NL9001772A - Inrichting voor het herhaald automatisch uitvoeren van een thermische cyclus bij de behandeling van monsters. - Google Patents

Description

Inrichting voor het herhaald automatisch uitvoeren van een thermische cyclus bij de behandeling van monsters

De uitvinding heeft betrekking op een inrichting voor het herhaald automatisch uitvoeren van een thermische cyclus bij de behandeling van biologische monsters.

Een dergelijke inrichting heeft talrijke toepassingen in de biologie in het algemeen en in de microbiologie in het bijzonder. In de microbiologie wordt de noodzaak van het behandelen van een biologisch monster bij verschillende temperaturen in het algemeen voorgeschreven door twee biologische basiskenmerken . In de eerste plaats is de biologische activiteit van een enzym sterk afhankelijk van de temperatuur.In het algemeen heeft elk enzym een optimale werkingstemperatuur en neemt de activiteit geleidelijk af wanneer men zich van deze temperatuur verwijdert. Curves die de variaties tonen in biologische activiteit als functie van de temperatuur kunnen derhalve worden verkregen en vormen een belangrijk kenmerk van elk enzym. In de tweede plaats houdt de moleculaire hybridisatiereac-tie tussen twee nucleinezuursequenties direkt verband met de temperatuur. Deze hybridisatie die gebaseerd is op de complementariteit van de basen tussen twee sequenties kan optreden tussen twee deoxyribonucleinezuur(DNA)moleculen, tussen twee ribonucleinezuur(RNA)moleculen of tussen een DNA-molecuul en een RNA-molecuul. Door moleculaire hybridisatie kan men ofwel paring door vorming van waterstofbrug-gen tussen twee afzonderlijke moleculen ofwel inter-moleculaire paring tussen twee complementaire sequenties krijgen. In het laatste geval is er sprake van de vorming van een zogenaamde secundaire structuur van DNA- of RNA-moleculen. Het effect van de temperatuur op de hybridisa-tiereactie is essentieel en elke DNA- (of RNA)-sequentie wordt door zijn Tm gedefinieerd, dat is de temperatuur waarbij 50% van de sequenties gepaard zijn met complementaire sequenties. De Tm van een bepaalde sequentie wordt experimenteel vastgesteld door met spectrofotometrie de hyper chromiciteit bij 260 nm te volgen , waarmee het uiteengaan (of denatureren) van twee complementaire DNA-sequenties gepaard gaat. Het geheel van de DNA-sequenties is bij hoge temperatuur (100°C) in de enkelstrengsvorm en bij lage temperatuur (10-20°C) in de dubbelstrengsvorm.

De Tm van een DNA-sequentie hangt voornamelijk af van de volgende twee parameters: de basenvolgorde en de ionensterkte van het medium. De Tm varieert gewoonlijk tussen 20 en 85°C. Het merendeel van de moleculaire reacties kan derhalve worden uitgevoerd in nauwkeurig gedefinieerde en geregelde thermische omstandigheden. Sommige van deze reacties vereisen het opeenvolgende gebruik van verschillende temperaturen en kunnen in de inrichting volgens de uitvinding worden bewerkstelligd. Het betreft hier in het bijzonder hydrolyse met restrictie-enzymen, modificatiereacties van DNA met enzymen, enzymatische reacties in cascade, het isoleren van repetitieve DNA-sequentiefamilies en het vermenigvuldigen met de "polymerase kettingreactie". Deze toepassingen zullen thans uitvoeriger worden besproken.

Hydrolyse van DNA met restrictie-enzymen

Met een restrictie-enzym kan men een DNA/DNA hybridisatieduplex knippen op een zeer specifieke plaats welke door de sequentie wordt gedefinieerd. Voor de meeste van deze enzymen is de temperatuur voor de maximale activiteit 37°C. De incubatietijd van DNA met het enzym bij 37°C varieert tussen 30 min en verscheidene uren. Een eenvoudige methode voor het desactiveren van het enzym bestaat derhalve uit het incuberen van het monster gedurende verscheidene minuten bij 100°C, een temperatuur waarbij het enzym irreversibel wordt gedenatureerd. Deze behandeling is even doeltreffend bij het denatureren van DNA dat terugkeert tot de dubbelstrengsvorm indien het wordt onderworpen aan geleidelijke verlaging van de temperatuur van 110°C tot 20°C. Door plotseling afkoelen van het monster kan geen correcte renaturering van het DNA worden bereikt. Geleidelijk afkoelen kan in het bijzonder in trappen verlopen.

