CS26191A2 - Method of analyte or oxidoreductase electrochemical determination, sensor-electrode system for this determination and application of respective suitable compounds - Google Patents

Description

Způsob'elektrochemického stanovení analytu nebo Oxidoreduk-tázy, senzorový, elektrodový systém k tomuto stanovení a po-užití k tomuto vhodných sloučenin

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu elektrochemického stano-vení analytu. za přítomnosti oxidoreduktázy a redukovatelnélátky, která v průběhu reakce při stanovení přenáší odpadají-cí elektrony z oxidoreduktázy na elektrodu, což vede k sig-nálu, který je mírou pro stanovovaný analyt, přičemž se re-dukovatelná látka enzymaticky redukuje a na elektrodě oxi-duje. Dále se vynález týká odpovídajícího způsobu elektro-chemického stanovení oxidoreduktázy za přítomnosti enzymo-vého substrátu a výše charakterizované redukovatelné látky.

Kromě toho se vynález týká senzorového elektrodo-vého systému pro'elektrochemické stanovení analytu ve vzor-ku, který obsahuje alespoň dva elektricky vodivé prostředky,které jspu navzájem izolovaňé*‘a mohou být prostřednictvímelektricky vodivého povrchu uvedeny do elektrického kontak-tu se zkoumaným vzorkem, přičemž alespoň jeden z elektric-ky vodivých povrchů uvádí do styku oxidoreduktázu a reduko-vatelnou látku, která je schopna přenášet elektrony mezioxidoreduktázou a elektricky vodivým povrchem. Dále se vyná-lez týká popřípadě odpovídajícího senzorového elektrodovéhosystému pro stanovení oxidoreduktázy, u kterého alespoňjedna z elektricky vodivých ploch uvádí do kontaktu oxido-reduktázový substrát a jednu výše charakterizovanou reduko-vatelnou látku.

Konečně se vynález týká použití určitých sloučenin jako přenéšečů elektronů mezi oxidoreduktázou a elektrodou v elektrochemickém systému.

Dosavadní stav techniky

Oproti kolorimetrickým metodám stanovení analytuv kapalině, které se vyhodnocuje vizuelně nebo kolorimetric-ky, nabízí odpovídající elektrochemické stanovení tu výho-du·, že elektrochemická reakce přímo poskytuje proud·, kterýse může přepočítat na koncentraci. Při kolorimetrickýchzpůsobech je třeba naproti tomu postupovat oklikou, totiž cestou baterie --- proud --- světlo --- zbytkové světlo /remise nebo transmise/---- proud---naměřená hodnota .

Pro elektrochemické, způsoby stanovení je nutnéstanovovaný analyt oxidovat nebo jej pomocí chemických neboenzymatických metod převést na substanci, která se může oxi-dovat. Přímá elektrochemická oxidace analytu, nebo z něj od-vozené substance, způsobuje na povrchu elektrody vysoképřepětí, to znamená potenciál. 'Tento způsob je velmi nene-Íektivní.· Mnohé jiné substance, které rovněž mohou.býtpřítomné ve zkoumaném vzorku, se při tom rovněž oxidují.Takovýto postup proto není prakticky analyticky použitelný.

Obvykle se proto oxidovatelný analyt'nebo od to-hoto analytu odvozená oxidovatelná substance, nechá reago-vat s odpovídající oxidoreduktázou a redukovatelnou látkou,jejíž redukovaná forma může být na elektrodě opět oxidována.Při tom se oxidovatelný analyt, popřípadě od analytu odvoze-ná oxidovatelná substance enzymem selektivně oxiduje. Tímredukovaný enzym se přítomnou redukovatelnou látkou oxidujea redukovaná redukovatelná látka se na elektrodě oxiduje.Redukovatelné látkgt slouží tedy jako přenašeč elektronůz enzymu na elektrodu. Podmínka je tedy taková, aby reduko-vatelná látka byla volena tak, aby reagovala s enzymem, a naelektrodě rychle a specificky. .P. W. Carr a kol. popisují v "Theory and appli-cations of enzyme electrodes in analytical and clinical

chemistry" , nakl. Wiley, New York (1980), str. 197 až 310, ’l· “ reakci' glukózy s kyslíkem jako. redukovatelnou látkou za en-.. zymové/katalýzy glukosooxidázou a důkaz vytvořeného peroxi- du, vodíku na elektrodě. Nevýhodné jsou při tom vedlejší re-dakce peroxidu vodíku, který je sám silným oxidačním činid-lem, a vedlejší reakce na povrchuelektrod v důsledku vyso-kého použitého potenciálu. Tento způsob vyžaduje protospeciální předběžné oddělování k vyloučení rušivých součás-tí ve zkoumaných vzorcích. Nevýhodná je dále potřeba kys-líku. Speciálně při vysokých koncentracích glukózy je di-fúze kyslíku ze vzduchu do vzorku a uvnitř vzorku limitu-jící rychlostí a zhoršuje tak podle okolností výsledky uve-dené metody. V EP-A-0 125 137 je popsán elektrodový senzoro-vý systém pro stanovení komponenty směsi substancí, který máalespoň dva elektricky vodivé prostředky, které jsou navzá-jem isolované a mohou být prostřednictvím elektricky vodivé-ho povrchu uvedeny do elektrického kontaktu se zkoumanýmvzorkem, přičemž jedna z elektricky vodivých ploch uvádído styku oxidoreduktázu a takzvanou "mediátorovou slouče-ninu" , která přenáší elektrony mezi tímto, enzymem a elek-tricky vodivým povrchem. Jako mediátorová sloučenina se po-užívá organokovová substance, mající alespoň dva organickékruhy, z nichž každý obsahuje alespoň dvě konjugované dvoj-né vazby a kovový atom svoje elektrony dělí s každým tímtokruhem. Jako výhodné mediátorové sloučeniny se stejně jakov EP-A-0 078 636 používá ferrocen nebo ferrocenové derivá-ty. Je zde třeba brát zřetel na to,, že takovéto sloučeninyse musí nejprve oxidovat, například na ferrociniový ion, abybyly schopny přenosu elektronů z oxidoreduktázy. Toto vedek takzvaným "náběhovým proudům" , které nastávají již bezpřítomnosti analytu, což při amperometrických způsobech,při kterých je vyskytující se proud mírou množství stanovo-vaného analytu, přirozeně působí rušivě. Dále je nevýhodná špatná rozpustnost takovýchto organokovových sloučenin, ně-hot toto vede ke zvýhodnění kyslíku, například při použitíoxidáz, jako je glukosooxidáza jako oxidoreduktáza a tím spe-cielně při nízkých koncentracích enzymového substrátu k ne-patrným proudům a ke kyslíkové závislosti. Špatná rozpust-nost a/nebo použití nepatrných koncentrací jsou u těchtov redukované formě použitých přenašečů elektronů předpokla-dem pro ještě akceptovatelné náběhové proudy. V souhrnu jsou přenašeče elektronů pro elektroche-mické způsoby stanovení, známé ze stavu techniky, charakte-rizované tím, že se za přítomnosti stanovovaného analytu re-dukují oxidoreduktázou a na elektrodě se zpětně oxidují na*výchozí sloučeninu. Když je koncentrace redukovatelné látky,fungující jako přenašeč elektronů, podstatně menší než je kon-centrace stanovovaného analytu, mohou se provádět pouze ki-netické metody. Pro stanovování konečného bodu-je nutné,aby redukovatelná látka, fungující jako přenašeč elektronů,byla ve srovnání se stanovovaným analytem v přebytku rozpuš-těna a aby stanovovaný analyt mohl úplně zreagovat. Při tomzreaguje proporcionální- množství redukovatelné látky ke sta-novovanému- analytu.,. Výhody oproti 'kinetickým měřením jsouobzvláště’rozšířená oblast linearity proudu/koncentrační vztah při amperometrických způsobech a lepší konkurenceschopnostvyšších koncentrací redukovatelné látky vzhledem ke kyslíkupři použití oxidáz jako oxidoreduktáz. Nevýhodná je všaknutnost přidat k úplné konverzi redukovatelnou látku, to zna-mená oxidační činidlo jako přenašeč elektronů s potenciálempodstatně vyšším, než má enzymový substrát a kromě toho nut-nost pracovat při elektrochemickém stanovení za přítomnostipřebytku oxidačního činidla, což potřebný potenciál ještě dá-le zvyšuje. Vysoké pracovní potenciály zlepšují však nespe-cifické reakce, na elektrodách, obzvláště tehdy, když 'mají:býtzkoušeny vzorky s větším množstvím součástí kromě stanovova-ného analytu.

Potud nejsou pro elektrochemické stanovení analy-tu enzymatickou oxidačně redukční reakcí ještě žádná uspoko-jivá řešení. Nejsou k disposici univerzálně použitelné re-dukovatelné látky, fungující jako přenašeče elektronů, kteréby byly schopny jak rychlé reakce s oxidoreduktázsmi, tak ta-ké nepotlačované reakce na povrchu elektrod při použití níz-kého potenciálu.

Podstata vynálezu Úkolem předloženého vynálezu tedy je vyřešení vý-še uvedeného problému. Obzvláště mají být nalezeny reduko-vatelné látky, které by mohly působit jako přenašeče elektro-nů mezi oxidoreduktážou a elektrodou v elektrochemickém sys-tému. Výše uvedený úkol.byl podle předloženého vynále-zu: vyřešen vypracováním způsobu elektrochemického stanoveníanalytu za přítomnosti oxidoreduktázy a redukovatelné látky,která v průběhu reakce při stanovení přenáší.přítomné ele-ktrony z oxidoreduktázy na elektrodu, což vede ke vzniku sig-nálu,. který .je mírou stanovovaného analytu, přičemž se redu-kovatelná látka enzymaticky redukuje a na elektrodě se oxi-duje, jehož podstata spočívá v tom, že látka vznikající oxi-dací na elektrodě, ge liší od původně použité redukovatelnélátky. Předmětem předloženého vynálezu je dále způsobelektrochemického stanovení oxidoreduktázy za přítomnosti od-povídajícího enzymového substrátu a redukovatelné látky, kte-rá je schopná přenášet elektrony z oxidoreduktázy na elektro-du, což způsobuje signál, který je mírou stanovovaného enzy-mu, přičemž se redukovatelná látka enzymaticky redukuje ana elektrodě se oxiduje, jehož podstata.spočívá v tom,..zelátka, vznikající oxidací na elektrodě, se.liší od původněpoužité redukovatelné látky. 6 Předmětem předloženého vynálezu je kromě toho po-užití; látky, která může přijímat elektrony z oxidoreduktázyza tvorba aromatického aminu bohatého na elektrony, jako pře-našeče elektronů mezi oxidoreduktázou a elektrodou v elektro-chemickém systému. Dále je předmětem předloženého vynálezu senzorovýelektrodový systém pro stanovení analytu v kapalném vzorku,obsahující alespoň dva elektricky vodivé prostředky, kteréjsou navzájem isolované, a které mohou být vždy pomocíelektricky vodivých povrchů v elektrickém kontaktu se zkou-maným vzorkem, přičemž alespoň jeden elektricky vodivý povrchjeve spojení s oxidoreduktázou a redukovatelnou látkou,která je schopna přenášet elektrony mezi oxidoreduktázou aelektricky vodivým povrchem, jehož podstata spočívá v tom, žejako redukovatelná látka se použije sloučenina, která se poredukci oxidoreduktázou na elektricky vodivém povrchu oxidu-je na látku, která se liší od původně použité redukovatelnélátky.

Konečně je předmětem předloženého vynálezu senzo-rový elektrodový systém pro elektrochemické stanovení oxido-reduktázy v kapalném vzorku, obsahující alespoň'dva elektric-ky vodivé prostředky, které.jsou navzájem isolované, a ketrémohou být vždy pomocí elektricky vodivých povrchů v elek-trickém kontaktu se zkoumaným vzorkem, přičemž alespoň je-den elektricky vodivý povrch je ve spojení s oxidoreduktázo-vým substrátem a redukovatelnou látkou, schopnou přenášetelektrony mezi oxidoreduktázou a elektricky vodivým povrchem,jehož podstata spočívá v tom, že se jako redukovatelná lát-ka použije sloučenina, která se po redukci oxidoreduktázouna elektricky vodivém povrchu oxiduje na látku, která se li-ší od původně použité redukovatelné látky.

Rovněž je konečně předmětem předloženého vynále-zu použití látky, která může přijímat elektrony z oxidore- '^ί!·'νΛ'· - 7 - duktázy za tvorby aromatického aminu, bohatého na elektrony,pro výrobu senzorového elektrodového systému podle předlože-ného vynálezu.

