PT93393B - Processo para a preparacao de vacinas e de agentes de diagnostico que contem regioes imunogenicas de proteina e7do virus do papiloma humano do tipo 16 ou anticorpos suscitados contra estas regioes - Google Patents
Processo para a preparacao de vacinas e de agentes de diagnostico que contem regioes imunogenicas de proteina e7do virus do papiloma humano do tipo 16 ou anticorpos suscitados contra estas regioes Download PDFInfo
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Description
Descrição referente ã patente de invenção de BEHRINGWERIE AK. TIENGESELLSCHAFT, alemã, indus trial e comercial, com aede em D-3550 Marburg, Alemanha Ocidental, (inventores: Dr. Dusan Bartsch, Prof. Br. Lutz Gissmann e Martin Mõller, residente: na Alemanha Ocidental), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE
VACINAS E DE AGENTES DE DIAGNOSTICO QUE CONTEM REGIÕES IMU NOGgNICAS DA PROTEÍNA E7 DO VI
RPS DO PAPILOMA HUMANO DO TIPO
OU ANTICORPOS SUSCITADOS
CONTRA ESTAS REGIÕES.
DESCRIÇÃO
A presente invenção refere-se a duas regiões imunogénicas da proteína E7 do viras do papiloma huma. no do tipo 16 (HPV 16), estando ama região imuno-reactiva localizada em 3 em relação à posição nucleotldica 595 e a outra em 3* em relação ã posição nucleotldica 667 do genoma do HPV 16.
Os virus de papiloma não podem ser multiplicados em cultura. A utilização do ADN do HPV para diagnóstico bem como a obtenção dos produtos de expressão, a sua utilização como antigenes, o isolamente de anticorpos e a preparação de agentes de diagnóstico correspondentes pressupõem por conseguinte processos de tecnologia genética.
Durst et al., Proc. Natl. Acad. Sei.
USA 80 (1983) 3813 - 3815 descrevem um novo tipo de virus de
papiloma humano (HPV), que designam por HPV 16. A sequência de ADN e a organização do genoma deste virus são reproduzidas
| por Seedorf | et | al., | Virology 145 Smotkin | (1985) 181 - 185. e Wettstein. Proc. | Natl. |
| Acad. Sei. | 83. | 4680 | - 4684 (1986) | identificaram o p | roduto da |
| transcrição | E7 | como | o produto de | transcrição de HPV | que ocor |
re mais frequentemente na linha de células CaSki e num outro carcinoma da nuca que contêm o ADN do HPV 16 predominantemente sob a forma de um plasmídeo. Seedorf et al., EMBO J. 6,
139 - 144 (1987) mostraram em seguida que a proteína E7 é a prateína virai de HPV 16 de ocurrência mais frequente nestas linhas de células, que contêm o HPV 16 sob a forma integrada ou sob a forma de um plasmídeo.
A proteína E7 parece desempenhar para além disso um papel na conservação do fenótipo transformado. Para além disso ocorrem cora frequência anticorpos contra a proteína E7 em pacientes com carcinoma da nuca. A detecção da proteína E7 do HPV 16 ou dos anticorpos dirigidos contra esta é por conseguinte de interesse em diagnóstico.
Na análise de um ADN de HPV 16 clona, do num banco de expressão shot gun com um antissoro policio, nal contra a E7 do HPV 16 de coelhos detectaram-se duas regiões imuno-reactivas no interior da proteína E7. A primeira região situa-se no domínio N-terminal da proteína E7 e é representada por quatro clones fágicos diferentes de grande dimensão:
| I. | 5’-ATG | TTA | GAT | TTG | CAA | CCA | GAG | ACA | ACT | GAT | CTC | TAC |
| TAT GAG | í CAA | -3’ | ||||||||||
| II. | 5’-ATG | TTA | GAT | TTG | CAA | CCA | GAG | ACA | ACT | GAT | CTC | TAC |
| III. | 5’-ATG | TTA | GAT | TTG | CAA | CCA | GAG | ACA | ACT | |||
| IV. | 5’-ATG | TTA | GAT | TTG | CAA | CCA | GAG | ACA |
A extremidade 5* do clone corresponde á posição nucleotídica 595 no genoma do HPV 16.
I. met leu asp leu gin pro glu thr thr asp leu tyr cys tyr glu gin
II. met leu asp leu gin pro glu thr thr asp leu tyr
III. met leu asp leu gin pro glu thr thr
IV. aet leu asp leu gin pro glu thr
A segunda região imuno-reactiva da proteína E7 do HPV 16 foi localizada na posição nucleotldica 667 do genoma do HPV 16:
5*-GAT GAA ATA GAT GGT CCA GCT GGA CAA GCA GAA CCG GAC AGA GCC CAT TAC-3' e contêm 17 ácidos aminados:
asp glu ile asp gly pro ala gly gin ala glu pro asp arg ala hia tyr
A presente invenção refere-se ainda às regiões imuno-reactivas mencionadas anteriormente· á sua utilização para diagnóstico» para a terapia e como medicamento ou como vacina.
