PT94037B - Processo para a preparacao de factor de crescimento epidermico (epidermal growth factor) e de composicoes farmaceuticas que o contem

Info

Description

Claims

PT94037B

Publication number: PT94037B
Application number: PT94037A
Authority: PT
Inventors: John K Cini; Amy L Finkenaur
Original assignee: Ethicon Inc
Priority date: 1989-05-16
Filing date: 1990-05-15
Publication date: 1996-11-29
Also published as: DE69002795T2; JPH0334992A; EP0398619A3; DK0398619T3; CA2016659A1; CA2016659C; GR900100334A; KR900017580A; AU5496890A; ES2058799T3; JP2763815B2; AU630952B2; DE69002795D1; US5130298A; EP0398619A2; EP0398619B1; PT94037A; GR1000392B

DESCRIÇÃO

DA

PATENTE DE INVENÇÃO

N.°

037

REQUERENTE: ETHICON, INCnorte-americana,industrial e comercial, estabelecida em U.S. Route 22, Somerville, New Jersey 08876, Estados Uni dos da América.

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE FACTOR DE

CRESCIMENTO EPIDÉRMICO (EPIDERMAL GRCWTH FACTOR) E DE COMPOSIÇQES FARMACÊUTICAS ESTABILIZADAS QUE 0 CONTÉM ··

INVENTORES: John K. Cini e Amy L. Finkenaur.

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.

E.U.A. em 16 de Maio de 1989, sob o n^s..

353,131.

INPl MOD 113 RF 16732

Descrição referente ã patente de invenção de ETHICON, INC., norte -americana, industrial e comercial, estabelecida em U.S. Route 22, Somerville, New Jersey 08876, Estados Unidos da América, (inventores: John K. Cini e Amy L. Finkenaur, residentes nos Estados Unidos da América), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE

FACTOR DE CRESCIMENTO EPIDfiRMICO (EPIDERMAL GROWTH FACTOR) E DE

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ESTABILIZADAS QUE 0 CONTEM.

DESCRIÇÃO

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas que contêm o factor de crescimento epidér mico (epidermal growth factor = EGF) e a um processo para a preparação e utilização destas composições. Em particular, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas que possuem uma estabilidade aumentada como resultado de possuírem na sua composição um catião de um metal, como por exemplo o zinco.

O EGF (também conhecido como urogastro na) é um factor de crescimento polipeptídico de 53 ácidos aminados que possui actividade mitogénica para vários tipos de cê

I

lulas, incluindo as células epiteliais e mesenquimais. Têm sido descritas variantes do EGF humano, como por exemplo a gama-urogastrona de 52 ácidos aminados. Foi descrito que o EGF é útil para o aumento da velocidade de cicatrização de feridas em virtude do seu efeito mitogénico. Foi também descrito que o EGF é útil para o tratamento de úlceras gástricas. Encontra-se publicada uma revisão sobre o EGF por Carpenter et al. em Epjl dermal Growth Factor, Its Receptor and Related Proteins, Expe rimental Cell Research, 164:1-10 (1986).

O desenvolvimento de uma formulação de EGF estável que possua uma duração elevada em armazenagem e que seja capaz de se conservar durante longos períodos apresen tando uma única espécie de EGF predominantemente activa é um importante objectivo na utilização terapêutica do EGF. No entanto, em virtude da instabilidade inerente do EGF, têm sido encontradas dificuldades no desenvolvimento de uma formulação de EGF estável como a descrita. Por exemplo, o EGF perde a actividade biológica na presença de humidade. A Patente U.S. NQ.

