KR20230113331A

KR20230113331A - 인간 파필로마 바이러스 백신 및 hpv 연관된 질환에 대한 이의 용도

Info

Publication number: KR20230113331A
Application number: KR1020237020302A
Authority: KR
Inventors: 더글라스 이. 브로우; 다모다르 알. 에티레디; 치 양; 첸 왕
Original assignee: 프레시전 인코포레이티드
Priority date: 2020-11-25
Filing date: 2021-11-23
Publication date: 2023-07-28
Also published as: WO2022115470A1; IL303113A; AU2021385551A1; EP4251278A1; US20240173396A1; CA3197920A1; CN117203342A; JP2023550480A; MX2023006038A

Abstract

HPV 연관된 장애 및 병리학의 사용 및 치료를 위한 다중 항원성 인간 파필로마 바이러스(HPV) 분자 백신 작제물; 예컨대 HPV6 및 HPV11 연관된 병리학을 표적화하는 HPV 분자 백신이 본원에 제공된다.

Description

인간 파필로마 바이러스 백신 및 HPV 연관된 질환에 대한 이의 용도

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2020년 11월 25일에 출원된 미국 가출원 제63/118,222호의 이익을 주장하고, 이는 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.

서열 목록의 참조

본 출원과 제출된 전자로 제출된 서열 목록(명칭: INX00511US-V1_SEQ-LIST_ST25; 크기: 71,267 바이트; 생성일: 2020년 11월 24일)의 내용은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.

기술분야

본 개시내용은 혁신적인 다중 항원성 HPV 분자 백신에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 본 개시내용은 HPV6 및 HPV11 연관된 병리학을 표적화하는 HPV 분자 백신에 관한 것이다.

세계적으로, 수천만명의 사람들은 현재 인간 파필로마바이러스(HPV: human papillomavirus)로 감염되고, 수백만명이 넘는 사람들이 매년 새로 감염되고 있다. 현재, 백신접종은 추천된 연령 그룹에게 주어질 때 HPV에 의해 야기된 질환을 보호할 수 있지만; (예를 들면, HPV 균주의 다수의 하위집단 및/또는 표적화된 하위집단에 대한) 확장된 보장범위 및 HPV 연관된 병리학에 대한 기능성을 갖는 HPV 백신에 대한 대단한 수요가 있다.

재발성 호흡기 유두종증(RRP: recurrent respiratory papillomatosis)은 호흡기에서 사마귀 유사 양성 파필로마의 재발성 성장을 특징으로 하는 희귀 질환이다. RRP는 아동 및 성인 둘 다에서 발생한다. 연소성 발생은 거의 항상 10세에 진단되고, 보통 5세 전에 진단된다. RRP는 인간 파필로마바이러스(HPV), 특히 HPV6 및 HPV11에 의해 야기된다.

성기 사마귀는 매우 흔하고, 항문성기 또는 첨규콘딜롬(condylomata acuminate)과 같은 다른 명칭에 의해 또한 알려질 수 있고, 미국에서만 매년 500,000건 내지 1,000,000건의 새로운 사례가 진단된다. HPV6 및 HPV11은 성기 사마귀의 약 90%의 원인이다. 현재의 치료 옵션은 대체로 기저 바이러스 감염의 제거보다는 사마귀의 제거에 집중한다. 넓은 범위의 치료제가 현재 사용 중이고, 이는 매우 가변적이고 극적으로 상이할 수 있다. 그러나, 모든 환자에서 사마귀를 제거하고 사마귀가 다시 생기는 것을 막는 데 있어서 치료는 100% 효과적이지 않다.

RRP에 대한 현재의 치료 표준은 필요한 대로 아쥬반트 치료제에 의한 수술 절제이다. 그러나, RRP의 구별 양상은 성장이 재발하는 경향이어서 반복 수술을 요한다. 공격성은 환자 중에서 변한다 - 일부 개체는 몇 주마다 수술을 요할 수 있는 한편, 다른 개체는 1년 2회 또는 생애 동안에 오직 수회 수술을 오직 요할 수 있다.

불행하게도, 과거에 개발된 치료제는 RRP에 대한 다수의 재발을 예방할 수 없었다. RRP 환자에 대한 더 좋은 치료를 개발할 필요가 있다. 본 명세서는 혁신적인 면역요법 접근법, RRP 및 다른 HPV6/11 연관된 질환, 예컨대 성기 사마귀를 치료하고 이의 과정을 변경하기 위해 항-HPV6/11 면역력을 유도하는 것을 목표로 하는 신규의 치료학적 HPV 백신을 기재한다.

백신은 전통적으로 감염성 질환에 대한 예방 조치로서 사용되었다. 몇몇 HPV 백신(GARDASIL 및 CERVARIX)은 RRP를 야기하는 동일한 하위유형의 HPV 감염과 또한 연관된 자궁경부암으로부터 여성을 보호하기 위해 개발되고 식약청(FDA)에 의해 허가되었다.

가다실(GARDASIL)은 HPV 유형 6, 11, 16 및 18에 대한 백신(RRP는 유형 6 및 11에 의해 야기됨)인 한편, CERVARIX는 오직 HPV 유형 16 및 18에 대한 백신이다. 가다실-9는 고위험 균주 31, 33, 45, 52, 58에 대해 보호하도록 표적화된다.

상기 기재된 예방 백신은 건강한 사람이 HPV 감염을 얻는 것을 막는 데 성공적일 뿐만 아니라 과거에 감염된 환자가 재감염되는 것을 막는 데 성공적이지만; 이것은 이미 HPV가 감염된 환자에서는 치료하거나 치유할 수 없다.

다수의 치료학적 HPV 백신은 임상 실험에 도달했고, 일부는 유망한 결과를 보여준다. 재조합 변형된 백시니아 안카라(Modified Vaccinia Ankara)인 MVA E2는 여성 환자에서 90% 병변 제거율을 보여주고 남성 환자에서 100% 병변 제거율을 보여주는 것으로 보고되었다. E6 및 E7을 암호화하는 플라스미드로 이루어진 DNA 백신인 IN0-3106은 재발성 호흡기 유두종증을 갖는 2명의 환자의 연구에서 임상 효능을 갖는 것으로 보고되었다. 그러나, 이 명백한 긍정적인 진행에도 불구하고 허가된 HPV 치료 백신이 부족하고; 실제로 이 제출 일자로부터, 특허 출원인은 임의의 FDA 허가된 HPV 치료 백신을 현재 알고 있지 않다.

참고에 의한 포함

본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 참고로 포함된 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.

면역 반응 유도 인간 파필로마 바이러스(HPV) 폴리펩타이드를 포함하는 비자연 발생 폴리펩타이드를 암호화하는 비자연 발생 폴리뉴클레오타이드(및 이로부터 발현된 폴리펩타이드)가 본원에 제공된다. 다양한 폴리펩타이드 링커 서열에 의해 연결되고, 이로써 백신 항원으로서 유용한 융합 단백질을 포함하는, HPV 면역 반응 유도 폴리펩타이드의 비자연 발생, 가변적으로 배치된, 구성이 본원에 또한 제공된다.

본 발명은 인간 파필로마바이러스(HPV), 특히 HPV6 및 HPV11에 대항한 백신에 대한 항원을 포함하는 비자연 발생 폴리펩타이드를 암호화하는 비자연 발생 폴리뉴클레오타이드의 조성물, 조성물을 제조하는 방법 및 용도; 및 이 특정한 HPV 제제에 의해 야기된 병리학적 병태를 치료하기 위한 치료 접근법을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 특히, 본 발명은 HPV6, HPV11 및 HPV16으로부터 유래된 다중 항원성 폴리펩타이드를 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드 및 이에 의해 암호화된 폴리펩타이드 및 백신 성분으로서 사용하기 위한 그리고 HPV 감염과 연관된 장애의 치료를 위한 다른 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 "적응증"은 HPV6 및/또는 HPV11(HPV6/11) 유도된 또는 연관된 질환에 대한 치료 백신; 예컨대, 비제한적인 예로서 재발성 호흡기 유두종증(RRP), 항문성기 사마귀 및 다른 HPV6/11 연관된 질환의 치료로서 본원에 기재된 조성물의 사용이다.

본 발명은 HPV6/11 유도된 질환에 대한 고유하고 혁신적인 구성 HPV 폴리펩타이드 백신 설계 접근법을 포함한다. 본 발명은 전체 단백질 서열의 사용, 펩타이드 "단편", 하이브리드 폴리펩타이드 작제물의 사용, 폴리펩타이드 및 펩타이드 HPV 유전자 산물(단백질)의 아미노산 치환, 삽입, 결실 및 재배열의 도입과 같은 설계 전략의 믹스를 포함한다. 본원에 기재된 것과 같은 설계 개념의 5개의 예(설계 번호 1-5)는 필요한 대로 상이한 변경으로 추가로 변형되고/되거나 최적화될 수 있다.

상기에 표시된 것과 같이, 특히 종양발생 유전자 발현 및/또는 불가능해진 필수 바이러스 기능(예를 들면, 바이러스 복제)을 막기 위해 점 돌연변이, 치환 돌연변이를 도입하고/하거나 바이러스 폴리펩타이드 서열을 재순서화함으로써 본원에 기재된 항원의 고유한 변형이 이루어졌다.

소정의 실시형태에서, HPV 초기 단백질 E2 및 E4는 HPV6/11에 대한 신규의 항원으로서 확인되었고, 이것을 본원에 기재된 설계로 도입하였다. 소정의 실시형태에서, 본 발명은 1개의 HPV 백신 설계로의 HPV로부터의 4개의 항원 성분의 신규의 도입을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 발명은 1개의 HPV 항원 작제물로의 암 고위험 및 암 저위험 HPV 유전자형 에피토프 둘 다의 신규의 통합 및 조합을 포함한다. 본원에 기재된 항원 설계는 인실리코 분석을 통해 결정된 것과 같이 내인성 인간 단백질에 대한 교차 반응성 없이 인간 생체내 항원성 가능성에 대해 조심스럽게 설계되고 선택되었다.

도 1은 본원에 기재된 설계를 설계하고 평가하기 위해 이용된 도구 및 기법의 참조를 포함하는 HPV6/11 항원 설계 작업흐름의 도식이다.
도 2 내지 도 6은 HPV6/11 항원 설계 번호 1 내지 번호 5에 대한 폴리펩타이드 및 이것에 사용된 모듈의 도식적, 순서 및 구조적 표시를 제공한다.

본 개시내용이 본원에 기재된 특정한 실시형태로 제한되지 않고, 그러므로 변할 수 있다고 이해되어야 한다. 당업자는 이의 범위 내에 포함된 본 개시내용의 변경 및 변형이 있다는 것을 인식할 것이다.

본원에 기재된 것과 같은 그리고 도면 및 서열 목록에 도시된 것과 같은 항원 성분을 연결하기 위해 사용된 경질 링커, 절단 가능한 링커, HPV 에피토프 링커 및 HPV 효능제 인핸서 링커는 다른 순열의 가변적인 수로 추가로 구성될 수 있다.

본 발명의 실시형태는 여러 가지의 다양한 뉴클레오타이드 서열(예를 들면, 비제한적인 예로서, 서열 번호 77 내지 81)에 의해 암호화될 수 있는 경질 링커 펩타이드 (EAAAK)n; 즉 (서열 번호 76) _n 의 사용을 포함하고; 여기서 "n"은 1 내지 10으로 변할 수 있다(예를 들면, EAAAK는 n=1이고; EAAAKEAAAK는 n=2이고, EAAAKEAAAKEAAAK는 n=3이고; 기타 등등임). "E"(Glu; 글루탐산으로도 알려짐), "A"(Ala; 알라닌으로도 알려짐) 및 "K"(Lys; 리신으로도 알려짐) 잔기의 수가 유사한 조성의 경질 링커 펩타이드 서열을 생성하는 데 있어서 반복의 수 및 패턴에서 변할 수 있는 것으로 또한 고려된다.

마찬가지로, 본원에 기재된 것과 같은 그리고 도면에 도시된 것과 같은 항원 단편은 각각의 설계 내에 그리고 각각의 설계 중에서 다양한 순열로 섞일 수 있다.

본원에 기재된 것과 같은 그리고 도면에 도시된 것과 같은 백신 설계는 재발성 호흡기 파필로마 병리학 및 장애의 치료뿐만 아니라 성기 사마귀, 항문성기 사마귀 및 다른 사마귀 및 다른 HPV 유도된 질환, 장애 및 과증식성 병리학의 치료에 사용될 수 있다.

HPV 초기(E) 영역 단백질의 구성적 또는 유도된 발현은 효과적인 HPV6/11 백신에 대한 표적을 제공한다.

HPV 초기 영역 단백질 기능은 하기를 포함한다: E1, E2는 바이러스 복제/전사에서 기능을 갖고(예를 들면, E2는 E6 및 E7의 발현을 조절하고; E1/E2 상호작용은 바이러스 복제에 필수적임); E4, E5는 (HPV11 E4가 바이러스 게놈 증폭에 필수적은 아니지만) 바이러스 복제 사이클의 후기 단계 동안 증가된 발현을 갖고; E6, E7은 복제 동안 협동적으로 작용한다(E6은 에피솜 게놈 유지에 필요하고, E7은 DNA 복제에서 활성인 상피 세포의 구획을 팽창시킴).

E2는 훌륭한 표적이고, 감염된 세포에서 발현되고, 강한 면역 반응을 생성하는 것으로 나타났고, 백신에서 유일한 표적(플라스미드 DNA 및 MVA E2)으로서 E2를 사용한 전임상 데이터 및 임상 데이터가 있다.

E4는 고유한 표적이고, 감염된 세포에서 발현되고, 발현 후기를 향상시켰고, HPV11 복제에 필수적이지 않지만 에피솜 상태의 생성에서 중요한 역할을 가질 수 있고; 백신 데이터가 이용 가능하지 않다.

E6 및 E7은 둘 다 감염된 세포에서 발현되지만, 건강한 세포에서 부재하여, 이들을 이상적인 항원 표적으로 만들고, 백신에서 표적으로서 E6 및 E7을 사용한 임상 데이터가 있다.

모든 용어는 이들이 당업자에 의해 이해되는 것처럼 이해되도록 의도된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 분야의 당업자에 의해 흔히 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본원에 사용된 제목 부문은 오직 체계적 목적을 위한 것이고, 기재된 대상을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

본 개시내용의 다양한 특징이 단일 실시형태의 맥락에서 기재될 수 있지만, 그 특징은 또한 별개로 또는 임의의 적합한 조합으로 제공될 수 있다. 하기 정의는 당해 분야에서의 정의를 보충하고, 현재의 출원에 관한 것이고, 임의의 관련된 경우 또는 비관련된 경우, 예를 들면 임의의 공동 소유된 특허 또는 출원에 귀속되지 않아야 한다. 따라서, 본원에 사용된 전문용어는 오직 특정한 실시형태를 기술할 목적이고 제한인 것으로 의도되지 않는다

정의

본 출원에서, 단수의 사용은 달리 구체적으로 기술되지 않는 한 복수를 포함한다. 본 명세서에 사용된 것과 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥이 명확히 달리 기술하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 것이 주목되어야 한다.

본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 기술되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 본원에 사용된 것과 같은 용어 "및/또는" 및 "임의의 이들의 조합" 및 이의 문법적 균등물은 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 이들 용어는 임의의 조합이 구체적으로 고려된다는 것을 전달할 수 있다. 오로지 예시 목적을 위해, 하기 구절 "A, B 및/또는 C" 또는 "A, B, C 또는 임의의 이들의 조합"은 "개별적으로 A; 개별적으로 B; 개별적으로 C; A 및 B; B 및 C; A 및 C; 및 A, B 및 C"를 의미할 수 있다. 용어 "또는"은 문맥이 구체적으로 분리 사용을 지칭하지 않는 한 공동으로 또는 분리하여 사용될 수 있다.

더욱이, 용어 "포함하는"뿐만 아니라 "포함한다", "포함한" 및 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한이 아니고, 즉 "포함한다"는 "제한된다"를 의미하지 않는다.

본 명세서에서 "일부 실시형태", "실시형태", "일 실시형태" 또는 "다른 실시형태"의 언급은 실시형태와 연결되어 기재된 특정한 특징, 구조 또는 특질이 반드시 본 개시내용의 모든 실시형태에 포함되는 것이 아니라 적어도 일부 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다.

본 명세서 및 청구항(들)에 사용된 것과 같은, 단어 "포함하는"(및 "포함한다" 및 "포함함"과 같은 포함하는의 임의의 형태), "갖는"(및 "갖는다" 및 "가짐"과 같은 갖는의 임의의 형태), "수반하는"(및 "수반한다" 및 "수반함"과 같은 수반하는의 임의의 형태) 또는 "함유하는"(및 "함유한다" 및 "함유함"과 같은 함유한다의 임의의 형태)은 포함적이거나 개방 말단이고, 추가의 가능한 성분, 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 명세서에 기술된 것과 같은 임의의 실시형태가 본 개시내용의 임의의 방법 또는 조성물과 관련하여 실행될 수 있고, 그 반대도 같다고 고려된다. 더욱이, 본 개시내용의 조성물은 본 개시내용의 방법을 달성하도록 사용될 수 있다.

본원에 사용된 것과 같은 기준 숫자 값 및 이의 문법적 균등물과 관련하여 용어 "약"은 그 숫자 값 자체 및 그 숫자 값의 플러스 또는 마이너스 10%의 값의 범위를 포함할 수 있다.

용어 "약" 또는 "대략"은 값이 어떻게 측정되거나 결정되는지에 따라 부분적으로 달라지는 당업자에 의해 결정된 것과 같은 특정한 값에 대한 허용 가능한 오차 범위, 즉 측정 시스템의 한계 내를 의미한다. 예를 들면, "약"은 당해 분야에서의 실행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하 또는 1% 이하의 범위를 의미할 수 있다. 또 다른 예에서, "약 10"의 양은 10 및 9 내지 11의 임의의 양을 포함한다. 더욱 또 다른 예에서, 기준 숫자 값과 관련하여 용어 "약"은 또한 그 값의 플러스 또는 마이너스 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%의 값의 범위를 포함할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 용어 "약"은 값의 1자릿수 내, 바람직하게는 5배 및 더 바람직하게는 2배 내를 의미할 수 있다. 특정한 값이 본 출원 및 청구항에 기재된 경우, 달리 기술되지 않는 한, 특정한 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 내를 의미하는 용어 "약"이 추정되어야 한다.

본원에 사용된 것과 같은 용어 "단리된" 및 이의 문법적 균등물은 자연 환경으로부터의 핵산의 제거를 지칭한다. 본원에 사용된 것과 같은 용어 "정제된" 및 이의 문법적 균등물은 자연으로부터 제거(게놈 DNA 및 mRNA를 포함)되든 또는 순도가 증가된 실험실 조건 하에 합성(cDNA를 포함) 및/또는 증폭되든 분자 또는 조성물을 지칭하고, 여기서 "순도"는 "절대 순도"가 아닌 상대 용어이다. 그러나, 핵산 및 단백질이 희석제 또는 아쥬반트에 의해 제형화될 수 있고, 여전히 실행적 목적을 위해 단리될 수 있다고 이해되어야 한다. 예를 들면, 핵산은 통상적으로 세포로의 도입에 사용될 때 허용 가능한 담체 또는 희석제와 혼합된다. 본원에 사용된 것과 같은 용어 "실질적으로 정제된" 및 이의 문법적 균등물은 핵산, 폴리펩타이드, 단백질 또는 다른 화합물이 자연적으로 연관된 폴리뉴클레오타이드, 단백질, 폴리펩타이드 및 다른 분자가 본질적으로 없는, 즉 약 50% 초과로 없는, 약 70% 초과로 없는, 약 90% 초과로 없는 핵산 서열, 폴리펩타이드, 단백질 또는 다른 화합물을 지칭한다.

본원에 사용된 것과 같은 "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드", "폴리뉴클레오타이드 작제물", "유전자", "유전자 작제물", "이종성 유전자" 및 이의 문법적 균등물은 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 중 어느 하나인 임의의 길이의 뉴클레오타이드 또는 핵산의 중합체 형태를 지칭한다. 이 용어는 분자의 일차 구조를 오직 지칭한다. 따라서, 이 용어는 이중 및 단일 가닥 DNA, 트리플렉스 DNA뿐만 아니라 이중 및 단일 가닥 RNA를 포함한다. 이것은 또한 예를 들면 메틸화에 의한 및/또는 캡핑에 의한 폴리뉴클레오타이드의 변형된 형태 및 폴리뉴클레오타이드의 비변형된 형태를 포함한다. 상기 용어는 또한 비자연 발생 또는 합성 뉴클레오타이드뿐만 아니라 뉴클레오타이드 유사체를 포함하는 분자를 포함하도록 의도된다. 본원에 개시되거나 고려되는 핵산 서열 및 벡터는 예를 들면 형질주입, 형질변환 또는 형질유도에 의해 세포로 도입될 수 있다.

본 발명의 "폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드" 및 기타 또는 유사한 용어 및 구절은 본 발명의 폴리펩타이드를 발현(즉, 암호화)하도록 사용될 수 있는 임의의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 실제로, 동일한 폴리펩타이드(즉, 코돈의 상이한 서열(뉴클레오타이드 트리플렛)에 의해 암호화되지만, 동일한 아미노산 서열의 폴리펩타이드)를 암호화할 수 있는 임의의 수의 상이한 폴리뉴클레오타이드 서열을 어떻게 작제하는지는 당업자에 의해 잘 알려져 있고 이해된다. 예를 들면, 특정한 폴리펩타이드를 암호화하는 여러 가지의 폴리뉴클레오타이드 서열을 생성하기 위해 표준 유전 코드 내에 변하는 코돈을 사용할 수 있다. 게다가, 예에 의해 비제한적인 예로서 하기에 기재된 것과 같은 호모 사피엔스(Homo sapiens) 코돈 용법 빈도 표와 같은 주어진 유기체에서 관찰된 "코돈 용법 빈도"의 사용을 통해 지도되고 선택된 것과 같은 코돈 선택의 사용을 통해 특정한 폴리펩타이드를 암호화하는 여러 가지의 폴리뉴클레오타이드 서열을 또한 생성할 수 있다.

따라서, 아미노산이 예컨대 하기 표에서 코돈(뉴클레오타이드 트리플렛)에 의해 암호화된다는 것이 당업자에 의해 또한 잘 알려져 있고 이해된다:

더욱이, 공공에게 이용 가능한 소프트웨어 리소스는 컴퓨터 생성된 "역-번역"(폴리펩타이드 서열의 "역번역"(즉, 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열로의 폴리펩타이드 서열의 전환)으로도 알려짐)에 대해 용이하게 이용 가능하다. 예를 들면, 하기를 참조한다:

2019년에 EMBL-EBI 서치 및 서열 분석 도구 API

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웹 인터페이스를 통해 EMBL-EBI 서비스를 사용하여 그리고 웹 서비스를 통해 프로그램상으로

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EMBL-EBI 업데이트: 2017로부터 생물정보학 도구에 대한 프로그램상 접근.

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코돈 용법 표에 대한 새롭고 업데이트된 리소스.

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단백질 서열 분석에 대한 MPI Bioinformatics Toolkit

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분자 생물학에 대한 개선된 도구

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핵산 서열을 취급하기 위한 컴퓨터 프로그램

Keller, C. 등, Nucleic Acids Res., Vol. 12, Iss. 1, Part 1, pp. 379-386 (1984).

본원에 사용된 것과 같은 "폴리펩타이드", "펩타이드" "폴리펩타이드 작제물" 및 "펩타이드 작제물" 및 이의 문법적 균등물은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. "성숙 단백질"은 전장이고 선택적으로 주어진 세포 환경에서 단백질에 통상적인 글리코실화 또는 다른 변형을 포함하는 단백질이다. 본원에 개시된 것과 같이, 본 발명의 실시형태는 본원에 기재된 HPV 항원/항원 폴리펩타이드, 펩타이드 및 성숙 단백질 및 또한 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)를 포함한다. 본원에 개시된 폴리펩타이드 및 단백질(이의 기능적 부분 및 기능적 변이체를 포함)은 하나 이상의 자연 발생 아미노산 대신에 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 이러한 합성 아미노산은 당해 분야에 알려져 있고, 예를 들면 아미노사이클로헥산 카복실산, 노르류신, α-아미노 n-데칸산, 호모세린, S-아세틸아미노메틸-시스테인, 트랜스-3-하이드록시프롤린 및 트랜스-4-하이드록시프롤린, 4-아미노페닐알라닌, 4-니트로페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 4-카복시페닐알라닌, β-페닐세린 β-하이드록시페닐알라닌, 페닐글리신, α-나프틸알라닌, 사이클로헥실알라닌, 사이클로헥실글리신, 인돌린-2-카복실산, 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카복실산, 아미노말론산, 아미노말론산 모노아미드, N'-벤질-N'-메틸-리신, N',N'-디벤질-리신, 6-하이드록시리신, 오르니틴, α-아미노사이클로펜탄 카복실산, α-아미노사이클로헥산 카복실산, α-아미노사이클로헵탄 카복실산, α-(2-아미노-2-노르보르난)-카복실산, α,γ-디아미노부티르산, α,β-디아미노프로피온산, 호모페닐알라닌 및 α-tert-부틸글리신을 포함한다.

핵산 및/또는 핵산 서열은 공통 조상 핵산 또는 핵산 서열로부터 자연적으로 또는 인공적으로 유래될 때 "동종성"이다. 단백질 및/또는 단백질 서열은 이의 암호화 DNA가 공통 조상 핵산 또는 핵산 서열로부터 자연적으로 또는 인공적으로 유래될 때 "동종성"이다. 동종성 분자는 동족체로 칭해질 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 것과 같은 임의의 자연 발생 단백질은 임의의 이용 가능한 돌연변이유발 방법에 의해 변형될 수 있다. 이 돌연변이유발된 핵산은 발현될 때 원래의 핵산이 암호화하는 단백질에 동종성인 폴리펩타이드를 암호화한다. 상동성은 일반적으로 2개 이상의 핵산 또는 단백질(또는 이의 서열) 사이의 서열 동일성으로부터 추론된다. 상동성 확립하는 데 있어서 유용한 서열 사이의 동일성의 정확한 백분율은 논의 중인 핵산 및 단백질에 따라 변하지만, 25%만큼 적은 서열 동일성은 상동성을 확립하기 위해 일상적으로 사용된다. 서열 동일성의 더 높은 수준, 예를 들면 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 또는 초과는 또한 상동성을 확립하기 위해 사용될 수 있다. 서열 동일성 백분율을 결정하기 위한 방법(예를 들면, 디폴트 매개변수를 사용한 BLASTP 및 BLASTN)은 본원에 기재되어 있고, 일반적으로 이용 가능하다.

폴리펩타이드의 2개의 핵산 서열 또는 아미노산 서열의 맥락에서 본원에 사용된 것과 같은 용어 "동일한" 및 이의 문법적 균등물 또는 "서열 동일성"은 규정된 비교 창에 걸쳐 최대 상응성에 대해 정렬될 때 동일한 2개의 서열에서의 잔기를 지칭한다. 본원에 사용된 것과 같은 "비교 창"은 서열이 2개의 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 인접한 위치의 기준 서열과 비교될 수 있는 적어도 약 20개, 보통 약 50개 내지 약 200개, 더 보통 약 100개 내지 약 150개의 인접한 위치의 분절을 지칭한다. 비교를 위한 서열의 정렬의 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 Smith 및 Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)의 국소 상동성 알고리즘에 의해; Needleman 및 Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)의 정렬 알고리즘에 의해; Pearson 및 Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A., 85:2444 (1988)의 유사성 방법을 위한 조사에 의해; 이들 알고리즘의 컴퓨터화된 실행(비제한적인 예로서 Intelligentics(미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)에 의한 PC/Gene 프로그램에서의 CLUSTAL, Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group(GCG)(미국 위스콘신주 매디슨 575 사이언스 드라이브)에서의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA를 포함)에 의해 수행될 수 있고; CLUSTAL 프로그램은 Higgins 및 Sharp, Gene, 73:237-244 (1988) 및 Higgins 및 Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989); Corpet 등, Nucleic Acids Res., 16:10881-10890 (1988); Huang 등, Computer Applications in the Biosciences, 8:155-165 (1992); 및 Pearson 등, Methods in Molecular Biology, 24:307-331 (1994)에 의해 잘 기재되어 있다. 정렬은 또한 대개 검사 및 수동 정렬에 의해 수행된다. 실시형태의 일 종류에서, 본원에서의 폴리펩타이드는 예를 들면 디폴트 매개변수를 사용하여 BLASTP(또는 CLUSTAL 또는 임의의 다른 이용 가능한 정렬 소프트웨어)에 의해 측정된 것과 같이 기준 폴리펩타이드 또는 이의 단편과 적어도 80%, 85%, 90%, 98% 99% 또는 100% 동일하다. 유사하게, 핵산은 또한 출발 핵산과 관련하여 기재될 수 있고, 예를 들면 이것은 예를 들면 디폴트 매개변수를 사용하여 BLASTN(또는 CLUSTAL 또는 임의의 다른 이용 가능한 정렬 소프트웨어)에 의해 측정된 것과 같이 기준 핵산 또는 이의 단편과 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있다. 1개의 분자가 더 큰 분자와 소정의 백분율의 서열 동일성을 갖는다고 말해질 때, 이는 2개의 분자가 최적으로 정렬될 때 더 작은 분자에서의 잔기의 상기 백분율이 2개의 분자가 최적으로 정렬되는 순서에 따라 더 큰 분자에서의 일치 잔기를 발견한다는 것을 의미한다.