Ukázalo se, že nevýhody způsobů, známých ze stavutechniky, pro elektrochemické stanovení analytu za přítomnos-ti oxidoreduktázy a redukovatelné látky, která způsobuje nut-nost vysokého potenciálu, obzvláště při použití přebytkuxxhxt&HKK redukovatelné substance, fungující jako přenašečelektronů, ve srovnání se stanovovaným analytem, mohou býtpotlačeny z větší části využitím nereversibilní reakce. Tím,že se na elektrodě tvoří jiná oxidovaná látka, než jaká bylapoužita původně jako redukovatelná látka, můža se provádětelektrochemické stanovení při obzvláště nízkém potenciálu atím bez nebezpečí rušivých reakcí. Výhoda nízkého potenciá-lu se může využít také potom, když se redukovatelná látka,fungující, jako přenašeč elektronů, může použít ve srovnáníse stanovovaným analytem pouze v nepatrném množství, totižpotom, když se jak původně použitá redukovatelná látka, taktaké látka vznikající oxidací na elektrodě, redukuje oxido-reduktázou potřebnou pro elektrochemický způsob. Když sejak původně použitá redukovatelná látka, tak také látka vzni-kající na elektrodě oxidací, redukuje oxidoreduktázou na stej-nou substanci, působí původně použitá redukovatelná látkajako zásobárna pro druhou redukovatelnou látku, která je ve-dena v oběhu mezi elektrodou a enzymem, přičemž tato látkaje rozdílná od původně použité redukovatelné látky. Výhody způsobu podle předloženého vynálezu vyplý-vají z toho, že mohou být voleny jako redukovatelné látky ta-kové sloučeniny, u nichž vzniká enzymatickou redukcí slouče-nina,, která může být na elektrodě oxidována při nižším na- ·pětíe Při oxidaci na elektrodě neexistuje totiž ještě žád-ná zvláštní koncentrace této nové oxidované látky. Dosudmusela být enzymaticky redukovaná sloučenina zpětně oxidovánana elektrodě na původně používanou redukovatelnou látku, kte-rá je přítomna již ve vysoké koncentraci. K tomuto byl nut-ný zvýšený positivní potenciál.

Ve smyslu předloženého vynálezu jsou výhodné jakoredukovatelné látky použitelné sloučeniny, které přenášejíB±sk±XBuay z enzymu elektrony, vznikající při oxidaci sub-strátu, odpovídajícího pro použitou oxidoreduktázu, a přitom se tvoří na elektrony bohatý aromatický amin·. Pod pojmemamin bohatý na elektrony se zde rozumí sloučenina, která jena elektrony bohatší než anilin a vzhledem k bohatosti naelektrony se může na elektrodě oxidovat při nízkém potenciá-lu. V úvahu přicházejí například deriváty anilinu, které naaromatickém kruhu nebo na anilinovém dusíku nesou jeden nebovíce substituentů+1. a/nebo +M , jako je například hy-droxylová skupina, alkylová skupina, alkoxyskupina, aryloxy-skupina, alkylthioskupina, arylthioskupina, aminoskupina,monoalkylaminoskupina a dialkylaminoskupija.

Alkylová skupina, alkoxyskupina, alkylthioskupina,monoalkylaminoskupina a dialkylaninoskupina jsou zbytky, vnichž značí alkylová skupina uhlovodíkový zbytek s 1 až 6uhlíkovými atomy, který může být substituován hydroxylovouskupinou, aminoskupinou, která je popřípadě jednou nebo něko-likrát substituovaná alkylovoú skupinou s 1 až^6 uhlíko-vými atomy, dále skupinou .ΡΟ^Η^ γ''skupinou nebo sku-,

pinou CO^H . Kyselinové zbytky ΓΌ^Η^ , SO-^H a CC^H mohou být přítomny jako takové nebo ve formě solí jako amonné soli, soli s alkalickými kovy nebo soli s kovy alkalickýchzemin.

Aryloxyskupiny.a arylthioskupiny jsou aromatickézbytky s 6 až 10 uhlíkovými atomy, přičemž obzvláště vý-hodné jsou fenoxyskupiny a fenylthioskupiny.

Amonné soli jsou takové, které obsahují amoniovýion WI^+ nebo takové}. které obsahují amoniový kation jed-nou nebo několikrát substituovaný alkylovou skupinou,- arylo-vou skupinou nebo aralkylovou skupinou. Alkylový zbytek valkylové skupině a aralkylové skupině značí uhlovodíkovýzbytek s 1 až 6 uhlíkovými atomy. Aryl v arylové- skupiněa aralkylové skupině je aromatický kruhový systém se 6 až10 uhlíkovými atomy1 přičemž výhodná je fenylová skupina.Výhodný aralkylový zbytek je benzylová skupina.

Jako soli s alkalickým kovem jsou výhodné lithné,sodné a draselné soli. Ze solí s kovy alkalických zeminjsou výhodné soli hořečnaté a vápenaté.

Pod pojmem deriváty anilinu se rozumí také slou-čeniny,, které na aromatickém kruhovém systému.nesou nesubsti-tuovanou aminoskupinu nebo áminoskupinu jednou nebo vícekrátsubstituovanou 4-1 a/nebo +M substituenty, jako je napří-klad alkylová skupina, přičemž tento kruhový systém je anne-lován jedním nebo několika aromatickými a/nebo alicyklic-kými kruhy. Jako aromatické kruhy při tom přicházejí v úva-hu jak uhlovodíkové systémy, tak také heteroaromáty. Jakopříklady je možno uvést annelované benzenové nebo naftaleno-vé kruhy nebo annelovaný pyridinový kruh.

Pod pojmem alicyklické kruhy se rozumí nasycenénebo nenasycené cykloalifatické kruhy s 5 až 7 uhlíkovýmiatomy,, výhodně 5 nebo ' 6 uhlíkovými atomy. .

Jako možné alkylsubst.ituenty jsxsiiaŠHíiaxHXÉsi ani- 10 - noskupiny je možno uvést uhlovodíkové zbytky s 1 až 6uhlíkovými atomy, které mohou být substituovány hydroxysku-pinou, aminoskupinou substituovanou popřípadě jednou nebo ně-kolikrát alky lovou skupinou s 1 až 6 uhlíkovými atomy,skupinou PO3H2 , skupinou SO3H a skwillou .o.<: . Kyse-linové zbytky a CO^H. se mohou vyskytovat jako takové nebo ve formě solí jako soli amonné, soli s alka-lickými kovy nebo kovy alkalických zemin, kterých se rovněžtýká výše uvedená definice. Výše uvedeným příkladům pro +1 a/nebo +M sub-stituentům nelze rozumět jako úplnému výčtu těchto substi-tuentů. Pro odborníka je jednoznačně jasné, zda je daný zby-tek +1 a/nebo +M substituentem a zda mají všechny tytozbytky možných substituentů, které se podle předloženého vy-nálezu mohou použít, být v aromatických aminech bohatých naelektrony.

Obzvláště výhodnné jako redukovatelné látky, kte-ré vedou při přenosu elektronů z oxidoreduktázy na siskixaromatický amin bohatý na elektrony, který se poto může naelektrodě při.nízkém potenciálu oxidovat, jsou sloučeniny vy-brané ze skupiny sloučenin obecného vzorce I X - R /1/ , ve kterém značí R aromatický zbytek bohatý na elektrony aX skupinu NO nebo ΝΉΟΗ ,

a sloučenin obecného vzorce II HO - H = Y /11/, · ve kterém značí Y chinoidní systém, který je možno po re- (λ^Τλ^ζ •.·Λχ·η··,‘·ς-ίλ.ίΡ7·>ι·.ί5 ^\<i;Í^ÍiX^-V/-<';Ší-ÁiiSh'SS\·'· :'-;,·. '<.-A<\v./v7\v,y;/;/z;YkSóv' ^';r7'VA'^<;^w>WAV^ dukci v aromatickém stavu označit jakona elektrony bohatý.

Pod pojmem aromatický zbytek bohatý na elektronyse zde rozumí možnosti udané výše proaromatické aminy bo-haté na : elektrony.

Takovéto redukovatelné, látky podle vynálezu sepři přenosu elektronů z oxidoreduktázy na aromatický aminyredukují a při oxidaci na elektrodě se neoxidují na původníredukovatelné látky. Jak je pro odborníky známé, odstraňujíse při elektrochemické oxidaci aromatických aminů bohatýchna elektrony tyto elektrony z arylového zbytku, takže výsled-kem jsou radikály nebo chinoidní systémy. Nevznikají všakžádné chinoidní oximy, žádné hydroxylaminy a žádné nitroso-sloučeniny. . Elektrochemicky oxidované sloučeniny mohou častoopět přenášet elektrony z oxidoreduktázy a tak se zpětně re-dukovat na aromatické aminy bohaté na elektrony. Je prototaké možné používat redukovatelné látky ve srovnání se stano-vovaným analytem v nepatrné koncentraci, to jest v přebytku.Působí. tak j ako forma zásoby pro aromatické. aiiiny bohaté., na .elektrony, vytvořené při přenosu elektronů z oxidoreduktázy,přičemž tyto aminy mohou být vedeny v oběhu jako přenašečeelektronů mezi oxidoreduktázou a elektrodou.

Jako výhodné příklady pro přenašeče elektronů po-dle vynálezu se jeví následující : 9 N-/2-hydroxyethyl/-N -p-nitrosofenyl-piperazin , N,N,-bis-/2hydroxyethy1/-p-ni tro soanilin , o-me thoxy-/N,J-bis-/2-hydroxyethy1//-p-nitrosoanilin ,p-hydroxynitrosobenzen , 9 N-methyl-N -/4-nitrosofenyl/-piperazin 7': ;7^/βό7<ΐί·>ην.ν4·'*.’3' - 12 - p-chinondioxim , N,N-dimethy1-p-nitrosoanilin , Ν,Ν-diethyl-p-nitrosoanilin , N-/4-nitroso.fenyl/-morfolin , N-benzyl-N-/5 -karboxypentyl/-p-nitrosoanilin , N,ΪΤ-dimethy 1- 4-nitroso-1-naftylamin , N,W-3-trimethyl-4-nitrosoanilin , N-/2-hydroxyethyl/-5-nitrosoindolin , · 14.14- bis-/2-hydroxye thy1/- 3-chlor-4-ni tro so anilin , 2,4-dimethoxy-niťrosobenzen , 14, lí-bis-/2-methoxye thyl/-4-nitrosoanilin , 3-methoxy-4-nitrosofenol , E-/2-hydroxyethyl/-6-nitroso-1,2,3,4~ tetrahydrochinolin , 14.14- dimethy 1-3- chlor- 4-nitrosoanilin , 14.14- bis-/2-hydroxyethyl/-3-fluor-4-nitrosoanilin , 14.14- bis-/2-hydroxye.thyl/-3-ríiethylthio-4-nitrosoanilin , . 14- / 2- hydro xy e thy 1/-14- / 2- / 2-ra e thoxy e thoxy/- e thyl/- 4-nitroso-anilin , 14-/2-hydroxye thyl/-14-/3-rnethoxy-2-hydroxy-l-pro pyl/-4-nitro-soanilin , N-/2-hydroxyethyl/-lí~/3-/2-hydroxyethoxy/-2-hydroxy- 1-propyl/--4-nitrosoanilin , N-/2-hydroxyethyl/-lí-/2-/2-hydroxye thoxy/-ethyl/-4-nitroso-anilin . . Obzvláště výhodná redukovatelná látka podle před- loženého vynálezu je :4,I4-bis-/2-hydroxyethyl/-p-nitrosoanilin jVilktčU^iiíJhíbvRív; - 13 -

Ještě výhodnější se jeví h-/2-hydroxyethyl/-h-/2-/2-hydro-xyethoxy/-ethyl/-4-nitrosoanilin .

Mnohé podle- předloženého vynálezu použitelné slou-čeniny obecného vzorce I jsou známé. hové jsou derivátynitrosoanilinu obecného vzorce III

ve kterém značí - RJ R2 a; R· vodíkový atom, atom halogenu, alkoxy-skupinu nebo alkylthioskupinu,alkylovou skupinu a hydroxyalkylovou skupinu, nebo jsou stejné nebo rozdílné a. vždy značídialkylaminoalkylovou skupinu, hydroxy-alkoxyalkylovou nebo alkoxyalkylovouskupinu, které jsou popřípadě substituo-vané v alkylové části hydroxyskupinou,nebo polyalkoxyalkylovou skupinu, kteráje popřípadě v alkylové části substituo-vaná hydroxyskupinou, nebo tvoří alkylenový zbytek přerušený ato- mem síry nebo . dusíku , přičemž dusíkový atom je substituován alkylovou skupinou, hydroxyalkylovou skupinou, hydroxyalko- xyalkylovou skupinou, alkoxylovou sku-

2 1R a RJ 14 - pinou, hydroxyalkylovou skupinou, di-oxanýlyl-alkylovou skupinou nebo póly-alkoxyalkylovou skupinou, icfcEK přičemžuvedený zbytek může být vždy popřípadě valkyloyé části substituován hydroxylo-vou skupinou, nebo 1 2 3 p když R je v orto poloze ke skupině IJR R , potom R ta-ká společně s R^- představuje alkylenovou skupinu, přičemžR^ potom značí hydroxyalkylovou skupinu nebo když alkylenováskupina obsahuje 3 uhlíkové atomy, značí také popřípadě al-kylový zbytek, nebo když R není vodíkový atom, R' a R , které jsou stej-né -nebo rozdílné, značíhydroxyalkylovou skupinu nebo sůl to-hoto derivátu. V uvedeném obecném vzorci představuje atom haloge-nu atom fluoru, chloru, bromu nebo jodu, přičemž fluor a chlorjsou obzvláště výhodné. Alkylová skupina, alkoxylová skupi-na a alkylthioskupina jsou zbytky s 1 až 6 uhlíkovými ato-my, přičemž obzvláště výhodné jsou zbytky s 1 až 3 uhlí-kovými atomy. Uvedená definice pro alkylovou skupinu platítaké pro alkylové části v hydroxyalkylové skupině, dialkyl-aminoalkylové skupině, hydroxyalkoxyal.kylové skupině, alkoxy-alkylové skupině, polyalkoxyalkylové skupině, alkoxyhydroxy-alkolové skupině a dioxanylyl-alkylové skupině.