717 717 descreve composições e métodos de estabilização do EGF contra esta perda de actividade biológica. Também o EGF hu mano perde actividade ao longo do tempo e dã origem a múltiplas espécies da molécula de EGF, as quais têm sido identificadas por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Pensa-se que estas espécies múltiplas de EGF sejam produtos de decomposição que resultam da degradação do EGF ou derivados que resul. tam da modificação química do EGF. Supõe-se que hã pelo menos três destes produtos de degradação, possuindo alguns ou todos actividade biológica de EGF reduzida. A incubação do EGF a 45Q C acelera a formação dos produtos de degradação normalmente en contrados após armazenamento durante longos períodos à tempera tura ambiente. Esta degradação e a perda de actividade biológi ca do EGF associada constituem uma desvantagem porque tornam pouco prática a armazenagem de preparados líquidos ou sólidos de EGF durante períodos longos.

A presente invenção proporciona um meio para a redução da degradação da molécula de EGF e a perda de actividade biológica resultante.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona una composição farmacêutica que contém uma quantidade farmacêutica mente eficaz de factor de crescimento epidérmico (EGF) humano e uma quantidade de um catião de um metal farmaceuticamente aceitável suficiente para evitar a degradação do referido EGF. Numa forma de concretização preferida o catião de um metal é o ião de zinco divalenfe. Também é proporcionada uma composição de EGF cristalino que contém um sal de um complexo de zinco e EGF que se encontra estabilizado contra a degradação e a perda de actividade biológica. A presente invenção proporciona ainda um processo para a estabilização de EGF por mistura do EGF com um catião de um metal adequado que possui a capacidade de evitar a degradação do EGF.

DESCRIÇÃO BREVE DA FIGURA

A Figura 1 é um cromatograma que apresenta a relação dos picos de EGF C, D, X e Y após análise de uma solução de EGF envelhecida por HPLC de fase invertida.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Por EGF humano designa-se o EGF com a sequência polipeptídica definida em Urdea, M. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80;6461-6465 (1983) ou qualquer porção substancial desta sequência. 0 EGF humano também se refere aos variantes do EGF humano, como por exemplo a gama-urogastrona.

EGF pode ser isolado a partir de origens naturais, pode ser produzido por técnicas de ADN recombinante ou pode ser prepara do por síntese química. Considera-se que podem ser utilizados na presente invenção fragmentos biologicamente activos, análogos ou derivados artificiais preparados por síntese química do EGF no lugar da molécula completa de ocorrência natural, desde que estes fragmentos, análogos ou derivados conservem a activi

dade biológica do EGF de ocorrência natural. A actividade biológica do EGF refere-se ãs actividades mitogênicas para as células epiteliais e mesenquimais e à inibição da secreção do ãcido gástrico. No significado que lhe é dado na presente memõ ria descritiva, a designação EGF inclui o EGF preparado por qualquer dos métodos anteriormente mencionados e quaisquer fragmentos, análogos ou derivados bioactivos e polipeptídeos relacionados.

termo análogo de EGF refere-se a qualquer polipeptídeo que possua uma sequência de ácidos amina dos substancialmente idêntica à do EGF em que um ou vários ãci^ dos aminados tenham sido substituídos por ácidos aminados quimicamente semelhantes. O termo análogo inclui também qualquer polipeptídeo que possua um ou vários ácidos aminados suprimidos ou adicionados em relação ao polipeptídeo do EGF mas que ainda conserva uma homologia substancial com a sequência de ácidos aminados do EGF. Uma homologia substancial é qualquer homologia superior a 50%. 0 termo fragmento de EGF refere-se a qualquer versão encurtada do EGF que contenha pelo menos 10 resíduos de ácidos aminados e que possua a mesma bioactividade do EGF. A expressão derivado químico refere-se a qualquer po lipeptídeo derivado de um polipeptídeo de ocorrência natural do EGF em que um ou vários ácidos aminados tenham sido derivatizados por síntese química por reacção de grupos laterais fun cionais dos ácidos aminados (isto é, derivado da molécula progenitora de EGF por meio de uma ou várias fases de transformação) .

