PT94899B

PT94899B - Aparelho para a execucao repetida e automatica de um ciclo termico para o tratamento de amostras

Info

Publication number: PT94899B
Application number: PT94899A
Authority: PT
Original assignee: Scras
Priority date: 1989-08-05
Filing date: 1990-08-03
Publication date: 1997-11-28
Also published as: IN177441B; HK33194A; AR243600A1; AU643225B2; AU6014890A; ES2027111A6; TNSN90110A1; GB2238005A; CA2022564A1; NZ234736A; ATA163290A; FR2650657B1; IE65524B1; DK185990D0; SE9002566L; SE9002566D0; JPH0383572A; NO903423D0; NL9001772A; IT1243976B

Description

DESORIgAO

A presente invenção refere-se a um aparelho para a execução repetida e automática de um ciclo térmico para o tratamento de amostras biológicas.

Um aparelho deste género tem numerosas aplicações em biologia em geral e, em especial, em microbiologia. Neste último domínio, a necessidade de tratamento de uma amcsbra biológica a temperaturas diferentes é geralmente deter minada por duas características biológicas básicas. Em primeiro lugar, a actividade biológica de uma enzima é grandemente dependente da temperatura. Em geral, cada enzima tem uma temperatura operativa óptima e a sua actividade diminui regularmente se nos afastarmos dessa temperatura. Podem assim obter-se curvas que mcdbram as variações da actividade

M.A.

- 1 biologica em função da temperatura, as quais representam uma característica importante de cada enzima. Em segundo lugar, a reacção de hibridização molecular entre duas sequências de ácidos nucleicos está dírectamente ligada à temperatura. Esta hibridização baseada na complementaridade das bases entre duas sequências pode ocorrer entre duas moléculas de ácido deoxiribonuoleico (DNA), entre duas moléculas de ácido ribonucleico (RNA) ou entre uma molécula de DNA e uma molécula de RNA. A hibridização molecular permite produzir, ou o empa relhamento por ligação de hidrogénio entre duas moléculas distintas, ou o emparelhamento intermolecular entre duas se quências complementares. Neste último caso, há a formação de uma denominada estrutura secundária de moléculas de DNA e de RNA. 0 efeito da temperatura na reacção de hibridização é es sencial, sendo oada sequência de DNA (ou de RNA) definida pe la sua Tm, isto é, a temperatura à qual 50$ das sequências estão emparelhadas para formar sequências complementares. A Tm de uma sequência precisa é calculada experimentalmente se, guindo a hipercromicidade a 260 nm por espectrografia, que acompanha o desemparelhamento (ou desnaturação) de duas sequências complementares de DNA. A totalidade das sequências de DNA estão sob a forma de um cordão único, a uma temperatu ra elevada (100°0), e na forma de cordão duplo, a temperaturas baixas (10-20°0).

A Tm de uma sequência de DNA depende essencial mente dos seguintes dois parâmetros: a sequência básica e a força ionioa do meio. As Tm que são usualmente encontradas variam entre 20 e 85 °0. Assim, a grande maioria de reacções moleculares pode produzir-se em condições térmicas perfeita mente definidas e controladas. Algumas destas reacções exigem a utilização sucessiva de diferentes temperaturas e.podem ser efectuadas no aparelho segundo a presente invenção. Isso refere-se particularmente à hidrólise que utiliza enzimas de restrição, reacções de modificação de enzimas para o DNA, reacções em cadeia de enzimas, o isolamento de famílias ·*

repetitivas de sequências de DNA. e a amplificação por reacção em cadeia de polimerases. Vão agora discutir-se com mais pormenor estas aplicações.

Hidrólise de DNA por enzimas de restrição

Uma enzima de restrição permite cortar um duplex de hibridização DNA/DNA num sítio muito específico, definido pela sua sequência. Para a grande maioria destas enzi mas, a temperatura de actividade máxima e 37 °0. 0 tempo de incubação do DNA com a enzima a 37 °C varia entre 30 m e algu mas horas. Assim, um processo simples de inactivação da enzi ma consiste na incubação da amostra durante vários minutos a 100°C, temperatura à qual a enzima e desnaturada de maneira irreversível. Este tratamento é igualmente eficiente na desnaturação do DNA que regressa à sua forma de cordão duplo, se for sujeito a uma redução progressiva da temperatura de 110°0 até 20°0. 0 arrefecimento brusco da amostra não nos permite obter a renaturação do DNA. 0 arrefecimento progressivo pode, em particular, ser feito por fases.