Dioxanylyl-alkylový zbytek je skupina, u které jedioxanový kruhový systém vázaný na alkylový zbytek. Výhodněse jedná o 1,4-dioxanový kruhový systém, to znamená 0 —\ - alkyl - - 15 -

Polyalkoxyalkylová skupina je zbytek vzorce• -alkyl-/alkoxy/n-alkoxy kde n. je číslo 1 až 10 , výhodně 1 až 4 , obzvláštěvýhodně 1 .až 3 . Alkylenová skupina, může. být přímá neborozvětvená, výhodně však s přímým řetězcem, nasycená nebo ne-nasycená, výhodně však nasycená, uhlovodíkový řetězec obsa-huje' 2 až 5 uhlíkových atomů, výhodně 2 až 4 uhlíkovéatomy, se dvěma Solnými vazebnými polohami.

Ve významu substituentů R^ a R^ , značícíchalkylenový zbytek, přerušený atomem síry nebo dusíku, je vý-hodný thiomorfolinový', popřípadě piperazinový zbytek, vytvo-řený za účasti dusíkového atomu z obecného vzorce III. Ob-zvláště výhodný je piperazinový zbytek.

Ve významu alky léno véno zbytku, ..tvořeného substi-tuenty R^ a R^ je výhodný indolinový nebo l,2,3>4-te-trahydrochinolinový zbytek, vytvořený za účasti aromatickéhokruhu z obecného vzorce III . Jako soli derivátu nitroso-anilinu obecného vzorce III podle vynálezu jsou obzvláště vý-hodné soli se silnými kyselinami.,' obzvláště minerálními, ja- .ko je například kyselina chlorovodíková, kyselina sírová,kyselina dusičná a kyselina fosforečná. Rejvýhodnější se je-ví hydrochloridy, tedy soli kyseliny solné.

Podle předloženého vynálezu jsou z nových nitroso-anilinových derivátů výhodné především následující : a/ 2,2’-//3-fluor-4-nitrosofenyl/imino/bis-ethylalkohol , b/ 2,2’-//3-chlor-4-nitrosofenyl/imino/bis-ethylalkohol , .c/ 2,2’-//3-methoxy-4-.nitrosofenyl/imino/bis-ethylalkohol , d/ 2,2’-//3-methylmerkapto-4-nitrosofenyl/imino/bis-ethyl- alkohol , 16 - e/ 2-//2-hydroxyethoxy/ethyl-/4-nitrosofenyl/amino/ethylal-kohol , f/ 2-//2-niethoxyethoxy/-ethyl-/4-nitrosofenyl/amino/ethylal- kohol , , g/ l-/n-/2-hydroxyethyl/-/4-nitrosoanilino/- 3~methoxy-2- -propylalkohol , h/ l-/N-/2-hydroxyethyl/-/4-nitrosoanilino//-3-/2-hydroxy-ethoxy/-2-propylalkohol , i/ 'l-methyl-4-/4-nitrosofenyl/-piperazin , j/ 4-/4-nitrosofenyl/-l-piperazino-ethylalkohol , k/ 5-nitroso-l-indolinethylalkohol , 1/ l-methyl~6-nitroso-l,2,3,4-tetrahydrochinolin , m/ 6-nitroso-3,4“dihydro-l/2H/chinolinethylalkohol ,a jejich soli . Z uvedených sloučenin jsou obzvláště výhodnésloučeniny a/ , d/ , e/ , f/ , §/ a h/ , jakož i jejichsoli. Zcela obzvláště výhodná je sloučenina e/ popřípadějejí soli, obzvláště hydrochlorid.

Sloučeniny obecného vzorce III jsou vyrobitel-né reakcí sloučeniny obecného vzorce IV

/IV/, -17 -

I ζ ζ 1 2 3 ζ ve kterém mají R , R a R·2 význam uvedený u sloučeninyobecného vzorce III., sdusitanem.. Analogický způsob je známý z J,J. D’Amico akol.. , J. Amer. Chem. Soc. 81, 5957 /1959/ .

Jako: dusitan se především používají dusitany alka-lických kovů, přičemž jako alkalické kovy přicházejí v úvahulithium, sodík, draslík, rubidium a cesium, výhodně se všakpoužívá dusitan sodný a dusitan draselný. Obzvláště výhodnýjejž dusitan sodný. Reakce se. provádí .výhodně v kyselém mediupři nízkých teplotách. Vhodná^teplota má být pod 10 °C ,výhodně v rozmezí -10 až +5 °C .

Reakce sloučeniny obecného vzorce IV s dusita-nem se provádí výhodně ve vodném mediu. Vhodně pH má býtnižší než 3 , obzvláště výhodně je nižší než 2 .

Pro reakci se při výhodné formě provedení před-loží sloučenina obecného vzorce IV nebo její sůl, výhodněsůl minerální kyseliny, jako je. kyselina chlorovodíková, ky-selina sírová, kyselina dusičná nebo kyselina fosforečná, do vodného, kyselého media a ochladí. K této předloze se za:udržování nízké teploty reakční směsipřidá dusitan, výhodně v rozpuštěné formě. Výhodně se takéjako rozpouštědlo pro dusitan použije vodné medium. Po pří-davku dusitanu se až do proběhnutí reakce udržuje reakční směspři nízké teplotě. Zpracování reakční směsi se výhodně pro-vádí extrakcí organickým rozpouštědlem a produkt se isolujez extraktu.

Sloučeniny podle předloženého vynálezu, použitel- né jako přenašeče elektronů, se mohou skladovat a použít voxidované formě. Tím se vyloučí náběhové proudy a konečný bod stanovení je proveditelný s přebytkem přenašeče elektro-nů. Sloučeniny podle předloženého vynálezu, použitelné jako přenašeče elektronů, jsou stabilní při skladování a mohou 18 - vstoupit do rychlé reakce s oxidoreduktázami. Jsou předevšímpři použití oxidáz konkurenceschopné vůči kyslíku a mohou býtpoužity v přebytku také vůči vysokým koncentracím stanovova-ného analytu. Obzvláště naposledy uvedená vlastnost je umož-něna dobrou rozpustností přenašeče elektronů podle vynálezu vevodném médiu.

Obzvláštní výhoda sloučenin podle předloženého vy-nálezu, použitelných jako přenašeče elektronů, je jejichvlastnost, že při elektrochemickém stanovení analytů v těl-ních tekutinách nedochází, nebo dochází pouze v nepodstatnémíře k neenzymatické redukci redukčně působícími látkami vtělních tekutinách. Přenašeče elektronů podle vynálezu se napovrchu elektrod rychle oxidují a v redukované formě nejsoucitlivé na kyslík. S těmito sloučeninami se může pracovatpři nízkém potenciálu pro oxidaci na elektrodě. V předloženém vynálezu sé jako analyt označuje sta- novovaná látka. Běžně se při tom jedná o komponentu ze smě-si látek. Především nabízí způsob podle vynálezu výhody přistanovování analytů v tělních tekutinách, jako je krev, plas-ma, sérum, moč, nebot zde velmi silně záleží na specifickéreakci pouze jedné· komponenty biologického vícesložkového sys-tému .

Způsob elektrochemického stanovení analytu podlepředloženého vynálezu spočívá v tom, že se analyt sám oxidu-je oxidoreduktázou, tedy představuje odpovídající enzymovýsubstrát, nebo se analyt v jedné nebo několika předřazenýchreakcích, především enzymatických reakcích, převede na slouče-ninu, která se může oxidovat pomocí oxidoreduktázy. Při ta-kovéto reakci uvolňované elektrony jsou úměrné množství sta-novovaného analytu. Když se tyto elektrony převedou reduko-vatelnou látkou podle vynálezu na. elektrodu., způsobuje tosignál, který je mírou pro stanovovaný analyt. úožrié jsouamperometrické způsoby, při kterých se měří proud, nebo po-tenciometrické způsoby, kdy se měří napětí. »m.;..;Mr....‘i:.P»vPn.\yíA,v;vNWAu*Ú3kJf'akskixků7.fóZÍ^ · <:.-<·:. . .'--'ó;’.-, !·'«.' - :;.·.Α./· - 19 -

Pro způsob podle předloženého vynálezu jsou jakooxidoreduktázy výhodné oxidázy, NAD/P/-nezávislé dehydroge-názy nebo diaforáza. Například se může podle vynálezu,sta-novovat glukóza sglukosooxidázou, laktát s laktátoxidázou,glycerolfosfát s glycerofosfátoxidázou nebo cholesterol po-mocí cholesteroloxidázy. Jako. NAD/P/~nezávislá dehydrogená-za se může například použít glukoso-dye-oxidoreduktáza prostanování glukózy. Diaforáza, která se může také označovatjako NADH:dye-oxidoreduktáza, se může použít výhodně k dů-kazu . NADH . V případech při nichž se má elektrochemicky stano-vit analyt, který neslouží sám jako substrát pro oxidoreduk-tázu, může se tento analyt převést pomocí jedné nebo několi-ka předřazených reakcí, obzvláště enzymatických reakcí, nasloučeninu, která je pro oxidoreduktázu akceptovatelná jakosubstrát. Například se mohou triglyceridy stanovit tak,že se tyto pomocí esterázy rozštěpí na glycerolově zbytky ana kyselinové zbytky, glycero1 se pomocí glyceroIkinázy aATP převedení na glycerolfosfát a tento se potom konečněoxiduje pomocí glycerofosfátoxidázy a při tom uvolněné elek-trony .se. přivádějí pomocí jednoho z;přenašečů elektronů, po-dle vynálezu, přičemž se vytváří proud, který je úměrnýmnožství triglyceridů ve zkoumaném vzorku.

Analogicky se může například také stanovovat cel-kový cholesterol tak, že se cholesterolester rozštěpí pomocícholesterolesterázy a takto vytvořený cholesterol se stanovíza pomoci cholesteroloxidázy. Také zde je množství taktovytvořeného cholesterolu a elektronů, uvolněných při oxidacipomocí cholesteroloxidázy. a převedených za pomoci redukova-telné látky podle předloženého vynálezu na elektrodu zy vy-tvoření proudu, úměrné stanovovanému množství celkového cho-lesterolu.

Pro stanovení NADH se nabízí enzym diaforáza.

20 -

Pomocí redukovatelné látky podle předloženého vynálezu semohou elektrony přenášet také z diaforázy na elektrodu.Vzhledem k tomu, že velmi mnoho biologických látek může en-zymaticky reagovat za tvorby NADH , je tímto způsobem mož-né mnoho analytů enzymatickými reakčními sekvencemi přemě-nit na MDH a tento' potom konečně stanovit přes diaforázua redukovatelnou látku podle vynálezu na jedné elektrodě. Z výše uvedeného výkladu se samo sebou rozumí,že se podle předloženého vynálezu přirozeně mohou stanovovattaké oxidoreduktázy, když se použije odpovídající sloučenina,která je akceptovatelná jako enzymový substrát, a redukova-telná látka podle vynálezu, lak se může například elektro-chemicky stanovit glukosooxidáza tak, že se glukóza a přena-šeč elektronů podle vynálezu uvede do styku za přítomnostiodpovídej íčího senzorového elektrodového systému.se stanovo-vaným vzorkem.

