KR20210083205A - 신규한 유기 전자전달매개체 및 이를 포함하는 장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 탁월한 산화환원전위를 나타내는 신규한 유기전자전달매개체 및 이를 포함하는 향상된 성능을 갖는 전기화학적 바이오센서와 같은 장치에 관한 것이다.

Description

신규한 유기 전자전달매개체 및 이를 포함하는 장치{Novel organic eletron-transfer mediator and device comprising the same}
본 발명은 신규한 유기전자전달매개체 및 이를 포함하는 전기화학적 바이오센서에 관한 것이다.
글루코스 센서의 작동 원리는 도 1과 같다. 구체적으로, 글루코스가 글루코스 산화 효소 (glucose oxidase)에 의해 산화되어 글루콘산이 되고 전자를 전달받은 환원된 중간체가 전극에 전자를 전달하게 된다. 결과적으로 혈중 포도당과 효소의 반응으로 발생하는 전자의 흐름이 전기적 신호로 변환되어 혈중 포도당 농도를 알 수 있게 된다.
혈당 측정 스트립에 사용되는 대표적인 글루코스 탈수소효소(glucose dehydrogenase)로 glucose dehydrogenase-flavin adenine dinucleotide (FAD-GDH)가 있다. FAD-GDH와 전극 사이 전자의 이동을 도와줄 수 있는 전자전달 매개체가 필요로 한데 Fe(CN)6 -3가 물에 잘 녹고, 저렴하며, 높은 민감도를 갖기 때문에 적절한 화합물로 알려져 있다. 그러나 활성 자리의 낮은 친화도 때문에 FAD-GDH와 Fe(CN)6 -3의 속도상수 (k2=kcat/kM)가 1 ⅹ103 M-1s-1 정도로 낮아 둘 사이의 반응성이 좋지 않다는 한계가 있다.
한편, 높은 속도 상수를 갖는 오스뮴 계열의 착물이 전자전달 매개체로 활용되고 있다. 착물의 리간드를 변형하면 적절한 전기화학적 전위를 갖도록 조절할 수 있기 때문에 활용성 측면에서도 매우 유용하지만 오스뮴 금속이 매우 비싸기 때문에 일회용인 혈당 측정 스트립에 쓰이기에 적절하지 않다. 때문에 값싸고 지속가능한 대체제로써 유기화합물에 대한 연구가 진행되고 있다. 현재 naphthoquinone/phenanthrenequinone 유도체를 비롯한 다양한 유기계열 전자전달 매개체들의 특성이 보고되어 있으나, 여전히 이러한 전자전달매개체로 사용될 수 있는 유기계열 물질들에 대한 개발 요구가 존재하고 있다.
이러한 배경하에서 본 발명자들은 페노싸이아진 유기 전자전달매개체 (phenothiazine organic electron transfer mediator)의 산화환원 반응에 주목했다. 하기 반응식 1과 같이 해당 페노싸이아진 유기 전자전달매개체가 산화환원 반응이 일어날 때 산화환원 전위는 수용액에서 측정했을 때 Ag/AgCl 기준전극 대비 -0.1 V로 알려져 있다(국제특허공개 WO 2008/036516호 참조, 미국특허 US 5,520,786 참조).
글루코스 센서가 저혈당구간(낮은 감응전류구간)에서 정확성이 떨어지는 중요한 요인은 이 구간에서 상대적으로 높은 배경전류가 있기 때문이다. 이 배경 전류는 전저전달매개체가 효소로부터 받는 전자 이외에 주위 환경으로부터 전자를 받는 경로가 있기 때문에 발생한다. 따라서 이 배경전류를 최소화 하기 위해서는 전자전달매개체가 주위환경으로부터 전자를 받는 경로가 차단되어야 하는데, 그러기 위해서는 전자전달매개체의 표준환원전위의 범위가 수용액에서 측정했을 때 Ag/AgCl 표준 전극 대비 약 -0.2~0.1 V사이의 값을 가지는 것이 최적이다. 유기용매(CH3CN, DMSO 등)에서 측정하였을 경우 Ag/AgCl 표준 전극 대비 -0.4~0.1 V사이의 값을 나타낼 수 있다.
[반응식 1]
페노싸이아진 유기 전자 전달체 (phenothiazine organic electron transfer mediator)의 산화환원 반응
Figure pat00001
한편 반응식 2와 같은 플라빈(flavin)[또는 아이소알록사진(isoalloxazine)] 유도체의 산화환원 전위는 Ag/AgCl 기준전극 대비 -0.46 V 로 알려져 있다. 이 화합물은 산화환원 조효소로 잘 알려진 FAD의 유도체로 FAD와 유사한 산화환원 전위를 갖지만 글루코스 센서용 전자전달매개체로서 최적의 산화환원전위를 보이지는 않는다.
[반응식 2]
리보플라빈, 플라빈 아데노신 다이뉴클레오타이드(FAD)의 구조와 그 유도체(isoalloxazine)의 산화환원 반응
Figure pat00002
보고된 FAD-FDAH2 유도체의 산화환원 전위 값을 보면 전자 끄는 치환기가 도입된 유도체의 전위가 좀 더 양의 값 방향으로 이동함을 알 수 있다 (참고논문 J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 2251-2255)[반응식 3]. 이 문헌에 따르면 플라빈 골격의 7, 8번 위치에 전자 끌개인 F, Cl,CN 등이 치환되면 산환환원 전위가 좀더 양의 방향으로 이동한다. 그러나 이 문헌에 기재된 플라빈 유도체 중에서 수용액에서 측정하였을 때 글루코스 전자전달 매개체의 최적 산환환원 전위 (-0.2~0,1V)를 갖는 화합물은 없다. 적어도 7, 8번 위치에 모두 CN기를 가지거나 이보다 더 전자 끌개의 성격이 강한 치환기를 도입해야 원하는 산화환원 전위 값을 가질 것을 예상할 수 있다.
[반응식 3]
플라빈 유도체의 환원 전위(V) (100mM, pH 7.4 HEPES vs Ag/AgCl) (참고논문: J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 2251-2255)
Figure pat00003
따라서, 혈당 센서에서 전자전달을 위한 적절한 산화 환원 전위가 수용액에서 -0.2~0.1 V 사이인 것을 고려하여 7,8번 위치에 적절한 전자 끄는 치환기를 도입하는 경우 글루코스 센서의 저혈당 구간에서 배경전류를 최소화할 수 있는 산화환원전위를 갖는 목표한 산화환원전위 스펙의 유기계열의 전자전달 매개체를 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 글루코스 센서에 최적화된 산화 화원 전위 값을 나타내어 전기화학적 바이오센서와 같은 장치의 성능을 부여하는 신규한 유기전자전달매개체 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 유기전자전달매개체를 포함하는 장치, 바람직하게는 전기화학적 바이오센서를 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이 와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 본 명세서에 기재된 수치는 명시하지 않아도 “약”의 의미를 포함하는 것으로 간주한다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.
본 발명에서 사용되는 잔기의 정의에 대해 상세히 설명한다. 별도 명시하는 경우에는 그 정의에 따르며, 별도 명시하지 않는 한, 각 잔기는 하기의 정의를 가지며, 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다.
본 발명에서 “할로” 또는 “할로겐”은 의 예는 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도를 포함한다.
본 발명에서“알킬”은 지방족 탄화수소 라디칼을 의미하며, 직쇄상, 분지상또는 환상(사이클로알킬)의 탄화수소 라디칼을 모두 포함한다.
본 발명에서, "알콕시(alkoxy)"는 -O-알킬 또는 알킬-O- 그룹을 나타내며, 여기서 알킬 그룹은 상기 정의된 바와 같다. 예를 들어, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, n-부톡시, t-부톡시와 같은 것들이 포함되지만 이에 국한되지 않는다.
본 발명에서, 단독으로 또는 다른 용어와 조합된 용어 “하이드록시” 또는 “하이드록실”은 -OH를 의미 한다.
본 발명에서, “시아노”는 -CN을 나타내고;“아미노”는 -NH2를 나타내고; “니트로”는 -NO2를 나타낸다.
본 발명에서 "아릴(aryl)"은 모 방향족 환 시스템 내 하나의 탄소 원자에서 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도된 예를 들어 6 내지 30개의 탄소 원자(C6-C30)의 1가의 방향족 탄화수소를 말한다. 상기 아릴은 포화된, 부분적으로 불포화된 환과 융합된 방향족 환을 포함하는 이중고리 라디칼을 포함할 수 있다.
본 발명에서 “헤테로아릴”은 N, O, 및 S 중에서 선택된 1개 이상, 바람직하게는 1개 내지 3개의 헤테로원자를 함유하는 모노헤테로사이클릭 또는 폴리헤테로사이클릭 방향족 탄화수소로부터 유래된 1가 또는 2가의 치환기를 의미한다. 달리 정의되지 않는다면, 헤테로아릴은 1 내지 10의 탄소 고리 원을 갖는 헤테로아릴, 바람직하게는 3 내지 7의 탄소 고리 원을 갖는 헤테로아릴, 더욱 바람직하게는 3 내지 5의 탄소 고리 원을 갖는 헤테로아릴을 의미한다.
본 발명에서 "치환"은 본 발명에서 달리 언급이 없는 한, 적어도 하나의 수소 원자가 할로겐 원자(예를 들어 F, Cl, Br, 또는 I), 시아노기, 히드록실기, 티올기, 니트로기, 아미노기, 이미노기, 아지도기, 아미디노기, 히드라지노기, 히드라조노기, 옥소기, 카보닐기, 카바밀기, 에스테르기, 에테르기, 카복실기 또는 그것의 염, 술폰산기 또는 그것의 염, 인산이나 그것의 염, 탄소수 1-6의 알킬기, 탄소수 1-6의 할로알킬기, 탄소수 2 내지 6의 알켄일기, 탄소수 2 내지 6의 할로알켄일기, 탄소수 2 내지 6의 알킨일기, 탄소수 2 내지 6의 할로알킨일기, 탄소수 1 내지 6의 알콕시기, 탄소수 1 내지 6의 할로알콕시기, 탄소수 1 내지 6의 알킬티오기, 1 내지 9의 탄소 고리원을 갖는 헤테로사이클로알킬기, 1 내지 9의 탄소 고리원을 갖는 헤테로사이클로알킬기, 탄소수 6 내지 10의 아릴기, 탄소수 6 내지 10의 아릴옥시기, 탄소수 6 내지 10의 아릴티오기, 1 내지 9의 탄소고리원을 갖는 헤테로알킬기, 1 내지 9의 탄소고리원을 갖는 헤테로아릴옥시기 및 탄소수 1 내지 9의 탄소고리원을 갖는 헤테로아릴티오기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 내지 3종일 수 있다.
하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1의 구조로 나타내어지는 신규한 유기계열 전자전달 매개체에 관한 것이다:
[화학식 1]
Figure pat00004
상기 식에서 R은 -H, ―F, ―Cl, ―Br, ―I, ―NO2, ―CN, ―CO2H, -SO3H, ―NHNH2, ―SH, ―OH, -NR1R2, 비치환되거나 치환된 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 비치환되거나 치환된 탄소수 1 내지 6의 알케닐기, 또는 비치환되거나 치환된 탄소수 6 내지 10의 아릴기이고, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 탄소수 1 내지 3의 알킬, 또는 -COOR3, 일 수 있고, 상기 R3은 탄소수 1 내지 6의 알킬일 수 있다. 바람직하게, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 Boc(t-부톡시카르보닐)일 수 있다.
L(링커)은 결합(bond), 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬기, (-OCH2CH2-)n (이때, n은 2-10임), 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 50의 에틸렌 아민기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 30의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴기 혹은 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 5 내지 30의 헤테로아릴기 혹은 헤테로아릴옥시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
바람직하게, 상기 L(링커) 중의 비치환된 탄소수 1-20의 알킬기는 탄소수 1 내지 10의 알킬기, 즉, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, sec-부틸기, t-부틸기, 펜틸기, 헥실기, 시클로헥실기, 헵틸기, 옥틸기 및 데칸기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한된 것은 아니다.
또한, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 50의 에틸렌 옥사이드기는 (-OCH2CH2-)n 에서 n의 수가 1-20인 에틸렌 옥사이드기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있고 이에 제한된 것은 아니다.
치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 50의 에틸렌 아민기는 (-NHCH2CH2-)n 에서 n의 수 1-20인 에틸렌 아민기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나 이에 제한된 것은 아니다.
치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 30의 알콕시기는 메톡시(methoxy), 에톡시(ethoxy), 프로폭시기(propoxy), 이소프로폭시 (isopropoxy), 부톡시기(butoxy), 터트-부톡시(tert-butoxy), 펜타녹시기(pentanoxy), 헥사녹시기(hexanoxy), 헵타녹시(heptanoxy), 옥타녹시(octanoxy), 데카녹시(decanoxy), 알킬-데카녹시(2-hexyl-1-decanoxy, 6-ethyl-3-decanoxy 등), 도데칸옥시(dodecanoxy), 알킬-도데칸옥시, 운데칸옥시(undecanoxy), 알킬-운데칸옥시기, 알릴옥시기 (allyloxy), 사이클로알킬옥시 및 사이클로헥실옥시(cyclohexyloxy)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나일 수 있으나 이에 제한된 것은 아니며, 상기 알킬-데카녹시기, 알킬-도데칸옥시기 및 알킬-운데칸옥시기의 알킬은 탄소수 1 내지 10의 알킬, 탄소수 1 내지 8의 알킬, 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬이나 이에 제한되는 것은 아니다.
치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴기 혹은 아릴옥시기는 페닐기, 벤질기, 톨릴기, 나프탈렌기, 페난트렌일기, 그 외 알킬페닐기, 및 페닐옥시기, 벤질옥시기, 톨릴옥시기, 나프탈렌옥시기, 페나트렌옥시기 및 그 외 알콕시페닐기 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나일 수 있으나 이에 제한된 것은 아니다.
치환 또는 비치환된 탄소수 5 내지 20의 헤테로아릴기 혹은 헤테로아릴옥시기는 퓨릴, 티오펜일, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 티아졸릴, 티아디아졸릴, 이소티아졸릴, 이소옥사졸릴, 옥사졸릴, 옥사디아졸릴, 트리아진일, 테트라진일, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 퓨라잔일, 피리딜, 피라진일, 피리미딘일, 피리다진일 등의 단환 헤테로아릴, 벤조퓨란일, 벤조티오펜일, 이소벤조퓨란일, 벤조이미다졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조이소티아졸릴, 벤조이속사졸릴, 벤조옥사졸릴, 이소인돌릴, 인돌릴, 인다졸릴, 벤조티아디아졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 퀴녹살리닐, 카바졸릴, 페난트리딘일, 벤조디옥솔릴 등의 다환식 헤테로아릴 중 하나일 수 있으나 이에 제한된 것은 아니다.
