JPH08280283A - 菌類耐性植物、該菌類耐性植物の製造方法および該方法で使用する組換えポリヌクレオチド - Google Patents

菌類耐性植物、該菌類耐性植物の製造方法および該方法で使用する組換えポリヌクレオチド

Info

Publication number
JPH08280283A
JPH08280283A JP3216681A JP21668191A JPH08280283A JP H08280283 A JPH08280283 A JP H08280283A JP 3216681 A JP3216681 A JP 3216681A JP 21668191 A JP21668191 A JP 21668191A JP H08280283 A JPH08280283 A JP H08280283A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gene
chitinase
intracellular
glucanase
plant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP3216681A
Other languages
English (en)
Inventor
Bernardus J C Cornelissen
ヨハネス クレメンス コルネリセン ベルナルデュス
Leo Sjoerd Melchers
シウールド メルヘルス レオ
Elisabeth J S Meulenhoff
ヨシーヌ ソフィー ミュエレンホッフ エリザベス
Roekel Jeroen S C Van
セバスチャン シャルルズ ファン ルーケル イェルーン
Marianne Beatrix Sela-Buurlage
ベアトリックス セーラ ビュールラッヘ マリアンヌ
Alexandra Aleida Vloemans
アレイダ ヴルーマンス アレクサンドラ
Charles Peter Woloshuk
ペーター ウォロシューク シャルルス
John Ferdinand Bol
フェルディナント ボルーケル ジョン
Hubertus J M Linthorst
ヨゼフュス マリア リントルスト フーベルテュス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universiteit Leiden
Rijksuniversiteit Groningen
Mogen International NV
Original Assignee
Universiteit Leiden
Rijksuniversiteit Groningen
Mogen International NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universiteit Leiden, Rijksuniversiteit Groningen, Mogen International NV filed Critical Universiteit Leiden
Publication of JPH08280283A publication Critical patent/JPH08280283A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N65/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing material from algae, lichens, bryophyta, multi-cellular fungi or plants, or extracts thereof
    • A01N65/08—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A01N65/38—Solanaceae [Potato family], e.g. nightshade, tomato, tobacco or chilli pepper
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/244—Endo-1,3(4)-beta-glucanase (3.2.1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2442—Chitinase (3.2.1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01006—Endo-1,3(4)-beta-glucanase (3.2.1.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01014—Chitinase (3.2.1.14)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01039—Glucan endo-1,3-beta-D-glucosidase (3.2.1.39)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01058—Glucan 1,3-beta-glucosidase (3.2.1.58)