Veralgemenisering van het stel enzymbehandelingen van DNA en RNA

Deze methode die van toepassing is op restrictie-enzymen kan worden aangepast voor de behandeling met vele enzymen, zoals : - polynucleotide-kinases - ligases - het eindstandige deoxynucleotidyl-transferase - DNA- en RNA-polymerases - endonucleases en exonucleases

Enzymatische behandeling in cascade

Veel opeenvolgende enzymatische behandelingen kunnen nodig zijn om één of meer gedefinieerde DNA-sequen-ties te verkrijgen. Een verandering van het reactiemedium tussen twee enzymatische reacties is in het algemeen noodzakelijk.

Isolatie van repetitieve DNA-sequentiefamilies DNA-sequenties komen in grote aantallen voor in complexe genomen (menselijk genoom = 3,5 x 109 baseparen). Het is mogelijk om verschillende repetitieve sequen-tiefamilies te onderscheiden als een functie van het aantal sequentiekopieën per genoom. Zo worden DNA-genomen die door warmte volledig gedenatureerd zijn in trappen en op selectieve wijze hersteld. De hoogrepetitieve sequenties worden eerst hersteld (familie 1) , daarna de middelrepetitieve sequenties (familie 2), vervolgens de nauwelijks repetitieve sequenties (familie 3) en tenslotte de unieke sequenties (familie 4).Het is derhalve mogelijk om deze verschillende families te isoleren door het monster te leiden over affiniteitskolommen van het hydroxyapatiet-type, waardoor enkelstrengige DNA-moleculen kunnen worden gescheiden van dubbelstrengige DNA-moleculen. Zij worden over de kolommen geleid bij een nauwkeurige temperatuur tijdens de trapsgewijze afkoeling van het monster. De temperatuur van de eerste kolom is ongeveer de smelttemperatuur (Tm) van de sequenties van familie 1. Onder deze omstandigheden kunnen de sequenties van familie 1 worden gescheiden van sequenties van de families 2, 3 en 4. Dezelfde methode wordt toegepast voor het scheiden van de families 2, 3 en 4. De inrichting volgens de uitvinding is bijzonder geschikt voor het uitvoeren van deze thermische cyclus.

Vermenigvuldiging van het aantal DNA-sequenties door "Polymerase kettingreactie" (PCR)

Met deze techniek kan men specifiek het aantal kopieën van een dubbelstrengs DNA-sequentie vermenigvuldigen . Het principe van PCR (R.K. Saiki et al, Science, 230. 1985, 1350-1354) is het gebruik van de activiteit van het DNA-afhankelijke DNA-polymerase dat met de synthese begint vanaf oligonucleotide beginmateriaal (PI en P2) dat aan het reactiemedium wordt toegevoegd. Een vermenigvuldigingscyclus bestaat uit drie opeenvolgende trappen: - Trao 1

Denatureren van het dubbelstrengs DNA bij 90-100°C.

- Trap 2

Hybridisatie van oligonucleotide-primers (15-35 nucleoti-den) PI en P2 op de doelwitsequenties.

PI hybridiseert met de (+) streng en P2 hybridi-seert met de (-) streng. Deze trap wordt uitgevoerd bij een temperatuur die ligt in de buurt van het gemiddelde van de Tm*s van PI en P2.

- Trap 3

Synthese van de complementaire DNA-streng door verlenging van de primers PI en P2 dankzij de activiteit van een DNA-polymerase. Deze trap verloopt in de buurt van de optimale werkingstemperatuur van het enzym, ofwel bij 37°C voor het Klenow-fragment ofwel bij 72°C voor het Taq-polymerase.

Zo is het aantal sequenties tussen PI en P2 na een cyclus vermenigvuldigd met 2, na twee cycli vermenigvuldigd met 4, na drie cycli vermenigvuldigd met 8, na tien cycli vermenigvuldigd met 1024 en na 20 cycli vermenigvuldigd met 1.048.576. In het algemeen bedraagt de vermenigvuldiging na n cycli 2n. Een vermenigvuldigingscyclus bestaat derhalve uit drie opeenvolgende thermische trappen en één volledige PCR-reactie vereist ongeveer 10 tot 60 cycli. Elke thermische trap duurt in het algemeen 1 tot 5 min. Het automatiseren van een dergelijke techniek vormt derhalve een aanzienlijke vooruitgang.

