendszerre is, amely legalább kétféle, elektromosan vezetőképes anyagot tartalmazó próbában levő analitnak elektrokémiai meghatározására szolgál. A legalább kétféle elektromosan vezetőképes anyag egymástól izoláltan van és ezek egy elektromosan vezetőképes felület segítségével elektromos összeköttetésbe hozhatók a vizsgálandó próbával, mimellett az elektromosan vezetőképes felületek közül legalább az egyik egy oxidoreduktáz és egy redukálható anyag, melyek képesek elektronokat az oxidoreduktáz és az elektromosan vezetőképes felület között átvinni, az említett összeköttetést megvalósítjuk, illetőleg a találmány tárgya még a megfelelő szenzorelektród-rendszer oxidoreduktáz meghatározására, mimellett az elektromosan vezetőképes felületek közül

V legalább az egyik egy oxidoreduktáz-szubsztátum, ami érintkezésbe van hozva valamilyen, a fentiekben jellemzett redukálható anyaggal.

A találmány végül bizonyos vegyületek alkalmazására is vonatkozik, melyeknek elektronátvivő szerepük van egy oxidoreduktáz és egy elektrokémiai rendszerben levő elektród között.

Valamilyen analitnak egy folyadékban történő meghatározására szolgáló kolorimetriás módszerekkel szemben — ahol a kiértékelés vizuálisan vagy fotometriásan történik — a megfelelő elektrokémiai meghatározás azzal az előnnyel jár, hogy az elektrokémiai reakció közvetlenül áramot szolgáltat, amit koncentrációra lehet átszámítani. Kolorimetriás eljárásoknál ezzel ellentétben kerülőuton [ telep (áramforrás)—ξ» ---* áram ---* fény ---maradék fény (remisszió vagy transzmisszió) ---*· áram --» mérési érték ] kell haladni.

Elektrokémiai meghatározási eljárásokhoz szükséges, hogy a meghatározni kivánt analitot oxidáljuk, vagy azt kémiai vagy enzimatikus módszerekkel valamilyen oxidálható anyaggá alakítsuk át. Valamilyen analitnak vagy belőle levezetett anyagnak elektród felületén történő közvetlen elektrokémiai oxidációja magas értékű feszültségeket (vagyis potenciálokat) követel meg. Ez az eljárás igy nem eléggé szelektív és a szelektivitás hiánya nagyfokú. Sok más anyag, melyek ugyancsak jelen lehetnek a vizsgálni kivánt próbában, ugyancsak oxidálódnak. Egy ilyen eljárás ezért analitikai célokra gyakorlatilag nem jön tekintetbe.

Ezért az oxidálható analitot vagy az analitból levezetett oxidálható anyagot szokásosan egy megfelelő oxidoreduktázzal és egy redukálható anyaggal — melynek redukált alakja elektródán ismét oxidálható — viszik reakcióba. Ennek során az oxidálható analitot, illetve az analitból levezetett oxidálható anyagot az enzim szelektiven oxidálja. Az ennek következtében redukálódott enzimet a jelen levő redukálható anyag oxidálja és a már redukált redukálható anyagot az elektródon oxidálják. Következésképpen a redukálható anyag az enzimről az elektródra irányuló elektronátvivőként szolgál. Előfeltétel tehát, hogy a redukálható anyagot úgy válasszák meg, hogy az gyorsan és specifikusan reagáljon az enzimmel és az elektródon egyaránt.

P.W. Carr és szerzőtársai a Theory and applications of enzyme electrodes in analytical and clinical chemistry” Címül Wiley kiadás (New York, 1980), cimü publikáció 197 - J10. oldalán leírják a glükóznak oxigénnel — mint redukálható anyaggal — glükózoxidázzal, mitjn enzimkatalizátorral végzett reagáltatását, valamint a keletkezett hidrogén-peroxidnak elektród segítségével végzett kimutatását. Ennek során hátrányosnak bizonyultak a hidrogén-peroxid mellékreakciói, az említett vegyület ugyanis önmagában véve is

- 5 erős oxidálószer, továbbá azok a mellékreakciók, melyek az elektródfelületen az alkalmazott magas pozitív feszültség folytán jönnek létre. Ez az eljárás ennélfogva speciális előzetes elkülönítési műveleteket tesz szükségessé a vizsgálandó próbákban levő zavaró alkotóelemek kizárása végett. Hátrányos továbbá az oxigénszükséglet, különösen nagy glükózkoncentráció esetén. A levegőből a próbába történő, valamint a próbán belüli oxigéndiffuzió ugyanis sebességet meghatározó tényező és ilyen körülmények között a módszerrel kapott eredményeket meghamisítja.

Az EP-A-0 125 137 számú szabadalmi publikációban le van írva egy szenzorelektród-rendszer, ami valamilyen anyagkeverék egyik komponensének meghatározására szolgál. Ebben legalább kétféle, elektromosan vezetőképes anyag van, melyek minden esetben egymástól izolálva fordulnak elő és a vizsgálni kívánt próbával egy elektromosan vezető felület révén elektromos érintkezésbe vihetők, mimellett ezen elektromosan vezetőképes felületek egyike egy oxidoreduktáz és egy úgynevezett ”mediátorvegyület”, ami az elektronokat az említett enzim és az elektromosan vezetőképes felület között átviszi. A művelet í az érintkezés létrehozása és mediátorvegyületként olyan szerves fémvegyületet alkalmaznak, mel legalább két szerves gyűrűje van, melyek közül mindegyik legalább két konjugált kettős kötést tartalmaz és emellett a fématom elektronjai ezen gyűrűk között oszlanak meg. Előnyös médiátőrként — csakúgy mint az EP-A-0 0?8 6J6 számú szabadalmi publikációban — ferrocént vagy ferrocénszármazékokat alkalmaznak. Emellett ügyelni kell arra, hogy az ilyen vegyületeket előbb oxidálni kell, például ferrociniumionná, mielőtt az oxidoreduktázból származó elektronok átvitelére alkalmazást nyernek. Ez úgynevezett felfutó áramokat okoz, ami már analit jelenléte nélkül is bekövetkezik és ami amperometriás eljárásnál — ahol a fellépő áram mértéke a meghatározni kívánt analitnak — természetesen zavaróan hat. Az ilyen szerves fémve gyű. letek nehéz oldhatósága hátrányos, továbbá mivel ez az oxigénnek előnyben részesítéséhez vezet, például oxidázok, igy oxidoreduktázként a glükózoxicLáz alkalmazásánál, ami speciálisan alacsony értékű enzimszubsztrátum-koncentrációknál kevés áramot és ezzel oxigénfüggőséget eredményez. A nehéz oldhatóság és/vagy a kicsiny koncentrációban való alkalmazás az ilyen redukált formában használt elektronátvivőknél egy előfeltétel a még elfogadható felfutási áramok számára.

A technika állásából kifolyólag ismert és elektrokémiai meghatározási eljárásokhoz alkalmas elektronátvivőkre általában véve jellemző, hogy azokat a meghatározni kívánt analit jelenlétében valamilyen oxidoreduktázzal redukálják és egy elektródon a kiindulási vegyületté visszaoxidálják. Amennyiben az elektronátvivőként funkcionáló redukálható anyag koncentrációja lényegesen kisebb a meghatározni • 9» · « 4

- 7 kívánt analit koncentrációjánál, úgy csak kinetikus módszereket lehet megvalósítani. Végpont-meghatározásokhoz szükséges, hogy az elektronátvivőként funkcionáló redukálható anyag a meghatározni kívánt analithoz képest feleslegben oldva legyen avégett, hogy a meghatározni kívánt analit teljesen átalakuljon. Ilyenkor a meghatározni kívánt analitnak a redukálható anyaggal arányos része lép reakcióba. A kinetikus méréssel szemben különös előny az amperometriás eljárásnál az áram/koncentráció-összefüggés linearitási tartományának szélesebbé válása, valamint a magasabb koncentrációban levő redukálható anyag jobb versenyképessége oxigénnel szemben, oxidoreduktázként oxidázok alkalmazásánál. Hátrányos vonás viszont, hogy a redukálható anyagot a teljes átalakulás érdekében — vagyis egy oxidálószert mint elektronátvivőt — jelentősen az enzimszubsztrátumét meghaladó potenciállal szükséges alkalmazni és ezen túlmenően az elektrokémiai meghatározásnál az oxidálószer feleslegének jelenlétében kell dolgozni, ami a szükséges potenciált még tovább növeli. Mégis a magas munkapotenciálok kedveznek a nem specifikus elektródreakcióknak, különösen akkor, amikor olyan próbákat kell vizsgálni, melyekben a meghatározni kívánt analiton kívül még számos más alkotóelem is van.

Eddig valamilyen analitnak enzimatikus redoxreakció utján végzett elektrokémiai meghatározására kielégítő megoldás még nem volt. Hiányoztak az univerzálisan elektron» ♦ ♦ * · · <

• · « · «« · átvivőként funkcionáló redukálható anyagok, melyek oxidoreduktázokkal gyorsan reagálni képesek, és ezzel együtt a reakciójuk nem gátolt az potenciál esetén sem.

elektródf «^leteken, még alacsony

A jelen találmány feladata és célkitűzése igy az volt, hogy ezt a problémát megoldjuk. Különösen olyan redukálható anyagokat kellett találnunk, melyek elektrokémiai rendszerben egy oxidoreduktáz és egy elektród közötti elektronátvivőként funkcionálni képesek. A célkitűzésre a szabadalmi igénypontokban jellemzett találmány adja a megoldást.

A találmány tárgya: eljárás valamilyen analitnak egy oxidoreduktáz és egy redukálható anyag elektrokémiai utón történő meghatározására, melynek során a meghatározási reakcióban az oxidoreduktázból származó elektronok egy elektródra kerülnek át és igy egy jelet eredményeznek, ami mértéke a meghatározni kívánt analitnak, mimellett a redukálható anyagot enzimatikusan redukáljuk és az elektródon oxidáljuk, azzal jellemezve, hogy az elektródon oxidáció által keletkezett anyag különbözik az eredetileg használt redukálható anyagtól.

A találmány további tárgya : eljárás egy oxidoreduktáz elektrokémiai meghatározására megfelelő enzimszubsztrátum és valamilyen redukálható anyag jelenlétében, ami képes arra, hogy az oxidoreduktázról elektronokat vigyen át egy *

- 9 elektródra és ezáltal egy jelet eredményezzen, ami mértéke a meghatározni kivánt enzimnek, mimellett a redukálható anyag enzimatikusan redukálva és az elektródon oxidálva lesz, azzal jellemezve, hogy az elektródon oxidáció által keletkezett anyag különbözik az eredetileg használt redukálható anyagtól.

A találmány tárgyát képezi ezeken kívül valamilyen anyag alkalmazása elektrokémiai rendszerben oxidoreduktáz és egy elektród közötti elektronátvivőként, ami oxidoreduktázból származó elektronokat képes felvenni elektrondus aromás amin keletkezése közben.

Még további tárgya a találmánynak egy szenzorelektród-rendszer valamilyen analitnak folyékony próbában történő meghatározásához, ami legalább kétféle— elektromosan vezetőképes és egymástól szigetelten levő — anyagot tartalmaz és elektromosan vezetőképes felület segítségével minden esetben elektromos összeköttetésbe hozható a vizsgálni kivánt próbával, mimellett az elektromosan vezetőképes felületek közül legalább az egyik egy oxidoreduktáz és egy redukálható anyag, amely képes arra, hogy elektronokat vigyen át az oxidoreduktáz és az elektromosan vezetőképes felület között, az érintkezést létrehozzuk, azzal jellemezve, hogy redukálható anyagként olyan vegyületet alkalmazunk, ami az oxidoreduktáz által történő redukciót követően az elektromosan vezetőképes felületen egy olyan anyaggá oxidálódik, * · 4 4 ·4 ·«« 4 4 4 ♦ ··

4 4.4444 • 4 44··«·

... .··. .4 4··.·

- 10 ami az eredetileg alkalmazott redukálható anyagtól különbözik.

Továbbmenően a találmány tárgya még egy olyan szenzorelektród-rendszer folyékony próbában levő oxidoreduktáznak elektrokémiai meghatározásához, ami legalább kétféle — elektromosan vezetőképes és egymástól szigetelten levő — anyagot tartalmaz és elektromosan vezetőképes fejlet segítségével minden esetben elektromos összeköttetésbe hozható a vizsgálni kívánt próbával» mimellett az elektromosan vezetőképes felületek közül legalább az egyik egy oxidoreduktáz-szubsztrátum és egy redukálható anyag, amely képes arra, hogy elektronokat vigyen át az oxidoreduktáz és az elektromosan vezetőképes felület között, az érintkezést létrehozzuk, azzal jellemezve, hogy redukálható anyagként olyan vegyületet alkalmazunk, ami az oxidoreduktáz által történő redukciót követően az elektromosan vezetőképes felületen egy olyan anyaggá oxidálódik, ami az eredetileg alkalmazott redukálható anyagtól különbözik.

Végezetül a találmány tárgyához tartozik még a találmány szerinti szenzorelektród-rendszer előállításához egy olyan anyag alkalmazása, amely egy oxidoreduktázból elektronokat képes felvenni, elektronban gazdag aromás amin képződése közben.