Abstract

(57)【要約】 ［目的］病原性菌類に対して優れた耐性を有する植物を
提供することを目的とする。 ［構成］植物を基本的に植物テチナーゼおよびβ−１，
３−グルカナーゼをコードする１つ以上の遺伝子を含む
１つ以上のポリヌクレオチドで遺伝子的にトランスホー
ムする。細胞内型の該加水分解酵素が好ましく特に該酵
素をコードする遺伝子を修正することにより植物のアポ
プラスト間隙を指向するものがより好ましい。少なくと
も１つのキチナーゼをコードする遺伝子および１つのβ
−１，３−グルカナーゼをコードする遺伝子を相対的に
過剰発現する植物が特に好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】
【産業上の利用分野】本発明は組換えＤＮＡ技術、特に
植物の遺伝子操作の分野に属し、遺伝子操作による菌類
耐性植物の製造方法および遺伝子操作植物および植物細
胞それ自体（遺伝子操作植物の一部分および無性生殖ま
たは有性生殖による子孫を含む）および該遺伝子操作に
使用可能な組換えポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮ
Ａ）に関する。
【技術的背景】ほとんどの農業および園芸作物は常に菌
類による攻撃の危険性にさらされている。菌類病による
重大な損失から作物を守るため作物およびしばしばその
作物を生育させる土壌が大量の殺菌剤で定期的に処理さ
れる。これらの殺菌剤は作物栽培のコストおよびより重
要である環境および栽培者に大きな負担をかける。さら
にこの処理は重労働である。それゆえ好ましくはヒトの
手間のかからない、菌類の攻撃から植物を守るより低コ
ストでより安全な方法が必要とされている。 （誘導耐性）植物には一般に病原に対していくつかのタ
イプの耐性：非宿主耐性、“水平”または部分的耐性お
よび“垂直”耐性がある。これらの耐性のいずれも分子
レベルではよく理解されていない。これら構成的に発現
されている耐性に加えて特定の病原感染またはいくつか
の生物的および非生物的因子により誘導され得る耐性メ
カニズムがある。この誘導耐性は非常に範囲が広くかつ
菌類を含む種々の病原に対するものである。さらにこの
ことについて以下に説明する。過敏性タバコカルチバ
（ニコチアナタバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａ
ｃｕｍ）ＣＶサムサン（Ｓａｍｓｕｎ）ＮＮ）の低い葉
にタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）を接種すると接種
した葉に局所的な損傷が形成される。接種しなかった葉
は３日後のＴＭＶによる一次感染に対して耐性となる。
この耐性は少なくとも２０日間持続し、その至適耐性は
７日後に見られる。またこの二次感染に対する耐性がタ
バコネクロシスウイルス、タバコリングスポットウイル
スなどの他のウイルス（ロス（Ｒｏｓｓ）およびボザー
ス（Ｂｏｚａｒｔｈ），１９６０；ロス（Ｒｏｓｓ）、
１９６１）およびシェラビオプシスバシコラ（Ｔｈｉｅ
ｌａｖｉｏｐｓｉｓｂａｓｉｃｏｌａ）（ヘクト（Ｈｅ
ｃｈｔ）およびベートマン（Ｂａｔｅｍａｎ），１９６
４）、フィトフトラニコチアナ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏ
ｒａ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）およびペロノスポラタバ
シナ（Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｔａｂａｃｉｎａ）
（マッキンタイヤ（ＭｃＩｎｔｙｒｅ）およびドズ（Ｄ
ｏｄｄｓ），１９７９，マッキンタイヤ（ＭｃＩｎｔｙ
ｒｅ）等、１９８１）などの菌類に対するものでもあ
る。誘導耐性の現象は多くの別の宿主およびいくつかの
別の病原についても研究されてきている（クック（Ｋｕ
ｃ），１９８２；セクエイラ（Ｓｅｑｕｅｉｒ），１９
８３）。これらの研究から出現してきた一般的描像は過
敏性応答は第１感染を起こした病原のタイプに関係なく
広範囲な病原に対する耐性を伴うということであった。 （誘導耐性に付随して発現されるたんぱく質）誘導耐性
とともに感染以前には存在しなかった多くのたんぱく質
が合成される。これらのたんぱく質は大きく分けて３つ
のカテゴリーに分類できる。 １）抗菌効果を示すフィトアレクシン類などの二次代謝
合成における重要酵素および病原侵入後植物細胞壁の強
化に使用されるリグニンの誘導体。これらの酵素または
それらのメッセンジャーＲＮＡは主に感染部位の直ぐ近
傍の細胞に存在する（エリストン（Ｅｌｌｓｔｏｎ）
等、１９７６；クレーマー（Ｃｒａｍｅｒ）等、１９８
５；ベル（Ｂｅｌｌ）等、１９８６）。 ２）細胞壁に取り込まれ、おそらくそこでリグニンのよ
うな芳香族化合物が結合するマトリクスとして機能する
ハイドロキシプロリンリッチグリコプロテイン（ＨＲＧ
Ｐ）またはイクステンション（フライ（Ｆｒｙ），１９
８６）。ＨＲＧＰは植物の細胞壁の重要な構造化合物で
あり、それらは菌類、細菌およびウイルスとの ｍＲＮＡは実質的量が感染部位周辺とともにその植物の
非感染部分にも存在する（ショワルター（Ｓｈｏｗａｌ
ｔｅｒ）等、１９８５）。 ３）３番目の誘導遺伝子群は細胞の内側およびアポプラ
ズマ間隙の両方に蓄積するたんぱく質をコードする。こ
れらのたんぱく質にはキチナーゼおよびグルカナーゼな
どの加水分解酵素がある。類壊性感染後これらの酵素は
しばしば非感染部分を含む植物全体に感染以前よりも高
い濃度で存在する。これらの酵素の合成の増加は微生物
性誘導物、通常菌類細胞壁調製物によっても誘導される
（ダービル（Ｄａｒｖｉｌｌ）およびアルバージェイム
（Ａｌｂｅｒｓｈｅｉｍ），１９８４；トッパン（Ｔｏ
ｐｐａｎ） 、１９８４；チャペル（Ｃｈａｐｐｅｌ）等、１９８
４；コンブリンク（Ｋｏｍｂｒｉｎｋ）およびホールブ
ロック（Ｈｏｈｌｂｒｏｃｋ），１９８６；ヘドリック
（Ｈｅｄｒｉｃｋ）等、１９８８）。 （菌類細胞壁の構造）菌類の細胞壁は種々の炭水化物ポ
リマーからなっていることが知られている。オーミセテ
ス（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）は別にしてほとんどの菌類は
かなりの量のキチンを含んでいる。キチンはβ−１，４
結合で結合するＮ−アセチルグルコサミド分子のポリマ
ーであり、菌類細胞壁においてはβ−１，３およびβ−
１，６結合をもつグルコースのポリマーであるβ−１，
３／β−１，６グルカンと結合していることが多い。ジ
ゴミセテス（Ｚｙｇｏｍｙｃｅｔｅｓ）群の菌類はβ−
１，３およびβ−１，６結合を有するグルカンを含ま
ず、一方ほとんどのオーミセテスではグルカンはセルロ
ースと会合している（ウェセルス（Ｗｅｓｓｅｌｓ）お
よびシエツマ（Ｓｉｅｔｓｍａ），１９８１）。 （単離した菌類細胞壁のインビトロにおける分解）単離
した菌類の細胞壁は植物抽出物（ヒルボーン（Ｈｉｌｂ
ｏｒｎ）およびファー（Ｆａｒｒ），１９５９；ワーゴ
（Ｗａｒｇｏ），１９７５；ヤング（Ｙｏｕｎｇ）およ
びペグ（Ｐｅｇｇ），１９８２）および微生物由来のキ
チナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼ調製物（スク
ジンス（Ｓｋｕｊｉｎｓ）等、１９６５；ハンスリー
（Ｈｕｎｓｌｅｙ）およびバーネット（Ｂｕｒｎｅｔ
ｔ），１９７０；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）等、１９７
４）によってインビトロで分解し得ることが以前から知
られていた。最近トマト由来の精製エンド−β−１，３
−グルカナーゼと菌類由来のエクソ−β−１，３−グル
カナーゼと組合せて菌類ベルチシリウムアルボアトラム
（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｌｂｏ−ａｔｒｕｍ）
から単離した細胞壁を加水分解し得ることが示された。
これらの調製物は各々単独ではこの活性を示さない（ヤ
ング（Ｙｏｕｎｇ）およびペグ（Ｐｅｇｇ），１９８
２）。また大豆由来の精製β−１，３−グルカナーゼ
（キーン（Ｋｅｅｎ）およびヨシカワ（Ｙｏｓｈｉｋａ
ｗａ），１９８３）は豆由来の精製キチナーゼと同様
（ボラー（Ｂｏｌｌｅｒ）等、１９８３）、インビトロ
で菌類から単離した細胞壁を分解し得ることが示され
た。フサリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎ
ｉ）から単離した細胞壁についてえんどう豆のキチナー
ゼおよびβ−１，３−グルカナーゼをテストするといず
れも活性があり、それらを合せると共働的に作用するこ
とが示された（マウチ（Ｍａｕｃｈ）等、１９８８
ｂ）。これらの加水分解酵素が効果的に生きている菌類
の細胞壁中のポリマー化合物を分解し得るかどうかは分
っていない。 （植物由来のキチナーゼおよびグルカナーゼによる合成
培地上の菌類生育の阻害）植物に由来するキチナーゼお
よびグルカナーゼのいくつかは合成培地上の菌類の生育
を阻害し得る。そら豆から精製したキチナーゼは寒天プ
レート検定において菌類のトリコデルマビリデ（Ｔｒｉ
ｃｈｏｄｅｒｍａ Ｖｉｒｉｄｅ）の生育を阻害し得る
（シルムバウム（Ｓｃｈｌｕｍｂａｕｍ）等、１９８
６）。各々えんどう豆のさやから精製したキチナーゼお
よびβ−１，３−グルカナーゼを合せると寒天プレート
上のいくつかの菌類の生育を阻害するが、別の菌類の生
育は阻害しない。アスコマイセートのクラドスポリウム
ククメリナム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃｕｃｕｍ
ｅｒｉｎｕｍ）はわずかに感受性を示すが、オーマイセ
ートのフィトフトラカクトラム（Ｐｈｙｔｈｏｐｈｔｈ
ｏｒａ ｃａｃｔｏｒｕｍ），パイシウムアファニデル
マタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕ
ｍ）およびパイシウムウルチナム（Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕ
ｌｔｉｎｕｍ）は非感受性である。えんどう豆のキチナ
ーゼ単独ではＴ．ビリデ（ｖｉｒｉｄｅ）の生育に影響
するがβ−１，３−グルカナーゼはフサリウム（Ｆｕｓ
ａｒｉｕｍ）ｆ．ｓｐ．ピシ（ｐｉｓｉ）の生育を阻害
する。これらの検定法における菌類生育の阻害は菌糸先
端の分解によるものであることが確められた（マウチ
（Ｍａｕｃｈ）等、１９８８ｂ）。これらの加水分解酵
素は合成培地上で生育する生きた菌類の細胞壁中の基質
に接近することは明らかである。もっとも活性をもつ植
物性加水分解酵素の少なくともいくつかは特定の菌類に
特異的であるようである。生態圏すなわち土壌または植
物の葉等における菌類に関する加水分解酵素の効果につ
いてはほとんど知られておらず、またこれらの酵素のい
くつかが菌類耐性を担っているものの候補にはあげられ
るが、全てのキチナーゼおよびグルカナーゼが生きた菌
類に対して活性を示すわけではないことも事実である。
おそらく加水分解酵素が侵入してきた菌類と接触する感
染段階および部位が非常に重要なのであろう。 （植物におけるキチナーゼおよびグルカナーゼの存在）
これまで知られてきたようにキチナーゼおよびβ−１，
３−グルカナーゼは全てではないにしろほとんどの単子
葉および双子葉両植物中に存在する。キチナーゼおよび
グルカナーゼは各々少なくとも細胞内および細胞外の２
つのクラスに分類できる。１つのクラスのキチナーゼお
よびグルカナーゼ両遺伝子は遺伝子群にコードされてい
るようである。 （植物におけるキチナーゼおよびグルカナーゼ遺伝子の
本来の発現）キチナーゼおよびグルカナーゼ遺伝子は植
物において構成的および厳密な調節的の両様式で発現し
ていることが知られている。タバコ植物の根においてキ
チナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼは構成的に合
成されている（フェリックス（Ｆｅｌｉｘ）およびメイ
ンズ（Ｍｅｉｎｓ），１９８６；シンシ（Ｓｈｉｎｓｈ
ｉ）等、１９８７；メメリンク（Ｍｅｍｅｌｉｎｋ）
等、１９８７、１９８９）。タバコ植物はフィトフソラ
パラシチカ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉ
ｔｉｃａ）ｖａｒ．ニコチアナ（ｎｉｃｏｔｉａｎａ
ｅ）（タバコの根の病原）の感染に耐性ではない。しか
し、この病原に対する耐性はＴＭＶによる接種によりタ
バコ植物に誘導し得る（マッキンタイヤ（ＭｃＩｎｔｉ
ｒｅ）およびドッズ（Ｄｏｄｄｓ），１９７９）。この
ことはキチナーゼおよびグルカナーゼ以外の、もしくは
これらに加えて別の未知因子が菌類耐性に関与している
ことを示している。一方キチナーゼもしくはグルカナー
ゼ濃度が有意に増加していないにもかかわらず菌類感染
に対して耐性を示す植物種が知られている。たとえば、
菌類のフィトフソラインフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈ
ｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）とトマトの適合的相
互作用により、キチナーゼもしくはグルカナーゼがそれ
らの葉に検出されないにもかかわらず全身的耐性（クリ
スト（Ｃｈｒｉｓｔ）およびメシンガー（Ｍｏｓｉｎｇ
ｅｒ），１９８９）、すなわち植物全体を通して感染に
対する耐性が生じる（フィッシャー（Ｆｉｓｃｈｅｒ）
等、１９８９）。加水分解酵素をコードする遺伝子の発
現と菌類耐性の間に明白な関係がないことは明らかであ
る。これらの観測に加えてキチナーゼの中には菌類耐性
との相関を直ちに示さないパターンの調節発現を示すも
のがある。たとえばキチナーゼをコードする遺伝子はと
りわけタバコの花において発展的な調節様式で発現され
ることが知られていいる（ロタン（Ｌｏｔａｎ）等、１
９８９）。グルカナーゼは大麦の種子に大量に生成する
ことが知られている（スウェグル（Ｓｗｅｇｌｅ）等、
１９８９；ウッドワード（Ｗｏｏｄｗａｒｄ）およびフ
ィンチャー（Ｆｉｎｃｈｅｒ），１９８２；ホー（Ｈｏ
ｊ）等、１９８８、１９８９）。 タバコ細胞懸濁液に
おける細胞内キチナーゼおよびグルカナーゼの合成はサ
イトキニンまたはオーキシンの添加により阻害し得る
（モーネン（Ｍｏｎｅｎ）等、１９８５；フェリックス
（Ｆｅｌｉｘ）およびメインズ（Ｍｅｉｎｓ），１９８
６；シンシ（Ｓｈｉｎｈｉ）等、１９８７；バウ（Ｂａ
ｕｗ）等、１９８７）。同じ加水分解酵素の合成は正常
なタバコ植物を無菌的に生育している生育培地にサイト
キニンを添加したときにこのホルモンにより誘導し得
る。特定の環境下では植物ホルモンエチレンもキチナー
ゼおよびグルカナーゼの合成を誘導し得る（フェリック
ス（Ｆｅｌｉｘ）およびメインズ（Ｍｅｉｎｓ），１９
８７）。土壌生育および無菌生育両方のタバコ植物の根
および下部の葉において細胞内キチナーゼおよびグルカ
ナーゼが検出され、一方上部の葉では全くか、もしくは
ほとんど検出されない（フェリックス（Ｆｅｌｉｘ）お
よびメインズ（Ｍｅｉｎｓ），１９８６；シンシ（Ｓｈ
ｉｎｓｈｉ）等、１９８７；メメリンク（Ｍｅｍｅｌｉ
ｎｋ）１９８７、１９８９）。したがって細胞内キチナ
ーゼおよびグルカナーゼの器官特異的発現もある。細胞
外キチナーゼおよびグルカナーゼをコードする遺伝子の
発現の調節はサイトキニンによってほとんど、もしくは
全く影響を受けない（メメリンク（Ｍｅｍｅｌｉｎｋ）
等、１９８７、１９８９）。タバコの花において細胞外
キチナーゼは特異的に葯、がく片および子房で発現され
る。したがって細胞外キチナーゼをコードする遺伝子に
ついても少なくとも器官特異的発現がある。 （キメラキチナーゼ遺伝子を発現するを菌類耐性植物）
菌類耐性における加水分解酵素の特性および働きに関し
ては未だ説明できていない点も多くあるが、菌類の攻撃
に対する感受性が減少した植物を提供した成功例がいく
つか報告されている。米国特許第４，９４０，８４０で
は細菌性キチナーゼ遺伝子（すなわち、セラチアマルセ
センス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）由
来のｃｈｉＡ遺伝子）を発現するタバコ植物は菌類のア
ルテルナリアロンジペス（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｌｏ
ｎｇｉｐｅｓ）に対する感受性が低いことが示された。
国際特許出願ＷＯ９００７００１では強力なウイルスプ
ロモーターまたは植物プロモーターの調節下、そら豆の
キチナーゼを発現する植物種タバコおよびカノラは試験
した２つの菌類主にボトリチスシネリア（Ｂｏｔｒｙｔ
ｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）およびリゾクトニアソラニ（Ｒ
ｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ Ｓｏｌａｎｉ）に対する感受性
が低いことが示された。しかしこれらの植物が他の菌類
に対しても同様に耐性があるかどうかは分っていない。
ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ−０２９２４３５では特定
のクラスの菌類に対する耐性が植物組織中でキチナーゼ
を発現する遺伝子の導入により与えられることが示され
た。ここでは遺伝子産物をミトコンドリア、液胞、小胞
体や他の細胞部分または細胞内（アポプラスマ）間隙に
さえも指向させる特定の場合の説明がなされている。望
ましい効果を得るためのキチナーゼのタイプやキチナー
ゼの作用の好ましい部位に関する情報はなかった。ＥＰ
−Ａ−０２７０２４８はトマト由来のポリガラクツロナ
ーゼのリーダー配列を用いることにより細菌遺伝子（大
腸菌ｏβ−グルクロニダーゼ遺伝子）が植物細胞壁を指
向するメカニズムを提唱している。とりわけキチナーゼ
およびグルカナーゼが植物細胞壁に向かい菌類の攻撃と
戦うことが提唱された。結果は示されておらず、またど
の加水分解酵素が使われているか、また細胞内植物たん
ぱく質が植物細胞の外側にどのように向かうかについて
も説明されていない。ＥＰ−Ａ−０３３２１０４ではキ
チナーゼおよびグルカナーゼをコードする遺伝子を含む
いわゆるＰＲ−遺伝子から誘導される化学的調節配列を
含む遺伝子構築物について述べている。菌類耐性植物の
結果については示していない。 （技術的背景）植物は各々少なくとも２つのクラス、細
胞内および細胞外のキチナーゼおよびβ−１，３−グル
カナーゼを含んでいる。該加水分解酵素をコードする遺
伝子の発現は構成的なものではなく、少なくとも全ての
組織で構成的ではないが発生的または組織特異的様式で
調節を受ける。しかし、これらの遺伝子の発現も頽壊性
病原による感染など特定のストレス条件下で誘導され得
る。ほとんどの場合、キチナーゼおよびβ−１，３−グ
ルカナーゼの合成の誘導は植物性病原菌類を含む広範囲
な病原に対する耐性の誘導を伴う。菌類耐性と加水分解
酵素をコードする遺伝子の間に相関があるかどうかは分
っていない。植物性病原菌類の細胞壁はグルカン類を含
んでおり、しばしば特定量のキチンを含んでいる。これ
らの炭水化物ポリマーは各々グルカナーゼおよびキチナ
ーゼの基質である。両方の加水分解酵素が観察される耐
性を担っているという仮説は魅力的である。しかし、こ
のことはこの仮説とは矛盾する多くの観察の立場から明
確なものとはなっていない。したがって加水分解酵素が
菌類耐性で重要な役割を果しているかどうか、またはそ
れらが関与しているときそれらの菌類耐性における役割
がどのように実質的なものなのかは未だ不明確のままで
ある。どのキチナーゼもが植物性病原性菌類に対する植
物の広範囲な防御を与え得るということは少なくとも疑
わしい。一般にキチナーゼおよびグルカナーゼ自身でさ
え広範囲な植物病原性菌類に対する十分な防御を与え得
るかどうかは疑わしい。（誘導）菌類耐性を獲得する複
雑な過程における加水分解酵素の役割はよく分っていな
い。しかし遺伝的修正により広範囲な植物病原性菌類に
対して植物を効果的に守る方法が必要である。
【発明の概要】本発明の目的は菌類の攻撃に対する耐性
を改良した植物を提供することである。そのために植物
