PT96599B - Processo para a preparacao de plantas resistentes a fungos e de polinucleotidos que induzem resistencia a fungos em plantas - Google Patents

Description

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que podem ser usados para a manipulação genética»

ESTADO DA TÉCNICA

Muitas culturas agrícolas e hortículas estio sob a ameaça constante de ataques de fungos» Para proteger as culturas de perdas significativas devidas a doenças provocadas por fungos, as colheitas, e por vezes o solo onde as culturas são plantadas, são periodicamente tratados com grandes quantida des de fungicidas. Estes fungicidas tornam-se uma pesada carga nos custos das culturas, e, mais importante, no ambiente e para os agricultores» Alem disso o tratamento exige um trabalho muito Iintensivo. Deste modo, existe uma necessidade de métodos menos dispendiosos e mais seguros para proteger as plantas dos ataques de fungos, que não exijam, de preferência, uma intervenção humana repetida»

Resistência induzida

Nas plantas ocorrem geralmente vários tipos de resistência contra agentes patogênicos; resistência nio-hospedei ra, resistência "horizontal11 ou parcial e resistência "vertical", Nenhuma destas formas de resistência é particularmente bem compreendida em termos moleculares. Para além destas formas de resistência expressas de forma constitutiva existe um mecanismo de resistência que pode ser induzido por certas infecções patogêni-cas assim como por um numero de factores biõticos e abiõticos. Esta resistência induzida tem um âmbito muito grande e é dirigida contra diversos agentes patogênicos, incluindo fungos» Isto serã explicado com mais pormenor adiante* A inoculação das folhas inferiores de um culti var de tabaco de reacção hipersensível (Nicotiana tabacum cv Sam sun NN) com vírus de mosaico do tabaco (TMV) tem como resultado a formação de lesões locais nas folhas inoculadas. As folhas não inoculadas apresentam resistência a uma segunda infecção com TMV iapõs 3 dias; esta resistência dura pelo menos vinte dias, e ob-tim-se uma resistência óptima apês 7 dias. A resistência contra * a segunda infecção ê também dirigida a outros vírus, tais como o . vírus da necrose do tabaco, o vírus da mancha em anel do tabaco - 2

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(Roes & Bozarth, 1960; Ross, 1961) e a fungos, tais como Thiela-vlopsls baslcola (Hecht & Bateman, 1964), Phytophthora nicotia-nae e Peronospora fcabaclna (Mclntyre & Doââs, 1979; Mclntyre et 1981) · O fenômeno da resistência induzida tem sido es tudado em muitas outras plantas hospedeiras e também em combinação com outros variados agentes patogenicos (Kuc, 1982; Sequeira 1983)· O quadro geral que emerge destes estudos ê que uma respos ta hipersenslvel ê acompanhada por resistência contra uma larga gama de agentes patogenicos, lndependentemente do tipo de agente patogenico que causou a primeira infecção·

Proteínas expressas concomitantes com resistência induzida

Juntamente com a resistência são sintetizadas numerosas proteínas, estando estas ausentes antes da infecção·

Be um modo grosseiro, podem ser distinguidas tres categorias de proteínas. 1) Enzimas fundamentais na síntese de metabolitos secundários, tais como fitoalexinas, que apresentam um efeito antimicrobiano, e percursores da lenhina, que ê usada no reforço das paredes celulares das plantas após a invenção patogênica* Estas enzimas, ou os seus AENs mensageiros, pode m ser encontrados principalmente em células na vizinhança imedia ta do local da infecção (Elllston et al., 1976; Cramer et al., 1985; Bell et al·, 1986). 2) Glicoprotelnas ricas em hidroxiprolina (HRPGs) ou extensivas, que podem ser incorporadas na parede celular e possivelmente al actuar como substância intercelular para a ligação de componentes aromáticos como a lenhina (Fry, 1986). As HRPGs sao componen tes estruturais importantes das paredes celulares das plantas, e a sua acumulação ocorre como reacção a fungos, bactérias e vírus (Maz&u & Esquerrê-Tugayê, 1986)· Em contraste com a situação das enzimas fundamentais mencionadas acima, as HRPGs e os seus ARNs sao encontrados em quantidades substanciais em partes não infectadas da planta assim como em redor do local da infecção (Showal 1 ter et al», 1985)# 3) Um terceiro grupo de genes induzidos codifica para proteínas que se acumulam tanto no interior das células como no espaço apo - 3 -

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plástico. Entre estas proteínas estão enzimas hidrolíticas tais como quitinases e glucanases. Após uma infecção necrõtica estas enzimas podem frequentemente ser encontradas por toda a planta, i incluindo nas partes não infectadas, em concentrações mais eleva das do que antes da infecção· 0 aumento da síntese destas enzimas parece ser induzida também por indutores microbianos, normal mente preparações de parede de células fúngicas (Darvill & Alber sheim, 1984; Toppan & Esquerre-Tugayé, 1984; Mauch et al., 1984; Chappel et al·, 1984; Kombrink & Hahlbrock, 1986; Hedriek et al. , 1988).

Estrutura das paredes de células fúngicas i

As paredes celulares de fungos são conhecidas por serem constituidas por vários polímeros de hidratos de carbono diferentes· A maior parte dos fungos, com a excepção das Oomicetas, contém quantidades consideráveis de quitina. A quiti-na e um polímero de moléculas de N-acetil-glucosamina que estão emparelhadas através de ligações β-1,4 e que, em paredes de células fúngicas, estio frequentemente associadas com /3-1,3//3-1,6 -glueano, polímeros de glucose com ligações /3-1,3 e β -1,6. Os fungos do grupo das Zigomicetas não contêm glucanos com ligações β -1,3 e β -1,6, enquanto que na maior parte das Oómicetas os glucanos estão associados ã celulose (para uma visão mais completa, vide: Wessels e Sietsma, 1981)·

Degradação in vitro de paredes de células fúngicas isoladas Ê conhecido já há muito tempo que as paredes de células fúngicas isoladas podem ser degradadas in vitro por extractos de plantas (Hilbom & Farr, 1959; Wargo, 1975; Young à Pegg, 1982) e também por preparações de quitinase e /^-1,3-glu-canase de origem microbiana (Skujins et al., 1965; Hunsley & Bur ; nett, 1970; Jones et al., 1974). I Mais recentemente mostrou-se que uma endo- β -1,3-glucanase purificada de tomate em combinação com uma exo- β --1,3-glucanase de origem fúngica eram capazes de hidrolisar paredes de células isoladas do fungo Verfclcilllum albo-atrum. Cada uma das preparações em separado não apresentava actividade (Younç - 4 -

& Pegg, 1982). Mostrou-se igualraente que uma β-1,3-glucanase purificada de soja (Keen & Yoshikawa, 1983), assim como uma quiti-nase purificada de feijão (Boller et al., 1983) eram capazes de degradar In vitro paredes celulares de fungos isoladas. Quando a quitinase de ervilha e a β-1,3-glucanase foram ensaiadas em paredes celulares isoladas de Fusarium solani, ambas aparentaram serem activas; em combinação, aparentaram actuar em sinergia (Mauch et al,, 1988b). Não se sabe se estas enzimas hidrolíticas podem degradar os compostos poliraêricos em paredes celulares de fungos vivos de um modo efectivo, ou mesmo se o podem fazer em absoluto.

Inibição do crescimento fúngico em meios sintéticos por ctuitina-se e glucanases de origem vegetal

Algumas qultinases e glucanases de origem vege tal são capazes de inibir o crescimento de fungos em meios sintê ticos. A quitinase purificada do feijão tem a possibilidade de inibir o crescimento do fungo Trichoderma viride em experiências em placas de agar (Schlumbaum et al,, 1986)· Uma combinação de quitinase e β-1,3-glucanase, ambas purificadas de vagens de ervi lhas, inibe o crescimento de alguns fungos em placas de agar, en quanto que outros fungos não são inibidos. A Ascomiceta Cladospo-rium cucumerlnum apresenta uma ligeira sensibilidade, enquanto as Oomicetas Phythophthora cactorum, Phythium aphanidermatum e Pythium ultimum são insensíveis. A quitinase de ervilha tem um efeito no cresci mento de T.viride, enquanto que aβ-1,3-glucanase inibe o cresci mento de Fusarium f .sp. pisi. Foi demonstrado que nestas amostrai a inibição do crescimento fúngico era devida a lise das extremidades das hifas (Mauch et al., 1988b). Aparentemente as enzimas hidrolíticas têm acesso ao seu substrato nas paredes celulares de fungos vivos, quando cultivadas em meios sintéticos, embora pelo menos algumas das enzimas hidrolíticas vegetais activas pareçam ser específicas para certos fungos. * Sabe-se pouco sobre o efeito das enzimas hidro ^líticas em fungos no biõtropo, isto ê, no solo ou nas folhas da - 5 -

míveis a um papel na resistência fúngica, evidentemente, nem todas as quitinases e glucanases possuem actividade contra fungos vivos.

Possivelmente, o estádio e o local da infecção nos quais as enzimas hidrolíticas entram em contacto com os fungos invasores podem ser de grande importância.

Ocorrência de quitinases e glucanases em plantas

Tanto quanto se sabe, as quitinases e as β-1,3 -glucanases encontram-se na maioria das espécies vegetais, se não mesmo em todas, tanto em plantas monocotiledõnias como em plantas dicotiledônias. Podem ser discriminadas pelo menos duas classes de quitinases e duas classes de glucanasess intracelular e extracelular. Tanto os genes da quitlnase como os da glucanase de uma classe em particular, parecem ser codificados por famílias de genes.

Expressão natural de genes de quitinase e genes de glucanase em plantas

Sabe-se que os genes da quitinase e da glucana se são expressos em plantas de uma forma ao mesmo tempo constitu tiva e estritamente regulada.

As quitinases e as β-1,3-glueanases são sintetizadas de uma forma constitutiva em raízes de plantas do tabaco (Felix e Meins, 1986, Shinshi et al., 1987,? Memelink et al«, 1987, 1989)· No entanto, as plantas do tabaco não são resistentes ã infecção de Phytophthora parasitlca var, nicotiniae (um a-gente patogênico da raiz do tabaco). Todavia, a resistência contra este agente patogênico pode ser induzida nas plantas do taba co, através de inoculação com TMV (Mclntyre & Dodds, 1979). Este !facto sugere que um conjunto de factores ainda desconhecidos a-!lêm de, ou juntamente com, as quitinases e glucanases, podem estar envolvidos na resistência fúngica.

Por outro lado, conhecem-se especies vegetais que aparentam ser resistentes â infecção fúngica, embora não se possa observar nenhum aumento significativo nos níveis de quiti- ** 6 *

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nases ou glucanases. Por exemplo, no tomate uma interacção compatível com o fungo Fhytophthora infestans provoca uma resistência sistémica (Christ & Mosinger, 1939)$ isto ê uma resistência a infecção por toda a planta, se bem que as quitinases ou as glu canases não possam ser detectadas nessas folhas (Fischer et al«, 1989}· Aparentemente não existe uma correlação evidente entre a expressão dos genes que codificam as enzimas hidrolíticas e a re i sistência fúngica·

Para alem destas observações, algumas quitinases apresentam um padrão de expressão regulado que não sugere i-mediatamente uma correlação com a resistência fúngica·

Por exemplo, sabe-se que os genes que codificam para as quitinases são expressos de um modo regulado pelo de senvolvimento, por exemplo nas flores de tabaco (Lotan et al., 1989}· Sabe-se que as glucanases se encontram em grandes quantidades em sementes de cevada (Swegle et al·, 1989; Woodward & Fin cher, 1982; Hoj et al., 1988, 1989}.

Em suspensões de células de tabaco a síntese de quitinases e glucanases intracelulares podem ser inibidas pela adição de eitoquininas ou auxinas (Mohnen et al», 1985; Felix & Meins, 1986; Shinshi et al·, 1987; Bauw et al., 1987)· A síntese das mesmas enzimas hidrolíticas pode ser induzida por citoquinina quando esta hormona é adicionada ao meio de cultura no qual são cultivadas plantas de tabaco normais axenicamente. Em certas circunstâncias a hormona vegetal etileno pode também induzir a síntese da quitinase e da glucanase (Felix !* Meins, 1987}· ! Nas raízes e folhas inferiores das plantas de tabaco, cultivadas no solo ou axenicamente, as quitinases e glucanases intracelulares podem ser âetectaâas, enquanto que nas folhas superiores não podem ser detectadas, ou podem-no numa pro porção muito inferior (Felix & Meins, 1986; Shinshi et al. 1987; Memelink, 1987, 1989). Desta forma, existe também expressão específica em relação a alguns orgaos das quitinases e glucanases intracelulares. A regulação da expressão dos genes que codificam para quitinases e glucanases extracelulares ê pouco, ou mesmo nada, influenciada pela citoquinina (Memelink et al», 1987, 7 -

pressas especificanente nas anteras, nas sêpalas e no ovário.

Deste nodo, existe igualmente pelo menos uma expressão específica em relação a alguns crgãos dos genes que co dificam para as quitinases extracelulares.

Plantas resistentes aos fungos que expressara genes de cruitinase quimérica

Apesar dos numerosos pontos ainda por elucidar sobre a natureza e o papel desempenhado pelas enzimas hidrolíti-cas na resistência fúngica, foram registados alguns sucessos ini ciais na tentativa de conferir ãs plantas uma menor sensibilidade aos ataques de fungos.

Na Patente dos E.TJ.JU 4 940 840, mostrou-se que as plantas de tabaco que expressam um gene de quitinase bac-teriana (ou seja o gene chiA de Serratia marcescens) são menos sensíveis ao fungo Alternaria longipes.

Sfo Pedido de Patente Internacional WÒ S007001 as espécies vegetais tabaco e canola, que expressão uma quitinase de feijão reguladas por um forte promotor virai ou por um pro motor vegetal, parecem ser menos sensíveis a dois dos fungos ensaiados, nomeadamente Botrytis cinerea e Bhizoctonia solani. Não se sabe, todavia, se estas plantas também são efectivamente resistentes a outros fungos.

No Pedido de Patente Europeia EP-A-Q 292 435 foi sugerido que a resistência a certas classes de fungos pode ser conferida pela introdução de um gene que expressa quitinase nos tecidos da planta.