Azt találtuk, hogy a technika állásából ismertté vált « «4 44 4 •4 «44 4« · * « · <«4 44 4 • 4 « 4444 4 ··· ···· 44 · ♦44·

- 11 és valamilyen analitnak oxidoreduktáz és egy redukálható anyag jelenlétében végzett elektrokémiai meghatározására irányuló eljárások hátrányait legnagyobbrészt el lehet kerülni egy nem reverzibilis reakció révén. Ilyen hátrány, hogy a szükséges potenciál értéke magas, különösen ha ezt az elektronátvivőként funkcionáló redukálható anyagnak a meghatározni kivánt analithoz képest feleslegben történő alkalmazása okozza. Azáltal, hogy az elektródon egy másféle oxidált anyag keletkezik, mint amilyent eredetileg alkalmaztunk redukálható anyagként, az elektrokémiai meghatározást különösen alacsony potenciálon és ennek folytán zavaró reakciók veszélye nélkül lehet megvalósítani. Az alacsony potenciállal járó előnyt akkor is ki lehet használni, amikor az elektronátvivőként funkcionáló redukálható anyagot csak kisebb mennyiségben alkalmazzuk a meghatározni kivánt analithoz képest ; nevezetesen akkor, amikor mind az eredetileg alkalmazott redukálható anyagot, mind az elektródon oxidáció által keletkezett anyagot az elektrokémiai eljáráshoz szükséges oxidoreduktáz redukálja. Amennyiben mind az eredetileg használt redukálható anyagot, mind az elektródon oxidáció révén keletkezett anyagot oxidoreduktázzal ugyanolyan (vagyis azonos) anyaggá redukáljuk, az eredetileg alkalmazott redukálható anyag készletformaként szerepel egy második redukálható anyag számára, amely az elektród és az enzim közötti körfolyamatban vesz részt és ami az eredetileg alkalmazott redukálható anyagtól különbözik.

« ««

·«♦

- 12 A találmány szerinti eljárás előnyei azon feltételhez kötődnek, hogy redukálható anyagok gyanánt olyanokat választhatunk ki, melyekből enzimatikus redukcióval egy olyan vegyület keletkezik, ami elektródon alacsonyabb feszültségnél már oxidálható. Az elektródon történő oxidációnál ezen uj oxidált anyag ugyanis még nincs számottevő koncentrációban jelen. Eddig az enzimatikusan redukált vegyületet az elektródon vissza kellett oxidálni az eredetileg alkalmazott redukálható anyaggá, igy az magasabb koncentrációban volt jelen és ennek folytán magasabb értékű pozitív potenciálra volt szükség .

A találmány szerinti értelemben a redukálható anyagok gyanánt alkalmazható vegyületek közül azok előnyösek, melyek az alkalmazott oxidoreduktáznak megfelelő szübsztrátum oxidációjánál keletkezett elektronokat átveszik az enzimtől és emellett egy elektrondus amin képeznek. Elektrondus aromás amin alatt itt olyan vegyületet kell érteni, amely elektronra nézve dusabb, mint az anilin és ezen elektrongazdagsága miatt elektródon alacsony potenciálon már oxidálható. Szóba jönnek például az összes anilinszármazékok, melyek egy vagy több +1 vagy/és +M - szubsztituenst, igy hidroxilcsoportot, alkilcsoportot, alkoxicsoportot, aril-oxi-csoportot, alkil-tio-csoportot, aril-tio-csoporto, aminocsoportot, monoalkil-amino-csoportot vagy dialkil-amino-csoportot hordoznak az aromás gyűrűn, vagy az anilin nitrogénatomján.

- 13 Az alkilcsoportok, az alkoxicsoportokha monoalkil-amino- és a dialkil-amino-csoportokban az alkilcsoport” valamilyen 1-6 szénatomos szénhidrogéncsoportot jelent, ami helyettesítve lehet még egy hidroxilcsoporttal, továbbá adott esetben 1-6 szénatomos alkilcsoporttal egyszeresen vagy többszörösen helyettesített aminocsoporttal, még továbbá szabad sav alakjában levő -PO^H^, -SO,,H vagy -CC^H csoporttal, illetve a nevezett savcsoportok sóival, melyek ammóniumsók, alkálifémsók vagy alkálifÖldfémsók lehetnek.

Az aril-oxi- és az aril-tio-csoportok 6-10 szénatomot tartalmazó aromás csoportok, mimellett a fenoxicsoport és a fenil-tio-csoport különösen előnyös.

Az ammóniumsók vagy ammóniumiont (NH⁺), vagy pedig alkil-, aril- vagy aralkilcsoporttal egyszeresen vagy kétszeresen helyettesített ammóniumkationokat tartalmaznak. Az alkil-. és az aralkilcsoportokban az alkilcsoportok jelentése 1-6 szénatomot tartalmazó szénhidrogéncsoport. Az árucsoport ilyen csoportként vagy aralkilcsoport részeként

6-10 szénatomot tartalmazó aromás gyűrűt vagy gyürürendszert jelent, mimellett a fenilcsoport előnyös. Aralkilcsoportként a benzilcsoport előnyös.

Az alkálifémsók előnyösen lítium-, nátrium- vagy káliumsók, mig az alkáliföldfémsók előnyösen magnézium- vagy kalciumsók lehetnek.

• 4 «

- 14 Anilinszármazékok alatt olyan vegyületeket is értünk, melyek egy aromás gyürürendszeren helyettesitetlen, vagy +1 vagy/és +M-helyettesitőkkel, mint például alkilcsoporttal (alkilcsoportokkal) egyszeresen vagy többszörösen helyettesített aminocsoportot hordoznak, mimellett a gyürürendszer egy vagy több aromás vagy/és aliciklusos gyűrűvel anellálva is lehet. Ebben a tekintetben aromás gyűrűként mind a csupán szénatomokból álló aromás, mind a heteroaromás rendszerek szóba jöhetnek. Példaképpen az anellált benzolgyűrűt, naftalingyürüt, valamint az anellált piridingyürüt említjük.

Aliciklusos gyűrűk alatt telitett vagy telítetlen cikloalifás gyűrűket értünk, melyek 5-7 szénatomot, előnyösen 5 vagy 6 szénatomot tartalmaznak.

Az aminocsoport lehetséges alkilhelyettesitői 1-6 szénatomos szénhidrogéncsoportok, melyek maguk is helyettesítve lehetnek hidroxilcsoporttal, továbbá adott esetben 1-6 szénatomos alkilcsoporttal/alkilcsoportokkal egyszeresen vagy többszörösen ^.lyettesitett aminocsoporttal, valamint -PO^H^, -SO^H vagy -CO^H képletü csoporttal, Ezek a -PO^H, -SO^H és -CO2H savcsoportok ebben a formájukban ; vagy pedig valamilyen só formájában, nevezetesen ammóniumsó, alkálifémsó vagy alkáliföldfémsó alakjában lehetnek. Idevonatkozóan mindazok a meghatározások érvényesek itt is, melyeket a fentiekben már megadtunk.

-- 15 A fentiekben a +1 vagy/és +M-szubsztituensekre megadott példákat nem lehet teljes körű felsorolásként érteni. Egyes esetekben a szakember tudni fogja» hogy egy bizonyos adott csoport +1 vagy/és +M-szubsztituens-e, mivel elektronban dús aromás aminokban — melyek a jelen találmány szerint alkalmazhatók — ezen csoportok mind jelen lehetnek.

Redukálható anyagként különösen előnyösek mindazok, melyekből oxidoreduktázból történő elektronátvitel során valamilyen elektronban dús aromás aminhoz jutunk, amit azután elektródon alacsony potenciál mellett oxidálni lehet. Ilyenek az (I) általános képletű vegyületek, ahol

R egy elektondus (elektronban bővelkedő) aromás csoportot és

X -NO vagy -NHOH képletű csoportot jelent, illetőleg a (II) általános képletű vegyületek, ahol

Y jelentése egy kinoidális rendszer, amely redukció után aromás, elektrondusnak nevezhető állapotba kerül.

Elektrondus aromás csoportok alatt itt a fentiekben az elektrondus aromás aminokra nézve megadott lehetőségeket kell érteni.

Az ilyen találmány szerinti redukálható anyagok az • 4 · « • 4

- 16 oxidoreduktázokból történő elektronátvételnél aromás aminokká redukálódnak és elektródon való oxidálásnál nem az eredeti redukálható anyagokká oxidálódnak. Miként az szakember számára ismeretes, elektrondus aromás aminok elektrokémiai oxidációjánál elektronok távoznak az árucsoportból, ami kinoid rendszerű gyököket eredményez, melyek azonban nem kinoid oximok, nem hidroxil-aminok és nem nitrozovegyületek.

Az elektrokémiai utón oxidált vegyületek a maguk részéről az oxidoreduktáztól ismét elektronokat vehetnek át és ilymódon visszaredukálhatók elektrondus szerkezetű aromás aminokká. Ennek folytán lehetséges az is, hogy a találmánynak megfelelő redukálható anyagokat csekély koncentrációban alkalmazzuk a meghatározni kivánt analithoz képest. Ilymódon ezek tartalékformaként hatásosak az oxidoreduktázból történő elektronátvételnél képződő elektrondus aromás aminok számára, melyeket az oxidoreduktáz és az elektród között elektronátvivőként körfolyamatba lehet vezetni.

A találmány szerinti elektronátvivők közül kiemelkedőnek bizonyultak például az alábbiak:

N-( 2-hidroxi-etil)-Ν’-p-nitrozo-fenil-piperazin,

N,N-bisz-(2-hilroxi-etil)-p-nitrozo-anilin, o-metoxi-[N,N-bisz-(2-hidroxi-etil)]-p-nitrozo-anilin, p-hidroxi-nitrozo-benzol,

N-metil-N’-(4-nitrozo-fenil)-piperazin,

p-kinon-dioxim,

N,N-dlmetil-p-nitrozo-anilin,

N,N-dietil-p-nitrozo-anilin,

N-(4-nitrozo-fenil)-morfolin,

N-benzil-N-(5’-karboxi-pentil)-p-nitrozo-anilin,

N,N-dimetil-4-nitrozo-l-naftil-amin,

N,N,3-trimetil-4-nitrozo-anilin,

N-(2-hidroxi-etil)-5-nitrozo-indolin,

N,N-bisz-(2-hidroxi-etil)-3-klór-4-nitrozo-anilin,

2,4-dimetoxi-nitrozo-benzol,

N,N-bisz-(2-metoxi-etil)-4-nitrozo-anilin,

J-metoxi-4-nitrozo-fenol,

N-(2-hidroxi-etil)-6-nitrozo-l,2,3,4-tetrahidrokinolin,

Ν,Ν-dimetil-3-klór-4-nitrozo-anilin,

N,N-bisz-(2-hidroxi-etil)-3-fluor-4-nitrozo-anilin,

N,N-bisz-(2-hidroxi-etil)-3-metil-tio-4-nitrozo-anilin,

N-(2-hidroxi-etil)-N-(2-(2-metoxi-etoxi)-etil)-4-nitrozo-anilin,

N-( 2-hidroxi-etil)-N-(5-metoxi-2-hidroxi-l-propil)-4-nitrozo-anilin,

N-( 2-hidroxi-etil) -N-( 2-hidroxi-etoxi) -2-hidrox.i-l-propil)-4-nitrozo-anilin,

N-(2-hidroxi-etil)-N-(2-( 2-hidroxi-etoxi)-etil)-4-nitrozo-anilin.

A találmány szerinti redukálható anyagként különösen *

• · ·4« · · · • · · 44·· *

44« ·4♦· ·« « · · « «

- 18 előnyös az N,N-bisz-(2-hidroxi-etil) -p-nitrozo-anilin és egészen különösen előnyös az N-(2-hidroxi-etil)-N-(2-(2-hidroxi-etoxi)-etil)-4-nitrozo-anilin.

A találmány szerint alkalmazható (I) általános képletü vegyületek közül számos vegyület már ismert. Újak viszont a (III) általános képletű nitrozo-anilin-származékok és ezek sói, ahol

R¹ hidrogénatomot, halogénatomot, alkoxicsoportot vagy alkil-tio-csoportot jelent, p

R valamilyen alkilcsoportot es

R^ egy hidroxi-alkil-csoportot képvisel, vagy pedig κ és R⁹ azonosan vagy eltérően dialkil-amino-csoportot, az alkilrészben adott esetben hidroxilcsoporttal helyettesített hidroxi-alkoxi-alkil- vagy alkoxi-alkil-csoportot, továbbá olyan poli( alkoxi-alkil)-csoportot jelent, amely az alkilrészben adott esetben hidroxilcsoporttal helyettesítve van, vagy pedig

3

R es R kénatommal vagy nitrogénatommal megszakított alkiléncsoportot jelent, mimellett a nitrogénatom alkilcsoporttal, hidroxi-alkil-csoporttal, hidroxi-alkoxi-alkil-csoporttal, alkoxi-hidroxi-alkil-csoporttal, dioxánilil-alkil-csoporttal vagy az alkilrészben adott esetben hidroxilcsoporttal helyettesített poli(alkoxi-alkil)-csoporttal helyettesítve «· « « ♦ ·4 « •· · « · « · · {« ·*· · · · • · ♦«»« · *···««· ·· « «·*·

- 19 van ; továbbá

2 3 ha R az -NR R általános képletű csoporthoz kepest orto2 1

-helyzetben van, úgy R és R együttesen egy alkilénlancot x

is alkothat, amikor is R hidroxi-alkil-csoport, vagy ameny3 nyiben az alkilénlánc J szénatomot tartalmaz, úgy R adott esetben még alkilcsoportot is jelenthet, valamint

2 3 ha R jelentése hidrogénatomtól eltérő, úgy R és R azonosan vagy eltérően egy-egy hidroxi-alkil-csoportot képvisel.