구체적으로, 상기 R은 -H, ―F, ―Cl, ―Br, ―I, ―NO2, ―CN, ―CO2H, -SO3H, ―NHNH2, ―SH, ―OH, -NR1R2, 비치환되거나 치환된 탄소수 1 내지 3의 알킬기, 비치환되거나 치환된 탄소수 1 내지 3의 알케닐기, 또는 페닐기일 수 있다.
구체적으로, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 Boc(t-부톡시카르보닐)일 수 있다.
구체적으로, 상기 R이 탄소수 1 내지 6의 알킬기 또는 탄소수 6 내지 10의 아릴기인 경우, 이들은 -OH, 탄소수 1 내지 3의 알킬기 및 탄소수 1 내지 3의 알콕시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상, 바람직하게는 1 내지 3, 더욱 바람직하게는 1 또는 2로 치환될 수 있다.
구체적으로, 상기 L은 결합(bond), 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 8의 알킬렌, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 6의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 20의 에틸렌 옥사이드기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 6의 에틸렌 아민기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 6의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 10의 아릴기 혹은 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 5 내지 12의 헤테로아릴기 혹은 헤테로아릴옥시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 L의 탄소수 1 내지 8의 알킬렌, 탄소수 1 내지 6의 알케닐기, 탄소수 2 내지 6의 에틸렌 옥사이드기, 탄소수 2 내지 6의 에틸렌 아민기, 탄소수 1 내지 6의 알콕시기, 탄소수 6 내지 10의 아릴기 혹은 아릴옥시기, 또는 탄소수 5 내지 12의 헤테로아릴기 혹은 헤테로아릴옥시기는 할로, 하이드록시, 시아노, 아미노, 탄소수 1-4의 알킬, 탄소수 2-4의 알케닐렌 및 탄소수 1-4의 알콕시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 하나 이상, 구체적으로 1 내지 3, 또는 1 또는 2의 치환기로 치환될 수 있다.
바람직한 일 양태로서, 상기 -L-R은 다음의 구조로부터 선택되는 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
H, -CH2CH2CH2SO3H,
Figure pat00005
, -CH2CH2CH2CH2CH2-NH(Boc), -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-NH(Boc), -CH2CH2-OH, -CH2CH2-Cl, -CH2CH2CH2CH2CH2-OH, -CH2CH2OCH2CH2-OH,
Figure pat00006
,
Figure pat00007
,
Figure pat00008
,
Figure pat00009
및 -CH2-CH=CH2.
바람직하게, 상기 화학식 1의 구조로 나타내어지는 신규한 유기계열 전자전달 매개체는 다음의 화학식 2 내지 16의 어느 하나의 화학식의 구조로 나타내어지는 화합물들일 수 있다.
[화학식 2]
Figure pat00010
[화학식 3]
Figure pat00011
[화학식 4]
Figure pat00012
[화학식 5]
Figure pat00013
[화학식 6]
Figure pat00014
[화학식 7]
Figure pat00015
.
[화학식 8]
Figure pat00016
[화학식 9]
Figure pat00017
[화학식 10]
Figure pat00018
[화학식 11]
Figure pat00019
[화학식 12]
Figure pat00020
[화학식 13]
Figure pat00021
[화학식 14]
Figure pat00022
[화학식 15]
Figure pat00023
[화학식 16]
Figure pat00024
[화학식 17]
Figure pat00025
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 화학식 1의 유기계열 전자전달 매개체의 제조 방법을 제공한다.
구체적인 일 양태로, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 유기계열 전자전달 매개체 중 화학식 2의 화합물의 제조방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
i) 하기 화학식 18의 화합물을 1,3-프로판설톤을 반응시켜 하기 화학식 19의 화합물을 수득하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 수득된 화학식 19의 화합물과 알록산 일수화물 및 붕산을 반응시켜 하기 화학식 2의 화합물을 수득하는 단계.
[화학식 18]
Figure pat00026
[화학식 19]
Figure pat00027
상기 제조방법은 하기 반응식 4와 같이 나타낼 수 있다.
[반응식 4]
플라빈 유도체 (2) 의 합성 방법
Figure pat00028
상기 단계 i)의 반응시, 시작물질과 결과물질의 분리를 좀 더 용이하게 하기 위하여 아세토나이트릴을 부가하여 반응시킬 수 있다. 또한 1,3-프로판설톤의 사용량은 화학식 18의 화합물에 대해 1.0 내지 2.0 당량이 사용 가능하나, 바람직하게는 1.1 내지 1.2 당량이다. 반응 온도는 50 내지 120℃, 70 내지 110℃ 또는 90 내지 105℃이나 이에 제한되는 것은 아니며 반응 조건에 따라 적절히 조절할 수 있다. 반응 시간은 2일 내지 4일이다.
상기 단계 ii)에서는 아세트산을 부가하여 반응시킬 수 있다. 또한 알록산 일수화물의 사용량은 화학식 20의 화합물에 대해 1.0 내지 1.5 당량이 사용 가능하나, 바람직하게는 1.0 내지 1.2 당량이고, 붕산의 사용량은 화학식 18의 화합물에 대해 0.5 내지 2.0 당량이 사용 가능하나, 바람직하게는 1.0 내지 1.2 당량이다. 반응 온도는 30 내지 80℃, 40 내지 70℃ 또는 50 내지 60℃이나 이에 제한되는 것은 아니며 반응 조건에 따라 적절히 조절할 수 있다. 반응 시간은 2시간 이상 4시간 이상 또는 1일 이상 2일 내지 3일이다.
또 다른 구체적인 일 양태로, 본 발명에 따른 화학식 1의 유기계열 전자전달매개체의 제조방법은 다음의 단계를 포함할 수 있다:
i) 하기 화학식 20의 1,2-다이브로모-4,5-다이플루오로벤젠(1,2-dibromo-4,5-difluorobenzene)을 폴리메틸하이드로실록산과 반응시킨 후, 트리스(디벤질리덴아세톤)다이팔라듐(0) {Pd2(dba)3}과 1,1'-비스(다이페닐포스피노)페로센 (DPPF) 하에서 Zn(CN)2와 반응시켜 하기 화학식 20의 화합물을 수득하는 단계;
ii) 상기 단계 i)에서 수득된 화학식 21의 화합물과 암모니아수를 반응시켜 화학식 22의 화합물을 수득하는 단계;
iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 화학식 22의 화합물과 화학식 23의 화합물을 반응시켜 화학식 24의 화합물을 수득하는 단계; 및
iv) 상기 단계 iii)에서 수득한 화학식 24의 화합물과 알록산 일수화물 및 붕산을 반응시켜 화학식 1의 화합물을 수득하는 단계.
[화학식 20]
Figure pat00029
[화학식 21]
Figure pat00030
[화학식 22]
Figure pat00031
[화학식 23]
H2N-L-R
[화학식 24]
Figure pat00032
이러한 제조방법은 하기 반응식 5로 나타내어질 수 있다.
[반응식 5]
친핵성 방향족 치환반응을 이용한 다이아민 구조 및 플라빈 유도체 합성 방법
Figure pat00033
이러한 제조방법은 4-아미노-5-플루오로프탈로나이트릴과 사슬형 아민 사이의 친핵성 방향족 치환 반응을 이용하여 아민 구조의 변화를 통해 수용해성과 고분자 사슬에 대한 도입이 가능한 유도체를 합성하는 것으로, 이러한 방법에 의하는 경우 고가의 화학식 18의 화합물(4,5-diaminophthalonitrile) 대신에 화학식 20의 1,2-다이브로모-4,5-다이플루오로벤젠(1,2-dibromo-4,5-difluorobenzene)을 이용하는바 경제적이고 고부가가치성을 지님과 동시에 연결부 구조에 다양한 말단기를 갖는 플라빈(Flavin) 유도체를 합성할 수 있다는 장점을 갖는다.
본 발명에 따른 유기계열 전자전달 매개체는 산화환원효소가 환원(글루코오스 산화)되어 얻은 전자를 전달하여 주는 역할을 하는 것으로, 폴리비닐피리딘 (Poly(vinylpyridine): PVP) 혹은 폴리비닐이미다졸 (Poly(vinylimidazole): PVI), 폴리알릴글라이시딜에터 (Poly allyl glycidyl ether: PAGE) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상과 같은 중합체 골격(backbone)에 해당하는 고분자 매트릭스와 연결된 산화-환원 중합체 형태로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가 일 양태는, 상기 유기계열 전자전달 매개체 및 중합체 골격을 포함하는 산화-환원 중합체에 관한 것이다.
일 예에서, 상기 산화-환원 중합체는 상기 중합체 골격과 유기계열 전자전달 매개체를 연결하는 링커 구조를 포함하는 것일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 산화-환원 중합체는 하기 화학식 25의 구조로 나타내어지는 것일 수 있다.
[화학식 25]
Figure pat00034
(상기 식에서 x은 5 내지 30 일 수 있다)
일 실시예에서, 상기 화학식 25의 산화-환원 중합체는 아래 반응식 6으로 도식화된 제조방법에 의해 제조될 수 있다.
[반응식 6]
Figure pat00035
구체적으로, 상기 제조방법은 말단에 이탈기를 갖는 전자전달 매개체와 친핵성 고분자와의 반응성을 이용한 도입 방법으로, 화학식 16으로 나타내어지는 10―(2-hydroxyethyl)-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile의 다이메틸포름아마이드를 반응의 촉매로서 사용한 알코올의 할로겐화 반응을 이용한 것이다. 이후, 말단에 좋은 이탈기인 클로라이드를 갖는 전자전달체를 초산 에틸과 물을 이용한 추출 후, 다이클로로메테인을 이용한 침전법을 통해 화학식 17로 나타내어지는 10―(2-chloroethyl)-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile을 합성할 수 있다. 이후 합성된 화학식 17의 물질을 폴리비닐이미다졸과 함께 다이메틸설폭사이드에 녹여 80 ℃로 24 시간 가열한 뒤, 초산 에틸 및 다이클로로메테인에 침전시키는 방법에 의해 최종적으로 화학식 25의 화합물을 수득할 수 있다.
이와 같이 본 발명에 따른 산화-환원 중합체는, 다양한 장치, 특히 삽입가능한 연속 혈당 측정 시스템에 유용하다.
또한, 본 발명의 추가 일 양태는 액체성 생체시료를 산화환원시킬 수 있는 효소와 상기 유기계열 전자전달 매개체를 포함하는 전기화학적 바이오센서용 센싱 막에 관한 것이다.
산화환원효소는 생체의 산화환원반응을 촉매하는 효소를 총칭하는 것으로, 본 발명에서는 측정하고자 하는 대상물질, 예컨대 바이오센서의 경우에는 측정하고자 하는 대상물질과 반응하여 환원되는 효소를 의미한다. 이와 같이 환원된 효소는 전자 전달 매개체와 반응하며, 이 때 발생한 전류변화 등의 신호를 측정하여 대상물질을 정량하게 된다. 본 발명에 사용 가능한 산화환원효소는 각종 탈수소효소(dehydrogenase), 산화효소(oxidase), 에스테르화효소(esterase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있으며, 산화환원 또는 검출 대상 물질에 따라서, 상기 효소 군에 속하는 효소들 중에서 상기 대상 물질을 기질로 하는 효소를 선택하여 사용할 수 있다.
보다 구체적으로 상기 산화환원효소는 글루코오스탈수소효소(glucose dehydrogenase), 글루탐산탈수소효소(glutamate dehydrogenase), 글루코오스산화효소(glucose oxidase), 콜레스테롤산화효소(cholesterol oxidase), 콜레스테롤에스테르화효소(cholesterol esterase), 락테이트산화효소(lactate oxidase), 아스코르브산 산화효소(ascorbic acid oxidase), 알코올산화효소(alcohol oxidase), 알코올탈수소효소(alcohol dehydrogenase), 빌리루빈산화효소(bilirubin oxidase) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
한편, 상기 산화환원효소는 측정하고자 하는 대상물질(예컨대, 대상물질)로부터 산화환원효소가 뺏어온 수소를 보관하는 역할을 하는 보조인자 (cofactor)를 함께 포함할 수 있는데, 예컨대, 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드 (flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 피롤로퀴놀린 퀴논 (Pyrroloquinoline quinone, PQQ) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
예컨대, 혈중 글루코오스 농도를 측정하고자 하는 경우, 상기 산화환원효소로서 글루코오스 탈수소효소(glucose dehydrogenase, GDH)를 사용할 수 있으며, 상기 글루코오스 탈수소효소는 보조인자로서 FAD를 포함하는 플라빈아데닌디뉴클레오티드-글루코오스탈수소효소(flavin adenine dinucleotide- glucose dehydrogenase, FAD-GDH), 및/또는 보조인자로서 FAD-GDH를 포함하는 니코틴아미드아데닌디뉴클레오티드-글루코오스탈수소효소 (nicotinamide adenine dinucleotide- glucose dehydrogenase)일 수 있다.
구체예에서, 상기 사용 가능한 산화환원효소는 FAD-GDH (예컨대, EC 1.1.99.10 등), NAD-GDH (예컨대, EC 1.1.1.47 등), PQQ-GDH (예컨대, EC1.1.5.2 등), 글루탐산탈수소효소 (예컨대, EC 1.4.1.2 등), 글루코오스산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.4 등), 콜레스테롤산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.6 등), 콜레스테롤에스테르화효소 (예컨대, EC 3.1.1.13 등), 락테이트산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.2 등), 아스코빅산산화효소 (예컨대, EC 1.10.3.3 등), 알코올산화효소 (예컨대, EC 1.1.3.13 등), 알코올탈수소효소 (예컨대, EC 1.1.1.1 등), 빌리루빈산화효소 (예컨대, EC 1.3.3.5 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
가장 바람직하게, 상기 산화환원효소는 37℃ 완충용액에서 1주일 동안 70% 이상의 활성도를 유지할 수 있는 글루코오스 탈수소효소이다.
본 발명에 따른 센싱 막은 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 산화-환원 중합체 20 내지 700 중량부, 예컨대 60 내지 700 중량부 또는 30 내지 340 중량부를 함유할 수 있다. 상기 산화-환원 중합체의 함량은 산화환원효소의 활성도에 따라서 적절히 조절할 수 있다.