V-

Zn 'a u

Způsob podle předloženého vynálezu se předevšímvyznačuje tím, že redukovatelná látka, používaná pro přenoselektronů z oxidoreduktázy na elektrodu, je ve své oxidovanéformě stabilní při skladování a kromě toho je dobře rozpust-ná ve vodě. Toto je především velice důležité pro stanoveníanalytů v tělních tekutinách, jako je například krev, plas-ma, sérum a moč. Podle předloženého vynálezu použitelné re-dukovatelné látky vykazují rychlou reakci s oxidoreduktáza-mi a jsou obzvláště při reakci s oxidázami velmi dobře kon-kurenceschopné vůči kyslíku. Na základě své rozpustnostimohou být velmi dobře použitelné pro amperometrické způsoby,kde je potřebný přebytek oproti nejvyšší stanovované koncen-traci analytů. Vzhledem k tomu, že redukovatelné látky, po-užitelné podle předloženého vynálezu připouštějí v tělníchtekutinách nouze.zanedbatelné ne.ěnzymatické redukce . zde pří- i’·; tomnými redukčními činidly, na povrchu elektrod se rychle - 21 - oxidují a v redukované formě nejsou citlivé ke kyslíku, ho-dí se tyto látky velice dobře pro specifická, bezporuchováelektrochemická stanovení. Bezporuchová a specifická elektro-chemická stanovení analytů jsou možná tehdy, když se kromětoho tím především způsobí, že redukovatelná látka použitel-ná podle vynálezu vyžaduj e pouze nepatrný potenciál na ele-ktrodách.

Způsob podle předloženého vynálezu pro elektro-chemické stanovení analytu není omezen na určitá elektroche-mická zařízení. Dají se k němu například použít senzorovéelektrodové systémy podle stavu techniky. Zásadně jsou vhod- né senzorové elektrodové systémy pro stanovení analytu v ka-palném vzorku, které obsahují alespoň dva elektricky vodivéprostředky jako elektrody, které jsou navzájem isolované ajsou schopné uvedení do elektrického kontaktu se zkoumanýmvzorkem pomocí elektricky<vodivého povrchu. Dá se při tompředpokládat, ze se použijí pouze dvě elektrody, totiž pra-covní elektroda a referenční elektrody. Také je možné uspo-řádání měření bez referenční elektrody, to znamená pouze spracovní elektrodou a protielektrodou. Při tom se pouze udr- žuje konstantní externí napětí. Možné je ale také použitítří elektrod, totiž referenční elektrody, pracovní elektro-dy a protielektrody. Odpovídající senzorové elektrodové sys-témy jsou známé ze stavu techniky, například z G. Kenze aR. lleeb, "Blektrochemische Analytik”, Springer-Verlág/1986/ .

Je důležité, abypro elektrochemické stanovení ana-lytu /alespoň/ jedna elektroda, to znamená jedna elektrickyvodivá plocha kontaktovala oxidoreduktázu a redukovatelnoulátku, která je schopna přenášet elektrony mezi oxidoreduk-tázou a elektricky vodivým povrchem. Je při tom zřejmé, žese všechny potřebné reagencie společně se zkoumaným-vzorkem ,nacházejí v roztoku, nebo že část reagencií, především oxi- 22 1 ·>< * doreduktáza a/nebo redukovatelná látka přenášející elektro-ny,“ jsou imobilizovány na elektrodě a zbytek reagencií se na-chází v roztoku, nebo že je celé množství reagencií, potřeb-ných pro stanovení, imobilizované na elektrodě. Zásadněnení pro funkci senzorového elektrodového systému rozhodu-jící, zda pracovní elektroda kontaktuje oxidoreduktázu a re-dukovatelnou látku fungující jako přenašeč elektronů jakorozpuštěné látky, nebo zda jsou tyto látky naneseny jakopevné substance na elektrodě a rozpouštějí se popřípadě přikontaktu se stanovovaným kapalným vzorkem nebo teké po kon-taktu se stanovovaným kapalným vzorkem zůstávají na elektro-dě imobilizované.

Je samozřejmé také to, že pro stanovení oxidore- h duktázy analogicky platí výše popsané. Musí se zde vzítohled na to, že senzorový elektrodový systém musí kontakto- /;

vat substrát oxidoreduktázy a redukovatelnou látku podle vy- M nálezu. V ostatním platí pro tento případ stejné požadavky ;·· a formy provedení jako při stanovování analytu.

Objasnění výkresů Přiložené obrázky blíže objasňují předmětný vy-nález. Tyto ukazují :

Obr. 1 , část a/ Schéma funkce podle vynálezu použitelné redukovatelné látky v postupu podle vyná-lezu a v senzorovém elektrodovém systému,když je koncentrace přenašeče elektronůvětší nebo stejná, jako je koncentrace sta-novovaného analytu.

Obr. 1 , část. b/ Schéma funkce látky přenášející elektronyv postupu a v senzorovém elektrodovém sys-tému podle stavu techniky . - 23 -

Obr. 2, část a/

Obr. 2, část b/

Schéma funkce redukovatelné látky použitel-né . podle vynálezu v postupu podle vynálezua v senzorovém systému, když je koncentracelátky přenášející elektrony podstatné niž-ší, než je koncentrace stanovovaného ana-lytu .

Schéma funkce látky přenášející elektronyv postupu a senzorovém elektrodovém systémupodle, stavu techniky.

Obr. 3 Senzorový elektrodový systém pro provádění způsobupodle vynálezu, u kterého se potřebné substance na-cházejí v roztoku.

Obr. 4 Senzorový elektrodový systém pro provádění způsobu . podle vynálezu, koncipovaný jako senzor pro jednopoužití, popřípadě jednorázový senzor.

Obr. 5 Diagram s hodnotou, získanou z cyklovoltammogrammů,pro anodické proudové maximum při různých koncen-tracích glukózy .s. D,lí-bis-/2-hydroxyethyl/-p-ni-trosóanilinem jako látkou přenášející elektronypři elektrochemickém testu na glukózu podle vyná-lezu .

Obr. .6 Diagram pro vztah mezi proudovou hustotou a koncen-trací M)H v teštu na NADH podle vynálezu, 9

Obr. Ί> Cyklovoltammogramm pro D-/2-hydroxyethyl/-D -p- -nitrosofenyl-piperazin a D,D-bis-/2-hy dr oxy e thy 1/--p-nitrosoanilin .

Obr. 8 Diagram závislosti proudové hustoty na koncentraciglukózy způsobem podle předloženého vynálezu sk-methyl-N,_/4-nitrosofenyl/-piperazinem jako lát- - 24 - kou přenášející elektrony za přítomnosti a za ne-přítomnosti vzdušného kyslíku.

Obr. 9 Diagram závislosti proudové hustoty na koncentraci.glukózy způsobem podle stavu techniky s tetrathia- - fulvalem jako látkou přenášející elektrony, za pří-tomnosti a za nepřítomnosti vzdušného kyslíku.

Obr. 10 Diagram závislosti proudové hustoty kjanjSsntraxE naLDH-koncentraci způsobem podle, vynálezu s N,N-bis--/2-hydroxyethyl/-p-nitrosanilinem jako látkou pře-nášející elektrony v různých časových odstupech postartu reakce stanovení s laktátdehydrogenázou .

Obr. 11 Křivka proud-čas pro způsob podle vynálezu s ele-ktrodou pro jednorázové použití podle obr. 4 přidůkazu glukózy .

Obr. 12 Diagram závislosti proudu na koncentraci glukózy přizpůsobu podle vynálezu s elektrodou pro jednorázo-vé použití podle obr. 4 po 10 sekundách reakční doby.

Na obr. 1 a 2 jsou znázorněny rozdíly mezizpůsobem podle předloženého vynálezu /a/ a způsobem podlestavu techniky /b/ při použití přebytku látky přenášejícíelektrony vzhledem ke stanovovanému analytu /obr. 1/ a připoužití velmi nepatrného množství látky přenášející elektro-ny vzhledem ke koncentraci stanovovaného analytu /obr. 2/.Při způsobu podle stavu techniky podle obr. 1b/ se látkapřenášející elektrony /E -,/ za přítomnosti stanovované-ho analytu nebo od analytu odvozené látky /^,θ^/ , která je enzymaticky oxidovaná na /3 / , převádí na redukovanou ox formu /Ere5_/ · --a 3Θθίηθ elektrodě se redukovaný přenašeč

I V). ? ý 7: ; ?.ip í; / ίί - 2β - elektronů /®rej/ zpětně oxiduje odevzdáním elektronů napůvodně použitou redukovatelnou látku /Εθχ 3/ ·

Naproti tomu se při způsobu podle vynálezu podleobr. lb/ redukovatelná látka /E , fungující jako pře- nasec- elektronů při enzymatické oxidaci stanovovaného ana-lytu, popřípadě od analytu odvozené substance /^Γθ^/ látó· na /sox/ převádí na redukovanou formu /Ε-ρθ^/ · Přianodické oxidaci na-elektrodě.se potom tvoří oxidovaná for-ma přenašeče elektronů /E „/ , která se liší od původně použité redukovatelné látky /E -,/ . Vzhledem k tomu, žena počátku elektrochemické oxidace je zcela nepřítomná lát-ka E o , může být látka E_ , oxidována při obzvláště οχ á red nízkém potenciálu. Redukovatelná látka /E^r -,/ přenáše-jící elektrony, podle vynálezu, může být volena tak, aby bylpro anodickou oxidaci enzymaticky vytvořené redukované for-my /Ε-ρθβ/ ' potřebný relativně nízký potenciál. Tím_ se mo-hou vyloučit rušivé doprovodné reakce, které nastávají, kdyžse při vložení vysokého potenciálu na elektrody doprovodnélátky ve zkoumaném vzorku oxidují, a tak způsobují vznikproudu, což vede k falešně pozitivnímu výsledku. Při způ-sobu podle stavu techniky podle- obr. . lb/ je pro zpětnouoxidaci enzymaticky vytvořené redukované formy přenašečeelektronů kvůli přebytku redukovatelné látky /E -,/ potřebný vyšší potenciál než je potenciál původněpoužité redukovatelné látky /Eqx -j/ ·

Když se redukovatelná látka /E -,/ , fungujícíjako přenašeč elektronů, použije v menším množství vzhledemke stanovovanému analytu, popřípadě vzhledem k látce od sta-novovaného analytu odvozené /sre<3/ > potom se může při způ-sobu, podle stavu techniky /obr. 2b/ vést redukovatelná nebot redukovanána původně použi- látka v oběhu mezi elektrodou a enzymem,forma /Ere(i/ se anodicky zpětně oxidujetou redukovatelnou látku /EQX p/ ♦ - 27 - Při způsobu podle vynálezu /obr 2a/ v příxoadě, vy- když,se oxidovaná forma^přenašeče elektronů /Eqx » tvořená na elektrodě, rovněž redukovaným enzymem redukujejako původně použitá redukovatelná látka /E -,/ , může po- w Λ J- tom.sloužit redukovatelná látka /BQX]/ například jakopři skladování stabilní forma zásoby pro elektrony přenáše- jící systém /Eox 2/Ere<i/ .

Pro způsob podle předloženého vynálezu se mohouzásadně použít všechny senzorové elektrodové systémy, kteréjsou také vhodné pro provádění způsobů podle stavu techniky.Ták se může použít senzorový elektrodový systém podle obr. 3 ,který je například známý z G. Henze a R. Reeb, "Elektro-chemische Analytik”, Springer-Verlag /1986 . Při tom se ponoří pracovní elektroda _1 , proti-elektroda 2 a referenční elektroda J do stanovovanéhokapalného vzprku . Pro elektrody se mohou použít běžnémateriály. Pracovní elektroda _1 a protielektroda 2 mo-hou být například vytvořeny výhodně ze vzácných kovů nebo zaspolupoužití takovýchto kovů. Výhodné materiály pro pra-covní elektrodu 1 a protiel.ektřodu 2 jsou například zla-to a platina. Referenční elektroda 3 může být rovněž vy-tvořena ze zde použitých systémů. Výhodný je napříkladsystém stříbro/chlorid stříbrný. Referenční elektroda J 'je výhodně přes solný můstek, například roztok chloridu dra-selného, ve spojení s ostatním elektrodovým systémem _1 , 2ve stanovovaném kapalném vzorku.

Oxidoreduktáza, popřípadě oxidoreduktázový sys-tém, potřebný pro způsob podle vynálezu /vždy podle toho,zda se má stanovovat analyt nebo oxidoreduktáza/ a redukova-telná látka, fungující jako přenašeč elektronů, mohou být ve.zkoumaném vzorku rozpuštěné, nebo se mohou také všechny nebozčásti nacházet na pracovní elektrodě _1 . Jak musí být - 28 - elektrody vždy podle měřeného elektrického signálu navzájemelektricky spojené a regulované, je pro odborníka v dané ob-lasti samozřejmé.

Na obr. 4 je znázorněna konstrukce elektrody projednorázové použití, která se může například použít k důka-zu glukózy. Na izolovaném nosném materiálu 8 , napříkladpolykarbonétové folii, mohou být pomocí vhodných metod umí-stěny potřebné elektrody a jim příslušející přívodní vedení.Jako vhodné metody lze uvést sítotiskové způsoby, injekto-vací způsoby, napařovací způsoby nebo techniky tenkého fil-mu. Na obr. 4 je znázorněna pracovní elektroda s pří"slušným elektricky vodivým přívodem 55 , dále referenčníelektroda 6. s přívodem 66 a protielektroda Ί. s odpo-vídajícím přívodním vedením 77 . Pro elektrody a jejich pří-vody se mohou použít běžně známé elektricky vodivé materiály.Například pro výrobu elektricky vodivých přívodů je možnopoužít na trhu dosažitelné tlakové grafitové pasty.