のゲノムに植物由来の細胞内キチナーゼをコードする１
つ以上の遺伝子を該遺伝子と天然には結合していないプ
ロモーターのコントロール下においた少なくとも１つの
組換えＤＮＡ構築物を導入することにより植物を遺伝子
的にトランスホームする。さらに本発明は少なくとも１
つの細胞内植物キチナーゼをコードするＤＮＡ配列を含
み、該細胞内キチナーゼがアポプラスト空隙に分泌され
るよう修正した少なくとも１つの組換えＤＮＡ構築物を
発現させることにより菌類の攻撃に対する耐性が改良さ
れた植物を提供する。好ましい態様において本発明はキ
チナーゼ、好ましくは細胞内キチナーゼをコードする遺
伝子およびグルカナーゼをコードする遺伝子を適当な強
力なプロモーターのコントロール下、１つ以上の組織で
発現させることにより菌類の攻撃に対しより効果的な防
御を示す植物を提供する。さらに好ましい態様において
本発明はアポプラスト間隙を指向する植物起源の細胞内
キチナーゼをコードする遺伝子およびさらに細胞内キチ
ナーゼ、細胞外キチナーゼ、細胞内グルカナーゼ、およ
び細胞外グルカナーゼからなる群から選ばれる加水分解
酵素をコードする１つ以上の遺伝子を構成的に発現する
植物を提供する。特に好ましい態様は細胞内キチナー
ゼ、細胞外キチナーゼ、細胞内β−１，３−グルカナー
ゼおよび細胞外β−１，３−グルカナーゼをコードする
遺伝子を発現する植物である。これらのうち先に述べた
植物性加水分解酵素の細胞内型をコードする遺伝子が特
に好ましい。さらにアポプラストを指向するよう遺伝子
操作で修正した細胞内加水分解酵素をコードする遺伝子
を使用するのが好ましい。細胞内加水分解酵素のアポプ
ラスト指向を達成させるため細胞内加水分解酵素のＣ末
端をコードする遺伝子の３′末端はその遺伝子の発現の
際に各酵素の細胞内指向に関するＣ末端アミノ酸を欠失
させるように修正する。一般にそのような修正はその酵
素機能および、またはそのたんぱく質の他の関連ドメイ
ンがネガティブに影響しないかぎり、Ｃ末端の少なくと
も３個のアミノ酸または必要とされる数のアミノ酸の欠
失である。このような修正は細胞内β−１，３−グルカ
ナーゼの場合で３乃至２５個のアミノ酸、また細胞内キ
チナーゼの場合で３乃至１０個のアミノ酸の欠失が好ま
しい。４乃至８個のアミノ酸の欠失がより好ましい。さ
らに本発明の態様にはキチナーゼを細胞内間隙に指向さ
せるよう修正した植物起源の少なくとも１つの細胞内キ
チナーゼをコードする１つ以上の植物内発現可能なＤＮ
Ａ配列および望ましい場合には細胞外キチナーゼ、細胞
内グルカナーゼおよび細胞外グルカナーゼからなる群か
ら選ばれる１つ以上の加水分解酵素をコードする付加的
ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子である。好ましい態
様にはｐＭＯＧ２００のＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩフラグメ
ント上にある細胞内キチナーゼ遺伝子；ｐＭＯＧ２００
上にあるペプチュニアハイブリドーマ由来の細胞外キチ
ナーゼ遺伝子；ｐＭＯＧ２１２のＸｂａＩ−ＳｓｔＩフ
ラグメント上にある細胞内β−１，３−グルカナーゼ遺
伝子；ｐＭＯＧ２１２のＳｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラ
グメント上にある細胞外β−１，３−グルカナーゼ遺伝
子または上記遺伝子と基本的に相同的な遺伝子がある。
アポプラストを指向する上記加水分解酵素の細胞内型を
コードする遺伝子の修正版が特に好ましい。これにはｐ
ＭＯＧ１８９の修正した細胞内キチナーゼ遺伝子（また
は抗菌類活性を保持するその短縮型）およびｐＭＯＧ１
８９の細胞内キチナーゼ遺伝子と基本的に相同的な細胞
内キチナーゼ遺伝子の修正型が含まれる。また停止コド
ンがコード領域に導入され生成する細胞内β−１，３−
グルカナーゼをアポプラスト指向とするｐＭＯＧ５１２
の修正型細胞内グルカナーゼ遺伝子も好ましい。また上
記遺伝子を含むＤＮＡ配列を有するクローニング−、発
現−、およびトランスホーメーションベクターおよび該
ＤＮＡ配列を含む微生物も特許請求している。これらの
ベクターのうちプラスミドｐＭＯＧ２００およびｐＭＯ
Ｇ２１２、およびこれらの誘導体が好ましい。さらに本
発明の態様には上記発明に従うプロセスで得られる菌類
耐性植物全体、原形質体、細胞、その植物の一部（種
子、果実、葉、花など）および無性的または有性的また
はその両方で再生され得る植物のその他の部分および該
植物の子孫が含まれる。以下に示す本発明の詳細な説明
からその産業上の利用の利点および分野は容易に理解さ
れよう。
【定義】 本発明の目的のため細胞外たんぱく質は本来
の植物における適正な発現後アポプラスト間隙に局在す
るたんぱく質であることが理解される。結果的に細胞内
たんぱく質は本来の植物における適正な発現後細胞内に
局在するたんぱく質である。アポプラスト間隙とは植物
細胞壁を含む細胞外間隙と定義される。本発明の目的の
ため、たんぱく質がアポプラスト間隙の一部を形成しな
い細胞の成分に局在する場合細胞内に局在すると言われ
る。これらの成分には核、クロロプラスト、ミトコンド
リア、液胞、小胞体、他の膜オルガネラ、細胞質および
原形質膜を含む全ての膜が含まれる。遺伝子のＤＮＡ配
列の６０％以上が対応しているときは、他言しないかぎ
りそれらの遺伝子は相同的であると言う。
【詳細な説明】 菌類耐性における関与からタバコおよ
びペチュニア由来の精製細胞外キチナーゼは細胞内キチ
ナーゼと比べて有意な抗菌類効果を示さないことが分っ
た。抗菌類検定においては等しいたんぱく質量によるよ
りもむしろ精製した細胞内および細胞外キチナーゼにつ
いて等しいキチン分解活性のものを比較した。テストし
た細胞外型の抗菌類活性は実質的に検出できなかった。
それゆえトランスホーム植物などにおける細胞外キチナ
ーゼをコードするキメラ遺伝子の発現は菌類耐性を提供
するのに十分ではない。しかし、存在する別の加水分解
酵素の抗菌類効果を増加させることにより細胞外キチナ
ーゼが菌類耐性において補助的役割を果しているという
ことを全く除外することはできない。この観測は植物の
加水分解酵素をコードするキメラ遺伝子の発現に基づ
き、植物中で菌類耐性を作り出すのに重要な意味を有し
ている。基本的に局在する部位が異なるいくつかの相同
たんぱく質（特にキチナーゼおよびグルカナーゼ）のＣ
末端の比較で、細胞内たんぱく質はしばしば細胞外類似
体に比べ約３乃至２５（細胞内β−１，３−グルカナー
ゼの場合）、もしくは３乃至１０（細胞内キチナーゼの
場合）個の残基の伸長がみられることを明らかにした。
驚くべきことに細胞内タバコキチナーゼのＣ末端部分の
約６残基のアミノ酸の欠失はアポプラスト間隙へのたん
ぱく質の分泌を起こすことが分った。明らかにＣ末端の
伸長部分は“液胞指向”シグナルとして機能している。
このことは植物の液胞で天然に生ずるキチナーゼのアポ
プラスト指向を始めて説明したものであると考える。こ
の知見は液胞たんばく質（たとえば液胞内に局在するた
んぱく質）をアポプラスト間隙に向かわせるのにうまく
利用し得る。ある範囲の植物病原性菌類に対するトラン
スホーム植物の保護における加水分解酵素の作用に非常
に効果的な部位はアポプラスト間隙であると考えられて
いる。したがって、菌類耐性を改善するため植物が天然
のものにしろ、または遺伝子修正によるものにしろその
植物のアポプラスト間隙で作用するキチナーゼ（または
抗菌性ドメインまたは領域を含むその短縮型）をコード
する遺伝子を含む組換えＤＮＡ構築物でトランスホーム
する場合は都合がよい。このような植物を得るためその
植物は細胞内キチナーゼをコードする遺伝子で液胞指向
性に関するＣ末端アミノ酸を含まなくなるように修正し
（たとえばその遺伝子のコード領域に翻訳停止コドンを
導入するなど）、結果的に植物中で生成する細胞内キチ
ナーゼ（のほとんど）がアポプラスト指向性となるよう
にした遺伝子を含む組換えＤＮＡ構築物でトランスホー
ムするのが好ましい。抗菌類活性に有意な影響を与える
ことなしに細胞内加水分解酵素をアポプラスト間隙に指
向させる可能性を評価するために以下の実験を行った。
植物を基本的に以下に示す遺伝子を含むＤＮＡ構築物で
トランスホームした。 １゜ペチュニア細胞外キチナーゼをコードする遺伝子、 ２゜タバコ細胞内キチナーゼをコードする遺伝子、 ３゜細胞内キチナーゼでキチナーゼがアポプラストを指
向するよう修正したものをコードするタバコ遺伝子（指
向構築物）、または ４゜ペチュニア細胞外キチナーゼ遺伝子および修正タバ
コ細胞内キチナーゼ遺伝子（指向構築物）。 全ての遺伝子はカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプ
ロモーターのコントロール下においた。トランスホーム
した植物の各カテゴリーの中からキメラ遺伝子の良好な
発現体を選択し、葉の細胞外液（ＥＦ）および全たんぱ
く質抽出物（ＴＥ）を単離した。植物１から４までの各
フラクションの抗菌類活性をテスト菌類としてフサリウ
ムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ）を用いて
測定した。ペチュニア細胞外キチナーゼを発現する植物
１のＥＦおよびＴＥはいずれも抗菌類活性を示さなかっ
た。このことは精製した加水分解酵素を用いた実験から
も予想されていたことである。植物２のＥＦはおそらく
（相対的に過剰）発現された細胞内キチナーゼが細胞か
ら漏れたことにより抗菌類活性を示したが、一方全たん
ぱく質抽出物は強い抗菌類効果を示した。修正したアポ
プラスト指向細胞内キチナーゼ遺伝子を発現する植物３
のＥＦおよびＴＥは両方とも強い抗菌類効果を示した。
重要なことにこのことは植物３の指向性細胞内キチナー
ゼも抗菌類活性を有することを示している。したがって
予想外にもＣ−末端液胞指向シグナルの欠失はキチナー
ゼの抗菌類活性に有意な影響を与えなかった。植物が細
胞内キチナーゼおよび修正した（アポプラスト指向性）
細胞内キチナーゼを発現するならその植物は菌類の攻撃
を効率的に防ぐことができる。このように本発明は菌類
耐性を改善した植物およびこれらの植物の製造法を提供
する。本発明の１つの特徴としてタバコおよびペチュニ
アのキチナーゼの細胞内型は細胞外キチナーゼよりも好
ましいことが示された。それゆえタバコの細胞内キチナ
ーゼと基本的に相同的な細胞内キチナーゼも好ましい。
細胞内植物キチナーゼの相同性はたんばく質レベルで５
０％以上、より好ましくは６０％以上、最も好ましくは
７０％であることが望ましい。本発明の第２の特徴は細
胞内キチナーゼの強い抗菌類効果が該たんばく質のＣ末
端の修正後も維持されるという予期せぬ知見である。ト
ランスホームによる植物の菌類耐性を改善のため最も強
力な加水分解酵素、すなわち細胞内型を選択し、活性の
ある抗菌類ドメイン／領域を含むこれらの加水分解酵素
またはその短縮型を抗菌類効果に至適なアポプラスト間
隙に指向させる。以下の一連の実験ではトランスジェニ
ック植物の葉の全たんぱく質抽出物および細胞外液内の
キチナーゼおよびグルカナーゼの協同効果を研究した。
基本的に以下のものを含む組換えＤＮＡでタバコ植物を
トランスホームした。 １）Ｃ末端の修正によりアポプラストを指向するタバコ
細胞内β−１，３−グルカナーゼをコードする遺伝子、 ２）Ｃ末端の修正によりいずれもアポプラストを指向す
るタバコ細胞内キチナーゼおよびタバコ細胞β−１，３
−グルカナーゼをコードする遺伝子、再びキメラ遺伝子
の良い発現体であるトランスジェニックタバコ植物を選
び葉の細胞外液（ＥＦ）および全たんぱく質抽出物（Ｔ
Ｅ）を単離した。アポプラストを指向する細胞内β−
１，３−グルカナーゼを発現する植物１のＥＦおよびＴ
Ｅは両方共、菌類フサリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ
ｓｏｌａｎｉ）に対し弱い抗菌類効果を示した。アポ
プラスト指向性細胞内キチナーゼおよびアポプラスト指
向性細胞性β−１，３−グルカナーゼの両方を発現する
植物２のＥＦおよびＴＥは驚くほど強い抗菌類効果を示
した。この効果は先の実験の植物３（アポプラスト指向
性細胞内キチナーゼをコードする遺伝子のみを発現す
る）のＥＦおよびＴＥよりもわずかに高いものであっ
た。これらの実験から細胞内β−１，３−グルカナーゼ
のＣ末端の修正はその酵素をうまくアポプラスト指向性
とし、かつそのＣ末端修正は細胞内β−１，３−グルカ
ナーゼの抗菌類活性に著しい影響を与えないと結論し得
る。さらに、細胞内キメラキチナーゼおよび細胞内キメ
ラβ−１，３−グルカナーゼの再遺伝子の発現による抗
菌類効果は各遺伝子単独の発現による効果よりも大きい
ことが示された。このように本発明の第３の特徴はキメ
ラ植物キチナーゼ遺伝子およびキメラ植物グルカナーゼ
遺伝子を両方共ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのコントロ
ール下で発現する植物を提供することである。本発明の
好ましい態様において植物内での発現可能型の細胞内型
植物加水分解酵素をコードする１つ以上の遺伝子をトラ
ンスホームした植物が提供される。Ｃ末端の修正により
アポプラスト指向性とされた細胞内型の植物性加水分解
酵素をコードする１つ以上の遺伝子を発現する植物が特
に好ましい。細胞内キチナーゼ遺伝子および細胞内β−
１，３−グルカナーゼ遺伝子をコードする少なくとも１
個の遺伝子でトランスホームした植物がより好ましい。
もし後者の植物が加水分解酵素を修正しアポプラスト指
向型としたものを発現するなら非常に好ましい。本発明
のもう１つの好ましい態様には好ましくはアポプラスト
指向性の細胞内キチナーゼ、細胞外キチナーゼ、好まし
くはアポプラスト指向性の細胞内グルカナーゼ、および
細胞外グルカナーゼを構成的に発現する植物がある。原
理的にこれらの遺伝子の高い発現がトランスホームした
植物宿主の細胞機能をそこなわない条件で修正または未
修正の植物性加水分解酵素をコードする遺伝子の組合せ
を選択し得る。植物性加水分解酵素をコードする遺伝子
に加え、他の植物性または非植物性遺伝子（たとえば細
菌、イースト、菌類または他の生物由来のもの）も同様
に使用できる。加水分解酵素をコードする植物遺伝子は
トランスホームする植物に対し、異種でも同種でもよ
い。これまで述べてきたキチナーゼおよびβ−１，３−
グルカナーゼ遺伝子に加え、加水分解酵素をコードする
遺伝子は他の生物種からも同様に容易に単離し得ること
は容易に理解できる。さらに本発明で述べている遺伝子
は全て合成されたものでもよい。望ましい加水分解酵素
をコードする遺伝子またはｃＤＮＡはたとえばタバコ
（たとえばレグランド（Ｌｅｇｒａｎｄ）等、１９８
７；シンシ（Ｓｈｉｎｓｈｉ）等、１９８７）、トマト
（ジョーステン（Ｊｏｏｓｔｅｎ）等、１９８９）から
単離され、塩基性細胞内キチナーゼはポテトから単離さ
れ（ゲイナー（Ｇａｙｎｏｒ），１９８８、コンブリン
ク（Ｋｏｍｂｒｉｎｋ）等、１９８８）、細胞外キチナ
ーゼはキュウリから単離され（メトロークス（Ｍｅｔｒ
ａｕｘ）およびボラー（Ｂｏｌｌｅｒ），１９８６；メ
トロークス（Ｍｅｔｒａｕｘ）等、１９８６）および細
胞内キチナーゼおよびグルカナーセはそら豆から単離し
得 （Ｍａｕｃｈ）およびステヘリン（Ｓｔａｅｈｅｌｉ
ｎ），１９８９）。さらにキチナーゼおよびβ−１，３
−グルカナーゼは誘導化合物としてチトサンを用いるこ
とによりえんどう豆から単離し得る（マウチ（Ｍａｕｃ
ｈ）等、１９８４）。さらに分析することにより少なく
とも５種の加水分解酵素、すなわち２種の塩基性β−
１，３−グルカナーゼおよび３種の塩基性キチナーゼの
存在が明らかになった（マウチ（Ｍａｕｃｈ）等、１９
８８ａ）。血清学的にそら豆の細胞外キチナーゼと関係
する細胞内および細胞外キチナーゼがアリウムポラム
（Ａｌｌｉｕｍ ｐｏｒｒｕｍ）Ｌ．から単離し得る
（スパヌ（Ｓｐａｎｕ）等、１９８９）。また葉にＢＭ
Ｖ（ブロマインモザイクウイルス）を接種することによ
りとうもろこしからもエンドキチナーゼおよびグルカナ
ーゼが単離し得る（ネイサー（Ｎａｓｓｅｒ）等、１９
８８）。えんどう豆由来の細胞内エンドキチナーゼと血
清学的に関係するキチナーゼが大麦（ホルデウムブルガ
レ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）から単離し得る
（スウェグル（Ｓｗｅｇｌｅ）等、１９８９）。また他
のクラスのグルカナーゼと同様にβ−１，３−グルカナ
ーゼも大麦から単離し得る（バランス（Ｂａｌａｎｃ
ｅ）等、１９７６；ホー（Ｈｏｊ）等、１９８８、１９
８９）。少なくとも４種類のキチナーゼと５種類のβ−
１，３−グルカナーゼがオート麦から単離し得る（フィ
ンク（Ｆｉｎｋ）等、１９８８）。菌類の攻撃に対して
植物を守るための加水分解酵素を入手する生物源は単に
説明のために掲げた上記のリストに限られるものではな
いことは理解されよう。植物性キチナーゼおよびβ−
１，３−グルカナーゼをコードするｃＤＮＡは望ましい
加水分解酵素に対する抗体を用い、その加水分解酵素の
合成の誘導後植物から単離されるポリＡ＋−ＲＮＡから
なるｃＤＮＡ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニン
グでうまく得られる。うまく発現させるために遺伝子は
プロモーターと機能的に結合していなければならない。
プロモーターの選択は望まれる発現レベルおよびそのコ
ントロール下にある遺伝子の望ましい調節様式に依存す
る。このことは当業者がよく知っているところである。
植物全体で機能し、分化パターンに関してほとんど制限
をもたない強力な構的プロモーターを使用するのが好ま
しい。高レベル発現する構成的プロモーターの例にはＣ
ａＭＶ３５ｓプロモーターがある。このプロモーターは
いわゆるエンハンサー配列（マギリー（Ｍｃ．Ｇｉｌｌ
ｅｙ）等、１９８７）に隣接しているとさらに発現レベ
ルが上昇する。高レベル、光誘導性プロモーターの例と
してはリブロースビスホスフェートカルボキシラーゼス
モールサブユニット（ｒｂｃｓｓｕ）プロモーター、ク
ロロフィルａ／ｂ結合たんぱく質（Ｃａｂ）プロモータ
ーなどがある。場合によっては１つまたはいくつかの所
定の組織、たとえば根や上皮細胞など菌類の攻撃の標的
となる組織に導入したキメラ遺伝子の発現を限定するこ
とが望ましい。組織特異的プロモターの例には根特異的
パタチンクラスＩＩプロモーターがある。キメラ遺伝子
の発現は傷、乾燥、温度など外的刺激に依存することが
ある。一般に選択する遺伝子はその遺伝子とは異種のも
のである可能性もある少なくともプロモーターおよび転
写ターミネーターを含む発現カセットの中に含められ
る。このような要素をどのように結合し適正に機能させ
るか、およびこのことが特別な技術なしに測定し得るこ
とはよく知られている。場合によっては真核性（ゲノ
ム）遺伝子はイントロンを含む。天然の、もしくは遺伝
子修正で導入された後者の存在は本発明には特に関係な
い。遺伝子操作の技術は当分野で容易に入手し得る（た
とえばマニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、１９８
９）。また加水分解酵素をコードする遺伝子に加え、病
原耐性に関して余分の効果を有する他のたんぱく質をコ
ードする遺伝子を目的の植物に導入してより広い病原範
囲の効果を改善することができる。このようなたんぱく
質はたとえばレクチン、ササゲトリプシンインヒビター
（ＣｐＴＩ）、バチルスツリンジエンシス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）トキシンなどか
らなる群から適当に選ばれる。１つ以上のキメラ遺伝子
を構成的に発現し得るトランスジェニック植物を得るた
め以下のものを含む本発明の範囲内の多くの代替物が使
用可能である。 Ａ．１つの選択マーカー遺伝子に物理的に結合した多く
の修正遺伝子を含むプラスミドのＤＮＡフラグメントの
使用。 Ｂ．１つの選択マーカーをコードする遺伝子に結合した
１つ以上のキメラ遺伝子をすでに発現し得るトランスジ
ェニック植物の、別の選択マーカーと結合した１つ以上
の遺伝子構築物を含むトランスジェニック植物由来の花
粉による交雑受粉。後にこの交雑で得られた種子は２つ
のマーカーの存在に基づき選択する。選択した種子から
得た植物はさらに交雑するのに使用される。 Ｃ．各々１つ以上のキメラ遺伝子および互いに異なる選