나아가, 본 발명에 따른 센싱 막은 막 성능의 증가를 위해 카본 나노튜브를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 카본 나노튜브는 전이금속착체, 특히 오스뮴과 함께 사용시 전자전달속도가 증가되어 센싱 막의 성능을 더욱 높일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 센싱 막은 가교제를 더 포함할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 센싱 막은 계면활성제, 수용성 고분자, 4차 암모늄염, 지방산, 점증제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제를 시약 용해시의 분산제, 시약 제조시의 점착제, 장기 보관의 안정제 등의 역할을 위하여 추가로 포함할 수 있다.
상기 계면활성제는 조성물을 분주할 때 조성물이 전극위에서 골고루 퍼져서 균일한 두께로 분주되게 하는 역할을 하는 것일 수 있다. 상기 계면활성제로 트리톤 X-100 (Triton X-100), 소듐도데실설페이트 (sodium dodecyl sulfate), 퍼플루오로옥탄설포네이트 (perfluorooctane sulfonate), 소듐스테아레이트 (sodium stearate) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 시약을 분주할 때 시약이 전극위에서 골고루 퍼져서 시약이 균일한 두께로 분주되게 하는 역할을 적절하게 수행하도록 하기 위하여, 상기 계면활성제를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 3 내지 25 중량부, 예컨대 10 내지 25 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 계면활성제 10 내지 25 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 계면활성제의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
상기 수용성 고분자는 시약 조성물의 고분자 지지체로서 효소의 안정화 및 분산(dispersing)을 돕는 역할을 수행하는 것일 수 있다. 상기 수용성 고분자로는 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone; PVP), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol; PVA), 폴리플루오로설포네이트(polyperfluoro sulfonate), 하이드록시에틸 셀룰로오즈(hydroxyethyl cellulose; HEC), 하이드록시프로필 셀룰로오즈(hydroxypropyl cellulose; HPC), 카르복시메틸 셀룰로오즈(carboxy methyl cellulose; CMC), 셀룰로오즈 아세테이트(cellulose acetate), 폴리아미드 (polyamide) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 시약 조성물은, 산화환원효소의 안정화 및 분산 (dispersing)을 돕는 역할을 충분하고 적절하게 발휘하도록 하기 위하여, 상기 수용성 고분자를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 70 중량부, 예컨대 30 내지 70 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 수용성 고분자 30 내지 70 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 수용성 고분자의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
상기 수용성 고분자는 지지체 및 효소의 안정화 및 분산 (dispersing)을 돕는 역학을 효과적으로 수행하기 위하여 중량평균분자량이 2,500 g/mol 내지 3,000,000 g/mol 정도, 예컨대, 5,000 g/mol 내지 1,000,000 g/mol 정도일 수 있다.
상기 점증제는 시약을 전극에 견고하게 부착하도록 하는 역할을 한다. 상기 점증제로는 나트로졸, 디에틸아미노에틸-덱스트란 하이드로클로라이드 (DEAE-Dextran hydrochloride) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 전기화학적 센서는, 본 발명에 따른 산화-환원 중합체가 전극에 견고하게 부착되도록 하기 위하여, 상기 점증제를 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 10 내지 90 중량부, 예컨대 30 내지 90 중량부의 양으로 함유할 수 있다. 예컨대, 활성도가 700 U/mg인 산화환원효소를 사용하는 경우 산화환원효소 100 중량부를 기준으로 점증제 30 내지 90 중량부를 함유할 수 있으며, 산화환원효소의 활성도가 이보다 높아지면, 점증제의 함량을 이보다 낮게 조절할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 이러한 유기전자전달매개체를 포함하는 장치, 바람직하게, 삽입가능한 장치일 수 있다. 또한 바람직하게, 상기 장치는 전기화학적 바이오센서일 수 있고, 더욱 바람직하게 전기화학적 글루코오스(혈당)센서일 수 있다.
구체적으로, 상기 전기화학적 바이오센서의 종류에는 제한이 없으나, 바람직하게는 연속적인 혈당 모니터링 센서일 수 있다.
이러한 연속적인 혈당 모니터링 센서의 구성으로, 본 발명은, 예를 들어 전극, 절연체(insulator), 기판, 상기 산화-환원 중합체 및 산화환원효소를 포함하는 센싱 막(sensing layer), 확산 막(diffusion layer), 보호 막(protection layer) 등을 포함할 수 있다. 전극의 경우, 작동 전극 및 대향 전극과 같은 2종의 전극을 포함할 수도 있고, 작동 전극, 대향 전극 및 기준 전극과 같은 3종의 전극을 포함할 수도 있다. 일 구현예에서, 본 발명에 따른 바이오센서는, 적어도 두개, 바람직하게는 두개 또는 세개의 전극을 갖춘 기판에, 상기 화학식 1의 유기계열 전자전달매개체를 포함하는 산화-환원 중합체와 액체성 생체시료를 산화환원시킬 수 있는 효소를 포함하는 시약 조성물을 도포한 후 건조하여 제작한 전기화학적 바이오센서일 수 있다. 예를 들면, 전기화학적 바이오센서에 있어서 작동 전극 및 대향 전극이 기판의 서로 반대면에 구비되고, 상기 작동 전극 위에 본 발명에 따른 유기계열 전자전달매개체를 갖는 산화-환원 중합체가 포함되는 센싱 막이 적층되고, 작동 전극 및 대향 전극이 구비된 기판의 양쪽 면에 차례로 절연체, 확산막 및 보호막이 적층되는 것을 특징으로 하는 평면형 전기화학적 바이오센서가 제공된다.
구체적인 양태로서, 상기 기판은 PET(polyethylene terephthalate), PC(polycarbonate) 및 PI(polyimide)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 소재로 된 것일 수 있다.
또한, 작동 전극은 탄소, 금, 백금, 은 또는 은/염화은 전극을 사용할 수 있다.
또한, 2 전극을 갖는 전기화학적 바이오센서의 경우 대향 전극이 기준 전극의 역할까지 같이 하기 때문에, 대향 전극으로 금, 백금, 은 또는 은/염화은 전극을 사용할 수 있고, 기준 전극까지 포함하는 3 전극의 전기화학적 바이오센서의 경우, 기준 전극으로 금, 백금, 은 또는 은/염화은 전극을 사용할 수 있고, 대향 전극으로 탄소 전극을 사용할 수 있다.
확산막으로는 Nafion, cellulose acetate, silicone rubber를 사용할 수 있으며, 보호막으로는 silicone rubber, polyurethane, polyurethane 기반 copolymer 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
제한되지 않은 예로서, 2 전극인 경우 대향전극이 기준전극의 역할까지 같이 하기 때문에 염화은 또는 은이 사용 될 수 있으며, 3 전극일 경우 기준전극이 염화은 또는 은이 사용되고, 대향 전극은 탄소 전극을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체예는 전기화학적 바이오센서의 적용 가능한 예로서 글루코오스를 측정하기 위한 바이오센서를 예시하고 있지만, 본 발명의 시약조성물에 포함되는 효소의 종류를 달리함으로써 콜레스테롤, 락테이트, 크레아티닌, 과산화수소, 알코올, 아미노산, 글루타메이트와 같은 다양한 물질의 정량을 위한 바이오센서에 적용할 수 있다.
본 발명에 따른 유기 전자전달매개체를 전기화학적 바이오센서와 같은 장치에 사용하는 경우 탁월한 산화환원전위 스펙을 나타냄으로 인해 전기화학적 바이오센서의 성능을 향상시킬 수 있다.
도 1은 글루코스 센서의 원리를 도식화한 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 유기 전자전달 매개체인 3-(7,8-dicyano-2,4-dioxo-3,4-dihydrobenzo[g]pteridin-10(2H)-yl)propane-1-sulfonic acid [화학식 2] 10―(2-hydroxyethyl)-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 16] 를 사용한 순환 전압 전류(cyclic voltammetry)측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3a 및 3b는 본 발명에 따른 유기 전자전달 매개체 [화학식 2]를 사용하여 pH에 따른 순환 전압 전류(cyclic voltammetry)를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a-4f는 본 발명에 따른 유기 전자전달 매개체 [화학식 2]를 사용한 pH별 안정성 시험 결과를 나타낸 그래프이다. 도 4a: pH 4, 도 4b: pH 5, 도 4c: pH 6, 도 4d: pH 7, 도 4e: pH 8 및 도 4f: pH 9에서의 안정성 결과를 나타낸다.
도 5a-5c는 본 발명에 따른 유기 전자 전달 매개체 3 종의 몇 가지 버퍼 용액에서 측정한 순환 전압 전류도 (CV) 5a: 화학식 2, 5b: 화학식 14, 5c: 화학식 15의 0.1 M PBS in H2O, 0.1M TBAP in CH3CN, 0.1M TBAP in DMSO에서 측정한 순환 전압 전류도 및 그 때의 산화 환원 전위 값과 E1/2를 나타낸 그림이다.
도 6은 화학식 25의 고분자 매트릭스가 연결된 전자전달매개체에 대해 물을 용매로 하여 측정한 순환 전압 전류도이다.
도 7은 화학식 3에 따른 유기 전자 전달 매개체의 순환 전압 전류도를 나타낸다.
도 8은 화학식 4에 따른 유기 전자 전달 매개체의 순환 전압 전류도를 나타낸다.
도 9는 화학식 5에 따른 유기 전자 전달 매개체의 순환 전압 전류도를 나타낸다.
도 10은 화학식 6에 따른 유기 전자 전달 매개체의 순환 전압 전류도를 나타낸다.
도 11은 화학식 7에 따른 유기 전자 전달 매개체의 순환 전압 전류도를 나타낸다.
도 12는 화학식 8에 따른 유기 전자 전달 매개체의 순환 전압 전류도를 나타낸다.
도 13은 화학식 9에 따른 유기 전자 전달 매개체의 순환 전압 전류도를 나타낸다.
도 14는 화학식 10에 따른 유기 전자 전달 매개체의 순환 전압 전류도를 나타낸다.
도 15는 화학식 11에 따른 유기 전자 전달 매개체의 순환 전압 전류도를 나타낸다.
도 16은 화학식 12에 따른 유기 전자 전달 매개체의 순환 전압 전류도를 나타낸다.
도 17은 화학식 13에 따른 유기 전자 전달 매개체의 순환 전압 전류도를 나타낸다.
도 18은 화학식 14에 따른 유기 전자 전달 매개체의 순환 전압 전류도를 나타낸다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
제조예 1: 3-[(2-amino-4,5-dicyano)phenylamino]propane-1-sulfonic acid 의 합성[화학식 19]
Figure pat00036
자석 젓개를 넣은 유리 배양 튜브에 4,5-diaminophthalonitrile [화학식 18] (0.5 g, 3.16 mmol)과 1,3-propanesultone (463.3 mg, 3.79 mmol), 그리고 아세토나이트릴(5.0 mL)를 상온에서 넣는다. 반응 혼합물을 100 ℃에서 2 일 동안 교반 한다. 상온까지 식힌 후, 침전된 고체를 거른다. 거른 고체를 다시 메탄올에 녹이고 녹지 않는 불순물을 제거한 뒤 용매를 회전 증발 응축기를 사용해 제거하여 연한 갈색 고체 생성물을 얻었다; 0.768 g (86%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 6.85 (s, 1H), 6.81 (s, 1H), 3.22 (t, 2H), 2.57 (t, 2H), 1.89 (m, 2H).
13 C NMR (400 MHz, DMSO): δ 138.26, 138.63, 118.11,117.98, 114.50, 111.23, 102.01, 101.10, 49.23, 42.03, 24.14.
FT-IR (KBr pellet): 3323(m), 3062(m), 2940(m), 2618(m), 2228(m), 1626(s), 1519(w), 1492(w), 1379(w), 1957(m), 1198(s), 1172(s), 1149(s), 1044(s), 729(w) cm-1
제조예 2: 3-(7,8-dicyano-2,4-dioxo-3,4-dihydrobenzo[g]pteridin-10(2H)-yl)propane-1-sulfonic acid) [화학식 2]
Figure pat00037
100 ml 둥근 바닥 플라스크에 3-[(2-amino-4,5-dicyano)phenylamino]propane-1-sulfonic acid (19) (1.5 g, 5.35 mmol), alloxan monohydrate(0.942 g, 5.885 mmol)과 붕산(0.363 g, 5.885 mmol)을 넣고 아세트산 (15 ml)을 넣는다. 질소분위기에서 반응 혼합물을 50 ℃에서 2 일 동안 교반 하고 생성된 노란색 고체를 거른다. 거른 고체를 아세토나이트릴에 녹여 안 녹는 불순물을 걸러 노란색 고체를 얻었다; 1.73 g (84%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 11.67 (s, 1H), 8.96 (s, 1H), 8.92 (s, 1H), 3.61 (t, 2H), 2.65 (t, 2H), 2.00 (m, 2H).
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ 159.08, 155.55, 151.20, 142.83, 137.50, 135.72, 135.65, 123.48, 117.74, 115.50, 115.39, 109.94, 47.84, 44.07, 22.71
FT-IR (KBr pellet): 3430(m), 3055(m), 2239(w), 1722(m), 1680(m), 1589(m), 1551(s), 1525(m), 1404(m), 1175(m), 1043(m) cm-1
제조예 3: 4,5-difluorophthalonitrile [화학식 21]
Figure pat00038
자석 젓개를 넣은 50 mL 유리 배양 튜브에 1,2-dibromo-4,5-difluorobenzene(2.0 g, 7.40 mmol)를 다이메틸아세트아마이드 5.0 mL에 녹인다. 상온에서 polyhydromethylsiloxane을 넣어준 뒤 그 온도에서 Pd2(dba)3 (144 mg, 0.158 mmol)와 dppf(120 mg, 0.216 mmol)을 넣어준다. Zn(CN)2 (1.87 g, 14.8 mmol)을 넣어준 뒤, 5.0 mL의 다이메틸아세트아마이드로 벽면의 반응물을 씻어주었다. 반응 혼합 물을 100 ℃에서 4 h 동안 교반한 뒤, 상온까지 식힌다. 반응 혼합물을 다이클로로메탄으로 묽혀준 뒤 고체 침전물을 걸러준 뒤 물과 다이클로로메탄을 이용하여 추출한다. 유기층을 모아 포화 NaCl 수용액으로 씻어준 뒤, 무수 Na-2SO4 를 넣어 남은 물을 제거한다. 유리 필터로 건조제를 걸러내고 회전 증발 농축기를 사용하여 용매를 최대한 제거한다. Hexane:EtOAc = 4 : 1 (Rf=0.34)의 조성을 갖는 전개액을 이용하여 칼럼 크로마토그래피로 정제한 뒤, 헥산으로 재결정하여 흰색 고체를 얻었다; 1.04 g (86%)