Elektrody obsahují většinou vzácné kovy, jako jestříbro, zlato nebo platina. V senzorovém elektrodovém sys-tému podle vynálezu, znázorněném na obr. 4 obsahuje pra-covní elektroda nutné reagencie, potřebné k provádění ele-ktrochemického stanovení analytu, popřípadě oxidoreduktázy.

Pro stanovení glukózy obsahuje například glukóso-oxidázu, redukovatelnou látku přenášející elektrony podle vy-nálezu, pufrovací látku, která optimalizuje hodnotu pHstanovovaného vzorku pro enzymatickou reakci, jakož i popří-padě. detergent a botnací činidlo, aby se pomocí vodivě upra-veného materiálu dosáhlo směsi, která by vykazovala potřeb-nou konzistenci pro výrobu elektrody a aby směs byla zpraco-vatelná jako pasta. Jako materiál pro zlepšení vodivostise může například přidávat grafitový prášek.

Referenční elektroda 6. a protielektroda 7 , *· ώ;;·*;Λ"<ΛϊΐΛJ- Λί‘>ϊ«."Λ?7. - 29 - jakož i odpovídající přívodní vedení 66 a 77 mohou býtnapříklad vyrobeny z na trhu dosažitelné stříbrné vodivé pas-ty, která obsahuje práškovitý chlorid stříbrný.

Senzorový elektrodový systém podle obr. 4 se můžezhotovit ve velikosti asi 10 x 30 mm <, Zkoumaný vzorek(roztok) se může nanést na povrch elektrod nebo se nosičtestu může ponořit do zkoumaného roztoku tak, aby byly povr-chy elektrod pokryty<> Při amperometrickém měření se potommůže vložit na elektrody potenciál a měřit proud, který jeúměrný stanovovanému analytu. K tomu se mezi pracovní elektrodou 5 a protielek-trodou 7 proud měří a reguluje tak, aby se mezi referenčníelektrodou 6. a pracovní elektrodou 5 udržovalo předemdané napětí. Měření napětí mezi pracovní elektrodou Ji areferenčníelektrodou. 6 se provádí bez proudu, aby odporvedení zde nehrál žádnou roli. Při nepatrných požadavcíchna přesnost potenciálu na elektrodách se může také od bezprou-dého měření napětí upustit, nebo provozovat referenční elek-trodu 6 současně jako protielektrodu 7 ·

Vynález je blíže objasněn následujícími příklady. Příklady provedení vynálezu Příklad 1

Glukózový test

Použije se senzorový, elektrodový systém, podleobr. 3 . Pracovní elektroda 1 sestává ze zlatého drátuo ploše 0,1 cm . Protielektroda 2 je tvořena platinovým - 30 - ? drátem o ploše 0,1 cm a referenční elektroda 3 je tvoře-na, systémem stříbro/chlorid stříbrný (firma Orion Researchlne., Boston, Massachusetts, USA) . V reakční nádobě se nachází roztok z 0,1 mol/1 kaliumfosfátového pufru a 0,1 mol/1 chloridudraselného, pH 7,0 ; 10 mmol/1 N,N-bis-/2-hydroxyethyl/-p-nitrosoanilinu aglukózy v koncentraci v rozmezí O až 100 mmol/1 <>

Reakce pro stanovení se vyvolá přídavkem glukoso-oxidázy (EC 1.1.3.4) do reakční směsi a následujícím míchá-ním,, Přidá se tolik glukosooxidázy, aby koncentrace v re-akční směsi činila 0,5 mg/ml (125 U/ml) . Jednu minutu popřídavku glukosooxidázy se pomocí potentiestatu (Mod. 273EG &amp;G, Princeton Applied Research, Princeton, New Jersey,USA) změří cyklovoltammogramm při skanovací rychlosti100 mV/s . Vyhodnotí se proudy prvního oxidačního maximapři 150 mV . Získané výsledky ukazuje obr» 5 . Odpovída-jící měření po pěti minutách po přídavkuglukosooxidázy ne-po při zamezení přístupu kyslíku (pod argonem) nevykazu-jí žádné podstatné změny.

Jak je zřejmé z diagramu na obr, 5 , dosahuje se aždo koncentrace glukózy asi 30 mmol/1 lineární závislostiXHKdxKkáhHxpxHMdEXÉ maxima anodické proudové hustoty na kon-centraci glukózy. Při vyšších koncentracích glulózy než30 mmol/1 se N,N-bis-/2-hydroxyethyl/-p-nitrosoanilin, po-užitý jako látka přenášející elektrony, úplně přemění na od-povídající fenylendiamin. Vyšší koncentrace než 30 mmol/1tedy nevedou k dalšímu' vzestupu, proudu. Vzhledem k tomu, že.pro výrobu jedné molekuly fenylendiaminu jsou zapotřehídvě glukózové molekuly a pouze asi dvě třetiny celkové glu- - 31 - kozy se nachází v. beta-formě a tím jsou použitelné pro kon-verzi pomocí glukosooxidázy, odpovídá zjištěná úplná konver-ze ; 10 mmol/1 látky přenášející elektrony 30 mmol/1 glu-kózy přesně teoretické stechiometrii. Při použití glukoso-dye-oxidoreduktázy (EG 1.1.99.17) namísto glukosooxidázy (EC 1.1.3.4) v 0,1 mol/1 trispufru, 0,1 mol/1 chloridu draselného, pH 7,0 a za přídav-ku 1 % albuminu z hovězího séra, se získají srovnatelnévýsledky. Příklad 2

Důkaz NADH

Stavba a uspořádání měření je stejné, jako je po-psáno v příkladě 1 . Reakční nádoba obsahuje 0,1 mol/1 kaliumfosfátového pufru, o,l mol/1 chloridu dra-selného, pH 7,0 , 10 mmol/1 N,N-bis~/2-hydroxyethyl/-p-nitrosoanilinu aNADH v koncentraci v rozmezí 0 až 10 mmol/1 . Měření se odstartuje přídavkem a promícháním dia-forázy (NADH:dye-oxidoreduktáza) z mikroorganismů s reak-ční směsí. Přidává se tolik enzymu, aby koncentrace enzymuv reakční směsi činila 0,2 mg/ml (3 U/ml) . Měření prou-dové hustoty po jedné minutě reakční doby dává lineárnívztah proudové hustoty a koncentrace, znázorněný na obr. ó . P ř í k 1 a d 3

Stanovení laktátu

Za pomoci stejného experimentálního uspořádání a i,’.. • dií-is,!-,;;.Sxai‘ťz . --ν./Λ-·.'·. - 32 - se stejným přenašečem elektronů, jako je popsán v příkladě 1se může stanovit také laktát. Jako enzym se použije laktát-oxidáza (EG 1.1.3.2) a jako pufr 0,1 mol/1 citrátovéhopufru, 0,1 mol/1 chloridu draselného a ph 5,5 . Příklad 4

Stanovení glycerolfosfátu

Když se v příkladě 1 nahradí enzym glukosooxi-dáza glycerofosfátoxidázou (EG 1.1.3o21) a pufr 0,1 mol/1tris pufrem, 0,1 mol/1 chloridu draselného a ph 8,0 , můžese analogicky stanovit glycerolfosfát. P ř i klad 5

Stanovení cholesterolu

Když se v příkladě 1 nahradí glukosooxidáza cho-lesteroloxidázou ze streptomycet (EC 1.1.3.6) , akceptorelektronů 10 mmol/1 N-methyl-N -/4-nitrosofenyl/-pipérazi-nu a pufr 0,1 mol/1 kaliumfosfátového pufru, 0,1 mol/1chloridu draselného a pH 5,5 se 2% Tritonem X 100 , mů- že se analogicky jako je uvedeno v příkladě 1 stanovitcholesterol. Příklad 6

Redukovatelné látky přenášející elektrony podle vynálezu

Sloučeniny uváděné v následující tabulce 1 sepři koncentraci 10 mmol/1 v kxi 0,1 mol/1 kaliumfosfátové-ho pufru, o,l mol/1 chloridu draselného a pH 7,0 nechají - 33 - reagovat s 50 mmol/1 glukózy a 0,5 mg/ml glukosooxidázy · (125 U/ml) . Při měření se použije uspořádání, popsané v ’ příkladě 1 . Odpovídající cyklovoltammogrammy poskytují pí- ' j kové potenciály, udávané v mV proti normální vodíkové elek- j trodě, přenašeče elektronů, redukovaného pomocí glukosooxi- ’ | dázy a glukózy. t t

Jako míra pro rychlost konverze je v tabulce 1 ?' udáván poměr oxidačních proudů při potenciálu nejvyššího oxi- ;; dačního píku po jedné a po deseti minutách. ii i J, 5 £

Tabulka 1 s í? a/ přenašeč elektronů píkový potenciál ' y. / rychlost konverze ' ·> I N-/2-hydroxyethy 1-N - ;S fy -p-nitrosofeny 1-piperazin 340 97 í< N,N-bis-/2-hydroxy- ethyl/-p-nitroso- í) -anilin 210 94 fif % $ o-methoxy-/N,N-bis-/2- ,‘lj -hy droxy ethyl//-p-ni- ?L- trosoanilin 170 35 •3; Iň; fft· p-nitrosofenol 220 62 - $ • · *C / p-chinondioxim 2 50 35 N,N-dimethy1-4-ni- troso-l-naftylamin 175 25 Uí —. $

Tabulka 1 /pokračování/ - 34 - přenašeč elektronů píkový potenciál a/ rychlost konverze H,U-3-trime thyl-4--nitrosoanilin 220 K-/2-hydroxye thy1/- -5-nitrosoindolin 80 li, li- b i s- / 2- hy dr o xy-e thyl/-3-chlor-4--nitrosoanilin 315 2,4-dimethoxy-nitro-sobehzen 130 H',Ii-bis-/2-methoxy- ethyl/-4-nitroso~ anilin 245 3-me thoxy- 4- ni t r o-sofenol 140 N-/2-hydroxyethyl/--6-nitroso-1,2,3 »4--tetrahydrochinolin 95 K, li- dime thyl- 3- chlor--4-nitrosoanilin 275 li ,11— bis-/2-hydroxy-ethyl/- 3-f luor- 4-ni-trosoanilin 2b0 56 86 72 95 68 30 82 27 74 35 -

Tabulka 1 /pokračování/ přenašeč elektronů . píkový potenciál a// rychlost konverze h ,l\í-bis-/2-hydroxy-ethyl/-3-methylthio--4-nitrosoanilin 195 - -' · i i 21 II— / 2— hy dr o xy e thy 1/- N-- 2- /2-me thoxye thoxy/--e thy1-4-nitro s o anilin 210 í i 1 59 ; N- / 2- hydro xye thy1/- 3.4--/3-me thoxy-2-hydroxy--l-propyl/-4-nitroso-anilin 225 f í f. 65 i h-/2-hydroxye thy1/-h--/3-/2-hydroxyethoxy/--2-hydroxy-l-propyl/~4--nitrosoanilin 210 i i ,č ’í i t 54 " ť a/ První píkový potenciál přenašeče elektronů redukovaného č glukosooxidázou a glukózou v niV proti Ag/AgCl ; ; b/ Proud prvního maxima v cyklovoltammogrammu při jedné mi-nutě reakční doby : proud při 10 minutách reakční do-by v % ; c/ Koncentrace 5 - 10 mol/1 , - 36 -

Na obr. 7 jsou znázorněny cyklovoltammogrammypro K-/2-hydroxyethyl/-U -p-nitrosofenyl-piperazin a proÍJ,N-bis-/2-hydroxyethyl/-p-nitrosoanilin. Tyto cyklovoltam-mogramy byly měřeny s 10 mmol/1 glukózy, aby se vyloučiloovlivnění reakcemi zbytkové glukózy během snímání cyklovol-.tammógřarnmu.' ·?. Příklad 7

Srovnání xykixxxiixxxag přenašeče elektronů podle vynálezus přenašečem podle stavu techniky a/ Při uspořádání pokusu, jako je popsáno v příkladě· 1 , se použije R-methyl-N -/4-nitrosofenyl/-piperazin v kon-centraci 10~4 mol/1 ve .fosfátovém pupru o pH 7,0 .Měření cyklovoltammogrammů při koncentracích glukózymezi 0 a 3 mmol/1 dává závislost proudové hustoty nakoncentraci glukózy, jak je znázorněno na obr. 8 . Při malých koncentracích se zjištuje ovlivňování vzduš-ným kyslíkem, které se může vyloučit měřením pod argonem.Stejné výsledky jako při použití argonu jako ochrannéhoplynu se dosáhnou použitím přenašeče elektronů ve vyššíchkoncentracích /10" mol/1 jž. Rovněž tak může být vylou-čeno ovlivnění měření kyslíkem použitím glukosodehydro-genázy namísto glukosooxidázy. bb/ Když se namísto N-methyl-N -/4-nitrosofenyl/-piperazi~ nu jako přenašeče elektronů podle vynálezu použije jakopřenašeč elektronů podle stavu techniky tetrathiafulva-len, vypadá závislost proudové hustoty na koncentraciglukózy tak, jak je znázorněno na obr. 9 . Tetrathiaful- valen vykazuje podstatně vyšší.poruchy způsobované, kys- ty. líkem, než vykazuje přenašeč elektronů podle vynálezu.