Uma quantidade farmaceuticamente eficaz de EGF refere-se a uma quantidade que proporcione um efe7 to terapêutico em vários regimes de administração. Por exemplo quando usado com a finalidade de cicatrização de feridas é a quantidade que é necessária para melhorar a velocidade de cica trização de uma ferida. As composições da presente invenção po dem ser preparadas por incorporação de quantidades de EGF na gama desde cerca de 0,01 até cerca de 1000 microgramas por ml de uma formulação aquosa. De preferência, a concentração situa -se na gama de 1 a 500 microgramas por ml e de modo especial4

mente preferido na gama de 1 a 100 microgramas por ml.

Conforme mencionado anteriormente, o EGF degrada-se ao longo do tempo dando origem a várias espécies da molécula de EGF que se pensa serem produtos de degradação. A degradação do EGF refere-se ao processo de envelhecimen to natural no qual a estrutura molecular da molécula de EGF que ê usada para material de partida (por exemplo a forma de 53 ácidos aminados ou uma variante desta) é: (a) modificada quimicamente para formar uma variante de EGF como resultado de uma reacção química de ocorrência natural ou induzida pelo ambiente como por exemplo isomerização, oxidação ou desaminação; ou (b) degradada ou decomposta em moléculas de menores dimensões. Esta degradação ocorre naturalmente como resultado de factores ambientais, como a luz, que pode causar foto-oxidação; alterações do pH; mudanças na força iônica; alterações da temperatura; e manipulação física da molécula. Foram identificados até agora três destes produtos de degradação. A Figura 1 apresenta um cromatograma de HPLC do EGF que mostra o EGF nati. vo, designado por Pico D, juntamente com três produtos de degradação designados por picos C, X e Y. O EGF estabilizado cor re predominantemente num único pico (Pico D) em HPLC de fase invertida. Os produtos de degradação principais do EGF parecem ser os representados pelos picos X e Y. Provou-se que a presen te invenção reduz a formação dos picos X e Y, contribuindo de_s te modo para a conservação de uma única espécie predominantemente activa de EGF, isto é, mais de 90% do material de partida conserva-se inalterado.

Deverã ter-se em conta que os presentes métodos podem também ser usados a fim de estabilizar outras proteínas através do bloqueio de resíduos de ácidos aminados activos com ligações de zinco. Estas outras proteínas incluem as proteínas cujos resíduos de ácidos aminados no interior da estrutura proteica têm uma acção de estabilização dum produto de degradação, como seja um intermediário isomerizado. Estas outras proteínas também incluem as que possuem domínios de ácjL dos aminados semelhantes a EGF, como sejam outros factores de crescimento, por exemplo o factor de crescimento de fibroblastos .

Foi anteriormente descrito que certas concentrações de zinco exercem um efeito estabilizador em solu ções neutras de insulina (ver U.S. 4 476 118; e Lougheed, W.D. et al., Diabetologia 19;1-9 (1980)). No entanto, o zinco não era usado para evitar a degradação (no sentido que é dado a e£ te termo na presente memória descritiva) da molécula de insuljL na mas sim para evitar a precipitação de insulina agregada a partir da solução. A insulina tem uma tendência para se agregar de modo heterogéneo e para formar agregados de peso molecu lar mais elevado, como por exemplo o hexâmero de insulina, que não é muito solúvel e tende a precipitar a partir da solução.

O zinco estabiliza a forma menos solúvel da insulina em hexâ mero tornando-a mais solúvel. As primeiras referências que de£ crevem este efeito de estabilização do zinco usavam o termo estabilização para referir o aumento de solubilidade e não a degradação, uma vez que não tinha sido descrita qualquer diminuição da actividade da insulina com o tempo. O zinco também tem sido usado como metal promotor de cristalização para a insulina e para a formação de cristais zinco-insulina (ver U.S.

764 592) .