1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ. 7.69(t, 2H, J=8.0Hz)
13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ): δ. 154.30(d), 151.66(d), 123.83-123.35(sextet), 113.71(t)
19 F NMR (375 MHz, CDCl 3 ): δ. 123.45
제조예 4: 4-amino-5-fluorophthalonitrile [화학식 22]
Figure pat00039
자석 젓개를 넣은 50 mL 유리 배양 튜브에 4,5-difluorobenzene(1.0 g, 6.09 mmol)를 아세토나이트릴(3.0 mL)에 녹인 후, 상온에서 28wt% 암모니아수(3.0 mL)를 넣고 교반한다. 50 ℃에서 8 h동안 교반하고 Hex : EA = 1 : 1의 전개액을 이용한 얇은막크로마토그래피(Rf시작물=0.66, Rf결과물=0.34)로 반응 종결여부를 확인한다. 반응혼합물에 물을 부어 묽혀준 뒤, 초산에틸을 이용하여 3회 추출한다. 유기층을 모아 포화 NaCl 수용액으로 씻어준 뒤, 무수 Na2SO4를 넣어 남은 물을 제거한다. 유리 필터로 건조제를 걸러내고 회전 증발 농축기를 사용하여 용매를 제거하여 흰색의 고체를 얻었다; 0.95 g (97%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 7.86(d, J=11.2, 1H), 7.23(d, J=8.0, 1H), 6.83(s, 2H)
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ 150.59, 142.27, 142.27, 120.55, 119.51, 116.47, 115.95, 112.16, 98.68
19 F NMR (375 MHz, DMSO): δ -125.32
FT-IR (KBr pellet): 3562(m), 3425(m), 3342(m), 3230(m), 3060(m), 2229(m), 1654(m), 1605(m), 1658(m), 1439(m), 1362(m), 1258(m), 1232(m) 894(m)
Anal. Calcd for C 8 H 4 FN 3 : C, 59.63; H, 2.50; F, 11.79; N, 26.08. Found: C, 59.59; H, 2.61; N, 26.10.
제조예 5: 4-amino-5-benzylaminophthalonitrile (3a)
Figure pat00040
자석 젓개를 넣은 10 mL 유리 배양 튜브에 4- amino-5-fluorophthalonitrile (22)(200 mg, 1.24 mmol)를 디메틸설폭사이드 1.0 ml에 녹인 후, 갑압증류법을 이용하여 정제한 benzylamine(0.136mL, 1.24 mmol, 1.0 equiv.)을 넣어준다. 반응 혼합물을 질소 분위기에서 120 ℃로 24 시간 교반한다. 상온에서 식은 반응혼합물을 초산에틸을 이용하여 묽혀주고, 유기층을 물로 씻어줌으로써 디메틸설폭사이드를 제거한다. 모아진 유기층을 포화 NaCl 수용액으로 씻어주고, 무수 MgSO4 로 남은 물을 제거한 뒤, 유리 필터로 건조제를 걸러내고 회전 증발 농축기를 사용하여 용매를 최대한 제거한다. Hexane:EtOAc = 1 : 1 (Rf=0.30)의 조성을 갖는 전개액을 이용하여 칼럼 크로마토그래피로 정제한 뒤, 톨루엔으로 재결정하여 연노란색 고체를 얻었다; 210 mg (68%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 7.35(m, 4H), 7.27 (m, 1H), 6.90 (s, 1H), 6.77 (s, 1H), 6.46 (t, 1H, J = 5.4 Hz), 6.09 (s, 2H), 4.44 (d, J = 5.4 Hz, 2H).
13 C NMR (400 MHz, DMSO): δ 140.16, 138.84, 138.58, 128.94, 127.78, 127.580, 118.45, 118.20, 115.16, 112.34, 102.20, 101.98, 46.39
제조예 6: 10-benzyl-7,8-dicyanoisoalloxazine [화학식 3]
Figure pat00041
10 ml 둥근 바닥 플라스크에 4-amino-5-benzylaminophthalonitrile (3a)(100 mg, 0.403 mmol), alloxan monohydrate(70.9 mg, 0.443 mmol 1.1equiv.)과 붕산(28 mg, 0.451mmol 1.12 equiv.)을 넣고 아세트산 (6 ml)을 넣는다. 반응 혼합물을 상온에서 2 시간 동안 교반 하고 생성된 노란색 고체를 거른다. 거른 고체를 물과 에틸에테르, 헥세인으로 씻어 노란색 고체를 얻었다; 124 mg (87%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 11.73 (s, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.44 (s, 1H), 7.31 (m, 5H), 5.83 (s, 2H).
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ 159.43, 155.84, 152.02, 143.87, 137.84, 136.03, 135.89 134.28, 129.07, 128.12, 127.34, 123.41, 117.93, 115.77, 115.60, 110.73, 47.69.
제조예 7: tert-butyl (5-((2-amino-4,5-dicyanophenyl)amino)pentyl)carbamate (4a)
Figure pat00042
자석 젓개를 넣은 10 mL 유리 배양 튜브에 4- amino-5-fluorophthalonitrile (22)(100 mg, 0.620 mmol)를 디메틸설폭사이드 1.0 ml에 녹인 후, N-1,5-diaminopentane(125 mg, 0.620 mmol, 1.0 equiv.)을 넣어준다. 반응 혼합물을 질소 분위기에서 100 ℃로 48 시간 교반한다. 상온에서 식은 반응혼합물을 초산에틸을 이용하여 묽혀주고, 유기층을 물로 씻어줌으로써 디메틸설폭사이드를 제거한다. 모아진 유기층을 포화 NaCl 수용액으로 씻어주고, 무수 MgSO4 로 남은 물을 제거한 뒤, 유리 필터로 건조제를 걸러내고 회전 증발 농축기를 사용하여 용매를 최대한 제거한다. Hexane:EtOAc = 1 : 1 (Rf=0.11)의 조성을 갖는 전개액을 이용하여 칼럼 크로마토그래피로 정제한 뒤, 투명한 거품형 고체를 얻었다; 37 mg (17%)
1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ 6.90 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 4.69 (s, 1H), 4.25 (s, 1H), 4.22 (s, 2H), 3.15 (dd, J = 11.8, 6.2 Hz, 4H), 1.79 - 1.64 (m, 2H), 1.62 - 1.47 (m, 4H), 1.45 (d, J = 12.4 Hz, 9H).
13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ): δ 156.43, 140.33, 137.649, 117.61, 117.34, 117.288, 112.99, 106.61, 103.54, 79.38, 43.47, 39.91, 30.00, 28.42, 28.22, 24.02
제조예 8: tert-butyl (5-(7,8-dicyano-2,4-dioxo-3,4-dihydrobenzo[g]pteridin-10(2H)-yl)pentyl)carbamate [화학식 4]
Figure pat00043
10 ml 둥근 바닥 플라스크에 아세트산 (1 mL)에 녹인 tert-butyl-N-[5-(2-Amino-4,5-dicyanophenylamino)-pentyl]carbamate (37 mg, 0.11mmol)에 alloxan monohydrate(19.4 mg, 0.121 mmol 1.1 equiv.)과 붕산(7.5 mg, 0.121 mmol 1.1 equiv.)을 아세트산 (2 ml)에 녹여 넣는다. 반응 혼합물을 상온에서 12 시간 동안 교반 하고 0 ℃로 온도를 낮춘 후 생성된 노란색 고체를 거른다. 거른 고체를 물과 0 ℃의 에틸에테르로 씻어 노란색 고체를 얻었다; 29 mg (59 %)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 11.67(s, 1H), 8.93(s, 1H), 8.79(s, 1H), 6.80(t, 1H, J = 2.0 Hz), 4.49(t, 2H), 2.928(d, 2H, J =5.6 Hz), 1.671(s, 2H), 1.368(m, 4H)
ESI-MS : 450.250
제조예 9: tert-butyl (6-((2-amino-4,5-dicyanophenyl)amino)hexyl)carbamate (5a)
Figure pat00044
자석 젓개를 넣은 10 mL 유리 배양 튜브에 4- amino-5-fluorophthalonitrile (22)(100 mg, 0.62 mmol)를 디메틸설폭사이드 1.0 ml에 녹인 후, N-1,6-diaminohexane(160.9 mg, 0.744 mmol, 1.2 equiv.)을 넣어준다. 반응 혼합물을100 ℃로 36 시간 교반한다. 상온에서 식은 반응혼합물을 초산에틸을 이용하여 묽혀주고, 유기층을 물로 씻어줌으로써 디메틸설폭사이드를 제거한다. 모아진 유기층을 포화 NaCl 수용액으로 씻어주고, 무수 MgSO4 로 남은 물을 제거한 뒤, 유리 필터로 건조제를 걸러내고 회전 증발 농축기를 사용하여 용매를 최대한 제거한다. Hexane:EtOAc = 1 : 2 (Rf=0.50)의 조성을 갖는 전개액을 이용하여 칼럼 크로마토그래피로 정제한 뒤, 투명한 거품형 고체를 얻었다; 140 mg (63%)
1 H NMR (400 MHz, CDCl 3 ): δ 6.74(s, 1H), 6.71(s, 1H), 4.68(s, 1H), 4.49(s, 1H), 4.36(s, 2H), 3.14(s, 4H), 1.66(t, 2H, J =6 Hz), 1.49-1.34(m, 15H)
13 C NMR (100 MHz, CDCl 3 ): δ 156.455, 140.048, 137.895, 117.549, 117.504, 117.273, 112.633, 106.087, 103.056, 79.358, 42.813, 39.566, 29.906, 28.424, 28.223, 25.639, 25.400
제조예 10: tert-butyl (6-(7,8-dicyano-2,4-dioxo-3,4-dihydrobenzo[g]pteridin-10(2H)-yl)hexyl)carbamate [화학식 5]
Figure pat00045
10 ml 둥근 바닥 플라스크에 아세트산 (1 mL)에 녹인 tert-butyl (6-((2-amino-4,5-dicyanophenyl)amino)hexyl)carbamate (5a)(100 mg, 0.280 mmol)에 alloxan monohydrate(49.3 mg, 0.308 mmol 1.1equiv.)과 붕산(19.4 mg, 0.314 mmol 1.12 equiv.)을 아세트산 (3 ml)에 녹여 넣는다. 반응 혼합물을 상온에서 12 시간 동안 교반 하고 0 ℃로 온도를 낮춘 후 생성된 노란색 고체를 거른다. 거른 고체를 물과 0 ℃의 에틸에테르, 헥세인으로 씻어 노란색 고체를 얻었다; 102 mg (79 %)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ. 11.68(s, 1H), 8.93(s, 1H), 8.78(s, 1H), 7.78(t, 1H, J =5.2Hz), 4.50(s, 2H), 2.89(dd, 2H, J =12.7, 6.5Hz), 1.67(br, 2H) 1.51-1.18(m, 15H)
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ. 159.41, 156.00, 155.87, 151.45, 143.23, 137.90, 135.93, 135.88, 123.73, 118.06, 115.92, 115.71, 110.25, 77.742, 45.05, 29.84 28.71, 26.78, 26.55, 26.10, 21.51
제조예 11: 4-amino-5-(5-hydroxypentyl)phthalonitrile (6a)
Figure pat00046
자석 젓개를 넣은 10 mL 유리 배양 튜브에 4-amino-5-fluorophthalonitrile (22)(500 mg, 3.10 mmol)를 디메틸설폭사이드 5.0 ml에 녹인 후, 5-amino-pentan-1-ol(0.405 mL, 3.72 mmol, 1.2 equiv.)을 넣어준다. 반응 혼합물을100 ℃로 48 시간 교반한다. 상온에서 식은 반응혼합물을 초산에틸을 이용하여 묽혀주고, 유기층을 물로 씻어줌으로써 디메틸설폭사이드를 제거한다. 모아진 유기층을 포화 NaCl 수용액으로 씻어주고, 무수 MgSO4 로 남은 물을 제거한 뒤, 유리 필터로 건조제를 걸러내고 회전 증발 농축기를 사용하여 용매를 최대한 제거한다. 고체혼합물을 과 메틸알콜 소량에 녹인 후 헥세인을 조금씩 넣으며 침전된 고체를 거르고 감압건조하여, 상아색 고체를 얻었다; 612 mg (81%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 6.84(s, 1H) 6.79(s, 1H), 5.98(s, 2H) 5.70(t, J =4.8Hz, 1H) 4.37(t, J =5.2 Hz, 1H), 3.38(dd, 2H, J =11.5, 6.2Hz), 3.10 (dd, J =12.2, 6.8Hz, 2H), 1.47-1.32(m, 4H)
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ. 139.76, 138.97, 131.11, 118.55, 114.71, 111.57, 102.29, 101.54, 61.09, 43.24, 32.59, 28.40, 23.66
Anal. Calcd for C 13 H 16 N 4 O: C, 63.91; H, 6.60; N, 22.93; O, 6.55. Found: C, 63.94; H, 22.97; N, 22.97.
제조예 12: 10-(5-hydroxypentyl)-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 6]
Figure pat00047
10 ml 둥근 바닥 플라스크에 아세트산 (1 mL)에 녹인 4-amino-5-(5-hydroxypentyl)phthalonitrile (6a)(100 mg, 0.409mmol)에 alloxan monohydrate(66.8 mg, 0.417 mmol 1.02equiv.)과 붕산(25.8 mg, 0.417 mmol 1.02 equiv.)을 아세트산 (3 ml)에 혼탁액 상태로 넣는다. 반응 혼합물을 상온에서 12 시간 동안 교반 하고 침전된 노란색 고체를 거른다. 거른 고체를 에틸에테르, 클로로폼, 헥세인으로 씻어 노란색 고체를 얻었다; 123 mg (86%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 11.67(s, 1H), 8.91(s, 1H), 8.78(s, 1H), 4.49(br, 2H), 4.43(t, 1H, J =5.0 Hz), 3.40(s, 2H), 1.66(s, 2H), 1.46(s, 4H)
13 C NMR (100MHz, DMSO): δ. 159.40, 155.87, 151.39, 143.17, 137.88, 135.86, 123.77, 118.05, 115.91, 115.69, 110.26, 60.97, 40.49, 45.17, 32.65, 26.66, 23.11.
제조예 13: 4-amino-5-[2-(2-hydroxy-ethoxy)-ethyl]-phthalonitrile (7a)
Figure pat00048