De uitvinding voorziet in een inrichting voor het herhaald automatisch uitvoeren van een thermische cyclus bij de behandeling van een monster, welke inrichting organen omvat die een baan definiëren welke fysisch gesloten is tijdens de behandeling en waarbinnen het monster tijdens de behandeling verblijft, organen voor het bewegen van het monster tussen verschillende posities langs de baan , en organen voor het verwarmen en afkoelen van het monster als functie van zijn positie langs de baan.

De organen die de baan definiëren bestaan bij voorkeur uit een capillaire buis. Deze kan van een halfstijf materiaal zoals kunststof zijn en kan een kleine diameter hebben, van ongeveer 0,1 mm tot ongeveer 4 mm, bij voorkeur van 1 tot 3 mm. Een dergelijke kleine inwendige doorsnede waarborgt een grote verhouding van warmteuitwis-selingsoppervlak tot volume en maakt dan ook snelle tem-peratuurvariaties mogelijk,in het bijzonder vergeleken met een monster in een conventionele buis van 0,5 tot 1,5 ml.Het monster dat in de inrichting volgens de uitvinding wordt behandeld heeft gewoonlijk een volume van 1 tot 50 μΐ.

Verschillende ruimtelijke opstellingen van de capillaire buis worden beoogd. De buis kan bijvoorbeeld een spiraalvorm, een gesloten kringloopvorm of een rechtlijnige vorm hebben. Elke omwenteling van de spiraal, elke omwenteling van de gesloten kringloop of elke passage van de lengte van de lineaire capillaire buis vormt één thermische cyclus, waarin het monster door twee of meer door een thermostaat geregelde zones gaat, bij verschillende temperaturen van 4 tot 150°C. Verdere thermische cycli , tot 100, worden gevormd door de volgende omwenteling van de spiraal, nog een omwenteling in de gesloten kringloop of de terugkeer van het monster in omgekeerde richting door de lengte van de rechtlijnige capillaire buis.

De door een thermostaat geregelde zones kunnen opgesteld zijn in een discontinu systeem of in een continu systeem. In een discontinu systeem zijn de zones gescheiden door een fysische barrière, waar slechts de capillaire buis doorheen steekt. Elke zone heeft een autonoom verwarmings-of koelsysteem. De barrière tussen de zones isoleert elke zone van het thermische effect van de aangrenzende zone(s). In een continu systeem is er geen fysische barrière. De capillaire buis doorloopt een continue en gerichte thermische gradiënt, die in een vloeibaar, gasvormig of vast medium kan worden gevormd. Een verandering van medium geeft de mogelijkheid van een continue maar onregelmatige thermische gradiënt.

De snelheid van het monster door de capillaire buis heeft een sterk effect op de behandeling. Indien het monster zeer langzaam door een zone beweegt , zal de temperatuur daarvan de zonetemperatuur benaderen of daaraan gelijk worden. Het monster kan zelfs in een bepaalde zone gedurende een vastgestelde periode worden gestopt, waardoor zijn temperatuur zich stabiliseert tot die van de zone. Indien het monster aan de andere kant snel door een zone beweegt , kan het thermische effect van die zone op het monster tot een minimum worden beperkt of onderdrukt.

De beweging van het monster in de capillaire buis kan op verschillende manieren worden verkregen: - door tenminste één peristaltische pomp die op een capillaire zone met een buigzame wand werkt; - door verplaatsing in een magnetisch systeem bestaande uit twee delen: een magneet en een deel dat beantwoordt aan de werking van de magneet (metalen deel of tweede magneet); - Eén van de delen is vast verbonden met een mechanisch aandrijfsysteem waardoor het kan roteren (cirkelvormig systeem) of verplaatst kan worden (lineair systeem). Het andere deel is binnen de capillaire buis gelegen en is vast verbonden met het monster. Dit deel kan bestaan uit tenminste één vast deeltje (bolletje, cylinder, suspensie van microscopisch kleine deeltjes in een vloeistof, enz.) of tenminste één vloeistofdeeltje.

- door de werking van tenminste één pomp die op een gas werkt; - door passieve capillaire werking; - door de werking van thermisch pompen dat gecreëerd wordt door de nabijheid van gasmassa's met verschillende temperaturen in de capillaire buis.

De beweging van het monster kan ook worden verkregen door een combinatie van twee of meer van deze processen. De beweging van het monster kan geregeld worden door een microprocessor.

In de inrichting volgens de uitvinding wordt een half-gesloten systeem gebruikt , dat gevormd wordt door de capillaire buis, waardoor het risico van moleculaire verontreiniging tijdens behandeling van het biologische monster wordt verminderd.

