JPH0383572A - サンプル処理用熱サイクルを反復して自動的に実施する装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物学的サンプル処理用熱サイクルを反復して
自動的に実施する装置に関する。

このような装置は一般に生物学とくに微生物学に多くの
用途を有する。後者の分野において、生物学的サンプル
を異なった温度で処理する必要性は一般的に二つの基本
的生物学的特性によって示される。まず、酵素の生物学
的活性は温度にいちじるしく影響される。一般に、各酵
素はもつともよい作用温度を有しその活性は通常この温
度から離れるならば低下する。温度の関数として生物学
的活性の変化を示す曲線が得られ、各酵素の重要な特性
を示す。第２に二つの連鎖した核酸間の分子交雑反応は
直接温度に関連する。この二つの連鎖間のベースの補完
に基づく分子交雑は二つのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）
分子間、二つのリボ核酸（ＲＮＡ）分子間または一つの
ＤＮＡ分子および一つのＲＮＡ分子間に起こる。

分子交雑は１つのものが二つの別の分子間の水素結合に
よるベアリングまたは二つの補完的連鎖ノ間の分子間ベ
アリングのいずれかによって発生する。あとの場合、Ｄ
ＮＡ分子またはＲＮＡ分子のいわゆる二次構造が形威さ
れる。交雑反応における温度の効果は本質的なもので、
ＤＮＡ（またはＩＩＮＡ）の各連鎖はそのＴｓ、すなわ
ち５０％の連鎖が補完的連鎖とベアリングすることによ
って画定される。正確な連鎖のＴｍは経験的にスペクト
ル測定によって２６０ｎｍにおいて吸収スペクトルに従
って評価され、それはＤＮＡの２つの補完的連鎖のアン
ペアリング（または変性）を伴う。ＤＮＡ連鎖全体は高
温（１００℃〉において単一ストランドを形威しまた低
温（１０〜２０℃）における二重ストランドを形成する
。

ＤＮＡ連鎖のＴｍは本質的に下記の二つのパラメータ、
すなわち基本的連鎖および媒体のイオン力に依存する０
通常Ｔｍは２０〜８５℃の間に変化することが見出され
る。しかして、大多数の分子反応は完全に限定されかつ
制御された熱的条件において発生する。これらの反応の
あるものは異なった温度の連続的使用を必要とし、本発
明が提供する装置によつ実施することができる。

これはとくに制限酵素を使用する加水分解、ＤＮＡに対
する酵素変型反応、カスケード酵素反応、ＤＮＡに対す
る連鎖の反復的分離および“重合連鎖反応”による増殖
に関連する。これらの用途は下記に詳細に説明する。

によるＤＮＡの　水 制限酵素は交雑二重ＤＮＡ　／　ＤＮＡをその連鎖によ
って限定されたきわめて特殊な場所で切断することがで
きる。これらの酵素の大部分に対し、最高活性温度は３
７℃である。３７℃における酵素に対するＤＮＡの培養
時間は３０分と数時間の間で変化する。しかして、酵素
を不活性化する簡単な方法はサンプルを数分間、酵素が
非可逆的に変性される、１００℃で培養することである
。この処理はＤＮＡ変性においても同様に有効であり、
ＤＮＡ　は温度が１１０℃から２０℃に徐々に低下する
ときその二重ストランド形式に戻る。サンプルの突然の
冷却はＤＮＡを正確に変性させることはできない、徐々
に冷却することは各段階をとくに進行させる。

ＤＮＡおよびＲＮ／ｌの　　　　における−制限酵素に
適用されるこの方法は多くの酵素の処理に適用される。

たとえば、 一多核性キナーゼ □リガーゼ 一境界デオキシヌクレオチダル・トランスフェラーゼ −Ｄ　Ｎ　ＡおよびＲＮＡ　ポリメラーゼ□エンドヌク
レアーゼおよびエキソヌクレアーゼ である。

カスケード　、几 多くの連続した酵素処理が一つ以上のＲＮＡ連鎖を得る
ため必要である０反応媒体は一般に二つの酵素反応の間
に必要である。

ＤＮＡ　　の　　ファもりの 多数のＤＮＡ連鎖が、複雑な染色体に存在する（人の染
色体は基本的ペアが３．５Ｘ１０’　）　＋１異なった
連鎖の複製ファξりを染色体当たりのコピー数の関数と
して区別することは可能である。