Kromě toho jsou měřeny podstatně nižší proudové husto- 37 -

Tetrathiafulvalen je dosti těžko rozpustný. Abyse dosáhla koncentrace 10“^ mol/1 ve fosfátovém pufruo pH 7,0 , musí se použít 2,5% Tween 20 jako deter-gent. Nastavení podstatně vyšší koncentrace tetrathia-fulvalenu pro zamezení poruch způsobovaných kyslíkem,což je možné v případě přenašeče elkktřonů podle předlo-ženého vynálezu, je vzhledem ke špatné rozpustnosti vy-loučené. Příklad 8

Stanovení enzymu a/ Laktát-dehydrogenázový test Při uspořádání pokusu, jaké je popsáno v příkladě 1se použijí'následující roztoky : 0,1 mol/1 natriumfosfátového pufru, 0,1 mol/1 chlori-du draselného, pH 9,0 10 mmol/1 N,N-bis~/2-hydroxyethyl/-p-nitrosoanilinu ...... 0,1 mol/1 D,L-laktátu /sodná sůl/ , 1 U/ml diaforázy /z mikroorganismů/ a10 mmol/1 NAH + . 2a silného míchání /magnetické míchadlo, 1000 otáčekza minutu/ se při konstantním potenciálu 75 mV protisystému stříbro/chlorid stříbrný měří proud. Llěřeníse startuje přídavkem laktát-dehydrogenázy /EC 1.1.1.27/.Přidávají se různá množství laktát-dehydrogenázy a měříse vždy po. 100 200 , 300 ,400 ,500 a 600 sekundách. Získané křivky proud/čas jsou znázorněny na obr. 10 . Ϊ LDH aktivity, nanesené na ose x byly zjištěny pomocí i'

- 38 - pyruvátového redukčního testu. b/ Glukoso-dehydrogenázový test

Analogicky jako je popsáno v příkladě 8b/ , může se v0,1 mol/1.. kaliumfosfátového pufru, 0,1 mol/1. chloridudraselného, pH. 7,0 , provádět s 10 mmol/1 NAD+ ,. 10 mmol/1 přenašeče elektronů podle vynálezu ,, 1 U/ml ' diaforázy a 0,1 mol/1 glukózy test na glokoso-dehydro-genázu, závislou na NAD . . .

Stejným způsobem se mohou stanovovat také oxidázy, dia-foráza nebo na NAD nezávislé dehydrogenázy. Příkladě

X

Jednorázový elektrodový systém pro důkaz glukózy

Senzorový elektrodový systém podle obr. 4 se vy-robí tak, že·se na polykarbonátovou folii _8 nanese síto-tiskem . vhodnými tiskovými pastami pracovní elektroda J ,referenční elektroda 6 , protiélektroda 7 a odpovídajícípřívody /55 , 66 a 77/ · Přívody jsou tvořeny na trhudostupnou grafitovou tiskařskou pastou /Acheson 421 SS ,Deutsche Acheson Colloids, Ulm, BRD/ . Referenční elektroda6 a protielektroda 7 jsou tvořeny stříbrnou vodivou pas-tou, která je smísena s 20 % hmotnostními práškovítého chlo-ridu stříbrného /Acheson SS 24566, Deutsche Acheson Colloids,Ulm, BRD/ . Y' %

Pro pracovní elektrodu _5 se za botnání homoge-nizují 2 % hmotnostní hydroxyethylcelůlozy /Natrosol 250 G,Hercules. B7·,· Rijswijk, Holandsko/ v 0,05 mol/1 natriumfos-fátového pufru /pH 7,0/ , 3 mmol/1 N,N-bis-hydroxyethyl-p--nitrosoanilinu , 500 KU Glukosooxidázy '/Glucoseoxidase, - 39 -

Reinheitsgrad II, Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, BRD/na 100 g směsi, 30 % hmotnostních grafitového prášku /UF296/97 , Graphitwerke Kropfmtlhl, BRD/ a 4 % hmotnostníethylenglykolu. Plochy elektrod jsou 2 u pracovní elektrody _5 4 x 6. mm =.24.mm , 2 u referenční elektrody 6: lxl,5 mm =1,5 mm a2 u protielektrody 7 : 1 x 1,5 mm = 1,5 mm

Pomocí sítotisku vyrobený senzorový elektrodovýsystém se ponoří do měřeného roztoku, obsahujícího 0,05 mol/1natriumfosfátového pufru /pH 7,0/ ,0,1 mol/1 chloridu sod-ného a' 0 až 45 mmol/1 glukózy tak, aby byly plochy elektrodzkoušenou kapalinou překryty. Při potenciálu 200 mV pro-ti integrované referenční elektrodě 6 /stříbro/chloridstříbrný/ se naměří křivka proud/čas , která je znázorně-ná na obr. 11 . nanesením hodnot proudu po deseti sekundách měřícího času se získá kalibrační křivka, znázorněná naobr. 12 , která udává závislost proudového toku na koncentra-ci glukózy. P ř í k 1 a d 10 9 Výroba 2,2 -//4-nitrosoaryl/imino/bis-ethylalkoholů

Do čtyřlitrové tříhrdlé baňky s míchadlem, teplo-měrem a přikapávací nálevkou se za silného míchání dá po čás-tech 2 mol N,B-bis~/beta-hydroxyethylanilinu/ /popřípadějeho arylsubstituovaných analogů/ ve směsi 200 ml vody a400 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Vzniklý roz-tok se pomocí chladicí lázně ochladí na teplotu 0 °C a přiteplotě v rozmezí 0 až 2 °C se za míchání přikape v prů-běhu 20 minut roztok 148 g /2,1 mol/ dusitanu sodného ve200 ml vody. Reakční směs se míchá ještě po dobu 30 minut - 40 - při teplote 0 C , . odsaje se většina krystalické žlutavě až zelenavě zbarvené nitrososloučeniny a filtrační koláč se dvakrát.promyje 200 ml ledové polokoncentrované kyseliny chlorovodíkové. Pro vyčištění se surový produkt rozpustí v 900 ml vody, za silného míchání se přidá 400 ml koncentro- f vaně kyseliny chlorovodíkové, roztok se míchá po dobu 30 mi- | nut při teplotě místnosti a potom dalších 30 minut za chla- ί zení ledovou lázní. Získaný krystalizát se potom rozpustí \ v 580 ml vody, smísí se se 265 ml koncentrované kyseliny i- chlorovodíkové a znovu se míchá po dobu 30 minut při teplo- , * tě místnosti a 30 minut za chlazení ledovou lázní. Vytoře- ? né krystaly se odsají, třikrát se promyjí vždy 150 ml ledo- j

vého acetonu a dvakrát vždy 200 ml diethyletheru a nakonec J se vysuší ve vakuu při teplotě místnosti. Získá se takto : . 3 í > a/ 2,2 -//4-nitrosofenyl/imino/bis-ethylalkohol-hydrochlo- 3 rid i Výtěžek : 32,8 % teorie, zelené krystaly , teplota tání 160 °C /rozklad/ .

Analogicky se' získají odpovídající arylsubstituované analogy u. b/ 2,2 -//3-fluor-4-nitrosořenyl/imino/bis-ethylalkohol--hydrochloridVýtěžek : 26,5 % teorie , žluté krystaly , teplota tání 140 °C /rozklad/ , DC : silikagel /Kiesegel 60, Merck/ , pohyblivá fázeethylacetát/raethylalkohol = 5 : 1 , Rj? = 0,59 .

Vyrobeno z 3-f luor-1,N-bis-/2-hydroxyethyl/anilinu/Chem. Ab.str. _57, -.13922 /1:)62// c/ 2,2 -//3-chlor-4-nitrosofenyl/imino/bis-ethylalkohol~ -hydro chlorid 41 - ‘ίϊ^ί»’Β\’υ '‘•i.'.''·?t'.>.rí Výtěžek : 21 % teorie , žlúté krystaly , teplota tání 154 °C /rozklad/ , DC: silikagel /Kieselgel 60 , Merck/ , pohyblivá fázemethylénchlorid/methylalkohol = 5 : 1 , Rf = 0,72 .

Vyrobeno z - 3-chlor-W,N-bis-/2-hydroxyethyl/anilinu/M. Rreifelder, G. R. Stone, J. Org. Chem. 26 , 1499/1961// . 9 d/ 2,2 -//3-methoxy-4-nitrosofenyl/imino/bis-ethylalkohol--hydrochlorid Výtěžek : 32 % teorie, okrově zbarvené krystaly , teplota tání 145 až 146 °C. /rozklad/ , . DC : silikagel /Kiesegel 60 , Merck/ , po- hyblivá fáze Methylenchlorid/methylalkohol = 5:1,

Rf = 0,4 ·

Vyrobeno z 3-methoxy-K,K-bis/2-hydroxyethy1/anilinu/M. Rreifelder a kol., J. Org. Chem. 26 , 1499 /1961//. e/ 2,2’-//3-methy3merkapto-4-nitrosofenyl/imino/bis-ethyl-alkohol-hydrochlorid Výtěžek : 59,3 % teorie , cervenohnědé krystaly , teplota tání 148 °C /rozklad/, DC : silikagel /Kiesegel 60 , Merck/ , pohyblivá fázeethylacetát/methylalkohol = 5 : 1 , Rf = 0,53 ·

Vyrobeno z 3-methylmerkapto-LI,li- bis-/2-hydroxyethy 1/-anilinu .. . Tento je možno získat tak, že se 0,1 molu 3-me thy lmerkap to anilinu rozpustí v 50 ml 4 N kyseliny,sírové a 0,35 mol ethylenoxidu a reakční směs se míchápo dobu 12 hodin při teplotě místnosti. Potom se přidá ϊ ίϊ - 42 - přebytek.roztoku hydrogenuhličitanu sodného, extrahuje se | methylenchloridem a čistí se·sloupcovou chromatografiína silikagelu /Kiesegel 60 , Merck , pohyblivá fáze To- | luen/aceton = 5 : 2 , 1L·. = 0,18 / , výtěžek je 25 %produktu ve formě bezbarvé olejovi.té látky . f/ 2-/methyl/3-chlor-4-nitrosofenyl/amino/ethylalkohol-hy- * drochlorid í Výtěžek : 15 % teorie , ' . í žluté krystaly , teplota tání 147 °C /'rozklad/ , i ' ..... . DC : silikagel /Kiesegel 60 , Merck/ , pohyblivá fáze ξ methylenchlorid/methylalkohol = 19 : 1 , = 0,34 · · ' £

Vyrobeno z 2-/methyl/3-chlorfenyl/-amin</ethylakoholu. [

Tento je možno získat z 2-//3-chlórfenyl/amino/ethylal- Ί koholu tříhodinovým varem s methyljodidemza přítomnosti ; 10 % hydroxidu sodného. . Po čištění pomocí sloupcové í chromatografie na silikagelu. /Kiesegel 60 , Merck, po- i hyblivá fáze toluen/aceton = 0732 5 : 2 , = 0,39/ í •se. získá<25 % produktu ve formě bezbarvé olejovité kát-. . . ; ky. ; Příklad 11 2-/7 2-hydroxye thoxy/-e thy1-/4-ni tro so fenyl/aminq/e thylalko-hol-hydrochlorid A/ 2-/72-hydroxyethoxy/ethyl-/fenyl/aminoJ7ethylalkohol ,.;Íií£SíffiíS^^

CH2CH20CH2CH20H ν ....