A fentiekben a halogénatom fluoratomot, klóratomot, brómatomot vagy jódatomot jelent. Különösen előnyös a fluorés a klóratom.

Az alkilcsoport, az alkoxicsoport és az alkil-tio-csoport 1-6 szénatomos csoportokat jelent, melyek közül az 1-3 szénatomot tartalmazó csoportok különösen előnyösek.

Az alkilcsoport ezen fenti meghatározása a hidroxi-alkil-, a clialkil-amino-alkil-, a hidroxi-alkoxi-alkil-, az alkoxi-alkil·-, a poli( alkoxi-alkil)az alkoxi-hidroxi-alkil- és a dioxánilil-alkil-csoportok alkilrészeire nézve is helytálló.

A dioxánilil-alkil-csoport egy olyan csoportot jelent, melynél egy dioxán-gyürürendszer valamilyen alkilcsoporthoz kapcsolódik. Előnyösen 1,4-dioxán-gyürürendszerről, vagyis az alábbi képletnek megfelelő csoportról van szó :

• 4··

A poli(alkoxi-alkil)-csoport az alábbi képletnek felel meg :

alkoxi-(alkoxi) -alkilahol n értéke : 1-10, előnyösen n = 1-4. Különösen előnyös, ha n = 1-5·

Az alkiléncsoport valamilyen egyenes vagy elágazó — előnyösen egyenes — szénláncu, telitett vagy telítetlen — előnyösen telitett — szénhidrogénlánc, amelynek két szabad kapcsolódási helye van és a szénhidrogénláncban 2-5» előnyösen 2-4 szénatom van.

5

Amennyiben H. és A jelentése kénatommal vagy nitrogénatommal megszakított alkiléncsoport, úgy a (III) általános képletben levő nitrogénatomot is beleszámítva a tiomorfolinocsoport, illetve a piperazinocsoport előnyös. Különösen előnyös a piperazinocsoport.

2

Ha R és R együtt alkilénláncot jelent, akkor az aromás gyűrűt is beleértve [(III) általános képlet] az indolinvagy az 1,2,5,4-tetrahidrokinolin-gyürürendszer előnyös.

A találmány szerinti (III) általános képletű nitrozo-anilin-származékok sói közül különösen az erős savakkal, igy a sósavval, a kénsavval, a salétromsavval és a foszfor- • 4 ··· · ·» • · · 4··«· ··· ·«·· ·· ·4·44 savval képezett sók előnyösek. Egészen különösen előnyösek a sósavas sók, vagyis a hidrokloridok.

A találmány szerinti uj nitrozo-anilin-származékok közül mindenekelőtt előnyösek a következők :

a) 2,2*-[(J-fluor-4-nitrozo-fenil)-iminoj-bisz-etanol,

b) 2,2*-[(. 3-klór—4-nitrozo-fenil)-iminoj-bisz-etanol,

c) 2,2’-[(3-metoxi—4-nitrozo-fenil)-iminoj-bisz-etanol,

d) 2,2*-[(3~metil-merkapto-4-nitrozo-fenil)-imino]-bisz-

-etanol,

e) 2-[(2-hidroxi-etoxi)-etil-( 4-nitrozo-fenil)-aminoj-

-etanol,

f) 2-[( 2-metoxi-etoxi)-etil-(4-nitrozo-fenil)-amino]-

-etanol,

g) l-[N-( 2-h.idroxi-etil) -( 4-nitrozo-anilino) ] -3-metoxi-2-propanol,

h) l-[N-( 2-hidroxi-etil) -( 4-nitrozo-anilino) ]-3-( 2-hidroxi-etoxi)-2-propanol,

i) l-metil-4-(4-nitrozo-fenil)-piperazin,

j) 4-(4-nitrozo-fenil)-1-piperazino-etanol,

k) 5-nitrozo-l-indolin-etanol,

l) l-metil-6-nitr ozo-1,2,3,4-tetrah.idr okinolin,

m) 6-nitrozo-3,4-dihidro-l(2H)kinolin-etanol és a fenti vegyületek sói.

Különösen előnyösek a fenti vegyületek közül az : a), *· • ···· ** ? ·· ··· · · · v ···· * • 9 · ····

d), e) , f) , g) és h) jellel jelöltek, valamint ezek sói. Egészen kiemelkedően előnyös az e) vegyület, illetőleg ennek sói, különösen a hidroklorid.

A (III) általános képletű vegyűleteket úgy lehet előállítani, hogy egy (IV) általános képletű vegyületet, ahol R¹, K² és T? jelentése a (III) általános képletű vegyületeknél már megadottal azonos, valamilyen nitrittel reagáltatunk.

Analóg eljárás már ismert a J.J. D’Amico és szerzőtársai által publikált közleményből : J. Amer. Chem. Soc. 81, 5957 (1959)·

Nitritként mindenekelőtt valamilyen alkálifém-nitritet alkalmazunk, mimellett alkálifémként a lítium, a nátrium, a kálium, a rubidium vagy a cézium jön tekintetbe. Előnyösen nátrium- és kálium-nitritet használunk, különösen előnyös a nátrium-nitrit alkalmazása. A reakciót előnyösen savas közegben és alacsony hőmérsékleten valósítjuk meg, melynek mértéke előnyösen 10 °C alatti, még előnyösebben -10 és +5 °C között van.

A (IV) általános képletű vegyület nitrittel történő reakcióját előnyös módon vizes közegben valósítjuk meg. A pH-értéknek előnyösen 3-nál kisebbnek, különösen előnyösen 2-nél kisebbnek kell lennie.

Egy előnyös megvalósítási mód értelmében egy (IV) ál* ·

- 23 talános képletű vegyületet vagy ennek valamilyen sóját, előnyösen ásványi savas , igy sósavas, kénsavas, salétromsavas vagy foszforsavas sóját savas vizes közegben előkészítjük és hütjük, majd ezen reakcióelegyhez az alacsony hőmérséklet fenntartása közben hozzáadagoljuk a nitritet, előnyösen oldott alakban. Előnyös módon a nitrit oldószereként is vizes közeget használunk. A nitrit hozzáadása után a reakció befejeződéséig a reakcióelegyet alacsony hőmérsékleten tartjuk. Feldolgozás céljából a reakcióelegyet előnyösen valamilyen szerves oldószerrel extraháljuk és a terméket az extraktumból izoláljuk.

A találmány szerinti elektronátvivőként alkalmazható vegyületeket oxidált formában tárolni lehet és ezeket igy vehetjük használatba. Ezáltal elkerüljük a felfutási áramokat és a végpont-meghatározásokat az elektronátvivő feleslegével valósíthatjuk meg. A találmány értelmében elektronátvivőként alkalmazható vegyületek stabilan tárolhatók és oxidoreduktázokkal gyorsan reakcióba tudnak lépni. Ezen vegyületek mindenekelőtt oxidázok alkalmazásánál oxigénnel szemben versenyképesek és a meghatározni kívánt analit legnagyobb koncentrációjához képest is feleslegben lehet alkalmazni őket. Különösen a legutóbb említett tulajdonság teszi lehetővé a találmány szerinti elektronátvivők vizes közegben történő alkalmazását a jó vizoldhatóság folytán.

• « · · · • · «

- 24 Különös előnye a találmány szerint elektronátvivőként alkalmazható vegyületeknek azon tulajdonságuk, hogy testfolyadékokban levő analitok elektrokémiai meghatározásánál a testfolyadékokban előforduló redukáló hatású anyagokkal egyáltalán nem, vagy csak jelentéktelen mértékben lépnek nem enzimatikus jellegű redukciós folyamatba. A találmány szerinti elektronátvivők az elektród felületén gyorsan oxidálódnak és redukált formában nem oxigénérzékenyek. Ezekkel a vegyületekkel az elektródon való oxidáció tekintetében már alacsony potenciálnál lehet dolgozni.

A jelen találmány leírásban analit névvel egy meghatározni kívánt anyagot illetünk, mimellett rendszerint egy anyagkeverék egyik komponenséről van szó. Ilyen vonatkozásban a találmány szerinti eljárás mindenekelőtt valamilyen analitnak egy testfolyadékban ( igy vérben, plazmában, szérumban, vizeletben) történő meghatározásánál nyújt előnyöket, mivel itt biológiai értelemben véve igen nagy mértékben sokkomponensü rendszer csupáncsak egyetlen komponensének specifikus reakciójára helyezzük a súlyt.

A találmány szerinti eljárás valamilyen analitnak elektrokémiai meghatározására azon alapszik, hogy magát az analitot egy oxidoreduktázzal oxidáljuk, igy tehát egy megfelelő enzimszubsztrátum keletkezik, vagy pedig az analitot egy vagy több előzetes reakcióban — előnyösen enzimatikus reakcióban — olyan vegyületté alakítjuk át, amit • · · · • · · · · · · • · · · · · · ······· · · *

- 25 egy oxidoreduktáz oxidálni képes. Az ilyen oxidációnál keletkezett elektronok arányosak a meghatározni kivánt analit mennyiségével. Amennyiben ezeket az elektronokat egy találmány szerinti redukálható anyagról elektródra visszük át, úgy ez egy jelet eredményez, ami mértéke a meghatározni kivánt analitnak. Amperometriás eljárás, melynél áramot mérünk, vagy potenciometria, vagyis a feszültség mérése, egyaránt lehetséges módszerek.

A találmány szerinti eljáráshoz oxidoreduktázként az oxidázok, a nem NAD(P)-függő dehidrogenázok vagy a diaforázok előnyösek. így például a találmány szerint glükózt glükózoxidázzal, laktatót laktátoxidázzal, glicerin-foszfátot glicerofoszfát-oxidázzal, koleszterint koleszterinoxidázzal lehet meghatározni. Glükóz meghatározására nem NAD(P)-függő dehidrogenázként például glükóz-dye-oxidoreduktázt alkalmazhatunk. Diaforázt — amelyet NADH : dye-oxidoreduktáznak is lehet nevezni — előnyösen a NADH kimutatásánál alkalmazhatunk.

Azokban az esetekben, melyekben egy olyan analitot kell elektrokémiai módszerrel meghatározni, amely önmagában véve nem szolgál egy oxidoreduktáz számára szubsztrátumként, az ilyen analitot egy vagy több megelőző reakcióval — különösen enzimatikus reakcióval — átalakíthatjuk egy olyan vegyületté, melyet egy oxidoreduktáz szubsztrátumként elfogad. így például triglicerideket úgy lehet meghatározni, hogy ezeket • · * · • · · · 9 9 9 • · · · · · · ······· · · *

- 26 egy észterázzal glicerin- és savmaradékká hasítjuk, majd, a glicerint glicerinkinázzal és ATP-val glicerin-foszfáttá alakítjuk át, végül ezt glicerofoszfát-oxidázzal oxidáljuk és az ennek során valamelyik találmány szerinti elektronátvivőből keletkezett elektronokat átjuttatjuk egy elektródra, amikor is áram lép fel, melynek nagysága a meghatározni kívánt próbában levő trigliceridekkel arányos.

Analóg módon például totálkoleszterint is meghatározhatunk olymódon, hogy a koleszterin-észtereket koleszterinészterázzal hasítjuk és az igy képződött koleszterint koleszterinoxidáz segítségével határozzuk meg. Itt is az a helyzet, hogy az igy keletkezett koleszterin mennyisége és a koleszterinoxidázzal végzett oxidáció során felszabadult elektronok mennyisége — mely utóbbiakat valamelyik jelen találmány szerinti redukálható anyag segítségével egy elektródra viszünk át és ilymódon áram jön létre — arányos a totálkoleszterin meghatározni kívánt mennyiségével.

Az NADH meghatározása számára a diaforáz enzim alkalmazása nyújt lehetőséget. A találmány szerinti redukálható anyagok segítségével elektronokat vihetünk át egy elektródra diaforázzal. Minthogy nagyon sok biológiai anyag átalakítható enzimatikus utón NADH keletkezése közben, ilyen uton-módon lehetséges sokféle analitnak enzimatikus reakciósorozattal NADH-vá történő átalakítása, amit végül is diaforázzal és egy találmány szerint alkalmazott redukálható • · · · ♦ · · • · · · · · « * « · · « 9

- 27 anyaggal elektródon meg lehet határozni.

A fentiekben kifejtettekből magától értetődően következik, hogy a találmány szerint természetesen oxidoreduktázokat is meg lehet határozni, ha egy megfelelő vegyületet, amely enzimszubsztrátűmként elfogadható, valamint egy találmány szerinti redukálható vegyületet alkalmazunk. így például glükózoxidázt elektrokémiai utón meg lehet határozni olymódon, hogy glükózt és egy jelen találmány szerinti elektronátvivőt eg-y megfelelő szenzorelektród-rendszer jelenlétében a meghatározni kívánt próbával érintkezésbe hozzuk.