Generalização do conjunto de tratamentos das enzimas de

DNA e RNA

Este processo aplicado âs enzimas de restrição pode ser adaptado para o tratamento de muitas enzimas, por £ xemplo:

-cinases polinucleicas

- ligases

- transferase deoxinucleotidílica terminal

- polimerases DNA e RNA

Tratamento de enzimas em cascata

Podem ser necessários muitos tratamentos de en zimas sucessivos para obter uma ou mais sequências definidas de DNA. É geralmente necessária uma alteração do meio de re- 3 -

acção entre duas reacções de enzimas.

Isolamento de famílias repetitivas de sequências de DNA

Existem sequências de DEA em grandes números em q genomas complexos (genoma humano = 3»5 x 10^ pares hásicos). $ possível distinguir diferentes famílias repetitivas de sequências em função do número de cópias de sequências por genoma. Assim, os genomas DEA totalmente desnaturados termicamente são restaurados em vários estádios e de uma maneira se lectiva. As sequências muito repetitivas são restauradas em primeiro lugar (família 1), depois as sequências mediamente repetitivas (família 2) e depois as famílias dificilmente re petitivas (família 3) e, finalmente, as sequências únicas (família 4). $ assim possível isolar estas diferentes famílias fazendo passar a amostra por colunas de afinidade do ti po de hidroxi-apatite que nos permitem separar moléculas DEA de cordão simples de moléculas DEA de cordão duplo. Elas são passadas nas colunas a uma temperatura exacta durante o arre fecimento, fase por fase da amostra. A temperatura da primei ra coluna é de cerca da temperatura de fusão (Em) das sequên cias da família 1. Eestas condições, podem separar-se as sequências da família 1 das famílias 2, 3 e 4. Aplica-se o mes mo processo para separar as famílias 2, 3 e 4. 0 aparelho

I descrito na presente invenção está particularmente bem adaptado para realizar esta sequência térmica.

Amplificação do número de sequências de DEA por reacção em cadeia de pomerases (POR)

Esta técnica permite-nos especialmente amplifi! car o número de cópias de uma sequênoia DEA de cordão duplo, í 0 princípio da PCR (R. K. Saiki et al, Science, 230, 1985,

350-1 354) consiste em usar a actividade da polimerase DEA dependente do DEA iniciando a síntese partindo do material inicial oligonucleotídico (Pl e P2) adicionado no meio de re acção. Um ciclo de amplificação consiste em três estádios su

I ' í «w Z|. ·*

cessivos:

- Estádio 1

Desnaturação do DNS com cordões duplos a 90-100° “ Estádio 2

Hihridização de escorvas (primers”) (nucleotidos 14-35) PI e P2 nas sequências objectivo.

PI hibridiza-se com o cordão (+) e P2 hibridiza-se com o cordão (-). Este estádio é realizado a uma tempera tura próxima da média das Tm de PI e P2.

- Estádio 3

Síntese do cordão de DNA complementar por extensão das escorvas PI e P2, graças à actividade de uma polimerase DNA. Este estádio tem lugar próximo da temperatura ópti ma da enzima, ou a 37°0 para o fragmento de Klenow ou a 72 °0 para a polimerase Tag.

Assim, depois de um ciclo de amplificação, o numero de sequências completadas por PI e P2 esta multiplicado por 2, multiplicado por 4 depois de 2 ciclos, por 8 depois de 3 ciclos, por 1 024 depois de 10 ciclos e por 1 048 576 depois de 20 ciclos. Geralmente, a taxa de amplificação após n ciclos é 2ⁿ. Um ciclo de amplificação consiste assim em 3 estádios sucessivos e uma reacção PCR completa necessita de cerca de 10 a 60 ciclos. Em geral cada estádio térmico dura de 1 a 5 minutos. A automatização de uma tal técnioa representa pois um progresso considerável.