자석 젓개를 넣은 10 mL 유리 배양 튜브에 4-amino-5-fluorophthalonitrile (22) (100 mg, mmol)를 디메틸설폭사이드 1.0 ml에 녹인 후, 2-(2-aminoethoxy)ethanol(0.075 ml, 0.744 mmol, 1.2 equiv.)을 넣어준다. 반응 혼합물을100 ℃로 48 시간 교반한다. 상온에서 식은 반응혼합물을 초산에틸을 이용하여 묽혀주고, 유기층을 물로 씻어줌으로써 디메틸설폭사이드를 제거한다. 모아진 유기층을 포화 NaCl 수용액으로 씻어주고, 무수 MgSO4 로 남은 물을 제거한 뒤, 유리 필터로 건조제를 걸러내고 회전 증발 농축기를 사용하여 용매를 최대한 제거한다. 고체혼합물을 초산에틸에 녹인 후 다이클로로메테인과 헥세인을 넣어 침전된 고체를 거르고 감압건조하여, 상아색 고체를 얻었다; 84 mg (55%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ. 6.90(s, 1H), 6.88(s, 1H), 6.03(s, 2H), 5.81(t, 1H, J =4.8Hz), 4.65(br, 1H), 3.61(t, 2H, J =5.2Hz), 3.52(m, 2H), 3.46(t, 2H, J =4.8Hz), 3.34(m, 2H)
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ. 139.94, 138.88, 118.51, 118.31, 114.99, 111.95, 102.24, 101.89, 72.64, 68.77, 60.63, 43.13
제조예 14: 10-(2-(2-hydroxyethoxy)ethyl)-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 7]
Figure pat00049
10 ml 둥근 바닥 플라스크에 아세트산 (1 mL)에 녹인 4-amino-5-[2-(2-hydroxyethoxy)-ethyl]-phthalonitrile (7a) (50 mg, 0.203 mmol)에 alloxan monohydrate(33.15 mg, 0.207 mmol 1.02equiv.)과 붕산(12.8 mg, 0.207 mmol 1.02 equiv.)을 아세트산 (2 ml)에 혼탁액 상태로 넣는다. 반응 혼합물을 상온에서 12 시간 동안 교반 하고 침전된 노란색 고체를 거른다. 거른 고체를 에틸에테르, 클로로폼, 헥세인으로 씻어 노란색 고체를 얻었다; 62 mg (87%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ. 11.70(s, 1H), 8.90(s, 1H), 8.81(s, 1H), 6.55(s, 2H), 4.78(s, 2H), 4.52(t, 1H, J =5.0Hz), 3.82(t, 2H, J =5.0Hz), 3.38(s, 2H)
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ. 159.40, 155.75, 151.59, 143.23, 137.59, 136.78, 135.67, 125.14, 117.32, 115.92, 115.71, 110.05, 72.96, 67.15, 60.53, 45.33
제조예 15: 2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 8]
Figure pat00050
10 ml 둥근 바닥 플라스크에 아세트산 (2 mL)에 녹인 1,2-diamino-7,8-phthalonitrile (18)(100 mg, 0.632 mmol)에 alloxan monohydrate(121.5 mg, 0.759 mmol 1.2 equiv.)과 붕산(46.9 mg,0.759 mmol 1.2 equiv.)을 아세트산 (2 ml)에 혼탁액 상태로 넣는다. 반응 혼합물을 상온에서 2 시간 동안 교반 하고 침전된 고체를 거른다. 거른 고체를 에틸에테르, 다이클로로메테인, 헥세인으로 씻어 아이보리색 고체를 얻었다; 165 mg (99%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ. 12.42(s, 1H), 11.97(s, 1H), 9.05(s, 1H), 8.73(s, 1H)
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ. 159.70, 150.02, 149.43, 143.83, 139.24, 137.98, 136.10, 135.02, 115.76, 115.74, 115.65, 111.05.
제조예 16: 4-amino-5-(4-methylbenzylamino]-phthalonitrile (9a)
Figure pat00051
자석 젓개를 넣은 10 mL 유리 배양 튜브에 4-amino-5-fluorophthalonitrile (22) (100 mg, mmol)를 디메틸설폭사이드 0.5 ml에 녹인 후, 4-methylbenzylamine (112.69 mg, 0.930 mmol, 1.5 equiv.)을 넣어준다. 반응 혼합물을 100 ℃로 24 시간 교반한다. 상온에서 식은 반응혼합물을 초산에틸을 이용하여 묽혀주고, 유기층을 물로 씻어줌으로써 디메틸설폭사이드를 제거한다. 모아진 유기층을 포화 NaCl 수용액으로 씻어주고, 무수 Na2SO4 로 남은 물을 제거한 뒤, 유리 필터로 건조제를 걸러내고 회전 증발 농축기를 사용하여 용매를 최대한 제거한다. 고체혼합물을 다이클로로메테인을 넣어 침전된 고체를 거르고 감압건조하여, 상아색 고체를 얻었다; 85 mg (52%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 7.23 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.15 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 6.89 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 6.39 (d, J = 5.7 Hz, 1H), 6.06 (s, 2H), 4.38 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 2.28 (s, 4H).
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ 140.12, 138.54, 136.63, 135.70, 129.47, 127.71, 118.45, 118.19, 115.05, 112.29, 102.06, 101.91, 46.11, 21.11.
제조예 17: 10-(4-methylbenzyl)-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 9]
Figure pat00052
10 ml 둥근 바닥 플라스크에 아세트산 (2 mL)에 녹인 4-amino-5-(4-methylbenzylamino]-phthalonitrile (9a) (30 mg, 0.114 mmol)에 alloxan monohydrate (21.97 mg, 0.137 mmol 1.2 equiv.)과 붕산 (8.47 mg, 0.137 mmol 1.2 equiv.)을 아세트산 (2 ml)에 현탁액 상태로 넣는다. 반응 혼합물을 상온에서 12 시간 동안 교반 하고 침전된 노란색 고체를 거른다. 거른 고체를 에틸에테르, 다이클로로메테인, 헥세인으로 씻어 노란색 고체를 얻었다; 23 mg (55%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 11.69 (s, 1H), 8.92 (s, 1H), 8.39 (s, 1H), 7.22 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.10 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 5.77 (s, 2H), 2.23 (s, 4H).
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ 159.09, 155.51, 151.65, 143.52, 137.43, 137.02, 135.60, 135.39, 130.92, 129.24, 126.98, 123.06, 117.47, 115.42, 115.23, 110.31, 47.02, 20.72.
제조예 18: 4-amino-5-(4-methoxybenzylamino)-phthalonitrile (10a)
Figure pat00053
자석 젓개를 넣은 50 mL 유리 배양 튜브에 4-amino-5-fluorophthalonitrile (22) (1.6 g, 9.93 mmol)를 디메틸설폭사이드 8.0 mL에 녹인 후, 4-methoxybenzylamine(1.632 g, 1.55 mL, 11.915 mmol, 1.2 equiv.)을 넣어준다. 반응 혼합물을 120 ℃로 24 시간 교반한다. 상온에서 식은 반응혼합물을 초산에틸을 이용하여 묽혀주고, 유기층을 물로 씻어줌으로써 디메틸설폭사이드를 제거한다. 모아진 유기층을 포화 NaCl 수용액으로 씻어주고, 무수 Na2SO4 로 남은 물을 제거한 뒤, 유리 필터로 건조제를 걸러내고 회전 증발 농축기를 사용하여 용매를 최대한 제거한다. 고체혼합물을 소량의 다이클로로메테인을 넣어 침전물을 거르고 감압건조하여, 상아색 고체를 얻었다; 2.71 g (98%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 7.28 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.95 - 6.90 (m, 2H), 6.89 (s, 1H), 6.78 (s, 1H), 6.37 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 6.07 (s, 2H), 4.35 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 3.73 (s, 3H).
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ 158.85, 140.11, 138.53, 130.52, 129.12, 118.47, 118.21, 115.03, 114.30, 112.29, 102.03, 101.93, 55.47, 45.86.
제조예 19: 10-(4-methoxybenzyl)-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 10]
Figure pat00054
10 ml 둥근 바닥 플라스크에 아세트산 (2 mL)에 녹인 4-amino-5-(4-methoxybenzylamino)-phthalonitrile (10a) (30 mg, 0.108 mmol)에 alloxan monohydrate (20.7 mg, 0.129 mmol 1.2 equiv.)과 붕산 (7.99 mg, 0.129 mmol, 1.2 equiv.)을 아세트산 (2 ml)에 현탁액 상태로 넣는다. 반응 혼합물을 상온에서 12 시간 동안 교반 하고 침전된 주황색 고체를 거른다. 거른 고체를 다이클로로메테인, n-헥세인으로 씻어 주황색 고체를 얻었다; 32 mg (77%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 11.74 (s, 1H), 8.95 (s, 1H), 8.47 (s, 1H), 7.33 (d, 2H), 6.89 (d, 2H), 5.85 (br, 2H), 3.72 (s, 3H).
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ 172.50, 159.46, 159.19, 155.89, 152.02, 143.88, 137.81, 135.98, 135.74, 128.97, 126.16, 123.43, 117.83, 115.81, 115.61, 114.43, 110.66, 55.51, 47.07, 21.49.
제조예 20: 4-amino-5-(3,4-dimethoxybenzylamino)-phthalonitrile (11a)
Figure pat00055
자석 젓개를 넣은 10 mL 유리 배양 튜브에 4-amino-5-fluorophthalonitrile(4) (200 mg, 1.24 mmol)를 디메틸설폭사이드 1.0 ml에 녹인 후, 3,4-dimethoxybenzylamine (249 mg, 0.222 ml, 1.49 mmol, 1.2 equiv.) 을 넣어준다. 반응 혼합물을 120 ℃로 24 시간 교반한다. 상온에서 식은 반응혼합물을 초산에틸을 이용하여 묽혀주고, 유기층을 물로 씻어줌으로써 디메틸설폭사이드를 제거한다. 모아진 유기층을 포화 NaCl 수용액으로 씻어주고, 무수 Na2SO4 로 남은 물을 제거한 뒤, 유리 필터로 건조제를 걸러내고 회전 증발 농축기를 사용하여 용매를 최대한 제거한다. 고체혼합물을 다이클로로메테인을 넣어 침전된 고체를 거르고 감압건조하여, 상아색 고체를 얻었다; 213 mg (56%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 6.99 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 1.2 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.80 (s, 1H), 6.35 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 6.08 (s, 2H), 4.34 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.73 (s, 3H).
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ 148.80, 148.02, 139.76, 138.25, 130.62, 119.52, 118.12, 117.86, 114.72, 112.02, 111.76, 111.53, 101.72, 101.60, 55.56, 55.50, 45.95.
제조예 21: 10-(3,4-dimethoxybenzyl)-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 11]
Figure pat00056
10 ml 둥근 바닥 플라스크에 아세트산 (2 mL)에 녹인 4-amino-5-(3,4-dimethoxybenzylamino)-phthalonitrile (11a) (100 mg, 0.324 mmol)에 alloxan monohydrate (57.1 mg, 0.357 mmol 1.1 equiv.)과 붕산 (22.1 mg, 0.357 mmol 1.1 equiv.)을 아세트산 (2 ml)에 현탁액 상태로 넣는다. 반응 혼합물을 상온에서 12 시간 동안 교반 하고 침전된 겨자색 고체를 거른다. 거른 고체를 다이클로로메테인, 헥세인으로 씻어 겨자색 고체를 얻었다; 118 mg (88%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO) δ 11.75 (s, 1H), 8.94 (s, 1H), 8.48 (s, 1H), 7.09 (s, 1H), 6.84 (s, 1H), 5.92 - 5.56 (m, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.70 (s, 3H).
13 C NMR (100 MHz, DMSO) δ 159.15, 155.53, 151.65, 148.85, 148.47, 143.54, 137.46, 135.63, 135.49, 126.18, 123.14, 119.28, 115.47, 115.27, 111.74, 111.53, 110.30, 55.70, 55.54, 47.06
제조예 22: 4-amino-5-(2,4-dimethoxybenzylamino)-phthalonitrile (12a)
Figure pat00057