A találmány szerinti eljárás mindenekelőtt azáltal tűnik ki, hogy az oxidoreduktázból az elektródra történő elektronátvitel céljaira alkalmazott redukálható anyag oxidált formájában tárolás szempontjából stabil és ezen túlmenően vízben jól oldható, ami főleg analitoknak testfolyadékokban — igy vérben, plazmában, szérumban, vizeletben történő meghatározását illetően nagyon fontos dolog. A találmány szerint alkalmazható redukálható anyagoknak gyors reakciójuk van oxidoreduktázokkal és különösen oxidázokkal való reakciónál nagyon jól versenyképesek oxigénnel szemben. Ezen anyagokat oldhatóságuk folytán nagyon jól lehet alkalmazni amperometriás végponteljárásokhoz, ahol követelmény, hogy még a meghatározni kívánt legmagasabb koncentrációjú analithoz képest is feleslegben legyenek. Minthogy a találmány értelmében alkalmazható redukálható anyagok testfolyadékokban csak elhanyagolható mértékben lépnek nem enzimatikus redukciós reakciókba az ott jelenlevő redukálószerekkel, továbbá mert ezek az anyagok elektródok felületén gyorsan oxidálódnak és redukált formájukban oxigénre alig érzékenyek, a szóban forgó anyagok nagyon megfelelnek specifikus és zavaroktól mentes analitmeghatározások céljaira. A zavaroktól mentes és specifikus elektrokémiai analitmeghatározás lehetséges voltát mindenekelőtt az teszi lehetővé, hogy a találmány értelmében alkalmazásra kerülő redukálható anyagok csak csekély mértékű elektródpotenciált követelnek meg.

Egy bizonyos analitnak a találmány szerinti elektrokémiai meghatározására irányuló eljárás nem korlátozódik meghatározott elektrokémiai berendezésekre. Erre például a technika állásából ismert szenzorelektród-rendszereket is alkalmazni lehet. Egy folyékony próbában levő analit meghatározásához alapvetően azok a szenzorelektród-rendszerek alkalmasak, melyek elektródként legalább két elektromosan vezetőképes és egymástól szigetelten levő anyagot tartalmaznak elektródként, melyek a vizsgálandó próbával egy elektromoson vezetőképes felület által elektromos éritkezésbe hozhatók. Emellett lehetséges, hogy csupáncsak két elektródot, nevezetesen egy munkaelektródot és egy referenciaelektródot alkalmazzunk. Lehetséges azonban referencia♦ ♦ • » »

• · ♦ ·

- 29 elektród nélküli mérési elrendezés is, vagyis ami csak munkaelektródból· és ellenelektródból áll. Emellett a feszültséget csak extern módon tartjuk konstans értéken. De három elektród, nevezetesen egy referenciaelektród, egy munkaelektród és egy ellenelektród alkalmazása is lehetséges. A megfelelő szenzorelektród-rendszerek a technika állásából ismertek, igy például G. Henze és R. Neeb Elektrochemische Analytik” c. munkájából, Springer Verlag (1986).

Fontos dolog, hogy egy analit elektrokémiai meghatározása céljából érintkezésbe (vagyis kontaktusba) hozzunk (legalább) egy elektródot — vagyis valamilyen elektromosan vezetőképes felületet — egy oxidoreduktázt, valamint egy redukálható anyagot, ami képes elektronok átvitelére az oxidoreduktáz és az elektromosan vezetőképes felület között. Emellett lehetséges, hogy valamennyi szükséges reagens együtt_z u véve a vizsgálni kívánt próbával oldatba-'legyen, vagy pedig a reagensek egy része, előnyösen az oxidoreduktáz és/vagy az elektronokat átvivő redukáló anyag egy elektródon immobilizálva van és csak a fennmaradó rész legyen oldatban, illetve hogy a meghatározáshoz szükséges reagensek valamennyien egy elektródon immobilizálva legyenek. Egy szenzorelektród-rendszer működése szempontjából alapvetően nem az a döntő kérdés, hogy vájjon a munkaelektród, az oxidoreduktáz és az elektronátvivőként funkcionáló redukálható anyag oldott állapotban érintkeznek, vagy hogy az említett anyagok szilárd formában egy elektródra felvitt állapotban vannak és adott esetben • · · · · · · • ·♦· · · · • · · · · · ·

- 30 azok a meghatározni kívánt próbával való érintkezés után is az elektródon immobilizálva maradnák.

Magától értetődik, hogy a fentiekben leírtak analóg módon egy oxidoreduktáz meghatározására nézve is érvényesek. Azt kell ebben az esetben figyelembe venni, hogy a szenzorelektród-rendszer, egy oxidoreduktáz-szübsztrátum és egy jelen találmány szerinti redukálható anyag kerül kontaktusba. A továbbiakat illetően erre az esetre nézve is a megfelelően érvényesek az analitmeghatározásnál megadott kivitelezési módok.

A mellékelt ábrák a találmányt közelebbről is megmagyarázzák. Nevezetesen :

Az 1. ábra a) része a találmány szerint alkalmazható redukálható anyagok találmány szerinti eljárásban és szenzorelektród -rendszerekben való funkciójához szolgáltat egy sémát arra az esetre nézve, amikor az elektronátvivő koncentrációja a meghatározni kívánt analit koncentrációjánál nagyobb, vagy azzal azonos ;

az 1. ábra b) részén a technika állásához tartozó eljárásokban és szenzorelektród-rendszerekben az elektronátvivő anyagok funkciójának sémája látható.

A 2. ábra a) része a találmány szerint alkalmazható redukálható anyagok találmány szerinti eljárásban és szenzorelektród-rendszerekben való funkciójához szolgáltat egy sémát arra az esetre nézve, amikor az elektronátvivő

- 31 anyag koncentrációja nagymértékben kisebb, mint a meghatározni kívánt analit koncentrációja ;

a 2. ábra b) részén a technika állásához tartozó eljárásokban és szenzorelektród-rendszerekben az elektronátvivo anyagok funkciójának sémája látható.

A 3· ábrán egy szenzorelektród-rendszer van feltüntetve, ami a találmány szerinti eljárás megvalósítására alkalmas, amennyiben a szükséges anyagok oldott állapotban vannak.

A 4. ábrán ugyancsak a találmány szerinti eljárás megvalósításához egy szenzorelektród-rendszer látható, melynek koncepciója egyszer használatos, illetőleg eldobható szenzor.

Az 5· ábra egy diagramot mutat, amely ciklovoltammogrammokból kapott értékből anódos áramsürüség-maximum-értékeket mutat különböző glükózkoncentrációknál·. A diagramot a találmány szerint elektrokémiai glükózteszttel vettük fel, elektródra átvivő anyagként N,N-bisz-( 2-hidroxi-etil)-p-nitrozo-anilint alkalmazva.

A 6. ábrán a találmány szerinti NADH-teszt áramsürüség — NADH-koncentrációviszony közötti összefüggést ábrázoljuk.

A 7. ábra N-(2-hidroxi-etil)-N’-p-nitrozo-fenil-pipe- • ·· ·· · ·9 •· · ·« ·· · · • · ·»· · · · • · ······ ·♦· ···· ·· · ····

- 32 razin és N,N-bisz-( 2-hidroxi-etil) -p-nitrozo-anilin ciklovoltammogrammját szemlélteti.

A 8. ábra bemutatja, hogy miként függ az áramsürüség a glükóz koncentrációjától, ha a találmány szerinti eljárást elektronátvivő anyagként N-metil-N’-(4-nitrozo-fenil)-piperazinnal valósítjuk meg, mégpedig a levegő oxigénjének jelenlétében vagy távollétében.

A 9. ábrán levő diagram ugyancsak az áramsűrűségnek a glükózkoncentrációtól való függését mutatja, amennyiben a technika állásához tartozó eljárás szerint elektronátvivő anyagként tetratiafulvalent használunk és a meghatározást levegő oxigénjének jelenlétében vagy távollétében végezzük.

A lű. ábrán levő diagram szemlélteti, hogy miként függ a találmány szerinti eljárásban az áramsürüség az LDH-koncentrációtól a laktátdehidrogenázzal végzett meghatározási reakció megindítása után eltelt különböző időtartamok alatt, amennyiben elektronátvivő anyagként N,N-bisz-( 2-hidroxi-etil)-p-nitrozo-anilint alkalmazunk.

A 11. ábra a 4. ábrán szereplő egyszer használatos elektróddal a találmány szerinti eljárásban glükóz meghatározásánál felvett áram-idő görbéket mutatja be.

A 12. ábrán az áramnak a glükózkoncentrációtól való

- 35 • · · · · · · • ·»< ♦ · · • ······ függése szerepel 10 másodpercnyi reakcióidő után, amennyiben a találmány szerinti eljárást valósítjuk meg és ehhez a 4. ábra szerinti egyszer használatos elektródot alkalmazzuk.

Az 1. és a 2. ábrán bemutatjuk a találmány szerinti eljárás (a) és a technika állásához tartozó eljárás (b) között fennálló különbségeket, ha az elektronátvivő anyagot a meghatározni kivánt analithoz képest feleslegben alkalmazzuk ( 1. ábra) és amikor az analitkoncentrációhoz képest nagyon csekély mennyiségű elektronátvivő anyagot használunk ( 2. ábra). A technika állásához tartozó eljárás szerint ( 1. ábra b) része ) az elektronátvivő anyagot (Ε _Ί) a meghatározni kivánt analit vagy az analitból levezetett anyag jelenlétében (S ^) — amelyet enzimatikusan oxidálunk — redukált formájába alakítjuk át (^ ^). A redukált elektronátvivőt elektronok leadása által visszaoxidáljuk az eredetileg alkalmazott redukálható anyaggá (Ξ ,) .

Ezzel szemben a találmány szerinti eljárásnak megfelelően ( lásd : 1. ábra a)-része ) az elektronátvivőként funkcionáló redukálható anyagot (Ε _Ί) a meghatározni kivánt analitnak vagy az analitból levezetett anyagnak (S ^) euzimatikus oxidációjánál (S ) átalakítjuk annak redukált formájává (^E _re^)· Valamilyen elektródon végzett anódos oxidációnál azután az elektronátvivő oxidált alakja képződik (^Eox 2^* ^{az ered}etileg alkalmazott redukálható anyagtól (^Ξοχ P különbözik. Az elektrokémiai oxidáció kezdetén az

- 54 Ε _οοχ 2 teljesen hiányzik, emiatt Ε^θ^ már különösen alacsony potenciálnál oxidálható. A találmány szerinti elektronátvivő redukálható anyagot (Ε_οχ -^) úgy lehet megválasztani, hogy az enzimatikusan képezett redukált forma (E anódos oxidációjához viszonylag alacsony potenciál elegendő. Ezáltal elkerülhetők a zavaró kisérőreakciók, melyek akkor jönnek létre, ha magasabb potenciálok alkalmazásánál a vizsgálni kivánt próbákban levő kisérőanyagok oxidálódnak az elektródokon, ami áram folyásához és ezáltal hamis pozitív eredményhez vezet. A technika állásához tartozó eljárásnál ( 1. ábra b) része) az elektronátvivő enzimatikusan képezett redukált formájának (^_re(j_) visszaoxidálásához az Ε _Ί feleslege miatt magasabb potenciál szükséges, mint az eredetileg alkalmazott redukálható anyag (Ε _Ί) esetén.

Amennyiben az elektronátvivőként funkcionáló redukálható anyagot (Ε _Ί) a meghatározni kivánt analithoz, illetőleg a meghatározni kivánt analitból levezetett anyaghoz (S képest a szükségesnél kevesebb mennyiségben (vagyis a‘felesleg’ ellenkezője) alkalmazzuk, úgy a technika állásához tartozó eljárás szerint ( 2. ábra b) része) a redukálható anyagot az elektród és az enzim között körbe lehet vezetni, mert a redukált forma (Ε^θ^) anódosan az eredetileg alkalmazott redukálható anyaggá (E ) visszaoxidálódik.

- 55 A találmány szerinti eljárás értelmében ( 2. ábra a) része) akkor, amikor az elektronátvivőnek az elektródon kialakult oxidált formája (Εθ_{χ 2}) éppúgy a redukált enzimből van redukálva, mint az eredetileg alkalmazott redukálható

stabil készletformaként az Εθ_χ

szer számára.

A találmány szerinti eljárás számára alapvetően minden szenzo'relektród-rendszer alkalmazható, melyek a technika állásához tartozó eljárások megvalósítására is megfelelők, így alkalmazni lehet a 5· ábrán bemutatott szenzorelektród-rendszert, miként az példának okáért a G. Henze és R. Neeb Elektrochemische Analytik” (Springer-Verlag, 1986) c. közleményből ismert.

Itt az (1) munkaelektród, a (2) ellenelektród és a (5) referenciaelektród belemerülnek a meghatározni kívánt, folyékony (4) próbába. Az elektródákhoz a szokásos anyagokat lehet alkalmazni. Az (1) munka- és a (2) ellenelektród például előnyösen valamilyen nemesfémből állhat, vagy ilyen fémek együttes alkalmazásával lehet őket előállítani. Az (1) munkaelektród és a (2) ellenelektród számára előnyös anyagok például az arany és a platina. A (5) referenciaelektród az ilyen célra szokásos rendszerekből lehet felépítve. Előnyös például az ezüst/ezüst-klorid rendszer. A (5) referenciaelektród előnyösen egy sóhidon, példának okáért kálium• · ······ ······· ·· · ····

-klorid-oldaton keresztül van összeköttetésben a többi (1, 2) elektródrendszerrel a meghatározni kívánt folyékony (4) próbában.

A találmány szerinti eljárás számára szükséges oxidoreduktáz, illetve oxidoreduktáz-rendszer (aszerint, hogy valamilyen analitot vagy egy oxidoreduktázt kell meghatározni) és az elektronátvivoként funkcionáló redukálható anyag a meghatározni kívánt (4) próbában lehetnek oldva, vagy pedig valamennyien vagy részben az (1) munkaelektródon vannak.Hogy az egyes elektródokat a mérendő elektromos jeltől függően miként kell elektromosan összekötni és beszabályozni, az szakember számára magától értetődő.