択マーカーを有するプラスミドの種々のＤＮＡフラグメ
ントの使用。もしコトランスホーメーションの頻が高い
なら１つのみのマーカーに基づく選択で十分であるが、
そうでないなら１つ以上のマーカーに基づく選択が好ま
しい。 Ｄ．新しい別のキメラ遺伝子および選択マーカー遺伝子
によるトランスジェニック植物の連続的トランスホーメ
ーション。 Ｅ．上記戦術を組合せたもの。上述の発明に関して実際
に用いる戦術は重要ではなく、望ましい構築物、使用可
能な材料および当事者の好みなどの因子に依存して容易
に決定され得る。植物のトランスホーメーションにはい
くつかの方法が使用できる。一般にこの方法の選択は本
発明に従う遺伝子および調節要素を含むトランスホーム
用遺伝子構築物が植物に導入され、その植物のゲノムに
安定して組込まれる限り本発明にとって重要ではない。
植物とは単子葉植物または双子葉植物でその子孫または
その植物の一部、細胞またはプロトプラストおよびトラ
ンスホーメーションの後にその植物全体を再生し得るそ
の他の植物物質を意味する。説明を目的とするいくつか
の例にはカルシウム／ポリエチレングリコール法（クレ
ンス（Ｋｒｅｎｓ）等、１９８２；ネグルチウ（Ｎｅｇ
ｒｕｔｉｕ）等、１９８７）、エレクトロポレーション
（参考文献）およびマイクロインジェクション（クロス
ウェイ（Ｃｒｏｓｓｗａｙ）等、１９８６）、（コー
ト）粒子衝突（クレイン（Ｋｌｅｉｎ）等、１９８
７）、ウイルス感染などによるプロトプラストのトラン
スホーメーションがある。トランスホームした植物の選
択および、またはスクリーニングの後、そのトランスホ
ーム植物は当分野でよく知られている方法により完全な
植物に再生される。つづいてトランホームした植物につ
いて望ましい性質の有無および、または望ましい性質の
発現の度合を評価する。最初の評価には新しく導入され
た遺伝子の発現レベル、トランスホームした植物の菌類
耐性レベル、望ましい性質の遺伝的安定性、野外試験な
どが含まれる。第２にもし必要ならばトランスホームし
た植物を他の植物、たとえば商品価値の高い植物または
他の好ましい特性をすでに導入された植物、またはハイ
ブリッド種子の生成に使用された植物、または別のトラ
ンスホーメーションを行った植物と交雑し得る。植物病
原性菌類に対する耐性を改良した商業価値の高い植物、
またはその一部は野外または温室で生育させ、つづいて
動物飼料、ヒトの食料、長期保存、食料もしくは他の工
業的処理に使用される。本発明の植物またはその一部は
殺菌剤の処理の必要が減少し、したがって材料、労働の
コストおよび環境公害を減少し、またこれらの植物の産
物（たとえばフルーツ、種子など）の寿命を延ばすこと
になる。菌類の攻撃を受けた植物種またはその変異体を
本発明の１つ以上の遺伝的構築物でトランスホームし、
感染率および、またはこのような攻撃の効果を減少させ
得る。説明のために以下に示す非限定的なリストの種が
特に好ましい：カリフラワー（ブラシカオレラシ（Ｂｒ
ａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）、朝鮮あざみ（シナ
ラスコリマス（Ｃｙｎａｒａ ｓｃｏｌｙｍｕｓ）（食
用花）などの食用花：クリサンセマム（Ｃｈｒｙｓａｎ
ｔｈｅｍｕｍ），ユリバラなどの装飾花；リンゴ（たと
えばマラスドメスチカス（Ｍａｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉ
ｃｕｓ），バナナ、いちご（たとえばすぐり、リベスラ
ブラム（Ｒｉｂｅｓ ｒｕｂｒｕｍ），スイートチェリ
ー（プラナスアビウム（Ｐｒｕｎｕｓ ａｖｉｕｍ），
キュウリ（ククミスサチバス（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔ
ｉｖｕｓ），ぶどう（ビチスビニフェラ（Ｖｉｔｉｓ
ｖｉｎｉｆｅｒａ）、レモン（シトラスリモン（Ｃｉｔ
ｒｕｓ ｌｉｍｏｎ），メロン（ククミスサチバス（Ｃ
ｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）ナッツ（たとえばウォ
ールナットジャグランスレジア（Ｊｕｇｌａｎｓ ｒｅ
ｇｉａ），オレンジ、ピーチ（プラナスペルシカ（Ｐｒ
ｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ），なし（ピラコムニス（Ｐ
ｙｒａ ｃｏｍｍｕｎｉｓ），コショー（ソラナムカプ
シカムＳｏｌａｎｕｍ ｃａｐｓｉｃｕｍ），プルーン
（プルナスドメスチカ（Ｐｒｕｎｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉ
ｃａ），ストロベリー（フラガリア（Ｆｒａｇａｒｉ
ａ），タバコ（ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ），ト
マト（たとえばリコペルシコンエスクレンタム（Ｌｙｃ
ｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）などの食
用フルーツ、キャベツ（ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃ
ａ），きくぢしゃ（シコリウムエンジビア（Ｃｉｃｈｏ
ｒｅｕｍ ｅｎｄｉｖｉａ），レタス（ラクチカサチバ
（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ），ほうれん草（スピ
ナシアオレラセア（Ｓｐｉｎａｃｉａ ｏｌｅｒａｃｅ
ａｅ），にら（アリウムポラム（Ａｌｌｉｕｍ ｐｏｒ
ｒｕｍ）などの葉野菜、ビート（ベタバルガリス（Ｂｅ
ｔａ ｖｕｌｇａｌｉｓ），にんじん（ダウカスカロタ
（Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ），かぶら／かぶはぼた
ん（ブラシカラパ（Ｂｒａｓｓｉｃａｒａｐａ），ラデ
ィッシュ（ラファナスサチバス（Ｒａｐｈａｎｕｓ ｓ
ａｔｉｖｕｓ）などの食用根野菜、そら豆（ファセオラ
ス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ），えんどう豆（ピサムサチバ
ム（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ），大豆（グリシンマ
ックス（Ｇｌｙｃｉｎ ｍａｘ），小麦（トリチカムア
スチパム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ），大
麦（ホルデウムバルガレ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａ
ｒｅ），コーン（ジーマイス（Ｚｅａ ｍａｙｓ），米
（オリザ（Ｏｒｙｚａ）などの食用種子、かぶキャベ
ツ、ポテト（ソラナムツベロサム（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕ
ｂｅｒｏｓｕｍ）などの食用塊茎。
【実施例】以下、本発明を実施例を用いてより詳しく説
明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではな
い。 実施例１ （抗菌類活性の検定）菌類増殖に関する種々のたんぱく
質溶液の効果をマイクロプレート検定法で検定した。２
４穴マイクロプレートの各ウェルに２５０μｌのポテト
デキストロース寒天（ＰＤＡ）を入れた。菌類の胞子を
水に懸濁し５０μｌ当り３００〜５００個の胞子をウェ
ルに入れた。この胞子を１晩かけて発芽させる。つづい
て１００μｌのフィルター除菌（０．２２μｍフィルタ
ー）たんぱく質溶液を加えた。コントロールとしては１
０分間煮沸したたんぱく質を用いた。マイクロプレート
をパラフィルムでカバーし室温でインキュベートした。
１〜２日後ウェル中の生育菌類の菌糸体をラクトフェノ
ールコットンブルーで染色し増殖度を評価した。 実施例２ （キチナーゼ活性検定）キチナーゼ活性は基質としてト
リチル化キチンを用い放射能測定により検定した（モラ
ノ（Ｍｏｌａｎｏ）等、１９７７）。トリチル化キチン
はキトサンのトリチル化無水物によるアセチル化により
合成した（モラノ（ｍｏｌａｎｏ）等、１９７７）。最
終産物の比活性はおよそ１．２×１０６ｃｐｍ／ｍｇで
あった。使用前にトリチル化キチンを３回洗浄した。
０．０２％アジ化ナトリウムを含む１０ｍＭリン酸カリ
ウムバッファ（ｐＨ６．４）１００μｌに５０μｌのト
リチル化キチン（およそ１５０，０００ｃｐｍ）および
５０μｌのたんぱく質溶液を加えた。振盪しながらこの
混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。この反
応は６００μｌの１０％トリクロロ酢酸を添加して停止
させる。キチンがペレットとなるまで遠心し（マイクロ
フュージで１０分間）、５００μｌの上清をグラスウー
ルで濾過しシンチレーションバイアルに移した。５ミリ
リットルのシンチレーション液の放射能を測定した。放
出された放射能量（毎分のカウント数で表現された）を
キチナーゼ活性の尺度とした。 実施例３ （キチナーゼの抗菌類活性）キチナーゼの抗菌類活性は
菌類フサリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎ
ｉ）を用いた前述のマイクロプレート検定法で検定し
た。２つの精製細胞外タバコキチナーゼ（病原関連たん
ぱく質ＰおよびＱとしても知られている）、精製細胞内
タバコキチナーゼ（３２ｋｄたんぱく質）および精製細
胞外ペチュニアキチナーゼをテストした。全ての場合で
約２０００カウント／分（キチナーゼ検定においてこの
活性によりトリチル化キチンから２０００ｃｐｍが放出
されるという意味）の活性を添加した。この活性はたん
ぱく質濃度と活性の間に線型が維持される範囲内にあ
る。コントロールとしてはウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）、バッファまたは熱失活キチナーゼを添加した。こ
の結果を表１に示す。 表１ キチナーゼによるフサリウムソラニの生育の阻害添加たんぱく質 阻 害 ペチュニア細胞外キチナーゼ − ペチュニア細胞外キチナーゼ、煮沸 − タバコ細胞外キチナーゼ（ＰＲ−Ｐ） − タバコ ＰＲ−Ｐ、煮沸 − タバコ細胞外キチナーゼ（ＰＲ−Ｑ） − タバコ ＰＲ−Ｑ、煮沸 − タバコ細胞内３２ｋｄキチナーゼ ＋ タバコ３２ｋｄ細胞内キチナーゼ、煮沸 − ＢＳＡ − バッファ − −；阻害なし、 ＋；阻害 表１の結果からタバコおよびペチュニアの細胞外キチナ
ーゼは抗菌類活性を有していないと結論し得る。 実施例４ （４．０キチナーゼに対応するｃＤＮＡのクローニン
グ）ＴＭＶ感染サムサン（Ｓａｍｓｕｎ）ＮＮタバコか
らポリアデニル化ＲＮＡを単離し当分野でよく知られて
いる標準的方法によりプライマーとしてオリゴ（ｄＴ）
を用い二本鎖ｃＤＮＡを調製した（ホーフトバンフィス
ズイネン（Ｈｏｏｆｔ ｖａｎ Ｈｕｉｊｓｄｕｉｊｎ
ｅｎ）等、１９８６）。この二本鎖ＤＮＡに“Ｃ−テー
ル”を提供する。この部分はプラスミドｐＵＣ９をＰｓ
ｔＩで切り開いた際その末端に誘導される“Ｇ−テー
ル”とハイブリダイズする（マニアチス（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ）等、１９８２）。得られた構築物は大腸菌ＭＨ−
１のトランスホーメーションに使用した。このトランス
ホーマントを２枚のニトロセルロースに移す。最初のフ
ィルターにインビトロでＴＭＶ感染タバコ由来のポリ
（Ａ）−ＲＮＡの転写ｃＤＮＡをハイブリダイズさせ、
もう１つのフィルターは健康なタバコ由来のポリ（Ａ）
−ＲＮＡのｃＤＮＡでハイブリダイズした（マニアチス
（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、１９８２）。第２のプローブ
よりも第１のプローブの方がよくハイブリダイズするト
ランスホーマントはＴＭＶ感染による誘導で合成される
ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡを含んでいる。得られたｃ
ＤＮＡクローンを挿入物の交差ハイブリダイゼーション
に基づき６個のクラスターに分類した。クラスターの中
では全てのクローンの挿入物が互いにハイブリダイズ
し、クラスター間では使用したハイブリダイゼーション
および洗浄条件で（０．１ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５
℃、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、１９８２）交
差ハイブリダイゼーションを起こさない（フーフトヴン
フィスズイネン（Ｈｏｏｆｔｖａｎ Ｈｕｉｊｓｄｕｉ
ｊｎｅｎ）等、１９８６）。６個のクラスターのクロー
ンの挿入物に対応するｍＲＮＡの合成のＴＭＶ誘導性は
当分野でよく知られているノーザンブロット分析で確認
した（フーフトヴァンフィスズイネン（Ｈｏｏｆｔ ｖ
ａｎ Ｈｕｉｊｓｄｕｉｊｎｅｎ）等、１９８６）。６
個のクラスター由来のｃＤＮＡクローン（の挿入物）と
の選択的ハイブイゼーションによるｍＲＮＡのインビト
ロ翻訳産物の免疫沈殿により２つのクラスター、すなわ
ちクラスターＤおよびＦのクローンはいわゆるＰＲ−た
んぱく質ＰおよびＱと血清学的に関連するたんぱく質の
ｍＲＮＡに対応している（フーフトヴァンフィスズイネ
ン（Ｈｏｏｆｔ ｖａｎ Ｈｕｉｊｓｄｕｉｊｎｅｎ）
等、１９８７）。この実験は当分野でよく知られている
標準的方法で行った。ＰＲ−たんぱく質ＰおよびＱはす
でに細胞外酸性キチナーゼとして同定されており、そし
て両たんぱく質に対する抗体はタバコ中に存在する２つ
の塩基性キチナーゼと交差反応する（レグランド（Ｌｅ
ｇｒａｎｄ）等、１９８７）。クラスターＤおよびＦの
クローンの挿入物をＭ１３ベクターにクローン化し、そ
の挿入物の配列をサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）等（１９７
７）の方法で決定した。クラスターＦ、すなわちＰＲＯ
Ｂ３からの１つのクローンは４１２塩基対の挿入物を含
んでおり、この部分はタバコの塩基性キチナーゼのＣ末
端配列と同一であると考えられる配列の１０９個のアミ
ノ酸をコードするオープンリーディングフレームを含ん
でいると考えられている（フーフトヴァンフィスズイネ
ン（Ｈｏｏｆｔ ｖａｎ Ｈｕｉｊｓｄｕｉｊｎｅｎ）
等、１９８７）。このキチナーゼのアミノ酸配列はｃＤ
ＮＡクローン、すなわちｐＣＨＮ５０のヌクレオチド配
列から決定した（シンシ（Ｓｈｉｎｓｈｉ）等、１９８
７）。結果的にクローンｃＤＮＡを含むクラスターＦは
タバコの１つ以上の細胞内塩基性キチナーゼに対応す
る。クラスターＤには６７個のアミノ酸をコードするオ
ープンリーディングフレームを含む４０４塩基対の挿入
物を含むクローン、すなわちＰＲＯＢ３０が属している
（フーフトヴァンフィスズイネン（Ｈｏｏｆｔ ｖａｎ
Ｈｕｉｊｓｄｕｉｊｎｅｎ）等、１９８７）。ＰＲＯ
Ｂ３およびＰＲＯＢ３０の挿入物のヌクレオチド配列か
ら誘導されるアミノ酸配列間のホモロジーは６５％であ
り、一方ヌクレオチド配列自体のホモロジーはわずか５
６％であった。このことからＰＲＯＢ３０は細胞内キチ
ナーゼと同一ではないがこれに関係するキチナーゼに対
応すると結論された。ＰＲ−たんぱく質ＰおよびＱの部
分的アミノ酸配列が確定した後、ＰＲＯＢ３０はＰＲ−
たんぱく質Ｐ、タバコの細胞外酸性キチナーゼに対応し
ていると結論された。 （４．１全細胞外キチナーゼをコードするｃＤＮＡクロ
ーンの構築）キチナーゼの全コード配列を含むｃＤＮＡ
クローンを得るためペチュニアハイブリダ（Ｐｅｔｕｎ
ｉａ ｈｙｂｒｉｄａ）ｃＤＮＡライブラリーからのク
ローンの選択用のプローブとしてクローンＰＲＯＢ３０
を使用した。上述のように二本鎖ｃＤＮＡを合成し、Ｅ
ｃｏＲＩ−メチラーゼで処理し、ＥｃｏＲＩ−リンカー
を付与し、ラムダｇｔ１１ベクターアームにライゲーシ
ョンした後、“ｃＤＮＡクローニングシステムラムダｇ
ｔ１１”に属する説明マニュアルに述べられている方法
に従がい大腸菌Ｙ１０９０にトランスフェクトした（ア
マーシャムインターナショナル社、１９８６）。後に新
しく構築したライブラリーをベントンおよびデービス
（Ｂｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ，１９７７）のプ
ラークハイブリダイゼーション技術で検索した。ここで
は先に述べた酸性キチナーゼ−ｃＤＮＡクローンをプロ
ーブとして使用した。この様にしてＰＲＯＢ３３０と相
同的配列をもつ５個の組換えファージが得られた。組換
えファージＤＮＡを単離し、後にその挿入物をＥｃｏＲ
Ｉで切り出しｐＵＣプラスミドにクローン化してクロー
ンＤ１、Ｄ２、Ｄ５、Ｄ６およびＤ８を作った。Ｍ１３
ファージにクローン化して元の挿入物のヌクレオチド配
列の全てまたはその一部を決定した。図１にクローンＤ
１のヌクレオチド配列および誘導されるアミノ酸配列を
示した。最初および最後の７個のヌクレオチドはこのラ
イブラリー構築に用いたＥｃｏＲＩ−リンカーに由来す
る。ＥｃｏＲＩ制限部位の直前にある挿入物の端の８個
のＡ残基の配列は元のｍＲＮＡのポリ（Ａ）−テールの
残りを示しており、結果的に大きいオープンリーディン
グフレームから先に指定された挿入物の方向および他の
キチナーゼの誘導されるアミノ酸配列との相同性が確認
された（上記参照）。クローンＤ５の挿入物はＤ１より
その５′端が１０ヌクレオチド長いと考える。しかしＤ
６の挿入物と比べるとポリ（Ａ）−テールの残りはその
配列中２５ヌクレオチド前に存在する。追跡し得る限り
ではＤ８、Ｄ２およびＤ６の挿入物の配列はＤ１および
Ｄ５のものと同じであると考える。ペチュニアクローン
Ｄ１およびタバコクローンＰＲＯＢ３０の決定されたア
ミノ酸配列のホモロジーは８０％であった。ＰＲＯＢ３
０はＰＲ−たんぱく質Ｐ、細胞外キチナーゼに対応する
部分的ｃＤＮＡクローンである。トランスジェニック植
物の分析でＤ１にコードされるキチナーゼは少なくとも
タバコでは細胞外に局在することが分った。結果的にＤ
１は細胞外キチナーゼをコードする全ヌクレオチド配列
を含んでいる。ＢａｍＨＩフラグメント上の細胞外キチ
ナーゼに対応するｃＤＮＡをクローン化するために以下
の実験を行った。２つのオリゴヌクレオチド、すなわち
５′−ＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＧＧＴＣＣ
Ｔ−３′および５′−ＡＡＴＴＡＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧ
ＡＣＧＧＡＴＣＣＡ−３′を合成し、互いにハイブリダ
イズさせＨｉｎｄ ＩＩＩ認識部位に適合する一端およ
びＥｃｏＲＩ認識部位に適合する一端をもつ二本鎖ＤＮ
Ａフラグメントを生成させた。さらにこのフラグメント
はＢａｍＨＩ、ＨｉｎｃＩＩおよび再びＢａｍＨＩを含
む。このフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ Ｉ
ＩＩで切り開いたｐＵＣ１９にクローン化した。これは
Ｈｉｎｄ ＩＩＩ認識部位は保存されているがＥｃｏＲ
Ｉ認識部位は保存されていないこの新しいプラスミドを
ｐＵＣ１９＋と呼ぶ。クローンＤ１のＥｃｏＲＩ挿入物
の末端を標準法に従がいクレノーフラグメントを用いて
充填しｐＵＣ１９＋のＨｉｎｃ ＩＩ部位にクローン化
した。 （４．２全細胞内キチナーゼをコードするｃＤＮＡクロ
ーンの構築）ＰＲＯＢ３挿入物による新しいサムサン
（Ｓａｍｓｕｎ）ＮＮライブラリー（上述のペチュニア
ライブラリと同じ方法で構築した）のスクリーニングで
組換えファージを得た。このファージの挿入物をＥｃｏ
ＲＩフラグメントとしてプラスミド中にクローン化し、
クローンＦ１を作った。一次構造の分析でＦ１の挿入物
のヌクレオチド配列はシンシ（Ｓｈｉｎｓｈｉ）等（１
９８７）によって調べられたクローンｐＣＨＮ５０と同
じであった。ｐＣＨＮ５０の挿入物はタバコの細胞内キ
チナーゼに対応する配列を特徴としているのでＦ１の挿
入物も細胞内キチナーゼに対応していると結論される。
ｐＣＨＮ５０の挿入物は全コード配列を含んでおらず結
果的に不完全である。Ｆ１の挿入物はｐＣＨＮ５０のも