A presente invenção proporciona um aparelho para a execução automática repetida de um ciclo térmico para o tratamento de uma amostra, compreendendo o aparelho meios que definem um trajecto que é fisicamente fechado durante to

- 5 do o tratamento e em cujo interior a amostra reside em todo o tratamento, meios para deslocar a amostra entre diferentes posições ao longo dotrajecto e meios para aquecer e arrefecer a amostra em função da sua posição no interior do trajec to.

Os meios que definem o trajecto compreendem de preferência um tubo capilar. Este tubo pode ser de um material semi-rígido, tal como um material plástico e pode ter um diâmetro pequeno, deste cerca de 0,1 mm a cerca de 4 mm, de preferência de 1 mm a 3 mm. Uma tal secção transversal in terna pequena garante uma grande superfície de permuta de ca lor em relação ao volume, permitindo portanto variações de temperatura rápidas, em particular comparadas com uma amostra num tubo convencional de 0,5 a 1,5 ml. A amostra tratada no aparelho segundo a presente invenção é usualmente de 1 a 50 microlitros.

São encaradas várias disposições espaciais. Pode, por exemplo, ser uma forma em espiral num anel fechado, ou uma forma linear. Oada uma das voltas da espira, cada uma das voltas do anel fechado ou cada passagem do comprimento do tubo capilar linear representa um ciclo térmico, dentro do qual a amostra passa através de duas ou mais zonas termoestatizadas, a temperaturas diferentes de 4°0 a 150°0. Outros ciclos térmicos, até 100, compreendem a volta seguinte da espiral, uma outra volta dentro do anel fechado ou o retorno da amostra no sentido oposto ao longo do comprimento do tubo capilar linear.

As zonas termoestatizadas podem estar dispostas num sistema discontínuo ou num sistema contínuo. Num sistema discontínuo, as zonas estão separadas por uma barreira física, atravessada apenas pelo tubo capilar. Oada zona tem um sistema de aquecimento ou arrefecimento autónomo. A barreira inter-zonas isola cada zona do efeito térmico da ou das zo- 6 -

nas adjacentes* Num sistema contínuo não há qualquer barreira física. 0 tubo capilar cruza um gradiente térmico contínuo e direccional, que pode ser criado num meio líquido, gasoso ou sólido. Uma mudança de meio dá a possibilidade de um gradiente térmico contínuo mas irregular.

A velocidade do movimento da amostra através do tubo capilar tem um efeito profundo no tratamento. Se a amos, tra se deslocar muito lentamente através de uma zona, a sua temperatura aproximar-se-á de ou atingirá a temperatura da zona. A amostra poderá mesmo parar dentro de uma zona dada durante um tempo pré-determinado, estabilizando a sua temperatura na dessa zona. Por outro lado, se a amostra se deslocar rapidamente através de uma zona, o efeito térmico dessa zona na amostra pode ser minimizado ou suprimido.

movimento da amostra no tubo capilar pode ser obtido de diferentes maneiras:

- por meio de pelo menos uma bomba peristáltica que actua numa zona capilar com uma parede flexível;

- por deslocamento num sistema magnético constitui do por duas partes: um íman permanente e uma parte que reage â acção do íman (parte metálica ou segundo íman);

Uma das partes está solidamente ligada a um sistema de accionamento mecânico, permitindo que a mesma rode (sistema circular) ou que se desloque em translacção (sistema linear). A outra parte está situada no interior do tubo capilar e está ligada solidamente à amostra. Esta parte pode ser constituida por pelo menos uma partícula solida (glóbulo, cilindro, suspensão de micropartículas num liquido, etc) ou pelo menos por uma partícula líquida.

- pelo efeito de pelo menos uma bomba que actua num gás;

- por acção capilar passiva;

- pela acção da bombagem térmica criada pela proxi midade de massas gasosas a temperaturas diferentes no interior do tubo capilar.

movimento da amostra pode também ser obtido por uma combinação de dois ou mais destes processos. 0 movimento da amostra pode estar sob o controlo de um microproces. sador.

aparelho segundo a presente invenção utiliza um sistema semifechado representado pelo tubo capilar, reduzindo o risco de contaminação molecular durante o tratamento da amostra biológica.