De acordo com o significado que lhes é dado na presente memória descritiva, os termos zinco, catião de zinco ou ião de zinco referem-se todos ao ião de zinco divalente. Se bem que a presente invenção seja exemplificada por meio da utilização do catião de zinco divalente, deverá notar-se que outros catioes adequados podem ter o mesmo efeito. Estes catioes adequados devem ser farmaceuticamente aceitáveis , o que significa que estes catioes não são tóxicos para seres humanos e não possuem efeitos secundários nocivos ou indesejáveis quando administrados a seres humanos, como por exem pio inflamações ou reacções imunológicas. Estes catioes adequa dos não devem causar a degradação do EGF, mas devem pelo contrário possuir uma capacidade de evitar esta degradação. Deste modo, estes catiões não devem causar ou induzir a formação de radicais livres. Além disso, os catiões não devem afectar de modo adverso as propriedades biológicas do EGF mas ao contrário devem conservar estas propriedades. Deste modo, um catião ade6

I

quado é um catião que é farmaceuticamente aceitável, não causa a formação de radicais livres e possui propriedades de evitar a degradação do EGF e de manter a actividade biológica do EGF. Deve notar-se que qualquer catião monovalente, divalente ou trivalente que possua estas propriedades se encontra abrangido no âmbito da presente invenção. Verificou-se que o lantânio (trivalente) forma um precipitado cristalino com o EGF. Não são adequados os catioes dos metais seguintes porque provocam a formação de radicais livres: manganês, cobre, ferro e cobalto. Outros catioes que podem ser adequados são os de magnésio, cálcio, cádmio, níquel, estanho, potássio e lítio.

De acordo com o significado que lhe é dado na presente memória descritiva, zinco-EGF ou complexo zinco-EGF refere-se a um ião complexo no qual o zinco se encontra ligado por coordenação ao EGF. Em soluções aquosas, o complexo zinco-EGF deve ser conservado numa gama de pH de 4,0 a 7,0, de preferência entre 5,5 e 6,0. Fora desta gama o complexo zinco-EGF dissocia-se em EGF monomérico e catião zinco. Deste modo, é preferido que as soluções aquosas de zinco-EGF sejam tamponizadas a fim de manter o pH entre os valores referidos. Qualquer sistema tampão que mantenha o pH na gama de 4,0 a 7,0, de preferência de 5,5 a 6,0, é adequado, desde que o contraião presente no tampão dão forme um quelato com o zinco ou cause de qualquer outro modo uma precipitação deste a partir da solução. Por exemplo, os sistemas tampões que contêm fosfato ou carbonato não são adequados porque provocam a prec_i pitação do zinco. São sistemas tampões adequados os sistemas baseados nos seguintes contraiões: acetato, succinato, cloreto sulfato, tartarato, malato, maleato e outros semelhantes. Um sistema tampão preferido é o sistema tampão de acetato. Numa forma de concretização preferida, adiciona-se acetato de zinco a uma solução de EGF a fim de estabilizar o EGF. 0 acetato de zinco possui a acção dupla de proporcionar iões de zinco para se ligarem ao EGF e contraiões de acetato para manter o pH entre os limites preferidos. Em alternativa, se se usa outro sal solúvel de zinco como o cloreto de zinco, então deve utilizar-se também um tampão.

Foi determinado que a estabilidade máxima do EGF é obtida quando se adiciona cerca de 10 a 20 mM de catião de zinco a uma solução aquosa de EGF que tem uma concen tração de cerca de 250 microgramas por ml. Deste modo, nas com posições preferidas da presente invenção utiliza-se zinco 10 a 20 mM para cada 250 microgramas de EGF/ml. Estas quantidades podem ser feitas variar pelo especialista na matéria em função da quantidade de EGF a ser estabilizada ou da quantidade de Zn_ -EGF cristalino que se pretende. Por exemplo, um aumento da concentração de EGF tornará necessário um aumento da quantidade de zinco proporcionalmente. Quantidades superiores de zinco, como por exemplo até 50 mM para cada 250 microgramas de EGF/ml, podem também ser usadas a fim de assegurar uma reacção completa. Quantidades mais baixas de zinco, como por exemplo 5 a 10 mM, podem também ser usadas mas é possível que nem todo o EGF seja estabilizado. A execução destas variações estão ao alcance do especialista na matéria.