용어 "실질적으로 동일한" 및 이의 문법적 균등물은 핵산 또는 아미노산 서열에 적용되면서 핵산 또는 아미노산 서열이 표준 매개변수를 사용하여 상기에 기재된 프로그램, 예를 들면 BLAST를 사용하여 기준 서열과 비교될 때 적어도 90% 또는 초과, 적어도 95%, 적어도 98% 및 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 예를 들면, (뉴클레오타이드 서열에 대한) BLASTN 프로그램은 디폴트로서 11의 워드 길이(W), 10의 기대치(E), M=5, N=-4 및 가닥 둘 다의 비교를 이용한다. 아미노산 서열에 대해, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 3의 워드 길이(W), 10의 기대치(E) 및 BLOSUM62 스코어링 행렬을 이용한다(Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992) 참조). 서열 동일성의 백분율은 비교 창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정되고, 비교 창에서의 폴리뉴클레오타이드 서열의 부분은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 기준 서열(부가 또는 결실을 함유하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 일치된 위치의 수를 생성하도록 서열 둘 다에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 수를 결정하고, 비교 창에서 위치의 총 수로 일치된 위치의 수를 나누고, 그 결과에 100을 곱해 서열 동일성의 백분율을 생성하여 백분율이 계산된다. 실시형태에서, 실질적인 동일성은 적어도 약 100개의 잔기의 영역에 걸쳐 적어도 약 50개의 잔기 길이인 서열의 영역에 걸쳐 존재하고, 실시형태에서, 서열은 적어도 약 150개의 잔기에 걸쳐 실질적으로 동일하다. 실시형태에서, 서열은 암호화 영역의 전체 길이에 걸쳐 실질적으로 동일하다.

"발현 벡터" 또는 "벡터"는, 부착된 분절의 복제 및/또는 발현을 가져오도록 이것에 또 다른 폴리뉴클레오타이드 분절이 부착된, 세포 내의 폴리뉴클레오타이드 복제의 자율 단위로서 거동하거나(즉, 그 자체의 제어 하에 복제를 할 수 있음), 숙주 세포 염색체로의 삽입에 의해 복제를 할 수 있게 하는, 임의의 유전 요소, 예를 들면 플라스미드, 염색체, 바이러스, 트랜스포손이다. 적합한 벡터는 플라스미드, 트랜스포손, 포유류 바이러스, 박테리오파지 및 코스미드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 벡터는 원하는 숙주 세포로의 벡터의 결찰 또는 삽입을 가져오고 부착된 분절의 발현을 가져오는 데 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유할 수 있다. 이러한 서열은 숙주 유기체에 따라 다르고; 이것은 전사를 가져오는 프로모터 서열, 전사를 증가시키는 인핸서 서열, 리보솜 결합 부위 서열 및 전사 및 번역 종결 서열을 포함한다. 대안적으로, 발현 벡터는 숙주 세포 DNA 서열로의 벡터의 결찰 또는 통합 없이 이것 내에 암호화된 핵산 서열 산물을 직접적으로 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 숙주 세포에서 복제할 수 있고 적절한 선택적 압력의 존재 하에 숙주 세포 내의 DNA의 염색체외 분절로서 지속하는 "에피솜 발현 벡터" 또는 "에피솜"이다(예를 들면, Conese 등, Gene Therapy, 11:1735-1742 (2004) 참조).

본원에 사용된 것과 같은 용어 "아데노바이러스" 및 "아데노바이러스 벡터"는 아데노바이러스 생활 주기에 참여하는 능력을 보유하고/하거나 예를 들면 파괴(예를 들면, 음파처리), 변성(예를 들면, 열 또는 용매를 사용함) 또는 가교 연결(예를 들면, 포르말린 가교 연결을 통함)에 의해 물리적으로 불활화된 아데노바이러스를 지칭한다. "아데노바이러스 생활 주기"는 (1) 바이러스 결합 및 세포로의 진입, (2) 아데노바이러스 게놈의 전사 및 아데노바이러스 단백질의 번역, (3) 아데노바이러스 게놈의 복제 및 (4) 바이러스 입자 어셈블리를 포함한다(예를 들면, Fields Virology, 5^th ed., Knipe 등 (eds.), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2006) 참조). 본원에 사용되고 기재된 것과 같은 아데노바이러스는 또한 자연 발생 바이러스 게놈의 하나 이상의 부분의 결실에 의해 복제 결핍이 될 수 있다(즉, 아데노바이러스 생활 주기에 참여하는 능력을 보유하지 않음). 본원에 사용되고 기재된 것과 같은 "아데노바이러스" 및 "아데노바이러스 벡터"는 아데노바이러스 게놈이 아데노바이러스 게놈과 관련하여 비자연적인 핵산 서열을 수용하도록 조작된 아데노바이러스를 포함할 수 있다. 통상적으로, 아데노바이러스 벡터는 예를 들면 아데노바이러스로의 유전자 전달을 위해 비자연적 핵산 서열의 삽입을 수용하도록 아데노바이러스의 아데노바이러스 게놈으로 하나 이상의 돌연변이(예를 들면, 결실, 삽입 또는 치환)를 도입함으로써 생성된다.

본원에 사용된 것과 같은 용어 "선택 가능한 마커 유전자"는 상응하는 선택적 제제의 존재 하에 핵산 서열을 발현하는 세포가 특이적으로 대하여 또는 대항하여 선택되게 하는 핵산 서열을 지칭한다. 적합한 선택 가능한 마커 유전자는 당해 분야에 알려져 있고, 예를 들면 국제 특허 출원 공보 WO 1992/08796호 및 WO 1994/28143호; Wigler 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567 (1980); O'Hare 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981); Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072 (1981); Colberre-Garapin 등, J. Mol. Biol., 150:1 (1981); Santerre 등, Gene, 30: 147 (1984); Kent 등, Science, 237: 901-903 (1987); Wigler 등, Cell, 11: 223 (1977); Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026 (1962); Lowy 등, Cell, 22: 817 (1980); 및 미국 특허 제5,122,464호 및 제5,770,359호에 기재되어 있다.

본원에 사용된 것과 같은 용어 "암호화 서열"은 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 분절을 지칭한다. 영역 또는 서열은 개시 코돈에 의해 5' 말단에 더 가깝게 결합되고 정지 코돈에 의해 3' 말단에 더 가깝게 결합된다. 암호화 서열은 또한 오픈 리딩 프레임으로 지칭될 수 있다.

본원에 사용된 것과 같은 용어 "작동 가능하게 연결된"은 분절이 이의 의도된 방식으로 기능하게 하는 방식으로 DNA 분절의 또 다른 DNA 분절에 대한 물리적 연결 및/또는 기능적 연결을 지칭한다. 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열은 DNA 서열의 전사의 조절을 직접적으로 또는 간접적으로 허용하는 방식으로 예를 들면 프로모터, 인핸서 및/또는 사일런서와 같은 조절 서열에 연결될 때 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 예를 들면, DNA 서열은 전사 개시 부위와 관련하여 정확한 리딩 프레임에서 프로모터의 전사 개시 부위와 관련하여 하류에 프로모터에 결찰되고 전사 연장이 DNA 서열을 통해 진행하게 할 때 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 인핸서 또는 사일런서는 DNA 서열의 전사를 각각 증가시키거나 감소시키는 방식으로 DNA 서열에 결찰될 때 유전자 산물을 암호화하는 DNA 서열에 작동 가능하게 연결된다. 인핸서 및 사일런서는 DNA 서열의 암호화 영역 상류에, 하류에 배치되거나 이것 내의 임베딩될 수 있다. 신호 서열에 대한 DNA는 신호 서열이 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 단백질원로서 발현되면 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA에 작동 가능하게 연결된다. DNA 서열의 조절 서열에 대한 연결은 통상적으로 적합한 제한 부위에서의 결찰에 의해 또는 당업자에게 알려진 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 서열에서 삽입된 어댑터 또는 링커를 통해 달성된다.

본원에 사용된 것과 같은 용어 "유도한다", "유도" 및 이의 문법적 균등물은 전사의 일부 기저 수준에 비해 전사 조절자에 의해 일어난 핵산 서열 전사, 프로모터 활성 및/또는 발현의 증가를 지칭한다.

용어 "전사 조절자"는 소정의 환경 조건(예를 들면, 리프레서 또는 핵 억제 단백질) 하에 프로모터 유도 DNA 서열의 전사를 방지하거나 억제하거나, 소정의 환경 조건(예를 들면, 인듀서 또는 인핸서) 하에 프로모터 유도 DNA 서열의 전사를 허용하거나 자극하도록 작용하는 생화학 요소를 지칭한다.

본원에 사용된 것과 같은 용어 "인핸서"는 예를 들면 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 증가시키는 DNA 서열을 지칭한다. 인핸서는 핵산 서열의 암호화 영역으로부터 수 킬로염기 떨어져 위치할 수 있고, 조절 인자의 결합, DNA 메틸화의 패턴 또는 DNA 구조 변경을 매개할 수 있다. 여러 가지의 상이한 원천으로부터의 다수의 인핸서는 당해 분야에 잘 알려져 있고, (예를 들면, 기탁, 예컨대 ATCC뿐만 아니라 다른 상업 원천 또는 개별 원천으로부터) 클로닝된 폴리뉴클레오타이드로서 또는 이것 내에 이용 가능하다. 프로모터(예컨대, 흔히 사용된 CMV 프로모터)를 포함하는 다수의 폴리뉴클레오타이드는 또한 인핸서 서열은 포함한다. 인핸서는 암호화 서열 상류에, 내에 또는 하류에 위치할 수 있다. 용어 "Ig 인핸서"는 면역글로불린(Ig) 좌위 내에 맵핑된 인핸서 영역으로부터 유래된 인핸서 요소를 지칭한다(이러한 인핸서는 예를 들면 중쇄(mu) 5' 인핸서, 경쇄(카파) 5' 인핸서, 카파 및 뮤 인트론 인핸서 및 3' 인핸서를 포함함(일반적으로 Paul W. E. (ed), Fundamental Immunology, 3rd Edition, Raven Press, New York (1993), pages 353-363; 및 미국 특허 제5,885,827호 참조).

용어 "프로모터"는 암호화 서열의 전사를 개시하는 폴리뉴클레오타이드의 영역을 지칭한다. 프로모터는 유전자의 전사 출발 부위 근처에, 동일한 가닥에 그리고 DNA에서의 상류에(센스 가닥의 5' 영역을 향해) 위치한다. 일부 프로모터는 이것이 세포에서 모든 상황에서 활성이므로 구성적인 한편, 다른 프로모터는 조절되어 특정 자극, 예를 들면 유도성 프로모터에 반응하여 활성이 된다. 본원에 사용된 것과 같은 용어 "프로모터 활성" 및 이의 문법적 균등물은 활성이 측정되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 뉴클레오타이드 서열의 발현의 정도를 지칭한다. 프로모터 활성은 직접적으로 예를 들면 Northern 블롯 분석에 의해 생성된 RNA 전사체의 양을 결정함으로써 또는 간접적으로 연결된 핵산 서열, 예컨대 프로모터에 연결된 리포터 핵산 서열이 암호화하는 산물의 양을 결정함으로써 측정될 수 있다.

본원에 사용된 것과 같은 "유도성 프로모터"는 전사 조절자, 예를 들면 생명적 인자 또는 비생명적 인자의 존재 또는 부재에 의해 활성으로 유도된 프로모터를 지칭한다. 유도성 프로모터는 유기체의 소정의 발생 단계에서 또는 특정한 조직에서 켜지거나 꺼질 수 있는 이것에 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현 때문에 유용하다. 유도성 프로모터의 비제한적인 예는 알코올 조절된 프로모터, 테트라사이클린 조절된 프로모터, 스테로이드 조절된 프로모터, 금속 조절된 프로모터, 발병 조절된 프로모터, 온도 조절된 프로모터 및 광 조절된 프로모터를 포함한다. 유도성 프로모터는 유전자 스위치 또는 유전 스위치의 부분일 수 있다. 유도성 프로모터는 유전자 스위치 리간드 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 경우에, 유도성 프로모터는 소분자 리간드 유도성 2개 폴리펩타이드 엑디손 수용체 기반 유전자 스위치일 수 있다. 일부 경우에, 유전자 스위치는 제한 없이 국제 특허 출원 WO 2001/070816호; WO 2002/029075호; WO 2002/066613호; WO 2002/066614호; WO 2002/066612호; WO 2002/066615호; WO 2003/027266호; WO 2003/027289호; WO 2005/108617호; WO 2009/045370호; WO 2009/048560호; WO 2010/042189호; WO 2010/042189호; WO 2011/119773호; 및 WO 2012/122025호; 및 미국 특허 제7,091,038호; 제7,776,587호; 제7,807,417호; 제8,202,718호; 제8,105,825호; 제8,168,426호; 제7,531,326호; 제8,236,556호; 제8,598,409호; 제8,715,959호; 제7,601,508호; 제7,829,676호; 제7,919,269호; 제8,030,067호; 제7,563,879호; 제8,021,878호; 제8,497,093호; 제7,935,510호; 제8,076,454호; 제9,402,919호; 제9,493,540호; 제9,249,207호; 및 제9,492,482호에 기재된 임의의 시스템에 기재된 것과 같은 엑디손 기반 수용체 성분으로부터 선택될 수 있고, 이들의 각각은 그 전체가 참고로 포함된다).

용어 "유전자 스위치" 또는 "유전 스위치"는 프로모터와 연관된 반응 요소와 예를 들면 하나 이상의 리간드의 존재 하에 반응 요소 및 프로모터가 혼입된 유전자의 발현을 조절하는 EcR 기반 시스템의 조합을 지칭한다. 엄격하게 조절된 유도성 유전자 발현 시스템 또는 유전자 스위치는 유전자 치료, 세포에서의 단백질의 대규모 제조, 세포 기반 고출력 스크리닝 검정, 기능적 게놈학 및 형질전환 식물 및 동물에서의 특질의 조절과 같은 다양한 분야에 유용하다. 이러한 유도성 유전자 발현 시스템은 리간드 유도성 이종성 유전자 발현 시스템을 포함할 수 있다.

"슬리핑 뷰티(SB: Sleeping Beauty) 트랜스포손 시스템"은 척추동물의 염색체로 DNA 서열을 도입하기 위한 합성 DNA 트랜스포손 시스템을 지칭한다. 상기 시스템의 일부 예시적인 실시형태는 예를 들면 미국 특허 제6,489,458호, 제8,227,432호, 제9,228,180호 및 WO/2016/145146호에 기재되어 있다. 슬리핑 뷰티 트랜스포손 시스템은 슬리핑 뷰티(SB) 트랜스포사제 및 SB 트랜스포손으로 구성된다. 실시형태에서, 슬리핑 뷰티 트랜스포손 시스템은 SB11 트랜스포손 시스템, SB100X 트랜스포손 시스템 또는 SB110 트랜스포손 시스템을 포함할 수 있다.

"트랜스포손" 또는 "전위 가능한 요소"(TE)는 때때로 돌연변이를 생성하거나 역전시키고 세포의 게놈 크기를 변경하는 게놈 내의 이의 위치를 변경할 수 있는 벡터 DNA 서열이다. 전위는 대개 TE의 중복을 발생시킨다. 클래스 I TE는 2개의 단계에서 카피되는데, 처음에 이것은 DNA로부터 RNA로 전사되고, 이후 생성된 RNA는 DNA로 역전사된다. 이후, 이 카피된 DNA는 새로운 위치에서 게놈으로 삽입된다. 역전사 단계는 TE 자체가 암호화할 수 있는 역전사효소에 의해 촉매화된다. 레트로트랜스포손의 특징은 레트로바이러스, 예컨대 HIV와 유사하다. 클래스 II TE의 잘라내어 붙여넣기 전위 기전은 RNA 중간체를 수반하지 않는다. 전위는 몇몇 트랜스포사제 효소에 의해 촉매화된다. 일부 트랜스포사제는 DNA에서의 임의의 표적 부위에 비특이적으로 결합하는 반면에, 다른 트랜스포사제는 특이적 DNA 서열 표적에 결합한다. 트랜스포사제는 표적 부위에서 시차를 둔 잘라내기를 만들어서 단일 가닥 5' 또는 3' DNA 오버행(점착성 말단)을 생성시킨다. 이 단계는 DNA 트랜스포손을 잘라내고, 이후 이것은 새로운 표적 부위로 결찰되고; 이 과정은 갭을 충전하는 DNA 중합효소 및 당-포스페이트 골격에 가까운 DNA 리가제의 활성을 수반한다. 이는 표적 부위의 중복을 발생시킨다. DNA 트랜스포손의 삽입 부위는 표적 DNA에서 시차를 둔 절단 및 DNA 중합효소에 의한 충전에 의해 생성될 수 있는 짧은 직접적인 반복부, 이어서 트랜스포사제에 의한 TE 절제에 중요한 일련의 도립 반복부에 의해 확인될 수 있다. 잘라내어 붙여넣기 TE는 도너 부위가 이미 복제되지만 표적 부위가 아직 중복되지 않을 때 이의 전위가 세포 주기의 S 기 동안 발생하면 중복될 수 있다. 전위는 클래스 I 및 클래스 II TE 둘 다에서 자율적 또는 비자율적 중 어느 하나로서 분류될 수 있다. 자율적 TE는 스스로 움직일 수 있는 한편, 비자율적 TE는 움직이는 또 다른 TE의 존재를 요한다. 이는 대개 비자율적 TE가 (클래스 II에 대해서는) 트랜스포사제 또는 (클래스 I에 대해서는) 역전사효소가 부족하기 때문이다.

"트랜스포사제"는 트랜스포손의 말단에 결합하고, 잘라내어 붙여넣기 기전 또는 복제 전위 기전에 의한 트랜스포손의 게놈의 또 다른 부분에 대한 이동을 촉매화하는 효소를 지칭한다.

본원에 사용된 것과 같은 "T 세포" 또는 "T 림프구"는 세포 매개된 면역력에서 중요한 역할을 하는 림프구의 유형이다. 이것은 세포 표면 상의 T 세포 수용체(TCR)의 존재에 의해 다른 림프구, 예컨대 B 세포 및 자연 살해 세포(NK 세포)와 구별될 수 있다.

"T 헬퍼 세포"(T_H 세포)는 혈장 세포 및 기억 B 세포로의 B 세포의 성숙 및 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화를 포함하는 면역학적 과정에서 다른 백혈구를 돕는다. 이 세포는 또한 이의 표면에 CD4 당단백질을 발현하기 때문에 CD4+ T 세포로서 알려져 있다. 헬퍼 T 세포는 항원 제시 세포(APC)의 표면에서 발현된 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩타이드 항원으로 제시될 때 활성화된다. 이것은 활성화되면 신속히 분열하고 활성 면역 반응을 조절하거나 이를 돕는 사이토카인이라 칭하는 작은 단백질을 분비한다. 이 세포는 상이한 유형의 면역 반응을 수월하게 하도록 상이한 사이토카인을 분비하는 T_H1, T_H2, T_H3, T_H9, T_H17, T_H22 또는 T_FH(T 소포성 헬퍼 세포)를 포함하는 몇몇 하위유형 중 하나로 분화할 수 있다. APC로부터의 신호전달은 특정한 하위유형으로 T 세포를 지시한다.

"세포독성 T 세포"(TC 세포 또는 CTL) 또는 "세포독성 T 림프구"는 바이러스 감염된 세포 및 종양 세포를 파괴하고, 또한 이식 거부에 연루된다. 이 세포는 또한 이의 표면에서 CD8 당단백질을 발현하기 때문에 CD8+ T 세포로서 알려져 있다. 이 세포는 모든 유핵 세포의 표면에 존재하는 MHC 클래스 I 분자와 연관된 항원에 결합함으로써 이의 표적을 인식한다. 조절 T 세포에 의해 분비된 IL-10, 아데노신 및 다른 분자를 통해, CD8+ 세포는 아네르기 상태로 비활성화될 수 있고, 이는 자가면역 질환을 예방한다.

"기억 T 세포"는 감염이 해소된 후 장기간 지속하는 항원 특이적 T 세포의 하위집단이다. 이것은 이의 동족 항원에 대한 재노출 시 다수의 효과기 T 세포로 신속히 팽창하여서 과거 감염에 대한 기억을 면역계에 제공한다. 기억 T 세포는 중앙 기억 T 세포(T_CM 세포) 및 2개의 유형의 효과기 기억 T 세포(T_EM 세포 및 T_EMRA 세포)의 3개의 하위집단을 포함한다. 기억 세포는 CD4+ 또는 CD8+ 중 어느 하나일 수 있다. 기억 T 세포는 통상적으로 세포 표면 단백질 CD45RO, CD45RA 및/또는 CCR7을 발현한다.

억제자 T 세포로 이전에 알려진 "조절 T 세포"(Treg 세포)는 면역학적 관용성의 유지에서 역할을 한다. 이의 주요 역할은 면역 반응의 종료를 향해 T 세포 매개된 면역력을 셧다운하고 흉선에서 음성 선택의 과정을 회피항 자가반응성 T 세포를 억제하는 것이다.

"자연 살해 T 세포"(NKT 세포 - 선천성 면역계의 자연 살해 세포와 혼동되지 않음)는 적응 면역계를 선천성 면역계와 브릿징한다. 주요 조직접합성 복합체(MHC) 분자에 의해 제시된 펩타이드 항원을 인식하는 종래의 T 세포와 달리, NKT 세포는 CD1d라 칭하는 분자에 의해 제시된 당지질 항원을 인식한다. 이 세포는 활성화되면 T 헬퍼(T_H) 및 세포독성 T(TC) 세포 둘 다에 기인한 기능을 수행할 수 있다(즉, 사이토카인 생성 및 세포용해/세포 사멸 분자의 방출). 이것은 또한 일부 종양 세포 및 헤르페스 바이러스로 감염된 세포를 인식하고 제거할 수 있다.

"입양 T 세포 전달"은 백신접종 단독 또는 환자의 자연 종양 반응에 의해 얻을 수 있는 것보다 더 많은 수의 T 세포를 달성하기 위한 종양 특이적 T 세포의 단리 및 생체외 팽창을 지칭한다. 이후, 종양 특이적 T 세포는 암을 공격하고 사멸할 수 있는 T 세포를 통해 남은 종양을 제압하는 능력을 이의 면역계에 제공하려는 시도로 암을 갖는 환자에게 주입된다. 종양 침윤 림프구 또는 TIL을 배양하고, 하나의 특정한 T 세포 또는 클론을 단리시키고 팽창시키고, 심지어 종양을 강력하게 인식하고 공격하도록 조작된 T 세포를 사용하는, 암 치료에 사용되는 많은 형태의 T 세포 치료가 있다.

본원에 사용된 것과 같은 "항체"는 단일클론 항체 또는 다중클론 항체를 지칭한다. 본원에 사용된 것과 같은 용어 "클론 항체"는 B 세포의 단일 클론에 의해 생성되고 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 지칭한다. 반대로, "다중클론 항체"는 상이한 B 세포에 의해 생성되고 동일한 항원의 상이한 에피토프에 결합하는 항체의 집단을 지칭한다. 전체 항체는 통상적으로 중(H)쇄 폴리펩타이드의 2개의 동일한 카피 및 경(L)쇄 폴리펩타이드의 2개의 동일한 카피인 4개의 폴리펩타이드로 이루어진다. 각각의 중쇄는 1개의 N-말단 가변(VH) 영역 및 3개의 C-말단 불변(CH1, CH2 및 CH3) 영역을 함유하고, 각각의 경쇄는 1개의 N-말단 가변(VL) 영역 및 1개의 C-말단 불변(CL) 영역을 함유한다. 경쇄 및 중쇄의 각각의 쌍의 가변 영역은 항체의 항원 결합 부위를 형성한다. VH 영역 및 VL 영역은 유사한 일반 구조를 갖고, 각각의 영역은 서열이 비교적 보존된 4개의 프레임워크 영역을 포함한다. 프레임워크 영역은 3개의 상보성 결정 영역(CDR)에 의해 연결된다. CDR1, CDR2 및 CDR3으로 알려진 3개의 CDR은 항원 결합을 담당하는 항체의 "초가변 영역"을 형성한다.

"항체 유사 분자"는 파트너에 선택적으로 결합할 수 있는 예를 들면 Ig-슈퍼패밀리의 구성원인 단백질일 수 있다. MHC 분자 및 T 세포 수용체는 이러한 분자이다. 일 실시형태에서, 항체 유사 분자는 TCR이다. 일 실시형태에서, TCR은 이의 MHC 결합 친화도를 증가시키도록 변형된다.

용어 "항체의 단편", "항체 단편", "항체의 기능적 단편", "항원 결합 부분" 또는 이의 문법적 균등물은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 부분을 의미하도록 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다(일반적으로, Holliger 등, Nat. Biotech., 23(9):1126-1129 (2005) 참조). 항체 단편은 바람직하게는 예를 들면 하나 이상의 CDR, 가변 영역(또는 이의 일부분), 불변 영역(또는 이의 일부분) 또는 이들의 조합을 포함한다. 항체 단편의 비제한적인 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 줄기 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) 항체의 단일 아암의 VL 도메인 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) 2개의 도메인이 단일 폴리펩타이드 사슬로서 합성되게 하는 합성 링커에 의해 연결된 Fv 단편의 2개의 도메인(즉, VL 및 VH)으로 이루어진 1가 분자인 단일 사슬 Fv(scFv)(예를 들면, Bird 등, Science, 242: 423-426 (1988); Huston 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); 및 Osbourn 등, Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998) 참조) 및 (v) 폴리펩타이드 사슬의 이합체인 디아바디(각각의 폴리펩타이드 사슬은 동일한 폴리펩타이드 사슬에서 VH와 VL 사이에 쌍 짓는 것을 허용하기에 너무 짧은 펩타이드 링커에 의해 VL에 연결된 VH를 포함하여서 2개의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 이합체 분자를 생성하기 위해 상이한 VH-VL 폴리펩타이드 사슬에서 상보성 도메인 사이의 쌍 짓기를 유도함)를 포함한다. 항체 단편은 당해 분야에 알려져 있고, 예를 들면 미국 특허 8,603,950호에 더 자세히 기재되어 있다.

"항원 인식 모이어티" 또는 "항원 인식 도메인"은 항원에 특이적으로 결합하는 분자 또는 분자의 일부분을 지칭한다. 일 실시형태에서, 항원 인식 모이어티는 항체, 항체 유사 분자 또는 이의 단편이고, 항원은 종양 항원이다.