De uitvinding wordt toegelicht aan de hand van de tekeningen, waarvan : de figuren la, lb en lc schematische diagrammen van de inrichting volgens de uitvinding zijn , die respectievelijk de spiraalvormige, gesloten kringloop en lineaire opstellingen van de capillaire buis weergeven ; Fig. 2 is een doorsnede volgens de lijn II-II van Fig. 3 van een inrichting volgens de uitvinding waarin de capillaire buis een gesloten kringloopvorm heeft; en

Fig. 3 is een doorsnede van de inrichting van Fig. 2 volgens de lijn III-III van Fig. 2.

In Fig. la-c zijn drie schematische diagrammen weergegeven . In elk diagram zijn drie door een thermostaat geregelde zones I, II en III aanwezig waardoorheen het biologische monster in de capillaire buis in een enkele thermische cyclus loopt. De thermostatische zones I, II en III kunnen worden vervangen door een continue of discontinue thermische gradiënt. In de spiraalvorm van Fig.la zijn evenveel windingen aanwezig als de thermische cycli die uitgevoerd moeten worden. In de gesloten kringloopvorm van Fig. lb is slechts één winding aanwezig en elke thermische cyclus bestaat uit één doorstroming door het biologische monster van de gesloten kringloop. In de lineaire vorm van Fig.lc wordt de eerste thermische cyclus voltooid door de passage van het monster van links naar rechts, d.w.z. achtereenvolgens door de door een thermostaat geregelde zones I, II en III. De tweede thermische cyclus wordt voltooid door de omgekeerde passage van het monster van rechts naar links, dat wil zeggen door achtereenvolgens de door een thermostaat geregelde zones III, II en I. Elke oneven genummerde cyclus volgt het patroon van de eerste cyclus en elke even genummerde cyclus volgt het patroon van de tweede cyclus. Opgemerkt wordt dat het monster door de thermostatische zone II in elke richting loopt, waardoor een opeenvolging van thermostatische zones I, II, III, III, II, I, I, II, III, III, II, I---- wordt verkregen. De passage door de door een thermostaat geregelde zone II bij de even cycli kan echter snel worden voltooid om het effect daarvan tot een minimum terug te brengen, en de verblijftijden in de zones I en III kunnen zodanig worden ingesteld dat hetzelfde I, II, III, I, II, III, I, II, III. effect als in de spiraalvormige en gesloten kringloopopstellingen wordt bereikt.

In de Figuren 2 en 3 is een gesloten kringloopvorm van de inrichting volgens de uitvinding weergegeven, met een magnetisch verplaatsingssysteem voor het biologische monster en een discontinu systeem van door een thermostaat geregelde zones.

De inrichting is voorzien van een capillaire buis 6 in de vorm van een gesloten kringloop. De capillaire buis 6 is voorzien van een aftakking e voor het binnenlaten van het te behandelen monster en van een aftakking s voor het verwijderen van het monster na behandeling.

Een wig 13 is beweegbaar langs de as B-B tussen een positie radiaal naar binnen, waarbij de capillaire buis 6 wordt gedrukt tegen een wand 5, en een positie radiaal naar buiten, waarbij de capillaire aftakkingen e en s tegen de elementen 14 worden gedrukt. In de positie radiaal naar binnen is de capillaire kringloop 6 onderbroken en zijn de aftakkingen e en s open voor het binnenlaten en verwijderen van het monster. In de positie radiaal naar buiten zijn de aftakkingen e en s gesloten en is het monster vrij om verder door de gesloten kringloop van buis 6 rond te stromen. De organen voor het bewegen van de wig 13 bevinden zich aan de buitenzijde van de beschreven inrichting en zijn niet weergegeven in de tekeningen.

Voor het bewegen van het monster door de gesloten capillaire kringloop 6 wordt een magnetisch systeem gebruikt. Dit bestaat uit een magneet 4 op een arm 2 welke vastzit aan een drijfas 3. De drijfas 3 zit in een asblok 11 en wordt aangedreven door een motor 12. Beantwoordend aan de werking van de magneet 4 is een partij welke gevormd wordt door metalen microscopisch kleine bolletjes gesuspendeerd in minerale olie. Deze partij bevindt zich in de capillaire buis 6 in aanraking met het monster.

Tijdens één wenteling van het monster door de gesloten capillaire kringloop 6 gaat het monster dicht langs de thermostatische compartimenten 7, 15 en 16. Het monster staat onder de thermische invloed van het compartiment ten opzichte waarvan het zich op dat ogenblik bevindt. Elk van deze compartimenten 7, 15 en 16 wordt door een thermostaat geregeld op een temperatuur tussen 4 en 150°C. De compartimenten zijn geïsoleerd van een band 10 op een montageplaat 9 door een instelbare tussenruimte 8.