자석 젓개를 넣은 10 mL 유리 배양 튜브에 4-amino-5-fluorophthalonitrile (22) (200 mg, 1.24 mmol)를 디메틸설폭사이드 1.0 ml에 녹인 후, 2,4-dimethoxybenzylamine (249 mg, 0.222 ml, 1.49 mmol, 1.2 equiv.)을 넣어준다. 반응 혼합물을 120 ℃로 24 시간 교반한다. 상온에서 식은 반응 혼합물을 초산에틸을 이용하여 묽혀주고, 유기층을 물로 씻어줌으로써 디메틸설폭사이드를 제거한다. 모아진 유기층을 포화 NaCl 수용액으로 씻어주고, 무수 Na2SO4 로 남은 물을 제거한 뒤, 유리 필터로 건조제를 걸러내고 회전 증발 농축기를 사용하여 용매를 최대한 제거한다. 고체혼합물을 다이클로로메테인을 넣어 침전된 고체를 거르고 감압 건조하여, 상아색 고체를 얻었다; 198 mg (52%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 7.07 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.84 (d, J = 0.9 Hz, 1H), 6.70 (s, 1H), 6.56 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.46 (dd, J = 8.3, 2.4 Hz, 1H), 6.12 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 6.04 (s, 2H), 4.22 (d, J = 5.3 Hz, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.71 (s, 3H).
13 C NMR (100 MHz, DMSO) δ 160.46, 158.54, 139.99, 138.70, 129.82, 118.50, 118.27, 117.94, 114.91, 111.99, 105.01, 101.98, 101.85, 98.84, 55.88, 55.63, 41.40.
제조예 23: 10-(2,4-dimethoxybenzyl)-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 12]
Figure pat00058
10 ml 둥근 바닥 플라스크에 아세트산 (1 mL)에 녹인 4-amino-5-(2,4-dimethoxybenzylamino)-phthalonitrile (12a) (50 mg, 0.162 mmol)에 Alloxan monohydrate (28.6 mg, 0.178 mmol 1.1 equiv.)과 붕산 (11.0 mg, 0.178 mmol 1.1 equiv.)을 아세트산 (1 ml)에 현탁액 상태로 넣는다. 반응 혼합물을 상온에서 12 시간 동안 교반 하고 침전된 주황색 고체를 거른다. 거른 고체를 다이클로로메테인, 헥세인으로 씻어 주황색 고체를 얻었다; 68 mg (97%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 11.67 (s, 1H), 8.92 (s, 1H), 8.34 (s, 1H), 6.75 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.63 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.30 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 1H), 5.56 (s, 2H), 3.87 (s, 3H), 3.68 (s, 3H)
13 C NMR (100 MHz, DMSO) δ 160.34, 159.00, 157.54, 155.39, 151.54, 143.32, 137.38, 135.64, 135.51, 127.94, 123.44, 117.35, 115.41, 115.22, 113.37, 110.09, 104.78, 98.46, 55.70, 55.31.
제조예 24: 4-amino-5-[2-(4-hydroxyphenyl)ethylamino]-phthalonitrile (13a)
Figure pat00059
자석 젓개를 넣은 10 mL 유리 배양 튜브에 4-amino-5-fluorophthalonitrile (22) (100 mg, 0.620 mmol)를 디메틸설폭사이드 1.0 ml에 녹인 후, 4-(2-aminoethyl)phenol(102 mg, 0.744 mmol, 1.2 equiv.) 을 넣어준다. 반응 혼합물을 100 ℃로 48 시간 교반한다. 상온에서 식은 반응 혼합물을 초산에틸을 이용하여 묽혀주고, 유기층을 물로 씻어줌으로써 디메틸설폭사이드를 제거한다. 모아진 유기층을 포화 NaCl 수용액으로 씻어주고, 무수 Na2SO4 로 남은 물을 제거한 뒤, 유리 필터로 건조제를 걸러내고 회전 증발 농축기를 사용하여 용매를 최대한 제거한다. 고체혼합물을 다이클로로메테인을 넣어 녹지 않은 고체를 거르고 감압건조하여, 고체를 얻었다; 121 mg (70%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 9.19 (s, 1H), 7.04 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.84 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 6.65 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.96 (s, 2H), 5.80 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 3.29 (t, J = 7.6 Hz, 2H) 2.74 (t, J = 7.6 Hz, 2H).
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ 156.15, 139.79, 138.75, 130.06, 129.73, 118.49, 118.35, 115.48, 114.85, 111.88, 102.31, 101.72, 45.01, 33.80.
제조예 25: 10--[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 13]
Figure pat00060
10 ml 둥근 바닥 플라스크에 아세트산 (2 mL)에 녹인 4-amino-5-[2-(4-hydroxyphenyl)ethylamino]-phthalonitrile (13a) (100 mg, 0.359 mmol)에 Alloxan monohydrate (63.3 mg, 0.395 mmol 1.1 equiv.)과 붕산 (24.4 mg, 0.395 mmol 1.1 equiv.)을 아세트산 (2 ml)에 현탁액 상태로 넣는다. 반응 혼합물을 상온에서 3 시간 동안 교반 하고 침전된 주황색 고체를 거른다. 거른 고체를 다이클로로메테인, 헥세인으로 씻어 주황색 고체를 얻었다; 131 mg (95%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 11.72 (s, 1H), 9.30 (s, 1H), 8.89 (s, 1H), 8.46 (s, 1H), 7.10 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 6.63 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 4.72 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 2.90 (t, J = 7.4 Hz, 2H).
13 C NMR (100 MHz, DMSO) δ 159.47, 156.69, 155.87, 151.24, 143.25, 137.66, 135.94, 135.48, 130.67, 127.78, 123.94, 117.30, 115.63, 115.45, 109.75, 46.31, 31.36.
제조예 26: 4-amino-5-[2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethylamino]-phthalonitrile (14a)
Figure pat00061
자석 젓개를 넣은 10 mL 유리 배양 튜브에 4-amino-5-fluorophthalonitrile (22) (200 mg, 1.24 mmol)를 디메틸설폭사이드 2.0 ml에 녹인 후, Dopamine hydrochloride (470.3 mg, 2.48 mmol, 2.0 equiv.)을 넣어준다. 상온에서 트리에틸아민 (376.4 mg, 0.519 mL, 3.72 mmol, 3.0 equiv.)을 천천히 적가한다. 반응 혼합물을 100 ℃로 48 시간 교반한다. 상온에서 식은 반응 혼합물을 초산에틸을 이용하여 묽혀주고, 유기층을 물로 씻어줌으로써 디메틸설폭사이드를 제거한다. 모아진 유기층을 포화 NaCl 수용액으로 씻어주고, 무수 Na2SO-4 로 남은 물을 제거한 뒤, 유리 필터로 건조제를 걸러내고 회전 증발 농축기를 사용하여 용매를 최대한 제거한다. 고체혼합물을 메탄올과 다이에틸에테르를 사용하여 재결정으로 침전된 고체를 거르고 감압건조하여, 벽돌색 고체를 얻었다; 340 mg (93%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 8.74 (br, 2H), 6.87 (s, 2H), 6.76 - 6.60 (m, 2H), 6.52 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 5.99 (s, 2H), 5.82 (t, J = 4.8 Hz, 1H), 2.71 (t, J = 7.5 Hz, 2H).
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ 145.47, 144.01, 140.11, 138.87, 130.51, 119.72, 118.59, 118.44, 116.67, 116.00, 114.63, 111.50, 101.97, 101.48, 45.10, 34.01.
제조예 27: 10--[2-(4-hydroxyphenyl)ethyl]-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 14]
Figure pat00062
10 ml 둥근 바닥 플라스크에 아세트산 (10.0 mL)에 녹인 4-amino-5-[2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethylamino]-phthalonitrile (14a) (400 mg, 1.359 mmol)에 Alloxan monohydrate (261.2 mg, 1.631 mmol 1.2 equiv.)과 붕산 (100.8 mg, 1.631 mmol 1.2 equiv.)을 아세트산 (10 ml)에 현탁액 상태로 넣는다. 반응 혼합물을 상온에서 4 시간 동안 교반 하고 침전된 고체를 거른다. 거른 고체를 에틸에테르, 클로로폼, 헥세인으로 씻어 검은 갈색 고체를 얻었다; 492 mg (90%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ. 11.69 (s, 1H), 8.86 (s, 1H), 8.81 (s, 1H), 8.73 (s, 1H), 8.47 (s, 1H), 6.66 (s, 1H), 6.57 (q, J = 8.3 Hz, 2H), 4.66 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 7.4 Hz, 2H).
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ 159.47, 155.88, 151.26, 145.62, 144.55, 143.21, 137.69, 135.90, 135.56, 128.49, 123.93, 120.35, 117.39, 116.95, 115.77, 115.66, 109.86, 46.30, 31.57.
제조예 28: 4-allylamino-5-amino-phthalonitrile (15a)
Figure pat00063
자석 젓개를 넣은 10 mL 유리 배양 튜브에 4-amino-5-fluorophthalonitrile (22) (200 mg, 1.24 mmol)를 디메틸설폭사이드 1.0 ml에 녹인 후, Allylamine (84.96 mg, 0.112 mL, 1.49 mmol, 1.2 equiv.)을 넣어준다. 반응 혼합물을 120 ℃로 48 시간 교반한다. 상온에서 식은 반응 혼합물을 초산에틸을 이용하여 묽혀주고, 유기층을 물로 씻어줌으로써 디메틸설폭사이드를 제거한다. 모아진 유기층을 포화 NaCl 수용액으로 씻어주고, 무수 Na2SO-4 로 남은 물을 제거한 뒤, 유리 필터로 건조제를 걸러내고 회전 증발 농축기를 사용하여 용매를 최대한 제거한다. 고체혼합물을 소량의 다이클로로메테인을 넣어 침전된 고체를 거르고 감압건조하여, 상아색 고체를 얻었다; 221 mg (89%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 6.89 (s, 1H), 6.77 (s, 1H), 6.08 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 6.02 (s, 2H), 5.88 (ddt, J = 17.2, 10.2, 5.1 Hz, 1H), 5.20 (dq, J = 17.4, 1.9 Hz, 1H), 5.15 (dt, J = 10.3, 1.7 Hz, 1H), 3.86 (td, J = 5.3, 2.6 Hz, 2H).
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ 139.98, 138.58, 134.98, 118.51, 118.27, 116.58, 115.03, 112.32, 102.04, 101.96, 45.21.
제조예 29: 10--allyl-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 15]
Figure pat00064
25 ml 둥근 바닥 플라스크에 아세트산 (4 mL)에 녹인 4-allylamino-5-amino-phthalonitrile (15a) (200 mg, 1.01 mmol)에 Alloxan monohydrate (177.7 mg, 1.11 mmol 1.10 equiv.)과 붕산 (69.9 mg, 1.13 mmol 1.12 equiv.)을 아세트산 (4 ml)에 현탁액 상태로 넣는다. 반응 혼합물을 상온에서 3 시간 동안 교반 하고 침전된 노란색 고체를 거른다. 거른 고체를 에틸에테르, 헥세인으로 씻어 노란색 고체를 얻었다; 261 mg (86%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 11.72 (s, 1H), 8.95 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 5.96 (ddd, J = 17.3, 10.2, 4.9 Hz, 1H), 5.22 (d, J = 11.1 Hz, 1H), 5.18 (d, J = 17.3 Hz, 1H).
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ 159.04, 155.47, 151.16, 143.17, 137.46, 135.55, 135.38, 129.83, 123.45, 118.02, 117.51, 115.49, 110.12, 46.46.
제조예 30: 4-amino-5-(2-hydroxyethyl)phthalonitrile (16a)
Figure pat00065
자석 젓개를 넣은 10 mL 유리 배양 튜브에 4-amino-5-fluorophthalonitrile (22) (200 mg, 1.24 mmol)를 디메틸설폭사이드 1.0 ml에 녹인 후, Ethanolamine (90.4 mg, 0.089 mL, 1.48 mmol, 1.2 equiv.)을 넣어준다. 반응 혼합물을 100 ℃로 24 시간 교반한다. 상온에서 식은 반응 혼합물을 초산에틸을 이용하여 묽혀주고, 유기층을 물로 씻어줌으로써 디메틸설폭사이드를 제거한다. 모아진 유기층을 포화 NaCl 수용액으로 씻어주고, 무수 Na2SO4 로 남은 물을 제거한 뒤, 유리 필터로 건조제를 걸러내고 회전 증발 농축기를 사용하여 용매를 최대한 제거한다. 고체혼합물을 다이클로로메테인을 넣어 침전된 고체를 거르고 감압건조하여, 상아색 고체를 얻었다; 161 mg (64%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 6.87 (s, 2H), 6.00 (s, 2H), 5.81 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.80 (t, J = 5.5 Hz, 1H), 3.58 (q, J = 5.6 Hz, 2H), 3.24 (q, J = 5.6 Hz, 2H).