Foi feita a menção de uma preferência dada em certos casos de dirigir os produtos génicos para o interior das mitocôndrias, dos vacuolos, para o interior das vesículas endo-plasmãtlcas ou outras partes da célula ou mesmo para o interior dos espaços intercelulares (apoplãsticos). Não foram divulgados preceitos sobre o tipo de quitinase ou sobre o local de acção preferencial da quitinase, j para se obter o efeito desejado. O EP-A-0 270 248 propõe um mecanismo para diri - 8 - i

gir um gene bacteriano (o gene de P -giueuronidase de 12. coli) na parede da célula da planta usando a sequência guia do gene de po ligalacturcnase do tomate. Foi proposto# por exemplo, dirigir quitinases ou glucanases para a parede da célula da planta para combater o ataque fúngico. Os resultados não foram apresentados# nem foi indicado que enzimas hidrolíticas devem ser usadas, nem como as proteínas intracelulares de plantas devesa ser dirigidas fora da parede celular»

Mo SP-A-Q 332 104 são descritas construções ge i nêticas que compreendem sequências quimicamente reguladoras deri vadas de genes de plantas # entre as quais os chamados genes PR, incluindo aqueles que codificam para a quitinase e glucanase. Mão foram apresentados quaisquer resultados de plantas resistentes a fungos.

Sumario do estado da técnica

As plantas contêm pelo menos duas classes de quitinases e β-1,3-glucanases: extraeelulares e intracelulares. A expressão dos genes que codificam para as referidas enzimas hidrolíticas não ê constitutiva# pelo menos não em todos os teci dos, mas é entre outras coisas regulada de uma forna específica em relação a cada tecido. Mo entanto# a expressão dos genes pode também ser induzida sob certas condições de stress# tais como uma Infecção por uma agente potogênico necrótico. Ma maior parte dos casos, a indução da síntese das quitinases e /3-1,3-glucana-ses ê acompanhada pela indução de resistência contra uma larga gama de agentes patogenicos, incluindo fungos fitopatogênicos. Não é claro se existe ou não uma relação de causa e efeito entre a resistência fúngica e a expressão dos genes que codificam para enzimas hidrolíticas.

As paredes celulares dos fungos fitopatogênicon contam glucanos e frequentemente uma certa quantidade de quitina., Estes polímeros de hidrates de carbono são substratos para glucanases e quitinases, respectivamente. Ê atracfcivo por a hipótese de que ambas as enzimas hidrolíticas sao responsáveis pela re • sistência observada» No entanto, este facto estã longe de ser ! óbvio, em vista das numerosas observações que entram claramente - 9 -

era conflito cora esta hipótese.

Em consequência, está ainda longe de ser claro se as enzimas hidrolític&s desempenham cu não ma papel significa tivo na resistência fúngica, quando aparentam desempenhar esse papel, atê que ponto o sau papel ê substancial na resistência fúngica. Parece ser no mínimo duvidoso que qualquer quitiae.se possa conferir uma protecção de grande êrabit© das plantas contra fungos fitopatogênicos, Geralmente, é atê questionável se as qui tinases e glucanases tem por si sõ a possibilidade de proporcionar uma protecção suficiente contra uma larga gama de fungos pa-togênicos de plantas. i S ainda reduzido o conhecimento de base que se jpossui sobre o papel das enzimas hidrolíticas no complexo proces so de aquisição (induzida) da resistência fúngica. Todavia, subsiste a necessidade de um método para proteger eficazmente as plantas contra (uma larga gama de) fungos fitopatogênicos, por meio de modificação genética.

RESUMO DA INVENÇÃO O objectivo da presente invenção ê proporcionai plantas que possuem uma resistência melhorada contra ataques de fungos. Para tal, as plantas são transformadas geneticamente por introdução dentro do genoma de uma dessas plantas de pelo menos uma construção de ADN recombinante compreendendo um ou mais genes que codificam para uma quitinase intracelular de origem vegetal, sob o controlo de um promotor que não esta associado naturalmen-Ite a esse gene.

Mais particularmente a invenção proporciona plantas que possuem uma resistência melhorada a ataques de fungos, em virtude da expressão de pelo menos uma construção de ADIS recombinante que compreende uma sequência de ADH, que codifica para pelo menos uma quitinase de planta intracelular, que ê modificada de tal modo que a quitinase intracelular acaba por ser se Igregada para o espaço apoplãstico* [ Num forma de concretização preferencial, a l presente invenção proporciona plantas que apresentam uma protec- - 10 - >

ção mais efectiva contra ataques fúngicos devido a expressão de um gene que codifica para urna quitinase, de preferência uma qui-tinase intracelular# e de um gene que codifica para uma glucana-ae, sob o controlo de um promotor que permite uma expressão aue-quadamente forte# num ou mais tecidos.

Huma forma de ooncretiaação ainda roais preferencial, a presente invenção proporciona plantas que expressam constitutivamente um gene que codifica para uma quitinase intracelular de origem vegetal que e dirigida para o espaço apoplãsti co e# adicionalmente, um ou mais genes que codificam para uma en zima hidrolítica do grupo que e constituído por quitinases iircra celulares# quitinases extracelulares# gincanases intracelulares e glucanases extracelulares.

Uma forma de concretização especialment® preferida ê uma planta que expressa os genes que codificam para uma quitinase intracelular, uma quitinase exfcracelular, uma /3-1,3--glueanase intracelular e uma β-1,3-glucanase extracelular. Bestes os genes que codificam para as formas intracelulares das enzimas hidrolíticas da planta mencionadas são particularmente pre feridos. Ainda mais preferencial ê o uso dos genes que codificam para enzimas hidrolíticas intracelulares, modificadas por manipu lação genética para permitir o direcelonamento para o apoplasto. No sentido de se conseguir o direcelonamento para o apoplasto das enzimas hidrolíticas intracelulares, a extremidade 3* do gene que codifica para a extremidade terminal C das enzimas hidrol]. ticas intracelulares ê modificada para se estabelecer# por expressão dos genes# a ausência dos ácidos assinados C-terminais que estão envolvidos no direcelonamento Intracelular das respec-tlvas enzimas· Geralmente esta modificação tem como resultado a ausência de pelo menos 3 ácidos amimados da extremidade terminal C, ou tantos ácidos aminados quanto o desejado# desde que a função enzimãtiea e/ou outros domínios relevantes da proteína não sejam afectados negativamente*

Preferencialmente uma tal modificação tem como resultado a supressão de entre 3 a 25 ácidos aminados no caso de β-1,3-glucanases intracelulares# e de entre 3 a 10 ácidos amina * dos no caso de quitinases intracelulares, f? dada maior preferên- - 11

cia â supressão áe 4 a £-- ãeiãos aminados. São formas de concretização adicionais da presente invenção as moléculas de ϋΐω reeombinante, compreendendo uma ou mais sequências de MM que se poderá expressar em plantas que codificam para pelo menos uma quitinase intracelular de origem vegetal que ê modificada para se conseguir o direccionamento da quitinase para o espaço intercelular, e, se desejado sequências de ADN adicionais que codificam para uma ou roais enzimas hi drollticas seleccionadas do grupo constituído por quitinases intracelulares , glucanases intracelulares e glucanases extraceiula res.

Certas formas de concretização preferenciais são os genes de quitinase intracelular localizados no fragmento EcoRI-SstX de pI10G200; o gene de quitinase oxiraosiular da patu-nia híbrida, localizado em pMOG2ÕO; o gene de β-1,3-glucanase in tracelular localizado no fragmento KbaX-Sstl de pMOG212? o gene que codifica para a/3 -1,3-glucanase intracelular que estã locali zado no fragmento SstI-HindIII de pMOG212, ou genes çue são na essência homõlogos dos genes referidos. São especialraente preferidas versões modificadas dos genes que codificam para fornas intracelulares das referidas enzimas hidrolíticas, que são dirigidas para o espaço apo-plástico. Estas versões incluem o gene de quitinase intracelular modificado de pM0GlG9 (ou formas truncadas deste que mantenham actividade antifungica), assim como formas modificadas de genes de quitinase intracelular, que sejam na essência homõlogos do ge ne de quitinase intracelular de p!-!OG189. S também preferido o ge ne de glucanase intracelular modificado de pMOG512, no qual um codão de paragem ê introduzido na região de codificação para dirigir para o espaço apoplãstico aβ -1,3-glucanase intracelular produzida.

Também se reivindicam vectores de clonagem, de expressão e de transformação contendo sequências de ADN que compreendem os referidos genes, assim como micrcorganismos que contêm as referidas sequências de ADN.

. Destes vectores os plasmídeos pMOG200 e pMOG * 212 e seus derivados são preferidos. - 12

Formas de concretização adicionais cia presente invenção incluem plantas resistentes a fungos completas obtidas pelos processos de acordo com a presente invenção? protoplastos, células, partes (tais como sementes, frutos, folhas, flores e se melhantes), e qualquer outra parta da planta gue se possa reprodu zir quer de uma forma sexuada, quer de uma forma assexuada, quer de ambas as formas, e a descendência das referidas plantas.

As vantagens e o campo de aplicação serio pron tamente percebidos a partir da descrição pormenorizada da invenção que se segue.

DESCRIÇSO DAS FIGURAS A Figura 1 mostra a sequência de nucleõtidos e a sequência deduzida de ácidos aminados de um ADNc completo correspondente a uma quitinase extracelular de Fetunia hybrida. A seta vertical mostra o local de separação do peptídeo de sinal· A Figura 2 mostra a sequência de nucleõtidos e a sequência deduzida de ácidos aminados de ma fragmento BamHl de ADN correspondente a uma quitinase intracelular de tabaco· A sequência desde o nucleõtido 2 ao 22 i originada por um fragmento sintético, enquanto que os nucleõtidos 23 a 2? formam o resto do local ue reconhecimento ScoRX· O local de reconhecimento Pstl (51-CSGCAG-3 *) encontra-se nas posições 129 a 134· Os últimos 21 nucleõtidos da sequência representam sucessivamente um local de reconhecimento Sooai preenchido, originado por uma molécula de adaptação da Eco31 usada para a construção do banco de ADHc, um local de reconhecimento Sal e outro BeaaEI, ambos originados por um poliadaptador da pIC19E. A seta mostra o local de separação do peptídeo de sinal. A Figura 3 mostra a sequência de nucleõtidos a a sequência deduzida de ácidos aminados ds um gene que codifica para uma /3 -1,3-glucanase de tabaco* A seta vertical mostra a posição na sequência de ácidos aminados onde o peptídeo de sinal e dividido. A posição do intrao e indicada? a sequência do intrão apenas é dada em parte. * A Figura 4 mostra a sequência de nucleõtidos e • a sequência deduzida de ãcidos aminados cie um gene que codifica - 13 -

'para «ma^-1,3-gluesnsse de tabaco. A esta vertical sestra o local na sequência de ácidos aminados onde o peptíâe© de sisal ê dividido. A Figura 5 mostra uma representação esquemática do vector de expressão pMQGl81. Mipr representa o gene de resistência ã anpicilina. Um local de reconhecimento de uma enzima de restrição entre parêntesis mostra que © local em questão ja não estã presente no plasmídeo. A Figura € mostra tsaa representação esquemática do vector pMOG183, um derivado de pMÕGlSl em que o local de reconhecimento BcoRl e substituído por um local de SstI. A Figura 7 mostra «ma representação esquemática do vector pMOG184, um derivado de pMDGISl em que o local de reconhecimento HindlXI ê substituído por um local de SSfel. A Figura 8 mostra uma representação esquemática do vector pM0G185, um derivado de PMQG184 em que o local de reconhecimento EcoRI é substituído por tua local de Xbal. A Figura 9 mostra uma representação esquemátice do vector binário pMOG23. A Figura 10 mostra uma representação esquemáti ca do vector binário pMOG22, um derivado de pMOG23 em que o gene de resistência ã kanamicina (NPTIX) ê substituído por um gene de resistência â higromicina (HPT)· A Figura 11 mostra uma representação esquemáti ca do plasmídeo pMOG20Q, um derivado de pM0G23 em que dois blocos integrados (cassettes) de expressão são clonados no poliadap tador, sendo um com a sequência de codificação para uma quitina-se intracelular (Chil) e um com a sequência de codificação para uma quitinase extracelular {ChiE), A seta dá a direcção da trans crição nos blocos integrados, começando cora o promotor CaliV 35S. A Figura 12 mostra uma representação esquemáti ca do plasmídeo pMOG212, um derivado de pM0G22 em que dois blocos integrados de expressão são clonados no poliadaptador, sendo um com a sequência de codificação para «ma β -1,3-glucanase (GluE) e um com a sequência de codificação para uma β-1,3-glucanase (GluI) As setas dão a direcção da transcrição começando com o promotor *. CaMV 35S. - 14 -

DEFINIÇÕES

Para os prôpositos da presente invenção estabe lece-se que uma proteína extracelular ê mm proteína que apõs ex pressão adequada na planta original ê localizada ao espaço apo-plastico.

Por conseguinte, mm proteína intracelular e uma proteína qu e apôs expressão adequada na planta de origem δ localizada intraceiularvaente. 0 espaço apopiãstioo e aqui definido como o es paço extracelular, incluindo a parede da célula da planta.

Para os propósitos desta invenção diz-se que umg proteína estã localizada intraeelulsrmante se estã localizada nua qualquer compartimento da célula que não faz parte d© espaço apoplãstico; estes compartimentos incluem, núcleos, cloro-plastos, mitocôndrias, vaeSolos, retículo enâoplasmãtioo, outros organelos membranosos, o citoplasma, s todas as membranas, incluj indo a membrana plãsmica.

Dia-se que os genes são essencialmont© hcsõlo-goe se as suas sequências de AM se correspondem ea sais de 605, excepto indicação eis contrario.

DSSCKIÇfQ FO&MENOHIZABZL DA IHVEHÇlO Ã luz do seu presumível envolvimento na resistência a fungos, descobriu-se surpreendentemente que quitinases extracelulares purificadas de tabaco e petúnia não possuem um e-feito antifúngico significativo quando comparadas com as quitina ses intracelulares. Num ensaio antifúngico, foram comparadas quantidades iguais de actividade quitinolítiea de quitinases intra celulares e extracelulares purificadas, em vez de quantidades i-guais de proteína. A actividade aatifungica das formas extracelulares ensaiadas era praticamente indetectãvel. j A expressão de um gene quimérico que codifica

I jpara uma quitinase extracelular numa tal planta transformada não jé, portanto, suficiente para proporcionar a resistência a fungos * No entanto, não se pode pôr eoiapletamente de parte o papel de su 1 porte desempenhado pelas quitinases extracelulares na resistência 15 - * k

a fungos# através fio aumento fio efeito antifmigic© cie outras enzimas hidrolíticas presentes* 3sta observação t<sa importantes a-plicaçoos para a técnica cia resistência a fungos sei plantas, baseada na expressão de genes quiialrleoss que eodlfiosss para enzimas hídrolíticas cie plantas e ulciZL.er,..‘ce cl© c-ux'cil-cís&í> © à comparação fias extrenifiades ΰ-terminais de diversas proteínas hesaSlcgas (pari glucanases), que difiram essencialmente na sua localização, reve lou que as proteínas intracelulares pissuea frequeatement© ss extensão aproximada de 3 a 25 (no osso fi© ^“1,3-glueanases in-fcra celulares) cu cie 3 a 10 (no caso fi© çuitinasea intracelulares) ácidos aminados residuais cca^eradas coz. os seus análogos* extra 'celulares* Descobriu-se surpreenâenbemente que a supressão de cerca de 6 ácidos esinafios residuais na porção C-teradnal de sca quitinase intracelular de tabaco resulta na secreção da proteína para o espaço apoplástico. Aparentemsnte a extensão C-terminal funciona como um sinal de dlreccionament© para os vacuolos.