용어 "보존적 아미노산 치환" 또는 "보존적 돌연변이"는 1개의 아미노산의 공통 특성을 갖는 또 다른 아미노산에 의한 대체를 지칭한다. 개별 아미노산 사이의 공통 특성을 정의하기 위한 기능적 방식은 동종성 유기체의 상응하는 단백질 사이의 아미노산 변화의 정규화된 빈도를 분석하는 것이다(Schulz, G. E. 및 Schirmer, R. H., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)). 이러한 분석에 따르면, 아미노산의 그룹이 정의될 수 있고, 여기서 그룹 내의 아미노산은 서로 우선적으로 교환하고, 따라서 전체 단백질 구조에 대한 이의 영향에서 가장 서로 닮는다(상기 Schulz, G. E. 및 Schirmer, R. H. 문헌). 보존적 돌연변이의 예는 상기 하위그룹 내의 아미노산의 아미노산 치환, 예를 들면 양전하가 유지될 수 있도록 아르기닌에 대한 리신의 치환 및 그 반대; 음전하가 유지될 수 있도록 아스파르트산에 대한 글루탐산의 치환 및 그 반대; 유리 -OH가 유지될 수 있도록 트레오닌에 대한 세린의 치환; 및 유리 -NH₂가 유지될 수 있도록 아스파라긴에 대한 글루타민의 치환을 포함한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 기능적 변이체는 적어도 하나의 비보존적 아미노산 치환에 의한 기준 단백질의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

용어 "비보존적 돌연변이"는 상이한 그룹 사이의 아미노산 치환, 예를 들면 트립토판에 대한 리신의 치환 또는 세린에 대한 페닐알라닌의 치환 등을 수반한다. 이 경우에, 비보존적 아미노산 치환이 기능적 변이체와 간섭하지 않거나 이의 생물학적 활성을 억제하지 않는 것이 바람직하다. 비보존적 아미노산 치환은 기능적 변이체의 생물학적 활성을 향상시킬 수 있어서, 기능적 변이체의 생물학적 활성은 동종성 모 단백질과 비교하여 증가된다.

본원에서 지칭되는 것과 같은 용어 "증식성 질환"은 과도한 세포 증식 및/또는 세포 기질의 턴오버가 암을 포함하는 질환의 발병에 상당히 기여하는 통합 개념을 지칭한다.

본원에 사용된 것과 같은 "환자" 또는 "대상체"는 증식성 장애, 예컨대 암으로 진단되거나 이것을 갖거나 발생시키는 것으로 의심되는 포유류 대상체를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 용어 "환자"는 증식성 장애, 예컨대 암을 발생시킬 평균 가능성보다 높은 포유류 대상체를 지칭한다. 예시적인 환자는 인간, 유인원, 개, 돼지, 소, 고양이, 말, 염소, 양, 설치류 및 본원에 개시된 치료제로부터 이익일 수 있는 다른 포유류일 수 있다. 예시적인 인간 환자는 남성 및/또는 여성일 수 있다. "이를 필요로 하는 환자" 또는 "이를 필요로 하는 대상체"는 질환 또는 장애, 예를 들면 비제한적인 예로서 인간 파필로마 바이러스(HPV) 감염으로 진단되거나 이것을 갖는 것으로 의심되는 환자로서 본원에 지칭된다.

"투여하는"는 환자 또는 대상체에게 본원에 기재된 하나 이상의 조성물을 제공하는 것으로서 본원에 지칭된다. 제한이 아니라 예에 의해, 조성물 투여, 예를 들면 주사는 정맥내(i.v.) 주사, 피하(s.c.) 주사, 진피내(i.d.) 주사, 복강내(i.p.) 주사 또는 근육내(i.m.) 주사에 의해 수행될 수 있다. 하나 이상의 이러한 경로가 이용될 수 있다. 비경구 투여는 예를 들면 볼루스 주사 또는 시간에 걸친 점진적인 관류에 의할 수 있다. 대안적으로 또는 동시에, 투여는 경구 투여에 의할 수 있다. 추가적으로, 투여는 또한 수술적 침적 또는 의학 장치의 배치에 의할 수 있다. 약학 조성물은 본원에 기재된 것과 같은 본 발명의 조성물을 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 조합하여 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 완충액, 예컨대 천연 완충 식염수, 인산염 완충 식염수 및 기타; 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만니톨; 단백질; 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예컨대 글리신; 항산화제; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA 또는 글루타티온; 아쥬반트(예를 들면, 수산화알루미늄); 및 보존제를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 것과 같이, 용어 "치료", "치료하는" 또는 이의 문법적 균등물은 원하는 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 실시형태에서, 그 효과는 치료학적이고, 즉 그 효과는 질환 및/또는 불리한 증상 또는 질환에 기인한 병리학적 징후를 부분적으로 또는 완전히 치유한다. 이를 위해, 본 발명의 방법은 치료학적 유효량의 본 발명의 핵산 서열을 발현하는 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 핵산 서열을 포함하는 벡터를 투여하는 것을 포함한다.

용어 "치료학적 유효량", 치료학적 양", "면역학적 유효량", "항종양 유효량", "종양 억제 유효량" 또는 이의 문법적 균등물은 원하는 치료 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량에서 그리고 필요한 시간 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 치료학적 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중 및 하나 이상의 대상체에서 원하는 반응을 일으키는 본원에 기재된 조성물의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다.

대안적으로, 환자 또는 대상체에 대한 본원에 기재된 하나 이상의 조성물의 투여의 약리학적 투여 및/또는 생리학적 투여는 "예방적"일 수 있고, 즉 그 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방한다. "예방학적 유효량"는 원하는 예방 결과(예를 들면, 질환의 예방 또는 표적 병리학의 징후의 예방)를 달성하기 위해 필요한 투여량에서 그리고 필요한 시간 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.

폴리펩타이드 및 아미노산 서열을 참조하여 용어 "순차적인 순서로" 또는 문법적 균등물은 서열의 N-말단에서 C-말단 순서를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드 및 핵산 서열을 참조하여 용어 "순차적인 순서로" 또는 문법적 균등물은 서열의 5'("5 프라임")에서 3'("3 프라임") 순서를 지칭한다.

HPV 분자 백신

인간 파필로마바이러스(HPV)는 200개 초과의 관련된 바이러스의 집단이다. 이 큰 그룹에서의 각각의 HPV 바이러스는 이의 HPV 유형(또는 혈청형)이라 칭하는 숫자가 주어진다. HPV는 피부 또는 점막 세포를 감염시키는 작은 비봉입된 데옥시리보핵산(DNA) 바이러스이다. 원형의 이중 가닥 바이러스 게놈은 대략 8 kb 길이이다. 게놈은 바이러스 복제를 담당하는 7개의 초기 단백질(E1 내지 E7) 및 바이러스 구조 단백질인 2개의 후기 단백질(L1 및 L2)을 암호화한다. 각각의 유전자는 특정 기능을 갖는다. 200개 초과의 알려진 HPV 유형 중 적어도 13개는 자궁경부암을 야기할 수 있고, 다른 항문성기암 및 두경부암과 연관된다. 2개의 가장 흔한 "고위험" 혈청형(HPV16 및 HPV-18)은 모든 자궁경부암의 대략 70%를 야기한다. HPV16 및 HPV-18에서, E6 및 E7인 2개의 주요한 종양단백질은 HPV 연관된 종양에 의해 구성적으로 발현되고, HPV 감염된 세포에서 세포 형질변환의 유도 및 유지에 중요하다. 최근의 증거는 또한 E5 단백질이 또한 바이러스 형질변환에 영향을 미친다는 것을 제시한다. HPV 유형 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 및 82는 발암성으로 여겨진다. 2개의 "저위험" HPV 6 및 11은 상당한 이환율을 야기하는 외부 성기의 흔한 양성 병태인 성기 사마귀를 야기하는 것으로 알려져 있다. HPV는 성 활동의 발생 직후 피크 발생률로 고도로 전파 가능하고, 대부분의 사람은 생애에 언젠가 감염을 획득한다.

성기 사마귀는 매우 흔하고, 항문성기 또는 첨규콘딜롬과 같은 다른 명칭에 의해 또한 알려질 수 있고, 500,000건 내지 1,000,000건의 새로운 사례가 미국에서만 매년 진단된다. HPV6 및 HPV11은 성기 사마귀의 약 90%의 원인이다. 현재의 치료 옵션은 대체로 기저 바이러스 감염의 제거보다는 사마귀의 제거에 집중한다. 넓은 범위의 치료제가 현재 사용 중이고, 이는 매우 가변적이고 극적으로 상이할 수 있다. 그러나, 모든 환자에서 사마귀를 제거하고 사마귀가 다시 생기는 것을 막는 데 있어서 치료는 100% 효과적이지 않다.

바이러스 유사 입자로 구성된 예방 백신은 세포 형질변환을 담당하는 비구조 단백질이 아니라 캡시드 구조에 면역을 오직 유도한다. 동물 모델에서의 초기 HPV 연구는 종 특이적 파필로마바이러스에 의한 접종이 동종성 바이러스 시험감염에 보호를 부여한 면역 반응을 유도한다는 것을 보여주었다. 그러나, 자연적 파필로마바이러스는 조직 배양에서 쉽게 성장할 수 없으므로 백신 개발에 대한 좋은 기질이 아니다. 후속 연구는 이종성 발현 시스템, 예컨대 효모 또는 바큘로바이러스 벡터에서 구조 단백질의 발현으로부터의 바이러스 입자의 생성에서 개시되었다. 결과는 L1 단독의 발현이 참된 HPV 비리온을 형태학적으로 닮지만 바이러스 DNA를 함유하지 않는 바이러스 유사 입자(VLP)의 생성으로 이어졌다는 것을 보여주었다. 이 VLP는 이종성 세포 기질에서 발현될 때 L1 단백질의 자가 조립에 의해 생성된다. 동물 연구에서, VLP는 동종성 바이러스에 의한 고용량 실험 감염을 보호하는 것으로 나타났다. HPV VLP는 마우스 또는 토끼에서 고도로 면역원성이고, 생성된 항체는 슈도비리온 중화 검정에서 시험될때 중화하고 유형 제한되는것으로 나타났다. 변성된 입자에 의한 면역화는 중화 항체를 생성시키거나 실험적 바이러스 시험감염을 보호하지 않고, 이는 중화 에피토프가 입체형태 의존적이라는 것을 나타낸다.

HPV 재조합 백신을 제조하는 방법을 포함하는 조성물, 키트 및 시스템이 본원에 제공된다. 본 개시내용에서의 HPV 재조합 백신(예를 들면, HPV 설계 1-5)은 단백질 조작을 통해 조작된다.

전달 시스템

고릴라 아데노바이러스 셔틀 벡터

본 개시내용의 소정의 양태는 본원에 기재된 하나 이상의 면역 반응 유도 HPV 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 소정의 실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 특정한 실시형태에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 일반적으로 인간에서 양성 병리학과 연관되고, 인간을 포함하는 여러 가지의 종으로부터 단리된 아데노바이러스의 게놈은 광범위하게 연구되었다. 아데노바이러스는 대략 36 kb의 이중 가닥 DNA를 함유하는 중간 크기(90 내지 100 nm)의 비봉입된 정이십면체 바이러스이다. 아데노바이러스 캡시드는 바이러스에 의한 세포의 감염의 초기 단계의 핵심적인 상호작용을 매개하고, 아데노바이러스 생활 주기의 종료 시 아데노바이러스 게놈을 패키징하는 데 필요하다. 캡시드는 240개의 헥손, 12개의 펜톤 염기 단백질 및 12개의 섬유를 포함하는 252개의 캡소머를 포함한다(Ginsberg 등, Virology, 28: 782-83 (1966)). 헥손은 3개의 동일한 단백질, 즉 폴리펩타이드 II를 포함한다(Roberts 등, Science, 232: 1148-51 (1986)). 펜톤 염기는 5개의 동일한 단백질을 포함하고, 섬유는 3개의 동일한 단백질을 포함한다. 단백질 IIIa, VI 및 IX는 아데노바이러스 코트에 존재하고, 바이러스 캡시드를 안정화하는 것으로 여겨진다(Stewart 등, Cell, 67: 145-54 (1991) 및 Stewart 등, EMBO J., 12(7): 2589-99 (1993)). pIX를 제외하고 캡시드 단백질의 발현은 아데노바이러스 중합효소 단백질에 따라 달라진다. 따라서, 아데노바이러스 입자의 주요 성분은 중합효소 단백질 유전자가 존재하고 발현될 때에만 게놈으로부터 발현된다.

아데노바이러스의 몇몇 특징은 치료 분야를 위해 세포에 유전 재료를 전달하기 위해(즉, "유전자 치료") 또는 백신 분야를 위해 항원 전달 시스템으로서 사용하기 위해 이것을 이상적인 비히클로 만든다. 예를 들면, 아데노바이러스는 높은 역가(예를 들면, 약 10¹³개의 입자 단위(pu))로 생성될 수 있고, 비복제 세포 및 복제 세포로 유전 재료를 전달할 수 있다. 아데노바이러스 게놈은 다량의 외인성 DNA(약 8 kb 이하)를 보유하도록 조작될 수 있고, 아데노바이러스 캡시드는 훨씬 더 긴 서열의 전달을 강화할 수 있다(Curiel 등, Hum. Gene Ther., 3: 147-154 (1992)). 추가적으로, 아데노바이러스는 일반적으로 숙주 세포 염색체로 통합되지 않고, 오히려 선형 에피솜으로서 유지되어서, 재조합 아데노바이러스가 정상 세포 기능을 방해할 가능성을 최소화한다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 아데노바이러스는 고릴라로부터 단리된다. 동양 고릴라(고릴라 베링게이(Gorilla beringei)) 및 서양 고릴라(고릴라 고릴라(Gorilla gorilla))의 2개의 종 내의 4개의 널리 인식된 고릴라 하위종이 있다. 서양 고릴라 종은 하위종 웨스턴 로우랜드 고릴라(Western Lowland Gorilla)(고릴라 고릴라 고릴라) 및 크로스 리버 고릴라(Cross River Gorilla)(고릴라 고릴라 디엘리)를 포함한다. 동양 고릴라 종은 하위종 마운틴 고릴라(Mountain Gorilla)(고릴라 베링게이 베링게이) 및 이스턴 로우랜드 고릴라(Eastern Lowland Gorilla)(고릴라 베링게이 그라우에리)를 포함한다(예를 들면, Wilson 및 Reeder, eds., Mammalian Species of the World, 3^rd ed., Johns Hopkins University Press, Baltimore, Maryland (2005) 참조). 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 아데노바이러스는 마운틴 고릴라(고릴라 베링게이 베링게이)로부터 단리된다.

다양한 고릴라 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 국제 특허 출원 공보 WO 2013/052832호; WO 2013/052811호; 및 WO 2013 052799호에 기재되어 있고, 이들의 각각은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.

아데노바이러스는 아데노바이러스 벡터, 예를 들면 유전자 전달 비히클로서 사용되는 이전에 알려진 아데노바이러스와 동일한 방식으로 변형될 수 있다. 아데노바이러스 및 아데노바이러스 벡터는 복제 유능, 조건적으로 복제 유능 또는 복제 결핍일 수 있다.

복제 유능 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 통상적인 숙주 세포, 즉 통상적으로 아데노바이러스에 의해 감염될 수 있는 세포에서 복제할 수 있다. 복제 유능 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 숙주 세포에서 바이러스 복제를 억제하지 않는 아데노바이러스 게놈에서 야생형 아데노바이러스(예를 들면, 하나 이상의 결실, 삽입 및/또는 치환)와 비교하여 하나 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 예를 들면, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 게놈의 전파에 필수적이지 않은 E3 영역으로 알려진 아데노바이러스 초기 영역의 부분 결실 또는 전체 결실을 가질 수 있다.

조건적으로 복제하는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 미리 결정된 조건 하에 복제하도록 조작된 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터이다. 예를 들면, 복제 필수 유전자 기능, 예를 들면 아데노바이러스 초기 영역에 의해 암호화된 유전자 기능은 유도성, 억제성 또는 조직 특이적 전사 제어 서열, 예를 들면 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 복제는 전사 제어 서열을 방해하는 특이적 인자의 존재 또는 부재를 요한다. 조건적으로 복제하는 아데노바이러스 벡터는 미국 특허 5,998,205호에 추가로 기재되어 있다.

복제 결핍 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 통상적인 숙주 세포, 특히 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 의해 감염되는 인간에서의 것에서 복제하지 않도록, 예를 들면 하나 이상의 복제 필수 유전자 기능 또는 영역에서의 결핍의 결과로서 복제에 필요한 하나 이상의 유전자 기능 또는 아데노바이러스 게놈의 영역의 보완을 요하는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터이다.

본원에 사용된 것과 같은 유전자 기능 또는 게놈 영역에서의 결핍은 핵산 서열이 전체적으로 또는 부분적으로 파괴되는(예를 들면, 결실되는) 유전자의 기능을 없애거나 손상시키도록(예를 들면, 유전자 산물의 기능이 적어도 약 2배, 5배, 10배, 20배, 30배 또는 50배만큼 감소되도록) 아데노바이러스 게놈의 충분한 유전 재료의 파괴(예를 들면, 결실)로서 정의된다. 전체 유전자 영역의 결실은 대개 복제 필수 유전자 기능의 파괴에 필요하지 않다. 그러나, 하나 이상의 전이유전자에 대한 아데노바이러스 게놈에서의 충분한 공간을 제공하는 목적을 위해 대부분의 하나 이상의 유전자 영역의 제거가 바람직할 수 있다. 유전 재료의 결실이 바람직하지만, 부가 또는 치환에 의한 유전 재료의 돌연변이는 또한 유전자 기능을 파괴하기 위해 적절하다. 복제 필수 유전자 기능은 아데노바이러스 복제(예를 들면, 전파)에 필요하고, 예를 들면 아데노바이러스 초기 영역(예를 들면, E1, E2 및 E4 영역), 후기 영역(예를 들면, L1, L2, L3, L4 및 L5 영역), 바이러스 패키징에 관여된 유전자(예를 들면, IVa2 유전자) 및 바이러스 연관된 RNA(예를 들면, VA-RNA-1 및/또는 VA-RNA-2)에 의해 암호화된 유전자 기능이다.

아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 복제 유능이든 또는 복제 결핍이든, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 적어도 일부분을 보유한다. 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 단백질 암호화 영역 및 비단백질 암호화 영역을 포함하는 아데노바이러스 게놈의 임의의 일부분을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 예를 들면 초기 영역 유전자(즉, E1A, E1B, E2A, E2B, E3 및/또는 E4 영역) 중 어느 하나에 의해 암호화된 단백질 또는 바이러스 구조 단백질을 암호화하는 후기 영역 유전자(즉, L1, L2, L3, L4 및 L5 영역) 중 어느 하나에 의해 암호화된 단백질과 같은 임의의 적합한 아데노바이러스 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.

아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 바람직하게는 pIX 단백질, DNA 중합효소 단백질, 펜톤 단백질, 헥손 단백질 및/또는 섬유 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함한다. 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 단백질의 전장 아미노산 서열을 암호화하는 전장 핵산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 단백질의 전장 아미노산 서열의 일부분을 암호화하는 전장 핵산 서열의 일부분을 포함할 수 있다.

핵산 서열의 "일부분"은 적어도 10개의 뉴클레오타이드(예를 들면, 약 10개 내지 약 5000개의 뉴클레오타이드)를 포함한다. 바람직하게는,핵산 서열의 "일부분"은 10개 이상(예를 들면, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 40개 이상, 45개 이상, 50개 이상 또는 100개 이상)의 뉴클레오타이드, 그러나 5,000개 미만(예를 들면, 4900개 이하, 4000개 이하, 3000개 이하, 2000개 이하, 1000개 이하, 800개 이하, 500개 이하, 300개 이하 또는 100개 이하)의 뉴클레오타이드를 포함한다. 바람직하게는, 핵산 서열의 일부분은 약 10개 내지 약 3500개의 뉴클레오타이드(예를 들면, 약 10개, 20개, 30개, 50개, 100개, 300개, 500개, 700개, 1000개, 1500개, 2000개, 2500개 또는 3000개의 뉴클레오타이드), 약 10개 내지 약 1000개의 뉴클레오타이드(예를 들면, 약 25개, 55개, 125개, 325개, 525개, 725개 또는 925개의 뉴클레오타이드) 또는 약 10개 내지 약 500개의 뉴클레오타이드(예를 들면, 약 15개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 150개, 175개, 250개, 275개, 350개, 375개, 450개, 475개, 480개, 490개, 495개 또는 499개의 뉴클레오타이드) 또는 상기 값의 임의의 2개에 의해 정의된 범위이다. 더 바람직하게는, 핵산 서열의 "일부분"은 약 3200개 이하의 뉴클레오타이드(예를 들면, 약 10개 내지 약 3200개의 뉴클레오타이드, 약 10개 내지 약 3000개의 뉴클레오타이드 또는 약 30개 내지 약 500개의 뉴클레오타이드 또는상기 값의 임의의 2개에 의해 정의된 범위)를 포함한다.

아미노산 서열의 "일부분"은 적어도 3개의 아미노산(예를 들면, 약 3개 내지 약 1,200개의 아미노산)을 포함한다. 바람직하게는, 아미노산 서열의 "일부분"은 3개 이상(예를 들면, 5개 이상, 10개 이상, 15개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 40개 이상 또는 50개 이상)의 아미노산, 그러나 1,200개 미만(예를 들면, 1,000개 이하, 800개 이하, 700개 이하, 600개 이하, 500개 이하, 400개 이하, 300개 이하, 200개 이하 또는 100개 이하)의 아미노산을 포함한다. 바람직하게는, 아미노산 서열의 일부분은 약 3개 내지 약 500개의 아미노산(예를 들면, 약 10개, 100개, 200개, 300개, 400개 또는 500개의 아미노산), 약 3개 내지 약 300개의 아미노산(예를 들면, 약 20개, 50개, 75개, 95개, 150개, 175개 또는 200개의 아미노산) 또는 약 3개 내지 약 100개의 아미노산(예를 들면, 약 15개, 25개, 35개, 40개, 45개, 60개, 65개, 70개, 80개, 85개, 90개, 95개 또는 99개의 아미노산) 또는 상기 값의 임의의 2개에 의해 정의된 범위이다. 더 바람직하게는, 아미노산 서열의 "일부분"은 약 500개 이하의 아미노산(예를 들면, 약 3개 내지 약 400개의 아미노산, 약 10개 내지 약 250개의 아미노산 또는 약 50개 내지 약 100개의 아미노산 또는 상기 값의 임의의 2개에 의해 정의된 범위)을 포함한다.

아데노바이러스 pIX 단백질은 아데노바이러스 캡시드에 존재하고, 헥손 9합체 상호작용을 강화하는 것으로 나타났고, 전장 게놈의 패키징에 필수적이다(예를 들면, Boulanger 등, J. Gen. Virol., 44: 783-800 (1979); Horwitz M.S., "Adenoviridae and their replication" in Virology, 2^nd ed., B.N. Fields 등 (eds.), Raven Press, Ltd., New York, pp. 1679-1721 (1990), Ghosh-Choudhury 등, EMBO J., 6: 1733-1739 (1987) 및 van Oostrum 등, J. Virol., 56: 439-448 (1985) 참조). pIX는 아데노바이러스 구조에 대한 이의 기여 이외에 또한 전사 특성, 예컨대 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(MLP) 활성의 자극을 나타내는 것으로 나타났다(예를 들면, Lutz 등, J. Virol., 71(7): 5102-5109 (1997) 참조).

아데노바이러스 DNA 중합효소 단백질은 시험관내 및 생체내 둘 다에서 바이러스 DNA 복제에 필수적이다. 중합효소는 아데노바이러스 DNA의 5' 말단에 공유 부착된 말단 단백질(TP)의 전구체(pTP)와의 복합체에서 공동정제된다(Field 등, J. Biol. Chem., 259: 9487-9495 (1984)). 아데노바이러스 DNA 중합효소 및 pTP 둘 다는 E2 영역에 의해 암호화된다. 중합효소 단백질은 pIX를 제외하고 모든 구조 단백질의 발현에 필요하다. 중합효소 단백질은 중합효소 단백질에 대한 유전자 서열 없이 생성되지 않는다. 그 결과, 바이러스 게놈은 복제되지 않고, 주요 후기 프로모터는 활성화되지 않고, 캡시드 단백질은 발현되지 않는다.

아데노바이러스 헥손 단백질은 아데노바이러스 캡시드에서 가장 크고 가장 풍부한 단백질이다. 헥손 단백질은 바이러스 캡시드 어셈블리, 캡시드의 이십면체 대칭의 결정(결국 캡시드 부피 및 DNA 패키징 크기에 대한 한계를 한정함) 및 캡시드의 통합성에 필수적이다. 게다가, 헥손은 아데노바이러스 벡터의 중화를 감소시키기 위해 변형을 위한 주요한 표적이다(예를 들면, Gall 등, J. Virol., 72: 10260-264 (1998) 및 Rux 등, J. Virol., 77(17): 9553-9566 (2003) 참조). 헥손 단백질의 주요 구조 특징은 혈청형에 걸쳐 아데노바이러스에 의해 공유되지만, 헥손 단백질은 혈청형 사이에 크기 및 면역학적 특성이 상이하다(Jornvall 등, J. Biol. Chem., 256(12): 6181-6186 (1981)). 15개의 아데노바이러스 헥손 단백질의 비교는 헥손의 주요 항원 및 혈청형 특이적 영역이 루프 1 및 루프 2(즉, 각각 LI 또는 l1 및 LII 또는 l2)에 있는 것으로 보인다는 것을 밝혀냈고, 이 루프 내에 아데노바이러스 혈청형 사이에 길이 및 서열이 변하는 7개의 구별되는 초가변 영역(HVR1 내지 HVR7)이 있다(Crawford-Miksza 등, J. Virol., 70(3): 1836-1844 (1996)).

아데노바이러스 섬유 단백질은 꼬리, 줄기 및 손잡이인 3개의 도메인을 갖는 아데노바이러스 폴리펩타이드 IV의 동종삼합체이다. (Devaux 등, J. Molec. Biol., 215: 567-88 (1990), Yeh 등, Virus Res., 33: 179-98 (1991)). 섬유 단백질은 손잡이 및 줄기 도메인을 통해 세포 표면 상의 수용체에 대한 주요한 바이러스 결합을 매개한다(Henry 등, J. Virol., 68(8): 5239-46 (1994)). 삼합체화를 위한 아미노산 서열은 손잡이에 위치하고, 이것은 펜톤 염기와 적절히 회합하도록 섬유의 아미노 말단(꼬리)에 필요한 것으로 보인다(Novelli 등, Virology, 185: 365-76 (1991)). 섬유는 세포 수용체를 인식하고 펜톤 염기를 결합시키는 것 이외에 혈청형 동일성에 기여한다. 상이한 아데노바이러스 혈청형으로부터의 섬유 단백질은 상당히 상이하다(예를 들면, Green 등, EMBO J., 2: 1357-65 (1983), Chroboczek 등, Virology, 186: 280-85 (1992) 및 Signas 등, J. Virol., 53: 672-78 (1985) 참조). 따라서, 섬유 단백질은 아데노바이러스의 생활 주기에 핵심인 다수의 기능을 갖는다.

아데노바이러스 펜톤 염기 단백질은 이십면체 캡시드의 꼭짓점에 위치하고, 5개의 동일한 단량체를 포함한다. 펜톤 염기 단백질은 이십면체 캡시드의 다수의 면에서 헥손 단백질을 브릿징하기 위한 구조를 제공하고, 섬유 단백질이 캡시드에서 혼입되기 위한 필수 계면을 제공한다. 펜톤 염기의 각각의 단량체는 RGD 트리펩타이드 모티프를 함유한다(Neumann 등, Gene, 69: 153-157 (1988)). RGD 트리펩타이드는 αv 인테그린에 대한 결합을 매개하고, 펜톤 염기의 RGD 서열에서 점 돌연변이를 갖는 아데노바이러스는 세포를 감염시키는 이의 능력이 제한된다(Bai 등, J. Virol., 67: 5198-5205 (1993)). 따라서, 펜톤 염기 단백질은 캡시드의 구성 및 바이러스 세포 상호작용의 최대 효율에 필수적이다.