CbLCrLCH ίΜΜΜ

146 g /0,8 mol/ 2-/2-anilinethoxy/ethanolu/získaného reakcí anilinu s 2-/2-chlorethoxy/-ethylalkoho-lem ve.výtěžku 54 % a ve formě bezbarvé olejoví té látkgts teplotou varu v rozmezí 131 až 133 °0/ se rozpustí v500 ml 4N kyseliny chlorovodíkové, za míchání se pomocí le-dové lázně ochladí na teplotu 0°C a v průběhu pěti minutse přikape při teplotě v rozmezí 0 až 10 UC 70,5 g, cožje asi 79 ml /1,6 mol/ ethylenoxidu. Po dvanáctihodino-vém stání reakční směsi při teplotě místnosti se přidá 500ml vody a za míchání se neutralizuje opatrným postupným pří- davkem celkem 200 g hydrogenuhliěitanu sodného. Potom seuvolněná base extrahuje 500 ml methylenchloridu, dále setřikrát protřepe vždy 250 ml methylenchloridu, organické fá-ze se spojí, vysuší se přes bezvodý síran sodný a ve vakuuse odpaří. Získ£ se takto 178,2 g produktu. DC : silikagel /Eiesegel, Merck/ , pohyblivá fáze toluen//aceton = 5 : 2 , = 0,18 . B/ 2-//2-hydroxyethoxy/-ethyl-/4-nitrosofenyl/amino/ethyl-alkohol-hydrochlorid í - 44 -

CH„CHQ0CHoCHo0HS d d d d

V gh„chooh 2 d HC1

Do tříhrdlé baňky o obsahu 2 litry, opatřené mí-chadlem, přikapávací nálevkou a teploměrem, se dá směs280 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a 140 ml vody,ochladí se na chladící lázni na teplotu -5 °C , v průběhu10 minut se za zachování této teploty přikape 178 g /0,79mol/ sloučeniny získané postupem podle A/ a reakční směsse míchá ještě po dobu 15 minut. Potom se přidá při teplo-tě 0 °C roztok 60 g /0,87 mol/ dusitanu sodného ve120 ml vody, přičemž se změní zbarvení z krvavě červené nahnědou, a reakční směs se míchá při teplotě 0 °G ještě podobu 30 minut. Potom se zředí přídavkem . 500 ml vody /pH.reakční směsi 1,4/ a za chlazení ledovou lázní se maximál-ně při teplotě 15 °G přikape 218 ml koncentrovaného vod-ného roztoku amoniaku až do pH 9 . Uvolněná nitrosobasese pětkrát vytřepe 400 ml n-butylalkoholu a rozpouštědlose odpaří na rotační odparce. Získá se takto 212,8 g pro-duktu ve formě tmavozelené olej ovité kapaliny.

Tento produkt se za účelem odstranění anorganic-kých látek rozmíchá se směsí 250 ml toluen/aceton 1:1,nerozpustný podíl se odsaje a promyje se 50 ml uvedené smě-si rozpouštědel. Jako zbytek zůstane 13,4 g anorganickéhomateriálu. Filtrát se chromaťograficky čistí na' sloupci si-likagelu /průměr 7,5 cm, výška náplně 90 cm , dělící ka-palina toluen/aceton 1:1/. Získá se takto 155 g ni- - 45 - trosobase ve formě tmavozelené olejovité kapaliny.

Tento produkt se rozpustí v 600 ml acetonu aroztok se za chlazení ledovou lázní po kapkách smísí s 250ml nasycené etherické kyseliny chlorovodíkové. Po třiceti-minutovém míchání za chlazení ledovou lázní se vytvořenékrystaly odsají, třikrát se promyjí 100 ml acetonu a vevakuu se vysuší přes difosforpentoxid. Získá se 159»5 g/63,6<% teorie/ v názvu uvedené sloučeniny,

Teplota tání 118 °C , DC : silikagel /Kiesegel 60., Merck/ , pohyblivá fáze to-luen/aceton 1:1, Rf = 0,24 · P ř í k lad 12

Analogickým způsobem jako v příkladě 11 se vyrobí následu-jící sloučeniny : a/ l-/K,lv-/2-hydroxyethyl/-/4-nitrosoanilino//~3-/2-hydro-’ xyethoxy/-2-propylalkoho1-hýdrochlorid HC1

X CH2CHCH2OCH2CH2OH

OH — 46 ~ Výtěžek : 10,5 % teorie , oranžově zbarvené krystaly, teplota tání 104 °C /roz-klad/ , “ DC : silikagel /Kiesegel 60 , Merck/ , pohyblivá fázetoluen/methylalkohol 5 : 1 , = 0,13 .

Vyrobí se z... . 1-/^,11-/2-hydroxyethyl//anilino//-3-/2-hydroxyethoxy/-2ppropylalkoholu

a tento z l~^-/anilino/7~3-/2-hydroxyethoxy/-2-pro-pylalkohoíu

přičemž tato sloučenina se získá z anilinu a l-cnlor-3- —/2-hydroxy—ethoxy/-2-propylalkoholu, pri výtěžku 21,5 % 47 produktu ve formě bezbarvé olejovité kapaliny, DC: silikagel /Kiesegel 60 , Merck/ , pohyblivá fázetoluen/aceton 5:2, R^ = 0,6 . 1

Uvedený l-Z?T,U-hydroxyethyl//anilino/12-3-/2--hydroxyetho-xy/-2-propylalkohol se získá reakcí uvedeného 1-/H- /ani-lino//~3-/2-hydroxyethoxy/-2-propylalkoholu reakcí sethylenoxidem za přítomnosti 4 U kyseliny octové za zís-kání 71 % produktu ve formě bezbarvé#/ olejovité kapali-ny , DC : silikagel /Kieselgel 60 , Merck/ , pohyblivá fázetoluen/aceton 5 : 2 , R^ = 0,43 · b/ l-/u-/2-hydroxyethy1/-/4-nitrosoanilino /}-3-methoxy-2-propylalkohol-hydrochlorid

Výtěžek činí 44,5 % , světle žluté krystaly , teplota tání 122 °C , /rozklad/ , DC : silikagel /Kieselgel 60 , Merck/ , pohyblivá fázemethylenchlorid/methylalkohol .49 : 1 , Rf = 0,55 ·

Tato sloučenina se získá z /t/-3-/Ú-/2-hydroxyethyl/ani- lino_/-l-methoxy-2-propylalkoholu /Měmecký říšský patent ' · ri I''i- • v·-:·:?.;·:-.·'?··;-·: ...... a :7ΛΛ<;;5·ν>ί.ν^,,·; Λ; ~ 48 - č. 603 808/1933/- Priedl&amp;nder 21, 295/ , /teplota va-ruli 212 až 214 °C / . c/ 2-//2-methoxyethoxy/ethy1-/4-nitrosofenyl/amino7ethyΙ-Α alkohol .

CHoCHo0H /52 X CH2CH20CH2CH20CH3 Výtěžek 25 % teorie ,.

Tmavohnědá pryskyřice , DC : silikagel /Kieselgel 60 , Merck/ , pohyblivá fázemethylenchlorid/methylalkohol 19 : 1 , Rf = °’49 »methýlenchlorid/methylalkóhol 5 : 1 , R^. = 0,77 /přes amorfní hygroskopický hydrochlorid s ΚΉ^/ .

Tato sloučenina se získá z 2- //2 -methoxyethoxy/ethyl--/fenvl/-amin^ethylalkoholu /A/

ch2ch2oh N ~ /A/ CH2CH20CH2CH20CH3 - 49 - která se připraví z anilinu a 2-raethoxy-ethoxy-chloetha-nu /jedna hodina zahříváni na 90 °C a dělení sloup-covou chromatografií na silikagelu se směsí toluen/ethyl-ester kyseliny octové 5:1» přičemž se E-/2-methoxy-ethoxymdcixH-ethyl/anilin,ve formě berbarvé olejovitékapaliny, R^ = 0,69/ a vytvořený produkt

dává s ethylenoxidem a 4 N kyselinou octovou sloučeni-nu /A/ ve formě bezbarvé olejovité kapaliny , DC : silikagel /Kieselgel 60 , Merck/ , pohyblivá fázetoluen/aceton 5 : 2 , R^ = 0,31 .... d/ 2-/?2-/2-/2-/2-methoxy/ethoxy/ethoxy/ethyl/-4-/nitroso-fenyl/aminq? ethylalkohol 0 = w

ch2ch2oi-i vch2ch2och2ch2och2ch2och2ch2oc!h3 - 50 - Výtěžek 63 % teorie , zelená olejovitá kapalina , DC : silikagel /Kieselgel 60 , Merck/ , pohyblivá fázetoluen/aceton 1:5» Rf = 0,64 ·

Uvedená sloučenina se získá z 2-/?2-/2~/2-/2-methoxy/ethoxy/ethoxy/ethyl/-4-/fenyl/amino/ethylalkoholu násle-dujícím způsobem. ( Z anilinu a diethylglykol-bis-/2-chlorethylethe-ru/ /Perry, Hibbert Can. J. Res. 14» 81 /1936// se zís-ká čtyřhodinovým zahříváním na teplotu 140 °G a násle-dujícím dělením na sloupcovou chromatografií na silika-gelu /Kieselgel 60 , Merck/ se směsí toluen/ethyles-ter kyseliny octové 2:1 sloučenina

K ‘CH2CH20CH2CH OCH2CH2OCH2CH2C1 s výtěžkem 20,5 % teorie ve formě žlutavé olej ovité ka-paliny ; Rf = 0,5 · Při reakci této sloučeniny s ethylenoxidem vzniká ve 4 Ukyselině octové prakticky kvantitativně sloučenina 51 -

XCH2CH20H. CH2CH20CH2CH20CH2CH20CH2CH2Cl ve formě zbarvené Olegovité kapaliny, \ DC : silikagel /Kieselgel 60 , Merck/ , pohyblivá fázemethylenchlorid/methylalkohol 19 : 1 , R^ = 0,61. Při zahřívání uvedené sloučeniny s KaOCH^ v methylal-koholu po dobu 24 hodin pod zpětným chladičem, zahuště-ní, přídavku vody, vyjmutí do ethylesteru kyseliny octo-vé a následujícím čištění sloupcovou chromatografií su-rového produktu na silikagelu /Kieselgel 60 , Merck/s toluenem a acetonem 5:2 se získá 51,3 % teorieproduktu ve formě bezbarvé olejovité kapaliny , Rf = 0,21. Příklad 13 K'-/4-nitrosofenyl/-K-/?2-diethylamino/-ethy3^-h,N -diethyl--1,2-ethandiamin-tris-hydrochlorid

xch2ch2k/c2h5/2 2X15/ 2 . 3 HG1 52 -

Teplota tání 125 °0 /rozklad/ , DC : silikagel /Kieselgel 60 , Merck/ , pohyblivá fázeisopropylalkohol/n-butylacetát/voda/koncentrovaný vodný amo-niak 50 : 30 : 15 : 5 , Rf = 0,56 ·

Uvedená sloučenina se připraví z ' U-/di-/2-diethylamino/et- hyl/anilinu . Příklad 14 Výroba 1-substituovaných 4-/4-nitrosofenyl/-piperazinů

0 = N

/—\

U N - R \—/ a/ 1-methy1-4-/4-nitrosofenyl/-piperazin-dihydrochlorid

0 = U

/~Λ N h - CUL . HC1 17,62 g /0,1 mol/ l-methyl-4-fenyl-piperazinu /který se připraví z 0,3 mol 1-fenylpiperazinu čtyřhodinovým zahříváním s 0,2 mol trinethylfos- 53 - fátu na teplotu 150 °G , isolací přídavkem hy-droxidu sodného a extrahováním diethyletherem,čištěním pomocí sloupcové chromatografie na sili-kagelu /Kieselgel 60, Merck/ použitím směsi me-thylenchlorid/methylalkohol 5 í 1 a získá se 40,1 % produktu ve formě, bezbarvé olejovité ka-paliny s teplotou varuQ 82 až 84.°C a =0,31 - podle Stewart a kol., J. Org. Chem. 13, 134 /19W/; se rozpustí ve směsi 20 ml koncentrované kyseliny chlo-rovodíkové a 10 ml vody, potom sé při teplotě v rozme-zí 0 až 2 °C přikape v rozmezí 15 minut roztok 8 g/0,12 mol/ dusitanu sodného v 16 ml vody a reakční směsse míchá po dobu 30 minut při teplotě 10 °C . Za stá-lého chlazení se přidá při stejné teplotě 60 ml koncen-trovaného vodného amoniaku, reakční směs se zředí 100 mlvody a červenohnědý roztok ,/pH 9/ se vytřepe třikrátvždy 100 ml methylenchloridu. Organická fáze se potomvysuší přes bezvodýsíran sodný a dále se odsaje a za-hustí. Zbytek /20,6 g zelených krystal·!/ se vyjme do 40 ml methylalkoholu.a za mxKhánxx® chlazení se smísí s20 ml nasycené etherické kyseliny chlorovodíkové. Poodsátí a promytí dvakrát 20 ml diethyletheru se získá 15,8 g /5' 6,8 % teorie/ v názvu uvedené sloučeniny jakoraechovitě zelenoá krystalické^ látky.

Teplota tání 187 až 189 °C /rozklad/ , DC : silikagel /Kieselgel 60 , herek/ methylenchlorid/methylalkohol 5:1, pohyblivá fáze

Rf = 0,72

Analogicky se vyrobí : • b/ 4- / 4-nitro sofenyl/~ 1-pip erazino- e tbylalkoho1- dihydro’-chlorid - 54 -

Ύ~^

Ν Η. - CH2CH2OH V_/ 2$ HC1 z 2-/4-fenyl-piperazino/-ethylalkoholu /Kremer, J.