Pensamos que esta © a primeira demonstração d© direcclonamento para o espaço apoplástico de quitinases que ©cor re naturalmente no vacuolo de uma célula vegetal. Sstas dôscobsr tas podem ser adequadamente aplicadas no direcclonamento cie proteínas vacuolares (p. ex. proteínas que estão localizadas no vr cuolo) para o espaço apoplástico.

Pensa-se que o espaço apoplástico ê um local de acção muito efectivo das enzimas iiidrolíticas na profcecção de plantas transformadas contra uma gama fie fungos patogênieos de plantas.

Deste modo, para obter uma resistência a fungos melhorada ê vantajoso que as plantas sejam transformadas coai uma construção de ADK recombinante que compreenda ura gene que co difique para uma quitinase (ou uma sua forma truncada, que com-reende os domínios ou partes antifángicos) que exerça a sua ação no espaço apoplástico da planta, quer naturalmente quer por meio de modificação genética.

Para obter tais plantas, e preferível que as Ílantas sejam transformadas com uraa construção de ADK recombinmi e que compreende um gene que codifique para uma quitinase intra - 16

celular, que ê modificado de tal forma que os ácidos aminados C-terminais envolvidos no direceiGnsaento vaeuolar não estão pre sentes (p,ex. por introdução de um coáão de paragem de tradução na região de cGdiíicaçâo do gene, ou de outra forma), resultando no direccionamento para o espaço apoplãstico (da maioria) das quitinases intracelulares produzidas nessa planta· A fim de avaliar a possibilidade de se direc-cionarem enzimas hidrolíticas intracelulares para o espaço apo-plastico, sem um efeito adverso significativo na actividade anti fúngica, a seguinte experiência foi levada a cabos

Foram transformadas plantas com construções cl© ÍADM compreendendo esseneialiaeafe© os seguintes genes: 19 um gene que codifica para uma quitins.se extraeelular de petlí-nia 29 um gene que codifica para uma quitinase intracelular de tabaco 39 um gene de tabaco que codifica, para uma quitinase intracelular, modificada de forma a obter-se o direccionamento para o espaço apoplãstico da (construção de direccionamento) da quitiras®, ou 49 o gene de quitinass extracelular de pstímia, © o gene (da oca strução de direccienamento) da quitinase intracelular de tabaco modificada*

Todos os genes foram colocados sob o controlo do promotor 35S do vírus do mosaico de couve-·flor. Be cada categoria das plantas transformadas seleccionaram-se os bons expres-sores dos genes quiméricos e sujeitaram-se a isolamento de fluidos extracelulares (FE) e de exfcraetos totais de proteínas (ST) das folhas. Os efeitos antifúngicos das diferentes fraoções cias plantas 1 a 4 foram determinados cora o fungo de ensaio Fusariuia solani. Hem os FE nem os ET da planta 1, que expressa a quitinase extracelular da pstunia, tiniram anaXcraer actividade antifungi ca, tal como era esperado a partir das experieneias que usam as * enzimas hidrolíticas purificadas. Os 5Ή da planta 2 possuiam um. • efeito antifungico residual (provavelmente devido a vazamento da i - 11 -

~ célula da quitinase intracelular (relatívamente sobr® ©spressa), enquanto que o extraci© dê proteínas total mostrava iiq forts Sfe ito antifungicc. 5¾ planta 3, que expressava o gene cie quitinase intracelular cliraeeionada para o espaço apoplãstieo modificacla tanto os FE corso os ΏΤ apresentavam na SorfcQ ©feito aiitifSngic©? este facto, de raoclo determinante, prova çu® o qnitine.se intracelular tlireccionada da planta 3 fesra ainda astiviâaS© antifSncrica. Desta forma, de um modo inesperado, a supressão cio sinal C-termin nal de direccionamsnb© pera © vmenol© aã© afecta sígviificativa-mente a activiílacle antifungies. cia cjuítisase® èb plantes podem s©r protegidas cie um modo ain da mais efectivo contra o ataqu© d® fungos se ©xprGssaresi tanto !uma quitinase intracelular com© ume çuitiaas® intracelular (£i-reccionada para o espaço apoplãsfcico) modificada.,

Deste modo a presente invenção proporciona plantas que possuem resistência melhorada a fungos, assim ecm© métodos para a obtenção destas plantas. iixm primeiro aspecto da presente invenção verificou-se que as fonaas intracelulares uas quitinases de tabaco e de petunia têm preferência sobre as quitinases extracelulares. Portanto, são preferidas as quitinases intracelulares que são es sencialmente homologas âs quitinases intracelulares de tabaco.

De preferência esta homologia de quitinases vegetais intracelula res deve ser superior a 50% ao nível das proteínas, de modo espe cialmente preferido superior a 60%, e ainda cie modo muito espe-ciali.iente prefericlo superior a 70%. ura segundo aspecto da invenção ê a verificação inesperada d© quo o forte ©feito antifungico das quitinases intracelulares © mantido apos modificação da extremidade C-termi-nal da proteína. Desta modo, para melhorar a resistência a fungos; em plantas transformadas seleccionam-ss as enzimas Iiidrolífcic-as mais potentes, isto ê as formas intracelulares, e estas enzimas hidrolíticas, ou as formas truncadas, que compreendera os domínios; /partes antifungiccs activos, são direccionados para o espaço a-poplãstico, onde o seu efeito antifungieo e õptimo. * Ha seguinte serie d® experiências foi investi- • gado o efeito combinado cias quitinases © glucanases nos ©xtrac- 18

plantas txansgãnlcas.

Sransformaraai-se plantas da tabaco com uma construção de MM recombinante compreendendo esseneialmentet

Mais uma ves, as plantas cie tabaco transgêni-cas que eram bons estressores dos genes quiméricos foram seieccio nadas, e sujeitas a isolamento do fluido extraeeiular (EE) e do extracto total da proteína (ES?) das folhas* ranto o FS como o Sida planta 1, que expressa a #-l,3-glueanase intracelular que foi direccionada para o apoplasto, apresentavam trn. fraco efeito anti fúngico para o fungo Eusariua solani. OíSeo Εϊ da planta 2, que expressa tanto a quiiiaase intracelular direccionada para o apoplasto como a fi -l,2-gflueanas© intracelular direccionada para o apoplasto, apresentavas» um ©fsit© antifungico surpreendentenen te forte? este efeito era ligeirasasnto mais forte do que o do PE e cio nf na planta 3 da experiência anterior (çue expressa apenas o gene que codifica para a quitinas® intracelular direccionada para c apoplasto}.

Pode concluir-se destas experiências que a modificação da extremidade C-terminal da /9-1,3-glueanase intraoelu lar quando efecfcuada coa -sucesso condus ao direccionamento para o espaço apoplãstic© (da maior parte) áa ©naima, e que a modificação C-terrainal não tem efeito adverso na activiciade antifíingi-ca da ·β -l,3-glucaims@ intracelular* Micionalmente, mostra-se que o efeito anfcifungico da expressão do gene quimérico da quifci ;nase intracelular e m gsno quimérico da β«lf3-glucanase intrace lular ê maior do que o efeito da expressão de cada «m dos genes • por si sô.

Deste modo, s® tercei iro aspecto da invenção 19 são proporcionadas plantas, que expressam um gene quimérico de quitinase vegetal e um gene quimérico de glueanase vegetal, ambos sob o controlo do promotor CaMV 35S*

Numa forma de concretização preferida da presente invenção são proporcionadas plantas que tenham sido transformadas com um ou mais genes que codificam para formas intracelulares de enzimas hidrolíticas de plantas, numa forma expressã-vel na planta· São especialmente preferidas as plantas que expressam um ou mais genes que codificam para formas intracelulares de enzimas hidrolíticas de plantas, que em virtude da modifi cação da extremidade C-terminal são direceianadas para o apoplas i to* Ainda mais preferidas são as plantas que são transformadas com pelo menos um gene que codifica para um gene de quitinase jintracelular e um gene de /^-1,3-glucanase intracelular· Ê vantajoso que estas ultimas plantas expressem as formas modificadas das enzimas hidrolíticas, para se atingir o direccionamento para o espaço apoplãstico das referidas enzimas»

Outra forma de concretização preferida da invenção ê uma planta que expressa de forma constitutiva uma quiti nase intracelular, de preferência direccionada para o apoplasto, uma quitinase extracelular, uma glueanase intracelular, de prefe renda direccionada para o apoplasto, e uma glueanase extracelular·

Em princípio qualquer combinação de genes que codificam para enzimas hidrolíticas de plantas pode ser escolhida modificados ou não modificados, desde que a expressão adequada-mente alta destes genes não prejudique a função celular da planta hospedeira transformada. Para alem dos genes que codificam para enzimas hidrolíticas vegetais, outros genes vegetais ou não (p. ex. derivados de bactérias, leveduras, fungos ou outras fon-jtes) podem também ser usados· | Os genes vegetais que codificam para as enzi mas hidrolíticas tanto podem ser endógenos como exógenos em rela ção ã planta que e transformada· | Será rapidamente compreendido como, para alem éos genes de quitinase e de β-1,3-glucanase mencionados, os genes • que codificam para enzimas hidrolíticas podem também ser facil- - 20 -

mente isolados a partir de outras espécies de plantas. Além dis so, os genes de acordo com a presente invenção podem ser inteira mente sintéticos.

Os genes ou ADNcs que codificam para as enzimas hidrolíticas desejadas podem por exemplo ser isolados a partir do tabaco (p« ex. Legrand et al., 1087? Shinshi et ai., 1987), do tomate (Joosten et al., 1989), uma quitinase intracelular básica pode ser isolada a partir da batata (Gaynor, 1988; Kombrink et al., 1988), uma quitinase extracelular pode ser isolada a partir do pepino (Metraux a Boller, 1986; Mêtraux et al., 1986), e tanto as quitinases intracelulares como as glucanases podem ser isoladas a partir do feijão (Broglie et al., 1986; Vo-geli et al., 1988; Mauch a Staehelin, 1989).

Para além do referido, podem isolar-se quitina ses e/ -lr3-glucanases a partir da ervilha, usando quitosano como composto de indução (Mauch et al», 1984). Por meio de uma anã lise mais profunda verificou-se a presença de pelo menos cinco hidrolases, isto é duas/3-1,3-giucanases básicas e três quitinases bãsicas (Mauch et al., 1988a). As quitinases intracelulares e extracelulares que estão sorologicamente relacionadas com uma quitinase intracelular do feijão podem ser isoladas a partir de Allium porrum L. (Spanu et al», 1989)· As endoquitinases e gluca nases podem também ser isoladas a partir do milho, apõs inoculação das folhas com BMV (vírus de mosaico do bromo) (Nasser et al, , 1988). As quitinases que estão sorologicamente relacionadas ccan uma endoquitlnase intracelular de feijão (Swegle et al., 198£ ) podem ser isoladas a partir da cevada (Bordeum vulgare). Também as β -1,3-glucanases, assim como outras classes de glucanases podem ser isoladas a partir da cevada (Balance et al*, 1976; Hoj et al., 1988, 1989). Sabe-se que existem na aveia pelo menos 4 quitinases diferentes e 5/-1,3-glucanases diferentes (Fink et al., 1988).

Deve notar-se que as fontes para a obtenção de enzimas hidrolíticas para a protecção de plantas contra ataques de fungos não estão limitadas ã lista dada acima, que é apenas dada a título de ilustração. \ Os ADNcs que codificam para quitinases e /-1,3 l glucanases de plantas são apropriadamente obtidos por busca imu- - 21

nolõgica de um banco de expressão de ADKc, feito de polyA -ARN, isolado das plantas apôs indução da síntese das enzimas hidrolí-ticas, usando um anticorpo contra a enzima hidrolítica desejada. ' j Para que seja expresso adequadamente o gene deve estar ligado operativamente a um promotor, A escolha do promotor estã dependente do nível de expressão desejado e do modo de regulação desejado do gene sob o seu controlo. Tudo isto estã incluído na técnica habitual.

De preferencia são usados promotores constitutivos fortes gue exerçam a sua função por toda a planta# com resi trições tão pequenas quanto possível no que respeita aos padrões de desenvolvimento. Um exemplo de um promotor constitutivo para expressão de alto nível e o promotor CaMV 35S. Este promotor pode ser ladeado pelas chamadas sequências intensificadoras (Mc Guilley et al.# 1987) para intensificar ainda mais os níveis de expressão* Outros exemplos de promotores de alto nível, inductí-veis pela luz# são# entre outros# o promotor de baixa subunidade da carboxilase de ribulose bifosfato (rbcSSU), o promotor da pro teína de ligação da clorofila a/b (Cab) e semelhantes» Ocasional mente, pode ser desejável reduzir a expressão dos genes quimera ; cos introduzidos a um ou a alguns tecidos pré-seleccionados, por j exemplo aqueles que sao alvos dos ataques de fungos# tais como as raízes e as células da epiderme# e semelhantes. Um exemplo bem conhecido de um promotor específico em relação ao tecido ê o promotor de classe-II da patatina específico da raíz, A expressãc dos genes quiméricos pode também estar dependente de estímulos exógenos# tais como ferimentos# secura# temperatura e semelhantes.

Geralmente o(s) gene(s) escolhido(s) está/es-tão contidos num bloco integrado de expressão# que compreende pelo menos um promotor e um terminador de transcrição# que pode sei estranho ao gene» £ bem conhecida a forma como tais elementos de vem ser ligados para que funcionem correctamente e esta circunstância pode ser determinada sem prática de actividade inventiva. ;i Ocasionalmente os genes eucariôtiCos (genõmi- , cos) contêm intrões. A presença destes# seja ela natural ou in-* troduzida por modificação genética# não ê particularmente rele- - 22 -

vante para a presente invenção. As técnicas para a manipulação de genes são facilmente acessíveis para qualquer especialista da técnica (vide p. ex*: Maniatis et al., 1989)*

Para alem dos genes que codificam para enzimas hidrolíticas também os genes que codificam para outras proteínas produzindo um efeito adicional na resistência patogênica podem ser introduzidos na planta em questão, com o fim de melhorar o efeito ou de alargar a gama patogênica· Estas proteínas são escolhidas de um modo adequado do grupo que consiste p.ex. em lec-tinas, inibidor da tripsina da ervilha (CpTX), toxinas de Bacil-lus thuringiensis e semelhantes.