しかして、完全に熱的に変性されたＤＮＡ染色体は各段
階にかつ選択された方法で貯蔵される。

複製連鎖はまず貯蔵され（第１フアミリ）、ついで中位
の複製連鎖が貯蔵され（第２フアξす）、そしてほとん
ど複製しない連鎖が貯蔵され（第３フアミリ）最後にユ
ニークな連鎖が貯蔵される（第４フアミリ）　これらの
異なったファミリを、サンプルを水酸化リン灰石型のア
フイニテイタワーに通し、単一ストランドＤＮＡ分子を
二重ストランドＤＮＡ分子から分離しうるようにするこ
とによって分離することができる。それらはサンプルを
一段毎に冷却する間正確な温度のコラムに通される。第
１コラムの温度は第１フアミリ連鎖の溶融温度（Ｔ−）
付近にある。これらの状態において、第１フアミリ連鎖
は第２．３および４フア朶りから分離される。同じ工程
が第２．３および４フアミリの分離に適用される０本発
明の装置は、この熱的連鎖を実施するのにとくに適して
いる。

“ボリメーーゼ　　　応（ＰＣＲ）　　″によるこの技
術はとくに二重ストランドＤＮＡ連鎖のコピー数を増殖
することが可能である。ＰＣＲ理論（Ｒ，に、５ａｉｋ
ｉ　他、１９８５、サイエンス誌２３０号、１３５０−
１３５４　頁）は反応媒体に加えられた初期オリゴヌク
レオチド材料（ＰＩおよびＰ２）から始まる合成の開始
に依存する、ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ活性を使用す
ることである。増殖サイクルは三つの連続した段階から
なっている。すなわち、−且一先一上 ９Ｏ−１００℃における二重ストランドによるＤＮＡ　
の変性、 一１殴−Ｊ４−」− 標的連鎖におけるオリゴヌクレオチドプライマ（１５〜
３５ヌクレオチド）ＰＩおよびＰ２の交雑 ＰＩは（＋）ストランドと交雑し、Ｐ２は（−）ストラ
ンドと交雑する。この段階はＰｌおよびＰ２のＴｍの平
均値に近い温度で実施される。

−量＝−隆一−Ｌ ＤＮＡポリメラーゼの活性のため、プライマＰ１および
Ｐ２の延長による補完的ＤＮＡの合成、この段階は酵素
のもつともよい作用温度、すなわちクレノー・フラグメ
ントに対して３７℃でまたタグ・ポリメラーゼに対して
７２℃、の近くで起こる。

しかして、増殖サイクル後、ＰｌおよびＰ２によって充
放された連鎖数は２倍となり、２サイクル後４倍となり
、３サイクル後８倍となり、１０サイクル後１０２４倍
となり、モして２０サイクル後１，０４８，５７６倍と
なる。−膜内に、拡大の割合はｎサイクル後２１′であ
る。３回の連続した熱段階および１回のＰＣＲ反応より
なる一つの増殖サイクルは、約１０ないし６０サイクル
を要する。各熱段階は一般に１ないし５分継続する。そ
のような技術の自動化はかなりの進歩を現す。

本発明は、サンプル処理用熱サイクルを反復して自動的
に実施する装置を提供するもので、その装置は、処理の
間中物理的に閉鎖されたその中にサンプルが処理の間中
存在する通路を画定する装置、サンプルを前記通路に沿
う異なった位置の間に移動する装置およびサンプルを通
路内の位置の関数として加熱および冷却する装置を備え
ている。

通路を画定する装置は毛細管を含むのが好ましい０毛細
管はプラスチック材料のような半剛性材料から作られ、
は＼’　０．１ｗｓからはＶ４ｍ好ましくははＶｌｎか
ら３ｆｌの小さい直径を有する。そのような小さい内部
断面は大きい熱交換面対容積比を有し、したがって、と
くに通常の０．５〜１．５　ｍｌ管に比較して迅速な温
度変化を可能にする０本発明装置によって処理されるサ
ンプルは通常工ないし５０マイクロリツトルである。

毛細管の種々の空間配置が企画される。たとえば、らせ
ん形、閉鎖ループ形または直線形とすることができる。

らせんの各巻き、閉鎖ループの各巻きまたは直線毛細管
の長い各通路は一つの熱サイクルを現し、その中をサン
プルが４℃から１５０℃の異なった二つ以上の自動温度
調節区域を通過する。１００までの別の熱サイクルはら
せんのつぎの巻き、閉鎖ループのつぎの巻きまたは直線
毛細管の長さに沿う反対方向のサンプルの戻りを含む。

自動温度調節区域は不連続式にまたは連続式に配置され
る。不連続式の場合、各区域は毛細管とだけ交差する物
理的障壁によって分離される。各区域は自律加熱または
冷却区域を有する。

中間区域障壁は各区域を隣接する区域の熱効果から分離
する。連続式において物理的障壁は存在しない０毛細管
は連続したかつ方向性のある熱勾配と交差し、その熱勾
配は液体、ガスまたは固体媒体によって発生される。媒
体の変化は連続したたりし不規則な熱勾配の可能性を生
ずる。