13 C NMR (100 MHz, DMSO) δ 160.46, 158.54, 139.99, 138.70, 129.82, 118.50, 118.27, 117.94, 114.91, 111.99, 105.01, 101.98, 101.85, 98.84, 55.88, 55.63, 41.40.
제조예 31: 10―(2-hydroxyethyl)-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 16]
Figure pat00066
10 ml 둥근 바닥 플라스크에 아세트산 (5 mL)에 녹인 4-amino-5-(2-hydroxyethyl)phthalonitrile (16a) (400 mg, 1.978 mmol)에 Alloxan monohydrate (380.24 mg, 2.373 mmol 1.2 equiv.)과 붕산 (146.8 mg, 2.373 mmol 1.2 equiv.)을 아세트산 (10 ml)에 현탁액 상태로 넣는다. 반응 혼합물을 상온에서 12 시간 동안 교반 하고 침전된 노란색 고체를 거른다. 거른 고체를 에틸에테르, 클로로폼, 헥세인으로 씻어 노란색 고체를 얻었다; 528 mg (86%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 11.71 (s, 1H), 8.92 (s, 1H), 8.82 (s, 1H), 4.94 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 4.69 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 3.81 (q, J = 5.7 Hz, 2H).
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ 159.37, 155.74, 151.62, 143.12, 137.70, 137.02, 135.73, 125.01, 117.36, 115.93, 115.67, 109.98, 57.91, 47.43.
제조예 32: 10―(2-chloroethyl)-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 17]
Figure pat00067
10 ml 둥근 바닥 플라스크에 10―(2-hydroxyethyl)-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile (16)(300 mg, 0.973 mmol)을 고체 상태로 넣고 질소 분위기 하에서 SOCl2 (5.0 mL)을 반응물이자 용매로서 넣어준다. 상온에서 DMF (20 ㎕) 을 넣은 뒤 환류냉각기를 장치하여 반응 혼합물을 65 ℃에서 12 시간 교반한다. 상온에서 식은 반응 혼합물을 얼음이 담긴 비이커에 부어 반응을 종결한다. 얼음물층을 초산에틸을 이용하여 세 번 추출하여 모아진 유기층을 포화 NaCl 수용액으로 씻어주었다. 무수 Na2SO4 로 남은 물을 제거한 뒤, 유리 필터로 건조제를 걸러내고 회전 증발 농축기를 사용하여 용매를 최대한 제거한다. 고체혼합물을 다이클로로메테인을 넣어 침전된 고체를 거르고 감압건조하여, DMF와 불순물을 제거하여 겨자색 고체를 얻었다; 210 mg (66%)
1 H NMR (400 MHz, DMSO): δ 12.40 (s, 1H), 9.09 (s, 1H), 8.84 (s, 1H), 4.50 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.82 (d, J = 14.2 Hz, 2H).
13 C NMR (100 MHz, DMSO): δ 158.66, 149.75, 148.60, 142.87, 138.76, 137.78, 136.16, 135.42, 116.05, 115.64z, 115.48, 111.77, 42.48.
제조예 33: 10-ethyl-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile 을 갖는 Polyvinylimidazole [화학식 25]
Figure pat00068
자석 젓개를 넣은 10 mL 유리 배양 튜브에 10―(2-chloroethyl)-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile (17) (20 mg, 0.0612 mmol)와 폴리비닐이미다졸(24 mg, 0.245 mmol)을 고체 상태로 넣어준뒤 상온에서 질소분위기 하에서 다이메틸설폭사이드 1.0 mL를 넣어 녹여준다. 반웅 혼합물을 80 ℃에서 24 시간 교반한다. 반응 종결 여부를 핵자기공명분석법을 통해 확인한 뒤, 반응 혼합물을 상온에서 식혀준다. 충분히 식은 반응 혼합물을 0 ℃로 차갑게 식힌 초산에틸에 천천히 적가하여 용매와 남은 시작 물질을 제거한다. 생성된 침전물을 다시 다이클로로메테인으로 씻어준 뒤 감압건조하여 연한 갈색 고체 고분자를 얻었다.; 무게 회수율 32mg
[결과 및 고찰]
실시예 1: 합성
하기 반응식 4 또는 반응식 5에 따라 본 발명에 따른 유기계열 전자전달 매개체를 합성하였다.
[반응식 4]
플라빈 유도체 (2) 의 합성 방법
Figure pat00069
상업적으로 구매한 4,5-diaminophthalonitrile (18)과 1,3-propanesulfone을 100 ℃에서 2일 동안 반응하여 3-[(2-amino-4,5-dicyano)phenylamino]propane-1-sulfonic acid (19)를 갈색 고체로 얻었다. 이후 alloxan monohydrate와 붕산과 함께 아세트산을 용매로 하여 50 ℃에서 2 일 동안 가열하여 노란색 고체인 3-(7,8-dicyanoisoalloxazinyl)-1-propanesulfonic acid (2)를 81% 수율로 얻을 수 있었다. 이 반응에서 많은 부산물이 생성되는데 아세토나이트릴 용매에 녹지 않는 물질을 분리해 내면 생성물을 비교적 깨끗하게 얻을 수 있다.
또한, 고가의 시작물질인 4,5-diaminophthalonitrile (18) 대신에 1,2-dibromo-4,5-difluorobenzene (20)을 이용하여 고부가가치성을 지님과 동시에 연결부 구조에 다양한 말단기를 갖는 Flavin 유도체를 합성할 새로운 방법을 찾아내었다. [반응식 5]는 4-amino-5-fluorophthalonitrile (22)과 사슬형 아민 사이의 친핵성 방향족 치환반응을 이용하여 아민 구조의 변화를 통해 수용해성와 고분자 사슬에 대한 도입이 가능한 유도체를 합성하는 새로운 방법을 나타낸다.
[반응식 5]
친핵성 방향족 치환반응을 이용한 다이아민 구조 및 Flavin 유도체 합성 방법
Figure pat00070
실시예 2: 순환 전압 전류법을 이용한 본 발명에 따른 유기계열 전자전달 매개체의 전기화학적 특성 확인
위와 같은 합성법을 이용하여 합성한 다양한 플라빈 또는 아이소알록사진(flavin or isoalloxazine) 유도체의 합성수율(yield)과 산화환원전위(E1/2) 값을 확인하였다. 산화환원전위의 측정은 아래와 같은 방법에 의해 수행하였다.
실험방법
유기계열 전자전달매개체는 15 mg을 각각의 용해도에 따라 0.1 M 인산완충생리식염수(PBS, Phosphate-Buffered Saline)이나 0.1 M 테트라부틸 암모늄 퍼클로레이트(Tetrabutylammonium perchlorate) 아세토나이트릴 용액이나 0.1 M 테트라부틸 암모늄 퍼클로레이트 다이메틸설폭사이드 5 mL에 녹인다. 작동 전극, 기준 전극, 대향 전극을 연결하고 전압의 변화에 따른 전기적 신호 변화를 측정하였다.
실험재료/조건
작동전극(working electrode): 유리탄소 전극 (dia: 3.0 mm)
기준전극(Reference electrode): Ag/AgCl 전극
대향전극(Counter electrode): 백금 로드(Platinum rod)
시험 파라미터
-장비: EmStat(PalmSens Co.), CHI1040C(CH Instruments Co.)
-Technique: cyclic voltammetry
-Potential range: -1.0 ~ 1.0 V
-Scan rate: 10 mV/s
상기 방법에 따라 측정된 산화환원전위 및 합성 수율을 다음의 표 1 및 2에 나타내었다.
Figure pat00071
Figure pat00072
(a E1/2의 값은 Cyclic voltammograms(CV)에서 산화되는 피크와 환원되는 피크의 평균으로 결정하였다. CV는 Ag/AgCl 기준전극으로 사용하고 탄소 유리전극을 작업전극으로, Pt 전극을 상대전극으로 하여 측정하였다)
그 중 수용액 상에서 CV 결과가 목표치에 부합하는 물질인 3-(7,8-dicyano-2,4-dioxo-3,4-dihydrobenzo[g]pteridin-10(2H)-yl)propane-1-sulfonate [화학식 2]와 10―(2-hydroxyethyl)-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 15]의 전기화학적 성질을 cyclic voltammetry를 통해 알아보았다. 작업 전극은 glassy carbon (dia. 3mm)을, 기준 전극으로는 Ag/AgCl (vycor type)을, 상대 전극은 Pt rod를 사용하여 측정한 결과를 얻었다. 물을 용매로 하여 2 mg/mL 농도의 용액을 만들어 측정에 사용했으며 0.1M PBS 버퍼로 pH를 조절했다. CV 측정 결과는 도 2와 같다.
[화학식 2]의 경우 pH 7.0에서 Eox는 -0.139 V, Ered는 -0.229 V를 갖고 화학식 15는 Eox가 -0.120 V, Ered가 -0.216 V 로서 가역적인 그래프를 보여 기대했던 산화환원 전위 스펙을 만족했다. pH별로 CV를 측정해보면 산성 조건으로 갈수록 환원 전위에 비해 산화 전위 값이 좀 더 크게 변하는 것을 확인할 수 있었다(도 3a, 도 3b). 또한 pH 별로 안정성을 알아보기 위해 각 pH 조건의 용액을 하루 경과 뒤 CV를 측정해보면 염기성 조건일 때 전류 값이 감소한 것을 볼 수 있었다(도 4a-4f). 이 결과로 보아 염기성 환경일 때 화합물이 변형되어 기존의 산화환원 반응에 참여하지 못하게 되는 것으로 추측해 볼 수 있었다.
3-(7,8-dicyano-2,4-dioxo-3,4-dihydrobenzo[g]pteridin-10(2H)-yl)propane-1-sulfonate [화학식 2]와 10-allyl-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 15], 10―(2-hydroxyethyl)-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 16]을 용매에 대한 산화환원 전위 값 변화 경향성을 비교하고자 했다. 유기 전자 전달 매개체 3 종의 몇 가지 버퍼 용액에서 측정한 순환 전압 전류도 (CV) 5a: 화학식 2, 5b: 화학식 14, 5c: 화학식 15의 0.1 M PBS in H2O, 0.1M TBAP in CH3CN, 0.1M TBAP in DMSO에서 측정한 순환 전압 전류도 및 그 때의 산화 환원 전위 값과 E1/2를 나타낸 그림이다. 측정한 세 가지 물질 중 측정 용매에 따라 산화 환원 전위 값의 변화가 가장 큰 구조는 3-(7,8-dicyano-2,4-dioxo-3,4-dihydrobenzo[g]pteridin-10(2H)-yl)propane-1-sulfonate [화학식 2]이다. 0.1 M TBAP in DMSO 용액에서 측정한 순환 전압 전류도에서 반파 전위(E1/2)가 0.061 V로 오른쪽으로 많이 이동하였음을 볼 수 있었다. 이는 해당 연구에서 합성한 다른 플라빈 계열의 유기 전자 전달체와는 다른 경향성이다. 물이나 아세토나이트릴 버퍼 용액에서와는 달리 용액의 색이 점차 진한 붉은색으로 변화됨을 보아 DMSO 하에서 다른 구조로 변화되는게 아닌가 생각된다. 도 5b는 10-allyl-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 15]의 용매에 따른 순환 전압 전류도이다. 용매에 따른 용해도 차이가 존재하기에 전류 세기는 용해도가 낮을수록 작고, 해당 용매에 대한 용해도가 좋을수록 전류 량이 증가하였다. 물에 대한 용해도가 매우 낮아 0.1 M PBS 수용액 버퍼에서 전류 크기가 작은 것을 확인할 수 있다. 여기서 두드러지는 특징은 해당 구조의 물에서의 반파 전위(E1/2)가 Ag/AgCl 기준 전극 대비 -0.196 V으로 목표하는 혈당 측정기에 적합한 산화 환원 전위를 갖는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 수용성이 매우 낮다라는 사용 한계점이 존재한다. 또한 동일한 전해질을 사용한 CH3CN과 DMSO에서는 산화 환원 전위 값의 차이가 거의 없음을 확인했다. 10―(2-hydroxyethyl)-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 16] 유도체의 전기 화학적인 특성을 보았을 때, 해당 물질은 반대로 아세토나이트릴에 대한 용해도가 매우 낮아 0.1 M TBAP in CH3CN 버퍼 용액에서의 전류 값이 매우 작은 것을 볼 수 있다. 반면에 물에 대한 용해도가 준수하고 0.1 M PBS in H2O 버퍼용액에서 측정한 반파 전위(E1/2)가 원하는 퍼텐셜 범위내에 포함되는 -0.154 V임을 확인할 수 있기에 혈당 측정 센서에 응용할 수 있는 전기 화학적 특성을 지님을 확인할 수 있었다. 또한 앞선 [화학식 15]와 비슷한 경향성으로 아세토나이트릴과 다이메틸설폭사이드 간의 산화 환원 전위 값 차이가 매우 작음을 확인할 수 있었다. 또한, 물과 유기용매의 산화 환원 전위 값 차이는 약 120-150 mV 로 유사한 경향성을 따른다. 따라서 [화학식 15]와 [화학식 16]의 CV 분석 결과를 통해, 물에 대한 용해도가 낮아 아세토나이트릴과 다이메틸설폭사이드에서의 순환 전압 전류도 결과만을 측정한 나머지 아이소알록사진 유도체들이 만약 물에 대한 용해도가 확보된다면 우리가 원하는 산화 환원 전위 값 범위 내에 포함되는 전기화학적 특성을 지닐 수 있었음을 추측해볼 수 있다.
실시예 3: 본 발명에 따른 유기계열 전자전달매개체를 고분자 매트릭스에 고정시킨 경우의 순환 전압 전류법을 이용한 전기화학적 특성 확인
본 발명에 따른 유기계열 전자전달 매개체를 고분자 매트릭스에 전자전달체를 고정시켜 연속 혈당 측정 시스템에서 적용 가능성을 확인하고자 다음의 방법에 따라 실험을 수행하였다.
말단에 이탈기를 갖는 전자전달체와 친핵성 고분자와의 반응성을 이용한 도입 방법으로, 10―(2-hydroxyethyl)-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 16]의 다이메틸포름아마이드를 반응의 촉매로서 사용한 알코올의 할로겐화 반응을 이용했다. 이에, 말단에 좋은 이탈기인 클로라이드를 갖는 전자전달체를 초산 에틸과 물을 이용한 추출 뒤, 다이클로로메테인을 이용한 침전법을 통해 10―(2-chloroethyl)-2,4-dioxo-2,3,4,10-tetrahydrobenzo[g]pteridine-7,8-dicarbonitrile [화학식 17]을 85 %의 수율로 합성할 수 있었다. 도 6은 좋은 이탈기를 갖는 유기 계열의 전자 전달 매개체의 합성과 이를 이용한 고분자 도입을 정리한 것이다. 그 후, [화학식 17] 물질을 폴리비닐이미다졸과 다이메틸설폭사이드에 녹여 80 ℃로 24 시간 가열한 뒤, 초산 에틸 및 다이클로로메테인에 침전 잡아 고분자 [화학식 25]를 갈색 고체로 얻을 수 있었다.
[반응식 6]
Figure pat00073
[화학식 25]
Figure pat00074
화학식 25의 화합물은 고분자의 물에 대한 용해도가 비교적 낮기 때문에 염석(salting out) 효과로 인해 버퍼 용액을 사용하기에 한계가 있어, 물을 용매로 하여 순환 전압 전류를 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 고분자에 도입된 이후에 산화 전위(Eox)가 -0.108 V, 환원 전위(Ered)가 -0.238 V 로 반파전위(E1/2)가 -0.173 V였다. 따라서 고분자 도입 이후에도 산화 환원 전위 값이 목표 산화 환원 퍼텐셜 범위에 포함되며 연속 혈당 시스템에 대한 도입도 가능할 수 있음을 예상해볼 수 있다.