Para obter plantas transgênicas capazes de expressarem constitutivamente mais do que um gene quimérico, esta disponível um numero de alternativas, abrangidas pela presente invenção, incluindo as seguintes: A, o uso de um fragmento de ADK ou plasmídeo com um numero de genes modificados emparelhados fisicamente a um gene marcador de selecção. B. Polinização cruzada de plantas transgênicas que têm jã a possibilidade de expressar um ou mais genes quiméricos emparelhados com um gene que codifica para um marcador de selecção, com pólen de uma planta transgênica que contêm uma ou mais construções de genes emparelhadas com outro marcador de selecção. Em seguida a semente, obtida por este cruzamento, ê seleccionada na base da presença dos dois marcadores· As plantas obtidas a partir das se mentes seleccionadas podem em seguida ser usadas para outros cru zamentos.

I !c* O uso de vários fragmentos diversos de ADN de plasmídeos, ca da um tendo um ou mais genes quiméricos e um outro marcador de selecção. Se a frequência da cotransformação ê alta, então a selecção na base de um só marcador é suficiente· Noutros casos, ê preferida a selecção com base em mais de um marcador.

Dm Transformações consecutivas de plantas transgênicas com genes quiméricos e genes marcadores de selecção novos e adicionais ) E. Combinações das estratégias acima mencionadas. - 23 -

A estratégia a utilizar não é um ponto critico da invenção descrita e pode ser facilmente determinada dependendo de factores tais como a construção desejada, os materiais dis poníveis e as preferências dos peritos na técnica.

Para a transformação de plantas estão disponíveis várias técnicas. Λ escolha da técnica não ê geralmente um ponto crítico da invenção, desde que a construção genética trans formante, compreendendo os genes e elementos regulatõrios de a-cordo com a invenção, possa ser introduzida numa planta e fique integrada de uma forma estável no genoxna dessa planta. Por planta entende-se qualquer planta dicotelidõnea ou monocotiledõnea, incluindo a descendência ou partes destas plantas, células ou protoplastos, e semelhantes, e qualquer outro material de plantas; que seja receptivo â transformação e subsequente regeneração numa planta completa.

Alguns exemplos para fins de Ilustração são a transformação de protoplastos usando o método do cálcio/poilieti leno-glicol (Krens et al., 1982; Negrutiu et al., 1987) electro-poração (ref.) e microinjecção (Crossway et al., 1986), bombarde araento de partículas (revestidas) (Klein et al», 1987), infecção com vírus e semelhantes. Apôs selecçio e/ou busca para o material da planta transformado, o material transformado ê regenerado em plantas completas, usando métodos conhecidos.

Subsequentemente as plantas transformadas são testadas no que respeita ã presença das propriedades desejadas e/ou â extensão a que as propriedades desejadas estão expressas. Uma primeira avaliação pode incluir o nível de expressão dos ge nes recentemente introduzidos, o nível da resistência fúngica das plantas transformadas, a hereditariedade estável das proprie dades desejadas, experiências de cultivo e semelhantes*

Ba segundo lugar, se desejado, as plantas tran sformadas podem ser cruzadas com outras variedades, por exemplo variedades de valor comercial mais elevado ou variedades nas quais outras caracterlsticas desejadas tenham já sido introduzi das, ou usadas para a criação de sementes híbridas, ou sujeitas ' a outro ciclo de transformação e semelhantes. • As plantas, ou partes destas com interesse co- - 24 i

mercial, com resistência melhorada contra fungos fitopatogéni-cos, podem ser cultivadas no campo ou em estufas, e subsequentemente serem usadas para alimentação animal, consumo directo por seres humanos, para armazenamento prolongado, usadas no processamento industrial alimentar ou outros, e semelhantes. As vantagens das plantas, ou de partes destas, de acordo com a invenção são a reduzida necessidade de tratamento fungicida, baixando des te modo os custos do material, trabalho, e a poluição ambiental, ou a duração prolongada de armazenagem dos produtos (p. ex, frutos, sementes, e semelhantes) destas plantas.

Qualquer espécie ou variedade de plantas que esteja sujeita a alguma forma de ataque de fungos pode ser trans formada com tuna ou mais construções genéticas de acordo com a in venção no sentido de diminuir o grau de infecção e/ou os efeitos de um tal ataque.

Como ilustração, as espécies da lista seguinte não-limitativa, são de interesse particular: flores comestíveis, tais como a couve-flor {Brassica oleracea), alcachofra (Cynara scolymus) (flores comestíveis); flores decorativas, tais como crisântemo, lírio, rosa; frutos comestíveis, tais como a maçã (p. ex. Malus domesticas), banana, bagas silvestres (p. ex. a groselha, Ribes rubrum), cereja doce (Prunus avium), pepino (Cu-cumis sativus), uvas (Vitis vinifera), limão (Citrus limon), melão (Cucumis melo), frutas secas (p. ex. nozes Juglans regia), laranja, pêssegos (Prunus pérsica), pera (Pyra coamunis), pimen-ta (Solanum capsicum), ameixas (Prunus domestica), morango (Fray garla), tabaco (Kicotiana), tomate (p. ex. Lycopersicon esculen-tum); vegetais com folhas, tais como couves (Brassica), endívia (Ciéhoreua endívia),alface (Lactuca safciva), espinafre (Spinacia oleraceae) alho-porro (Allium porrum); raízes comestíveis, tais como beterraba (Beta vulgar!s) cenoura (Daucus carota), nabo/nabi ça (Brassica rapa), rabanete (Raphanus sativus)(raízes comestíveis) ; sementes comestíveis, tais como feijão (Phaseolus), ervilha (Pisum sativum) feijão de soja (Glycin max), trigo (Triticum aestivum), cevada (Hordeum vulgare), milho (Zea mays), arroz (Or yza); tubérculos comestíveis, tais como couve-rãbano, batata (So lanum tuberosum), e semelhantes. ? - 25 -

Os seguintes Exemplos tem por objectivo ilustrar mais completamente a presente invenção, e não devem ser con siderados como limitando ou restringindo o âmbito da invenção em questão·

PARTE EXPERIMENTAL EXEMPLO 1

Analise da actividade antifúngica

Avaliou-se o efeito de diversas soluções de proteínas no crescimento de fungos por meio de uma análise em placa de microtitulação. Pipetaraia-se 250 μ! de agar de dextrose de batata (PDA) para cada alvéolo de uma placa de microtitulação de 24 alvéolos. Suspenderam-se esporos fúngicos em água e adicio naram-se aos alvéolos 300 a 500 esporos em 50 jul. Os esporos foram pre-germinados de um dia para o outro. Subsequentemente adicionaram-se 100 jul de soluções de proteínas esterilizadas por filtragem (filtro de 0,22 μ&)» como controlo ferveram-se proteínas durante 10 minutos. As placas de microtitulação foram cobertas com Parafilm e incubadas â temperatura ambiente. Apõs 1 a 2 dias o micelio dos fungos em crescimento foi corado com azul de algodão de lactofenol e estimou-se o grau de crescimento. EXEMPLO 2

Análise da actividade da guitinase A actividade da quitinase foi determinada ra-diometricamente com quitina tratada com tritio corno substrato (Molano et al., 1977). A quitina tratada com tritio foi sintetizada por acetilação de quitosano cqm anidrido tritiado (Molano et al., 1977)· A actividade específica do produto final era acro '1...... g — ximadamente de 1,2 x 10 cpm/mg. Antes de ser usada a quitina tratada com tritio foi lavada três vezes* Adicionaram-se 50 jal de quitina tratada com tritio (aproximadamente 150 000 cpm) e 50 ul de solução de proteína a 100 ;ul de tampão de fosfato de potássio 10 mM de pH 6,4 com 0,02% de azida de sÕdio. A mistura foi incubada com agitação durante 30 minutos a 3?°C. A reacção 26 -

foi feita parar por adição de 600 >ul de acido trieloro-aeêcieo I a 10%. ApÕs centrifugação a fim de separar a quitina (10 minutos ! numa microcentrífuga), filtraram-se sobre lã de vidro e pipeta- i ramrse para um frasco de cintilação SOO jul do sobrenadante. Adicionaram-se 5 ml do fluido de cintilação e mediu-se a radioacti-vidade» A quantidade de radioactividade libertada (expressa corno contagens por minuto) foi tomada como uma medida para a activi-dade da quitinase. i j EXEMPLO 3 1 i .............................

Actividade antifungica da quitinase A actividade antifúngica das quitinases foi avaliada através da analise em placa de microtitulação acima dejs crita usando o fungo Fusarium solani. Analisaram-se duas quitina ses de tabaco extracelulares purificadas (também conhecidas como proteínas relacionadas com a patogenese P e Q), uma quitinase de tabaco intracelular purificada (proteína de 32 kD) e uma quitina se de petunia extracelular purificada· Em todos os casos a actividade adicionada era aproximadamente de 2000 contagens por minu to (querendo dizer que esta actividade liberta 2000 cpm da quiti na tratada com trítio na analise da quitinase)* Esta actividade encontra-se dentro da gama em que se verifica linearidade entre a concentração das proteínas e a actividade· Como controlo foram adicionadas albumina de soro de bovino (BSA), tampão ou quitinase inactivada pelo calor. Os resultados são apresentados no Quadro l.

Quadro X· Inibição do crescimento de Fusarium solani por quitinases·

Proteína adicionada inibição quitinase extracelular de petúnia quitinase extracelular de petúnia, fervida * quitinase extracelular de tabaco (PR-P) . PR-P de tabaco, fervida - 27 -

I quitinase extracelular da tabaco (PR-Q) PR-Q de tabaco, fervida quitinase 32 kD intracelular de tabaco I quitinase intracelular 32 kD de tabaco, fervida ! BSA tampão - : nenhuma inibição;+ ; inibição ! h partir dos resultados do Quadro I pode-se concluir que as quitinases extraeelulares de tabaco e de petunia não possuem actividade antifungica. EXEMPLO 4 4.0 Clonacrem de APNcs correspondentes a cmitinase

Isolou-se ARN poliadenilado a partir de tabaco NN Samsun infectado com tísv e produziu-se AlíNe de dupla cadeia usando oligo(dT) como iniciador (Hooft vau Sluijsduijnen et al., 198$) através de técnicas usuais conhecidas dos investigadores nesta especialidade. Ao ADISí de dupla cadeia foram acrescentadas "caudas-C* que foram hibridas com "caudas-fí" que incorporadas no plasmídeo pUC9 depois de este plasmídeo ter sido aberto com Psfcl (Maniatis et al., 1982). As construções obtidas foram usadas na transformação de Escherichla coli MH-1. os transformantes foram colocados em duplicado em filtros de nitrocelulose. O primeiro | filtro foi hibridado in vitro com ADííc de poly(A)-ARK transcrito de tabaco infectado com TMV, o outro filtro foi hibridado com ADNc contra poly(A)-ARM de tabaco saudavel (Maniatis et al., 1982: ) · Os transformantes que apresentaram melhor hlbridação com a primeira sonda do que com a segunda continham ADNc correspondente a ARNms cuja síntese foi induzida por via de infecção com TMV. Foi possível subdividir os clones de ADííc obtidos em seis grupos com base em hlbridações cruzadas das inserções: dentro de um gru . po, as inserções de todos os clones hiforidam umas com as outras,

Huijsduijnen \ entre grupos não se deu qualquer hlbridação cruzada (Hooft van et al., 1986) sob as condições de hlbridação e de - 28 -

lavagem usadas (0,1 de SBC, 1¾ de SDS, 65°C; Maniatis et al., 1982). Confirmou-ss a inductibilida&e pelo TM*/ da síntese dos ARNras correspondentes as inserções dos clones dos seis grupos por analise de mancha de Northern* bem conhecida dos investigadores desta especialidade (líooft van Huijsduijnen et al»,. 1988)

Através de imunopreeipitaçoes dos produtos de tradução in vitro de Aiaftas por meio de Iiibridação selectiva com (as inserções de) clones de ADNc dos seis grupos, demonstrou-se que os clones de dois grupos, noaeadanente os grupos D e F, correspondiam a ARHras para proteínas sorologicamente relacionadas com as chamadas proteínas PRP e Q (Eooft van Euisduijnen et al. 1, 1987). As experiências foram conduzidas de acordo com técnicas !usuais conhecidas dos investigadores desta especialidade. As pro teínas PRP e Q tinham já anteriormente sido identificadas como quitinases acídieas extracelulares, e anticorpos contra ambas as proteínas apresentaram reaeçao erusada com duas quitinases básicas também presentes no tabaco (Legranci et al., 1987)· Inserções de clones dos grupos D e F foram subclonadas em vectores Ml3 e a sequência das inserções foi determinada pelo método de Sanger et ai», (1977). Um clone do grupo F, no&eadamento o PROB3, parecia conter uma inserção de 412 pares de bases, onde ocorra um pa drão de leitura aberto, codificando para 109 ácidos aroinados de onde a sequência parece ser idêntica a sequência C-terminal de uma quitinase básica de tabaco (Hooft van Huijsduijnen et al., 1987). A sequência de ácidos aminados desta quitinase foi determinada a partir da sequência de nucleõtidos de ma clone de ADlíc, nomeadamente pCHN50 (Shinshi et al» , 1987). O grupo F, incluindo O clone PK0B3, corresponde em consequência a uma ou mais quitina ses básicas intracelulares de tabaco. O grupo D contêm um clone, nomeadamente o PROB 30, com uma inserção de 404 pares de bases, em que ocorre um qua idro de leitura aberto, que codifica para 87 ácidos arainados (Hoo ft van Huijsduijnen et al., 1987). A hoaologia entre as sequên-bias de ácidos aminados deduzidas das sequências de nucleõtidos jdas inserções de PROB3 e PROB30 aparenta ser de 65%, enquanto as próprias sequências de nucleõtidos apresentaram uma homologia de apenas 56%. Daqui concluiu-se que PP.OB30 corresponde a uma quiti' aase que está relacionada com, mas não ê idêntica ã quitinase in - 29 -

~~ tracelular. Apos terem sido"estabelecidas sequências de ácidos aminados parciais para as proteínas PE P e Q, concluiu-se que PR0B3Q corresponde a proteína PR P, uma quitinase extracelular de tabaco· 4«1 Construção de clones de ADlâc que codificam para uma guitina se extracelular completa