毛細管を通るサンプルの移動速度は処理に顕著な影響が
ある。サンプルがきわめてゆっくりその区域を通るなら
ば、その温度はその区域の温度に達する。サンプルを一
定期間一定区域に停止させ、その温度をその区域の温度
に安定することもできる。反対に、サンプルが迅速に移
動するならばその区域の熱の影響は最少にされまたは抑
制される。

毛細管内のサンプルの移動は異なった方法で得られる。

すなわち、 一可撓壁を有する区域の毛細管に作用する少なくとも一
つのせん動ポンプにより、 三部分、すなわち、磁石および磁石の効果に対応するパ
ーティ　（金属または第２の磁石）よりなる磁気装置に
より、 前記部分の一方は機械的駆動装置に連結され、それを回
転させ（回転式）または並進させる（直線式）、前記部
分の他方は毛細管内側に設けられ、サンプルに固定され
る。この部分は少なくとも一つの固体粒子（小球、シリ
ンダ、液体中の微粒子の懇濁物等）または少なくとも一
つの液体粒子よりなることができる。

一ガスに作用する少なくとも一つのポンプの効果により
、 一活性毛細管作用により、 一毛細管内側の異なった温度のガス質量の接近により発
生したポンプ作用によって 得られる。

サンプルの移動はまたこれらの方法の二つ以上の組合わ
せによっても得られる。サンプルの運動はマイクロプロ
セッサによって制御される。

本発明の装置は毛細管によって現される、半閉鎖式を使
用し、生物学的サンプルを処理する間の分子汚染の危険
を減少する。

以下、本発明を図面に基づいて説明する。

第１ａ〜ＩＣ図には三つの線図が示されている。各図面
は、それぞれ毛細管内の生物学的サンプルが単一の熱サ
イクルを通される三つの自動温度調節区域Ｉ、■および
■を示している。

自動温度調節区域■、■および■は連続的または不連続
的熱勾配によって置換しうる。第１ａ図のらせん形式に
おいて、実施されるのと同じだけの熱サイクルが存在す
る。第１ｂ図の閉鎖ループ型式において、一つのだけの
ループが存在し、各熱サイクルは生物学的サンプルによ
って閉鎖ループの一つの回路からなっている。第１ｃ図
の直線形において第１熱サイクルは左から右へ、すなわ
ち連続して自動温度調節区域！、■および■に、サンプ
ルを通すことにより完成される。第２熱サイクルは左か
ら右への、すなわち連続して自動温度調節区域■、■お
よび■にサンプルを通す戻り通路によって完成される。

奇数の各サイクルは第１のパターンをとり、各偶数の各
サイクルは第２のパターンをとる。サンプルは本質的に
両方向に温度調節区域■を通り１１■、■、■、■、■
、■、■、■、■、■、■・・・の連続を生ずる。しか
しなから、偶数サイクルにおける自動温度調節区域■の
通過は迅速に完了してその効果を最少にすることができ
、区域Ｉおよび■における遅延時間はらせんおよび閉鎖
ループ配置と同じ■、■、■、■、■、■・・・の作用
を達成するように！ＩＩ　ｍされる。

第２図および第３図において、図示の装置は本発明装置
の、生物学的サンプル用磁気変位装置および自動温度ｉ
ｌ１節区域の不連続装置を備えた、閉鎖ループ形式を示
している。

装置は閉鎖ループ形式の毛細管６を備えている０毛細管
６は処理されるサンプル流入用支管ｅ、および処理後の
サンプル除去用支管Ｓを備えている。

キー１３は軸線Ｂ−Ｂに沿って、毛細管６が壁５に押付
けられる半径方向内方位置と、毛細支管ｅおよびＳが要
素１４に押付けられる半径方向外方位置との間に移動し
うる。半径方向内方位置において、毛細管ループ６は遮
断され、支管ｅおよびＳはサンプル出入のため開放され
る。半径方向外方位置において、支管ｅおよびＳは閉鎖
され、サンプルは閉鎖ループ毛細管６の周りを自由に循
環し続ける。キー１３を移動する装置は記載した装置の
外部にあり、図示されていない。

サンプルを閉鎖ループ毛細管６の周りの移動のため、磁
石装置が使用される。これは駆動軸３に固定したアーム
２上に支持された磁石４を有する。駆動軸３は１１にお
いて軸支されかつモータ１２によって付勢される。磁石
２の作用に応動するものは金属性油に懸濁する金属の微
小球によって形式されたパーティである。このパーティ
は毛細管６内にあってサンプルと接触する。