A presente invenção também proporciona uma composição de EGF cristalino que contém um sal de um complexo de zinco e EGF, que possui a vantagem de poder ser armazenada durante longos períodos. O catião do sal de zinco-EGF pode ser qualquer catião que conduza ã formação de um sal de zinco-EGF, como por exemplo sódio, potássio, lítio, cãlcio, amónio, magnésio ou bário. Conforme anteriormente mencionado, o complexo zinco-EGF precipita da solução desde que o pH esteja entre os limites de 4,0 e 7,0. Fora destes limites o comple xo dissocia-se. O EGF deve estar dissociado a fim de ter um efeito biológico in vivo. Deste modo, o zinco-EGF, sob forma j aquosa ou cristalina, pode ser aplicado directamente a uma feri da ou a outra superfície biológica a fim de proporcionar uma formulação de libertação lenta de EGF. O pH fisiológico dos fluidos corporais, isto é, a um pH próximo da neutralidade, causam a dissociação lenta do zinco-EGF libertando EGF monomérico.

O zinco-EGF cristalino pode ser preparado de vários modos. Em geral, adiciona-se um sal de zinco so lúvel, como por exemplo acetato de zinco ou cloreto de zinco,

a uma mistura aquosa de EGF. Se necessário, ajusta-se o pH para que se situe entre os limites de 4,0 a 7,0, de preferência de 5,5 a 6,0. Deste modo o zinco-EGF cristalino precipitará da solução à temperatura ambiente e sem agitação. Em alternativa, pode adicionar-se EGF sob qualquer forma, como por exemplo sob forma liofilizada, a uma solução tamponizada de ião de zinco.

Os cristais de zinco-EGF podem ser recuperados de qualquer modo conhecido na técnica. Por exemplo, a solução aquosa que contém os cristais pode ser centrifugada a fim de aglomerar os cristais. Em seguida o sobrenadante é re tirado e os cristais são filtrados, lavados e secos.

Uma vez que o EGF foi descrito como sendo útil para a cicatrização de feridas, as composições da presente invenção podem ser usadas para tratar feridas de modo a acelerar a velocidade de cicatrização. Os tipos de feridas que podem ser cicatrizadas usando as composições da presente invenção são os que resultam de qualquer lesão acidental ou mé dica que cause uma lesão epitelial, como feridas oftálmicas, como as que resultam de úlceras na córnea, queratotomia radial, transplantações de córnea, epiqueratofacia e outras feridas in duzidas por via cirúrgica no olho; e feridas cutâneas como quei maduras, feridas do local dador de transplantações de pele e úlceras (cutâneas, de decúbito, de estase venosa e diabética). Para além disso, é possível tratar com as composições da presente invenção condições dermatológicas em que houve uma lesão da pele, como psoríase, queimaduras solares e inflamação cutânea. As composições podem ser aplicadas ao local da ferida por via tópica ou internamente, em função do tipo de ferida.

Os métodos para aumentar a velocidade de cicatrização de uma ferida incluem a aplicação ou o contacto das composições da presente invenção directamente â ferida administrando por via tópica a composição ao local da ferida.

A composição pode permanecer em contacto com a ferida durante um período de tempo suficiente para aumentar a velocidade de crescimento celular no local da ferida. Estes métodos incluem a incorporação de qualquer composição da presente invenção em qualquer composição farmaceuticamente aceitável de libertação

controlada, como uma pomada, um gel, uma pulverização de aeros sol, microcápsulas, películas ou espumas liofilizadas ou uma formulação aquosa ou mergulhar um penso de gaze numa solução aquosa da composição e em seguida aplicar esta formulação ou penso ao local da ferida.