のよりも５′端が３０ヌクレオチド長いにもかかわらず
Ｆ１中に含まれるキチナーゼコード配列も不完全であ
る。全キチナーゼをコードする配列をもつフラグメント
を得るため以下のクローニングステップを行った。Ｆ１
の挿入物はその３′末端がポリリンカーのＢａｍＨＩ部
位に適合するようＥｃｏＲフラグメントとしてｐＩＣ１
９Ｈ（マルシ（Ｍａｒｓｈ）等、１９８４）にクローン
化した。これをプラスミドｐＩＣ１９／Ｆ１と呼ぶ。２
つのオリゴヌクレオチド（５′−ＧＡＴＣＣＡＡＣＡＴ
ＧＡＧＧＣＴＧＴＧＣＡ−３′および５′−ＡＡＴＴＴ
ＧＣＡＣＡＧＣＣＴＣＡＴＧＴＴＧ−３′）を合成し
た。これらはハイブリダイゼーションして１つのフラグ
メントを形成する。このフラグメントはｐＩＣ１９／Ｆ
１の挿入物中のオープンリーディングフレームの５′端
を含むＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメントとともにＢａ
ｍＨＩ−ＰｓｔＩで切り開いたｐＵＣプラスミドに三点
ライゲーション反応でクローン化した。このクローニン
グでｐＵＣ／５′Ｆ１が生成する。オリゴヌクレオチド
の配列はそのフラグメントが５個のアミノ酸をコード
し、かつ生ずるＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメント中に
ＥｃｏＲＩ認識部位が除かれ、かつ前記５個のアミノ酸
に対するトリプレットがＦ１のオープンリーディングフ
レームと同相となるように選択した。ｐＩＣ１９Ｈ／Ｆ
１のＨｉｎｄ ＩＩＩおよびＰｓｔＩ（部分的）による
消化後このＨｉｎｄ ＩＩＩ／ＰｓｔＩフラグメントを
挿入物の３′部分とともにＥｃｏＲＩ認識部位を欠く中
間ベクターにクローン化した。この挿入物の末端にある
ＥｃｏＲＩ部位を当分野でよく知られているバックライ
ゲーションという方法を用いて充填することにより置換
した。ＥｃｏＲＩ認識部位の除去後、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
−ＰｓｔＩフラグメントをｐＵＣ／５′Ｆ１にクローン
化した。このようにして得たプラスミドはＢａｍＨＩフ
ラグメント上にあるタバコの細胞内キチナーゼの全コー
ド配列を含むｃＤＮＡを含んでいる。図２に誘導される
アミノ酸配列とともにこのＢａｍＨＩフラグメントの配
列を示した。ヌクレオチド２−２２の配列は合成フラグ
メントに由来し、一方ヌクレオチド２３−２７はＥｃｏ
ＲＩ認識部位の残りの部分に相当する。ＰｓｔＩ認識部
位（５′−ＣＴＧＣＡＧ−３′）は部位１２９−１３４
に存在する。この配列の最後の２１個のヌクレオチドは
連続的にｃＤＮＡライブラリーの構築に使用したＥｃｏ
ＲＩリンカー分子に由来する充填したＥｃＯＲＩ認識部
位、いずれもｐＩＣ１９Ｈのポリリンカーに由来するＳ
ｍａＩおよびＢａｍＨＩ認識部位を示している。 （４．３たんぱく質のアポプラスト指向性を得るように
修正した細胞内キチナーゼをコードする遺伝子の構築）
アポプラストを指向する細胞内キチナーゼをコードする
遺伝子を構築するために図２に示す細胞内キチナーゼの
配列を修正した。部位９６１のＧをＴに交換することに
より停止コドンとする。第２の停止コドンは部位９６８
のＴ残基をＡに置換することにより導入する。部位９７
５のＴ残基のＣへの置換はＳａｌＩ部位を生成する。こ
れらの修正は当分野でよく知られているオーバーラッピ
ングポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を用
いて導入した。後に全配列についてＰＣＲ法の結果とし
て突然変位が導入される可能性をチェックした。 実施例５ （５．０細胞内および細胞外グルカナーゼをコードする
遺伝子のクローニング）ＰＲ−２、ＰＲ−Ｎもしくはそ
の関連配列を発現する組換えファージをタバコＰＲ−た
んぱく質２およびＮで免疫化したウサギから入手した抗
血清を用いて先に述べたラムダｇｔ１１タバコｃＤＮＡ
ライブラリーからスクリーニングした。ここで用いた方
法はハイン（Ｈｕｙｎｈ）等（１９８５）の方法に基づ
いており当分野でよく知られているものである。この方
法で同定された１つの組換えファージの挿入物をこのラ
イブラリーの再スクリーニングのプローブとして用いた
が今度はベントン（Ｂｅｎｔｏｎ）およびデービス（Ｄ
ａｖｉｓ）（１９７７）のプラークハイブリダイゼーシ
ョン法を用いた。この方法を用い３０個の組換えファー
ジを同定した。これらのファージのＤＮＡの挿入物をＥ
ｃｏＲＩで切り出し、ｐＵＣプラスミドにクローン化し
た。種々の制限パターンに基づき得られたクローンをい
くつかのグループに分類した。Ｍ１３ベクターへのクロ
ーン化の後、各グループ由来のいくつかのクローンのヌ
クレオチド配列を決定し、それらにコードされているペ
プチドのアミノ酸配列を誘導した。既知の配列と今回得
られた配列を比較する分析により少なくとも５グループ
の各々がユニークなβ−１，３−グルカナーゼをコード
していることが示された。グルカナーゼｃＤＮＡの１つ
をプローブとして用いたタバコ由来の全ＲＮＡのハイブ
リダイゼーション実験はこれらのグルカナーゼのｍＲＮ
Ａもサリチル酸塩による誘導後またはＴＭＶによる感染
後合成されることを示した（メメリンク（Ｍｅｍｅｒｉ
ｎｋ）等、１９８９）。 （５．１細胞外β−１，３−グルカナーゼをコードする
遺伝子の単離）上述のｃＤＮＡクローンの１つを用いサ
ムサン（Ｓａｍｓｕｎ）ＮＮタバコの核由来のＤＮＡの
ゲノムライブラリーをＳａｎ３ＡＩで部分的に切断し
（コルネリセン（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ）等、１９８
７）グルカナーゼをコードする遺伝子で組換えファージ
をスクリーニングした。いくつかの組換えファージが得
られたがそのうちの４つ、すなわちｇＩ１、ｇＩ３、ｇ
Ｉ４およびｇＩ９（ＰＲ−Ｎ）をさらに調べた。サウザ
ンブロット分析で制限地図を作ったがこれは４つのクロ
ーン各々がユニークな遺伝子を含んでいることを示し
た。つづけてｐＵＣプラスミドおよびＭ１３ベクターに
クローン化してｇＩ３およびｇＩ９について配列分析を
行った。クローンｇＩ９の遺伝子配列をそれから誘導さ
れるアミノ酸配列とともに第３図に示した。比較により
このアミノ酸配列はタバコ細胞外β−１，３−グルカナ
ーゼＰＲ３６と同じであることが分った。このアミノ酸
配列は部分的に明らかにされており（ヴァンデンブルク
（Ｖａｎｄｅｎ Ｂｕｌｃｋｅ）等、１９８９）そのＣ
末端の２１番目のアミノ酸、トレオニン残基はＰＲ３６
には存在していないと考えられた。ここで述べている遺
伝子は細胞外β−１，３−グルカナーゼをコードするＤ
ＮＡ配列で最初に単離されかつ特徴づけられたものであ
る。発現ベクターにこの遺伝子をクローン化するために
以下の操作を行った。この分野ではよく知られているＰ
ＣＲ法を用いその遺伝子の前にＢａｍＨＩ認識部位を導
入し、かつその遺伝子の後にＨｉｎｄ ＩＩＩ認識部位
を導入した。その後この配列をＰＣＲ法の結果可能性の
ある突然変異の導入をチェックした。この遺伝子をＢａ
ｍＨＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメントとして発現ベク
ターｐＭＯＧ１８３（実施例６参照）にライゲーション
し、つづいてＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩによる
切断による線状化することによりこの発現ユニットはグ
ルカナーゼ遺伝子自身の転写ターミネーターを含むＳｓ
ｔＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩを生ずる。 （５．２細胞内グルカナーゼをコードする遺伝子の単
離）細胞内グルカナーゼに対応するクローン（メメリン
ク（Ｍｅｍｅｒｉｎｋ）等、１９８９）をプローブとし
て使用し、上述のゲノムライブラリーを検索した。ユニ
ークな挿入物を含む多くの組換えファージが得られたが
制限分析後わずか２つのユニークな遺伝子が関連してい
ることが分った。１つのファージｇＧＬＢ５０のＤＮＡ
をさらにサウザンブロット分析、サブクローニングおよ
び関係クローンの挿入物の一次構造の解明（いずれも当
分野でよく知られている）により特徴づけた。この遺伝
子の一次構造およびこれから誘導されるアミノ酸配列を
図４に示した。比較によりこのアミノ酸配列はシンシ
（Ｓｈｉｎｓｈｉ）等（１９８８）による多くの重復ｃ
ＤＮＡクローンの配列から誘導されるタバコの細胞内塩
基性β−１，３−グルカナーゼの配列と著しくホモロジ
ーが高いことが分った。これらのｃＤＮＡは互いに非常
によく対応しているけれどもこれらは異なる遺伝子であ
る。少なくともこのｃＤＮＡクローンの１つはこれまで
述べてきた遺伝子の一部に等しい配列を有する挿入物を
含んでいる。この遺伝子を発現ベクターにクローン化す
るためにこの遺伝子の前にＢａｍＨＩ認識部位を導入
し、かつこの遺伝子の後にＳｓｔＩ認識部位を導入し
た。その後、この配列をＰＣＲ法の結果導入する可能性
のある突然変異についてチェックした。この遺伝子をＢ
ａｍＨＩ−ＳｓｔＩフラグメントとして発現ベクターｐ
ＭＯＧ１８５（実施例６参照）にライゲーションし、さ
らにこのベクターをＢａｍＨＩおよびＳｓｔＩによる消
化による線状化の後１つの発現ユニットはグルカナーゼ
遺伝子自身の転写ターミネーターを含むＸｂａＩ−Ｓｓ
ｔＩフラグメントを生じる。上述の操作に加えＰＣＲ法
でその遺伝子の前にＢａｍＨＩ認識部位を導入した。つ
ぎにこの配列をＰＣＲ法により導入される可能性のある
突然変異についてチェックした。さらにグルカナーゼ遺
伝子を含むＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントをＢａｍ
ＨＩおよびＸｂａＩにより消化したプラスミドｐＩＣ１
９Ｈにクローン化した（マルシ（Ｍａｒｓｈ）等、１９
８４）。ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる消化に
より発現ベクターｐＭＯＧ１８３（実施例６参照）を線
状化した後この遺伝子をＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
フラグメントとしてこのベクターにクローン化し、グル
カナーゼ遺伝子自身の転写ターミネーターを含むＳｓｔ
Ｉ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメント中にグルカナーゼ発
現ユニットを生成する。 （５．３アポプラスト指向性となるように修正した細胞
内グルカナーゼをコードする遺伝子の構築）アポプラス
トを指向する細胞内グルカナーゼをコードする遺伝子を
構築するために５．２．で述べた細胞内グルカナーゼ遺
伝子の配列を修正した。最後にＰＣＲ法を用い配列ＧＴ
ＣＴＣＴＧＧＴＧＧ（ヌクレオチド１８８３−１８９
３、図４）を配列ＴＧＡＴＡＴＣＧＴＴＡに変えた。こ
の修正で２つの修正コドンとその間にあるＥｃｏＲＩ認
識部位を導入された。配列をＰＣＲ法で導入する可能性
のある突然変異についてチェックした。 （実施例６） （６．０発現ベクターの構築）遺伝子の高い構成的発現
はとりわけその遺伝子が関係するプロモーターに依存す
る。このような要求を満足させるために発現ベクターｐ
ＭＯＧ１８１を構築し、これを図５に示した。つぎにｐ
ＲＯＫＩの発現カセットを（ボールコンベ（Ｂａｕｌｃ
ｏｍｂｅ）等、１９８６）をＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ Ｉ
ＩＩフラグメントとしてｐＵＣ１８にクローン化した。
このカセットにはＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ制限フラグメ
ント上にカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３
５ＳプロモーターおよびＢａｍＨＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
フラグメント上にノパリンシンテース（ｎｏｓ）転写タ
ーミネーターが含まれる。このプロモーターフラグメン
トは−８００残基で始まり転写開始部位である＋１残基
までの配列からなる（ギリー（Ｇｕｉｌｌｅｙ）等、１
９８２）。文献から−３４３から−９０までの配列の重
復はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの活性を増加させるこ
とが分っている（ケイ（Ｋａｙ）等、１９８７）。２つ
のいわゆるエンハンサー配列を含むプロモーターフラグ
メントを得るために当分野でよく知られている以下のク
ローニング操作を行った。まず部位−５１２にあるＮｃ
ｏＩ認識部位の上流の配列を除去し、そのＮｃｏＩ認識
部位自体をＥｃｏＲＩ認識部位に変えた。この事を行う
ためにｐＵＣ１８中の発現カセットをＮｃｏＩで切断
し、これで生じた末端をクレノーフラグメントで充填し
た。つぎに充填したＡｃｃＩ−ＥｃｏＲＶプロモーター
フラグメント（部位−３８８〜−９０）を線状化プラス
ミドにクローン化した。このことにより充填ＥｃｏＲＩ
部位を充填ＡｃｃＩ認識部位のライゲーションで新しい
ＥｃｏＲＩ部位が生ずる。新しく生成したプラスミドｐ
ＭＯＧ１８１にはまだＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフ
ラグメント上にある発現カセット中の二重エンハンサー
配列とともにＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含んでい
る。ｐＭＯＧ１８１から多くの誘導体を作った。そのＥ
ｃｏＲＩ認識部位にアダプター（５′−ＡＡＴＴＧＡＧ
ＣＴＣ−３′）をクローン化した。この結果ＥｃｏＲＩ
部位は再生されずＳｓｔＩ認識部位が導入された。この
プラスミドｐＭＯＧ１８３（図６）はＳｓｔＩ−Ｈｉｎ
ｄ ＩＩＩフラグメントの発現カセットを含んでいる。
同様にＨｉｎｄ ＩＩＩ部位をＳｓｔ認識部位で置換す
ることによりｐＭＯＧ１８１からｐＭＯＧ１８４を開発
した（図７）。ｐＭＯＧ１８４中のＥｃｏＲＩ部位をＸ
ｂａＩ部位で置換えることによりｐＭＯＧ１８５を作製
した（図８）。 （実施例７） （バイナリーベクター）アグロバクテリウムツメファシ
エンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃ
ｉｅｎｓ）を介してタバコのゲノムヘキチナーゼおよび
β−１，３−グルカナーゼキメラ遺伝子を導入するため
にバイナリーベクターｐＭＯＧ２３（図９）およびｐＭ
ＯＧ２２（図１０）を使用した。ベクターｐＭＯＧ２３
はベクターＢＩＮ１９（ボバン（Ｂｏｖａｎ）１９８
４）の誘導体である。ベクターＢＩＮ１９は当分野でよ
く知られている方法を用い本発明には基本的ではない次
に示す修正を行った。第１にネオマイシンホスホトラン
スフェラーゼ遺伝子ＩＩ（ＮＰＩ ＩＩ遺伝子）からみ
て左端（ＬＢ）と右端（ＲＢ）の位置を互いに交換し
た。つぎにこのＮＰＴＩＩ遺伝子の向きを反転させ、こ
の遺伝子の転写がＬＢの方向で起こるようにした。最後
にＢＩＮ１９ポリリンカーを以下に示す認識部位Ｅｃｏ
ＲＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、Ｓ
ａｃＩ、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩを含むポリリ
ンカーと交換した。ベクターｐＭＯＧ２２はｐＭＯＧ２
３の誘導体であり、ここではＮＰＩ ＩＩ遺伝子はハイ
グロマイシン耐性遺伝子に置き換えられている。この遺
伝子は大腸菌ハイグロマイシンホスホトランスフェラー
ゼ（ＨＰＴ）をコードしており、プラスミドＰＬＧ９０
に由来する（ヴァンデンエルゼン（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅ
ｌｚｅｎ）等、１９８５）。このプラスミドはｐＬＧ８
６（グリッツ（Ｇｒｉｔｚ）等、１９８３）の誘導体で
あり、この遺伝子の翻訳開始コドンの前１９塩基対から
停止コドンの後２０塩基対に及ぶＢａｍＨＩ認識部位を
含んでいる。当分野でよく知られている標準的組換えＤ
ＮＡ技術である部位指定突然変異誘発を用い翻訳開始コ
ドンの４ヌクレオチド前にあるＡＴＧコドンをＡＴＡコ
ドンに変えた。同様にしてＨＰＴ遺伝子のコード領域中
のＥｃｏＲＩ認識部位を５′ＣＡＡＴＴＣ３′に変え
た。次にクレノーポリメラーゼで両方のＢａｍＨＩ端を
充填した後（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）等、１９
８２）このＢａｍＨＩフラグメントをこれも両ＢａｍＨ
Ｉ端を充填したｐＲＯＫＩの発現カセットのＢａｍＨＩ
認識部位にクローン化した（ボールコンベ（Ｂａｕｌｃ
ｏｍｂｅ）等、１９８６）。この方法でＣａＭＶ３５Ｓ
プロモーターおよびｎｏｓ転写ターミネーターの間にＨ
ＰＩコード配列を含む発現ユニットが得られた。 （実施例８） （キメラ遺伝子のバイナリーベクターへのクローニン
グ）細胞外キチナーゼをコードするｃＤＮＡ（４．１参
照）、細胞内キチナーゼｃＤＮＡ（４．２参照）および
修正細胞内キチナーゼｃＤＮＡ（４．３参照）をＢａｍ
ＨＩフラグメントとしてｐＭＯＧ１８１にクローン化し
た。制限酵素分析によりプロモーターの後に適正な方向
でコード配列を含むクローンを選択した。その後Ｅｃｏ
ＲＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメントとして単離される
発現カセットをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで線
状化したバイナリーベクターｐＭＯＧ２３にクローン化
した。生成したプラスミドを各々ｐＭＯＧ１９６、ｐＭ
ＯＧ１９８およびｐＭＯＧ１８９と呼ぶ。さらにアポプ
ラスト指向性となるように修正した細胞内キチナーゼを
コードする遺伝子を含む発現カセットを同様にｐＭＯＧ
２２にクローン化し、ｐＭＯＧ２８９を作製した。アポ
プラスト指向性となるよう修正した細胞内グルカナーゼ
の発現ユニットを含むＳｓｔＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラ
グメントをｐＭＯＧ２３にクローン化しｐＭＯＧ５１２
を作製した（５．３参照）。細胞外キチナーゼをコード
するｃＤＮＡをＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＭＯＧ
１８４にクローン化し、また細胞内キチナーゼをコード
するｃＤＮＡをＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＭＯＧ
１８３にクローン化した。両クローニングステップの
後、制限酵素分析を用いプロモーターの後に適正な方向
でコード配列を含むクローンを選択した。つぎに両カセ
ットを各々ＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩおよびＳｓｔＩ−Ｈｉ
ｎｄ ＩＩＩフラグメントとして単離し、３点ライゲー
ションによりＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで線状
化したプラスミドｐＭＯＧ２３にクローン化した。この
プラスミドｐＭＯＧ２００（図１１）はＮＰＴＩＩ遺伝
子に物理的に結合する両キチナーゼ遺伝子をバイナリー
プラスミド上に含んでいる。細胞外キチナーゼの発現ユ
ニットを含むＳｓｔＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩフラグメント
および細胞内グルカナーゼの発現ユニットを含むＸｂａ
Ｉ−ＳｓｔＩフラグメントをＸｂａＩおよびＨｉｎｄ
ＩＩＩで線状化したバイナリーベクターｐＭＯＧ２２に
３点ライゲーション反応でクローン化した。得られたバ
イナリープラスミドｐＭＯＧ２１２（図１２）はハイグ
ロマイシン耐性遺伝子に物理的に結合した両グルカナー
ゼ遺伝子を含んでいる。 （実施例９） （トランスジェニック植物）タバコのトランスホーメー
ションのために無菌的に生育した植物に由来したリーフ
ディスクを用いた（ホルシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）等、１９