A 4. ábrán egyetlen alkalommal használható elektród szerkezetét és felépítését mutatjuk be, ilyent például glükóz kimutatására (meghatározására) lehet alkalmazni. Egy szigetelő (8) hordozóanyagra, például polikarbonátból készült fóliára, megfelelő módszerekkel fel lehet vinni a szükséges elektródokat és az ezekhez tartozó hozzávezetéseket. A megfelelő módszerek például a következők lehetnek: szitanyomásos, injektáló, felgőzölögtető eljárás, illetve a vékonytilmtechnika. A 4. ábrán látható az (5) munkaelektród, az ehhez tartozó elektromosan vezetőképes (55) hozzávezetések, a (6) referenciaelektród a (66) hozzávezetéssel és a (7) ellenelektród a megfelelő (77) hozzávezető-pályával. Az elektródok és a hozzávezető pályák készítéséhez ··· ·· · · · * • a ····« · • a a aa·· a aaaaaaa ·« · ····

- 37 elektromosan vezetőképes, ismert anyagokat lehet alkalmazni. így például az elektródokhoz vezető, elektromosan vezetőképes hozzávezetések előállításához a kereskedelemben kapható grafit-nyomópasztákat alkalmazhatjuk. Az elektródok többnyire valamilyen nemesfémet, igy ezüstöt, aranyat vagy platinát tartalmaznak. A 4. ábrának megfelelő, találmány szerinti szenzorelektród-rendszerben olyan munkaelektród van, amely tartalmazza azon reagenseket, melyek valamilyen analit, illetőleg egy oxidoreduktáz elektrokémiai meghatározásának megvalósításához szükségesek. így glükóz meghatározásához például glükózoxidázt, valamilyen találmány szerinti elektronátvivő redukálható anyagot, pufferanyagot, ami a vizsgálni kívánt próba pH-értékét az enzimatikus reakcióra nézve optimális értéken tartja, valamint adott esetben egy detergenst és duzzasztószert, hogy a keverék vezetőképességét létrehozó anyaggal elektród készítéséhez szükséges konzisztenciát elérjük és a keveréket ilymóclon paszta formájában feldolgozhatóvá tegyük. Vezetőképességüvé tevő anyagként például grafitport lehet hozzáadni. A (6) referenciaelektródot, a (7) ellenelektródot, valamint a megfelelő (66) és (77) hozzávezetéseket például a kereskedelmi áruként beszerezhető ezüsttartalmu vezetőpasztákból lehet készíteni, ezek porított ezüst-kloridot tartalmaznak. A 4. ábrának megfelelő szenzorelektród-rendszert például 10 x 30 mm méretben lehet készíteni. A vizsgálni kívánt oldatot felvihetjük az elektród felületére, vagy pedig a teszt

-hőhordozóját belemerithetjük a vizsgálni kívánt oldatba olymódon, hogy az elektródfelületek a folyadékkal be legyenek borítva. Amperometriás mérésnél ekkor egy potenciál jön létre és áramot lehet mérni, az áram arányos a meghatározni kívánt analittal.

Ehhez a (7) ellenelektród és az (5) munkaelektród között áramot mérünk és szabályzunk olymódon, hogy a (6) referenciaelektród és az (5) munkaelektród között egy előre megadott feszültséget tartunk fenn. Az (5) munkaelektród és a (6) referenciaelektród közötti feszültségmérés árammentesen történik, úgy hogy a vezetőpályák ellenállásának nincs semmiféle szerepe. Az elektródpotenciálok pontosságát illetően mérsékeltebb követelmények támasztása esetén az árammentes feszültségmérésről le is lehet mondani, vagy pedig a (6) referenciaelektródot egyidejűleg (7) ellenelektródként működtetjük.

A találmányt az alábbiakban következő példákkal közelebbről is megmagyarázzuk:

··· ····

1. példa

Glükózteszt

A 5. ábra szerinti szenzorelektród-rencLszert alkalmazzuk. Az (1) munkaelektród aranyból készült huzal, melynek p

felülete 0,1 cm . A (2) ellenelektród platinahuzal, melynek

P felülete ugyancsak 0,1 cm , mig a (3) referenciaelektród egy ezüst/ezüst-klorid rendszer, melynek előállítója az Orion Research Inc. cég (Boston, Massachusetts, USA).

A reakcióedényben az alábbi összetételű oldat van :

0,1 mól/liter kálium-foszfát-puffer és 0,1 mól/liter kálium-klorid, pH = 7,0 ;

mmól/liter N,N-bisz-(2-hidroxi-etil)-p-nitrozo-anilin és glükóz, 0 és 100 mmól/liter közötti koncentrációban.

A meghatározási reakciót glükózoxidáznak (EC 1.1.3.4) a reakcióoldatba történő beadagolásával és ezt követően keveréssel indítjuk be. Annyi glükózoxidázt adunk a reakcióelegyhez, hogy annak koncentrációja az elegyre vonatkoztatva 0,5 mg/ml ( 125 U/ml ) legyen. Egy perccel a glükózoxidáz hozzáadása után ciklovoltammogrammot veszünk fel egy Potentiostat” berendezéssel ( Mód. 273 EG and G, Princeton Applied Research, Princeton, New Jersey, USA ) történő méréssel ; a letapogatási arány (Scan-Rate) : 100 mV/s. Kiértéke«· ·· * ·· • · · · · · · • ·♦♦ · · · ♦ ···< · • ···· «« · ···· lésre kerülnek a 150 mV-nál mért első oxidációs maximumokhoz tartozó áramok. A kapott eredményeket az 5· ábrán szemléltetjük. Az 5 perccel a glükózoxidáz hozzáadása után, illetve az oxigén kizárása közben (argon alatt) végzett megfelelő mérések nem mutattak lényeges eltérést.

Miként az 5· ábrán szereplő diagramból jól látható, kb. 50 mmól/liter glükózkoncentrációig az anódos áramsürüsé'gi maximuma egy lineáris összegfüggést mutat a glükózkoncentrációtól függően ; 30 mmól/liternél magasabb glükózkoncentrációnál az elektronátvivő anyagként alkalmazott N,N-bisz-( 2-hidroxi-etil)-p-nitrozo-anilin teljesen átalakul a megfelelő fenilén-diaminná. Tehát 50 mmól/liternél nagyobb koncentrációban a glükóz további áramnövekedést nem okoz. Minthogy egy molekula fenilén-diamin keletkezéséhez két molekula glükóz szükséges és az összes glükóznak csak mintegy kétharmad része van β-formában és ennyi áll rendelkezésre emiatt a glükózoxidázzal való reakció számára, az elektronátvivőre talált és 30 mmól/liter glükóz által okozott 10 mmól/liter teljes átalakulási érték pontosan megfelel az elméleti sztöchiometriai értéknek.

Glükózoxidáz (1.1.5.4) helyett glükóz-dye-oxidoreduktáznak (EC 1.1.99*17 ) 0,1 mól/liter triszpufferben, 0,1 mól/liter kálium-kloridban ( pH = 7,0 ) történő alkalmazása és 1 % szarvasmarha-szérumalbumin hozzátétele mellett hasonló eredményeket kapunk.

• «··· · «· · ··· ····

2. példa

NADH -k imutatá s

A mérési elrendezés felépítése az 1. példában kai azonos. A reakcióedény az alábbiakat tartalmazza:

0,1 mól/liter kálium-foszfát-puffer, 0,1 mól/liter kálium-klorid, pH = 7j0 ;

mmól/liter N,N-bisz-(2-hidroxi-etil)-p-nitrozo-anilin és NADH 0-10 mmól/liter közötti koncentrációban.

A mérés úgy kezdődik, hogy a fentiekhez mikroorganizmusokból származó diaforázt (NADH : dye-oxidoreduktáz) adunk és az enzimet összekeverjük a reakcióeleggyel. Annyi enzimet adunk hozzá, hogy a reakcióelegyben az enzimkoncentráció 0,2 mg/ml ( J U/ml) legyen. 1 perc reakcióidő után áramsürüséget mérünk, amelyre a 6. ábrán szereplő lineáris áramsürüség/koncentráció összefüggés jellemző.

J. példa

Laktat meghatározása

Az 1. példában leírtakkal azonos kísérleti berendezéssel és azonos elektronátvivővel laktatót; is meg lehet határozni. Enzimként laktátoxidázt (EC 1.1.3.2 ) alkalmazunk és pufférként 0,1 mól/liter citrátpuffért és 0,1 mól kálium• · · ·

- 42 -klóridőt, pH = 5»5 használunk.

4. példa

Glicerin-foszfát meghatározása

Amennyiben az 1. példa szerinti eljárásban a glükózoxidáz enzimet glicerofoszfátoxidázzal (EC 1.1.J.21) és a puffért 0,1 mól/liter triszpufferrel és 0,1 mól/liter kálium-klór iddal helyettesítjük — az utóbbiak pH-ja = 8,0 — úgy analóg módon glicerin-foszfátot határozhatunk meg.

3. példa

Koleszterin meghatározása

Amennyiben az 1. példa szerint járunk el, de a glükózoxidázt Streptomycesből származó koleszterinoxidázzal (EC 1.1.3.6) , az elektronakceptort 10 mmól/liter N-metil-N*-(4-nitrozo-fenil)-piperazinnal és a puffért 0,1 mól/liter kálium-foszfát-pufferrel, 0,1 mól/liter kálium-kloriddal (pH = 5,5 ), valamint 2 % Triton X 100^ -zal helyettesítjük, úgy az 1. példában leírtakkal analóg módon koleszterint lehet meghatározni.

6. példa

Találmány szerinti elektronátvivő tulajdonságú redukálható anyagok

- 43 Az alábbi 1. Táblázatban megnevezett vegyületeket mmól/liter koncentrációban reagáltatjuk 50 mmól/liter glükózzal és 0,5 mg/ml glükózoxidázzal (125 U/ml) 0,1 mól/liter kálium-foszfát-pufferben és 0,1 mól/liter kálium-kloridban, pH = 7j0. A műveletekhez az 1. példában leirt mérési elrendezést alkalmazzuk. A megfelelő ciklovoltammogrammok a glükózoxidázzal és a glükózzal redukált elektronátvivők csúcspotenciáljait adják meg egy normál hidrogénelektróddal szemben, millivoltban (mV) kifejezve.

Az átalakulási sebesség mértékeként az 1. Táblázatban azt a viszonyt adjuk meg, ami az oxidációs áramok között a legmagasabb oxidációs csúcsok potenciáljánál egy perc és tiz perc eltelte után mérhető, illetve kiszámítható.

1. Táblázat

Elektronátvivő

Osucspoten- Átalakulási ciálok^a sebességi

N-(2-hidroxi-etil)-N*-p-nitrozo-fenil-piperazin

340

N,N-bisz-( 2-hicLroxi-etil)-p-nitrozo-anilin

210 o-metoxi-[N,N-bisz-( 2-hidroxi-etil)]-p-nitrozo-anilin

170 • · · · · · ···· F * »* • · · · · · • · · 9 9 9 9

- 44 Elektronátvivő

Csucspoten- Átalakulási ciálok^a sebességi p-nitrozo-fenol

220 p-kinon-dioxim^c

N,N-dimetil-4-nitrozo-1-naftil-amin

175

N,N,3-trimetil-4-nitrozo-anilin

220

N-( 2-hidroxi-etil) -5-nitrozo-indolin

N,N-bisz-(2-hidroxi-etil)-3-klór-4-nitrozo-anilin 315

2,4-dimetoxi-nitrozo

-benzol

N,N-bisz-(2-metoxi-etil)-4-nitrozo-anilin

245

3-metoxi-4-nitrozo-fenol 140

N-(2-hidroxi-etil)-6

-nitrozo-1,2,3,4-tetrahidrokinolin

- 45 Elektronátvivő Osucspoten- Átalakulási ciálok^a sebességi

N,N-dimetil-5-klór-4-
-nitrozo-anilin	275	27
N,N-bisz-( 2-hidroxi-etil)- -5-fluor-4-nitrozo-anilin	260	7-+
N,N-bisz-( 2-hidroxi-etil)- -5-meti1-tio-4-nitrοzo- -anilin	195	21
N-( 2-hidroxi-etil-N-2- -(2-metoxi-etoxi)-etil)- -4-nitrozo-anilin	210	59
N-(2-hidroxi-etil)-N- -(. 5-nietoxi-2-hidroxi-l- -propil)-4-nitrozo-anilin	225	65
N-(2-hidroxi-etil)-N-( 5- -(2-hidroxi-etoxi-2-hidroxi- -1-propil)-4-nitrozo-anilin	210	54

a: A glükózoxidázzal és glükózzal redukált elektronátvivő első csúcspotenciálja Ag/AgCl elektróddal szemben, millivoltban (mV) kifejezve.

• · · • · · · · · · • · · · · · · ······· ·· ·

- 46 b : Az áram első maximuma a ciklovoltammogrammban 1 percnyi reakcióidőnél, arányba állítva a 10 percnyi reakcióidőnél mért árammal, százalékban kifejezve.

c : Koncentráció 5 x 10 mól/liter.