Para obter clones de ADNc contendo a sequência ie codificação completa para as quitinases, o clone PROB30 foi usado como uma sonda para a selecção de clones de um banco de ADNc de Petunia hybrida» O ADNe de dupla cadeia foi sintetizado conforme descrito acima, tratado com EcoRl-metilase, provido com adaptadores de EcoRI, ligados aos braços do vector lambda gtll e transfectados para E. coll Y1090 absolutamente de acordo com o método descrito no manual de instruções pertencente a "sistema de clonagem de ADNc-larobda gtll" (Amersham International plc, 1936). Em seguida, o banco recem-construido foi sondado cora a técnica de hibridação de placa de Benton e Davis (1977), no qual o clone de ADIíc de quitinase acidica previamente descrito serviu de sonda· Deste modo, foram obtidos cinco fagos recorabinantes com sequências homologas a PRGB30. O ADR de fago recoiribinante foi isolado e em seguida as inserções foram retiradas por corte com EcoRI e subclonadas num plasmídeo pUC, obtendo-se como resultado os clones Dl, D2, 05, D6 e DG. Apõs serem subclonadas em secções em fagos M13, as sequências de nucleõtidos das inserções originais foram determinadas completa ou parcialmente· ma Figura 1, são apresentadas a sequência do clone Dl e uma sequência de ácidos aminados deduzida. Os primeiros e os últimos 7 nucleõtidos têm origem nos adaptadores de EcoRI que foram usados para a construção do banco. A sequência de oito resíduos A no fim da in serção, imediatamente antes do local de reconhecimento EcoRI representa o restante da cauda de poli (A) do ARKm original e por conseguinte confirma a orientação da inserção previamente atri-;buida pelo quadro de leitura aberta de grande dimensão e a homc logia em relação â sequência de ácidos aminados deduzida das ou-. tras quitinases (ver acima). A inserção do clone D5 aparenta ser * mais longa em 10 nucleõtidos na sua exfcreroidade 5* do que no ca- 30

so de Dlj a parte restante da cauda de poli(ã) foi, porem, tal como com a inserção de Q6, encontrada 25 aucleôtidos iaais cedo na sequência. Tanto quanto se pôde seguir o curso, as sequências das inserções de D-3, D2 e Ώ6 aparentaram ser idênticas âs de 01 e D5. Ά iiomoiogia entre a sequência de ácidos amina-dos determinada do clone 01 de Petiínla e do clone PR0B3G de taba co ê aproximadamente de SOS. 0 PR0B3Q ê um clone de IdMe parcial que corresponde â proteína PR P, um quiiinase extracelular. imã lises de plantas transgenicas têm provado que a quitinase ccdifi cada em Dl ê extracelularmente localizada, pelo menos no tabaco. Por conseguinte, 01 contêm a sequência completa de aucleêtidos que codifica para um quitinase extracelular. A fim de elonar o MMo correspondente a quitinase extracelular num fragmento BaiaHX, realisaram-se as seguintes experiências.

Dois dos oligonuoleôtidos foram sintetizados, nomeadamente o 5’31 e o S^MTTAGS&TCC GTCGACGGATCCA-3 * e estes foram hibridados um com o outro, obtendo-se como resultado um fragmento de ADH de dupla cadeia com uma extremidade compatível com o local de reconhecimento HindSII e uma extremidade compatível com o local de reconhecimento EcoRI. Para além disso, o fragmento contêm locais de reconhecimento para BamIII, Hindi e mais uma vez BamHI. Este fragmento é clonado em pUC19, aberto com EcoRI e HindIII, recuperando-se deste modo o local de reconhecimento HindIII mas não o local de reconhecimento EcoRI. O novo plasuídeo foi chamado pUCl9+, Apôs as extremd, dades da inserção de EcoRI do clone Dl terem sido preenchidas com polimerase de Klenow de acordo com técnicas usuais, o fragmento foi clonado para o local Hindi de pUCl94-. 4.2 Construção de um clone de ASHo ciue codifica para uma quiti-Inase intracelular completa

I

Por busca de um novo banco de Samsun 3JH (que foi construído da mesma maneira que o banco de Petunia acima descrito) com a inserção de PR023 obteve-se ura fago recoabinante A inserção deste fago foi subclonada num plasmídeo sob a forma de um fragmento EcoRI, obtendo-se como resultado um clone Fl. - 31

Por clarificaçao da estrutura primaria verificou-se que a secjuên cia de nucleótidos da inserção de Fl era idêntica ao clone pCM 50, gue foi caracterizado por Shinshi e colaboradores (198?)*

Visto que a inserção de pC®!50 foi earacterisada como una sequên cia correspondente â quitinase intracelular do tabaco, concluiu--se que a inserção de Fl também corresponde a uma quitinase intracelular· A inserção de pCHITSO não contem a sequência de codificação completa e esta en consequência incompleta. Embora a inserção de Fl seja 30 nucleéticlos raais longa na extremidade 5* do que o pCHNSO, a sequência de codificação da quitinase contida em Fl estã também incompleta.

Para obter um fragmento com uma sequência que codifica para uma quitinase completa, foram percorridas as seguintes etapas de clonagenu A inserção fie Fl foi clonafia sob a forma de um fragmento EcoRI para o pIC19II (Marsh et al., 1984) de tal modo que a extremidade 3* da inserção se juntou justamente no local BamHX do poliadaptador. Deste modo obteve-se como re sultado o plasmídeo pIC19/Fl.

Foram sintetizados dois oligonucleõtidos (5*-GATCCAACATGAGGCTGTGCA- 3 * e 51 -AA2TTGCACAGCCECA*G^G-3 *) que formam um fragmento apés hibridação raa com o outro. Este fragmento ê clonado numa reacção de ligação de três pontos num plasmídeo pUC aberto com BamEl-Pstx, juntamente com o fragmento EcoRl-PstI, com a extremidade 5* do quadro de leitura aberta na inserção ds PIC19/F1. Esta clonagem teve ccmo resultado o plasmídeo pUC/E*Fl. A sequência dos oligonuclectidos foi escolhida de tal noão que o fragmento codificava para cinco ácidos ensinados, e também de tal modo que no fragmento BamHI-PstX subsequenteraente obtido, o local de reconhecimento EcoRI foi eliminado © os tripletos para os cinco ácidos aminaclos referidos estavam em fase com o quadro de leitura aberta em Fl. Apés digestão de pIC19H/Fl com HindIXI e (parcialmente) com Psfcl, o fragmento HindIII/PstI foi clonado com a parte 3* da inserção para um vector intermediário ao qual faltava um local de reconhecimento EcoRI. O local fie EcoRI na ex tremidade da inserção foi substituído por preenchimento e ligação retrõgada, técnicas conhecidas dos investigadores nesta especialidade. Apés a eliminação do local de reconhecimento EcoRI, o fragmento Hindlll-Pstl foi clonado para pUC/5*Fl. O plasmídeo 32

assim obtido contém num fragmento BamHI um ADííc com uma sequência de codificação completa para uma quitinase intracelular de tabaco. Na figura 2 apresenta-se a sequência deste fragmento BamHI com a sequência de ãciâos aminados deduzida. A sequência dos nu-cleõtidos 2 a 22 tem origem no fragmento sintético, enquanto que os nucleÕtidos 23 a 27 formam a parte restante do local de reconhecimento EcoRI. O local de reconhecimento PstI (5*-CTGCAG-3 *) encontra-se na posição 129 a 134. Os últimos 21 nucleÕtidos desta sequência representam sucessivamente um local de reconheeimen to EcoRI preenchido que tem origem numa molécula do adaptador de EcoRI usada para a construção do banco de ÃDKc, um local de reco nhecixnento Smal e um de BamHI, ambos com origem no poliadaptador de pIC19H. 4.3 Construção de um gene que codifica para uma quitinase intra celular, modificado de forma a obter um direccionamento da proteína para o espaço apoplãstico.

Para que a construção de um gene que codifica para uma quitinase intracelular pudesse sar direccionada para o apoplasto, a sequência do gene da quitinase intracelular conforme ê mostrada na Figura 2 foi modificada. O G na posição 961 foi mudado para um T, daqui se criando um codão de paragem* om segun do codão de paragem foi introduzido pela substituição do resíduo T na posição 968 por um A. A mudança do resíduo T na posição 975 para um C teve como resultado a criação de um local Sall. Estas modificações foram introduzidas através cio uso de uma técnica de reacção de cadeia de polimerase (PCR) com sobreposição, conhecida dos peritos na matéria. Em seguida, toda a sequência foi veri ficada para a possível introdução de mutações como resultado da técnica de PCR* BXSMPBO 5 5.0 Clonagem de genes que codific gluca nases estracslu- lares e intracelulares

Efectuou-se uma busca no banco de ABiíc do taba co lambda gtll, anteriormente descrito, para detectar fagos re-combinantes que expressassem PR-2, PR-N e sequências relaciona- - 33 -

das, com anti-soro obtido a partia: de coelhos que tinham sido ±-munizados corá proteínas RR 2 e 15 de tabaco* & técnica usada foi baseada em métodos descritos por liuynh et al*, (1035) e pode pre sumir-se que ê conhecida dos investigadores da especialidade* L· inserção de um fago recombinante identificado por este método foi usada como uma sonda para efectuaxr uma nova busca no banco de ADNc, mas desta vez usando a técnica de hibridação de placa de Banton e Davis (1977) * Usando este método, identificaram-se 30 fagos recombinantes. ks inserções no íiXM destes fagos foram abertas com EcoRl e subclonadas num plasmldeo pUC. Com base nos vários padrões de restrição, dividiram-se os clones deste modo obtidos em vários grupos. Depois da dosagem em vectores M13, % terminaram-se as sequências nucleotídicas de vãrios dos clones de cada grupo e deduziram-se as sequências de ácidos aminados dos peptídeos codificados por aquelas* Estas análises, em combinação com a comparação das sequências assim obtidas ccia sequências obtidas anteriormente, indicam que para pelo menos 5 grupos de clones, cada ura codifica para uma mica/3-1,3-glucanase. Por experiências de hibridação cora SRN total de tabaco, eu que m dos ÂDNcs da glucanase foi usado como sonda, \rerif icou-se que ©s tes ARliins da glucanase foram também sintetizados a seguir a indu ção com salicilato ou a seguir a infecçH© com TMl7 (lamelink et al., 19S9). 5*1 Isolamento de genes que codificam para/^-l.S-glucanases e:z-tracelulares

Usando um dos clones de ílDlíc acima descritos, efectuou-se uma busca num banco de ÃDH do núcleo de tabaco Sam- sun M parcialmente cortado com SsuS&l (Comelissen et al», 1937) para fagos recombinantes com genes que codificam para giucana-ses. Obtiveram-se vários fagos recombinantes a partir dos quais se caracterizaram mais compleiamsnte quatro, a saber gll, g!3, giá e gl9 (PR-:,). Por análise d© mancha de Southern obtiveram-se mapas de restrição que mostram que cada m dos quatro clones con tinha um gene distinto* bpos subclonagem em sucessivos plasmíde-os pUC e vectores M13, efectuaraít-se análises de sequencinçãc eia gI3 e gI9. Λ sequência do gene no cisne gl9, em conjunto com a sequência de ácidos aminados deduzida desta são apresentados na 34 -

figura 3. Por comparação verifiea-e® que esfca sequência cie ácidos aminados e idêntica ã da fi -1 s 3-glucannse oxtracelular do ta baco PR36, cuja sequência cl© ácidos aminados foi parcialmente clarificada (Van den Bulcke et al«, 1989) com a compreensão de que o 210 ãeldo aminaclo na extremidade C~terminal, um resíduo de treonina, não parece estar presente em PP36. 0 gene aqui descrito ê a primeira sequência de ADK isolada e caraoterizada que codifica para uma β-1,3-glucanase extraeelular. Z fim de olonar o gene mm», vector de expressão,, efectuaram-se os tratamentos seguintes. Usando a técnica de PCP. conhecida dos investigadores da especialidade, introduziu-se um local de BamllX antes cio gene e um local de reconhecimento Hindiz:: foi introduzido depois do gene. Sim seguida a sequência ê analisa da para verificar a possível introdução de mutações como resulta do da técnica de PCR. Apês ligação do gene sob a forma de um fragmento BamHI-HIndIII no vector de e-jprsssio pMOG183 (ver em 6) e a seguir a linearização por corte com BamHI e Elndlll , ob-tem-se uma unidade de expressão num fragmento SstI-HindIII com o terminador de transcrição do prõprio gene da gincanas©. 5.2 Isolamento de genes que codificam mra glucanases intraceíu lares

Usa-se um clone que corresponde a uma glucana-se intracelular (Memelinfc et al., 1989) como sonda para efectuar uma busca no banco genõmico acima descrito. Embora se tenha obti do um grande numero de fagos recombinantes com inserções únicas, verificou-se que apõs analise de restrição apenas 2 genes interessam. 0 ADH de um fago, gGLBSO, foi caracterizado mais completamente por analise de mancha de Southern, subclonagem e por cia rificação da estrutura primária das inserções cios subclones relevantes, o que foi efectuado usando técnicas conhecidas dos investigadores da especialidade. Ha figura 4 apresenta-se a estrutura primária do gene obtido juntameate com a sequência de ácidos aminados deduzida. Por comparação verifica-se que esta seque ncia de ácidos aminados ê extremamente homologa da sequência de uma /3-1,3-glucanase básica intracelular do tabaco conforme deduzida das sequências de vários clones de ADHc que apresentam sobreposições por Shinshi e colaboradores (1988). Se bem que os - 35 -

I ADllcc correspondes poosivslmsnte us ao outro càm ma rolacao forte, são no entanto genes diferentes. Pelo wossob mu dos elcnes de ADN contes una inserção çrue tora uma sequência idêntica a tansa parte do gene aqui descrito. A fim de clonar o gene num vector de expressão levaram-se a efeito as seguintes fases. Sieanáo a técnica de Σ?€Π, conhecida dos investigadores da especialidade, intrcdus-se um local de reconhecimento de BamEI antes do gene e introdus-se um local de reconhecimento de SstZ depois do gene. Em seguida cbsor va-se a sequência para verificação de possível introdução d© natações como resultado da técnica d© Pcn. A seguir a ligação de gene sob a forma de um fragmento BsmEl-gstZ no vector de ©pressão pílOGIBS (ver Exemplo 6), após linearização do vector por digestão com BamEZ e SstI, obtem-se una uniciade cie expressão num fragmento Xbal-Estl cora o terminador de transcrição cio próprio gene da glucanase. de PCR, introduz-se un local cie reconhecimento BamKX antes dc ge ne. En seguida a sequência é observada para verificar a possível introdução de mutações corno resultado da técnica de PCR. Em seguida clonou-se o fragmento BamEZ-Efcal que contêm o gene da glu-canase no plasmídeo pIC19E (Marsh et al.p 1984} após linearização do plasmídeo por digestão com BamEZ © Sal. Após linearização do vector de expressão pMGGISS (ver em β) por digestão com BamEl s hindi II, ligou-se o gene neste vector sob a foram cl® um fragmento BamKI-KindXXl, ciando como resultado usa unidade de expressão de glucanase num fragmento Sstl-HindXXX com o tsrminador d® transcrição do próprio gene da glucanase. 5.3 Construção de um gene cjue codifica para uma glucanase ir,tra celular, modificado de modo a obter um dirscoionamenfco da protol na para o apoplasto