As composições da presente invenção são úteis em formulações para gotas oftálmicas, géis oftálmicos, pomadas oftálmicas, formulações com liposomas ou micelas, veículos aquosos para mergulhar pensos de gaze, pensos para queimaduras, peles artificiais, suturas e revestimentos de agra fes, unguentos ou pomadas, formulações em gel, espumas e semelhantes. Podem ser usados nestas composições outros materiais, como tampões, conservantes, agentes de ajustamento da tonicida de, anti-oxidantes, polímeros para ajustar a viscosidade ou co mo diluentes e excipientes. São exemplos específicos destes ou tros materiais tampões de acetato e de borato; timerosol, ácido sórbico, metil- ou propil-paraben e conservantes de clorobu tanol; cloreto de sódio e/ou açúcares para ajustamento da toni cidade; e excipientes como manitol, lactose ou sucrose.

A estabilidade estrutural do EGF como resultado de ligação metálica é uma função da estequiometria do metal em relação ao EGF, do pH e da força iónica do meio. Outra variável importante na formação do complexo metal-proteína e a constante dieléctrica (DIE) e a actividade da ãgua à superfície da proteína. Verificou-se que os compostos neutros afectam a estrutura da água e a DIE do meio. Uma redução na DIE causará um aumento na interacção iónica (por exemplo, complexo metal-EGF), incrementando deste modo a estabilidade. Um segundo efei to de redução da DIE será um aumento das ligações de hidrogénio intramoleculares, o que também contribuirá para a estabili dade do EGF. Deste modo, pensa-se que os factores que provocam uma redução da DIE possuem um efeito de estabilização na proteína EGF por alteração da polaridade da ãgua, modificando o invólucro de hidratação ao redor da proteína e em alguns casos interactuando directamente com a superfície da proteína. São exemplos de compostos neutros que possuem a capacidade de redu zir a DIE os seguintes: álcoois mono-hídricos e poli-hídricos,

como etanol, isopropanol, manitol, sorbitol, inositol, sucrose, lactose, glicerina e outros semelhantes; compostos poli-hidroxílicos, como glicerol, polietileno-glicol, propileno-glicol, polioxmer (Pluronic F-68), povidona, hidroximetilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipropilcelulose, octoxinol-9 e outros semelhantes; agentes tensio-activos, como polissorbato (Tweens), Bri j, monoester e triéster de polioxietileno de sorbitano e ou tros semelhantes; ácidos aminados, como glicina, leucina, ácidos poliaminados e outros semelhantes; e outros compostos, como gelatina ou gelatina hidrolisada e dextrano. Estes compostos foram todos aprovados pela F.D.A. e são solúveis em ãgua. Pensa-se que a adição de qualquer destes compostos farmacêuticos com carga neutra às composições da presente invenção pode au- í mentar ainda mais a estabilização do EGF.

As presentes composições podem também ser combinadas com compostos anti-bacterianos, como compostos de sulfadiazina e em especial com sulfadiazina-prata e sulfadiazina-zinco. Um composto de sulfadiazina-zinco pode ter a du pia finalidade de proporcionar propriedades antibacterianas e de estabilização à composição.

As composições da presente invenção po dem ser liofilizadas a fim de proporcionar uma estabilidade acrescida do EGF. Os métodos de liofilização são bem conhecidos na especialidade. As formulações liofilizadas estáveis que contêm factores de crescimento são descritas no pedido de Paten te U.S. com o número de série 098 817, depositado simultaneamente pelo mesmo requerente, o qual se dá como aqui reproduzido.

Os exemplos que se seguem destinam-se a elucidar mais completamente a presente invenção. A invenção não deve ser considerada como limitada por estes exemplos mas apenas pelas reivindicações em anexo.

EXEMPLO 1

Usou-se EGF produzido por via recombinante (Chiron Corporation, Emerville, CA) nas experiências que se seguem. A estabilidade do EGF com ião de zinco foi ensaiada

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a pH 5,5 até 6,5. O EGF liofilizado foi reconstituído em aceta to de sódio 50 mm a pH 5,5. Adicionou-se em seguida uma solução de cloreto de zinco a esta solução de EGF. Em alternativa poderiam ter sido adicionados acetato de zinco ou cristais de um sal de zinco. Manteve-se o pH entre os limites de 5,5 a 6,5 a o zinco-EGF precipitou da solução ã temperatura ambiente.