A presente invenção á para além diaso elucidada por meio dos exemplos que se seguem e encontra-se definida nas reivindicações.
Exemplos:
1. Preparaçao do banco de expressão ehotgun” do genoma do HPV 16
ADN de HPV 16 clonado no vector plasmídico bacterlano sp65 foi reduzido a fragmentos de dimen, sao média de cerca de 100 parea de bases (pb) por meio da acção de ultrassons seguidos de tratamento com ADNase I.
As extremidades destes fragmentos fo, ram preenchidas com o auxílio de polimerase de ADN T4 e de li. gase de ADN de E. coli. Cortou-se o vector de expressão fd-tet-J6 com PVU II e ligaram-se os fragmentos de extremidades alinhadas. 0 vector fd-tet-J6 deriva do bacteriófago fd e foi descrito por G. P. Smith. Science 228. 1315 - 1317 (1985).
2« Detecção de reacções lmunogénicas
Após inoculação dos fagos recorabinan, tes de E» Coli 119 em placas pesquizaram-se réplicas sobre filtros de nitrocelnlose coa soros específicos para a detecção de fagos iauno-reactivos. 200 recombinantes reagiram com o an. ti-soro: 30 destes foram pesquizados adicionalmente por meio de análise de sequênciação de ADN. Foram obtidos os seguintes resultados:
1. Todos os recombinantes contém sequências específicas E7.
2. No interior da proteína E7 foram encontradas duas regiões lmunogénicas. A primeira região foi identificada por meio de 25 clones com sobreposições. Estes 25 clones podem ser distribuídos em 4 classes:
| I. | 5*-ATG | TTA | GAT | TTG | CAA | CCA | GAG | ACA | ACT | GAT | CTC | TAC TGT |
| TAT | GAG | CAA- | -3’ | |||||||||
| II. | 5’-ATG | TTA | GAT | TTG | CAA | CCA | GAG | ACA | ACT | GAT | CTC | TAC |
| III. | 5*-ATG | TTA | GAT | TTG | CAA | CCA | GAG | ACA | ACT | |||
| IV. | 5’-ATG | TTA | GAT | TTG | CAA | CCA | GAG | ACA |
A extremidade 5' dos clones corresponde á posição nucleotídica 595 do genoma do HPV 16:
De modo correspondente a sequência de ácidos aminados das quatro classes á:
| I. | met glu | leu gin | asp | leu gin | pro | glu | thr | thr | asp leu | tyr cys | tyr |
| II. | met | leu | asp | leu gin | pro | glu | thr | thr | asp leu | tyr | |
| III. | met | leu | asp | leu gin | pro | glu | thr | thr | |||
| IV. | met | leu | asp | leu gin | pro | glu | thr | ||||
| A | dimensão mínima | desta | região é | por. | |||||||
| tanto | de 8 | ácidos | aminados | • Uma vez que anticorpos monoclonais |
apenas reagem contra as classes I e II, mas o anti-soro policlonal reage contra todas as 4 classes* encontram-se localiza, dos no antigene das classes I e II pelo menos 2 epítopos dife. rentes.
Utilizou-se um oligonucleótido sinté. tico correspondente á sequência de ácidos aminados da classe II (met-leu-asp-leu-gln-pro-glu-thr-thr-asp-leu-tyr) numa aná. lise de ELISA e verificou-se a'a reacção nítida com o soro de coelho policlonal suscitado contra a E7 do HPV 16.
A segunda região imuno-reactiva de 17 ácidos aminados foi encontrada em 5 clones e localizada na posição nucleotldica 667 do genoma do HPV 16:
5’-GAT CAA ATA GAT GGT CCA GCT GGA CAA GCA GAA CCG GAC AGA GCC CAT TAC—3* correspondente aos 17 ácidos aminados:
asp glu ile asp gly pro ala gly gin ala glu pro asp arg ala his tyr
1. Processo para a preparação de uma vacina contra o vírus do papiloma humano (HPV) caracterizado por se incorporar como substância activa um peptídeo que contém uma das sequências de ácidos aminados
I. met leu asp leu gin pro glu thr thr asp leu tyr cys tyr glu gin
Claims (4)
- REIVINDICAÇÕES
II . met leu asp leu gin pro glu thr thr asp leu tyr III . met leu asp leu gin pro glu thr thr IV. met leu asp leu gin pro glu thr em conjunto com substâncias veiculares apropriadas. - 2. Processo para a preparação de agentes de diagnóstico caracterizado por se incorporar pelo menos um peptídeo com uma das sequências de ácidos aminados referidas na reivindicação 1.
- 3. Processo para a preparação de anticorpos policlonais ou monoclonais caracterizado por se utilizar para a imunização pelo menos um peptídeo com uma das sequências de ácidos aminados referidas na reivindicação 1.
- 4. Processo para a preparação de agentes de diagnóstico caracterizado por se incorporar um anticorpo policlonal ou monoclonal preparado de acordo com o processo da reivindicação 3.A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 10 de Março de 1989, sob o N° . P 39 07 721.78.0
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