A 7· ábrán ciklovoltammogrammok szerepelnek, ezeket

N-(2-hidroxi-etil)-N’-p-nitrozo-fenil-piperazint, illetve N,N-bisz-(2-hidroxi-etil)-p-nitrozo-anilint alkalmazva vettük fel és a mérést 10 mmól/liter glükózzal végeztük, hogy elkerüljük a maradék glükóz reakciói által okozott befolyásokat a ciklovoltammogramm felvétele során.

7. példa

Egyik találmány szerinti elektronátvivő összehasonlítása a technika állásából ismert elektronátvivővel

a) Olyan felépítésű kísérleti berendezésben, mint amilyent az 1. példában ismertettünk, egy 7»0 pH-ju foszfátpufferbe beadagolunk annyi N-metil-N’-(4-nitrozo-fenil)-piperazint, hogy annak koncentrációja 10~^ mól/liter legyen. A 0 és 3 mmól/liter közötti glükózkoncentrációknál kimért ciklovoltammogrammokon az áramsürüségnek a glükózkoncentrációtól való függősége jelenik meg, .miként azt a 8. ábra mutatja. Kicsiny koncentrációknál a levegő oxigénjének befolyása állapítható meg, amit argon alatt végzett méréssel lehet elkerülni. Az • · · · · ·

- 47 “2 elektronátvivőnek magasabb koncentrációban ( 10 mól/liter) történő alkalmazásával ugyanolyan eredményt érünk el, mint az argonnak védőgázként való használatával. Ugyanígy elkerülhető az oxigénnek a mérésre gyakorolt befolyása abban az esetben, ha glükózoxidáz helyett glükózdehidrogenuzt alkalmazunk.

b) Amennyiben elektronátvivőként a jelen találmány szerinti N-metil-N*-(4-nitrozo-fenil)-piperazin helyett a technika állásához tartozó tetratiafulvalént használunk, úgy az áramsürüségnek a glükózkoncentrációtól való függését a 9. ábra szemlélteti. A tetratiafulvalén használata jelentős mértékben magasabb oxigénzavarást mutat, mint a jelen találmány szerinti oxigénátvivő esetében észlelt érték. Ezen túlmenően jelentős mértékben kisebb áramerősséget mérünk.

A tetrahidrofulvalént nagyon nehezen oldható anyag.

Annak érdekében, hogy pH = 7 értékű foszfátpufferben 10 mól/liter koncentrációt elérjünk, detergensként még 2,5 % Tween 20 -at is kell alkalmazni. A jelentősen magasabb értékű tetratiafulvalén-koncentrációk beállítása az oxigén által okozott zavarok csökkentése végett, ami a találmány szerinti elektronátvivő esetén lehetséges,itt a nehéz oldhatóság miatt kiesik.

I • ·

8. példa

Enzimmeghatározás

a) Laktát-dehidrogenáz-teszt

Az 1. példában leírtakkal analóg kísérleti berendezésben az alábbi oldatokat készítjük elő :

0,1 mól/liter nátrium-foszfát-puffer, 0,1 mól/liter kálium-klorid, pH = 9,0 ;

mmól/liter N,N-bisz-(2-hidroxi-etil)-p-nitrozo-anilin;

0,1 mól/liter D,L-laktát (nátriumsó) ;

U/ml mikroorganizmusokból származó diaforáz és mmól/liter NAD⁺·

Mágneses keverővei végzett erős keverés közben (1000 fordulat/perc)75 mV konstans potenciálnál áramot mérünk e.züs t/ ezüst-klorid elektróddal szemben. A meghatározást laktát-dehidrogenáz (EC 1.1.1.27) hozzáadásával indítjuk meg. A laktát-dehidrogenázt különböző mennyiségekben adjuk hozza és esetenként 100, 200, 300, 400/és 600 másodperc eltelte után mérést végzünk. A kapott áram/idő görbéket a 10. ábrán szemléltetjük. Az ordinátatengelyen megadott LDH-aktivitásokát a szokásos piruvátredukciós-teszttel határoztuk meg.

I

b) Glükóz-dehidrogenáz-teszt

A fenti a) pontban leírtakkal analóg módon 0,1 mól/liter kálium-foszfát-pufferben, 0,1 mól/liter kálium-kloridban ( pH = 7,0), 10 mmól/liter NAD⁺-cLal, 10 mmól/liter találmány szerinti elektronátvivővel,

U/liter diaforázzal és 0,1 mól/liter glükózzal el lehet végezni egy tesztelést NAD-függő glükóz-dehidrogenázra.

Megfelelő módon oxidázokat, diaforázt és nem NAD-függő dehidrogenázokat is meg lehet határozni.

9. példa

Egyszer használatos elektródrendszer glükóz meghatározásához

Egy 4. ábra szerinti szenzorelektród-rendszert készítünk olymódon, hogy egy (8) polikarbonát-fóliára alkalmas nyomópasztával végzett szitanyomással (5) munkaelektródot, (6) referenciaelektródot, (7) ellenelektródot, továbbá (55), (66) és (77) vezetőpályákat viszünk fel. A vezetőpályák kereskedelmi áruként kapható grafitnyomópasztából (Acheson 421 SS, Deutsche Acheson Colloids, Ulm, Német Szövetségi Köztársaság), állnak mig a (6) referenciaelektród és a (7) ellenelektród ugyancsak a kereskedelemben beszerezhető ezüst-vezetőpasztából áll, amihez 20 sulyszázalék porított ezüst-kloridot elegyítenek (Acheson SS 24566, Deutsche Acheson Colloids, Ulm, Német Szövetségi Köztársaság).

Az (5) munkáélektród számára 100 g keverékre számolva egy 2 sulyszázalékos hidroxi-etil-cellulóz-gélben (duzzasztmányban) (Natrosol 250 G, Hercules BV,Rijswijk, Hollandia), ami tartalmaz 0,05 mól/liter nátrium-foszfát-puffért ( pH = 7,0 ), 3 mmól/liter N,N-bisz-(hidroxi-etil)-p-nitrozo-anilint, 500 KU glükózoxidázt (Glucoseoxidase, Reinheitsgrad II , Boehringer Mannheim, G.m.b.H, Mannheim, Német Szövetségi Köztársaság), továbbá 30 sulyszázalék grafitport (W? 296/97, Graphitwerke, Kropfmühl, Német Szövetségi Köztársaság) és 4 sulyszázalék etilénglikolt homogenizálunk.

Az elektródfelületek mérete és nagysága :

az (5) munkaelektródnál a (6) referenciaelektródnál a (7) ellenelektródnál

4x6 mm = 24 mm x 1,5 mm - 1,5 é s x 1,5 mm = 1,5 mm

A szitanyomásos eljárással készített szenzorelektród-rendszert úgy merítjük be a 0,05 mól/liter nátrium-foszfát-puffert (pH = 7,0), 0,1 mól/liter nátrium-kloridot és 0-45 mmól glükózt tartalmazó mérési oldatba, hogy a vizsgálni kívánt folyadék befedje az elektródfelületeket. Az integrált (6) ezüst/ezüst-klorid referenciaelektróddal szemben 200 mV potenciálnál áram/idő görbéket veszünk fel, ezeket * « ·♦ · ··

- 51 a 11. ábrán szemléltetjük. Az áramértékek 10 másodperc mérési idő utáni felvitele egy hitelesítési görbét eredményez, ami a 12. ábrán látható és megadja az áramfolyásnak a glükóz koncentrációjától való függőségét.

10. példa

2,2’-[(4-nitrozo-aril)-imino]-bisz-etanolok előállítása

Keverővei, hőmérővel és csepegtető tölcsérrel ellátott literes háromnyaku lombikban 2 mól N,N-bisz-(p-hidroxi-etil-anilin)-hoz (illetőleg ennek arilszubsztituált analógjához) erős keverés közben részletekben hozzáadagolunk 200 ml vízből és 400 ml tömény sósavból álló elegyet. A kapott oldatot ezután hütőfürdővel 0 °G-ra lehűtjük, majd 0 — 2 °C közötti hőmérsékleten hozzácsepegtetünk 200 ml vízben oldva 148 g (2,1 mól) nátrium-nitritet. A műveletet keverés közben és 20 perc leforgása alatt végezzük. Ezután az elegyet JO percen át 0 °C hőmérsékleten utánakeverjük, a többnyire kristályos és sárgástól zöldesig terjedő szinü nitrozovegyületet leszivatjuk és a nuccstortát két Ízben, alkalmanként 200 ml jéghideg, félig koncentrált sósavval mossuk. Tisztítás céljából a nyers terméket feloldjuk 900 ml vízben, ehhez erőteljes keverés .közben 400 ml tömény sósavat adunk, a reakcióelegyet JŰ percen át szobahőmérsékleten, majd további 30 percen át jeges hűtés közben keverjük. A kapott krisztallizátumot ezt követően feloldjuk 580 ml viz• · ·♦ ♦ • · ·· • ·♦♦· · ·· · ♦···

- 52 ben, ehhez 265 ni tömény sósavat adunk, az elegyet 50 percig szobahőmérsékleten és további 3θ percen, át jeges hűtés közben keverjük. A keletkezett kristályokat leszivatjuk, három ízben, alkalmanként 150 ml jéghideg acetonnal, ezután két ízben, alkalmanként 200 ml dietil-éterrel mossuk, végül szobahőmérsékleten vákuumban szárítjuk. Ilyen módszerrel még az alábbi vegyületeket is előállíthatjuk :

a) 2,2’-[(4-Nitrozo-fenil)-iminoj-bisz-etanol-hidroklorid

Kitermelés: 32,8 % az elméletire számítva, zöld kristályok;

olvadáspont : 160 °C (bomlás).

Analóg módon kapjuk meg a megfelelő arilszubsztituált analóg vegyületeket :

b) 2,2*-[(5-Fluor-4-nitrozo-fenil)-imino]-bisz-etanol-

-hidroklorid

Kitermelés: 26,5 % az elméletire számítva, sárga kristályok;

olvadáspont: 140 °C (bomlás). Vékonyréteg-kromatográfia szilikagélen (Kieselgel 60, Merek) — futtatószer : etil-acetát/metanol = 5*1, = 0,59·

A fenti vegyületet 5-fluor-N,N-bisz-[2-hidroxi-etil]-anilinből (Chem. Abstr. 57» 13922 [1962]) kiindulva állítjuk elő.

• *· ·♦ ♦ ·· ··♦ ·· ♦· 9 · • · ··♦ · · · * · ····»· ···♦·♦· ·· · »*··

c) 2,2*-[( 3-Klór-4-nitrozo-fenil)-imino]-bisz-etanol-

-hidroklorid

Kitermelés: 21 % az elméletire számítva, sárga kristályoki olvadáspont: 154 °C (bomlás). Vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer: metilén-diklorid/metanol = 5*1, Rf = 0,72.

A fenti vegyületet 5-klór-N,N-bisz-[2-hicLroxi-etil] -anilinből (M. Freifelder, G.R. Stone, J. Org. Chem. 26, 1499 (1961)) kiindulva állítjuk elő.

d) 2,2’ -[( 5-Metoxi-4-nitrozo-fen.il)-iminoj-bisz-etanol-

-hidroklorid

Kitermelés: 32 % az elméletire számítva, okkerszinü kristályok; olvadáspont : 145 - 146 °C (bomlás) . Vékonyréteg-kromatográf ia Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer: metilén-diklorid/metanol = 5*1, R^ = 0,4 .

A fenti vegyületet 5-metoxi-N,N-bisz-[2-hidroxi-etilJ-anilinből [ M. Freifelder és szerzőtársai, J. Org. Chem.

26, 1499 (19θ1)] kiindulva állítjuk elő.

e) 2,2*-[( 3-Metil-merkapto-4-nitrozo-fenil)-imino]-bisz-

-etanol-hidroklorid

Kitermelés : 59,3 % az elméletire számítva, vörösbarna színű kristályok: olvadáspont : 148 °C (bomlás). Vékonyréteg-kromatográf ia Kieselgel 60-on (Merek) — futtató- 54 szer: etil-acetát/metanol = 5^J1> Rf = 0>53·

A kiindulási vegyületként használt 3-metil-merkapto-N,N-hisz-(2-hidroxi-etil)-anilint állítjuk elő, hogy 0,1 mól 3-metil-merkapto-anilint feloldunk ml 4 N ecetsavban és 0,55 mól etilén-oxidban, majd ezt az elegyet 12 óra hosszat szobahőmérsékleten keverjük. Ezt követően feleslegben nátrium-hidrogén-karbonát-oldatot adunk hozzá, metilén-dikloriddal extraháljuk és Kieselgel 60-on (Merek) oszlopkromatográfiás tisztítást végzünk. A futtatószer: toluol/aceton = 5^;2, R^ = 0,18, a kitermelés 25 %, színtelen olajos anyag.

f) 2-[Metil-( 3-klór-4-nitrozo-fenil)-amino]-etanol-hidro- klorid

Kitermelés: 15 % az elméletire számítva, sárga kristályok; olvadáspont : 147 °C (bomlás). Vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer : metilén-diklorid/metanol = 19:1, R_f = 0,34 .

A fenti vegyületet 2-[metil-( 3-klór-fenil)-amino-etanol ból kiindulva állítjuk elő, melyet 2-[(3-klór-fenil)-amino]-etanolból kapunk meg olymódon, hogy azt 3 órán át metil-jodiddal főzzük 10 % nátrium-hidroxid jelenlétében, végül oszlopkromatográfiás tisztítást végzünk Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer: toluol/aceton = = 5:1, Rf = 0,39, a kitermelés 25 %, színtelen olajos anyag.