Para a construção d© um gene que codifica para uma glucanase intracelular que se pretende díreccionar para o a-poplasto, fizeram-se modificações na sequência do gene da gluca-nase intracelular descrito em 5.2. Para ecfes fim alterou-se a . sequência GTCTCTGGSGG (nucleõtidos 1883 a 1893 na Figura 4) para

Esta mcdifiea-

sequência TG&TATCGTIPA usando a técnica de PCR - 36 -

ção tem como resultado a introdução ú& oois eoúSes ue paragem com um local òe reconhecimento SeoRV entre eles. íis sequências foram observadas para verificação da possível introdução cie r-uta ções coroo resultado da técnica de itíi, IXiePiíU ti C.Q Construção cie veatores da expressão £. expressa© constitutiva elevada de genes depende, entre outros fastores, do promotor dos genes considerados. A fim da catisfaser estas condições, construiu-se o vecstor de expressão pKGGlQl, qus se representa na figura 5. Para este fim, clona-se o bloco integrado cie expressão de pHOICL (Baulcora-be et al., 1936) ea pUClO sob a forna cie ura fragmento BcoSU-Hind III. Esto bloco integrado sontêia o promotor 35S do vírus ão mosaico -da couve-flor (CaMV) num fragmento cia restrição EciEI-Bag III e o tGnvdiialor de transcrição cia síntese de nopalina (nos) num fragmento dçoPJ^linâlII. 0 fragmento promotor s constituiclo pela sequência que começa, com o resíduo -SO0 e prolonga-se ate o resíduo +1 inclusive do genoma do CaMV, sendo a posição 4-1 o local de inicio da transcrição ÇGuiXiey et al., 1932). Ά partir da literatura sabe-se que a duplicação da sequência entre -343 e -90 aumenta a aotividade do promotor de 35S do GaMV (Kay et al,, 1937). A fim de obter usa fragmento promotor com uma sequência intensificadora, como ê designada, dupla, levarem-se a cabo as seguintes fases de clonagem usando técnicas conhecidas dos invés tigadorss desta especialidade. Em primeiro lugar suprimiu-se a sequência a montante do local de reconhecimento Hcol na posição -512 o alterou-ss o próprio local cie reconhecimento Hcol para wa local de reconhecimento EcoP,I. Para este fim, abriu-se por corte o bloco integrado ds expressão es pOGXS com Hcol, preencheram-se as extremidades assim obtidas com polímeras® de Klenow e ligou--se um adaptador EcoEI nas ©xfremidades. Abriu-se por corte σ plasiaídeo obtido com IcoRI, de onde resultou a supressão do fra<£ mento SeoRI, e prsenehsraa-ss as extremidade usando polimerase de Klenow. En seguida, o fragmento promotor Accl-EcoRV (posições -388 a -90) com as extremidades preenchidas foi clonado no plas-mídeo linear, creando deste modo um aovo local EcoRI por ligação - 37 -

-GCl do fragmento bcoRI preenchido com o local de preenchido. 0 novo plasmídeo obtiao, phOGltl, contei o promotor 333 do Gam com sequências iatensificsdoras duplas ama bloco ia· tegrauo de expressão que se situa ainda num fragmento EcoRI-hind III*

Frepararem-se vários derivados a partir d© puQ G181. Clonau-se um adaptador (5 '-iy^SG&GCrC-â8) no local de reco' nhecimento EcoBX, d© tal modo que o local ScoBI não foi reccnj-tituido e foi introdusido xm local de reconhecimento sstx» 0 plasmídeo resultante pMOG183 (figura d) contem agora o blocc integrado ue expressão de um fragmento SstI-HiadXIZ. Bo mesmo modo o plasmídeo pmQSlíá4 foi desenvolvido a partir de pi-JGwl31 (figura 7) por substituição do local t&adXZX por ua local de racoaíieci-mento SsfcX* & substituição do local BcoRl eia pMOGICd por um local Kbal deu origem ao plasmídeo plfiõGXaS (figura 8). ESSmPLO 1

Vectores binários II fia de iafcrodusir os genes da quifcinase quimérica e dei y®«l, 3-glucaaase a© gencea do tabaco por maio de agro bactsriuir. tumaSaclens, usaram-se os vectores binários pMOG23 (figura 9) a p2IOG22 (figura 10). G veotor pMQS23 e ura derivado do vector BI319 (Eavaa, 19-34) * S. partir deste último veefcor, foram feitas as seguintes alterações, cu® não são essenciais para a presente invenção, asando técnicas conhecidas dos investigadores da especialidade. shl primeiro lugar, trocsim-se entre si as posições dc borco esquerdo (BE) e cio bordo direito (BD) em relação ao gene II -M fcsfotransfera.se cie asomicina (gene da ΕΡΤΙΪ}. Em seguida fus-se rodar a orientação do gene da ΕΠΡΤΧΧ de tal modo qus a transcriçião do gene ©correse na direeça© do BE* Por fim substituiu-se c pcliadaptador BXSJ19 por um poliaclaptador com os seguintes locais de reconhecimento ãe ©nsimas de restriçãos Eco RI, Kpnl, bamEI, Xbal, Saci, Xhol e HinalII. 0 veefcor PKOG22 $ usi derivado de pMQG23 ©m que o gene da HPfll foi substituído por mt c?©a® <2© resistência a hi-* gromicina* 0 gane usado codifica para usta fosfotransferase d.e hi 1 gromicina (EPT) de Eschsriàhia coli e e retirado do plasmídeo - 33 -

PLG9Ô (Vau ά&ε. Elsen ©b al.g 19C5) « Este plasmífisc e ua derivado dc pLGSC) (Grits Gt ai»g 19C3) e contem xm local fie z&cGSheclr&n-to DcuiKI que se prolonga desde 19 pexes de beses entes fio oodao de início da tradução ate 20 pares cie bases apoe o codão fie para ger.t do gene. Usando cntagenese dirigida a um local, uma técnica de recombinação de &DH usual eonliscifia fies investigadores fia especialidade, o ecfião 2S?G quatro nueleõ&icos antes fio codão fia início da tradução & sufcstituido por m codão ÃEâ.. Do mesmo mcfio «* *“ o local dc rsconheoisentc EcoSS na região fie ccâificsçao fio gone IiPí ê alterado para 5*G&&£SC 31. Εκ seguidas o fragmento BamEX, apos preenchimento fie ©ribas as extreoifiafies Béinlil usando poline-rase de Klenou (Maniatis et alag 1202) ® clcnafio no Iceal fie re-conheciiuento BaulIX fio blceo intsgrafi© fie pressão fie pSOKI {hm lcombe et ai», 1986) spõc asbas as esrtreaidades d© EcasHI terem sido preoncLifias. Deste nodo obteve-se um unidade de expressão cora a sequência fie codificação EPS entra o promotor 35S fio Cais? e o terminafior fie tra-iscrição nos.»

Clonagem de genes quiméricos e?a vectore® binários O SlDIíc que codifica para a quitinase extraee-lular (descrito em £.1), ο ΔΒΙΤα fia quitinase intracelular {descrito cra 4.2) e o iKDHc da quitinase intracelular modificada (des crito ora 4.3) são clonados sob a foriaa de fragmentos BazaHl em pMOGl-Sl. Ssleccionasarse clones usando analise por enzimas de res trição que possuam sequências de codificação na orientação csrfa depois do promotor. Em seguida clonarasi-se os blocos integrados de expressão isolados sob a forma de fragmentos gcoRI-HindxxI no vector binãrio pMOG23, apõs linearização deste plasmídeo com Eco RI e FinõIII. Os plasmídeos resultantes são designados por pM06 196, pK0G198 e pMOG189, respectivamente. Além disso, o bloco integrado de expressão com o gene que codifica para a quitinase in tracelular modificada de forma a direccionar a proteína para o apoplasto é também clcnafio em pMGG22, dando origem ao vector PMOG269. \ O fragmento Sstl-EindlXI com a unidade de ex- 1 pressão para a glucanase intracelular modificada de forma a di- - 39 - cçç CSXKsrr.- ! reccionar a proteína rara o epoplasto (descrito e® 5.3} a clona-do em pMCS23 , dando ©rigssi ao sector pl33S512. 0 ADHc cais codifica para a guitínase exfcrace-lular é clonado sob a fosnaa ele wr fragmento Ba®EI em pMOG184 e o ADN que codifica para a emitinase iatracsldar sob a forma de vira fragmento BamHI em pMQGX£3«. A seguir às duns operações de clona-gem, seleccionas-s© os elones ussnd© analise por enzimas de restrição de modo a colocar as ssgnsncias ds codificação na orienta ção correcta apõs o promotor« Pm segnicla? isoiarararse os dois blocos integrados sob a. foroa ôs fragmentos BcoRI-Ssfel e Sstl-HindlII f respectivamonto, © donaraEa*s© num ponto de ligação tri pio em pMOG23f após linasrisacão deste plasmídeo com ScoEI e HindlII. 0 plasmídeo obtido, pí-!0G2QQ (figura 11), contem agora os dois genos u?. cmitinase ao plassídeo binário acoplado fisicamente ao gene ca ΠΡΤΙΙ. 0 fragmento Sstl-HânclIlX com a unidade de erpre ssão para a glucanss© ortracslnlar e o fragmento SfoaX-SstX oom a unidade de expressão antes da gincanas-a intracelular são clona-dos numa reacção de ligação em três pontos no vector binário pMG 22, após linearização deste plasmídeo cora SábaX e HindiXI. O pias íiídeo binário obtido, pI-!OG212 (figura 12} contêm agora ambos os genes da glucanaso acoplados fisicamente ao gene da resistência da higromieina.

Plantas transgênicas

Para a transformação do tabaco utiiizam-se discos foliares (Horseh et al«, 1985) originários de plantas cul tivadas axenicamente. A cultura foi levada a efeito cora estirpes bacterianas derivadas da estirpe Agrobacterina tumefaciens LBA 4404 (Hoekema et al., 1983) em que o veetor binãrio foi cruzado por meio da mobilização com o auxílio ão plasmídeo pKK2Q13 (Ditta et al., 1980). As estirpes de Agrobacterium assim obtidas foram mantidas sob pressão selectiva (20 mg/L de rifampicina, 1G0 mg/l ãe kanamicina) e forara cultivadas tal qual para co-eultura. A • formação de rebentos transgênicos foi estabelecida em meios com . 100 mg/1 ãe kanamicina nos casos em que se usaram derivados do — 60 —

vector binário © om meioe coei 25 «g/1 fie Ligromicina ss se usaram darivadoo da gl0S22. &e plantas transgeaioas obtidas a partir Cios rebentos foram analisadas para verificar a esspres-são aos genes iiiti*vK2u2Íaos, usando a técnica coahscida ccmo auã-lise de mancha de Western· L· técnica fia analise fie mancha de i?es' tem ê conhecida dos investigadores fia especialidade· Sm alguns casos vomaran-se discos foliares de plantas trasisgé&ieas a fia ae inserir outros genes adicionais· Praticou-se um eo-cultura de discos foliares resistentes a Kanaaicina com estirpes de fiqro bacterium que continham derivados fie pI13G22 a uma ço-cultera fie discos foliares resistentes a higroíaieina com estirpes d© eme continham derivados d© pliOâ23· SelGeeionarae-se ao plantas capa-z&s do expressão constitutiva d© todos os gsnes introfiusidos e obtiveran-se sementes apõs terem sido fertilisafias por auto-poli niração* Usaram-ee sementes FI destas plantas transgenicas para uma análise mais pormeaorisada· C&tiverem^se plantas trsnsgeaieas de tabaco transformadas cora p&QGX&G, p23OG10G, ££203139 ou p£2GG512 e tranc-forruafias duplament© coh piíôGiSS t ρΐϊ&02ύ§, pISQGSll + p£80G23S ou pMGG2Q0 + pidOe212,

Lireccionamento fia çultlnase Intracelular -rara o apoplasto S, fim fie avaliar a pessiMlifiafis fie fiireccie-nar a cuitinase intracelular para o espaço apoplãstico, levou-se α ofeite a seguinte ©speriencia. ♦fransforiaaram-s© plantas fie tabaco Saasun is? com o vector pifufil93 a fira fie provocar a ©pressão constitutiva ao gene fia quitinase extraceluiar fia petíinia (linha vegetal 1); com piuòdlSí» a fim fia provocar a expressão constitutiva do gene ua quitinase intracelular do tabaco (linha 2)i coa phC8139 a fim de provocar a expressão constitutiva do gene da quitinase intracelular modificado (linha 3) © com pKCS196 fi pKGG239 a fia fie provocar a expressão constitutiva fio g©si© cia quitinase extrace-. luiar © ao gene da quitinase intracelular modificado para obter um direcoionameato para o espaço apoplãstioo. hs linhas fia plsa- - 41 - tas tranegeniGss foram eeloceionadas com. respeito ®. ©levr.cia expressão co caca gere qnteõrico (alcsnrori-s® &te 0,5$ cia frac-ção de proteína solúvel total). & partir de cada 1¾¾ £-,ε çuatro linhas seleccionadas preparou-se o fluida exi.raeeluxar {pxoco&i· mento cie isolamento, vers Pnrenfc e Asselir? 19M) e extractc® proteicos totais de folha (F_atsfmnnn et &!<».? 1987) ® ensaiaram-a® estes para determinação cia natividade antifungioa sobre o fungo

Fusarium solani. Betecton-se ectividade cie- quitinase no fluido extracelular <FS) cias linhas vegetais 1, 3 s í, e no extrnctc proteico total (ET) ®s& teias as linhas vegetais (1 a 4}» í!a de* terminação cia activida.de ©ntiflingiea aclisionsrem-se 100 pl és FE flas linhas 1, 3 s í fiiluiu-se a fim ©hfcsr m conteúdo es» ao-tiviclade cie cuitinas© cie aprexímadamsnte 2009 cpm (ver Exemplo 2). As diluições de FE da linha 2 s dc tabaco és comparação ueo transgenico eram as mesmas que para a linha 1» Os loo μΐ cio ET diluído cias quatro linhas transgsnicas continham uma activi-daé© de quitinase ds aproximafiSEsnfce 2000 ops. b diluição do ST c:a. planta ãe comparação ©rei igual â da 1-inha. vegetal 1· ©s resultados do ensaio antifúngico são apresentados no Cuadro 2.