Claims (17)

  1. 하기의 화학식 1의 구조를 갖는 유기 전자 전달매개체:
    [화학식 1]
    Figure pat00075

    상기 식에서,
    R은 -H, ―F, ―Cl, ―Br, ―I, ―NO2, ―CN, ―CO2H, -SO3H, ―NHNH2, ―SH, ―OH, -NR1R2, 비치환되거나 치환된 탄소수 1 내지 6의 알킬기, 비치환되거나 치환된 탄소수 1 내지 6의 알케닐기, 또는 비치환되거나 치환된 탄소수 6 내지 10의 아릴기이고, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 탄소수 1 내지 3의 알킬, 또는 -COOR3, 일 수 있고, 상기 R3은 탄소수 1 내지 6의 알킬일 수 있다. 바람직하게, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 Boc(t-부톡시카르보닐)일 수 있다.
    L(링커)은 결합(bond), 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 20의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 50의 에틸렌 옥사이드기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 50의 에틸렌 아민기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 30의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴기 혹은 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 5 내지 30의 헤테로아릴기 혹은 헤테로아릴옥시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 L 중의 비치환된 탄소수 1-20의 알킬기는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, sec-부틸기, t-부틸기, 펜틸기, 헥실기, 시클로헥실기, 헵틸기, 옥틸기 및 데칸기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이고;
    치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 50의 에틸렌 옥사이드기는 (-OCH2CH2-)n 에서 n의 수가 1-20인 에틸렌 옥사이드기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이고;
    치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 50의 에틸렌 아민기는 (-NHCH2CH2-)n 에서 n의 수 1-20인 에틸렌 아민기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이고;
    치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 30의 알콕시기는 메톡시(methoxy), 에톡시(ethoxy), 프로폭시기(propoxy), 이소프로폭시 (isopropoxy), 부톡시기(butoxy), 터트-부톡시(tert-butoxy), 펜타녹시기(pentanoxy), 헥사녹시기(hexanoxy), 헵타녹시(heptanoxy), 옥타녹시(octanoxy), 데카녹시(decanoxy), 알킬-데카녹시(2-hexyl-1-decanoxy, 6-ethyl-3-decanoxy 등), 도데칸옥시(dodecanoxy), 알킬-도데칸옥시, 운데칸옥시(undecanoxy), 알킬-운데칸옥시기, 알릴옥시기 (allyloxy), 사이클로알킬옥시 및 사이클로헥실옥시(cyclohexyloxy)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나이고;
    치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 30의 아릴기 혹은 아릴옥시기는 페닐기, 벤질기, 톨릴기, 나프탈렌기, 페난트렌일기, 알킬페닐기, 및 페닐옥시기, 벤질옥시기, 톨릴옥시기, 나프탈렌옥시기, 페나트렌옥시기 및 알콕시페닐기 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나이고;
    치환 또는 비치환된 탄소수 5 내지 20의 헤테로아릴기 또는 헤테로아릴옥시기는 퓨릴, 티오펜일, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 티아졸릴, 티아디아졸릴, 이소티아졸릴, 이소옥사졸릴, 옥사졸릴, 옥사디아졸릴, 트리아진일, 테트라진일, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 퓨라잔일, 피리딜, 피라진일, 피리미딘일, 피리다진일 등의 단환 헤테로아릴, 벤조퓨란일, 벤조티오펜일, 이소벤조퓨란일, 벤조이미다졸릴, 벤조티아졸릴, 벤조이소티아졸릴, 벤조이속사졸릴, 벤조옥사졸릴, 이소인돌릴, 인돌릴, 인다졸릴, 벤조티아디아졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴, 퀴녹살리닐, 카바졸릴, 페난트리딘일 및 벤조디옥솔릴로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나인 것인, 유기 전자 전달매개체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 R은 -H, ―F, ―Cl, ―Br, ―I, ―NO2, ―CN, ―CO2H, -SO3H, ―NHNH2, ―SH, ―OH, -NR1R2, 비치환되거나 치환된 탄소수 1 내지 3의 알킬기, 비치환되거나 치환된 탄소수 1 내지 3의 알케닐기, 또는 페닐기이고, 상기 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H 또는 Boc(t-부톡시카르보닐)인 것인, 유기 전자 전달 매개체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 L은 결합(bond), 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 8의 알킬렌, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 6의 알케닐기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 6의 에틸렌 옥사이드기, 치환 또는 비치환된 탄소수 2 내지 6의 에틸렌 아민기, 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 6의 알콕시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 6 내지 10의 아릴기 혹은 아릴옥시기, 치환 또는 비치환된 탄소수 5 내지 12의 헤테로아릴기 혹은 헤테로아릴옥시기로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 유기 전자 전달 매개체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 -L-R은 다음의 구조로부터 선택되는 하나인 것인, 유기 전자 전달 매개체:
    H, -CH2CH2CH2SO3H,
    Figure pat00076
    , -CH2CH2CH2CH2CH2-NH(Boc), -CH2CH2CH2CH2CH2CH2-NH(Boc), -CH2CH2-OH, -CH2CH2-Cl, -CH2CH2CH2CH2CH2-OH, -CH2CH2OCH2CH2-OH,
    Figure pat00077
    ,
    Figure pat00078
    ,
    Figure pat00079
    ,
    Figure pat00080
    및 -CH2-CH=CH2.
  6. 제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 구조를 갖는 유기 전자 전달매개체는 다음의 화학식 2 내지 17 중 어느 하나의 구조로 나타내어지는 것인, 유기 전자 전달매개체:
    [화학식 2]
    Figure pat00081

    [화학식 3]
    Figure pat00082

    [화학식 4]
    Figure pat00083

    [화학식 5]
    Figure pat00084

    [화학식 6]
    Figure pat00085

    [화학식 7]
    Figure pat00086
    .
    [화학식 8]
    Figure pat00087

    [화학식 9]
    Figure pat00088

    [화학식 10]
    Figure pat00089

    [화학식 11]
    Figure pat00090

    [화학식 12]
    Figure pat00091

    [화학식 13]
    Figure pat00092

    [화학식 14]
    Figure pat00093

    [화학식 15]
    Figure pat00094

    [화학식 16]
    Figure pat00095

    [화학식 17]
    Figure pat00096
    .
  7. i) 하기 화학식 18의 화합물을 1,3-프로판설톤을 반응시켜 하기 화학식 19의 화합물을 수득하는 단계;
    ii) 상기 단계 i)에서 수득된 화학식 19의 화합물과 알록산 일수화물 및 붕산을 반응시켜 하기 화학식 2의 화합물을 수득하는 단계,
    를 포함하는 하기 화학식 2의 유기 전자 전달 매개체의 제조방법.
    [화학식 18]
    Figure pat00097

    [화학식 19]
    Figure pat00098

    [화학식 2]
    Figure pat00099
    .
  8. 제7항에 있어서, 상기 1,3-프로판설톤의 사용량은 화학식 18의 화합물에 대해 1.0 내지 2.0 당량이고, 상기 알록산 일수화물의 사용량은 화학식 20의 화합물에 대해 1.0 내지 1.5 당량인 것인, 제조방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 단계 i)의 반응 온도는 50 내지 120℃ 및 반응 시간은 2일 내지 4일이고, 상기 단계 ii)의 반응 30 내지 80℃이고 반응 시간은 2시간 이상인 것인, 제조방법.
  10. i) 하기 화학식 20의 1,2-다이브로모-4,5-다이플루오로벤젠(1,2-dibromo-4,5-difluorobenzene)을 폴리메틸하이드로실록산과 반응시킨 후, 트리스(디벤질리덴아세톤)다이팔라듐(0) {Pd2(dba)3}과 1,1'-비스(다이페닐포스피노)페로센 (DPPF) 하에서 Zn(CN)2와 반응시켜 하기 화학식 20의 화합물을 수득하는 단계;
    ii) 상기 단계 i)에서 수득된 화학식 21의 화합물과 암모니아수를 반응시켜 화학식 22의 화합물을 수득하는 단계;
    iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 화학식 22의 화합물과 화학식 23의 화합물을 반응시켜 화학식 24의 화합물을 수득하는 단계; 및
    iv) 상기 단계 iii)에서 수득한 화학식 24의 화합물과 알록산 일수화물 및 붕산을 반응시켜 화학식 1의 화합물을 수득하는 단계,
    를 포함하는 화학식 1에 따른 유기 전자 전달 매개체의 제조방법:
    [화학식 20]
    Figure pat00100

    [화학식 21]
    Figure pat00101

    [화학식 22]
    Figure pat00102

    [화학식 23]
    H2N-L-R
    [화학식 24]
    Figure pat00103

    [화학식 1]
    Figure pat00104

    상기 식들에서, L 및 R은 제1항에서 정의된 바와 같다.
  11. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 유기계열 전자전달 매개체 및 폴리비닐피리딘 (Poly(vinylpyridine): PVP) 혹은 폴리비닐이미다졸 (Poly(vinylimidazole): PVI) 및 폴리알릴글라이시딜에터 (Poly allyl glycidyl ether: PAGE) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상과 같은 중합체 골격(backbone)을 포함하는, 산화-환원 중합체.
  12. 제11항에 있어서, 상기 화학식 25로 나타내어지는, 산화-환원 중합체:
    [화학식 25]
    Figure pat00105

    상기 식에서, X는 5 내지 30이다.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 유기 전자전달매개체를 포함하는 장치.
  14. 제13항에 있어서, 상기 장치는 전기화학적 바이오센서인 것인, 장치.
  15. 제13항에 있어서, 상기 장치는 삽입가능한 것인 장치.
  16. 액체성 생체시료를 산화환원시킬 수 있는 효소; 및
    제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 유기 전자전달매개체를 포함하는 전기화학적 바이오센서용 센싱 막.
  17. 제16항에 있어서, 상기 효소는
    탈수소효소 (dehydrogenase), 산화효소 (oxidase), 및 에스테르화효소 (esterase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소; 또는
    탈수소효소, 산화효소, 및 에스테르화효소로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 산화환원효소와 플라빈 아데닌 디뉴클레오타티드 (flavin adenine dinucleotide, FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (nicotinamide adenine dinucleotide, NAD), 및 피롤로퀴놀린 퀴논 (Pyrroloquinoline quinone, PQQ)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 보조인자를 포함하는 것인, 전기화학적 바이오센서용 센싱 막.
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