• · ·

- 55 11. példa

2-[( 2-Hidroxi-etoxi)-etil-( 4-nitrozo-fenil)-amino]-etanol-hidroklorid

a) 2-[(2-Hidroxi-etoxi)-etil-(fenil)-amino]-etanol [ (B) képletü vegyület]

146 g (0,8 mól) 2-(2-anilino-etoxi)-etanolt ( a vegyületet anilinnak 2-(2-klór-etoxi)-etanollal végzett reagáltatásával kapjuk meg, a kitermelés 54 %-os, az anyag színtelen olaj, forráspont-^ í 1J1 - 133 °C) feloldunk 500 ml 4N ecetsavban, majd keverés közben hütőfürdővel 0 °C-ra lehűtjük és 0 - 10 °C hőmérsékleten öt perc leforgása alatt hozzácsepegtetünk 70,5 &’» vagyis körülbelül 79 ml (1,6 mól) etilén-oxidot. 12 órai szobahőmérsékleten történő állás után ehhez 5θθ ml vizet adagolunk és keverés közben összesen 200 g nátrium-hidrogén-karbonát adagokban történő óvatos hozzáadásával semlegesítjük. Ezt követően a szabaddá vált bázist 5θθ ml metilén-dikloriddal extraháljuk, utána háromszor, alkalmanként 250 ml metilén-dikloriddal utólagos kirázást végzünk, egyesitjük a szerves fázisokat, melyeket nátrium-szulfát felett szárítjuk, ezután leszivatjuk és vákuumban bepároljuk. Ilyen módon 173,2 g terméket kapunk. Vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 50-on (Merek) — futtatószer : toluol/aceton = 5:2, = 0,18.

• · · ·

b) 2-[(2-Hidroxi-etoxi) -etil-( 4-nitrozo-fenil) -amino]-

-etanol-hidroklorid [(C) képletű vegyület]

Keverővei, csepegtetőtölcsérrel és hőmérővel ellátott literes háromnyaku lombikba beadagolunk egy 280 ml tömény sósavból és 140 ml vízből álló elegyet, ezt szénsavas hütőfürdővel -5 °0 hőmérsékletre lehűtjük, majd 10 perc leforgása alatt és az említett hőmérsékleti értéket állandóan tartva hozzácsepegtetünk 178 g (0,79 mól) fenti a) pont szerint kapott anyagot. Ezután az elegyet 15 percen át utánakeverjük. Ezt követően 0 °C hőmérsékleten hozzáadunk 120 ml vízben oldva 60 g (0,87 mól) nátrium-nitritet, amikor is vérvöröstől barnáig terjedő elszíneződés lép fel. Az elegyet 30 percig 0 °C-on utánakeverjük, majd 506 ml viz hozzáadásával ( a reakcióelegy pH-ja = 1,4 ) hígítjuk és jeges hűtés közben, maximálisan 15 °C hőmérsékleten, 218 ml tömény vizes ammóniaoldatot adunk hozzá pH = 9 érték eléréséig. A szabaddá tett nitrozobázist öt ízben 400 ml n-butanollal kirázzuk és az oldószert forgó bepárlóberendezésben ledesztilláljuk. Ilymódon 212,8 g sötétzöld színű olajos anyagot kapunk. Ezt a szervetlen alkotóelemek eltávolítása céljából 250 ml toluol/aceton = 1:1 eleggyel felkeverjük, az oldhatatlan részt leszivatjuk és azt 50 ml toluol/aceton = 1:1 eleggyel mossuk. 18,4 g szervetlen anyag marad vissza. A szürletet ezután egy Kieselgel 60-oszlopon (7»5 cm átmérőjű, töltési magassága : 90 cm, az eluálószer: toluol/aceton = 1:1 ) kromatográfiás utón tisztítjuk. Sötétzöld színű olajos anyag formájában 155 g nitrozobázist kapunk. Ezt 600 ml acetonban oldjuk és külső jeges hűtés közben cseppenként 25O ml telített éteres hidrogén-klorid-oldatot adunk hozzá. Továbbra is Jeges hűtés közben az elegyet 5O percig keverjük, majd a képződött kristályodat leszivatással elkülönítjük, 100 ml acetónnal háromszor mossuk és vákuumban, szobahőmérsékleten difoszfor-pentaoxid felett szárítjuk. Ilyen módon 159,9 g ( az elraéleti kitermelés 69,6 %-a) cim szerinti — azaz (C) képletű — vegyületet kapunk, melynek olvadáspontja : 118 °C. Vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer : toluol/aceton = 1:1, R^=Ű,24.

12. példa

A 11. példában leírtakkal analóg módon az alábbi vegyületeket állítjuk elő :

a) l-[N,N-( 2-Hidroxi-etil)-( 4-nitrozo-anilino)]-3-(2-hidrox.i-etoxi) -2-propanol-hidroklorid [(D) képletű vegyület]

Kitermelés: 10,5 % az elméletire számítva, narancsszínű kristályok; olvadáspont : 104 °C (bomlás). Vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on (Merek) __ futtatószer:

··♦·

- 58 toluol/metanol = 5:1, Rf = 0,13·

A cim szerinti (D) képletű vegyületet l-[N,N-(2-hidroxi-etil) -(anilino)]-J-(2-hidroxi-etoxi)-2-propanolból [(E) képlet] kiindulva állítjuk elő. A kiindulási vegyületet viszont l-[N-(anilino)]-3-(2-hidroxi-etoxi)-2-propanolból [(F) képlet] 4N ecetsav jelenlétében etilén-oxiddal végzett reakcióval készítjük. Kitermelés: 71 % színtelen olajos anyag, vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer : toluol/aceton = 5:2, = 0,43.

Az utóbbit pedig anilinből l-klór~3-(2-hidroxi-etoxi)-2-propanollal végzett reagáltatással készítjük. Kitermelés: 21,5 % színtelen olajos anyag, vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer : toluol/aceton = = 5:2, R_f = 0,6.

b) l-[N-(2-Hidroxi-etil)-(4-nitrozo-anilino)]-3-metoxi-2-propanol-hidroklorid [(G) képletű vegyület ]

Kitermelés: 44,5 %, világossárga színű kristályok, olvadáspont : 122 °C (bomlás). Vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer : metilén-diklorid/metanol = 49:1, R^ = 0,55 ·

A fenti vegyületet (t)-3-[N-( 2-hidroxi-etil)-anilino]-l-metoxi-2-propanolból kiindulva állítjuk elő (603808 :

- 59 számú Német Birodalmi szabadalmi leírás (1955) — Friedlánder 21, 295 )> (forráspont-^: 212 - 214 °C).

c) 2-[(2-Metoxi-etoxi)-etil-(4-nitrozo-fenil)-amino]-

-etanol [ (H) képletü vegyület ]

Kitermelés : 25 % az elméletire számítva, sötétbarna szinü gyanta. Vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer : metilén-diklorid/metanol = 19:1, Rf = 0,49 ; metilén-diklorid/metanol = 5^:1> Rf = 0,77 (az amorf higroszkópos hidrokloridon át ammóniával).

A cím szerinti vegyületet 2-[(2-metoxi-etoxi)-etil-(fenil)-amino-etanolból [(A) képlet ] állítjuk elő.

Az említett kiindulási anyagot viszont anilinből és

2-metoxi-etoxi-klór-etanból készítjük olymódon, hogy a nevezett anyagokat egy órán át 90 °C hőmérsékletre hevítjük, majd oszlopkromatográfiás elválasztást végzünk Kieselgel 60-on (Merek) toluol/etil-acetát = 5^1 ele^gyel. Az igy létrejött N-(2-metoxi-etoxi-etil)-anilin [ R^ = 0,69, színtelen olajos anyag, (J) képletü vegyület ]. uz atilén-oxiddal és 4N ecetsavval reagáltatva színtelen olaj formájában a már nevezett (A) képletü kiindulási anyagot eredményezi. Vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer: toluol/aceton = 5:2, R^ = O,J1.

···· ·· • ·

d) 2-[( 2-( 2-(. 2-( 2-Metoxi) -etoxi) -etoxi)-etil) -4-( nitro- zo-fenil)-amino]-etanol [(K) képletű vegyület]

Kitermelés : 63 % az elméletire számítva, zöld szinü olaj, vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer : toluol/aceton = 1:5, Rf = 0,64.

A cím szerinti vegyületet 2-[(2-(2-(2-(2-metoxi)-etoxi)-etoxi)-etil)-4-(fenil)-amino]-etanolból kiindulva állítjuk elő.

A fent nevezett kiindulási anyagot viszont az alábbiak szerint készítjük :

Anilinből és dietilglikol-bisz-( 2-klór-etil-éter)-bői [Perry, Hiböert Can. J. Rés. 14, 81 (1936)] négy órán át 140 °C hőmérsékleten történő hevítéssel és ezt követő oszlopkromatográfiás elválasztással, amit Kieselgel 60-on (Merek) végzünk toluol/etil-acetát =2:1 eleggyel, az elméletire számított 20,5 %-os kitermeléssel, sárgás szintolaj formájában megkapjuk az (L) képlett vegyületet, melynek Rf értéke =0,5 ·

Ezen (L) képlett vegyületnek 4N ecetsavban etilén-oxiddal végzett reagáltatásával gyakorlatilag kvantitatív kitermeléssel az (M) képletű vegyületet kapjuk testszinü (beige) olaj formájában. Vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel ·· ·* • · tf · • ··· · ·

- · ···· · ··· ·* · ····

60-on (Merek) — futtatószer : metilén-diklorid/metanol = = 19:1, R_f = 0,61.

Ebből metanolban levő nátrium-metiláttal (NaOCH^) órán át végzett visszafolyatás közbeni forralással, bepárlással, viz hozzáadásával, etil-acetátba történő felvétellel és a nyers termék ezt követő oszlopkromatográfiás tisztításával·, amit Kieselgel 60-on (Merek) toluol/aceton 5:2 eleggyel végzünk, az elméletire számított 51*3 %-os kitermeléssel,színtelen olajos anyag formájában kapjuk meg a kívánt kiindulási vegyületet, = 0,21.

13. példa

N-(4-Nitrozo-fenil)-N-[(2-dietil-amino)-etilJ-Ν,Ν*-dietil-1,2-etán-diamin-trisz-hidroklorid [(N) képletű vegyület ]

A cím szerinti vegyület olvadáspontja: 125 °C (bomlás). Vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer : izopropanol/n-butil-acetát/viz/tömény vizes ammóniaoldat = 50:30:15:5» Rf = 0,56.

A cím szerinti vegyületet N-[di-(2-dietil-amino)-etil] -anilinből kiindulva állítjuk elő.

14. példa

1-N-szubsztituált 4-(4-nitrozo-fenil)-piperazinok

-előállítása [(0) általános képletű vegyületek]

a) l-Metil-4-(4-nitrozo-fenil)-piperazin-dihidro-klorid [(P) képletű vegyület]

17,62 g (0,1 mól) l-metil-4-fenil-piperazint [ a nevezett vegyületet 0,3 mól 1-fenil-piperazinból 0,2 mól trimetil-foszfáttal 1^0 °C-on végzett 4 órán át tartó hevítéssel, nátrium-hidroxid hozzáadásával történő izolálással és dietil-éterrel történő extrahálással, továbbá Kieselgel 60-on (Merek) metilén-diklorid/metanol = 5sl eleggyel végzett oszlopkromatográfiás tisztítással kapjuk meg az elméletire számítva 40,1 á kitermeléssel, színtelen folyadék formájában, forráspont^ : 82 - 84 °C , = 0,31; Stewart és szerzőtársai, J. Org. Chem. 13, 134 (1980) ] feloldunk 20 ml tömény sósav és 10 ml víz elegyében, ezután 0 - 2 °C hőmérsékleten 15 perc leforgása alatt hozzácsepegtetünk 8 g (0,12 mól) nátrium-nitritet 16 ml vízben oldva és a reakcióelegyet 30 percig 10 °C hőmérsékleten utánakeverjük. További hűtés közben és az említettel azonos hőmérsékleten 60 ml tömény vizes ammónia- 65 oldatot adunk az elegyhez, majd 100 ml vizet hozzáadva hígítjuk és a vörösbarna szinü oldatot ( pH = 9) három Ízben, alkalmanként 100 ml metilén-dikloriddal kirázzuk. Ezt követően a szerves fázist nátrium-szulfát felett szárítjuk, majd leszivatjuk és bepároljuk. A maradékul kapott 20,6 g moszatzöld színű kristályokat 40 ml metanolba felvesszük és hűtés közben 20 ml telített éteres hidrogén-klorid-oldattal elegyítjük. Leszivatás és két ízben 20 ml éterrel végzett mosás után igy moszatzöld szinü kristályok formájában

15,8 g cím szerinti vegyületet kapunk, ami az elméleti kitermelés 56,8 %-ának felel meg ; olvadáspont : 187 - 189 °C (bomlás). Vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer : metilén-diklorid/metanol = 5*1» Rf = 0,72.

Analóg módon állítjuk elő az alábbi vegyűleteket :

b) 4-( 4-Nitrozo-fenil)-1-piperazino-etanol-dihidroklorid [(Q) képletű vegyület]

A fenti vegyületet metanol/viz = 7*1 elegyből végzett átkristályositással kapjuk meg tiszta állapotban, világosszürke szinü kristályok formájában, melyek olvadáspontja : 170 - 175 °C (bomlás). Vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer : metilén-diklorid/metanol = 5*1, Rf = 0,67. Kiindulási anyagként a 2-( 4-fenil-piperazino)-etanol szolgál [Kremer, J. Amer. Chem. Soc. $8, 373 (1936)].