Cuadro 2. Inibição do crescimento Se Fusarium solsni por quiti-nases de plantas ôs tabaco transgsnicas

Inibição

Planta transg-Snica

Fluido extracelular

Ssfcraeéô total linha 1 (extracel.) - ~ linha 2 (intraeel.) - ~ linha 3 (intraeel.moá.) + + linha 4 (extracel. + + + intracelular mod.) não transformada - ~ sem inibição i *1· ; inibição a 5 - 42

ο ΖΏ rsci c« 3S cia linha qus ecprassa o c,ona fia quitriiasG s^traesdular cia pstffeiia, aprassntsn cmlrzsí: efeito antifungico, c©£0 ora cio esperar a partir de e^sriõncias! αο:ϊ1 as qoitl&asss (vor ISrssaplo 3). & pressnca do ao™ tiviaaue c.o quitiras® ao FE da linha 1 nostrs çpo a çuitinusa da petunia no taooc© ostã fiiraosionacia para o espaço anopllisfclco. m &3Ei qu© na ncior parte das erparisnsins não tivesse siv.o -.eeeatada qaalqusr activifiafis ds quitinase a©m_ act-tividade aatirangicia ao ãZ -ila liana 2, en alguass experiências i eiioontroa-cís aourvíXiaâs cio qiiitinass ao FZh larovavolsoate fiovifio a fuga as aantro daa células da qaitinnsG intracelular (relativa monto soors-} srrprosca.. 2"o 33 da liana 2 varificou-sa ua forte ei.oii.-w aaaii eaja.jo e daato o ZO ©so*© © lie? da Ilidia 3P crtie eapreo” sa o gene da quitinasa iatraoelular diresoioaaâo para o apoplno-to iiiocariCv.-:lo# r.pres^tsia um forte efeito crntifangico, Este fac-to prova que a ç«ua.fciaaaa intracelular direocionacla da linha 3 possux aiit\ia aouivi^ala ontifãigioc: 0 d-parenteiiente a supreesSo (de parte) do ainai G^terniaal que s usai!© para dirscc&onar para 03 vacados nao sfecta fis siodo significativo a aaSividad© anti— fúngica da quitinas-a intracelular. EZEIfi?LO 11

Efeito sinergístiao da gincanas© na acitlvlfiafie antifúncrica da quitlnase

SransSormarasi-s® plantas de tabaco Sasasun Zd corfi o vector pZOS512 a fia <1® provocar a expressão constitutiva do gene da quitlnase intracelular modificada (linha 1)j cosi pio G512 + pZlOG2B9 a fim de provocar a espressao constitutiva do gene da glucanase intracelular modificado (linha 2) e ©os pMGGldS a fim de provocar a expressão constitutiva do gene da quitinase intracelular modificado (linha 3; ver exemplo 19). As linhas vegetais foram seleeeionadas para identificação das eme possuiam altos níveis fie expressão de cada gene quimérico. A partir de ca da uma das linhas selsccionadas preparou-(F2) (Parent e Asselin, 1984) e extractos proteicos totais (ET) 9 de folha (Kaufmann et a!.* 1987). Prepararam-se diluições inici-• ais de FE e de ET cias linhas 2 e 3 atê mm actividade de quiti- 43 -

2) o Ls diluincGG ês dn lisha 3o E: nnse αα 2500 aro (ver ssr-snplo iniciais do FE o do ciu linha 2. eram iguais seguida, figcrcir-s© diluieebs er.: sêris das cliluiçcbs iniaifiis e experínentarRiS-nc octac port. detcsraiiici^c- cia sativid&Se nzstifã:^* giea. lião co encontrou qualquer difercncu de ©atividade 0ntifúngica entre a serio de dlluigcos da FE © cie 3ϋ?» Para eãJki disse ? a actividade r;.c.is ©lavada cia uotÍvidac-3 entiffbigica foi ©reentra ca nos extractos (diluidos) da linha 2« Jlparenteivysnte a glucana-se intracelular dirc-Geionada para o apspl&et© hen ir:. efeito cír nergístiee rolrre a aotiviclac-G ouhiffegico da qultinc.®© intraoelu lar cdreceicnada para c apoplcsto» EEÕI3EO 12

Analise de plantas t.ransgenicas eme tem maa expressão combinada de uma guitinase e gincanas® intracelular não modificada e de uma quitlnase e glncanase exfcra.eelnlar 0 Pliytopiitora nicofciaaae var. nicotianae (Pm) é um fungo que pertence à família dos Gomycetes. Ê tua agente pa-togênico da rais do tabaco, para alem cie outras plantas. A infec cão desta planta £ac coe que as folhas murchem e/ou causa o apodrecimento áa base do caule» Por fia a planta do tabaco acaba por morrer como consequência cia infecção. L· fim cie avaliar a resistência ao fungo de plantas transgõnicas que expressam os genes não modificados que codificam para as ensiiaas IsicIrolítioBs vegetais* pode efeoftuar-s© r. seguinte experiência. Inoculam-s© com taaa suspensão em agua. cie 2x10a zoõsporos de Pm des plantas transgênicas que expressam constitutivamente. as duas çmitinases não modificadas e os dois genes não modificados de P -l,3-glucanase (pmog 200 cie quitinaes n.reod; pmogg212* de gluc n.sod), des plantas de comparação (fcran cos) transformadas com o vector vazio e cios plantas não transge-nicas. Pipeta-se a suspensão para a base do caule no solo no vaso em que a planta foi cultivada ® em seguida rega-se coe ãgua.

No períocio seguinte as plantas são observadas para doteeção do desenvolvimento de sintomas da doença. Apôs dois a três dias as \ plantas de comparação e as plantas não traasgênicas mostram os 2 primeiros sintomas da doença; apôs 3 semanas, aproximadamente 17 — // «

cac 20 plantes apcssenteEi cintc*r..ac? βΐ^.-.α. wcao *_c«.-casi

Das plantas taretegSniofie çce sspsesceQ eoí-SUi^eXL^a^nus os ge-nus cias duns quitinaese s ôn β -ItS-gUs®831®**1 c^~n^ poucas Fintas estão liçr6Írr.E0i:ts osx&ãd&c q?o£ - rtó^ueLo íTiHr.a eiip^ricneid pr©pararasifi“£- discor foliaror cc-ei um £inr.sfcso cl© apresa 1 χ„ a i*«iax das folhas -5e plemt&c troisgsskieas ΰε&εζ^ ^4Α’&2££0 oc^utita tiva das duas rritia: asse £ £as crias glcsacascís# &£ pintas es coitiparação (fcrasess) tr^xsglhlcao c da L~~wwa£ v-'^ tex.-s.icc· i-ac transgãnlaas» Et scgaica piçstac-sc 11 Λ;Λ w<y ‘'^ »^ερ~3εώ© w zoospcrcs cia I?~~ src Sgu®. (5C»0C gccspoccc.-' “^-í &αΧα (a pcix^ inferior c) cs clicccs s ον seguida gcícsc^b-s c cibu^-aj estéril e cei^rx-ee incubar ã tciiponstun^ <5λα4.'»μ«β· jr^uem -se tris eonjan&os -de ©ince âisacs s- cs-5· a e^jr· risncia pede ser ©festuada varias vssss vO-z ° ***&**·» i©i3alcc«-u estãvel. »p5s cerca cb ux dia cdcsssTa-S-ss cs ^^siEog saxaa.3 :~2 início ca infoccãc nas íisssa do ccxeatajao* ^-•-'S amuo cias estes estão conplk^anto cclcaisatoo 03 21*»· das plantas trais genicas capases dc erpressar as quitinas©^ e as g^dcai-ases ι·..^~ trara sintomas la doança imos graves* 3122310 uapQls de eaneo dias l?ol'3:a ©feetuas-s© onsaios ccai discos foliares exactamente conforuo descrito taabsai esc- esporos do fungo Sna^a-tephorus oaoULieris (anasorfo de Malgootonra ...soí asai Hului) t us: í^s— eidoEdcwte. li concentração de iaocralo usada pode ser de SGôG a 10000 basiuiosporos por h1 de ãgua» Ipoc das clias os discos ano observados. Vcrifioa-s© crae os discos cias plantas aso trsnsçjtmi" cas a das* plantão transgãnioas de sos^aração estão todos infaota dos, ençuanto cus os discos das plantas trsnsgêaicas que ©spres-sam os geiiws G& onitinass cui^lrica © da y^-1» 3-glueaiia.se estio muito menos afeotados.

Do mesmo noã.or a sesÃsibili&act© das plantas transgenicaa e das plantas do comparação pede ser determinada para o fungo Ditem cri a alternata g 1¾¾ as-jonisete» Ssto fungo cau »a a s,ferrugGS;i de tabaco, m é^eriêsieiao poesia ser efectuadas do íiíOlío oescrito por Spzrr qe 2373* à concentração do inoculo pouo ser àe 5000 a 10000 conídeos por r.l, 2lpos 1Ô dias, o desen-volviiaento da 55ferrugem'3 no material foliai inoculado s avaliado de acordo com o critério sugerido por Spurr (1973), O material - 45 -

fciie.r· :;.Πο trcncjcíõhic© & cte comparação apresenta necroses de 11-c. tirar ct ©rfiVQS* enquanto çue o material foliar que tem ui...a *->j;prer-sãc constitutiva cios dois genes da qultinase e cios uont goaee 5a /9 *-l,?/^ltKian8S© são apresenta sintomas da doença ou a« presente sinfcor.no apenas «salto menos Intensos (lesões amarelas ligeiras). &3 cis <32p?sriências são ereetuadas oanforue Ges criis, verifisn-sa qu© a enpresslo constitutiva de uaa quitiuasa extraealuler _s d© uma fi-lg 3-çlucanase esctracelular e de uma %ai-tinasc l::/rrac3lnl“r s de uma ^-l,3vefluaasase intracelular propor ciona u::.a ro.sistêrcAa contra infecçoes fúngicas ou pelo menos provoca tira suscetibilidade ©u sensibilidade reduzida a estas infec^csr. ‘fedas as publicações e pedidos de patentes mea cionac..r>o rs presente scmõria descritiva constituem indicações cio nível do ocr.hecir.ontcs cios especialistas na matéria a que se dirige a i-rcc-urt© invesçõò· sodas as publicações e pedidos de patentes sãc Cpxln*. com© reproduzidas na presente memória por referência cor.c cg cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica ti indivicliinXmante dado como reproduzido por re-forência* 83 bem que a nresente invenção tenha sido -las-crita er.i algum porosnor por meio de ilustrações e de ejceaiplõs cor. a filia lidado de dasesa e de compreensão, é obvio que ê possível praticar a!çrav.as variações e modificações mantendo-se no âtbito das 2; oivircl icações ss* aaeso.

CESGSXTO DE mcmomMISMDB h estirpe de Igcãeriçãla qqIí, DH5 d 8 que ecs-têm o plasmídeo pMOG23 {CBS 102*90) e a estirpe d© ISssherichia coli DH5 d, que contêm o plasmídeo (CBS 101.90) foras de positadas em 29 de Janeiro de 19S0 ao Ccsntr&al Bursau voor Sehi-mmelcuitures (CBS), Baarn, Países Baixos, G genõtipo cia estirpe Kscherichia ooli DliSoCes 5* , ead&is àedai7 (sy-E nyl·), swo3âC, thi-1, lambda , recAl, gyr^yQ, rei&l „ $£0dia©2 Kl5. A estirpe oe Aç^robaoteriusa tusafaciens x?'Sf.c404 que ê uma boa estirpe recaptora para todos os vectores binários - 46 -

de transformação de plantas, tisfea sido sstsriôjsasnfcs depositar» ãa em 24 de Fevereiro de 1983 e anoantra-ss disooníval através do Centraal Bureau voor Ssfeimmslefâlfc^rss (CBS) * Baaxn, Paísss Baixos, sob o número CBS 191.33·

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Σ ν7 Ζ Η 3 I C .11 3 Ίϋ 8 i/rcoasso para a preparação aa usa planta quo ct^re.»«£*·ϋ»jr uC:..a rayarsiaao ws ;usnrpuieos.G genevicsi tis rôsceri^-u piaiiua que iiia !-ioa orrgeH. sli as qu-Si^iiau paras que por regeuoror· (jiciu jjOuo uar origea ei rereri&ci pisnus;* «raa soore^eEkpressão ree-ci*” uiva ,„e ΐ—ί gana 'kiS passaíiSÊS inuraoa._ca.c-L' sli paro η»η*ο3 cm ·_.. u·· ruuíi uociuoo / uca.'sc‘úarr?JâxiG par* se ríccrc~.o&rr iio genGitici or .>su vurice pOALnuoiaouiciGs ÁraoOâiLjmaíítiesá '.fis provosaLi a ròrericae «ο** ore^oXpróSúH tO · i r.:c 3GCr rr/?t:ú\'?.naCo pr:? a < porlrrte. CoviCo a ' referia;: eiàCiraeõ aoerciD ::: "iãinaea intraoslaXa : :-r. roCifieaçHo cio c-o: irtraGoInlero a rsiT?inCienoa© 1 oa^ cor CirigiCa para o r- nss Geãificci ηεί"ίΐ a >.a

Processo de aeomo acu a reivindicação 2 oa~ racterizaáo por o gene que codifica para a referida quitinase intracelular ser modificado por criação Ce xm coclão cie parager. na região de codificação na ei:tr®Biâafe S2 do gene. irTGCSáiss© Cie aoorcie ggi: s. r«rvrnciiL<3ciçao .c glo ractorl<úu.u.o por a crlaçao og ocoao cio pamgesi ser o resu^ua-ao ca su^-lcc; .ao tiS encre. o e cu aordos aiaircmos Cecerrrií?.ars. - 5a -

Processo para n preparação de una planta çtio apret,a.,taf coi:o reoiiltacl© de nanipulaoão gerstioa da referida plauta cu *a up& planta tyas Xlie deu origs·:: ca Ce çpalques’ parte qii·,; por regeneração çoãâ dar ©riges5. ã referida planta, une. sc-bre expressão relativa Ce ar gene cie quiiimsG e & ® gene de β·Ί,Ζ -glucaaase era paio nonos «na dos seus tecidos* caracteriaado por 53 -

Claims (1)