본원에 기재된 것과 같은 핵산 또는 아미노산 서열 "동일성"은 관심 있는 핵산 또는 아미노산 서열을 기준 핵산 또는 아미노산 서열과 비교함으로써 결정될 수 있다.　 관심 있는 서열을 생성시키도록 기준 서열에서 (예컨대, 예를 들면 점 돌연변이, 삽입 또는 결실에 의해) 변경되고/되거나 변형된 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 수가 계수된다. 이러한 변경의 총 수는 관심 있는 서열의 총 길이로부터 공제되고, 그 차이는 관심 있는 서열의 길이에 의해 나눠지고 백분율로서 표시된다. 최적 정렬을 얻고 2개 이상의 서열 사이의 동일성을 계산하기 위한 다수의 수학 알고리즘은 알려져 있고, 다수의 이용 가능한 소프트웨어 프로그램으로 일체화된다. 이러한 프로그램의 예는 (핵산 및 아미노산 서열의 정렬을 위해) CLUSTAL-W, T-Coffee 및 ALIGN, BLAST 프로그램(예를 들면, BLAST 2.1, BL2SEQ 및 이의 나중의 버전) 및 (예를 들면, FASTA3x, FASTM 및 SSEARCH)(서열 정렬 및 서열 유사성 조사를 위해) FASTA 프로그램을 포함한다. 서열 정렬 알고리즘은 또한 예를 들면 Altschul 등, J. Molecular Biol., 215(3): 403-410 (1990), Beigert 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106(10): 3770-3775 (2009), Durbin 등, eds., Biological Sequence Analysis: Probabilistic Models of Proteins and Nucleic Acids, Cambridge University Press, Cambridge, UK (2009), Soding, Bioinformatics, 21(7): 951-960 (2005), Altschul 등, Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402 (1997) 및 Gusfield, Algorithms on Strings, Trees and Sequences, Cambridge University Press, Cambridge UK (1997))에 개시되어 있다.

아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 단독으로 또는 임의의 조합으로 상기 언급된 서열의 1개, 2개, 3개, 4개 또는 모든 5개를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 상기 언급된 서열의 임의의 2개의 임의의 조합, 상기 언급된 서열의 임의의 3개의 임의의 조합, 상기 언급된 서열의 임의의 4개의 임의의 조합 또는 상기 언급된 서열의 모든 5개를 포함할 수 있다.

본원에 기술된 것과 같이, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 복제 유능, 조건적으로 복제 또는 복제 결핍일 수 있다. 바람직하게는, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 복제 결핍이어서, 복제 결핍 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 전파를 위해(예를 들면, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성하기 위해) 아데노바이러스 게놈의 하나 이상의 영역의 적어도 하나의 복제 필수 유전자 기능의 보완을 요한다.

복제 결핍 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 전파를 위해 아데노바이러스 게놈의 하나 이상의 영역에서 하나 이상의 복제 필수 유전자 기능의 결핍을 야기하기 위해 임의의 적합한 방식으로 변형될 수 있다. 아데노바이러스 게놈의 하나 이상의 영역의 하나 이상의 복제 필수 유전자 기능의 결핍의 보완은 결핍한 복제 필수 유전자 기능을 제공하기 위한 외인성 수단의 사용을 지칭한다. 이러한 보완은 예를 들면 파괴된 복제 필수 유전자 기능을 암호화하는 보완 세포 및/또는 외인성 DNA(예를 들면, 헬퍼 아데노바이러스)를 사용함으로써 임의의 적합한 방식으로 실행될 수 있다.

아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 오직 초기 영역(즉, E1-E4 영역), 아데노바이러스 게놈의 오직 후기 영역(즉, L1-L5 영역), 아데노바이러스 게놈의 초기 영역 및 후기 영역 둘 다 또는 모든 아데노바이러스 유전자(즉, 고용량 아데노벡터(HC-Ad)의 하나 이상의 복제 필수 유전자 기능이 결핍일 수 있다. Morsy 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 965-976 (1998); Chen 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 1645-1650 (1997); 및 Kochanek 등, Hum. Gene Ther., 10: 2451-2459 (1999)를 참조한다. 복제 결핍 아데노바이러스 벡터의 예는 미국 특허 제5,837,511호; 제5,851,806호; 제5,994,106호; 제6,127,175호; 제6,482,616호; 및 제7,195,896호 및 국제 특허 출원 공보 WO 1994/028152호, WO 1995/002697호, WO 1995/016772호, WO 1995/034671호, WO 1996/022378호, WO 1997/012986호, WO 1997/021826호 및 WO 2003/022311호에 개시되어 있다.

아데노바이러스 게놈의 초기 영역은 E1, E2, E3 및 E4 영역을 포함한다. E1 영역은 E1A 하위영역 및 E1B 하위영역을 포함하고, E1 영역에서의 복제 필수 유전자 기능의 하나 이상의 결핍은 E1A 하위영역 및 E1B 하위영역의 어느 하나 또는 둘 다에서 복제 필수 유전자 기능의 하나 이상의 결핍을 포함할 수 있어서, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 전파하기 위한(예를 들면, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성하기 위한) 아데노바이러스 게놈의 E1A 하위영역 및/또는 E1B 하위영역의 보완을 요한다. E2 영역은 E2A 하위영역 및 E2B 하위영역을 포함하고, E2 영역에서의 복제 필수 유전자 기능의 하나 이상의 결핍은 E2A 하위영역 및 E2B 하위영역의 어느 하나 또는 둘 다에서 복제 필수 유전자 기능의 하나 이상의 결핍을 포함할 수 있어서, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 전파하기 위한(예를 들면, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성하기 위한) 아데노바이러스 게놈의 E2A 하위영역 및/또는 E2B 하위영역의 보완을 요한다.

E3 영역은 임의의 복제 필수 유전자 기능을 포함하지 않아서, 부분적으로 또는 전체적으로 E3 영역의 결실은 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 전파하기 위한(예를 들면, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성하기 위한) E3 영역에서의 임의의 유전자 기능의 보완을 요하지 않는다. 본 개시내용의 맥락에서, E3 영역은 인간 아데노바이러스 5의 E3 영역으로부터의 12.5K 단백질(NCBI 기준 서열 AP_000218)과 높은 상동성으로 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임으로 개시하고, 인간 아데노바이러스 5의 E3 영역으로부터의 14.7K 단백질(NCBI 기준 서열 AP_000224.1)과 높은 상동성으로 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임으로 종료하는 영역으로서 정의된다. E3 영역은 전체적으로 또는 부분적으로 결실될 수 있거나 전체적으로 또는 부분적으로 보유될 수 있다. 결실의 크기는 게놈이 최적 게놈 패키징 크기와 가깝게 일치하는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터를 보유하도록 맞춤될 수 있다. 더 큰 결실은 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 게놈에서 더 큰 이종성 핵산 서열의 삽입을 수용할 것이다. 본 개시내용의 일 실시형태에서, E3 영역에 있는 L4 폴리아데닐화 신호 서열이 보유된다.

E4 영역은 다수의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함한다. ORF6 및 일부 경우에 ORF3을 제외하고 E4 영역의 모든 오픈 리딩 프레임의 결실을 갖는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 전파하기 위한(예를 들면, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성하기 위한) E4 영역에서의 임의의 유전자 기능의 보완을 요하지 않는다. 반대로, E4 영역의 ORF6 및 일부 경우에 ORF3의 파괴 또는 결실(예를 들면, E4 영역의 ORF6 및/또는 ORF3에 기초한 복제 필수 유전자 기능의 결핍)을 갖고, E4 영역 또는 자연적 E4 프로모터의 임의의 다른 오픈 리딩 프레임, 폴리아데닐화 서열 및/또는 우측 도립된 말단 반복부(ITR)의 파괴 또는 결실을 갖거나 갖지 않는, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 전파하기 위한(예를 들면, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성하기 위한) E4 영역(구체적으로, E4 영역의 ORF6 및/또는 ORF3)의 보완을 요한다. 아데노바이러스 게놈의 후기 영역은 L1, L2, L3, L4 및 L5 영역을 포함한다. 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 또한 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 원하면 복제 결핍이게 할 수 있는 국제 특허 출원 공보 WO 2000/000628호에 기술된 것과 같은 주요 후기 프로모터(MLP)에서의 돌연변이를 가질 수 있다.

복제 필수 유전자 기능의 하나 이상의 결핍을 함유하는 아데노바이러스 게놈의 하나 이상의 영역은 바람직하게는, 선택적으로 부분적으로 또는 전체적으로 E3 영역의 결실을 갖는, 아데노바이러스 게놈의 하나 이상의 초기 영역, 즉 E1, E2 및/또는 E4 영역이다.

복제 결핍 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 또한 숙주 세포에서 바이러스 복제를 억제하지 않는 아데노바이러스 게놈에서 야생형 아데노바이러스와 비교하여 하나 이상의 돌연변이(예를 들면, 하나 이상의 결실, 삽입 및/또는 치환)를 가질 수 있다. 따라서, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 복제 필수 유전자 기능의 하나 이상의 기능 이외에 다른 면에서 복제 필수가 아닌 결핍일 수 있다. 예를 들면, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 게놈의 전파에 필수적이지 않은 E3 영역으로 알려진 아데노바이러스 초기 영역의 부분 결실 또는 전체 결실을 가질 수 있다.

일 실시형태에서, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 복제 결핍이고, 최대한 전파를 위해(예를 들면, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성하기 위해) 아데노바이러스 게놈의 E1 영역 또는 E4 영역의 보완을 요한다. 따라서, 복제 결핍 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 전파를 위해(예를 들면, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성하기 위해) 아데노바이러스 게놈의 E1A 하위영역 및/또는 E1B 영역(E1 결핍 아데노바이러스 벡터로 표시됨) 또는 아데노바이러스 게놈의 E4 영역(E4 결핍 아데노바이러스 벡터로 표시됨)의 적어도 하나의 복제 필수 유전자 기능의 보완을 요한다. 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 E1 영역의 적어도 하나의 복제 필수 유전자 기능(바람직하게는 모든 복제 필수 유전자 기능) 및 아데노바이러스 게놈의 비필수 E3 영역의 적어도 하나의 유전자 기능이 결핍일 수 있다(E1/E3 결핍 아데노바이러스 벡터로 표시됨). 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 E4 영역의 적어도 하나의 복제 필수 유전자 기능(바람직하게는 모든 복제 필수 유전자 기능) 및 아데노바이러스 게놈의 비필수 E3 영역의 적어도 하나의 유전자 기능이 결핍일 수 있다(E3/E4 결핍 아데노바이러스 벡터로 표시됨).

일 실시형태에서, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 복제 결핍이고, 최대한 전파를 위해(예를 들면, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성하기 위해) 아데노바이러스 게놈의 E2 영역, 바람직하게는 E2A 하위영역의 보완을 요한다. 따라서, 복제 결핍 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 전파를 위해(예를 들면, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성하기 위해) 아데노바이러스 게놈의 E2A 하위영역(E2A 결핍 아데노바이러스 벡터로 표시됨)의 적어도 하나의 복제 필수 유전자 기능의 보완을 요한다. 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 E2A 영역의 적어도 하나의 복제 필수 유전자 기능(바람직하게는 모든 복제 필수 유전자 기능) 및 아데노바이러스 게놈의 비필수 E3 영역의 적어도 하나의 유전자 기능이 결핍일 수 있다(E2A/E3 결핍 아데노바이러스 벡터로 표시됨).

일 실시형태에서, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 복제 결핍이고, 최대한 전파를 위해(예를 들면, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성하기 위해) 아데노바이러스 게놈의 E1 영역 및 E4 영역의 보완을 요한다. 따라서, 복제 결핍 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 전파를 위해(예를 들면, 아데노바이러스 벡터 입자를 형성하기 위해) 아데노바이러스 게놈의 E1 영역 및 E4 영역 둘 다(E1/E4 결핍 아데노바이러스 벡터로 표시됨)의 적어도 하나의 복제 필수 유전자 기능의 보완을 요한다. 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 게놈의 E1 영역의 적어도 하나의 복제 필수 유전자 기능(바람직하게는 모든 복제 필수 유전자 기능), 아데노바이러스 게놈의 E4 영역의 적어도 하나의 복제 필수 유전자 기능 및 아데노바이러스 게놈의 비필수 E3 영역의 적어도 하나의 유전자 기능이 결핍일 수 있다(E1/E3/E4 결핍 아데노바이러스 벡터로 표시됨). 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 바람직하게는 최대한 전파를 위해 아데노바이러스 게놈의 E1 영역의 보완을 요하고, 전파를 위해 아데노바이러스 게놈의 임의의 다른 결핍의 보완을 요하지 않는다. 더 바람직하게는, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 최대한 전파를 위해 아데노바이러스 게놈의 E1 영역 및 E4 영역의 보완을 요하고, 전파를 위해 아데노바이러스 게놈의 임의의 다른 결핍의 보완을 요하지 않는다.

아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는, 아데노바이러스 게놈의 다수의 복제 필수 유전자 기능이 결핍일 때(예를 들면, E1/E4 결핍 아데노바이러스 벡터), 단일 복제 필수 유전자 기능이 결핍된 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터(예를 들면, E1 결핍 아데노바이러스 벡터)에 의해 달성된 것과 유사한 보완 세포주에서 바이러스 성장을 제공하도록 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 스페이서 서열은 임의의 뉴클레오타이드 서열 또는 원하는 길이를 갖는 서열, 예컨대 적어도 약 15개의 염기 쌍(예를 들면, 약 15개의 뉴클레오타이드 내지 약 12,000개의 뉴클레오타이드), 바람직하게는 약 100개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드, 더 바람직하게는 약 500개의 뉴클레오타이드 내지 약 8,000개의 뉴클레오타이드, 더욱 더 바람직하게는 약 1,500개의 뉴클레오타이드 내지 약 6,000개의 뉴클레오타이드 및 가장 바람직하게는 약 2,000개 내지 약 3,000개의 뉴클레오타이드 길이 또는 상기 값의 임의의 2개에 의해 정의된 범위의 서열을 함유할 수 있다. 스페이서 서열은 아데노바이러스 게놈과 관련하여 암호화 또는 비암호화 및 자연적 또는 비자연적일 수 있지만, 결핍 영역에 대한 복제 필수 기능을 복원하지 않는다. 스페이서는 또한 발현 카세트를 함유할 수 있다. 더 바람직하게는, 스페이서는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터와 관련하여 비자연적인 폴리아데닐화 서열 및/또는 유전자를 포함한다. 아데노바이러스 벡터에서의 스페이서의 사용은 예를 들면 미국 특허 5,851,806호 및 국제 특허 출원 공보 WO 1997/021826호에 추가로 기재되어 있다.

아데노바이러스 게놈의 전부 또는 일부, 예를 들면 아데노바이러스 게놈의 E1 영역, E3 영역 및 E4 영역을 제거함으로써, 생성된 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 캡시드로 패키징되는 능력을 보유하면서 외인성 핵산 서열의 인서트를 수용할 수 있다. 외인성 핵산 서열은 임의의 위치에서의 삽입이 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터 입자의 형성을 허용하는 한 아데노바이러스 게놈에서의 그 위치에서 삽입될 수 있다. 외인성 핵산 서열은 바람직하게는 아데노바이러스 게놈의 E1 영역, E3 영역 또는 E4 영역에 배치된다.

본 개시내용의 복제 결핍 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 바이러스 벡터 스톡의 높은 역가를 생성하기 위해 적절한 수준에서 복제 결핍 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터에 존재하지 않지만 바이러스 전파에 필요한 유전자 기능을 제공하는 보완 세포주에서 생성될 수 있다. 이러한 보완 세포주는 알려져 있고, 293 세포(예를 들면, Graham 등, J. Gen. Virol., 36: 59-72 (1977)에 기재됨), PER.C6 세포(예를 들면, 국제 특허 출원 공보 WO 1997/000326호 및 미국 특허 제5,994,128호 및 제6,033,908호에 기재됨) 및 293-ORF6 세포(예를 들면, 국제 특허 출원 공보 WO 95/34671호 및 Brough 등, J. Virol., 71: 9206-9213 (1997)에 기재됨)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 본 개시내용의 복제 결핍 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터를 생성하기 위한 다른 적합한 보완 세포주는 발현이 숙주 세포에서 바이러스 성장을 억제하는 전이유전자를 암호화하는 아데노바이러스 벡터를 전파시키기 위해 생성된 보완 세포를 포함한다(예를 들면, 미국 특허 출원 공보 제2008/0233650호 참조). 추가의 적합한 보완 세포는 예를 들면 미국 특허 제6,677,156호　및 제6,682,929호 및 국제 특허 출원 공보 WO 2003/020879호에 기재되어 있다. 일부 경우에, 세포 게놈은 복제 결핍 아데노바이러스 벡터의 모든 결핍을 보완하는 유전자 산물인 핵산 서열을 포함할 필요는 없다. 복제 결핍 아데노바이러스 벡터에서 결여된 하나 이상의 복제 필수 유전자 기능은 복제 결핍 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 복제에 필요한 하나 이상의 필수 유전자 기능을 트랜스로 공급하는 헬퍼 바이러스, 예를 들면 아데노바이러스 벡터에 의해 공급될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 본 발명의 복제 결핍 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터에서 결여된 하나 이상의 복제 필수 유전자 기능을 보완하는 비자연적 복제 필수 유전자를 포함할 수 있다. 예를 들면, E1/E4 결핍 아데노바이러스 벡터는 상이한 아데노바이러스(예를 들면, 본 발명의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터와 상이한 혈청형의 아데노바이러스 또는 본 발명의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터와 상이한 종의 아데노바이러스)로부터 얻어지거나 유래된 E4 ORF 6을 암호화하는 핵산 서열을 함유하도록 조작될 수 있다.

아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 전이유전자를 추가로 포함할 수 있다. 용어 "전이유전자"는, 비자연적 핵산 서열이 단백질(예를 들면, 펩타이드 또는 폴리펩타이드)을 생성하도록 발현될 수 있도록, 적절한 조절 요소(예를 들면, 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 비자연적 핵산 서열로서 본원에서 정의된다. 조절 요소(예를 들면, 프로모터)는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터에 자연적 또는 비자연적일 수 있다.

"비자연적" 핵산 서열은 자연 발생 위치에서 아데노바이러스의 자연 발생 핵산 서열이 아닌 임의의 핵산 서열(예를 들면, DNA, RNA 또는 cDNA 서열)이다. 따라서, 비자연적 핵산 서열은 아데노바이러스에서 자연적으로 발견될 수 있지만, 아데노바이러스 게놈 내에 비자연적 위치에 위치하고/하거나 비자연적 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 용어 "비자연적 핵산 서열", "이종성 핵산 서열" 및 "외인성 핵산 서열"은 동의어이고, 본 개시내용의 맥락에서 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 비자연적 핵산 서열은 바람직하게는 DNA이고, 바람직하게는 단백질을 암호화한다(즉, 하나 이상의 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열).

비자연적 핵산 서열은 질환에 대해 포유류를 예방적으로 또는 치료학적으로 치료하기 위해 사용될 수 있는 치료학적 단백질을 암호화할 수 있다. 적합한 치료학적 단백질의 예는 사이토카인, 독소, 종양 억제자 단백질, 성장 인자, 호르몬, 수용체, 미토겐, 면역글로불린, 신경펩타이드, 신경전달물질 및 효소를 포함한다. 대안적으로, 비자연적 핵산 서열은 병원균(예를 들면, 박테리아 또는 바이러스)의 항원을 암호화할 수 있고, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 백신으로서 사용될 수 있다.

바이러스 기반 전달 시스템

본 개시내용은 또한 본원에 기재된 핵산이 삽입된 전달 시스템, 예컨대 바이러스 기반 시스템을 제공한다. 대표적인 바이러스 발현 벡터는 아데노 연관된 바이러스 벡터, 아데노바이러스 기반 벡터, 렌티바이러스 기반 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 헤르페스 바이러스 기반 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 전이유전자의 장기간 안정한 통합 및 딸 세포에서의 이의 전파가 가능하게 하므로 장기간 유전자 전달을 달성하기 위한 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는 비증식 세포, 예컨대 간세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 쥣과 백혈병 바이러스와 같은 종양-레트로바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 부가된 이점을 갖는다. 이것은 또한 낮은 면역원성의 부가된 이점을 갖는다. 추가 실시형태에서, 바이러스 벡터는 아데노 연관된 바이러스 벡터이다. 추가의 실시형태에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 일반적으로 그리고 실시형태에서, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능적인 복제 기원, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 하나 이상의 선택 가능한 마커를 함유한다.

추가의 적합한 벡터는 숙주 세포의 DNA로 무작위로 통합될 수 있거나 발현 벡터와 숙주 세포의 염색체 사이의 특정 재조합이 가능하게 하도록 재조합 부위를 포함할 수 있는 통합 발현 벡터를 포함한다. 이러한 통합 발현 벡터는 원하는 단백질의 발현을 가져오도록 숙주 세포의 염색체의 내인성 발현 제어 서열을 이용할 수 있다. 부위 특이적 방식으로 통합되는 벡터의 예는 예를 들면 Invitrogen(캘리포니아주 칼스바드)으로부터의 flp-in 시스템(예를 들면, pcDNATM5/FRT) 또는 Stratagene(캘리포니아주 라 졸라)으로부터의 pExchange-6 Core Vector에서 발견될 수 있는 것과 같은 cre-lox 시스템의 성분을 포함한다. 숙주 세포 염색체로 무작위로 통합되는 벡터의 예는 예를 들면 Invitrogen(캘리포니아주 칼스바드)으로부터의 pcDNA3.1(T-항원의 부재에서 도입될 때) 및 Promega(위스콘스주 매디슨)로부터의 pCI 또는 pFN10A(ACT) FLEXITM을 포함한다. 추가의 프로모터 요소, 예를 들면 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 통상적으로, 이것은 출발 부위의 30 내지 110 bp 상류의 영역에 위치하지만, 다수의 프로모터는 또한 출발 부위의 하류에 기능적 요소를 함유하는 것으로 최근에 나타났다. 프로모터 요소 사이의 간격은 흔히 융통성이 있어서, 프로모터 기능은 요소가 서로에 대해 도립되거나 이동될 때 보존된다. 티미딘 키나제(tk) 프로모터에서, 프로모터 요소 사이의 간격은 활성이 감소하기 시작하기 전에 떨어져 50 bp로 증가할 수 있다. 프로모터에 따라, 개별 요소가 전사를 활성화하도록 협동적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 보인다.

적합한 프로모터의 하나의 예는 즉시 초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 이 프로모터 서열은 이에 작동가능하게 연결된 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열의 높은 발현 수준을 유도할 수 있는 강한 항시적 프로모터 서열이다.

그러나, 비제한적인 예로서 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡스타인 바 바이러스 즉시 초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터를 포함하는 다른 항시적 프로모터 서열뿐만 아니라 비제한적인 예로서 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터 및 크레아티닌 키나제 프로모터와 같은 인간 유전자 프로모터를 또한 사용할 수 있다. 추가로, 본 개시내용은 항시적 프로모터의 사용으로 제한되지 않아야 한다. 본 개시내용의 부분으로서 유도성 프로모터가 또한 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은 이것이 이러한 발현이 원해질 때 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 끼거나, 발현이 원해지지 않을 때 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

유전자를 세포로 도입하고 이를 발현하는 방법이 당해 분야에 알려져 있다. 발현 벡터의 맥락에서, 벡터는 당해 분야에서의 임의의 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들면 포유류, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포로 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들면, 발현 벡터는 물리적 수단, 화학적 수단 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포로 전달될 수 있다.

폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포로 도입하기 위한 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 포격, 미량주사, 전기천공 및 기타를 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 제조하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들면, Sambrook 등 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001))을 참조한다. 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포로 도입하기 위한 방법은 인산칼슘 형질주입 또는 폴리에틸렌이민(PEI) 형질주입이다.

관심 있는 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포로 도입하기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터 및 특히 레트로바이러스 벡터는 포유류, 예를 들면 인간 세포로 유전자를 삽입하기 위한 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 포진 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노 연관 바이러스 및 기타로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제5,350,674호 및 제5,585,362호를 참조한다.

비바이러스 기반 전달 시스템

폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포로 도입하기 위한 화학적 수단은 콜로이드 분산 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노캡슐, 마이크로구, 비드, 및 수중유 에멀션, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함하는 지질 기반 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체내 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드 시스템은 리포솜(예를 들면, 인공 막 베시클)이다.

지질 제형의 사용은 숙주 세포로의 핵산의 도입(시험관내, 생체외 또는 생체내)을 위해 고려된다. 또 다른 양태에서, 핵산은 지질과 회합될 수 있다. 지질과 회합된 핵산은 리포솜의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포솜의 지질 이중층 내에 섞여 있거나, 리포솜 및 올리고뉴클레오타이드 둘 다와 회합된 연결 분자를 통해 리포솜에 부착되거나, 리포솜에 포획되거나, 리포솜과 복합체화되거나, 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 배합되거나, 지질 중의 현탁액으로서 함유되거나, 미쉘에 함유되거나 복합체화되거나 그렇지 않으면 지질과 회합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 연관된 조성물은 용액 중의 임의의 특정한 구조로 제한되지 않는다. 예를 들면, 이것은 이중층 구조에, 미쉘로서 또는 "붕괴된" 구조에 의해 존재할 수 있다. 이것은 또한 용액 중에 단순히 섞여 있을 수 있어서, 가능하게는 크기 또는 형상이 균일하지 않은 응집체를 형성한다. 지질은 자연 발생일 수 있는 지방 물질 또는 합성 지질이다. 예를 들면, 지질은 세포질에 자연적으로 발생하는 지방 액적뿐만 아니라 장쇄 지방족 탄화수소 및 이의 유도체를 함유하는 화합물의 종류, 예컨대 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올 및 알데하이드를 포함한다.

사용에 적합한 지질은 상업 원천으로부터 얻어질 수 있다. 예를 들면, 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")은 Sigma(미주리주 세인트 루이스)로부터 얻어질 수 있고; 디세틸 포스페이트("DCP")는 K & K Laboratories(뉴욕주 플레인뷰)로부터 얻어질 수 있고; 콜레스테롤("Choi")은 Calbiochem-Behring으로부터 얻어질 수 있고; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 다른 지질은 Avanti Polar Lipids, Inc.(알라바마주 버밍햄)로부터 얻어질 수 있다. 클로로폼 또는 클로로폼/메탄올에서의 지질의 스톡 용액은 약 -20℃에서 저장될 수 있다. 클로로폼은 메탄올보다 더 용이하게 증발되므로 유일한 용매로서 사용된다. "리포솜"은 둘러싸인 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 여러 가지의 단일 및 다중 라멜라 지질 비히클을 포함하는 총칭 용어이다. 리포솜은 인지질 이중층 막 및 내부 수성 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것으로 규명될 수 있다. 다중 라멜라 리포솜은 수성 매질에 의해 분리된 다수의 지질 층을 갖는다. 이것은 인지질이 과량의 수성 용액에 현탁될 때 자연스럽게 형성된다. 지질 성분은 밀폐 구조의 형성 전에 자가 재배열을 겪고, 지질 이중층 사이에 물 및 용해된 용질을 포획한다(Ghosh 등, Glycobiology 5: 505-10 (1991)). 그러나, 용액 중의 보통의 소포 구조와 상이한 구조를 갖는 조성물이 또한 포함된다. 예를 들면, 지질은 미쉘 구조를 취할 수 있거나 단순히 지질 분자의 비균질한 응집체로서 존재할 수 있다. 또한 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.

일부 경우에, 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 또한 비바이러스 기반 전달 시스템, 예컨대 척추동물의 염색체로 DNA 서열을 도입하기 위한 합성 DNA 트랜스포손 시스템을 지칭하는 "슬리핑 뷰티(SB) 트랜스포손 시스템"을 사용하여 세포로 도입될 수 있다. 상기 시스템의 일부 예시적인 실시형태는 예를 들면 미국 특허 제6,489,458호 및 제8,227,432호에 기재되어 있다. 슬리핑 뷰티 트랜스포손 시스템은 슬리핑 뷰티(SB) 트랜스포사제 및 SB 트랜스포손으로 구성된다. 실시형태에서, 슬리핑 뷰티 트랜스포손 시스템은 SB11 트랜스포손 시스템, SB100X 트랜스포손 시스템 또는 SB110 트랜스포손 시스템을 포함할 수 있다.

DNA 트랜스포손은 단순한 잘라내어 붙여넣기 방식으로 하나의 DNA 부위로부터 또 다른 부위로 전위한다. 전위는 정의된 DNA 분절이 하나의 DNA 분자로부터 절제되고 동일한 또는 상이한 DNA 분자 또는 게놈에서 또 다른 부위로 이동하는 정확한 과정이다. 다른 Tc1/마리너-유형 트랜스포사제가 하는 것처럼, SB 트랜스포사제는 수혜자 DNA 서열에서 TA 디뉴클레오타이드 염기 쌍으로 트랜스포손을 삽입한다. 삽입 부위는 동일한 DNA 분자에서 또는 또 다른 DNA 분자(또는 염색체)에서 어디든 있을 수 있다. 인간을 포함하는 포유류 게놈에서, 대략 20000만개의 TA 부위가 있다. TA 삽입 부위는 트랜스포손 통합의 과정에서 중복된다. TA 서열의 이 중복은 전위의 특질이고, 일부 실험에서 그 기전을 확신하도록 사용된다. 트랜스포사제는 트랜스포손 내에 암호화될 수 있거나, 트랜스포사제는 또 다른 원천, 예를 들면 DNA 또는 mRNA 원천에 의해 공급될 수 있고, 이 경우에 트랜스포손은 비자율 요소가 된다. 비자율 트랜스포손은 삽입 후 독립적으로 계속해서 절제하고 재삽입할 수 없으므로 유전 도구로서 가장 유용하다. SB 트랜스포손은 척추동물 동물의 게놈으로의 유전자의 도입을 위해 그리고 유전자 치료를 위해 비바이러스 벡터로서 사용되도록 고안되었다.