De motor 12 staat onder controle van een programmeerbare microprocessor welke verschillende parameters mogelijk maakt die verband houden met de beweging van het monster. Deze parameters zijn onder meer het totale aantal cycli waaraan het monster wordt onderworpen, de snelheid van de monsters en het aantal , de positie en de duur van de stopzettingen van het monster tijdens elke cyclus. De microprocessor is via een interface verbonden met een thermokoppel dat continu de feitelijke temperatuur van het monster in de capillaire buis 6 meet. De verschillende bewegingsparameters van het monster kunnen derhalve worden gevarieerd als functie van de meettemperatuur, onder de geprogrammeerde controle van de microprocessor. De microprocessor onder de geprogrammeerde controle kan ook de beweging van de wiggen 13 regelen alsmede de temperatuur in de compartimenten 7, 15 en 16 en uitwendige inrichtingen, zoals een peristaltische pomp, die de beweging van het monster in de ingang en uitgang regelen. Fig. 3 toont drie onafhankelijke wiggen 13 die elk verbonden zijn met een capillaire buis 6.

Claims (17)

1. Inrichting voor het herhaald automatisch uitvoeren van een thermische cyclus voor de behandeling van een monster,met het kenmerk, dat de inrichting organen omvat die een baan definiëren welke fysisch gesloten is tijdens de behandeling en waarbinnen het monster tijdens de behandeling verblijft, organen voor het bewegen van het monster tussen verschillende posities langs de baan en organen voor het verwarmen en afkoelen van het monster als functie van zijn positie langs de baan.

2. Inrichting volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de organen die de baan definiëren bestaan uit een capillaire buis.

3. Inrichting volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de capillaire buis van een half-stijf kunststof materiaal is vervaardigd.

4. Inrichting volgens conclusie 2 of 3, met het kenmerk, dat de capillaire buis een inwendige middellijn van 0,1 tot 4 mm heeft.

5. Inrichting volgens één van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de baan een spiraalvorm heeft.

6. Inrichting volgens één van de conclusies 1 tot 4, met het kenmerk, dat de baan een gesloten kringloopvorm heeft.

7. Inrichting volgens één van de conclusies 1 tot 4, met het kenmerk, dat de baan een rechtlijnige vorm heeft.

8. Inrichting volgens één van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de organen voor het verwarmen en afkoelen van het monster bestaan uit twee of meer door een thermostaat geregelde zones waar de baan doorheen loopt.

9. Inrichting volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de door een thermostaat geregelde zones op een discontinue wijze zijn opgesteld, elke zone gescheiden is van de volgende door een fysische barrière waar slechts de baan doorheen steekt en elke zone voorzien is van een autonoom verwarmings- of koelsysteem.

10. Inrichting volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat de door een thermostaat geregelde zones op een continue wijze zijn opgesteld langs de baan waardoor een continue en gerichte thermische gradiënt wordt verschaft.

11. Inrichting volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat de thermische gradiënt onregelmatig is.

12. Inrichting volgens één van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de organen voor het bewegen van het monster bestaan uit magnetische organen omvattende een magnetisch deel binnen de baan en grenzend aan het monster en een uitwendige magneet welke op het magnetische deel werkt zodat dit deel en derhalve ook het monster wordt bewogen.

13. Inrichting volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het magnetische deel bestaat uit een magneet uit één stuk of een suspensie van magnetische microscopisch kleine deeltjes in een vloeistof welke niet mengbaar is met het monster.

14. Inrichting volgens één van de conclusies 1 tot 11, met het kenmerk, dat de organen voor het bewegen van het monster bestaan uit een pomp welke werkt op een gas.

15. Inrichting volgens één van de conclusies 1 tot 11, met het kenmerk, dat de organen voor het bewegen van het monster bestaan uit het effect van thermisch pompen dat gecreëerd wordt door de nabijheid van gasmassa's met verschillende temperaturen binnen de baan.

16. Inrichting volgens één van de conclusies 2 tot 11, met het kenmerk, dat de organen voor het bewegen van het monster bestaan uit passieve capillaire werking .

17. Inrichting volgens één van de conclusies 3 tot 11, met het kenmerk, dat de organen voor het bewegen van het monster bestaan uit een peristaltische pomp.