８５）。アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢ
Ａ４４０４株から誘導したバクテリウム株を培養した。
その株をプラスミドｐＲＫ２０１３（ジッタ（Ｄｉｔｔ
ａ）等、１９８０）の助けを借りた移動によりバイナリ
ーベクターを交配した。このアグロバクテリウム（Ａｇ
ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株を淘汰圧下に維持し（２０
ｍｇ／ｌリファンピシン、１００ｍｇ／ｌカナマイシ
ン）、共培養と同様に培養した。バイナリーベクターｐ
ＭＯＧ２３の誘導体を用いた場合のトランスジェニック
植物発芽は１００ｍｇ／ｌカナマイシンを含む培地で確
められ、またｐＭＯＦ２２の誘導体の場合は２０ｍｇ／
ｌハイグロマイシンを含む培地を用いた。発芽から得ら
れた植物は新しく導入された遺伝子の発現に関していわ
ゆるウェスタンブロッティング法を用いて分析した。ウ
ェスタンブロッティング法は当分野でよく知られた方法
である。ある場合には別の遺伝子を挿入するためトラン
スジェニック植物からリーフディスクを採取した。カナ
マイシン耐性リーフディスクをｐＭＯＧ２２誘導体を含
むアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
株と共培養し、またハイクロマイシン耐性リーフディス
クをｐＭＯＧ２３誘導体を含む植物と共培養した。導入
した全ての遺伝子を構成的に発現し得る植物を選択し、
ついで自家受粉により受精した後種子を採取した。これ
らのトランスジェニック植物のＦ１実生をさらに分析し
た。各々ｐＭＯＧ１９６、ｐＭＯＧ１９８、ｐＭＯＧ１
８９またはｐＭＯＧ５１２でトランスホームし、また各
々ｐＭＯＧ１９６＋ｐＭＯＧ２８９、ｐＭＯＧ５１２＋
ｐＭＯＧ２８９またはｐＭＯＧ２００＋ｐＭＧ２１２で
二重トランスホームしたトランスジェニックタバコ植物
を得た。 （実施例１０） （細胞内キチナーゼのアポプラスト指向性）細胞内キチ
ナーゼをアポプラストに指向させる能力を評価するため
に以下の実験を行った。サムサン（Ｓａｍｓｕｎ）ＮＮ
タバコ植物をｐＭＯＧ１９６でトランスホームしペチュ
ニア細胞外キチナーゼ遺伝子を構成的に発現させ（植物
系列１）、ｐＭＯＧ１９８でトランスホームしタバコ細
胞内キチナーゼ遺伝子を構成的に発現させ（植物系列
２）、ｐＭＯＧ１８９でトランスホームし修正した細胞
内キチナーゼ遺伝子を構成的に発現させ（系列３）、お
よびｐＭＯＧ１９６＋ｐＭＯＧ２８９でトランスホーム
しアポプラスト間隙に指向するように修正した細胞内キ
チナーゼ遺伝子および細胞外キチナーゼ遺伝子を構成的
に発現させた。各キメラ遺伝子を高い効率で発現するト
ランスジェニック植物の系列の選択を行なった（全可溶
性たんぱく質フラクションの０．５％以上に達するも
の）。選択した各系列４つから細胞外液（単離操作、ペ
アレント（Ｐａｒｅｎｔ）およびアセリン（Ａｓｓｅｌ
ｉｎ）、１９８４参照）および全葉たんぱく質抽出物を
調製し（コーフマン（Ｋａｕｆｍａｎｎ）等、１９８
７）、これらを菌類フサリウムソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕ
ｍ ｓｏｌａｎｉ）を用いて抗菌活性をテストした。キ
チナーゼ活性は植物系列１、３および４の細胞外液（Ｅ
Ｆ）および全ての植物系列（１〜４）の全たんぱく質抽
出物に検出された。抗菌類検定には１００μｌの植物系
列１、３および４のＥＦを用いおよそ２０００ｃｐｍの
キチナーゼ活性を含むように希釈した（実施例２参
照）。系列２および非トランスジェニックコントロール
タバコのＥＦの希釈は系列１の希釈と同じであった。４
つのトランスジェニック系列の希釈ＴＥ１００μｌはお
よそ２０００ｃｐｍのキチナーゼ活性を含んでいた。コ
ントロールのＴＥの希釈は植物系列１の希釈と等しかっ
た。抗菌類検定の結果を表２に示す。 ペチュニア細胞外キチナーゼ遺伝子を発現する系列１の
ＥＦおよびＴＥは精製キチナーゼを用いた実験から予想
されるように（実施例３参照）抗菌類活性を示さなかっ
た。系列１のＥＦのキチナーゼ活性の存在はタバコ中の
ペチュニアキチナーゼがアポプラスト間隙を指向してい
ることを示している。ほとんどの実験において系列２の
ＥＦにはキチナーゼ活性も抗菌類活性も検出できなかっ
たが、いくつかの実験でＥＦ中にキチナーゼ活性が見い
出された。これはおそらく細胞からの（相対的に過剰
に）発現された細胞内キチナーゼの漏れによるものであ
ろう。修正したアポプラスト指向性細胞内キチナーゼ遺
伝子を発現する系列３ではＥＦおよびＴＥはいずれも強
い抗菌類活性を示した。このことは系列３の指向性細胞
内キチナーゼも抗菌類活性を有していることを示してい
る。Ｃ末端液胞指向性シグナルの欠失が細胞内キチナー
ゼの抗菌類活性に有意に影響しないことは明らかであ
る。 （実施例１１） （キチナーゼの抗菌類活性に関するグルカナーゼの相乗
効果）サムサン（Ｓａｍｓａｎ）ＮＮタバコ植物をｐＭ
ＯＧ５１２でトランスホームし修正した細胞内グルカナ
ーゼ遺伝子を構成的に発現し（系列１）、ｐＭＯＧ５１
２＋ｐＭＯＧ２８９でトランスホームし修正した細胞内
キチナーゼ遺伝子および修正した細胞内グルカナーゼ遺
伝子を構成的に発現させ（系列２）およびｐＭＯＧ１８
９でトランスホームし修正したキチナーゼ遺伝子を発現
させた（系列３、実施例１０参照）。各キメラ遺伝子に
ついて発現レベルが高い植物系列を選択した。選択した
各系列から細胞外液（ＥＦ）（ペアレント（Ｐａｒｅｎ
ｔ）およびアセリン（Ａｓｓｅｌｉｎ）、１９８４）お
よび全葉たんぱく質抽出物（ＴＥ）（コーフマン（Ｋａ
ｕｆｍａｎｎ）等、１９８７）を調製した。約２０００
ｃｐｍのキチナーゼ活性が含まれるように系列２および
３のＥＦおよびＴＥの最初の希釈を行った（実施例２参
照）。系列１のＥＦおよびＴＥの最初の希釈は系列３の
希釈に等しかった。つづいて最初の希釈物を連続的に希
釈し、これらの抗菌類活性をテストした。ＥＦおよびＴ
Ｅの一連の希釈物に抗菌類活性の差は見られなかった。
さらにもっとも高い抗菌類活性は系列２の（希釈）抽出
物に見られた。アポプラスト指向性細胞内グルカナーゼ
がアポプラスト指向性細胞内キチナーゼの抗菌類活性に
関し相乗効果を示すことが明らかになった。 （実施例１２） （非修正細胞内キチナーゼおよびグルカナーゼおよび細
胞外キチナーゼおよびグルカナーゼを合せて発現するト
ランスジェニック植物の分析）フィトフトラニコチアナ
（Ｐｈｕｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）
ｒａｒ、ニコチアナ（ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）（Ｐｎ
ｎ）はオーマイセテス（Ｏｏｍｙｃｅｔｅｓ）属に属す
る菌類である。これはとりわけタバコの根の病原であ
る。この植物の感染により葉のしおれおよび、または茎
の根元の腐敗（ブラックシャンク）を起こす。時にはこ
のタバコ植物は感染で枯れてしまう。植物性加水分解酵
素をコードする未修正遺伝子を発現するトランスジェニ
ック植物の菌類耐性を評価するために以下の実験を行っ
た。２つの未修正キチナーゼおよび２つの未修正β−
１，３−グルカナーゼ遺伝子（未修正キチナーゼｐｍｏ
ｇ２００；未修正グルカナーゼｐｍｏｇ２１２＊）を構
成的に発現する１０個のトランスジェニック植物、空ベ
クターでトランスホームした１０個のコントロール植物
および１０個の非トランスジェニック植物に対し２×１
０５のＰｎｎ遊走子懸濁液を接種した。懸濁液は鉢の中
で茎の根本の土にピペットで加えた。そこで植物を生育
させ後に水で洗浄した。その後この植物の病状の経過を
モニターした。２〜３日後コントロール植物および非ト
ランスジェニック植物は最初の病状を示してくる。３週
間後２０本の植物のうちおよそ１７本が症状を示すよう
になる。いくつかの植物は死ぬであろう。構成的に２つ
のキチナーゼおよびβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子を
発現するトランスジェニック植物のうちいくつかは３週
間後にわずかなしおれを示す。別の実験では約１ｃｍの
リーフディスクを両キチナーゼから再グルカナーゼを構
成的に発現し得るトランスジェニック植物、コントロー
ルトランスジェニック植物および非トランスジェニック
タバコ植物から作る。つづいて１０μｌのＰｎｎ遊走子
の懸濁水（ｍｌ当り５０００個の遊走子）をディク（の
内側）にピペットでのせ、その後このディスクを無菌水
の中に入れ室温でインキュベートする。５個のディスク
３組を各テストで用い、したがって全部で実験当り１０
個のコントロールディスクを用いる。この実験を一定し
た結果が出るまで何回も行う。約１日後、感染の最初の
徴候がコントロールディスクに表われる。５日後それら
には全てコロニーが出現する。キチナーゼおよびグルカ
ナーゼを発現し得るトランスジェニック植物のディスク
は５日後でさえ弱い病状しか示されない。上述のように
精密に行ったリーフディスクを用いたテストは菌類のサ
ナテフォラスククメリス（Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ
ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ）（アナモルフリゾクトニアソラ
ニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）カン（Ｋ
ｕｈｎ））、（担子菌亜門）の胞子を用いても行い得
る。接種濃度は水１ｍｌ当り５０００〜１００００個の
胞子のものを使用する。１０日間後、このディスクをチ
ェックする。非トランスジェニック植物およびコントロ
ールトランスジェニック植物のディスクは全て感染して
いるようだが一方キチナーゼおよびβ−１，３−グルカ
ナーゼのキメラ遺伝子を発現するトランスジェニック植
物のディスクはなんの影響もうけていない。同様にトラ
ンスジェニックおよびコントロール植物の感受性は菌類
アルタナリアアルタナタ（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌ
ｔｅｒｎａｔａ）（子嚢菌亜門）でテストし得る。この
菌類はタバコに“ブラウンスポット”を起こす。実験は
１９７３スパー（Ｓｐｕｒｒ）が行った方法で行い得
る。接種濃度は１ｍｌ当り５０００〜１００００個のコ
ニジアで行った。１０日後接種した葉の上の“ブラウン
スポット”の発達をスパー（Ｓｐｕｒｒ）（１９７３）
により示された基準に従がい判定した。非トランスジェ
ニックおよびコントロールの葉は軽度から重度の類壊を
示したが両キチナーゼおよび両β−１，３−グルカナー
ゼ遺伝子を構成的に発現する葉は全く病状を示さない
か、もしくは示してもごく軽度のものであった（淡黄色
障害）。もし実験を上述のように行うなら、細胞外キチ
ナーゼおよび細胞外β−１，３−グルカナーゼおよび細
胞内キチナーゼおよび細胞内β−１，３−グルカナーゼ
の構成的発現は菌類感染に対して耐性を提供するか、も
しくは少なくともその感受性を減少させることが示され
るであろう。本明細書で述べられている全ての出版物お
よび特許は本発明が関する分野の技術水準を示してい
る。全ての出版物および特許出願は各々の出版物または
特許出願が特別にかつ個別に参考として引用されている
との同じ程度に参考として引用されている。理解を明確
にするため説明や実施例を用いてある程度詳しく本発明
について述べてきたが特許請求の範囲内で特定の変化お
よび修正が可能であることは明らかである。 （微生物の登録）プラスミドｐＭＯＧ２３を含む大腸菌
ＤＨ５α株（ＣＢＳ１０２．９０）およびプラスミドｐ
ＭＯＧ２２を含む大腸菌ＤＨ５α株（ＣＢＳ１０１．９
０）は１９９０年１月２９日オランダ、バーンのセント
ラルブリューボァシメルカルチャレス（Ｃｅｎｔｒａａ
ｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌ ｃｕ
ｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）に登録した。大腸菌ＤＨ５α
株の遺伝子型は：Ｆ−、ｅｎｄＡ１、ｈｓｄＲ１７（ｒ
ｋ −ｍｍｋ ＋）、ｓｕｐＥ４４、ｔｈｉ−１、ｌａｍｄ
ａ−、ｒｅｃＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｒｅｌＡ１、φ８０
ｄｌａｃＺＭ１５。アグロバクテリウムツメファシエン
ス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ）ＬＢＡ４４０４株は全てのバイナリー植物トラン
スホーメーションベクターの良い受容株であり、１９８
３年２月２４日すでに登録済みでＣＢＳ１９１，８３番
としてオランダ、バーンのセントラルブリューボアシメ
ルカルチャレス（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏ
ｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌ ｃｕｌｔｕｒｅｓ）から入手
可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はペチュニアハイブリダ（Ｐｅｔｕｎｉａ
ｈｙｂｒｉｄａ）の細胞外キチナーゼに対応する完全
なｃＤＮＡのヌクレオチド配列および誘導されたアミノ
酸配列を示している。垂直矢印はシグナルペプチドの切
断部位を示している。
【図２】図２はタバコの細胞内キチナーゼに対応するＢ
ａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列およ
び誘導されるアミノ酸配列を示している。ヌクレオチド
２〜２２の配列は合成フラグメントに由来するもので、
一方ヌクレオチド２３〜２７はＥｃｏＲＩ認識部位の残
りに由来する。ＰｓｔＩ認識部位（５′−ＣＴＧＣＡＧ
−３′）は部位１２９−１３４に存在する。この配列の
最後の２１個のヌクレオチドは順番にｃＤＮＡライブラ
リーの構築に用いられたＥｃｏＲＩリンカー分子に由来
する充填化ＥｃｏＲＩ認識部位、いずれもｐＩＣ１９Ｈ
のポリリンカーに由来するＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ認
識部位を含んでいる。矢印はシグナルペプチドの切断部
位を示している。
【図３】図３はタバコの細胞内キチナーゼに対応するＢ
ａｍＨＩ ＤＮＡフラグメントのヌクレオチド配列およ
び誘導されるアミノ酸配列を示している。ヌクレオチド
２〜２２の配列は合成フラグメントに由来するもので、
一方ヌクレオチド２３〜２７はＥｃｏＲＩ認識部位の残
りに由来する。ＰｓｔＩ認識部位（５′−ＣＴＧＣＡＧ
−３′）は部位１２９−１３４に存在する。この配列の
最後の２１個のヌクレオチドは順番にｃＤＮＡライブラ
リーの構築に用いられたＥｃｏＲＩリンカー分子に由来
する充填化ＥｃｏＲＩ認識部位、いずれもｐＩＣ１９Ｈ
のポリリンカーに由来するＳｍａＩおよびＢａｍＨＩ認
識部位を含んでいる。矢印はシグナルペプチドの切断部
位を示している。
【図４】図４はタバコの細胞外β−１，３−グルカナー
ゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列および誘導さ
れるアミノ酸配列を示している。垂直の矢印はシグナル
ペプチドが切断されるアミノ酸配列の位置を示してい
る。イントロンの位置も示してある。イントロンの配列
は部分的にしか示していない。
【図５】図５はタバコの細胞外β−１，３−グルカナー
ゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列および誘導さ
れるアミノ酸配列を示している。垂直の矢印はシグナル
ペプチドが切断されるアミノ酸配列の位置を示してい
る。イントロンの位置も示してある。イントロンの配列
は部分的にしか示していない。
【図６】図６はタバコの細胞内β−１，３−グルカナー
ゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列および誘導さ
れるアミノ酸配列を示す。垂直の矢印はシグナルペプチ
ドが切断されるアミノ酸配列中の位置を示している。
【図７】図７はタバコの細胞内β−１，３−グルカナー
ゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列および誘導さ
れるアミノ酸配列を示す。垂直の矢印はシグナルペプチ
ドが切断されるアミノ酸配列中の位置を示している。
【図８】図８は発現ベクターｐＭＯＧ１８１を図式的に
示したものである。Ａｍｐｒはアンピシリン耐性遺伝子
を意味している。カッコ内の制限酵素認識部位はその部
位がもはやプラスミド中に存在しないことを示してい
る。
【図９】図９はｐＭＯＧ１８１の誘導体であるベクター
ｐＭＯＧ１８３を図式的に示したもので、ここではＥｃ
ｏＲＩ認識部位はＳｓｔＩ部位に置き換えられている。
【図１０】図１０はｐＭＯＧ１８１の誘導体であるベク
ターｐＭＯＧ１８４を図式的に示したもので、ここでは
Ｈｉｎｄ ＩＩＩに認識部位がＳｓｔＩ部位に置き換え
られている。
【図１１】図１１はｐＭＯＧ１８４の誘導体であるベク
ターｐＭＯＧ１８５を図式的に示したもので、ここでは
ＥｃｏＲＩ認識部位がＸｂａＩ部位に置き換えられてい
る。
【図１２】図１２はバイナリーベクターｐＭＯＧ２３を
図式的に示したものである。
【図１３】図１３はｐＭＯＧ２３の誘導体であるバイナ
リーベクターｐＭＯＧ２２を図式的に示したものであ
り、ここではカナマイシン耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）が
ハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＰＴ）に置き換えられ
ている。
【図１４】図１４はｐＭＯＧ２３の誘導体であるプラス
ミドｐＭＯＧ２００を図式的に示したもので、ここでは
２つの発現カセット、１つは細胞内キチナーゼをコード
する配列を含むもので（ＣｈｉＩ）、もう１つは細胞外
キチナーゼコードする配列を含むもの（ＣｈｉＥ）がポ
リリンカーにクローン化されている。矢印はＣａＭＶ３
５Ｓプロモーターから始まるカセットにおける転写の方
向を示している。
【図１５】図１５はｐＭＯＧ２２の誘導体であるプラス
ミドｐＭＯＧ２１２を図式的に示したもので、ここでは
２つの発現カセットすなわち１つは細胞外β−１，３−
グルカナーゼをコードする配列を含むもので（Ｃｌｕ
Ｅ）、もう１つは細胞内β−１，３−グルカナーゼをコ
ードする配列を含むもの（ＣｌｕＩ）がポリリンカーに
クローン化されている。矢印はＣａＭＶ３５Ｓプロモー
ターで始まる転写の方向を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ベルナルデュス ヨハネス クレメンス コルネリセン オランダ エヌエル2361 エーべー ヴァ ルモント ヘレンウェッヒ 29 (72)発明者 レオ シウールド メルヘルス オランダ エヌエル2334 エーアー レイ デン ファン スウィーテンストラート 47 (72)発明者 エリザベス ヨシーヌ ソフィー ミュエ レンホッフ オランダ エヌエル1507 アーエー アム ステルダム オルテリウスカーデ 31 (72)発明者 イェルーン セバスチャン シャルルズ ファン ルーケル オランダ エヌエル1077 デーデー アム ステルダム パルナシュッスウェッヒ 35 (72)発明者 マリアンヌ ベアトリックス セーラ ビ ュールラッヘ オランダ エヌエル3817 ヴェーペー ア メルスフォールト エディソンストラート 58 (72)発明者 アレクサンドラ アレイダ ヴルーマンス オランダ エヌエル2331 エヌエム レイ デン ルイーズ ウェンストラート 38 (72)発明者 シャルルス ペーター ウォロシューク オランダ エヌエル2318 テーアー レイ デン ビュントフラッス 19 (72)発明者 ジョン フェルディナント ボルーケル オランダ エヌエル2341 カーアー ウー ヘストヘースト ランヘヴォールト 34 (72)発明者 フーベルテュス ヨゼフュス マリア リ ントルスト オランダ エヌエル2331 ハーエス レイ デン アンク ファン デル ムールスト ラート 70