외인성 핵산을 숙주 세포로 도입하거나 그렇지 않으면 세포를 본 개시내용의 억제제에 노출시키기 위해 사용된 방법과 관련하여, 숙주 세포에서 재조합 DNA 서열의 존재를 확인하기 위해, 여러 가지의 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정은 예를 들면 당업자에게 잘 알려진 분자 검정, 예컨대 Southern 및 Northern 블로팅, RT-PCR 및 PCR; 예를 들면 면역학적 수단(ELISA 및 Western 블롯)에 의해 또는 본 개시내용의 범위 내에 해당하는 제제를 확인하기 위해 본원에 기재된 검정에 의해 특정한 펩타이드의 존재 또는 부재를 검출하는 것과 같은 "생화학적" 검정을 포함한다.

실시형태에서, 본원에 기재된 변형된 효과기 세포 및 다른 유전 요소는 SB11 트랜스포손 시스템, SB100X 트랜스포손 시스템, SB110 트랜스포손 시스템, piggyBac 트랜스포손 시스템(예를 들면, Wilson 등, "PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells," Molecular Therapy 15:139-145 (2007) 참조, 본원에 그 전체가 참고로 포함됨) 및/또는 piggyBac 트랜스포손 시스템(예를 들면, Mitra 등, "Functional characterization of piggyBac from the bat Myotis lucifugus unveils an active mammalian DNA transposon," Proc. Natl. Acad. Sci USA 110:234-239 (2013) 참조)을 사용하여 세포로 전달된다. 추가의 트랜스포사제 및 트랜스포손 시스템은 미국 특허 제6,489,458호; 제6,613,752호, 제7,148,203호; 제7,985,739호; 제8,227,432호; 제9,228,180호; 미국 특허 공보 제2011/0117072호; Mates 등, Nat Genet, 41(6):753-61 (2009). doi: 10.1038/ng.343. Epub 2009 May 3, Gene Ther., 18(9):849-56 (2011). doi: 10.1038/gt.2011.40. Epub 2011 Mar 31 and in Ivics 등, Cell, 91(4):501-10, (1997)에서 제공되고, 이들의 각각은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.

추가의 적합한 비바이러스 시스템은 숙주 세포의 DNA로 무작위로 통합될 수 있거나 발현 벡터와 숙주 세포의 염색체 사이의 특정 재조합이 가능하게 하도록 재조합 부위를 포함할 수 있는 통합 발현 벡터를 포함할 수 있다. 미리 결정된 유전 좌위로의 전이유전자의 표적화된 통합은 많은 분야에 바람직한 목표이다. 처음에, 부위 특이적 재조합효소에 대한 제1 재조합 부위는 무작위로 또는 미리 결정된 위치에서 게놈 부위에서 삽입된다. 후속하여, 세포는 관심 있는 유전자 또는 DNA 및 제2 재조합 부위 및 재조합효소에 대한 원천(발현 플라스미드, RNA, 단백질 또는 바이러스-발현 재조합효소)을 보유하는 플라스미드에 의해 형질주입된다. 제1 재조합 부위와 제2 재조합 부위 사이의 재조합은 플라스미드 DNA의 통합으로 이어진다.

이러한 통합 발현 벡터는 원하는 단백질의 발현을 가져오도록 숙주 세포의 염색체의 내인성 발현 제어 서열을 이용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화된 통합은 통합 부위를 플랭킹하는 서열에 동종성인 도너 폴리뉴클레오타이드에서의 서열의 존재에 의해 촉진된다. 예를 들면, 본원에 기재된 도너 폴리뉴클레오타이드를 사용한 표적화된 통합은 종래의 형질주입 기법, 예를 들면 동종성 재조합에 의한 유전자 넉아웃 또는 넉인을 생성하도록 사용된 기법 후에 달성될 수 있다. 다른 실시형태에서, 표적화된 통합은 통합 부위를 플랭킹하는 서열에 동종성인 도너 폴리뉴클레오타이드에서의 서열의 존재에 의해 그리고 세포를 부위 특이적 재조합효소의 존재 하에 도너 폴리뉴클레오타이드와 접촉시킴으로써 둘 다에 의해 촉진된다. 부위 특이적 재조합효소 또는 단순히 재조합효소에 의해, 이것은 이의 상용성 재조합 부위 사이의 보존적 부위 특이적 재조합을 촉매화하는 폴리펩타이드라는 것이 의도된다. 본원에 사용된 것과 같이, 부위 특이적 재조합효소는 활성을 보유하는 자연적 폴리펩타이드뿐만 아니라 유도체, 변이체 및/또는 단편 및 활성을 보유하는 재조합효소를 암호화하는 자연적 폴리뉴클레오타이드, 유도체, 변이체 및/또는 단편을 포함한다.

숙주 세포에서 이종성 유전자를 통합하기 위한 시스템이 본원에 또한 제공되고, 상기 시스템은 하나 이상의 유전자 발현 카세트를 포함한다. 일부 경우에, 시스템은 제1 폴리펩타이드 작제물을 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 유전자 발현 카세트를 포함한다. 다른 경우에, 시스템은 제2 폴리펩타이드 작제물을 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 유전자 발현 카세트를 포함할 수 있다. 더욱 다른 경우에, 시스템은 제3 유전자 발현 카세트를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 유전자 발현 카세트 중 하나는 (i) 전사촉진 도메인; (ii) 핵 수용체 리간드 결합 도메인; (iii) DNA 결합 도메인; 및 (iv) 엑디손 수용체 결합 도메인 중 하나 이상을 암호화하는 유전자 스위치 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 시스템은 상기 세린 재조합효소의 존재 하에 상기 숙주 세포와 적어도 상기 제1 유전자 발현 카세트의 접촉 시 상기 이종성 유전자가 상기 숙주 세포에서 통합되도록 재조합 부착 부위; 및 세린 재조합효소를 추가로 포함한다.

일부 경우에, 시스템은 상기 리간드의 존재 하에 상기 숙주 세포와 접촉 시 상기 이종성 유전자가 상기 숙주 세포에서 발현되도록 리간드를 추가로 포함한다. 하나의 경우에, 시스템은 또한 재조합 부착 부위를 포함한다. 일부 경우에, 하나의 재조합 부착 부위는 파지 게놈 재조합 부착 부위(attP) 또는 박테리아 게놈 재조합 부착 부위(attB)이다. 하나의 경우에, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 또 다른 경우에, 숙주 세포는 인간 세포이다. 추가의 경우에, 숙주 세포는 T 세포 또는 NK 세포이다.

프로모터

"프로모터"는 암호화 서열의 전사를 개시하는 폴리뉴클레오타이드의 영역을 지칭한다. 프로모터는 유전자의 전사 출발 부위 근처에, 동일한 가닥에 그리고 DNA에서의 상류에(센스 가닥의 5' 영역을 향해) 위치한다. 일부 프로모터는 이것이 세포에서 모든 상황에서 활성이므로 구성적인 한편, 다른 프로모터는 조절되어 특정 자극, 예를 들면 유도성 프로모터에 반응하여 활성이 된다. 더욱 다른 프로모터는 비제한적인 예로서 T 세포 특이적 프로모터를 포함하여 조직 특이적 또는 활성화된 프로모터이다.

본원에 사용된 것과 같은 용어 "프로모터 활성" 및 이의 문법적 균등물은 활성이 측정되는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 뉴클레오타이드 서열의 발현의 정도를 지칭한다. 프로모터 활성은 직접적으로 예를 들면 Northern 블롯 분석에 의해 생성된 RNA 전사체의 양을 결정함으로써 또는 간접적으로 연결된 핵산 서열, 예컨대 프로모터에 연결된 리포터 핵산 서열이 암호화하는 산물의 양을 결정함으로써 측정될 수 있다.

본원에 사용된 것과 같은 "유도성 프로모터"는 전사 조절자, 예를 들면 생명적 인자 또는 비생명적 인자의 존재 또는 부재에 의해 활성으로 유도된 프로모터를 지칭한다. 유도성 프로모터는 유기체의 소정의 발생 단계에서 또는 특정한 조직에서 켜지거나 꺼질 수 있는 이것에 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현 때문에 유용하다. 유도성 프로모터의 예는 알코올 조절된 프로모터, 테트라사이클린 조절된 프로모터, 스테로이드 조절된 프로모터, 금속 조절된 프로모터, 발병 조절된 프로모터, 온도 조절된 프로모터 및 광 조절된 프로모터이다. 일 실시형태에서, 유도성 프로모터는 유전 스위치의 부분이다. 유도성 프로모터는 유전자 스위치 리간드 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 경우에, 유도성 프로모터는 소분자 리간드 유도성 2개 폴리펩타이드 엑디손 수용체 기반 유전자 스위치, 예컨대 RHEOSWITCH® 유전자 스위치일 수 있다. 일부 경우에, 유전자 스위치는 PCT/US2001/009050호(WO 2001/070816호); 미국 특허 제7,091,038호; 제7,776,587호; 제7,807,417호; 제8,202,718호; PCT/US2001/030608호(WO 2002/029075호); 미국 특허 제8,105,825호; 제8,168,426호; PCT/1J52002/005235호(WO 2002/066613호); 미국 출원 제10/468,200호(미국 공보 제20120167239호); PCT/US2002/005706호(WO 2002/066614호); 미국 특허 제7,531,326호; 제8,236,556호; 제8,598,409호; PCT/U52002/005090호(WO 2002/066612호); 미국 특허 제8,715,959호(미국 공보 제20060100416호); PCT/US2002/005234호(WO 2003/027266호); 미국 특허 제7,601,508호; 제7,829,676호; 제7,919,269호; 제8,030,067호; PCT/U52002/005708호(WO 2002/066615호); 미국 출원 제10/468,192호(미국 공보 제20110212528호); PCT/US2002/005026호(WO 2003/027289호); 미국 특허 제7,563,879호; 제8,021,878호; 제8,497,093호; PCT/US2005/015089호(WO 2005/108617호); 미국 특허 제7,935,510호; 제8,076,454호; PCT/U52008/011270호(WO 2009/045370호); 미국 출원 제12/241,018호(미국 공보 제20090136465호); PCT/US2008/011563호(WO 2009/048560호); 미국 출원 제12/247,738호(미국 공보 제20090123441호); PCT/US2009/005510호(WO 2010/042189호); 미국 출원 제13/123,129호(미국 공보 제20110268766호); PCT/US2011/029682호(WO 2011/119773호); 미국 출원 제13/636,473호(미국 공보 제20130195800호); PCT/US2012/027515호(WO 2012/122025호); 및 미국 특허 제9,402,919호(이들의 각각은 그 전체가 참고로 포함됨)에 기재된 것과 같은 엑디손 기반 수용체 성분, 그러나 제한 없이 이들에 기재된 임의의 시스템으로부터 선택될 수 있다.

적어도 2개의 기능적 단백질 또는 이의 일부분; 적어도 하나의 프로모터; 및 적어도 하나의 조작된 재조합 부위를 포함하는 본원에 기재된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 적어도 하나의 비바이러스 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 제공되고; 상기 적어도 하나의 프로모터는 상기 적어도 2개의 기능적 단백질의 발현을 유도한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 프로모터는 구성적일 수 있다. 일부 경우에, 적어도 하나의 프로모터는 조직 특이적일 수 있다. 일부 경우에, 적어도 하나의 프로모터는 유도성일 수 있다. 일부 경우에, 유도성 프로모터는 소분자 리간드 유도성 2개 폴리펩타이드 엑디손 수용체 기반 유전자 스위치이다. 다른 경우에, 적어도 하나의 프로모터가 유도성일 수 있고, 적어도 하나의 프로모터가 활성화된 특이적일 수 있는 프로모터의 조합이 사용될 수 있다.

유도성 프로모터는 상기 적어도 2개의 유전자의 발현의 용량 조절된 제어를 위해 리간드를 이용한다. 일부 경우에, 리간드는 엑디스테로이드, 9-시스-레티노산, 레티노산의 합성 유사체, N,N'-디아실하이드라진, 옥사디아졸린, 디벤조일알킬 시아노하이드라진, N-알킬-N,N'-디아로일하이드라진, N-아실-N- 알킬카보닐하이드라진, N-아로일-N-알킬-N'-아로일하이드라진, 아르니도케톤, 3,5-디-tert-부틸- 4-하이드록시-N-이소부틸-벤자미드, 8-O-아세틸하르파지드, 옥시스테롤, 22(R) 하이드록시콜레스테롤, 24(들) 하이드록시콜레스테롤, 25-에폭시콜레스테롤, T0901317, 5-알파-6-알파-에폭시콜레스테롤-3-설페이트(ECHS), 7-케토콜레스테롤-3-설페이트, 프라메솔, 담즙산, 1,1-비포스포네이트 에스테르, 유약 호르몬 III, RG-115819(3,5-디메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(2-메틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드-), RG-115932((R)-3,5-디메틸- 벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드) 및 RG- 115830(3,5 -디메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드) 및 임의의 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

일부 실시형태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 실시형태에서, 프로모터는 비유도성 프로모터이다. 일부 경우에, 프로모터는 조직 특이적 프로모터일 수 있다. 본원에서 "조직 특이적"은 조직 또는 세포 유형의 하위집단에서의 유전자의 조절된 발현을 지칭한다. 일부 경우에, 조직 특이적 프로모터는 프로모터가 오직 유기체의 소정의 조직 또는 세포 유형에서 발현을 유도하도록 공간적으로 조절될 수 있다. 다른 경우에, 조직 특이적 프로모터는 프로모터가 유기체의 발생 동안을 포함하여 시간에 걸쳐 다르게 세포 유형 또는 조직에서의 발현을 유도하도록 시간적으로 조절될 수 있다. 일부 경우에, 조직 특이적 프로모터는 공간적으로 및 시간적으로 둘 다로 조절된다. 소정의 실시형태에서, 조직 특이적 프로모터는 세포 유형의 특정한 시간 또는 단계에서 구성적으로 또는 간헐적으로 소정의 세포 유형에서 활성화된다. 예를 들면, 조직 특이적 프로모터는 특이적 세포, 예컨대 T 세포 또는 NK 세포가 활성화될 때 활성화되는 프로모터일 수 있다. T 세포는 예를 들면 MHC 클래스 II 분자에 의해 펩타이드 항원으로 제시될 때 여러 가지의 방식으로 활성화될 수 있다.

하나의 경우에, 적어도 하나의 프로모터는 조작된 프로모터 또는 이의 변이체이다. 본원에 기재된 것과 같이, 프로모터는 IL-2로부터의 최소 프로모터 서열 및 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT) 반응 요소(들); NFIL2D 반응 요소, NFkB/TCF 반응 요소, NF_AT/NFIL2B 반응 요소 또는 NFIL2A/OCT 반응 요소 중 하나 이상을 혼입할 수 있다. 반응 요소의 예는 본원에 그 전체가 포함된 Mattila 등, EMBO J. 9(13):4425-33 (1990)에 기재되어 있다.

본원에 기재된 IL-12 발현의 리간드 유도성 제어를 위한 유전자 스위치의 사용은 예를 들면 조절된 발현을 허용하고 치료 지수를 개선함으로써 IL-12의 안전성 프로파일을 개선할 수 있다. 그러나, 유전자 스위치(들)를 사용한 IL-12의 리간드 용량 의존적 발현을 위한 조건은 활성자 리간드(예를 들면, 벨레디멕스)의 존재 또는 부재이다. 소정의 실시형태에서, IL-12 발현의 유도를 위한 추가의 조건적 제어가 고려된다. T 세포 활성화된 특이적 프로모터의 제어 하의 유전자 스위치 성분이 제공된다. 이는 유전자 스위치의 제어 하에 전이유전자(들)의 벨레디멕스 제어된 발현에 필요한 유전자 스위치 성분의 조건적 발현(예를 들면, T 세포 활성화)을 발생시킨다. 일부 실시형태에서, 이는 벨레디멕스가 존재하고 T 세포가 활성화될 때 종양 특이적 T 세포에 의한 사이토카인, 예컨대 IL-12 또는 IL-15의 우선적 발현을 발생시킨다. 이는 유전자 스위치 제어된 전이유전자 발현의 증가된 국소화된 수준으로 이어질 수 있다.

예를 들면, 유전자 스위치 성분의 T 세포 활성화 특이적 발현은 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT) 반응 요소(들)를 포함하는 프로모터에 의해 제어될 수 있다. NFAT 전사 인자는 효과기 T 세포 상태의 핵심 조절자이다. NFAT는 초기 전사 관문이어서 계속해서 소진을 유도한다. NFAT는 TCR 자극 후에 T 세포에서 신속히 활성화되고, 적절한 공동자극 신호전달에 의해 유도된 AP-1과 단백질 복합체를 형성하고, 효과기 유전자 및 T 세포 기능을 조절한다. NFAT 반응 요소(들)는 T 세포 활성화에 반응하여 전이유전자의 발현을 유도하도록 다른 최소 프로모터 서열(예를 들면, IL2 최소 프로모터)와 융합될 수 있다.

활성화 특이적 프로모터의 다른 예는 인터류킨-2(IL2) 프로모터 및 예정사(PD)-1(CD279) 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 유전자 스위치 성분은 또한 최소 프로모터 서열(예를 들면, IL2)에 대한 전염증성 신호전달 경로의 NF-κB와 같은 다른 핵 인자에 대한 결합 부위를 융합함으로써 면역 세포 활성화 시 조건적으로 발현될 수 있다.

소정의 실시형태에서, 프로모터는 IL-2 코어 프로모터, IL-2 최소 프로모터, IL-2 인핸서 및 프로모터 변이체, (NF-κB)₁-IL2 프로모터 변이체, (NF-κB)₃-IL2 프로모터 변이체, (NF-κB)₆-IL2 프로모터 변이체, 1X NFAT 반응 요소-IL2 프로모터 변이체, 3X NFAT 반응 요소-IL2 프로모터 변이체, 6X NFAT 반응 요소-IL2 프로모터 변이체, 인간 EEF1A1 프로모터 변이체, 인간 EEF1A1 프로모터 및 인핸서, 인간 UBC 프로모터 및 합성 최소 프로모터 1 중 임의의 하나 이상일 수 있다.

유전자 스위치

유전자 스위치 폴리펩타이드, 리간드 유도성 유전자 스위치 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 이 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드를 혼입하는 방법 및 시스템이 본원에 제공된다. 소정의 양태에서, 본 개시내용은 이종성 유전자 발현의 유도성 제어를 위해 유전자 스위치 시스템을 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이고, 이종성 유전자 발현은 상기 유전자 스위치 시스템에 의해 조절되고; 상기 이종성 유전자는 본원에 개시된 하나 이상의 면역 반응 유도 인간 파필로마 바이러스(HPV) 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

용어 "유전자 스위치"는 프로모터와 연관된 반응 요소와 예를 들면 하나 이상의 리간드의 존재 하에 반응 요소 및 프로모터가 혼입된 유전자의 발현을 조절하는 EcR 기반 시스템의 조합을 지칭한다. 엄격하게 조절된 유도성 유전자 발현 시스템 또는 유전자 스위치는 유전자 치료, 세포에서의 단백질의 대규모 제조, 세포 기반 고출력 스크리닝 검정, 기능적 게놈학 및 형질전환 식물 및 동물에서의 특질의 조절과 같은 다양한 분야에 유용하다. 이러한 유도성 유전자 발현 시스템은 리간드 유도성 이종성 유전자 발현 시스템을 포함할 수 있다.

EcR 기반 유전자 스위치의 초기 버전은 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) EcR(DmEcR) 및 무스 무스쿨루스(Mus musculus) RXR(MmRXR) 폴리펩타이드를 사용하였고, 스테로이드, 포나스테론A의 존재 하에 이 수용체가 포유류 세포주 및 형질전환 마우스에서 리포터 유전자를 전사촉진한다는 것을 보여주었다(Christopherson 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(14):6314-18 (1992); No 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(8):3346-51 (1996)). 나중에, Suhr 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(14):7999-8004 (1998))은 터부페나지드인 비스테로이드성 엑디손 효능제가 외인성 이종이합체 파트너의 부재 하에 봄빅스 모리(Bombyx mori) EcR(BmEcR)을 통해 포유류 세포에서 리포터 유전자의 높은 수준의 전사촉진을 유도하였다는 것을 보여주었다.

국제 특허 출원 PCT/US97/05330호(WO 97/38117호) 및 PCT/US99/08381호(WO99/58155호)는 외인성 유전자 및 엑디손 반응 요소를 포함하는 DNA 작제물이 이에 대한 리간드의 존재 하에 및 선택적으로 침묵 파트너로서 작용할 수 있는 수용체의 존재 하에 유전자 발현을 유도하도록 엑디손 반응 요소에 결합하는 엑디손 수용체를 포함하는 제2 DNA 작제물에 의해 활성화된 외인성 유전자의 발현을 조절하는 방법을 개시한다. 이 예에서, 엑디손 수용체는 드로소필라 멜라노가스터로부터 단리되었다. 통상적으로, 이러한 시스템은 최적 활성화를 제공하기 위해 침묵 파트너, 바람직하게는 레티노이드 X 수용체(RXR)의 존재를 필요로 한다. 포유류 세포에서, 곤충 엑디손 수용체(EcR)는 포유류 레티노이드 X 수용체(RXR)와 이종이합체화를 할 수 있고, 이로써 리간드 의존적 방식으로 표적 유전자 또는 이종성 유전자의 발현을 조절하도록 사용될 수 있다. 국제 특허 출원 PCT/US98/14215호(WO 99/02683호)는 누에 나방 봄빅스 모리로부터 단리된 엑디손 수용체가 외인성 이합체 파트너의 필요 없이 포유류 시스템에서 기능적이라는 것을 개시한다.

미국 특허 제6,265,173호는 수용체의 스테로이드/갑상선 슈퍼패밀리의 다양한 구성원이 유전자 발현 시스템에서 사용하기 위한 드로소필라 멜라노가스터 울트라스피라클 수용체(USP)의 적어도 이합체화 도메인을 포함하는 USP 또는 이의 단편과 조합될 수 있다는 것을 개시한다. 미국 특허 제5,880,333호는 전사촉진 도메인 및 DNA 결합 도메인이 2개의 상이한 하이브리드 단백질 상에 배치된 식물에서 사용되는 드로소필라 멜라노가스터 EcR 및 울트라스피라클(USP) 이종이합체 시스템을 개시한다. 이들 경우의 각각에서, 전사촉진 도메인 및 DNA 결합 도메인(국제 특허 출원 PCT/US98/14215호에서처럼 자연적 EcR 또는 국제 특허 출원 PCT/US97/05330호에서처럼 변형된 EcR 중 어느 하나로서)은 단일 분자로 혼입되고, USP 또는 RXR 중 어느 하나인 다른 이종이합체 파트너는 이의 자연적 상태로 사용되었다.

국제 특허 출원 PCT/US01/0905호는 전사촉진 도메인 및 DNA 결합 도메인을 2개의 상이한 단백질에 배치함으로써 이들이 서로 분리된 엑디손 수용체 기반 유도성 유전자 발현 시스템이 리간드의 부재 하에 크게 감소된 배경 활성 및 리간드의 존재 하에 배경에 비해 유의미하게 증가된 활성을 생성시킨다는 것을 개시한다. 이 2개-하이브리드 시스템은 출원 PCT/US97/05330호 및 PCT/US98/14215호에 개시된 2개의 시스템과 비교하여 유의미하게 개선된 유도성 유전자 발현 조절 시스템이다. 2개-하이브리드 시스템은, DNA 결합 도메인이 유전자에서의 DNA 결합 부위에 결합할 때 전사촉진 도메인이 프로모터를 더 효과적으로 활성화하도록, DNA 결합 도메인에 비해 더 양호한 위치로 전사 활성화 도메인을 가져오는 한 쌍의 상호작용 단백질의 능력을 이용하는 것으로 여겨진다(예를 들면, 미국 특허 제5,283,173호 참조). 2개-하이브리드 유전자 발현 시스템은 핵 수용체 폴리펩타이드에 융합된 DNA 결합 도메인을 암호화하는 제1 유전자 발현 카세트 및 상이한 핵 수용체 폴리펩타이드에 융합된 전사촉진 도메인을 암호화하는 제2 유전자 발현 카세트인 2개의 유전자 발현 카세트를 포함한다. 리간드의 존재 하에, 제1 폴리펩타이드와 제2 폴리펩타이드의 상호작용을 촉진하여서 DNA 결합 도메인 및 전사촉진 도메인의 이합체화를 생성시키는 입체형태학적 변경이 유도된다고 여겨진다. DNA 결합 도메인 및 전사촉진 도메인이 2개의 상이한 분자 상에 있으므로, 리간드의 부재 하의 배경 활성이 크게 감소된다.

일부 경우에, 유도성 프로모터는 소분자 리간드 유도성 2개 폴리펩타이드 엑디손 수용체 기반 유전자 스위치, 예컨대 Intrexon Corporation의 RHEOSWITCH^® 유전자 스위치일 수 있다. 일부 경우에, 유전자 스위치는 PCT/US2001/009050호(WO 2001/070816호); 미국 특허 제7,091,038호; 제7,776,587호; 제7,807,417호; 제8,202,718호; PCT/US2001/030608호(WO 2002/029075호); 미국 특허 제8,105,825호; 제8,168,426호; PCT/1J52002/005235호(WO 2002/066613호); 미국 출원 제10/468,200호(미국 공보 제20120167239호); PCT/US2002/005706호(WO 2002/066614호); 미국 특허 제7,531,326호; 제8,236,556호; 제8,598,409호; PCT/U52002/005090호(WO 2002/066612호); 미국 특허 제8,715,959호(미국 공보 제20060100416호); PCT/US2002/005234호(WO 2003/027266호); 미국 특허 제7,601,508호; 제7,829,676호; 제7,919,269호; 제8,030,067호; PCT/U52002/005708호(WO 2002/066615호); 미국 출원 제10/468,192호(미국 공보 제20110212528호); PCT/US2002/005026호(WO 2003/027289호); 미국 특허 제7,563,879호; 제8,021,878호; 제8,497,093호; PCT/US2005/015089호(WO 2005/108617호); 미국 특허 제7,935,510호; 제8,076,454호; PCT/U52008/011270호(WO 2009/045370호); 미국 출원 제12/241,018호(미국 공보 제20090136465호); PCT/US2008/011563호(WO 2009/048560호); 미국 출원 제12/247,738호(미국 공보 제20090123441호); PCT/US2009/005510호(WO 2010/042189호); 미국 출원 제13/123,129호(미국 공보 제20110268766호); PCT/US2011/029682호(WO 2011/119773호); 미국 출원 제13/636,473호(미국 공보 제20130195800호); PCT/US2012/027515호(WO 2012/122025호); 및 미국 특허 제9,402,919호(이들의 각각은 그 전체가 참고로 포함됨)에 기재된 것과 같은 엑디손 기반 수용체 성분, 그러나 제한 없이 이들에 기재된 임의의 시스템으로부터 선택될 수 있다.

본원에 개시된 유전자-스위치 폴리펩타이드를 발현하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 숙주 세포에서 이종성 유전자 및 인터류킨의 발현을 조절하기 위한 시스템이 제공된다.