• ·

c) 3-[4-(4-Nitrozo-fenil)-l-piperazinil]-l,2.-propándiol-

-dihidroklorid

Í(R) képletü vegyület]

A fenti vegyületet zöld színű kristályok formájában kapjuk meg, olvadáspont : 163 °C (bomlás). Vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer : etil-acetát/metanol = 2:1, R_f = 0,41. A kiindulási anyag : l-fenil-4-(2,3-dihidroxi-propil)-piperazin [ H. Howell és szerzőtársai J. Org. Chem. 27, 1711 (1962)].

d) 4-(4-Nitrozo-fenil)-a-(metoxi-metil)-piperazino-l-etanol-

-dihidroklorid [(£) képletü vegyület]

A fenti vegyület sárga színű kristályok formájában, olvadáspont : 162 °C (bomlás) kapható meg. Vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on — futtatószer : meti_lén-diklorid/metanol = 19:1, - 0,51. A kiindulási anyag :

l-fenil-4-( 2-hidroxi-3-metoxi-propil)-piperazin [H. Howell és szerzőtársai, J. Org. Chem. 27, 1711 (1962)].

e) 2-[2-[4-(4-Nitrozo-fenil)-l-piperazinil]-etoxi]-etanol-

-dihidroklorid [(T) képletü vegyület]

A fenti vegyületet zöld kristályok formájában kapjuk meg, olvadáspont : 134 °C (bomlás). Vékonyréteg-kroma• · ♦ ·

- 65 tográfia Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer : etil-acetát/metanol = 5*1, Rf = 0,31· A kiindulási anyag : 2-(2-(4-( fenil)-l-piperazinil]-etoxi]-etanol, melyet 2 mól 1-fenil-piperazinból és l-(2-klór-etoxi]-2-metoxi-etánból kaphatunk meg ( az utóbbi tekintetében lásd a 2,837,574 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírást).

f) l-(1,4-Dioxánilil)-metil-4-( 4-nitrozo-fenil)-piperazin-

-dihidroklorid ((U) képletű vegyület]

A cim szerinti vegyületet zöldessárga szinü kristályok formájában kapjuk meg, olvadáspont: 166 °G (bomlás). Vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer : toluol/metanol = 5*1, Rf = 0,69·

A fenti (U) képlett vegyületet l-(1,4-dioxánilil)-metil-4-(fenil)-piperazinból kiindulva állítjuk elő. A nevezett kiindulási anyagot viszont l-klór-3-(p~hidroxi-etoxi)-2-propanolból ( M. S. Kharash, W. Nudenberg, J. ürg. Chem. 8, 189 (1943)] készítjük 1-fenil-piperazinnal 130 °C-on 5 órán át történő hevítéssel, ezt követően etil-acetáttal végzett extrahálással és bepárlással, majd Kieselgel 60-on (Merek) végzett oszlopkromatográfiás tisztítással, melynek során futtatószerként toluol/aceton =5*2 elegyet alkalmazunk.

• ·

- 66 15« példa

Heterociklusos nitrozovegyületek

a) 5-ΝΐίΓθζο-1-1ηΗο1ίη-θtarol-hidroklorid

E(W) képletű vegyület]

A cím szerinti (W) képletű nitrozovegyületet 1-indolino-etanolból kiindulva állítjuk elő. A kiindulási anyagot 1 mól indolinnak 1 mól 2-klór-etanollal 1 mól finomra porított kálium-karbonát jelenlétében történő visszafolyatás közbeni 1 órás hevítésével kapjuk meg az elméletire számítva 65,8 %-os kitermeléssel, színtelen olaj formájában. Forráspont _r - : 128 - 150 °C, vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer : toluol/aceton = 5*2, Rf = 0,42. A nitrozovegyületet ammónia hozzáadásával és metilén-dikloriddal bázis formájában izoláljuk. Ezt éteres hidrogén-klorid-oldattal alakítjuk át hidrokloriddá. Világosbarna színű kristályokat kapunk, olvadáspont : 180 °C, vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer : metilén-diklorid/metanol = 5*1, Rf = 0,51.

b) l-Metil-6-nitrozo-l,2,5,4-tetrahidro-kinolin-hidroklorid [(I) képletű vegyület ]

A cim szerinti (I) képletű vegyületet 1-metil-1,2,5,4-tetrahidro-kinolinból kiindulva állítjuk elő. A kiin- 67 dulási anyagot viszont 1,2,3,4-tetrahidrokinolinnak tri metil-foszfáttal történő hevítésével készítjük [Huisgen és szerzőtársai, Chem. Bér. 92, 203 (1959)]· A nyers terméket a szokásosan, vagyis a 10. és a 11. példában leírtakkal analóg módon állítjuk elő és azt Kieselgel 60-on (Merek) izopropanol/n-butil-acetát/viz = 5^:3í2 eleggyel tisztítjuk. A tisztított terméket ezután acetonban oldjuk és éteres hidrogén-klorid-oldat hozzá adásával megkapjuk a cím szerinti vegyületet, melynek olvadáspontja : 123 - 124 °C (bomlás). Vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on — futtatószer : izopropanol/n-butil-acetát/viz = 5^3:2, R^ - 0,7·

c) 6-Nitrozo-3,4-dihidro-l(2H)-kinolin-etanol-hidroklorid [( Z) képletű vegyület]

A cím szerinti ( Z) képletű vegyületet 2-( 3,4-dihidro-2H-kinolin-l-il)-etanolból [ Zaheer és szerzőtársai, Indián J. Chem. jL, 479 (1963), forráspont^ : 140- 144 °C ] kiindulva kapjuk meg. A nyers terméket Kieselgel 60-on (Merek) végzett oszlopkromatografálással tisztítjuk — a futtatószer : metilén-diklorid/metanol = 19:1 elegy. Ezután izopropanolos oldatból éteres hidrogén-klorid-oldattal kicsapjuk a hidrokloridot és azt etanolból átkristályositjuk. Ilyen módon megkapjuk a cím szerinti vegyületet okkerszinü kristályok formájában.

, · ·»··· a •••a··· · a ♦ *···

- 68 A kitermelés az elméletire számítva 10,5 %-os, olvadáspont : 193 - 195 °C (bomlás). Vékonyréteg-kromatográfia Kieselgel 60-on (Merek) — futtatószer : metilén-diklorid/metanol = 19:1» = 0»36.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK:

1. Eljárás valamilyen analitnak egy oxidoreduktáz és egy redukálható anyag jelenlétében történő elektrokémiai meghatározására, mely meghatározás során az oxidoreduktázból származó elektronok egy elektródra jutnak át és igy egy jelet eredményeznek, ami mértéke a meghatározni kívánt analitnak, mimellett a redukálható anyagot enzimatikusan redukáljuk és az elektródon oxidáljuk, azzal jellemezve, hogy az elektródon oxidáció által keletkezett anyag különbözik az eredetileg alkalmazott redukálható anyagtól.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy mind az eredetileg alkalmazott redukálható anyagot, mind pedig az oxidoreduktázból származó és az elektródon oxidáció által keletkezett anyagot redukáljuk.
3. Az 1. és a 2. igénypont szerinti eljárás közül bármelyik, azzal jellemezve, hogy redukálható anyagként egy olyan vegyületet alkalmazunk, amely a meghatározási reakció folyamán az oxidoreduktázból keletkezett elektronokat valamilyen elektrondus aromás amin keletkezése közben felveszi.
4. A 3· igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy redukálható anyagként az (I) általános képletű vegyü- ·« · 4

- 70 leitek csoportjába tartozó valamilyen vegyületet — ahol

R jelentése elektrondus aromás csoport, mig

X -NO vagy -ΝΉ0Η képletű csoport — és (II) általános képletű vegyületeket alkalmazunk, ahol

Y kinoidális rendszert jelent, amely redukció által létrejött aromás állapotban elektrondusnak nevezhető.
5. Az 1.-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy oxidoreduktázként egy oxidázt, egy nem NAD(P)-függő dehidrogenázt vagy diaforázt alkalmazunk.
6. Eljárás egy oxidoreduktáz elektrokémiai meghatározására megfelelő enzimszubsztrátum és valamilyen redukálható anyag jelenlétében, ami képes arra, hogy az oxidoreduktázról elektronokat vigyen át egy elektródra és ezáltal egy jelet eredményezzen, ami mértéke a meghatározni kívánt enzimnek, mimellett a redukálható anyag enzimatikusan redukálva és az elektródon oxidálva lesz, azzal jellemezve, hogy az elektródon oxidáció által keletkezett anyag különbözik az eredetileg használt redukálható anyagtól.
7. Valamilyen anyag alkalmazása elektrokémiai rendszerben elektronátvivőként egy oxidoreduktáz és egy elektród között, azzal jellemezve, hogy az említett anyag elektrondus aromás amin képződése közben oxidoreduktázból származó elektronok felvételére képes.
8. Szenzorelektród-rendszer folyékony próbában levő b, analit elektrokémiai meghatározásához, amely rendszeren legalább kétféle elektromosan vezetőképes anyag egymástól izoláltan fordul elő, de ezek egy elektromosan vezetőképes felület közbejöttével a vizsgálni kivánt próbával mindig elektromos érintkezésbe hozhatók, mimellett az elektromosan vezetőképes felületek közül legalább az egyik egy oxidoreduktáz és egy redukálható anyag, amelyek képesek elektronokat átvinni az oxidoreduktáz és az elektromosan vezetőképes felület között.a már említett kontaktust létrehozzuk, azzal jellemezve, hogy redukálható anyagként egy olyan vegyületet alkalmazunk, amely az oxidoreduktáz által történt redukció után az elektromosan vezetőképes felületen az eredetileg alkalmazott redukálható anyagtól eltérő anyaggá oxidálódik.
9. A 8. igénypont szerinti szenzorelektród-rendszer, azzal jellemezve, hogy mind az eredetileg alkalmazott redukálható anyagot, mind az elektromosan vezetőképes felületen oxidáció által keletkezett vegyületet az oxidoreduktáz redukálja.
10. Szenzorelektród-rendszer folyékony próbában levő oxidoreduktáz elektrokémiai meghatározásához, amely rendszerűén legalább kétféle elektromosan vezetőképes anyag egymás·* · · tói izoláltan fordul elő, de ezek egy elektromosan vezetőképes felület közbejöttével a vizsgálni kivánt próbával mindig elektromos érintkezésbe hozhatók, mimellett az elektromosan vezetőképes felületek közül legalább az egyik egy oxidoreduktáz-szubsztrátum és egy redukálható anyag, amelyek képesek elektronokat átvinni az oxidoreduktáz és az elektromosan vezetőképes felület között,a már említett kontaktust létrehozzuk, azzal jellemezve, hogy redukálható anyagként egy olyan vegyületet alkalmazunk, amely az oxidoreduktáz által történt redukció után az elektromosan vezetőképes felületen az eredetileg alkalmazott redukálható anyagtól eltérő anyaggá oxidálódik.
11. Valamely anyag alkalmazása a 8. vagy a 10. igénypont szerinti szenzorelektród-rendszer előállításához, azzal jellemezve, hogy az anyag egy oxidoreduktázból elektronokat képes felvenni, elektrondus aromás amin keletkezése közben.
12. A (III) általános képletű nitrozo-anilin-származékok, vagy ezen származékok sói, ahol r! hidrogénatomot, halogénatomot, alkoxicsoportot vagy alkil-tio-csoportot jelent, valamilyen alkilcsoportot és egy hidroxi-alkil-csoportot képvisel; vagy pedig _ k. ·<·· ·· · _Λ ·· · · • « ·*·»· · • · »»···· ······· ·· · ··*·

- 73 R² és R^ azonosan vagy eltérően dialkil-amino-csoportot, az alkilrészben adott esetben hidroxilcsoporttal helyettesített hidroxi-alkoxi-alkil- vagy alkoxi-alkil-csoportot, továbbá olyan poli( alkoxi-alkil)-csoportot jelent, amely az alkilrészben adott esetben hidroxilcsoporttal helyettesítve van, vagy pedig

R² és R.3 kénatommal vagy nitrogénatommal· megszakított alkiléncsoportot jelent, mimellett a nitrogénatom alkilcsoporttal, hidroxi-alkil-csoporttal, hidroxi-alkoxi-alkil-csoporttal, alkoxi-hidroxi-alkil-csoporttal, dioxánilil-alkil-csoporttal vagy az alkilrészben adott esetben hidroxilcsoporttal helyettesített poli(alkoxi-alkil)-csoporttal helyettesítve van ; továbbá

1 2 5 ha R az -NR P altalános képletü csoporthoz képest orto-

2 1

-helyzetben van, úgy p_L és R együttesen egy alkilénlancot is alkothat, amikor is R⁷ hidroxi-alkil-csoport, vagy ameny-

3 nyiben az alkilénlanc 3 szénatomot tartalmaz, úgy R adott esetben még alkilcsoportot is jelenthet, valamint

1 2 ^zha R jelentése hidrogénatomtól eltérő, úgy R és R' azonosan vagy eltérően egy-egy hidroxi-alkil-csoportot képvisel.
13· Eljárás a 12. igénypont szerinti bármelyik ve gyület előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely (IV) általános képletű vegyületet, melyben R , R és R^> jelentése a 12. igénypontban megadott, egy nitrittel reagáltatunk.