Ilustra-se a presente invenção nos desenhos anexos, cujas figuras representam:

Às fig. la, lb e lc,-diagramas esquemáticos do a parelho segundo a presente, invenção, mostrando as disposições helicoidal, em anel fechado e linear, respeetivamente, do tubo capilar;

A fig. 2, uma vista em corte transversal feito pela linha (II-II) da fig. 3 de um aparelho segundo a presen te invenção, no qual o tubo capilar tem a forma de anel fechado; e

A fig. 3, uma vista em corte do aparelho da fig. 2, feito pela linha de corte (III-III) da fig. 2.

Com referência em primeiro lugar às fig. la a lc nelas representam-se três diagramas esquemáticos. Em cada um deles há três zonas termoestatizadas (I), (II) e (III), atra vés das quais a amostra biológica passa no tubo capilar, num ciclo térmico único. As zonas termostáticas (I), (II) e

(III) poderiam ser substituídas por um gradiente térmico oon tínuo ou discontínuo. Na forma em espiral da fig. la, há tan tas espiras quantos os ciclos térmicos a efectuar. Na forma em anel fechado da fig. 1b, há precisamente uma espira e cada um dos ciolos consiste num circuito do anel fechado percorrido pela amostra biológica. Na forma linear da fig. 1c, o primeiro ciclo térmico é completado pela passagem da amostra da esquerda para a direita, isto é, através da zona termoestatizada (I), da zona termoestatizada (II) e da zona ter moestatizada (III) em sequência. 0 segundo ciclo térmico é completado pela passagem de retorno da direita para a esquer da, isto é através da zona (III), da zona (II) e da zona (I), sucessivamente. Todos os ciclos de ordem ímpar seguem o padrão do primeiro e todos os oiclos de ordem par seguem o padrão do segundo. Nota-se que a amostra passa substancialmente pela zona (II) nos dois sentidos, produzindo assim uma su cessão de zonas termoestatizadas (I, II, III, III, II, I, I, II, III, III, II, I ...). Porém, a passagem através da zona (II) em todos os ciclos pares pode ser completada rapidamente para minimizar o seu efeito e os tempos de permanência nas zonas (I) e (III) ajustados para conseguir o mesmo efeito (I, II, III, I, II, III, I, II, III, ... que nas disposições em espiral e em anel fechado.

Oom referência agora âs fig. 2 e 3, o aparelho i lustrado rncètra uma forma em anel fechado do aparelho segundo a presente invenção, com um sistema de deslocamento magnético para a amostra biológica e um sistema discontínuo de zonas termoestizadas.

aparelho está provido de um tubo capilar (6), sob a forma de um anel fechado. 0 tubo capilar (6) está provido com um ramo (e) para a entrada da amostra a tratar e com um ramo (s) para a remoção da amostra depois do tratamento.

Uma chave (13) é movei ao longo do eixo (B-B) en

tre uma posição radialmente interior, na qual o tubo.capilar (6) está empurrado contra uma parede (5), e uma posição radialmente para fora, na qual os ramos (e) e (s) do tubo capi lar estão empurrados contra os elementos (14). Ha posição ra dial para dentro, o anel capilar (6) está interrompido e os ramos (c) e (s) estão abertos para entrada e remoção da amos tra. Ha posição radialmente para fora, os ramos (e) e (s) es tão fechados e a amostra está livre para continuar o ciclo em torno do tubo capilar (6) em anel fechado. Os meios para mover a chave (13) são exteriores ao aparelho descrito, não estando representados nos desenhos.

Para o movimento da amostra em torno do tubo capilar (6) em anel fechado, utiliza-se um sistema magnético. Este sistema compreende um íman (4) suportado num braço (2) solidário com um eixo de accionamento (3). 0 veio de acciona mento (3) está apoiado rotativamente em (11) e é accionado por um motor (12). Há uma parte que responde à acção do íman (2), formada por microglóbulos metálicos em suspensão em óleo mineral. Esta parte está no tubo capilar (6) em contacto com a amostra.