Deixaram-se envelhecer as amostras durante um período de 28 dias e em seguida usou-se uma análise de HPLC para estudar as alterações estruturais que envolvessem a formação de novas espécies (por exemplo, picos C, X e Y) ou de EGF em várias condições de armazenagem e na presença de novas formulações. Pode usar-se HPLC de fase inversa para a análise quantitativa e qualitativa do EGF. Os resultados das HPLC são apresentados seguidamente no Quadro 1.

O complexo zinco-EGF deve ser dissocia do antes da análise de HPLC porque o complexo não pode correr na coluna de HPLC tal qual. Por conseguinte, antes da HPLC, o pH das amostras a serem analisadas foi ajustado a 3,0. Em alternativa, pode usar-se EDTA (um agente quelante) para inverter a cristalização. A HPLC de fase inversa foi levada a efeito usando uma coluna Vydac C-4 (4,6 mm x 25 cm, 5 um). O caudal era de 0,8 ml/min a 26OC usando um gradiente linear de 26% a 32% de acetonitrilo (0,1% em TFA) durante 26 minutos.

Quadro 1

EGF a vãrios pH's durante 28 dias a 460 c

Com Zn++ Sem Zn++

Conforme se pode ver a partir do Quadro 1, a formação das espécies de degradação representadas pelos picos Y e X foi muito reduzida quando o EGF foi incorporado numa formulação na presença de iões de zinco em comparação com as formulações que não continham iões de zinco. Experiências adicionais mostraram que as espécies dos picos X e Y tinham uma perda de 40% da actividade biológica em relação ao pi_ co D do EGF nativo. A espécie do pico C não apresentou qualquer alteração na actividade biológica. Deste modo, a estabilização do EGF com zinco tem como resultado um aumento significativo da actividade biológica do EGF por meio da redução da formação das espécies dos picos X e Y.

EXEMPLO 2

Esta experiência foi programada a fim de responder à questão de se a estabilidade do complexo zinco-EGF resulta da exclusão de ãgua pelo complexo insolúvel e de grande dimensão ou em alternativa da interacção directa do ião zinco com ãcidos aminados específicos da proteína. Prepararam-se uma solução de zinco-EGF e uma solução de comparação como no Exemplo 1 e ajustaram-se as amostras a pH 4,6. A este pH o EGF precipita naturalmente a partir da solução uma vez que se encontra no seu ponto isoeléctrico. Incubaram-se dois conjuntos de EGF precipitado a pH 4,6 em tampão de acetato de sódio durante 7 dias a 46QC. Um conjunto tinha o ião zinco presente e o outro não. Os resultados de HPLC são apresentados seguidamen te no Quadro 2.

Quadro 2

EGF a pH 4,6 durante 28 dias a 46Q C

Com Zn++

Picos em %

C

D

Y

X

Quadro 2 mostra que o complexo zinco -EGF tem uma diminuição significativa nos picos X e Y em compa ração com a formulação que apenas contém EGF sob a forma prec_i pitada. Este resultado sugere que ê importante uma interacção directa entre o zinco e o EGF e que o complexo zinco-EGF é estável tanto sob forma aquosa com sob forma cristalina.