1. Processo de acordo cma oualçmer cias reivindicações 1 a 4 caracteri zado por a planta obtida apresentar adieic naliuente urna sobre esspressãc relativa de pelo menos um gene cue codifica para nma ensima seleccionada cio grupo constituído por çruitinases extraceluiares, ^ -i, 3-glueanases intracelulares e β-1,3-çl«canases extraceluiares. ii = soordo ogí„ a reivindicação C vl.-* XitOv*~-xx^£.^.o £ or a ΐ ontíaa. apresentar adioionalHentís somt -íri-i rtí-oao roxa*civa oq p-sag gene d© çultinasG g.-c ti.tiOc*- Oi.i -, ^—v' '·»;£» P l/ώ gltuaiLase xiitracÈiwisiiT· - 8a - ^-pcí-g c.s ?-£φ£.*ί>> ;·?:: r Esivii:íiG"ção 6 £jf;~ rr.cfc'· νί.--·τ ir prr c. pirata o!: ticia ?.pv-:-sr=:'t-rK· adiciorrJaisat® raa ser ri:-d::-, rr-iic.·.· ^I^oiívb ν.Φ ia. c·©^ &$ aaitinas;® es&rsoelul&re ."'aas d® β “I ΰ c 3 —— v..r. gv:·- ^ «i;& Cr,; :-xtra._;alaIaa0 Processo cs -00¾¾ eom çualguer das reivindicações ti a '> oar-iGttorrssido t.or a β íí-glucsenase intracelular ser dirigida para o axoplast© devido a um.a edificação do gos:© cus codifica para a referida ^ —1r3~gXueanas@ Intracelular. - IO51 ~ ás cioosí&o cc·:.. a reiviaaioanão £ gc- íj ractori isatt^ P^2·’ 0 y'-ne enie ecci2.£iea para a referida β *“lr3-glnoa-nasc i^tr^sxvxfc;r ^sr iiccilrieacc# por oriação cie mk ccdãc de paragem na rcgrao ootirrrçsaaao açi essfcre^iiade 33 ào gene. “ 11a - vx<X;esstj» t;3 ficosílo C-Tti a reivindicação 10 ca— racfceriuado c-s-xaçao Ci° cc-S&o de pssragGsa ssr o roeultadc da supressão e-írare ώ © 25 auidos gaaiaados C-teminais da/0-1^3 " 5C -

   - 12a - ?:·.:ν^χ,ζιχ> f® nccíx® &*r· itiaicticr cias reivir.ci*3 crvõcc 1 r. 11 ciri^tcrinrilo por ©o c-er®;t irtroclusiclcs ©staror sol· regulação !s l^g^-gi* Cr®?/ 3Γ-5. ,. r- G «= Xá “ Processo para a preparação cie usa goliaucleéti-do recorfcinanfce cu© contêm informarão ger^Sfcica para usa sobre* -expressão relativa cie ura gene <ãe quitinase intracelular carac-terisaclo por eg incorporar mm polinndaotido essencial^ente a) vez. promotor çue seja funcional esi plantas, h) um gene ©ue codifica para quitinss® intracelular sob a regulação ao referido promotor? © c) un teraLn&doe? ligado ©perativsraeat® ao referido gene, e cl) un gene codifica para ua traço seleccionãvel ou eme pode servir de parca, ligado operativaseate a sequências de regulação para uma expressão adequada» - 14a « irGoesso õe acortio tso& a roivinaicaçao ii ®·; ~ raeterisa-o por o gen® çue codifica par® a quitinaco intrcealr* lar ser modificação oe modo a criar ua eo~&o ©& paragem ae rrr,cu-çáo na região ã© codificação aa esi-àrena-t.a^© 3® do gane» - I£a - "rcossso d© acordo Gca a reivindicação M ca-ract-^risalo por o ccâão a© aaragsa ser resultado cia supressão cie ovlr© 3 ® 13 tcâlos ,iaactos! e-tasíainsis da qrdtino.e<r< intracoi·-- lar. - :isa - Procssso de acordo sob qualquer das rerviíxii-cações 13 a 13 caracterisado por na prepe^sção oo polinodeoti— o.o roço.íbiiiÇi-tG co incorporar adicioasi^®^® a jjiioruaçao s^a» tioa nara a sobro-Ospraeeão relativa â© Pôl° aeíie>s ura gene qaa codifica para tsaa ensima seleeeionada c.o grupo constituido por guitinases extracslulares, -1,3-glu0aaaíái3S i-at^acelulares © » E3 = 'JL f uj " 5—7..

   ‘-LT2 cl rafsrida ΓΛΣ1" r.J33 scuiaroj, a© ead ..5::1 -,ΖΖ-',.ι - „3 ., ©—'737; 3333737.7.2.1531773,3 λ) ::...t .rrrejlrr; 3--3 3 313 plantas, -C3 :* rdcrid ;;c:í._ gs- didiêiai: varr. ;i *?. tas safsriãas oasiir.ns vl ^íí%j'...O 1*'‘3UwLTj!»‘> -3 053-3.:-I'3'3vJ/l? 3 j} 5.5 t22n:;.i:5rdbr cg arotivri:” ente ar referido gsns» - 17' Processo de assoreio cr-v a reivindicação 16 para η vrspsr·?/?*:? ís 535 polinBcleôtido recicsdisiante que contem adicio nalir.cnte a informação gsnstiea parei a sosr©”expr©ssao relativeL-ireato de irr. gens gno codifica para 111¾ ouitinase esÉfcraesluIar, er>raot5rissdo por f) ser uia gene que oosdfica para uma quitina-33 c^tracelular. α "3 r«®. >=j irrccese© ee acordo ov... a reivindicação 1* -ara a prevciraçao úe um golinucleotido resom.dnsrite cue contlm apiedo nalíúciite a informação genética para a £'0.:.re-ôsspressão relativa ue Uu gere roo cc0.1 roa para uma “jl , ρ„ΐΐθ£ιΐ5όώΌ rivor acv3Í'c.Ji:.r , caractericarc por £) ser um geme que edifica para ira giucanase intracelular· ;© « K,- « w- .-diV. ·»··«. Srccsscc· is acr-rdr oro a reivindicação 16 gora 5 5 rlinssisciiis rc-occiinnnte çj.3 contem r.iicio ^ο1....-..5ΐ-ι a ic-i..;r...tgã.o çéáiStier. pitei 5: f.djL^^seeÊGO relativa v.e ei., griís ^rr codifica ivo oo/^dd-gdussiisse esítraoslrdar* oar^ctoricac.o ror ser mi gene íss eedifion para 133^/0-1,3-lucrxo c::fri.eeliiirir«. .....a “ c: r ^ Processo para a preparação áe ua polimiclôõti-clo rc.ccvMnunts çps ©ontem informação genética para uma soire-•osç reccão- relativa ie ar* gane cie β “1?£<= gincanas® intracelular rarr.et-iiiLrr.r-0 prr se incorporar nusa polinueXeõtid© essencial- ...ri.tr a) u:r prsnstrr ene seja funcional en plantas, b) 37. gene 73© codifica para β -1, 3-gÍuoanass intracelular s^ír a 55 -

   “ιττνα— < j a. llaacc· cpora^iv ar vando co aassrido roncj © <..) a..,. t;-«.í.·... vadidiar. para ϊχ: traço r-clsocior^©! cm cais pode í ©vil· do íai:·^ ligado sv tamisar voâs © saraênoias ds ro? cr «©paC ti,áX L_.li SigmaSSaC cX-SCTJiTX.Cle - dG - Processo de acordo cosi cpalçper das reivinãi~ cp^õoc 16 , 1?. on 20 'caracterisado por o çene eme codifica par© r f3 ‘\/í -/dnaanan© intraeslnlar ser Hoáirâoado d© sedo a criar as, cn^~r ,;n p?^r?r· .£s traição TiEi regia© àe codificação na @&das“ ri ©rês 3' do rene* t., ^ í;^OC;^3í£>SG GG c^GGlf^dG i:i GGGVXlig.GddòawaJD _.=~dJ 3r\iCtOlrii.LiâiV-.G j*>íyZ^ ^ CGCíSlG pcá^ci-J^L.- L' 'a-ϊΐ Uώ·:'J^.> ua entre J a ia áci-aos asilados o^terninais da /^“Ij-^glxccndn..-. i* ver aj^.i. alar. - 23a ~ -V. .C.C ·- ·?- tlCO- Processo d5 acor-ão cac. gaalgaer das r©ivindi~ 2r ©rr/oàrrisada ;:sr ar, ;:;© ara-·©© cie roliimicl·-?.·-i-rds sx incorporar adioioraiasnás a informação g©?«©“ rd:rr~3,:gr3ssao relativa c.s vaio estios '<ra gen© ana a araβ“li 3~ο1χοε:ι&&3 artraadLuiarf rae cíXiton js~ VZdéL. .._____«ά,;. ra-. ,.;as codifica sara aaa P~*1BS^glaaaaase -ia:·; ~. asaviação de raf-ride- grosoter e c ligado cgsraóivarriôo ao rsfsrido gana0 .-. ,a .:v> Processo para a preparagao ãà na. vec-fcor de elar.rgaa. eu aa trarsforrarão earaoãeriaaao $o% sa incorpora:; ca poli:-\~.cú·*.6 iic:c raaaaaiaaate preparado do acordo coa* otiialgíser aas raàri:ar jacaoc lã a 33. = 05a ~ Processe da acordo αον·. a reivindicação 21 ;·.«»

   ” 24' ” — Processo 4~ aoordo ύέλ ?. reiviadicaoãb 2i· gg-racterissado por o vector obtido ser o plasmídeo pMO<3212 ot» ur?. seu derivado que. seja ess@aoial*?ont3 idêntico» Processo is acordo cji. a reivindicação 24 aa^ w> raccariaaao par o voctor obtido ser o piaso&ioo pl-í0e249 ou ta u.SiTiV-li.i.O .1 λ ίύ'Βυϋίι£ί3,Ώχ123ΐΤώά ÍC^ncIvE·^ » '_· "j.-j, ; j. :-, *-, ,';C;.?'·^" ' ' ’ - .niGil ;^2LCr Λ-GG 2·' ·=*

   Procsr.s© para a prG:>nrr.çao fe sstirres fie caraatsrisafio por se ir-trrciuoir uk qu vários pias r.í-iera obticoí? de seorâo gog çualciucr ias reivindioaaces Sr. a 2-‘< ou se trensforrar ccei mi ou varies cics referidos plasmíclar.-s» » -;,-,a Processo para a prepararão fe uma planta ro-sisctíi.a·-: a fungos aarsaterisad© por s& irtrcdusir no gssona ca rcrorr^c planta ou eas plantas que liie deram origem ou em çueie gaer parte aa planta a partir cia çual a pirata pode ser regenera ua uiu poiinueloociio roconbinanto obtteo ds acorac com çu&içusr ene ruj.Va.i-ca.Gagoa£, 12 a 23. Lb requerentes reivindicam a prioridade cg pe~ o.iuC v.g i í:.t2n-s uciandês apresentado cr.: 30 ce Janeiro cio 131 ,,3 sob O ,ÍV .;'G-Jblià0 ^isioa7 3:j de Janeiro csJLS&l <5; ΜΕΙΠΓΕ SEKIzL 3L EESIPEΙΖΓ.ΛΒ3 GO EEEIELE

   *G _

   Ρ, 13 S U Γ·ί ο ‘PP^aríí'?^ W"*. Λ ΡΡ^ΡΑΞΙ?'·f!^0 FF5 "PL^TShH ΐ "ν' r;rjg 2PDjSErl ÍBESISTl jLLu‘; ·*' A FUIíGOS A FIEMOS SI! PL&iit ..r <_ ... .;· v ' .1 • .-· *.·.> ' α α vj_C*«ú X-- · - í«í -ejí «. - *4.» :f:u a^:;3.^j:i-I;n:. ;?:-.·; γγγ-:γϊ :=·*ΐ: -' -."-ο ^ ·-- •’Ί JGSSO pesa í .:, j;.:> -y—... ^-; .1.1 „·' . ‘1": :τ ·.. '»,|*.ri:^·*» ^ ^-‘TT-P. 1"1Θ cl r&3?h OGCjjí ·. lai’ ÔL.C .-flV-iVci uG "cl -' 53^2 11:.3 3-3Ί23 -is-aiíos f c™:;. vrkricg j ylim:yIsoP i. I X I X

   MKFWGSV LAL SF G AATTCCTAAT AATCGCGAAAAAMT GAAGTT CT GGGGATC AGT ATTGGCATT GT CTTTT 10 30 - 50 VVFLFLTGTL A^Q NVGSIVTS GTTGTGTTCTTGTTCCTAACAGGAACACTGGCACAAMTGTTGGTTCTATTGTGACAAGC 70 90 110 DLFDQMLKNRNDARCFAVRF GACTTATTTGACCAGATGCTTAAAAATAGGAATGATGCTAGATGTTTTGCCGTACGGTTT 130 150 170 YTYDAFIAAANSFPGFG-TTG TACACTTACGATGCCTTCATAGCTGCTGCCAATTCGTTCCCAGGTTTTGGAACTACTGGT 190 210 230 DDTARKKEIAAFFGQTSHET GATGATACTGCCCGTAAGAAAGAAATTGCTGCCTTTTTCGGTCAAACTTCTCATGAAACT 250 270 290 TGGTLSPDGPYAGGYCFLRE ACTGGTGGTACCTTAAGTCCAGATGGTCCATATGCAGGAGGATATTGCTTTCTTAGAGAA 310 330 350 GNQMGNGYYGRGPIQLTGQS GGCAATCAAATGGGAAACGGATACTATGGCAGAGGACCCATCCAATTGACAGGCCAATCT 370 390 410 NYDLAGKAIEQDLVNNPDLV AACTATGACTTAGCTGGGAAAGCTATTGAACAAGACTTAGTTAACAACCCTGATTTAGTA 430 450 470 ATDATVSFKTAIWFWMTPQG GC AAC AGAT GCTACT GT AT CATT CAAAAC AGC AATATGGTTCTGGATGACACCAC AGGGT 490 510 530 NKPS CHDVITGRWTPSAADT AACAAGCCATCTTGCCACGACGTTATCACCGGCCGATGGACGCCATCAGCCGCCGATACA 550 570 590 SANRVPGYGVITNI INGGIE TCGGCGAATCGTGTACCAGGTTATGGTGTCATTACTAACATAATTAATGGTGGAATTGAA 610 630 650 CGKGQNARVEDRIGYYRRNV TGTGGCAAAGGT CAGAATGCACGAGTGGAAGATCGAATT GGATATTACAGGAGGAATGTA 670 690 710 SIMNVAPGDNLDCYNQRNFA AGT AT AAT GAACGT GGCCCCTGGAGAC AATTTGGATT GTT ACAACCAAAGGAACTTT GCC 730 750 770 E V * G AAGT CTAGGCTGGT CAC ATT AT GAGT GCAAAT GTTAT GTAGT C AT GGAG AT G AC AGTAT 790 810 830 AC AACTT AT ATTT G AAT GT AAT AAAT AAGGG ATT CTCT ATGCCC ATTT AT G AT AG AGT GA 850 870 890 AAT AT ATT ATT GTTT GT CTT CTT GGAAAGAAGT AGAACCAACAGTT CCTTTAAAAAAAAGG AATT C 910 950 FIG.1