일부 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제1 유전자 발현 카세트; 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 제2 유전자 발현 카세트; 및 리간드를 포함하는 숙주 세포에서 이종성 유전자 및 사이토카인의 발현을 조절하기 위한 시스템이 있고; 상기 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드는 (i) 전사촉진 도메인; (ii) DNA 결합 도메인; 및 (iii) 리간드 결합 도메인; (iv) 상기 이종성 유전자; 및 (vi) 상기 사이토카인 중 하나 이상을 포함하여서, 상기 숙주 세포를 상기 리간드의 존재 하에 상기 제1 유전자 발현 카세트 및 상기 제2 유전자 발현 카세트와 접촉 시 상기 이종성 유전자 및 상기 사이토카인은 상기 숙주 세포에서 발현된다. 일부 경우에, 이종성 유전자는 본원에 기재된 항원 결합 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 경우에, 사이토카인은 적어도 하나의 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인, 종양 괴사 인자 또는 이들의 변이체 또는 조합을 포함한다. 일부 경우에, 사이토카인은 인터류킨이다. 일부 경우에, 인터류킨은 IL12, IL2, IL15, IL21 및 이의 기능적 변이체 및 단편 중 적어도 하나이다. 일부 실시형태에서, 사이토카인은 막 결합되거나 분비될 수 있다. 다른 실시형태에서, 사이토카인은 세포내일 수 있다. 인터류킨은 막 결합된 IL-15(mbIL-15) 또는 IL-15와 IL-15Rα의 융합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, mbIL-15는 본원에 기재된 변형된 효과기 세포와 공동발현될 수 있는 막 결합된 키메라 IL-15이다. 일부 실시형태에서, mbIL-15는 전장 IL-15Rα, 이의 기능적 단편 또는 변이체와 인프레임으로 융합된 전장 IL-15(예를 들면, 자연적 IL-15 폴리펩타이드) 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 경우에, IL-15는 링커를 통해 IL-15Rα에 간접적으로 연결된다. 일부 경우에, mbIL-15는 Hurton 등, "Tethered IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113(48):E7788-E7797 (2016)에 기재된 것과 같다. 또 다른 양태에서, 인터류킨은 IL-12를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-12는 단일 사슬 IL-12(scIL-12), 프로테아제 민감한 IL-12, 탈안정화된 IL-12, 막 결합된 IL-12, 끼워진 IL-12이다. 일부 경우에, IL-12 변이체는 WO2015/095249호, WO2016/048903호, WO2017/062953호에 기재되어 있고, 이들 모두는 그 전체가 참고로 포함된다.

유전자 스위치 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공되고, 상기 유전자 스위치 폴리펩타이드는 a) 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 DNA 결합 도메인을 포함하는 제1 유전자 스위치 폴리펩타이드 및 b) 핵 수용체 리간드 결합 도메인에 융합된 전사촉진 도메인을 포함하는 제2 유전자 스위치 폴리펩타이드를 포함하고, 제1 유전자 스위치 폴리펩타이드 및 제2 유전자 스위치 폴리펩타이드는 링커에 의해 연결된다. 일부 경우에, 링커는 본원에 기재된 링커, 예를 들면 GSG 링커, 푸린링크, 2A 링커, 예컨대 F/T2A, T2A, p2A, GSG-p2A, 이들의 변이체 및 유도체일 수 있다. 다른 경우에, 링커는 IRES일 수 있다.

일부 경우에, DNA 결합 도메인(DBD)은 본원에 기재된 DBD, 예를 들면 GAL4(GAL4 DBD), LexA DBD, 전사 인자 DBD, 스테로이드/갑상선 호르몬 핵 수용체 슈퍼패밀리 구성원 DBD, 박테리아 LacZ DBD 및 효모 DBD 중 적어도 하나를 포함한다. 전사촉진 도메인은 본원에 기재된 전사촉진 도메인, 예를 들면 VP16 전사촉진 도메인, p53 전사촉진 도메인 및 B42 산성 활성자 전사촉진 도메인 중 하나를 포함할 수 있다. 핵 수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체(EcR), 유비쿼터스 수용체, 고아 수용체 1, NER-1, 스테로이드 호르몬 핵 수용체 1, 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15, 간 X 수용체 β, 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질, 간 X 수용체, 간 X 수용체 α, 파르네소이드 X 수용체, 수용체 상호작용 단백질 14 및 파메솔 수용체 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.

일부 경우에, 폴리펩타이드 링커 또는 리보솜-스키핑 서열에 의해 연결된 유전자 스위치 폴리펩타이드는 리간드 유도성 유전자 스위치와 비교하여 유전자 발현의 개선된 용량 의존적 리간드 유도성 제어를 나타내고, 유전자 스위치 폴리펩타이드는 비암호화 서열, 예컨대 IRES에 의해 연결된다. 일부 경우에, 2A 링커에 의해 연결된 유전자 스위치 폴리펩타이드는 유전자 스위치와 비교하여 이종성 유전자 발현의 개선된 용량 의존적 리간드 유도성 제어를 나타낼 수 있고, 상기 유전자 스위치 폴리펩타이드는IRES에 의해 분리된다.

일부 실시형태에서, 유전자 스위치는 VP16 전사촉진 도메인을 포함한다. 일 실시형태에서, 유전자 스위치는 엑디손 수용체(EcR), 유비쿼터스 수용체, 고아 수용체 1, NER-1, 스테로이드 호르몬 핵 수용체 1, 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15, 간 X 수용체 β, 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질, 간 X 수용체, 간 X 수용체 α, 파르네소이드 X 수용체, 수용체 상호작용 단백질 14 및 파메솔 수용체 중 적어도 하나를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 유전자 스위치의 DNA 결합 도메인(DBD)은 GAL4(GAL4 DBD), LexA DBD, 전사 인자 DBD, 스테로이드/갑상선 호르몬 핵 수용체 슈퍼패밀리 구성원 DBD, 박테리아 LacZ DBD 및 효모 DBD 중 적어도 하나를 포함한다. 더욱 또 다른 경우에, 유전자 스위치는 울트라스피라클 단백질(USP), 레티노이드 수용체 X(RXR), 이들의 기능적 단편 및 변이체 중 적어도 하나를 추가로 포함하고, 상기 기능적 단편 및 변이체는 EcR에 결합할 수 있다.

본원에 기재된 것과 같은 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 조작된 세포에서 발현될 수 있다. 본원에서 조작된 세포는 이의 자연 상태 또는 내인성 상태로부터 변형된 세포이다. 조작된 세포의 예는 예를 들면 유전자 스위치 폴리펩타이드, 관심 있는 유전자(GOI), 세포 태그, 이종성 유전자 및 본원에 기재된 임의의 다른 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드를 암호화하도록 (예를 들면, 폴리뉴클레오타이드의 세포로의 형질주입에 의해) 변형된 본원에 기재된 세포이다.

리간드

일부 실시형태에서, 유도성 유전자 스위치 조절에 사용된 리간드는 제한 없이 N-[(1R)-1-(1,1-디메틸에틸)부틸]-N'-(2-에틸-3-메톡시벤조일)-3,5-디메틸벤조하이드라지드(벨레디멕스라고도 지칭됨), (2S,3R,5R,9R,10R,13R,14S,17R)-17- [(2S,3R)-3,6-디하이드록시-6-메틸헵탄-2-일]-2,3,14-트리하이드록시-10,13-디메틸-2,3,4,5,9,11,12,15,16,17-데카하이드로-1H-사이클로펜타[a]페난트렌-6-온; N'-(3,5-디메틸벤조일)-N'-[(3R)-2,2-디메틸-3-헥사닐]-2-에틸-3-메톡시벤조하이드라지드; 5-메틸-2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6-카복실산 N'-(3,5-디메틸-벤조일)-N'-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-하이드라지드; 5-메틸-2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6-카복실산 N'-(3,5-디메톡시-4-메틸-벤조일)-N'-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-하이드라지드; 5-메틸-2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6-카복실산 N'-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-하이드라지드; 5-메틸-2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6-카복실산 N'-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메톡시-4-메틸-벤조일)-하이드라지드; 5-에틸-2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6-카복실산 N'-(3,5-디메틸-벤조일)-N'-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-하이드라지드; 5-에틸-2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6-카복실산 N'-(3,5-디메톡시-4-메틸-벤조일)-N'-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-하이드라지드; 5-에틸-2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6-카복실산 N'-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메틸-벤조일)-하이드라지드; 5-에틸-2,3-디하이드로-벤조[1,4]디옥신-6-카복실산 N'-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(3,5-디메톡시-4-메틸-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메톡시-4-메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메톡시-4-메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메톡시-4-메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메톡시-4-메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드; 2-메톡시-니코틴산 N-(1-tert-부틸-펜틸)-N'-(4-에틸-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메틸-벤조산 N-(2,2-디메틸-1-페닐-프로필)-N'-(4-에틸-벤조일)-하이드라지드; 3,5-디메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-펜틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-하이드라지드; 및 3,5-디메톡시-4-메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-펜틸)-N'-(3-메톡시-2-메틸-벤조일)-하이드라지드 중 어느 것으로부터 선택될 수 있다.

일부 경우에, 엑디손 수용체 기반 유도성 유전자 스위치의 용량 조절된 제어에 사용된 리간드는 제한 없이 임의의 엑디스테로이드, 예컨대 엑디손, 20-하이드록시엑디손, 포나스테론 A, 무리스테론 A 및 기타, 9-시스-레티노산, 레티노산의 합성 유사체, N,N'-디아실하이드라진, 예컨대 미국 특허 제6,013,836호; 제5,117,057호; 제5,530,028호; 및 제5,378,726호 및 미국 공개 출원 제2005/0209283호 및 제2006/0020146호에 개시된 것; 미국 공개 출원 제2004/0171651호에 기재된 것과 같은 옥사디아졸린; 디벤조일알킬 시아노하이드라진, 예컨대 유럽 출원 461,809호에 개시된 것; N-알킬-N,N'-디아로일하이드라진, 예컨대 미국 특허 제5,225,443호에 개시된 것; N-아실-N-알킬카보닐하이드라진, 예컨대 유럽 출원 제234,994호에 개시된 것; N-아로일-N-알킬-N'-아로일하이드라진, 예컨대 미국 특허 제4,985,461호에 기재된 것; 아르니도케톤, 예컨대 미국 공개 출원 제2004/0049037호에 기재된 것(이들의 각각은 본원에 참고로 포함됨) 및 3,5-디-tert-부틸-4-하이드록시-N-이소부틸-벤자미드, 8-O-아세틸하르파지드, 옥시스테롤, 22(R) 하이드록시콜레스테롤, 24(들) 하이드록시콜레스테롤, 25-에폭시콜레스테롤, T0901317, 5-알파-6-알파-에폭시콜레스테롤-3-설페이트(ECHS), 7-케토콜레스테롤-3-설페이트, 프라메솔, 담즙산, 1,1-비포스포네이트 에스테르, 유약 호르몬 III 및 기타를 포함하는 다른 유사한 재료 중 어느 것으로부터 선택될 수 있다. 본 개시내용에 유용한 디아실하이드라진 리간드의 예는 RG-115819(3,5 -디메틸-벤조산 N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-N'-(2-메틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드-), RG-115932((R)-3,5-디메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드) 및 RG-115830(3,5-디메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-부틸)-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-하이드라지드)를 포함한다. 예를 들면, 미국 특허 출원 제12/155,111호 및 PCT 출원 PCT/US2008/006757호를 참조하고, 이들 둘 다는 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.

사이토카인

소정의 실시형태에서, 본원에 제공된 HPV 백신 항원은 다른 사이토카인과 함께 (예를 들면, 동일한 HPV 항원 전달 벡터의 부분으로서 또는 별개의 벡터를 통해) 공동전달되고/되거나 공동발현된다. 소정의 실시형태에서, 본원에 제공된 HPV 백신 항원은 유전자-스위치 폴리펩타이드 및 사이토카인, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 이를 혼입한 방법 및 시스템이다. 사이토카인은 세포 신호전달에 관여된 약 5 내지 20 kDa의 작은 단백질의 카테고리이다. 일부 경우에, 사이토카인은 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 콜로니 자극 인자 또는 종양 괴사 인자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 케모카인은 세포의 이동을 지도하도록 화학주성인자로서 역할을 하고, CXC, CC, CX3C 및 XC의 4개의 하위패밀리로 분류된다. 예시적인 케모카인은 CC 하위패밀리: CCL1, CCL2(MCP-1), CCL3, CCL4, CCL5(RANTES), CCL6, CCL7, CCL8, CCL9(또는 CCL10), CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27 및 CCL28; CXC 하위패밀리: CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16 및 CXCL17; XC 하위패밀리: XCL1 및 XCL2; 및 CX3C 하위패밀리 CX3CL1로부터의 케모카인을 포함한다.

소정의 실시형태에서, 본원에 제공된 HPV 백신 항원은 인터페론과 함께 (예를 들면 동일한 HPV 항원 전달 벡터의 부분으로서 또는 별개의 벡터를 통해) 공동전달되고/되거나 공동발현된다. 인터페론(IFN)은 인터페론 유형 I(예를 들면 IFN-α, IFN-β, IFN-ε, IFN-κ 및 IFN-ω), 인터페론 유형 II(예를 들면 IFN-γ) 및 인터페론 유형 III를 포함한다. 일부 실시형태에서, IFN-α는 IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFNA8, IFNA10, IFNA13, IFNA14, IFNA16, IFNA17 및 IFNA21을 포함하는 약 13개의 하위유형으로 추가로 분류된다.

소정의 실시형태에서, 본원에 제공된 HPV 백신 항원은 다른 인터류킨과 함께 (예를 들면 동일한 HPV 항원 전달 벡터의 부분으로서 또는 별개의 벡터를 통해) 공동전달되고/되거나 공동발현된다. 인터류킨은 백혈구 또는 백색 혈액 세포에 의해 발현되고, 이것은 T 및 B 림프구 및 조혈 세포의 발생 및 분화를 촉진한다. 예시적인 인터류킨은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8(CXCL8), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35 및 IL-36을 포함한다. 일부 실시형태에서, 인터류킨은 IL-2, IL-12, IL-15, IL-21 또는 IL-15와 IL-15α의 융합이다.

일부 양태에서, 인터류킨은 IL-12를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-12는 단일 사슬 IL-12(scIL-12), 프로테아제 민감한 IL-12, 탈안정화된 IL-12, 막 결합된 IL-12, 끼워진 IL-12이다. 일부 경우에, IL-12 변이체는 WO2015/095249호, WO2016/048903호, WO2017/062953호에 기재되어 있고, 이들 모두는 그 전체가 참고로 포함된다.

일부 실시형태에서, 인터류킨은 mbIL-15를 포함한다. 일부 실시형태에서, mbIL-15는 본원에 기재된 변형된 효과기 세포와 공동발현될 수 있는 막 결합된 키메라 IL-15이다. 일부 실시형태에서, mbIL-15는 전장 IL-15Rα, 이의 기능적 단편 또는 변이체와 인프레임으로 융합된 전장 IL-15(예를 들면, 자연적 IL-15 폴리펩타이드) 또는 이의 단편 또는 변이체를 포함한다. 일부 경우에, IL-15는 링커를 통해 IL-15Rα에 간접적으로 연결된다. 일부 경우에, mbIL-15는 Hurton 등, "Tethered IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells," PNAS 2016에 기재된 것과 같다.

소정의 실시형태에서, 본원에 제공된 HPV 백신 항원은 종양 괴사 인자와 함께 (예를 들면 동일한 HPV 항원 전달 벡터의 부분으로서 또는 별개의 벡터를 통해) 공동전달되고/되거나 공동발현된다. 종양 괴사 인자(TNF)는 아폽토시스를 조절하는 사이토카인의 그룹이다. 일부 경우에, 비제한적인 예로서 TNFα, 림프독소-알파(LT-알파), 림프독소-베타(LT-베타), T 세포 항원 gp39(CD40L), CD27L, CD30L, FASL, 4-1BBL, OX40L 및 TNF 관련된 아폽토시스 유도 리간드(TRAIL)를 포함하는 TNF 패밀리 내의 약 19개의 구성원이 있다.

소정의 실시형태에서, 본원에 제공된 HPV 백신 항원은 콜로니 자극 인자와 함께 (예를 들면 동일한 HPV 항원 전달 벡터의 부분으로서 또는 별개의 벡터를 통해) 공동전달되고/되거나 공동발현된다. 콜로니 자극 인자(CSF)는 조혈 줄기 세포의 표면 상의 수용체 단백질과 상호작용하는 분비된 당단백질이고, 이것은 후속하여 세포 증식 및 특정 종류의 혈액 세포로의 분화를 조절한다. 일부 경우에, CSF는 대식세포 콜로니 자극 인자, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 또는 프로메가포이에틴을 포함한다.

일부 실시형태에서, 사이토카인은 본원에 기재된 키메라 항원 수용체와 공동발현된 막 결합된 사이토카인이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 방법은 사이토카인의 투여를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 사이토카인은 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 콜로니 자극 인자 또는 종양 괴사 인자를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 하나 이상의 방법은 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 콜로니 자극 인자 또는 종양 괴사 인자로부터 선택된 사이토카인의 투여를 추가로 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 하나 이상의 방법은 IL2, IL7, IL12, IL15, IL-15와 IL-15Rα의 융합, IL21, IFNγ 또는 TNF-α로부터 선택된 사이토카인의 투여를 추가로 포함한다.

인터류킨-12

특정한 실시형태에서, 본원에 제공된 HPV 백신 항원은 인터류킨-12 사이토카인의 전달 및/또는 발현과 함께 대상체에게 전달되고/되거나 대상체에서 발현된다(예를 들면, IL-12 폴리펩타이드는 동일한 HPV 백신 항원 발현 벡터로부터 발현되거나 HPV 백신 항원 전달 또는 발현과 함께 별개의 벡터로부터 발현됨). 소정의 실시형태에서, HPV 백신 항원 전달 또는 발현과 함께, 대상체에서의 IL-12의 발현은 발현의 구성적 조절 또는 유도성 조절에 의해 제어된다. 바람직한 실시형태에서, HPV 백신 항원 전달 또는 발현과 함께, 대상체에서의 IL-12의 발현은 발현의 유도성 조절에 의해 제어된다(IL-12의 유도적으로 조절된 발현이라고도 지칭됨). 인터류킨 12(IL-12)는 항원 자극에 반응하여 수지상 세포, 대식세포, 중성구 및 인간 B-림프아구성 세포(NC-37)에 의해 자연적으로 생성된 인터류킨이다. IL-12는 4개의 알파 나선의 번들로 구성된다. 이것은 IL-12A(p35) 및 IL-12B(p40)인 2개의 별개의 유전자에 의해 암호화된 이종이합체 사이토카인이다. p40의 활성 이종이합체(p70이라고 지칭됨) 및 동종이합체는 단백질 합성 후 형성된다. IL-12는 면역계의 마스터 조절자이다. IL-12는 NK 세포 및 T 세포를 활성화함으로써 면역 반응을 촉진한다(도 11).

HPV 재조합 백신을 포함하는 조성물, 키트 및 시스템 및 이를 제조하는 방법이 본원에 제공된다. 유전자-스위치 폴리펩타이드 및 IL-12, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 이를 혼입한 방법 및 시스템이 본원에 또한 제공된다.

링커

본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 발현 및 기능성을 수월하게 하도록 링커를 포함하는 작제물이 또한 개시된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 링커는 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드에서 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 링커는 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터와 적합한 말단 구조를 생성하기 위해 부가될 수 있는 원하는 제한 부위를 함유하는 DNA의 이중 가닥 분절일 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드 링커는 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 변형시키는 데 유용할 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드 링커를 포함하는 벡터 변형은 다수의 클로닝 부위에서의 변경 또는 폴리-히스티딘 꼬리의 부가일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 링커는 또한 응집성 끝 말단을 갖는 제한 효소에 의해 절단된 벡터로 클로닝하기 위한 무딘 인서트 DNA의 끝을 조정하도록 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 링커의 사용은 벡터로의 무딘 결찰보다 더 효과적일 수 있고, 하류 적용에서 벡터로부터 인서트를 방출하는 방법을 제공할 수 있다. 일부 경우에, 인서트는 치료 용도에 유용한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 일부 경우에, 링커는 절단 가능한 링커일 수 있다.

폴리뉴클레오타이드 링커는 올리고머일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 링커는 DNA 이중 가닥, 단일 가닥 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 경우에, 링커는 RNA일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 링커는 일부 경우에 T4 리가제에 의해 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 결찰될 수 있다. 결찰을 수월하게 하도록 과량의 폴리뉴클레오타이드 링커는 인서트 및 벡터를 포함하는 조성물에 첨가될 수 있다. 일부 경우에, 인서트 및 벡터는 링커가 도입되기 전에 전처리된다. 예를 들면, 메틸화효소에 의한 전처리는 인서트 DNA의 원치 않은 절단을 막을 수 있다.

소정의 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 2개 이상의 폴리펩타이드는 개재하는 링커 폴리펩타이드를 암호화하는 개재하는 서열에 의해 분리될 수 있다. 본원에서 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 2개 이상의 폴리펩타이드를 분리하는 아미노산 서열과 관련하여 용어 "개재하는 링커 폴리펩타이드"는 막관통 도메인을 세포 표면 폴리펩타이드(예를 들면, 자연 폴리펩타이드의 절두된 변이체를 포함)에 연결하기 위해 본원에 개시된 폴리펩타이드 작제물에 선택적으로 포함된 아미노산의 서열을 지칭하는 용어 "펩타이드 링커"와 구별된다. 소정의 경우에, 개재하는 링커는 절단에 민감한 개재하는 링커 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 링커는 절단 가능한 링커 또는 리보솜 스키핑 링커이다. 일부 실시형태에서, 절단 가능한 링커 또는 리보솜 스키핑 링커 서열은 2A, GSG-2A, GSG 링커, SGSG 링커, 푸린링크 변이체 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 2A 링커는 p2A 링커, T2A 링커, F2A 링커 또는 E2A 링커이다. 일부 실시형태에서, 관심 있는 폴리펩타이드는 절단에 민감한 개재하는 링커 폴리펩타이드에 의해 연결된 융합 단백질로서 발현된다. 소정의 실시형태에서, 절단에 민감한 개재하는 링커 폴리펩타이드(들)는 F/T2A, T2A, p2A, 2A, GSG-p2A, GSG 링커 및 푸린링크 변이체 중 임의의 하나 이상일 수 있다. 2017년 5월 18일에 공개된 PCT/US2016/061668호(WO2017083750호)에 개시된 것과 같은 링커(폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열)는 본원에 참고로 포함된다.

소정의 실시형태에서, 링커 폴리펩타이드는 하기 표에 개시된 것을 포함한다:

일부 경우에, 바이러스 2A 서열이 사용될 수 있다. 2A 요소는 IRES보다 짧을 수 있는데, 5개 내지 100개의 염기 쌍을 갖는다. 일부 경우에, 2A 서열은 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개 또는 100개의 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 2A 연결된 유전자는 하나의 단일 오픈 리딩 프레임에서 발현될 수 있고, "자가 절단"은 2A 폴리펩타이드의 C-말단에서 GP인 마지막 2개의 아미노산 사이에 공동번역으로 발생할 수 있어서, 동일한 양의 공동발현된 단백질을 생성시킨다.

바이러스 2A 서열은 약 20개의 아미노산일 수 있다. 일부 경우에, 바이러스 2A 서열은 공통 모티프 Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro를 함유할 수 있다. 공통 모티프 서열은 공동번역으로 작용할 수 있다. 예를 들면, 글리신 잔기와 프롤린 잔기 사이의 일반 펩타이드 결합의 형성은 방지될 수 있고, 이는 리보솜 스키핑 및 초기 폴리펩타이드의 절단을 발생시킬 수 있다. 이 효과는 등몰 수준으로 다수의 유전자를 생성시킬 수 있다.

2A 펩타이드는 단일 오픈 리딩 프레임에서의 다수의 단백질의 폴리펩타이드로의 번역을 허용할 수 있고, 이것은 후속하여 리보솜 스키핑 기전을 통해 개별 폴리펩타이드로 절단될 수 있다(Funston 등, J. Gen. Virol. 89(Pt 2):389-96 (2008)). 일부 실시형태에서, 2A 서열은 F/T2A, T2A, p2A, 2A, T2A, E2A, F2A 및 BmCPV2A, BmIFV2A 및 임의의 이들의 조합을 포함할 수 있다.

일부 경우에, 벡터는 IRES 서열 및 2A 링커 서열을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 2A 펩타이드와 연결된 다수의 유전자의 발현은 2A 펩타이드 앞의 스페이서 서열(GSG)에 의해 수월해질 수 있다. 일부 경우에, 작제물은 스페이서, 링커, 어댑터, 프로모터 또는 이들의 조합을 조합할 수 있다. 예를 들면, 링커는 상이한 2A 펩타이드에 의한 스페이서(SGSG 또는 GSG 또는 Whitlow 링커) 및 푸린 링커(R-A-K-R) 절단 부위를 가질 수 있다. 스페이서는 I-Ceui일 수 있다. 일부 경우에, 링커는 조작될 수 있다. 예를 들면, 링커는 화학 특징, 예컨대 소수화도를 포함하도록 설계될 수 있다. 일부 경우에, 적어도 2개의 링커 서열은 동일한 단백질을 생성할 수 있다. 다른 경우에, 다수의 링커는 벡터에서 사용될 수 있다. 예를 들면, 관심 있는 유전자는 적어도 2개의 링커에 의해 분리될 수 있다.

소정의 실시형태에서, 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 2개 이상의 폴리펩타이드는 개재하는 링커 폴리펩타이드를 암호화하는 개재하는 서열에 의해 분리될 수 있다. 소정의 경우에, 링커는 절단에 민감한 링커이다. 일부 실시형태에서, 관심 있는 폴리펩타이드는 절단에 민감한 링커 폴리펩타이드에 의해 연결된 융합 단백질로서 발현된다. 소정의 실시형태에서, 절단에 민감한 링커 폴리펩타이드(들)는 하기에 기재된 푸린링크, fmdv, p2a, GSG-p2a 및/또는 fp2a 중 임의의 1개 또는 2개일 수 있다. 일부 경우에, 링커는 APVKQGSG이다.

소정의 경우에, 링커 폴리펩타이드는 아미노산 서열 "RAKR"를 포함할 수 있다. 소정의 경우에, 푸린 링커 폴리펩타이드는 "CGTGCAAAGCGT" 또는 "AGAGCTAAGAGG"를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화될 수 있다.

일부 실시형태에서, 링커는 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드에서 사용될 수 있다. 링커는 가요성 링커, 경질 링커, 생체내의 절단 가능한 링커 또는 임의의 이들의 조합일 수 있다. 일부 경우에, 링커는 (가요성 링커 및 경질 링커에서처럼) 기능적 도메인을 함께 연결하거나 생체내 절단 가능한 링커에서처럼 유리 기능적 도메인을 방출할 수 있다.

링커는 생물학적 활성을 개선하고, 발현 수율을 증가시키고, 바람직한 약리학적 프로파일을 달성할 수 있다. 링커는 또한 하이드라존, 펩타이드, 디설파이드 또는 티오에스테르를 포함할 수 있다.

일부 경우에, 본원에 기재된 링커 서열은 가요성 링커를 포함할 수 있다. 가요성 링커는 연결된 도메인이 소정의 정도의 이동 또는 상호작용을 요할 때 적용될 수 있다. 가요성 링커는 작은 비극성 아미노산(예를 들면, Gly) 또는 극성 아미노산(예를 들면, Ser 또는 Thr)으로 구성될 수 있다. 가요성 링커는 주로 Gly 및 Ser 잔기의 스트레치로 이루어진 서열("GS" 링커)을 가질 수 있다. 가요성 링커의 예는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n의 서열을 가질 수 있다. 카피수 "n"을 조정함으로써, 이 예시적인 GS 링커의 길이는 기능적 도메인의 적절한 분리를 달성하도록 또는 필요한 도메인간 상호작용을 유지시키도록 최적화될 수 있다. GS 링커 이외에, 다른 가요성 링커는 재조합 융합 단백질에 사용될 수 있다. 일부 경우에, 가요성 링커는 또한 작은 또는 극성 아미노산, 예컨대 Gly 및 Ser에서 풍부할 수 있지만, 가요성을 유지시키기 위해 추가 아미노산, 예컨대 Thr 및 Ala를 함유할 수 있다. 다른 경우에, 극성 아미노산, 예컨대 Lys 및 Glu는 용해도를 개선하도록 사용될 수 있다.

본원에 기재된 링커 서열에 포함된 가요성 링커는 양호한 가요성 및 용해도를 제공하도록 작은 또는 극성 아미노산, 예컨대 Gly 및 Ser에서 풍부할 수 있다. 가요성 링커는 소정의 이동 또는 상호작용이 융합 단백질 도메인에 원해질 때 적합한 선택일 수 있다. 게다가, 가요성 링커가 경질 구조를 가질 수 없더라도, 이것은 기능적 도메인 사이의 거리를 유지시키기 위해 패시브 링커로서 작용할 수 있다. 가요성 링커의 길이는 적절한 폴딩을 허용하도록 또는 융합 단백질의 최적 생물학적 활성을 달성하도록 조정될 수 있다.