Durante uma volta da amostra em torno do tubo ca pilar (6) em anel fechado, a amostra passa próximo de compar timentos termoestatizados (7), (15) e (16). A amostra está sob a influência térmica do compartimento em frente do qual se encontra nesse instante. Cada um destes compartimentos (7) , (15) e (16) está regulado termicamente a uma temperatura entre 4°C e 150°C. Os compartimentos estão isolados de uma abraçadeira (10), suportada por uma plaoa de montagem (9), por um espaçador ajustavel (8).

motor (12) está sob o controlo de um microprocessador programável que permite que sejam fixados vários pa rametros associados com o movimento da amostra. Estes parâme tros incluem o número total de ciclos a que a amostra é su- 10 jeita, a velocidade do movimento das amostras e o número, a posição e a duração das paragens da amostra durante cada ciclo. 0 microprocessador tem interface com um termopar que me de continuamente a temperatura aotual da amostra no tubo capilar (6). Os vários parâmetros do movimento da amostra podem assim ser alterados em função da temperatura medida, sob o controlo programado do microprocessador. 0 microprocessador sob controlo programado pode também governar o movimento das chaves (13), a temperatura nos compartimentos (7), (15) e (l6) e o aparelho exterior, tal como uma bomba peristáltica, que governa o movimento da amostra nos ramos de entrada e de saída. A fig. 3 mostra três chaves (13) independentes, cada uma delas associada a um tubo capilar (6).

Claims

REIMOICAÇOES

- 1- Aparelho para a execução repetida e automática de um ciclo térmico para o tratamento de uma amostra, caracterizado por compreender meios que definem uma passagem que está fisicamente fechada durante todo o tratamento e em cujo interior reside a amostra durante todo o tratamento, meios para deslocar a amostra entre posições diferentes ao longo da passagem e meios para aquecer e arrefecer a amostra em função da sua posição no interior da passagem.

- 2ã _

Aparelho de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por os meios que definem a passagem serem constituídos por um tubo capilar.

_ 3ã _

Aparelho de acordo com a reivindicação 2, caracte rizado por o tubo capilar ter um diâmetro interno de 0,1 mm a 4 mm.

- 4§ Aparelho de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por os meios para aquecer e ar refecer a amostra compreenderem duas ou mais zonas com a temperatura regulada por termostato através das quais passa a pas. sagem.

- 5^â Aparelho de acordo com a reivindicação 4, caracte rizado por as zonas com a temperatura, regulada por termostato estarem dispostas de maneira discontínua, estando cada uma d_e las separada da seguinte por uma ‘barreira física atravessada apenas pela passagem e estando cada uma delas provida com um sistema de aquecimento ou de arrefecimento autónomo.

- 6ã Aparelho de acordo com a reivindicação 4, caracte rizado por as zonas com temperatura regulada por termostato estarem dispostas continuamente ao longo da passagem para pro porcionar um gradiente térmico contínuo e direceional.

- ₇a _

Aparelho de acordo com a reivindicação 6, caracte! rizado por o gradiente térmico ser irregular.

_ ga _

Aparelho de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por os meios para mover a amos, tra compreenderem meios magnéticos que incluem uma parte magnética no interior da passagem adjacente à amostra e um íman exterior que actua na parte magnética pará mover a mesma e portanto a amostra.

- Aparelho de acordo com a reivindicação 8, caracte rizado por a parte magnética ser um íman maciço ou uma suspen são de micropartículas magnéticas num líquido não miscível com a amostra.

- 15 Aparelho de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por os meios para mover a amostra compreenderem uma bomba que actua num gás.

Aparelho de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por os meios para mover a amostra compreenderem o efeito de bombagem térmica criado pela proximidade de massas gasosas a temperaturas diferentes no interior da passagem.

- 12ã Aparelho de acordo com a reivindicação 2 ou qualquer das reivindicações 3 a 7» caracterizado por os meios para mover a amostra compreenderem a acção capilar passiva.

- 13^ Aparelho de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 7, caracterizado por os meios para mover a amostra compreenderem uma bomba peristáltica.

A requerente reivindica a prioridade do pedido britânico apresentado em 5 de Agosto de 1989, sob o numero

- 14 3917965.4.