EXEMPLO 3

Com o objectivo do presente pedido de patente, a actividade biológica do complexo zinco-EGF foi avaliada por meio da análise de ligação ao receptor (RBA). Esta análise mede a ligação do EGF ao seu receptor e a análise tem uma gama de variabilidade de 15 a 30%. É um método aceite para a determinação da actividade biológica do EGF. O método de aná lise da ligação ao receptor usado foi o de Savage et al., Analytical Biochem., 111, páginas 195 e segs. (1981). O método de RBA é também descrito e executado na Patente U.S. 4 717 717, cuja descrição se dá como reproduzida na presente memória descritiva por referência. Misturou-se o EGF a uma concentração de 100 microgramas por ml com ião de zinco, ocorrendo uma precipitação. O material precipitado foi dividido em dois volumes iguais. Adicionou-se EDTA a uma amostra a duas vezes o nível molar do ião zinco. Obteve-se como resultado uma solução límpi da sem precipitação. A outra amostra foi deixada sem qualquer alteração sob forma precipitada e as três amostras foram anal_i sadas por RBA, sendo os resultados apresentados no Quadro 3. 0 tampão usado na análise de RBA foi um tampão de fosfato a pH

7,4. Α este ρΗ ο complexo Zn-EGF dissociou-se na sua forma monomérica e o zinco precipitou sob a forma de fosfato de zinco. Para amostra de comparação usou-se EGF sem zinco.

Quadro 3 (microgramas por ml)

Zn-EDTA, EGF

Zn-EGF precipitado

EGF isolado

135+5

140+20

138+10

Os resultados do Quadro 3 mostram que não houve perda de actividade de EGF na presença de zinco sob forma precipitada, o que sugere que o complexo zinco-EGF é reversível .

A presente invenção foi descrita na presente memória descritiva em relação a certas formas preferi das de concretização e por meio de exemplos. Uma vez que será fácil para os especialistas na matéria imaginar variações óbvias, a invenção não deve ser considerada limitada ãs formas de concretização e aos exemplos apresentados mas apenas pelas reivindicações que se seguem.

Picos em %

- lê Processo para a preparaçao de factor de crescimento epidérmico (epidermal growth factor = EGF) huma no cristalino caracterizado por compreender as fases de

a) formar uma solução aquosa de EGF;

b) adicionar zinco sob forma aquosa ou sólida ã referida solu ção de EGF a fim de formar uma mistura de zinco e EGF usan do 10 a 20 mM de zinco por 250 micrograma de EGF/ml;

c) ajustar o pH da referida mistura a um pH numa gama de 4,0 a 7,0;

d) deixar que se faça a formação de cristais zinco-EGF; e

e) recuperar a forma cristalina de zinco-EGF a partir da mistura.

-
2s Processo para a preparação de uma composição estabilizada de EGF caracterizado por compreender uma fase de combinar EGF com uma quantidade suficiente de iões de zinco de modo a estabilizar o EGF contra a degradação.

- 3â Processo para a preparação de uma compo sição farmacêutica que contém uma quantidade farmaceuticamente eficaz de EGF e uma quantidade de iões de zinco suficiente para evitar a degradação do referido EGF caracterizado por compreender as fases de formulação de EGF e iões de zinco.

Processo para a preparação de uma composição de EGF cristalino caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um complexo de zinco e EGF quando preparado de acordo com a reivindicação 1.

- 53 Processo para a estabilização de uma composição farmacêutica que contém EGF caracterizado por se in corporar na referida composição uma quantidade de iões de zinco suficiente para estabilizar o referido EGF contra a perda de actividade biológica.

- 63 Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a composição obtida ser uma solução aquosa tamponizada.

- 73 Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a composição obtida ser um gel.

Processo de acordo com a reivindicação

- 83 17
3, caracterizado por a composição obtida ser uma pomada.

- 9â Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por compreender adicionalmente a fase de se incorporar um composto redutor de constante dieléctrica neutra.

- 10â Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a composição obtida ter um pH numa gama desde cerca de 4,0 até cerca de 7,0.

- llâ Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a composição obtida ter um pH numa gama desce cerca de 5,5 até cerca de 6,0.

- 12S Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a composição obtida ter uma concentração de catiões de zinco de 10 a 20 mM por 250 micrograma de EGF/ml;

- 13â 18

133

Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o tampão ser um tampão de acetato.

A requerente reivindica a prioridade do pedido norte-americano apresentado em 16 de Maio de 1989, sob o número de série 353,131.