Amer. Chem. Soc. 58, 379 /1936// jako světle šedé krys-taly ; čistá látka rekrystálizačí ze směsi methylalko-hol/voda 7:1, teplota tání 170 až 173 °C /rozklad/,DC : silikagel /Kieselgel 60 , Merck/ , pohyblivá fázeraethylenchlorid/methylalkohol 5 : 1 > Rf = 0,67 ; c/ 3-/4-/4-nitrosofenyl#-l-piperazinyl/-l,2-propandiol-di~hydrochlorid '

z l-fenyl-4-/2,3-dihydroxypropyl/-piperazinu /H. -Kowella kol., J. Org. Chem. 27, 1711 /1962// jako zelená krys-talická látka, teplota tání 1&amp;3 °C /rozklad/ , DC : silikagel /Kieselgel 60 , Merck/ , pohyblivá fázeethylester 'kyseliny octóvé/methylalkohol 2 : 1

Rf = 0,41 ; - 55 - d/ 4- / 4- ni tr o s o feny 1/- alfa- /íne thoxyme thy 1/- p ip eraz ino-1--ethylalkohol-dihydrochlorid

CH2CHCH2OCH3

OH 2 HC1 z 1-feny 1-4-/2-hydroxy-3-rnethoxypropyl/piperazinu/H. Howell a kol., J. Org. Chem. 27 , 1711 /1962// veformě žlutých krystalů, teplota tání 162 °C /rozklad/ ,DC : silikagel /Kieselgel 60 , Merck/ , pohyblivá fázernethylenchlorid/methylalkohol 19 : 1 > = 0,51 > e/ 2-^2-/4~/4-nitrosofenyl/-l-piperazinyl/ethoxy/-e±hylal-koho1-dihydrochlorid 0

/“λ N N - CHoCHo0CHoCHQ0CI-L· . 2 HC1 \_y z 2-/2-/4-/feny1/-1-piperaziny1/e thoxy-e thylalkoholu/získatelného ze 2 mol . 1-fenylpiperazi.hu. .a -.1-/2-chlor-,ethoxy/-2-rnethoxyethanu podle US patentu c,. 2 837 974/ve formě zelených krystalů, teplota tání 134 °C /roz- - 56 -Μ V h: Λ.'/λ’ί ;' klad/ , DC : silikagel /Kieselgel 60 , Merck/ , pohyb-livá fáze ethylester kyseliny octové/methylalkohol 5:1,Rf = 0,31 ; f/ . l-/l,4“diqxanylyl/methyl-4-/4-nitrosofenyl/-piperazin--dihydrochlorid

. 2 HC1 z 1-/1,4-dioxanylyl/methyl-4-/fenyl/-piperazinu /zís-kaného pětihodinovým zahříváním l-chlor-3-*/beta-hydroxy-ethoxy/-2-propylalkoholu /M. S. Kharash, W. Nudenberg, J. Org. Chem. 8, 189 /1943// a 1-fenylpiperazinem nateplotu I30 °C , extrakcí, ethylesterem kyseliny octovéa zahuštěním. Ohromatografické čištění na sloupci sili-kagelu /Kieselgel 60 , Merck/ , pohyblivá fáze toluen/aceton 5:2/ ve formě žlutozelené krystalické látky,teplota tání 166 °C /rozklad/ , DC : silikagel /Kieselgel 60 , Merck/ , pohyblivá fázetoluen/methylalkohol 5:1,

Rf =0,69 Příklad. 15

Nitro s o heteřo cykly a/ 5-nitroso-l-indolinethylalkohol-hydrochlorid 57 -

HC1 Z 1-indolinoethylalkoholu /získaného jednohodinovým zahříváním 1 mol in-dolinu s 1 mol 2-chlorethylalkoholu za přítom-nosti jemně práškovitého uhličitanu draselného,pod zpětným chladičem, přičemž se získá 63 >3 % / /teorie/ produktu ve formě bezbarvé olej ovité ka-paliny s teplotou varuQ v rozmezí 128 až 130°C , DG silikagel /Kieselgel 60 , Merck/ ,pohyblivá fáze toluen/aceton, 5:2, R^ = 0,42/

Se·získá nitrososloučenina, která se přídavkem amoniaku .s methylenchloridem isoluje jako base. Pomocí etherickékyseliny chlorovodíkové se tato base převede na hydrochlo-rid. Získá se takto světle hnědá krystalická látka o te-plotě tání 180 °C , DG : silikagel /Kieselgel 60 , Merck/ , pohyblivá fáze methylenchlorid/methylalkohol 5 : 1 » R^ = 0,51 ; b/ 1-methyl-6-nitroso-l,2,3» 4-tetrahydro-chinolin-hydro-chlorid

Uvedená sloučenina se vyrobí z l-methyl-l,2,3»4-tetra-hydro-chinolinu /tento se získá z 1,2,3,4-tetrahydro-chinolinu zahříváním s trimethylfosfátem postupem podleHuisgen a kol. , Chern. Ber. 92 , 203 /1959//· Surový produkt se připraví běžným způsobem analogicky jako vpříkladech 10 a 11 a přečistí se na silikagelu /Kiesel-gel 60 , Merck/ směsí isopropylalkoholu,n-butylacetátu avody 5 : 3 : 2 . Rozpuštěním v acetonu a po přídavkuetherické. kyseliny .chlorovodíkové se získá v názvu uve-dená sloučenina s teplotou tání 123 až 124 °C /rozkl./.DC : silikagel /Kieselgel 60 , Merck/ , pohyblivá fázeisopropylalkohol/n-butylacetát/voda 5 : 3 · 2 , = 0,7· c/ 6-nitroso-3,4-dihydro-1/2H/-chinolin-ethylalkohol-hvdro-chlorid

59 -

Uvedená sloučenina se získá z2-/3>4-dihydro-2H-chinolin--l-yl/ethanolu /Zaheer a kol., Indián J. Citem. 1, 479/1963//· Surový produkt se přečistí pomocí sloupcové citro-matografie na silikagelu /Kieselgel 60 , Merck/ za použi-tí směsi Methylenchloridu a methylalkoholu 19 : 1 . Povyšrážení hydrochloridu z isopropylalkoholu etherickou kyse-linou' chlorovodíkovou a překrystalizováním z ethylalkoholuse získá 10,5 % /teorie/ okrově zbarvených krystalů v názvu uvedené sloučeniny o teplotě tání 193 až 135 °C /rozkl.DC : silikagel /Kieselgel 60 , Merck/, pohyblivá fáze me-thylenchlorid/methylalkohol 19 : 1 , R^. = 0,36 .

Claims (2)

1. - 60 - Patentové nárokv

   Z °

   1. Způsob elektrochemického stanovení analytu za přítomnosti oxidoreduktázy a redukovatelné látky, kteráv průběhu stánovovací reakce přenáší uvolněné elektronyz oxidoreduktázy na elektrodu, což způsobuje signál,který je mírou pro stanovovaný analvt, přičemž redukova-telná látka se enzymaticky redukuje a na elektrodě seoxiduje, vyznačující se vznikající na elektrodě oxidací, jeužité redukovatelné látky. tím , že látka,různá od původně po- Z,působ- podle bodu 1v y z n a č u j í c í se t í m , že se jak původně použitá redukovatelná látka., tak také látka vznikajícíoxidací na elektrodě,, .redukují oxidoreduktázou. Způsob podle bodů 1 a 2 , vyznačující se t í m , že se jako reduko-vatelná látka použije taková sloučenina, která přijímáelektrony, vznikající v průběhu stánovovací reakce, zoxidoreduktázy za tvorby aromatického aminu bohatého naelektrony.
2. 4. Způsob podle bodu 3 , v y z n a o u jící se t í m , že se jako redu- . kovatelná látka.použije- sloučenina vybraná ze s.kupinyzahrnující sloučeniny obecného vzorce I 61 - /1/, ve kterém značí R aromatický zbytek bohatý na elektro-ny- e. Σ skupinu NO nebo skupinu NHOH , a sloučeniny obecného vzorce II HO - /11/, ve kterém značí Y chinoidní systém, který je možno v aromatickém stavu, vzniklém redukcí,označit jako bohatý na. elektrony . Způsob podlevyznačuj í c reduktáza použije oxidáza,NAD/.?/ nebo.diaforáza. bodů 1 až 4 ,í se t í m se se jako oxido- dehydrogenáza nezávislá na Způsob elektrochemického stanovení oxidoreduktá-zy za přítomnosti odpovídajícího enzymového substrátu aredukovatelné látky, která je schopná přenášet elektronyz oxidoreduktázy na elektrodu, což vede k signálu, kte-rý je mírou pro stanovovaný enzym, přičemž se redukova-telná látka enzymaticky redukuje a na elektrodě se oxi-duje, vyznačující se t í m , že látkavznikající oxidací na elektrodě je různá od původně po-užité redukovatelné látky . Použití látky, která nůže přijímat elektrony z bohatého na idoreduktážou oxidoreduktázy za tvorby aromatického aminuelektrony, jako přenašeče elektronů mezi oxa elektrodou v elektrochemickém systému. 62 θ· Senzorový, elektrodový systém pro elektrochemické stanovení analytu v kapalném vzorku, obsahující alespoňdva elektricky vodivé prostředky, které jsou navzájemisolované a které mohou být v elektrickém kontaktu sezkoumaným vzorkem prostřednictvím, svých elektricky vodi-vých povrchů, přičemž ‘alespoň jedaa z elektricky vodivýchpovrchů je uveden do styku s oxidoreduktázou a reduko-vatelnou látkou, schopnou přenášet elektrony mezi oxido-reduktázou a elektricky vodivým povrchem, vyznačující se tím, že jako redukova-telná látka je použita sloučenina, která se po redukcioxidoreduktázou oxiduje na elektricky vodivém povrchu nalátku, která je různá od původně použité redukovatelnélátky. podle bodu 8 , , že jak původně po-sloučenina, vznika-oxidací, je redukova- 9- lo Senzorový elektrodový systémvyznačující se tímužitá redukovatelná látka, tak takéjící na elektricky vodivém povrchuná oxidoreduktázou. Senzorový elektrodový systém pro elektrochemickéstanovení oxidoreduktázy v kapalném vzorku, obsahujícíalespoň dva elektricky vodivé prostředky, které jsou na- vzájem isolované a které mohou být v elektrickém kontak- tu se zkoumaným vzorkem prostřednictvím svých elektric-ky vodivých povrchů, přičemž alespoň jeden z elektrickyvodivých povrchů je uveden do styku se substrátem oxido-reduktázy a redukovatelnou látkou, schopnou přenášet elektrony mezi oxidoreduktázou a elektricky vodivým po-vrchem , vyznačující se t i m , že jako redukovatelná látka je použita sloučenina, která se po.redukci oxidoreduktázou oxiduje na električky vodivémpovrchu na látku, která je různá od původně použité re-dukovatelné látky. 63 - 11. 12. Použití látky, která může přijímat elektrony zoxidoreduktázy za tvorby aromatického aminu bohatého naelektrony, pro výrobu senzorového elektrodového systémupodle bodů 8 nebo 10 . Derivát nitrosoanilinu obecného vzorce III

   ve kterém 9 3 R- a značí R1 vodíkový atom, atom halogenu, al-koxylovou skupinu nebo alkylthio-skupinu , p R alkylovou skupinu ar3 hydroxyalkylovou skupinu, nebo jsou stejné nebo rozdílné a značí dialkylami-noalkylovou skupinu, hydroxyalkoxyalkylovounebo alkoxyalkylovou skupinu, které jsou po-případě v alkylové části substituované hydro-xylovou skupinou, nebo polyalkoxyalkylovouskupinu, která je popřípadě v alkylové částisubstituovaná hydroxylovou skupinou, nebo - 64 - R'“ a RJ tvoří alkylenový zbytek, přerušený atomem si-vý nebo dusíku, který je substituovaný alky-lávou skupinou, hydroxyalkylovou skupinou,hydroxyalkoxyalkylovou skupinou, alkxxyxkuxηχεηη, alkoxyhyd.roxyalkylovou skupinou, di-ox^nylyl-alkylovou skupinou nebo polyalkoxy-alkylovou skupinou, přičemž tyto jsou popří-padě vždy v alkylové části substituovány hy-droxylovou skupinou, nebo 1 ~ 2 3 když substituent R je v orto poloze ke skupině KR R , o . Ί značí Rc také společně s R alkylenový zbytek, při-čemž R^ potom značí hydroxyalkylovou skupinu, nebokdyž alkylenový zbytek obsahuje 3 uhlíkové atomy, zna-čí popřípadě také alkylovou skupinu, nebo když substituent R1 neznačí vodíkový p o z čí R a R' , které jsou stejné nebodroxyalkylovou skupinu, atom, potom zna-roždíIné, v zdy hy- nebo sůl tohoto derivátu . Způsob výroby sloučeniny podlevyznačující se tím,vat sloučenina obecného vzorce IV bodu 12, že se nechá reago- 13 65 ve s

   Ή Kterém áusitanem · κ-

   K- 3 ν^2·Ώ·Θ?Λ /XV/» uve XenX γ>ο<1θ 12·