본원에 기재된 링커는 일부 경우에 경질 링커를 추가로 포함할 수 있다. 경질 링커는 폴리펩타이드의 도메인 사이의 고정된 거리를 유지시키도록 사용될 수 있다. 경질 링커의 예는 몇몇 열거하자면 알파 나선 형성 링커, Pro 농후 서열, (XP)n, X-Pro 골격, A(EAAAK)nA(n = 2 내지 5)일 수 있다. 경질 링커는 α-나선 구조를 채택함으로써 또는 일부 경우에 다수의 Pro 잔기를 함유함으로써 비교적 질긴 구조를 나타낼 수 있다.

본원에 기재된 링커는 일부 경우에 절단 가능할 수 있다. 다른 경우에, 링커는 절단 가능하지 않다. 절단 가능하지 않은 링커는 생체내 과정 또는 생체외 과정에 걸쳐 하나의 분자로서 작용하도록 기능적 도메인을 함께 공유로 연결할 수 있다. 링커는 또한 생체내 절단 가능할 수 있다. 절단 가능한 링커는 생체내 유리 기능적 도메인을 방출하도록 도입될 수 있다. 절단 가능한 링커는 몇몇 열거하자면 환원제, 프로테아제의 존재에 의해 절단될 수 있다. 예를 들면, 디설파이드 결합의 환원은 절단 가능한 링커를 생성하도록 이용될 수 있다. 디설파이드 링커의 경우에, 티올, 예컨대 글루타티온에 의한 디설파이드 교환을 통한 절단 사건은 절단을 생성할 수 있었다. 다른 경우에, 재조합 융합 단백질에서의 링커의 생체내 절단은 또한 특정 세포 또는 조직에서 병리학적 병태(예를 들면 암 또는 염증) 하에 생체내 발현되거나 소정의 세포 구획 내에 구속될 수 있는 프로테아제에 의해 수행될 수 있다. 일부 경우에, 절단 가능한 링커는 표적화된 절단을 허용할 수 있다. 예를 들면, 많은 프로테아제의 특이성은 구속된 구획에서 더 느린 링커 절단을 제공할 수 있다. 절단 가능한 링커는 또한 하이드라존, 펩타이드, 디설파이드 또는 티오에스테르를 포함할 수 있다. 예를 들면, 하이드라존은 혈청 안정성을 부여할 수 있다. 다른 경우에, 하이드라존은 산성 구획에서 절단을 허용할 수 있다. 산성 구획은 7 이하의 pH를 가질 수 있다. 링커는 또한 티오에테르를 포함할 수 있다. 티오에테르는 비환원성일 수 있다. 티오에테르는 세포내 단백분해 분해를 위해 설계될 수 있다.

일부 경우에, 유전자는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개 이하의 링커에 의해 분리될 수 있다.

링커는 조작된 링커일 수 있다. 링커를 설계하는 방법은 컴퓨터 작업일 수 있다. 일부 경우에, 컴퓨터 작업 방법은 그래픽 기법을 포함할 수 있다. 컴퓨터 작업 방법은 데이터베이스로부터 도출된 3차원 펩타이드 구조의 라이브러리로부터 적합한 펩타이드에 대해 조사하도록 사용될 수 있다. 예를 들면, Brookhaven Protein Data Bank(PDB)는 링커의 선택된 아미노산 사이의 공간에서의 거리에 이어지도록 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서 푸린 폴리펩타이드 및 2A 폴리펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 있고, 푸린 폴리펩타이드 및 2A 폴리펩타이드는 적어도 3개의 소수성 아미노산을 포함하는 폴리펩타이드 링커에 의해 연결된다. 일부 경우에, 적어도 3개의 소수성 아미노산은 글리신(Gly)(G), 알라닌(Ala)(A), 발린(Val)(V), 류신(Leu)(L), 이소류신(Ile)(I), 프롤린(Pro)(P), 페닐알라닌(Phe)(F), 메티오닌(Met)(M), 트립토판(Trp)(W)으로 이루어진 목록으로부터 선택된다. 일부 경우에, 폴리펩타이드 링커는 또한 하나 이상의 GS 링커 서열, 예를 들면(GS)n, (SG)n, (GSG)n 및 (SGSG)n을 포함할 수 있고, n은 0 내지 15의 임의의 수일 수 있다.

폴리펩타이드 작제물의 개선된 발현을 얻는 방법이 제공되고, 상기 방법은 제1 기능적 폴리펩타이드 및 제2 기능적 폴리펩타이드를 포함하는 상기 폴리펩타이드 작제물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 단계(상기 제1 기능적 폴리펩타이드 및 제2 기능적 폴리펩타이드는 서열 APVKQ와 적어도 60%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 링커 폴리펩타이드에 의해 연결됨); 및 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 단계(상기 발현은 서열 APVKQ와 적어도 60%의 동일성을 갖는 서열을 포함하는 링커 폴리펩타이드를 갖지 않는 상응하는 폴리펩타이드 작제물과 비교하여 폴리펩타이드 작제물의 개선된 발현을 발생시킴)를 포함한다.

IRES 요소

본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 발현 및 기능성을 수월하게 하도록 IRES 요소를 포함하는 작제물이 본원에 또한 개시된다. 본원에 사용된 것과 같은 용어 "내부 리보솜 진입 부위(IRES)"는 내부 리보솜 진입 부위를 의미하도록 의도된다. IRES 서열을 포함하는 벡터에서, 제1 유전자는 그 자체의 5'-UTR에 의해 캡 의존적, 리보솜 스캐닝, 기전에 의해 번역될 수 있는 반면에, 후속하는 유전자의 번역은 캡 독립적 방식으로 IRES에 대한 리보솜의 직접적인 동원에 의해 달성될 수 있다. IRES 서열은 5' 캡핑된 말단에 대한 결합 없이 진핵 리보솜이 결합하고 번역을 시작하게 할 수 있다. IRES 서열은 하나의 전사체로부터의 다수의 유전자의 발현을 허용할 수 있다(Mountford 및 Smith, Trends Genet. 11(5):179-84 (1995)).

본원에 사용된 것과 같은 용어 "CAP" 또는 "캡"은 진핵 mRNA로부터의 단백질의 발현 동안 일반 번역 개시 경로에서 필요한 요소로서 작용하는 그 mRNA의 5' 말단에 3'에서 5'(7meG-ppp-G) 연결된 변형된 뉴클레오타이드, 일반적으로 7-메틸 구아노신을 지칭한다.

소정의 경우에, IRES 영역은 바이러스, 예컨대 피코르나바이러스, 뇌심근염 바이러스, C형 간염 바이러스 IRES 서열로부터 유래될 수 있다. 다른 경우에, IRES 서열은 뇌심근염 바이러스로부터 유래될 수 있다. 본원에 사용된 것과 같은 용어 "EMCV" 또는 "뇌심근염 바이러스"는 피코르나비리다에 과의 속의 뇌심근염 바이러스 종의 임의의 구성원 단리물 또는 균주를 지칭한다. 예는 EMCV-R(Rueckert) 균주 바이러스, 콜롬비아-SK 바이러스이다. 일부 경우에, 세포 IRES 요소, 예컨대 진핵 개시 인자 4G, 면역글로불린 중쇄 결합 단백질, c-myc 원종양유전자, 혈관 내피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자-1 IRES 또는 임의의 이들의 조합 또는 변형이 사용될 수 있다. 일부 경우에, 세포 IRES는 바이러스 IRES와 비교할 때 증가된 유전자 발현을 가질 수 있다.

바이러스, 세포 또는 이들의 조합의 IRES 서열은 벡터에서 사용될 수 있다. IRES는 뇌심근염(EMCV) 또는 폴리오바이러스(PV) 유래일 수 있다. 일부 경우에, IRES 요소는 폴리오바이러스(PV), 뇌심근염 바이러스(EMCV), 구제역병 바이러스(FMDV), 돼지 테스코바이러스-1(PTV-1), 아이시바이러스(AiV), 세네카 밸리 바이러스(SVV), C형 간염 바이러스(HCV), 전통적 돼지 콜레라 바이러스(CSFV), 인간 면역결핍 바이러스-2(HIV-2), 인간 면역결핍 바이러스-1(HIV-1), 몰로니 쥣과 백혈병 바이러스(MoMLV), 고양이과 면역결핍 바이러스(FIV), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 인간 사이토메갈로바이러스 잠복(pUL138), 엡스타인 바 바이러스(EBNA-1), 헤르페스 바이러스 마레크병(MDV RLORF9), SV40 폴리시스트론성 19S(SV40 19S), 로팔로시퓸 파디(Rhopalosiphum padi) 바이러스(RhPV), 귀뚜라미 마비 바이러스(CrPV), 엑트로피스 오블리쿠아(Ectropis obliqua) 피코르나 유사 바이러스(EoPV), 플라우티아 스탈리(Plautia stali) 장 바이러스(PSIV), 트리아토마 바이러스(TrV), 벌 마비 디시스트로바이러스(IAPV, KBV), 블랙 커런트 회귀 바이러스(BRV), 펠라고늄 꽃 브레이크 바이러스(PFBV), 히비스커스 퇴록 둥근무늬 바이러스(HCRSV), 크루시퍼 감염 토바모바이러스(CrTMV), 감자잎 롤 폴레로바이러스(PLRV), 담배 식각 바이러스(TEV), 지아르디아바이러스(GLV), 레이슈마니아 RNA 바이러스-1(LRV-1) 및 이들의 조합 또는 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 경우에, IRES는 Apaf-1, XIAP, HIAP2/c-IAP1, DAP5, Bcl-2, c-myc, CAT-1, INR, 분화 LEF-1, PDGF2, HIF-1a, VEGF, FGF2, BiP, BAG-1, CIRP, p53, SHMT1, PITSLREp58, CDK1, Rpr, hid, hsp70, grim, skl, 안테나페디아(Antennapedia), dFoxO, dInR, Adh-Adhr, HSP101, ADH, URE-2,GPR1, NCE102, YMR181a, MSN1, BOI1, FLO8, GIC1 및 임의의 이들의 조합 또는 변형으로 이루어진 군으로부터 선택된다. IRES 요소가 2개의 오픈 리딩 프레임(ORF) 사이에 포함될 때, 번역의 개시는 제1 ORF에서 정규 5'-m7GpppN 캡 의존적 기전에 의해 발생하고, IRES 요소의 하류에서 제2 ORF에서 캡 독립적 기전에 의해 발생할 수 있다.

일부 경우에, 유전자는 내부 리보솜 진입 부위(IRES)에 의해 연결될 수 있다. IRES는 다수의 유전자의 동시 발현을 허용할 수 있다. 예를 들면, IRES 서열은 단일 mRNA 전사체로부터의 다수의 단백질의 생성을 허용할 수 있다. 리보솜은 5'-캡 독립적 방식으로 IRES에 결합하고 번역을 개시할 수 있다.

일부 경우에, IRES 서열은 약 500개의 염기 쌍일 수 있다. IRES 서열은 300개의 염기 쌍 내지 1000개의 염기 쌍일 수 있다. 예를 들면, IRES는 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 550개, 600개, 650개, 700개, 750개, 800개, 850개, 900개, 950개 또는 1000개의 염기 쌍 길이일 수 있다.

일부 경우에, IRES 서열을 포함하는 벡터 내의 하류 유전자의 발현은 감소될 수 있다. 예를 들면, IRES 서열 뒤의 유전자는 IRES 서열 앞의 유전자에 비해 감소된 발현을 가질 수 있다. 감소된 발현은 앞의 유전자에 비해 1% 내지 99% 감소일 수 있다.

발현을 조절하는 방법

일 실시형태에서, 조작된 세포에서 이종성 유전자의 발현을 조절하는 방법이 제공된다. 이종성 유전자 발현의 리간드 유도성 제어를 위한 유전자 스위치 폴리펩타이드, 항원 결합 폴리펩타이드 및 이종성 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드는 도 1 내지 도 16 중 어느 하나에 도시된 것과 같은 하나 이상의 유전자 발현 카세트에 있다. 또 다른 경우에, 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 벡터 또는 비바이러스 벡터를 통해 조작된 세포로 혼입된다. 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터를 포함할 수 있다. 비바이러스 벡터는 슬리핑 뷰티 트랜스포손을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 폴리뉴클레오타이드는 재조합효소 또는 유전자 편집 기법을 통해 조작된 세포로 혼입된다. 재조합효소의 예는 본원에 기재된 것과 같은 세린 재조합효소이다. 유전자 편집 기법의 예는 CRISPR 또는 Argonaute 시스템을 포함할 수 있다. 본원에서 "CRISPR 시스템"의 "CRISPR 유전자 편집 시스템"은 게놈의 특정 영역에 대한 DNA 서열의 변경을 표적화하기 위한 임의의 RNA 지도된 Cas 단백질 매개된 과정을 지칭한다. 본원에서 "Argonaute 유전자 편집 시스템"은 게놈의 특정 영역에 대한 DNA 서열의 변경을 표적화하기 위한 임의의 단일 가닥 DNA 지도된 Argonaute 엔도뉴클레아제 매개된 과정을 지칭한다.

약학 조성물 및 투여량

본 개시내용은 본원에 기재된 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터 및 이에 대한 담체(예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 담체)를 포함하는 조성물을 제공한다. 조성물은 바람직하게는 담체, 바람직하게는 생리학적으로(예를 들면, 약학적으로) 허용 가능한 담체, 및 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터를 포함하는 생리학적으로 허용 가능한(예를 들면, 약학적으로 허용 가능한) 조성물이다. 임의의 적합한 담체는 본 개시내용의 맥락 내에 사용될 수 있고, 이러한 담체는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 담체의 선택은 부분적으로 조성물의 특정한 사용(예를 들면, 동물에 대한 투여) 및 조성물을 투여하기 위해 사용된 특정한 방법에 의해 결정될 것이다. 이상적으로는, 복제 결핍 아데노바이러스 벡터의 맥락에서, 약학 조성물은 바람직하게는 복제 유능 아데노바이러스가 없다. 약학 조성물은 선택적으로 멸균일 수 있다.

적합한 조성물은 항산화제, 완충액 및 정균제를 함유할 수 있는 수성 및 비수성 등장성 멸균 용액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 조성물은 단일 용량 또는 다중 용량 밀봉 용기, 예컨대 앰플 및 바이알에 존재할 수 있고, 사용 직전에 멸균 액체 담체, 예를 들면 물의 첨가만을 요하는 냉동 건조된(동결건조된) 조건에서 저장될 수 있다. 즉석 용액 및 현탁액은 멸균 산제, 과립제 및 정제로부터 제조될 수 있다. 바람직하게는, 담체는 완충 식염수 용액이다. 더 바람직하게는, 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터는 투여 전에 손상으로부터 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터를 보호하기 위해 제형화된 조성물의 부분이다. 예를 들면, 조성물은 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터를 제조하거나 저장하거나 투여하기 위해 사용된 장치, 예컨대 유리류, 주사기 또는 침에서의 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 손실을 감소시키도록 제형화될 수 있다. 조성물은 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 광 민감도 및/또는 온도 민감도를 감소시키도록 제형화될 수 있다. 이를 위해, 조성물은 바람직하게는 예를 들면 상기에 기재된 것과 같은 약학적으로 허용 가능한 액체 담체 및 폴리소르베이트 80, L-아르기닌, 폴리비닐피롤리돈, 트레할로스 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 안정화제를 포함한다. 이러한 조성물의 사용은 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 사용 기한을 연장하고 이의 투여를 용이하게 할 것이다. 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터 함유 조성물에 대한 제형은 예를 들면 미국 특허 제6,225,289호, 미국 특허 제6,514,943호 및 국제 특허 출원 공보 WO 2000/034444호에 추가로 기재되어 있다.

조성물은 또한 형질유도 효율을 향상시키도록 제형화될 수 있다. 게다가, 당업자는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 다른 치료학적 활성 제제 또는 생물학적 활성 제제를 갖는 조성물에 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 염증을 제어하는 인자, 예컨대 이부프로펜 또는 스테로이드는 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터의 생체내 투여와 연관된 종창 및 염증을 감소시키기 위한 조성물의 부분일 수 있다. 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터가 숙주에게 항원 암호화 핵산 서열을 전달하기 위해 사용되면, 면역계 자극자 또는 아쥬반트, 예를 들면 인터류킨, 리포폴리사카라이드 또는 이중 가닥 RNA는 항원에 대한 임의의 면역 반응을 향상시키거나 변형시키도록 투여될 수 있다. 항생제, 즉 살균제 및 진균제는 이미 있는 감염을 치료하고/하거나 미래의 감염, 예컨대 유전자 전달 절차와 연관된 감염의 위험을 감소시키도록 존재할 수 있다.

일부 실시형태에서, 대상체에서 투여를 위해 본원에 개시된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 본원에 개시된다. 일부 경우에, 본원에 개시된 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 암호화하고, 선택적으로 사이토카인 및/또는 추가 치료제를 함유하는 변형된 효과기 세포 조성물이 있다. 일부 경우에, 효과기 세포의 변형을 위해 키메라 항원 수용체의 발현을 조절하기 위한 유전자-스위치 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터가 본원에 또한 포함된다.

일부 경우에, 변형된 효과기 세포 또는 유전자-스위치 폴리펩타이드를 암호화하는 벡터 및 키메라 항원 수용체의 약학 조성물은 약학적으로 사용될 수 있는 조제물로 활성 화합물의 가공을 수월하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 이상의 생리학적으로 허용 가능한 담체를 사용하여 종래의 방식으로 제형화된다. 적절한 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라진다. 본원에 기재된 약학 조성물의 요약은 예를 들면 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999)에서 발견된다.

약학 조성물은 선택적으로 종래의 방식으로, 예컨대, 오직 예에 의해 종래의 혼합, 용해, 과립화, 드라제-제조, 가루화, 유화, 캡슐화, 포획 또는 압축 공정에 의해 제조된다.

소정의 실시형태에서, 조성물은 또한 산, 예컨대 아세트산, 붕산, 시트르산, 락트산, 인산 및 염산; 염기, 예컨대 수산화나트륨, 인산나트륨, 붕산나트륨, 시트르산나트륨, 아세트산나트륨, 락트산나트륨 및 트리스-하이드록시메틸아미노메탄; 및 완충액, 예컨대 시트레이트/덱스트로스, 중탄산나트륨 및 염화암모늄을 포함하는 하나 이상의 pH 조정제 또는 완충제를 포함할 수 있다. 이러한 산, 염기 및 완충액은 허용 가능한 범위에서 조성물의 pH를 유지시키기 위해 필요한 양으로 포함된다.

다른 실시형태에서, 조성물은 또한 조성물의 삼투압농도가 허용 가능한 범위가 되게 하는 데 필요한 양으로 하나 이상의 염을 포함할 수 있다. 이러한 염은 나트륨, 칼륨 또는 암모늄 양이온 및 클로라이드, 시트레이트, 아스코르베이트, 보레이트, 포스페이트, 바이카보네이트, 설페이트, 티오설페이트 또는 바이설파이트 음이온을 갖는 것을 포함하고; 적합한 염은 염화나트륨, 염화칼륨, 티오황산나트륨, 아황산수소나트륨 및 황산암모늄을 포함한다.

본원에 기재된 약학 조성물은 비제한적인 예로서, 경구, 비경구(예를 들면, 정맥내, 피하, 근육내, 대뇌내, 뇌실내, 관절내, 복강내 또는 두개내), 비강내, 협측, 설하 또는 직장 투여 경로를 포함하는 임의의 적합한 투여 경로에 의해 투여된다. 일부 경우에, 약학 조성물은 비경구(예를 들면, 정맥내, 피하, 근육내, 대뇌내, 뇌실내, 관절내, 복강내 또는 두개내) 투여를 위해 제형화된다.

본원에 기재된 약학 조성물은 비제한적인 예로서 치료되는 개체에 의한 경구 섭취를 위한 수성 경구 분산액, 액체, 겔, 시럽, 엘릭시르, 슬러리, 현탁액 및 기타, 고체 경구 투여량 형태, 에어로졸, 제어 방출 제형, 신속 용융 제형, 발포성 제형, 동결건조된 제형, 정제, 산제, 환제, 드라제, 캡슐, 지연 방출 제형, 연장 방출 제형, 박동성 방출 제형, 다중미립자 제형 및 혼합된 즉시 방출 및 제어 방출 제형을 포함하는 임의의 적합한 투여량 형태로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 약학 조성물은 캡슐로 제형화된다. 일부 실시형태에서, 약학 조성물은 (예를 들면, IV 투여를 위해) 용액으로 제형화된다. 일부 경우에, 약학 조성물은 점적으로서 제형화된다. 일부 경우에, 약학 조성물은 주사로서 제형화된다.

본원에 기재된 약학 고체 투여량 형태는 선택적으로 본원에 기재된 화합물 및 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 첨가제, 예컨대 상용성 담체, 결합제, 충전제, 현탁제, 착향제, 감미료, 붕괴제, 분산제, 계면활성제, 활택제, 착색제, 희석제, 가용화제, 보습제, 가소화제, 안정화제, 침투 향상제, 습윤제, 소포제, 항산화제, 보존제 또는 이들의 하나 이상의 조합을 포함한다.

더 다른 양태에서, 표준 코팅 절차, 예컨대 Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition (2000)에 기재된 것을 사용하여, 조성물 주위에 필름 코팅이 제공된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 (예를 들면, 캡슐에 의한 투여를 위해) 입자로 제형화되고, 제형의 일부 또는 전부는 코팅된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 (예를 들면, 캡슐에 의한 투여를 위해) 입자로 제형화되고, 제형의 일부 또는 전부는 마이크로캡슐화된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 (예를 들면, 캡슐에 의한 투여를 위해) 입자로 제형화되고, 제형의 일부 또는 전부는 마이크로캡슐화되지 않고 비코팅된다.

소정의 실시형태에서, 본원에 제공된 조성물은 또한 살균 활성을 억제하기 위해 하나 이상의 보존제를 포함할 수 있다. 적합한 보존제는 수은 함유 물질, 예컨대 메르펜 및 티오메살; 안정화된 이산화염소; 및 4차 암모늄 화합물, 예컨대 벤잘코늄 클로라이드, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 및 세틸피리디늄 클로라이드를 포함한다.

"소포제"는 수성 분산액, 마감된 필름에서의 버블의 응집을 생성시킬 수 있거나, 일반적으로 가공을 손상시키는 가공 동안의 발포를 감소시킨다. 예시적인 소포제는 실리콘 에멀션 또는 소르비탄 세스쿠올레이트를 포함한다.

"항산화제"는 예를 들면 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 아스코르브산나트륨, 아스코르브산, 나트륨 메타바이설파이트 및 토코페롤을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 항산화제는 필요한 경우 화학 안정성을 향상시킨다.

본원에 기재된 제형은 항산화제, 금속 킬레이트화제, 티올 함유 화합물 및 다른 일반 안정화제로부터 이익일 수 있다. 이러한 안정화제의 예는 (a) 약 0.5% 내지 약 2% w/v의 글리세롤, (b) 약 0.1% 내지 약 1% w/v의 메티오닌, (c) 약 0.1% 내지 약 2% w/v의 모노티오글리세롤, (d) 약 1 mM 내지 약 10 mM EDTA, (e) 약 0.01% 내지 약 2% w/v의 아스코르브산, (f) 0.003% 내지 약 0.02% w/v의 폴리소르베이트 80, (g) 0.001% 내지 약 0.05% w/v의 폴리소르베이트 20, (h) 아르기닌, (i) 헤파린, (j) 황산덱스트란, (k) 사이클로덱스트린, (l) 펜토산 폴리설페이트 및 다른 헤파리노이드, (m) 2가 양이온, 예컨대 마그네슘 및 아연; 또는(n) 이들의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

"결합제"는 응집 품질을 부여하고, 예를 들면 알긴산 및 이의 염; 셀룰로스 유도체, 예컨대 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스(예를 들면, Methocel®), 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스(예를 들면, Klucel®), 에틸셀룰로스(예를 들면, Ethocel®) 및 미정질 셀룰로스(예를 들면, Avicel®); 미정질 덱스트로스; 아밀로스; 마그네슘 알루미늄 실리케이트; 폴리사카라이드 산; 벤토나이트; 젤라틴; 폴리비닐피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체; 크로스포비돈; 포비돈; 전분; 전호화 전분; 트라가칸트, 덱스트린, 당, 예컨대 수크로스(예를 들면, Dipac®), 글루코스, 덱스트로스, 당밀, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨(예를 들면, Xylitab®) 및 락토스; 자연 또는 합성 검, 예컨대 아카시아, 트라가칸트, 가티 검, 이사폴 껍질의 점질물, 폴리비닐피롤리돈(예를 들면, Polyvidone® CL, Kollidon® CL, Polyplasdone® XL-10), 라치 아라보갈락탄, Veegum®, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스, 알긴산나트륨 및 기타를 포함한다.

"담체" 또는 "담체 재료"는 의약품에서 임의의 흔히 사용된 부형제를 포함하고, 본원에 개시된 화합물, 예컨대, 이브루티닙 및 항암제의 화합물과의 상용성 및 원하는 투여량 형태의 방출 프로파일 특성에 기초하여 선택되어야 한다. 예시적인 담체 재료는 예를 들면 결합제, 현탁제, 붕괴제, 충전제, 계면활성제, 가용화제, 안정화제, 활택제, 습윤제, 희석제 및 기타를 포함한다. "약학적으로 상용성인 담체 재료"는 아카시아, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 칼슘 글리세로포스페이트, 락트산칼슘, 말토덱스트린, 글리세린, 규산마그네슘, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 나트륨 카세이네이트, 콩 레시틴, 타우로콜산, 포스포티딜콜린, 염화나트륨, 인산삼칼슘, 인산이칼륨, 셀룰로스 및 셀룰로스 접합체, 당 나트륨 스테아로일 락틸레이트, 카라기난, 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 전호화 전분 및 기타를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예를 들면, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. 및 Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999)를 참조한다.

"분산제" 및/또는 "점도 조절제"는 액체 매질 또는 과립화 방법 또는 블랜드 방법에 걸친 약물의 확산 및 균질성을 제어하는 재료를 포함한다. 일부 실시형태에서, 이 제제는 또한 코팅 또는 부식 매트릭스의 유효성을 촉진한다. 예시적인 확산 촉진제/분산제는 예를 들면 친수성 중합체, 전해질, Tween ® 60 또는 80, PEG, 폴리비닐피롤리돈(PVP; 상업적으로 Plasdone®으로 알려짐) 및 탄수화물 기반 분산제, 예컨대, 예를 들면 하이드록시프로필 셀룰로스(예를 들면, HPC, HPC-SL 및 HPC-L), 하이드록시프로필 메틸셀룰로스(예를 들면, HPMC K100, HPMC K4M, HPMC K15M 및 HPMC K100M), 카복시메틸셀룰로스 나트륨, 메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 하이드록시프로필셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 프탈레이트, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 아세테이트 스테아레이트(HPMCAS), 비결정질 셀룰로스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 트리에탄올아민, 폴리비닐 알코올(PVA), 비닐 피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체(S630), 에틸렌 옥사이드와 포름알데하이드를 갖는 4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페놀 중합체(티록사폴로도 알려짐), 폴록사머(예를 들면, 에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드의 블록 공중합체인 Pluronics F68®, F88® 및 F108®); 및 폴록사민(예를 들면, 에틸렌디아민에 대한 프로필렌 옥사이드 및 에틸렌 옥사이드의 순차적 첨가로부터 유래된 사작용성 블록 공중합체인 Poloxamine 908®로도 알려진 Tetronic 908®(BASF Corporation, 뉴저지주 파르시파니)), 폴리비닐피롤리돈 K12, 폴리비닐피롤리돈 K17, 폴리비닐피롤리돈 K25 또는 폴리비닐피롤리돈 K30, 폴리비닐피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체(S-630), 폴리에틸렌 글리콜(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜은 약 300 내지 약 6000 또는 약 3350 내지 약 4000 또는 약 7000 내지 약 5400의 분자량을 가질 수 있음), 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 폴리소르베이트-80, 알긴산나트륨, 검, 예컨대, 예를 들면 검 트라가칸트 및 검 아카시아, 구아 검, 잔탄 검을 포함하는 잔탄, 당, 셀룰로식, 예컨대, 예를 들면 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 폴리소르베이트-80, 알긴산나트륨, 폴리에톡실화 소르비탄 모노라우레이트, 폴리에톡실화 소르비탄 모노라우레이트, 포비돈, 카보머, 폴리비닐 알코올(PVA), 알기네이트, 키토산 및 이들의 조합을 포함한다. 가소화제, 예컨대 셀룰로스 또는 트리에틸 셀룰로스는 또한 분산제로서 사용될 수 있다. 리포솜 분산액 및 자가 유화 분산액에서 특히 유용한 분산제는 디미리스토일 포스파티딜 콜린, 난으로부터의 자연 포스파티딜 콜린, 난으로부터의 자연 포스파티딜 글리세롤, 콜레스테롤 및 이소프로필 미리스테이트이다.