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 １つ以上の組換えポリヌクレオチドを使
    用した遺伝子操作により、少なくとも組織の１つにおい
    て細胞内キチナーゼを相対的に過剰発現する植物、また
    はその子孫または該植物を再生する該植物の一部分。
  2. 【請求項２】 細胞内キチナーゼをコードする遺伝子を
    修正することにより細胞内キチナーゼがアポプラストを
    指向する請求項１記載の植物。
  3. 【請求項３】 前記細胞内キチナーゼをコードする遺伝
    子を該遺伝子の３′末端のコード領域中に翻訳停止コド
    ンを作ることにより修正した請求項２記載の植物。
  4. 【請求項４】 翻訳停止コドンの生成により３個から１
    ０個のＣ末端のアミノ酸が失欠する請求項３記載の植
    物。
  5. 【請求項５】 １つ以上の組換えポリヌクレオチドを使
    用した遺伝子操作により少なくとも組織の１つでキチナ
    ーゼ遺伝子およびβ−１，３−グルカナーゼ遺伝子を相
    対的に過剰発現する植物、またはその子孫、または該植
    物を再生する植物の一部分。
  6. 【請求項６】 請求項１乃至４のいずれか１項記載の植
    物で、さらに細胞外キチナーゼ、細胞内β−１，３−グ
    ルカナーゼおよび細胞外β−１，３−グルカナーゼから
    なる群から選ばれる酵素をコードする遺伝子の少なくと
    も１つを相対的に過剰発現する植物。
  7. 【請求項７】 請求項６記載の植物で、さらに少なくと
    も細胞外キチナーゼ遺伝子および細胞内β−１，３−グ
    ルカナーゼ遺伝子を相対的に過剰発現する植物。
  8. 【請求項８】 請求項６記載の植物で、さらに細胞外キ
    チナーゼ遺伝子、細胞内β−１，３−グルカナーゼ遺伝
    子および細胞外β−１，３−グルカナーゼ遺伝子を相対
    的に過剰発現する植物。
  9. 【請求項９】 細胞内β−１，３−グルカナーゼをコー
    ドする遺伝子を修正することにより該細胞内β−１，３
    −グルカナーゼがアポプラストを指向する請求項６乃至
    ８のいずれか１項記載の植物。
  10. 【請求項１０】 細胞内β−１，３−グルカナーゼをコ
    ードする遺伝子を該遺伝子の３′末端のコード領域に翻
    訳停止コドンを作ることにより修正する請求項９記載の
    植物。
  11. 【請求項１１】 翻訳停止コドンの生成が細胞内β−
    １，３−グルカナーゼの３乃至２５個のＣ末端のアミノ
    酸を失欠させる請求項１０記載の植物。
  12. 【請求項１２】 新しく誘導された遺伝子がＣａＭＶ３
    ５Ｓプロモーターのコントロール下にある請求項１乃至
    １１のいずれか１項記載の植物。
  13. 【請求項１３】 細胞内キチナーゼ遺伝子を相対的に過
    剰発現させる遺伝情報を含む組換えポリヌクレオチドで
    基本的に、 ａ）植物中で機能するプロモーター、 ｂ）前記プロモーターのコントロール下で細胞内キチナ
    ーゼをコードする遺伝子、 ｃ）前記遺伝子に機能的の結合するターミネーター、お
    よび ｄ）適正な発現のための調節配列に機能的に結合する選
    択可能またはスクリーニング可能な遺伝子、以上ａ）〜
    ｄ）を含むポリヌクレオチド。
  14. 【請求項１４】 細胞内キチナーゼをコードする遺伝子
    を該遺伝子の３′末端のコード領域に翻訳停止コドンを
    生成することにより修正した請求項１３記載の組換えポ
    リヌクレオチド。
  15. 【請求項１５】 停止コドンが細胞内キチナーゼの３乃
    至１０個のＣ末端アミノ酸を欠失させる請求項１４記載
    の組換えポリヌクレオチド。
  16. 【請求項１６】 請求項１３乃至１５のいずれか１項記
    載の組換えポリヌクレオチドで、さらに細胞外キチナー
    ゼ、細胞内β−１，３−グルカナーゼおよび細胞外β−
    １，３−グルカナーゼからなる群から選ばれる酵素をコ
    ードする少なくとも１個の遺伝子を相対的に過剰発現す
    る遺伝情報で、基本的に ｅ）植物中で機能するプロモーター、 ｆ）前記プロモーターのコントロール下前記酵素の１つ
    をコードする遺伝子、および ｇ）前記遺伝子と機能的に結合するターミネーター、以
    上ｅ）〜ｇ）を含むポリヌクレオチド。
  17. 【請求項１７】 請求項１６記載の組換えポリヌクレオ
    チドで、さらに前記ｆ）が細胞外キチナーゼをコードす
    る遺伝子であり細胞外キチナーゼをコードする遺伝子を
    相対的に過剰発現する遺伝情報を含むポリヌクレオチ
    ド。
  18. 【請求項１８】 請求項１６記載の組換えポリヌクレオ
    チドで、さらに前記ｆ）が細胞内β−１，３−グルカナ
    ーゼをコードする遺伝子であり細胞内β−１，３−グル
    カナーゼをコードする遺伝子を相対的に過剰発現する遺
    伝情報を含むポリヌクレオチド。
  19. 【請求項１９】 請求項１６記載の組換えポリヌクレオ
    チドで、さらに前記ｆ）が細胞外β−１，３−グルカナ
    ーゼをコードする遺伝子であり細胞外β−１，３−グル
    カナーゼをコードする遺伝子を相対的に過剰発現する遺
    伝情報を含むポリヌクレオチド。
  20. 【請求項２０】 細胞内β−１，３−グルカナーゼ遺伝
    子を相対的に過剰発現する遺伝情報を含む組換えポリヌ
    クレオチドで、基本的に ａ）植物中で機能するプロモーター、 ｂ）前記プロモーターのコントロール下細胞内β−１，
    ３−グルカナーゼをコードする遺伝子、 ｃ）前記遺伝子と機能的に結合するターミネーター、お
    よび ｄ）適正な発現のため調節配列と機能的に結合する選択
    可能またはスクリーニング可能な遺伝子、以上ａ）〜
    ｄ）を含むポリヌクレオチド。
  21. 【請求項２１】 細胞内β−１，３−グルカナーゼをコ
    ードする遺伝子を該遺伝子の３′末端のコード領域に翻
    訳停止コドンを生成することにより修正する請求項１
    ６、１８または２０記載の組換えポリヌクレオチド。
  22. 【請求項２２】 停止コドンが細胞内β−１，３−グル
    カナーゼの３乃至２５個のＣ末端のアミノ酸を失欠させ
    る請求項２１記載の組換えポリヌクレオチド。
  23. 【請求項２３】 請求項２１または２２のいずれか１項
    記載の組換えポリヌクレオチドで、さらに少なくとも細
    胞外β−１，３−グルカナーゼをコードする遺伝子を相
    対的に過剰発現する遺伝情報で、基本的に ｅ）植物中で機能するプロモーター、 ｆ）前記プロモーターのコントロール下細胞外β−１，
    ３−グルカナーゼをコードする遺伝子、および ｇ）前記遺伝子に機能的に結合するターミネーター、以
    上ｅ）〜ｇ）を含むポリヌクレオチド。
  24. 【請求項２４】 請求項１２乃至２３のいずれか１項記
    載の組換えポリヌクレオチドを含むクローニングまたは
    トランスホーメーションベクター。
  25. 【請求項２５】 プラスミドｐＭＯＧ２００および基本
    的にこれと等価なその誘導体。
  26. 【請求項２６】 プラスミドｐＭＯＧ２１２および基本
    的にこれと等価なその誘導体。
  27. 【請求項２７】 プラスミドｐＭＯＧ２８９および基本
    的にこれと等価なその誘導体。
  28. 【請求項２８】 プラスミドｐＭＯＧ５１２および基本
    的にこれと等価なその誘導体。
  29. 【請求項２９】 請求項２５乃至２８のいずれか１項記
    載のプラスミドを１つ以上含むアグロバクテリウム株。
  30. 【請求項３０】 ゲノム中に請求項１２乃至２３のいず
    れか１項記載の組換えポリヌクレオチドを導入すること
    による菌類耐性植物またはその子孫または該植物を再生
    する植物の１部分の製造方法。
JP3216681A 1990-01-30 1991-01-29 菌類耐性植物、該菌類耐性植物の製造方法および該方法で使用する組換えポリヌクレオチド Pending JPH08280283A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL9000222 1990-01-30
NL9000222 1990-01-30
US08/047,413 US5670706A (en) 1990-01-30 1993-04-19 Fungal resistant plants, process for obtaining fungal resistant plants and recombinant polynucleotides for use therein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH08280283A true JPH08280283A (ja) 1996-10-29