閉鎖ループ毛細管６の周りのサンプルの一回転中、サン
プルは自動温度調節区域７．１５および１６を通過する
。サンプルは当分の間関連する室内の熱の影響をうける
。これらの各室７．１５および１６は４℃と１５０℃と
の間で熱的に調節される。室は調節可能な間隔８によっ
て、取付板９に支持された支柱１０から遮断される。

モータ１２はプログラムしうるマイクロプロセッサの制
御をうけ、サンプルの移動と関連する種々のパラメータ
を一定することができる。

これらのパラメータはサンプルがうける全サイクル数、
サンプルの移動速度および各サイクル中のサンプルの停
止数、位置および時間を含んでいる。マイクロプロセッ
サは毛細管６内のサンプルの実際の温度を連続的に測定
するサーモカップルによって制御される。サンプル運動
の種々のパラメータはマイクロプロセッサのプログラム
された制御によって、測定温度の関数として変更される
。マイクロプロセッサのプログラムされた制御はキー１
３の運動、室７．１５および１６内の温度ならびに入口
および出口支管内のサンプルの移動を制御するぜん動ポ
ンプのような外部装置を支配する。第３図は、それぞれ
毛細管６に関連する三つの別々のキー１３を示す。

【図面の簡単な説明】

第１ａ、１ｂ、ｌｃ図は毛細管のらせん、閉鎖ループお
よび直線的配置を示す本発明装置の路線図であり、第２
図は毛細管が閉鎖ループ形式である本発明装置の第３図
の■−■線に沿う断面図であり、第３図は第２図のｍ−
ｍ線に沿う第２図の装置の断面図である。 ２・・・・・アーム、 ６・・・・毛細管、 １０−・・−・支柱、 １４・−・−要素、 ３・−・−・駆動軸、４−・・−・磁石、５°−・・・
壁、７・・・・温度調節区域９−・・・取付板、１２−
・・・セータ、　　１３−・・・キー１５．１６・・・
温度調節区域 ■ ニＬ五１１Ｃ トー■ ニを五１２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、処理の間中物理的に閉鎖されその中にサンプルが処
   理の間中存在する通路を画定する装置、サンプルを前記
   通路に沿う異なつた位置の間に移動する装置およびサン
   プルを通路内の位置の関数として加熱および冷却する装
   置を備えたサンプル処理用熱サイクルを反復して自動的
   に実施する装置。 ２、前記通路を画定する装置は毛細管を有する請求項１
   に記載の装置。 ３、毛細管が半剛性プラスチックから作られた請求項２
   に記載の装置。 ４、前記毛細管は０．１〜４ｍｍの内径を有する請求項
   ２または３に記載の装置。 ５、前記通路はらせん通路である請求項１ないし４のい
   ずれか一項に記載の装置。 ６、前記通路は閉ループ通路である請求項１ないし４の
   いずれか一項に記載の装置。 ７、前記通路は直線通路である請求項１ないし４のいず
   れか一項に記載の装置。 ８、サンプルを加熱および冷却する装置は前記通路が通
   過する二つ以上の自動温度調節区域を有する請求項１な
   いし７のいずれか一項に記載の装置。 ９、前記自動温度調節区域は不連続的に設けられ、それ
   ぞれ前記通路とだけ交差する物理的障壁によつて分離さ
   れまたそれぞれ自律式加熱または冷却装置を備えた請求
   項８記載の装置。 １０、前記自動温度調節区域は前記通路に沿つて連続的
   に設けられ連続的かつ方向性ある熱勾配を形成する請求
   項８に記載の装置。 １１、熱勾配が不規則である請求項１０に記載の装置。 １２、サンプルを移動する装置がサンプルに隣接する前
   記通路内の磁石群および前記磁石群に作用してそれを従
   つてサンプルを移動させる磁気装置を有する請求項１な
   いし１１のいずれか一項に記載の装置。 １３、前記磁石群は固体磁石またはサンプルと混合しな
   い液体内の磁石微粒子の懸濁物である請求項１２に記載
   の装置。 １４、サンプルを移動する装置はガスに作用するポンプ
   を有する請求項１ないし１１のいずれか一項に記載の装
   置。 １５、サンプルを移動する装置は、前記通路内の異なつ
   た温度のガス状質量の接近によつて発生する熱ポンプ作
   用の効果を有する請求項１ないし１１のいずれか一項に
   記載の装置。 １６、サンプルを移動する装置は、積極的毛細管作用を
   有する請求項２に直接的または間接的に従属する請求項
   ２または３ないし１１のいずれか一項に記載の装置。 １７、サンプルを移動する装置は、ぜん動ポンプを有す
   る請求項３に直接的または間接的に従属する請求項３ま
   たは４ないし１１のいずれか一項に記載の装置。