Family

ID=26646648

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP3216681A Pending JPH08280283A (ja) 1990-01-30 1991-01-29 菌類耐性植物、該菌類耐性植物の製造方法および該方法で使用する組換えポリヌクレオチド

Country Status (12)

Country Link
US (1) US5670706A (ja)
EP (1) EP0440304B1 (ja)
JP (1) JPH08280283A (ja)
AT (1) ATE197815T1 (ja)
AU (1) AU654471B2 (ja)
CA (1) CA2035134A1 (ja)
DE (1) DE69132479T2 (ja)
ES (1) ES2152213T3 (ja)
GR (1) GR3035470T3 (ja)
IE (1) IE910298A1 (ja)
IL (1) IL97020A (ja)
PT (1) PT96599B (ja)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5521153A (en) * 1987-10-02 1996-05-28 Ciba-Geigy Corporation Synergistic antifungal protein and compositions containing same
EP0460753A3 (en) * 1990-06-07 1992-04-15 Mogen International N.V. New antifungal preparations, process for making such preparations, process for obtaining plants with decreased susceptibility to fungi
EP0462065B1 (de) * 1990-06-15 2005-03-02 Syngenta Participations AG Neue Signalsequenzen
US6087560A (en) * 1991-01-29 2000-07-11 Rijksuniversiteit Te Leiden Transgenic fungal resistant plants expressing chitinase and glucanase, process for obtaining, and recombinant polynucleotides for uses therein
DK61691D0 (da) * 1991-04-08 1991-04-08 Danisco Genetiske konstruktioner
US6512166B1 (en) * 1991-06-17 2003-01-28 Cornell Research Foundation, Inc. Combinations of fungal cell wall degrading enzyme and fungal cell membrane affecting compound
AU672636B2 (en) * 1992-10-05 1996-10-10 Syngenta Mogen Bv Antifungal chitin binding proteins and DNA coding therefor
USRE39238E1 (en) 1992-10-09 2006-08-15 Max-Planck-Gesellschaft zür Forderung der Wissenschaften e.V. Transgenic pathogen-resistant organism
DE4234131C2 (de) * 1992-10-09 1995-08-24 Max Planck Gesellschaft Transgener pathogen-resistenter Organismus
US6232525B1 (en) 1993-01-08 2001-05-15 Novartis Finance Corporation Mutant plants and uses therefor
US6107544A (en) * 1993-01-08 2000-08-22 Novartis Finance Corporation Method for breeding disease resistance into plants
CA2152173A1 (en) * 1993-01-08 1994-07-21 John A. Ryals Method for breeding disease resistance into plants
US5530187A (en) * 1993-07-16 1996-06-25 The Salk Institute For Biological Studies Transgenic plants containing multiple disease resistance genes
EP0639642A1 (en) * 1993-08-17 1995-02-22 Mogen International N.V. Chitinase, DNA coding therefore and plants containing same
US5919688A (en) * 1994-10-14 1999-07-06 Novo Nordisk A/S Enzyme with B-1, 3-glucanase activity
US5637745A (en) * 1995-01-30 1997-06-10 Elf Atochem North America, Inc. Organometallic compounds and polymers made therefrom
US5773696A (en) 1996-03-29 1998-06-30 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
US6121436A (en) 1996-12-13 2000-09-19 Monsanto Company Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi
GB9714564D0 (en) 1997-07-10 1997-09-17 Zeneca Ltd Composition
US7161064B2 (en) * 1997-08-12 2007-01-09 North Carolina State University Method for producing stably transformed duckweed using microprojectile bombardment
CN1125179C (zh) * 1999-01-28 2003-10-22 中国农业科学院生物技术研究所 胞内或胞外协同表达两种抗真菌病基因培育抗病作物
WO2000056908A2 (en) 1999-03-24 2000-09-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Maize chitinases and their use in enhancing disease resistance in crop plants
AU5320300A (en) * 1999-06-03 2000-12-28 Cornell Research Foundation Inc. Fungal exo-beta 1,3 glucosidase encoding dna molecule and its use in controlling fungi in plants
DE19930959A1 (de) * 1999-07-05 2001-01-25 Aventis Res & Tech Gmbh & Co Neue Antimycotika und Fungizide, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung
US6521435B1 (en) * 1999-08-30 2003-02-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Nucleic acid sequences encoding cell wall-degrading enzymes and use to engineer resistance to Fusarium and other pathogens
WO2002061043A2 (en) 2001-01-29 2002-08-08 Cargill, Incorporated Fungal resistant transgenic plants
DE10113045A1 (de) * 2001-03-14 2002-09-19 Tares Gmbh Fungizid zur Hemmung der pathogenen Wirkung von Pilzen sowie ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen, die die pathogene Wirkung von Pilzen hemmen.
US7087810B2 (en) * 2001-11-07 2006-08-08 Muller Mathis L Isolated nucleic acids encoding proteins with chitinase activity and uses thereof
TWI265974B (en) * 2001-11-20 2006-11-11 Univ Hong Kong Genetically modified plants with enhanced resistance to fungal diseases and a method of production thereof
US8207092B2 (en) 2006-10-16 2012-06-26 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for improving plant health
EP2053916A2 (en) 2006-10-16 2009-05-06 Monsanto Technology, LLC Methods and compositions for improving plant health
EP2220112B1 (en) 2007-11-26 2015-08-26 Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Compositions comprising fibrous polypeptides and polysaccharides
PL2655644T3 (pl) 2010-12-22 2019-05-31 Basf Enzymes Llc Poprawa sposobów fermentacji i produktów ubocznych
US10131866B2 (en) 2013-02-21 2018-11-20 Direvo Industrial Biotechnology Gmbh Mycotoxin-binders
US20150366238A1 (en) 2013-02-21 2015-12-24 Direvo Industrial Biotechnology Gmbh Prebiotic animal feed product
EP3001794A1 (en) 2013-05-16 2016-04-06 Direvo Industrial Biotechnology GmbH Animal feed product for monogastric animals

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4940840A (en) * 1984-03-26 1990-07-10 Dna Plant Technology Corporation Novel chitinase-producing bacteria and plants
US4801540A (en) * 1986-10-17 1989-01-31 Calgene, Inc. PG gene and its use in plants
GB8626878D0 (en) * 1986-11-11 1986-12-10 Ici Plc Dna
EP0846771A1 (en) * 1987-05-20 1998-06-10 Novartis AG Zea mays plants and transgenic zea mays plants regenerated from protoplasts or protoplast-derived cells
PT89915B (pt) * 1988-03-08 1994-10-31 Ciba Geigy Ag Processo para a preparacao de sequencias de dna regulaveis quimicamente
KR910700346A (ko) * 1988-12-16 1991-03-14 제임스 제이. 플라인 트랜스제닉(transgenic)식물내에서 키티나제를 과발현시키는 방법
AU638695B2 (en) * 1989-02-16 1993-07-08 Akademie Der Wissenschaften Der Ddr A thermostable (1,3-1,4)-beta-glucanase
ATE241699T1 (de) * 1989-03-24 2003-06-15 Syngenta Participations Ag Krankheitsresistente transgene pflanze
EP0418695A1 (de) * 1989-09-13 1991-03-27 Ciba-Geigy Ag Regulatorische DNA-Sequenz

Also Published As

Publication number Publication date
PT96599A (pt) 1991-10-15
ATE197815T1 (de) 2000-12-15
DE69132479T2 (de) 2001-05-17
IL97020A (en) 2000-12-06
EP0440304A1 (en) 1991-08-07
DE69132479D1 (de) 2001-01-04
IL97020A0 (en) 1992-03-29
EP0440304B1 (en) 2000-11-29
ES2152213T3 (es) 2001-02-01
CA2035134A1 (en) 1991-07-31
PT96599B (pt) 1998-07-31
AU7003491A (en) 1991-08-01
AU654471B2 (en) 1994-11-10
US5670706A (en) 1997-09-23
IE910298A1 (en) 1991-07-31
GR3035470T3 (en) 2001-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH08280283A (ja) 菌類耐性植物、該菌類耐性植物の製造方法および該方法で使用する組換えポリヌクレオチド
US5834268A (en) Stilbene synthase genes for grapevine
US5530187A (en) Transgenic plants containing multiple disease resistance genes
US5856151A (en) Antifungal preparations containing osmotin
JPH07500970A (ja) 植物寄生線虫に対する低下された感受性を有する植物の生産方法
JPH06507070A (ja) 植物キチナーゼ遺伝子およびその使用
Garcia‐Casado et al. Characterization of an apoplastic basic thaumatin‐like protein from recalcitrant chestnut seeds
Ryals et al. Systemic acquired resistance: an inducible defense mechanism in plants
Liu et al. A β-1, 3-glucanase gene expressed in fruit of Pyrus pyrifolia enhances resistance to several pathogenic fungi in transgenic tobacco
EP0639642A1 (en) Chitinase, DNA coding therefore and plants containing same
AU718274B2 (en) Antifungal proteins, DNA coding therefore, and hosts incorporating same
AU645990B2 (en) Regulatory DNA sequence
IE912039A1 (en) Novel signal sequences
AU5111793A (en) Antifungal chitin binding proteins and dna coding therefor
CA2180353A1 (en) Antimicrobial proteins from aralia and impatiens
US6087560A (en) Transgenic fungal resistant plants expressing chitinase and glucanase, process for obtaining, and recombinant polynucleotides for uses therein
US20100212050A1 (en) Plants over-expressing pme
CA2110403A1 (en) Biocidal proteins
US6066491A (en) Process for obtaining fungal resistant plants with recombinant polynucleotides encoding β-1,3-glucanase modified for apoplast targeting
Kiba et al. Gentian lipid transfer protein homolog with antimicrobial properties confers resistance to Botrytis cinerea in transgenic tobacco
Kálai et al. Comparative study of constitutive and inducible promoters in tobacco
EP0667905A1 (en) Antifungal chitin binding proteins and dna coding therefor

Legal Events

Date Code Title Description
A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20050920

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20050926

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20060511

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20060516