하나 이상의 부식 촉진자와 하나 이상의 확산 촉진자의 조합은 또한 본 조성물에 사용될 수 있다.

용어 "희석제"는 전달 전에 관심 있는 화합물을 희석하기 위해 사용된 화학 화합물을 지칭한다. 희석제는 더 안정한 환경을 제공할 수 있으므로 화합물을 안정화시키도록 또한 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서 인산염 완충 식염수 용액을 포함하는, (pH 제어 또는 유지를 또한 제공할 수 있는) 완충 용액에 용해된 염은 당해 분야에서 희석제로서 사용된다. 소정의 실시형태에서, 희석제는 압축을 수월하게 하도록 또는 캡슐 충전을 위해 균질한 블렌드에 대한 충분한 벌크를 생성하기 위해 조성물의 벌크를 증가시킨다. 이러한 화합물은 예를 들면 락토스, 전분, 만니톨, 소르비톨, 덱스트로스, 미정질 셀룰로스, 예컨대 Avicel®; 이염기성 인산칼슘, 인산이칼슘 2수화물; 인산삼칼슘, 인산칼슘; 무수 락토스, 스프레이 건조된 락토스; 전호화 전분, 압축 가능한 당, 예컨대 Di-Pac®(Amstar); 만니톨, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스 아세테이트 스테아레이트, 수크로스계 희석제, 가루 설탕; 일염기성 황산칼슘 1수화물, 황산칼슘 2수화물; 락트산칼슘 3수화물, 덱스트레이트; 가수분해된 시리얼 고체, 아밀로스; 분말화 셀룰로스, 탄산칼슘; 글리신, 카올린; 만니톨, 염화나트륨; 이노시톨, 벤토나이트 및 기타를 포함한다.

"충전제"는 락토스, 탄산칼슘, 인산칼슘, 이염기성 인산칼슘, 황산칼슘, 미정질 셀룰로스, 셀룰로스 분말, 덱스트로스, 덱스트레이트, 덱스트란, 전분, 전호화 전분, 수크로스, 자일리톨, 락티톨, 만니톨, 소르비톨, 염화나트륨, 폴리에틸렌 글리콜 및 기타와 같은 화합물을 포함한다.

"활택제" 및 "유동화제"는 재료의 응집 또는 마찰을 방지하거나 감소시키거나 억제하는 화합물이다. 예시적인 활택제는 예를 들면 스테아르산, 수산화칼슘, 탈크, 나트륨 스테아릴 푸마레이트, 탄화수소, 예컨대 광유 또는 수소화 식물성 오일, 예컨대 수소화 대두유(Sterotex®), 고차의 지방산 및 이의 알칼리-금속 및 알칼리 토금속 염, 예컨대 알루미늄, 칼슘, 마그네슘, 아연, 스테아르산, 스테아르산 나트륨, 글리세롤, 탈크, 왁스, Stearowet®, 붕산, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 류신, 폴리에틸렌 글리콜(예를 들면, PEG-4000) 또는 메톡시폴리에틸렌 글리콜, 예컨대 카보왁스™, 올레산나트륨, 벤조산나트륨, 글리세린 베헤네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 마그네슘 또는 나트륨 라우릴 설페이트, 콜로이드성 실리카, 예컨대 Syloid™, Cab-O-Sil®, 전분, 예컨대 옥수수 전분, 실리콘 오일, 계면활성제 및 기타를 포함한다.

"가소화제"는 마이크로캡슐화 재료 또는 필름 코팅이 덜 취성이 되게 하도록 이것을 연화시키도록 사용된 화합물이다. 적합한 가소화제는 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜, 예컨대 PEG 300, PEG 400, PEG 600, PEG 1450, PEG 3350 및 PEG 800, 스테아르산, 프로필렌 글리콜, 올레산, 트리에틸 셀룰로스 및 트리아세틴을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가소화제는 또한 분산제 또는 습윤제로서 기능할 수 있다.

"가용화제"는 화합물, 예컨대 트리아세틴, 트리에틸시트레이트, 에틸 올레에이트, 에틸 카프릴레이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 도쿠세이트, 비타민 E TPGS, 디메틸아세타미드, N-메틸피롤리돈, N-하이드록시에틸피롤리돈, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 사이클로덱스트린, 에탄올, n-부탄올, 이소프로필 알코올, 콜레스테롤, 담즙염, 폴리에틸렌 글리콜 200-600, 글리코푸롤, 트랜스쿠톨, 프로필렌 글리콜 및 디메틸 이소소르비드 및 기타와 같은 화합물을 포함한다.

"안정화제"는 임의의 항산화 제제, 완충액, 산, 보존제 및 기타와 같은 화합물을 포함한다.

"현탁제"는 폴리비닐피롤리돈, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈 K12, 폴리비닐피롤리돈 K17, 폴리비닐피롤리돈 K25 또는 폴리비닐피롤리돈 K30, 비닐 피롤리돈/비닐 아세테이트 공중합체(S630), 폴리에틸렌 글리콜(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜은 약 300 내지 약 6000 또는 약 3350 내지 약 4000 또는 약 7000 내지 약 5400의 분자량을 가질 수 있음), 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스 아세테이트 스테아레이트, 폴리소르베이트-80, 하이드록시에틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 검, 예컨대, 예를 들면 검 트라가칸트 및 검 아카시아, 구아 검, 잔탄 검을 포함하는 잔탄, 당, 셀룰로식, 예컨대, 예를 들면 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 하이드록시에틸셀룰로스, 폴리소르베이트-80, 알긴산나트륨, 폴리에톡실화 소르비탄 모노라우레이트, 폴리에톡실화 소르비탄 모노라우레이트, 포비돈 및 기타와 같은 화합물을 포함한다.

"계면활성제"는 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 도쿠세이트, Tween 60 또는 80, 트리아세틴, 비타민 E TPGS, 소르비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 폴리소르베이트, 폴록사머, 담즙염, 글리세린 모노스테아레이트, 에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드의 공중합체, 예를 들면, Pluronic®(BASF) 및 기타와 같은 화합물을 포함한다. 일부 다른 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 지방산 글리세라이드 및 식물성 오일, 예를 들면 폴리옥시에틸렌(60) 수소화된 캐스터유; 및 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 및 알킬페닐 에테르, 예를 들면 옥톡시놀 10, 옥톡시놀 40을 포함한다. 일부 실시형태에서, 계면활성제는 물리적 안정성을 향상시키기 위해 또는 다른 목적을 위해 포함될 수 있다.

"점도 향상제"는 예를 들면 메틸 셀룰로스, 잔탄 검, 카복시메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스 아세테이트 스테아레이트, 하이드록시프로필메틸 셀룰로스 프탈레이트, 카보머, 폴리비닐 알코올, 알기네이트, 아카시아, 키토산 및 이들의 조합을 포함한다.

"습윤제"는 올레산, 글리세린 모노스테아레이트, 소르비탄 모노올레에이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 나트륨 도쿠세이트, 나트륨 올레에이트, 나트륨 라우릴 설페이트, 나트륨 도쿠세이트, 트리아세틴, Tween 80, 비타민 E TPGS, 암모늄염 및 기타와 같은 화합물을 포함한다.

키트/제조 물품

소정의 실시형태에서, 본원에 기재된 하나 이상의 방법과 사용하기 위한 키트 및 제조 물품이 본원에 개시된다. 이러한 키트는 하나 이상의 용기, 예컨대 바이알, 관 및 기타를 수용하도록 구획화된 캐리어, 패키지 또는 용기를 포함하고, 용기(들)의 각각은 본원에 기재된 방법에 사용되는 별개의 부재 중 하나를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면 병, 바이알, 주사기 및 시험관을 포함한다. 일 실시형태에서, 용기는 여러 가지의 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성된다.

본원에 제공된 제조 물품은 패키징 재료를 함유한다. 약학 패키징 재료의 예는 블리스터 팩, 병, 관, 백, 용기, 병, 및 선택된 제형 및 투여 및 치료의 의도된 방식에 적합한 임의의 패키징 재료를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.

키트는 통상적으로 내용물 및/또는 사용 설명을 열거한 라벨 및 사용 설명을 갖는 패키지 인서트를 포함한다. 일련의 설명이 또한 통상적으로 포함될 것이다.

일부 실시형태에서, 라벨은 용기 상에 있거나 이와 연관된다. 일 실시형태에서, 라벨을 형성하는 철자, 숫자 또는 다른 부호가 용기 자체에 부착, 성형 또는 에칭될 때 라벨은 용기 상에 있고; 예를 들면 패키지 인서트로서 용기를 또한 보유하는 리셉터클 또는 캐리어 내에 존재할 때 라벨은 용기와 연관된다. 일 실시형태에서, 라벨은 내용물이 특정 치료학적 분야에 사용된다는 것을 나타내도록 사용된다. 라벨은 또한 예컨대 본원에 기재된 방법에서 내용물의 사용을 위한 지시를 나타낸다.

HPV 백신 설계에 대한 항원성 정보학 작업흐름

새로운 HPV 항원 성분의 확인

HPV E2 및 E4 유전 성분이 HPV 필수 기능에서 작용한다는 중요한 역할에 기초하여, 상응하는 단백질의 위치뿐만 아니라 인실리코 예측, E2 및 E4 유래된 항원은 HPV 치료 백신에 대해 확인되었다. 도 1을 참조한다. 비종양발생 및 바이러스 불활화 유전 변형은 또한 예컨대 HPV E2 및 E6 단백질에서 HPV 단백질로부터 바이러스 및 종양발생 생물학적 활성을 제거하도록 적용되었다. 유전 조작은 또한 펩타이드의 면역원성 특징을 보유하지만, 각각 E7 및 E4의 종양발생 및 바이러스 증폭 기능을 제거하는 방식으로 재순서화된 단백질 서열의 생성을 달성하도록 적용되었다.

그러므로, 본 명세서에서 예시화된 5개의 설계의 혁신적인 양태는 (1) 4개 이상의 상이한 HPV 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 유전자 작제물의 사용; (2) 종양발생 및 필수 바이러스 기능을 비활성화하기 위한 아미노산 점 돌연변이와 중첩하는 폴리펩타이드 서열 셔플링 기법의 조합; (3) 숙주 감염된 세포에서 고도로 발현된 HPV 단백질로부터의 다수의 항원 성분을 포함하는 HPV 단백질의 혼입; (4) 처음의 알려진 하이브리드 항원 설계; (5) 암 고위험 및 암 저위험 HPV 균주로부터의 에피토프의 조합; (6) 혼합되고 규칙적으로 반복하는 링커의 사용; (7) 폴리펩타이드 아단위를 안정화하고 원치 않는 분자내 상호작용을 방지하기 위한 경질 링커의 사용; (8) 에피토프 사이의 절단 가능한 링커의 사용; (9) 단백질-단백질 링커(-) 기능 둘 다뿐만 아니라 특히 항원 및 에피토프(즉, 링커 서열에 의해 부여된 항원성)를 제공하기 위한 링커 서열의 이중 사용을 포함한다.

항원성은 항체 또는 세포 매개된 면역 반응의 생성을 자극하는 역량이다. 최종 설계 서열의 항원성은 아미노산 서열의 주요 화학 특성에 기초하여 항원 인식을 위한 정렬 독립적 모델인 Vaxjen 소프트웨어에 의해 예측되었다. 결과는 5개의 항원 서열이 항원성이라는 것을 나타낸다. 표 4(항원성/바이러스 및 종양)를 참조한다.

알레르겐은 흔히 항체 반응을 촉발하는 작은 항원이다.　알레르겐성은 항원이 알레르겐 또는 비알레르겐이든 분류를 위해 기계 학습 방법에 의해 생물정보학 기반 알레르겐 예측 소프트웨어인 ALLERTOP에 의해 예측되었다. 이것은 논리 회귀(LR), 결정 나무(DT), 나이브 베이즈(Bayes)(NB), 랜덤 포레스트(RF), 다층 신경망(MLP) 및 k 최근접 이웃(kNN)을 포함한다. 결과는 5개의 항원 서열이 비알레르겐성이라는 것을 나타낸다. 표 4(알레르겐성)를 참조한다.

다양한 조직에서의 자가면역 부작용의 교차반응성 또는 기원은 적응 면역요법에서 중요한 안전성 영향을 갖는다. 서열 상동성 분석은 이 신규의 항원이 블라스트 조사, 기본적 국소 정렬 조사 도구에 의해 인간 프로테옴과 교차반응성을 갖는지를 평가하도록 수행되었다. 숙주 교차반응성은 이 5개의 항원 서열에서 확인되지 않았다. 표 4(숙주 교차반응성)를 참조한다.

소프트웨어/도구:

본원에 기재된 설계의 수행에 사용된 소프트웨어 도구는 하기를 포함한다:

ALLERTOP(AllerTOP v.2--a server for in silico prediction of allergens; J Mol Model. 2014 Jun;20(6):2278. doi: 10.1007/s00894-014-2278-5. Epub 2014 May 31. 참조)

ANN(Reliable prediction of T-cell epitopes using neural networks with novel sequence representations; Protein Sci. 2003 May;12(5):1007-17. 참조)

BLAST(기본적 국소 정렬 조사 도구; NCBI, National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine 8600 Rockville Pike, Bethesda MD, 20894 USA.)

CLUSTALW2(EMBL-EBI, Wellcome Genome Campus, Hinxton, Cambridgeshire, CB10 1SD, UK. +44 (0)1223 49 44 44.)

GENEIOUS V11.1.5(geneious.com/biopharma/ 참조)

IEDB CONSENSUS(A consensus epitope prediction approach identifies the breadth of murine T(CD8+)-cell responses to vaccinia virus; Nat Biotechnol. 2006 Jul;24(7):817-9. Epub 2006 Jun 11. 참조)

NETMHCPAN 4.0(Gapped sequence alignment using artificial neural networks: application to the MHC class I system; Bioinformatics. 2016 Feb 15;32(4):511-7. doi: 10.1093/bioinformatics/btv639. Epub 2015 Oct 29. 참조)

PHYRE2(The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis; 07 May 2015; nature.com/articles/nprot.2015.053; doi.org/10.1038/nprot.2015.053. 참조)

PYMOL MOLECULAR GRAPHICS SYSTEM V2.1.1(pymol.org/2/; sourceforge.net/projects/pymol/support 참조)

VAXJEN(VaxiJen: a server for prediction of protective antigens, tumour antigens and subunit vaccines; BMC Bioinformatics. 2007 Jan 5;8:4. 참조)

본 발명의 추가 실시형태

본 발명의 실시형태("E")는 하기를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다:

E1. 암 저위험 인간 파필로마 바이러스(HPV) 단백질로부터 유래된 적어도 하나의 에피토프 및 암 고위험 HPV 단백질로부터 유래된 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 비자연 발생 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.

E2. 인간 파필로마 바이러스 6(HPV6)으로부터 유래된 적어도 하나의 에피토프 및 인간 파필로마 바이러스 11(HPV11)로부터 유래된 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 비자연 발생 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.

E3. E2에 있어서, 비자연 발생 폴리펩타이드는 인간 파필로마 바이러스 16(HPV16)으로부터 유래된 적어도 하나의 에피토프를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.

E4. 하기 중 임의의 4개로부터 유래된 HPV 에피토프를 포함하는 비자연 발생 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서,

HPV6 E2 단백질;

HPV6 E4 단백질;

HPV6 E6 단백질;

HPV6 E7 단백질;

HPV11 E6 단백질; 및/또는

HPV11 E7 단백질;

여기서, 폴리펩타이드는 적어도 하나의 HPV6 에피토프 및 적어도 하나의 HPV11 에피토프를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.

E5. E4에 있어서, 비자연 발생 폴리펩타이드는 HPV16 단백질로부터 유래된 적어도 하나의 에피토프를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.

E6. 하기 중 임의의 3개로부터 유래된 HPV 에피토프를 포함하는 비자연 발생 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서,

HPV6 E2 단백질;

HPV6 E4 단백질;

HPV6 E6 단백질; 또는

HPV6 E7 단백질;

여기서, HPV 에피토프는 HPV 게놈에 의해 자연적으로 암호화되지 않은 아미노산 서열에 의해 연결된, 폴리뉴클레오타이드.

E7. 하기의 각각으로부터 유래된 HPV 에피토프를 포함하는 비자연 발생 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서,

HPV6 E2 단백질;

HPV6 E4 단백질;

HPV6 E6 단백질; 및

HPV6 E7 단백질,

E8. E6 또는 E7에 있어서, HPV 에피토프의 적어도 2개를 연결하는 아미노산 서열은 서열 번호 34의 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.

E9. 비자연 발생 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 비자연 발생 폴리펩타이드는

a) HPV6 E2 단백질, HPV6 E4 단백질, HPV6 E6 단백질, HPV6 E7 단백질, HPV11 E6 단백질 및 HPV11 E7 단백질; 또는

b) HPV6 E2 단백질, HPV6 E4 단백질, HPV6 E6 단백질, HPV6 E7 단백질, HPV11 E6 단백질, HPV11 E7 단백질; HPV16 E6 단백질 및 HPV16 E7 단백질로부터 유래된 HPV 에피토프를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.

E10. E9에 있어서, 하나 이상의 폴리펩타이드 링커를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고, 하나 이상의 링커는

a) 서열 번호 45;

b) 서열 번호 42;

c) 서열 번호 40;

d) 서열 번호 34;

e) 서열 번호 52;

f) 서열 번호 48;

g) 서열 번호 50; 및/또는

h) 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.

E11. 비자연 발생 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 비자연 발생 폴리펩타이드는

a) HPV6 E2 단백질, HPV6 E4 단백질, HPV6 E6 단백질, HPV6 E7 단백질, HPV11 E6 단백질 및 HPV11 E7 단백질(여기서, 폴리펩타이드는 서열 번호 45, 서열 번호 42 또는 서열 번호 40의 적어도 하나의 링커 서열을 추가로 포함함);

b) HPV6 E2 단백질, HPV6 E4 단백질, HPV6 E6 단백질, HPV6 E7 단백질, HPV11 E6 단백질 및 HPV11 E7 단백질(여기서, 폴리펩타이드는 서열 번호 34의 적어도 하나의 링커 서열을 추가로 포함함);

c) HPV6 E2 단백질, HPV6 E4 단백질, HPV6 E6 단백질, HPV11 E6 단백질, HPV11 E7 단백질, HPV16 E6 단백질; HPV16 E7 단백질(여기서, 폴리펩타이드는 서열 번호 52, 서열 번호 48 또는 서열 번호 50의 적어도 하나의 링커 서열을 추가로 포함함); 또는

d) HPV6 E2 단백질, HPV6 E4 단백질, HPV6 E6 단백질, HPV11 E6 단백질, HPV11 E7 단백질, HPV16 E6 단백질; 및 HPV16 E7 단백질(여기서, 폴리펩타이드는 서열 번호 57의 적어도 하나의 링커 서열을 추가로 포함함)로부터 유래된 HPV 에피토프를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.

E12.

a) 서열 번호 67;

b) 서열 번호 69;

c) 서열 번호 71;

d) 서열 번호 73; 또는

e) 서열 번호 75와 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 98% 동일한 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.

E13.

a) 서열 번호 66;

b) 서열 번호 68;

c) 서열 번호 70;

d) 서열 번호 72; 또는

e) 서열 번호 74와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 비자연 발생 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.

E14. E13에 있어서, 아미노산 서열은 a), b), c), d) 또는 e) 중 어느 하나와 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 98% 동일하거나 100% 동일한, 폴리뉴클레오타이드.

E15. E1 내지 E14 중 어느 하나에 있어서, HPV 에피토프의 하나 이상은 상응하는 야생형 HPV 서열과 비교하여 아미노산 치환, 아미노산 삽입, 아미노 서열 결실, 아미노산 서열 분리 또는 아미노산 서열 재배열을 포함하고, 상기 아미노산 서열 치환, 삽입, 결실, 분리 또는 재배열은 자연 발생 HPV 종양발생 생물학적 활성 또는 필수 바이러스 복제 기능을 제거하도록 기능하는, 폴리뉴클레오타이드.

E16. E1 내지 E15 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 포유류에서 HPV6 또는 HPV11 항원에 대한 생체내 면역 반응을 생성하는 데 유용하거나, 상기 폴리뉴클레오타이드는 포유류에서 HPV6 및 HPV11 항원에 대한 생체내 면역 반응을 생성하는 데 유용한, 폴리뉴클레오타이드.

E17. E1 내지 E16 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드.

E18. E1 내지 E16 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 벡터.

E19. E18에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 비바이러스 벡터인, 벡터.

E20. E19에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터인, 벡터.

E21. E20에 있어서, 상기 아데노바이러스 벡터는 비인간 영장류 바이러스 벡터인, 벡터.

E22. 약학적으로 허용 가능한 담체 및 E1 내지 E16 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드, E17의 폴리펩타이드 또는 E18 내지 E21의 벡터를 포함하는 조성물 또는 백신.

E23. 조성물 또는 백신에서 사용하기 위한 비자연 발생 폴리펩타이드를 암호화하는 HPV6 및 HPV11 조성물, 백신 또는 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 자연 발생 HPV 폴리펩타이드의 유도체를 암호화하도록 HPV 폴리뉴클레오타이드 서열을 조작하는 단계를 포함하고, 바이러스 폴리펩타이드의 적어도 하나는 종양발생 생물학적 활성 또는 필수 바이러스 복제 기능을 갖고, 하나 이상의 아미노산 서열 치환, 결실, 삽입, 분리 또는 재배열의 조합은 유도체 바이러스 폴리펩타이드를 생성하도록 조성물, 백신을 통해 발현되거나 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되고, HPV 종양발생 생물학적 활성 또는 필수 HPV 복제 기능은 유도체 바이러스 폴리펩타이드로부터 제거되지만, 유도체 바이러스 폴리펩타이드에 대한 숙주 면역-반응성 및/또는 면역원성 활성은 상응하는 자연 발생 바이러스 폴리펩타이드와 비교하여 보유되거나 향상되는, 방법.

E24. E23에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 또는 유도체 바이러스 폴리펩타이드는 생체내 항원 에피토프 인식의 인실리코 예측, 생체내 알레르겐 인식의 인실리코 예측, 인간 프로테옴 교차반응성 서열 상동성 분석, 아미노산 서열 이화학적 특성 분석, 3차원(3D) 구조 분석, 종양발생 및/또는 바이러스 기능 불활성화 돌연변이, 결실, 치환 및/또는 재배열의 확인 중 임의의 2개 이상과 조합된 바이러스 항원의 확인을 포함하는 단계를 사용하여 설계되는, 방법.

E25. E24에 있어서, 면역원성, 면역 보호 효과, 유도체 바이러스 폴리펩타이드의 종양발생 또는 바이러스 기능의 시험관내 또는 생체내 평가를 추가로 포함하는, 방법.

E26. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 임의의 2개 이상의 성분의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E27. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N, O 또는 P의 임의의 2개 이상의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E28. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 L1, L2, L3, L4, L5, L6, L7, L8 또는 L9의 임의의 1개 이상의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E29. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 A, B, C, D, E 또는 F의 임의의 2개 이상의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E30. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 A, B, C, D, E, F, L1, L2, L3 또는 L4의 임의의 2개 이상의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E31. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 A, B, C, D, E, F 또는 L1의 임의의 2개 이상의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E32. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 A, B, C, D, E, F, L2, L3 또는 L4의 임의의 2개 이상의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E33. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 A, B, C, D, E, F 및 L1의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E34. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 A, B, C, D, E, F, L2, L3 및 L4의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E35. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 G, H, I, J 또는 K의 임의의 2개 이상의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E36. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 G, H, I, J, K, L1, L2 또는 L4의 임의의 2개 이상의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E37. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 G, H, I, J 및 K의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E38. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 G, H, I, J, K, L1, L2 및 L4의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E39. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 I, L, M 또는 N의 임의의 2개 이상의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E40. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 I, L, M, N, L2, L4, L5, L6 또는 L7의 임의의 2개 이상의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E41. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 I, L, M 및 N의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E42. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 I, L, M, N, L2, L4, L5, L6 및 L7의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E43. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 N, O 또는 P의 임의의 2개 이상의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E44. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 N, O, P, L2, L3, L4, L5, L6, L7 또는 L8의 임의의 2개 이상의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E45. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 N, O 및 P의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E46. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 N, O, P, L2, L3, L4, L5, L6, L7 및 L8의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E47. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 임의의 순서로 표 5의 성분 A, B, C, D, E, F 및 L1의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E48. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 순차적인 순서로 표 5의 서열 성분 A, L1, B, L1, C, L1, D, L1, E, L1 및 F를 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E49. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 임의의 순서로 표 5의 성분 A, B, C, D, E, F, L2, L3 및 L4의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E50. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 순차적인 순서로 표 5의 서열 성분 A, L4, B, L3, C, L2, D, L3, E, L4 및 F를 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E51. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 임의의 순서로 표 5의 성분 G, H, I, J, K, L1, L2 및 L4의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E52. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 순차적인 순서로 표 5의 서열 성분 G, L1, L2, L1, H, L1, L4, L1, I, L1, J, L1 및 K를 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E53. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 임의의 순서로 표 5의 성분 I, L, M, N, L2, L4, L5, L6 및 L7의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E54. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 순차적인 순서로 표 5의 서열 성분 L, L7, L2, L7, M, L5, L4, L6, I, L7, L2, L7 및 N을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E55. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 임의의 순서로 표 5의 성분 N, O, P, L2, L3, L4, L5, L6, L7 및 L8의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E56. 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 순차적인 순서로 표 5의 서열 성분 N, L8, L2, L8, O, L8, P, L8, L4, L8, L3, L8, L5, L8, L6, L8 및 L7을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.

E57. E26 내지 E56 중 어느 하나에 있어서, 임의의 하나 이상의 L1 서열 성분은 표 5의 L9 서열 성분으로 치환된, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드.

E58. AA 하위집단 번호 1, AA 하위집단 번호 2, AA 하위집단 번호 3, AA 하위집단 번호 4 또는 AA 하위집단 번호 5의 서열의 임의의 2개 이상을 포함하는 폴리펩타이드로서, 서열은 임의의 순서로 있거나 하기에 기재된 것과 같이 순차적인 순서로 있는, 폴리펩타이드.

E59. AA 하위집단 번호 1, AA 하위집단 번호 2, AA 하위집단 번호 3, AA 하위집단 번호 4 또는 AA 하위집단 번호 5의 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서, 서열은 임의의 순서로 있거나 하기에 기재된 것과 같이 순차적인 순서로 있는, 폴리펩타이드.

E60. AA 하위집단 번호 1, AA 하위집단 번호 2, AA 하위집단 번호 3, AA 하위집단 번호 4 또는 AA 하위집단 번호 5의 서열의 임의의 2개 이상을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 서열은 임의의 순서로 있거나 하기에 기재된 것과 같이 순차적인 순서로 있는, 폴리뉴클레오타이드.

E61. AA 하위집단 번호 1, AA 하위집단 번호 2, AA 하위집단 번호 3, AA 하위집단 번호 4 또는 AA 하위집단 번호 5의 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 서열은 임의의 순서로 있거나 하기에 기재된 것과 같이 순차적인 순서로 있는, 폴리뉴클레오타이드.

AA 하위집단 번호 1:

서열 번호 1(HPV6 E2^*);

서열 번호 34(경질 링커);

서열 번호 3(HPV6 E4 1-56);

서열 번호 34(경질 링커);

서열 번호 5(HPV6 E7 70-98);

서열 번호 34(경질 링커);

서열 번호 7(HPV6 E4 36-90);

서열 번호 34(경질 링커);

서열 번호 9(HPV6 E7 1-58);

서열 번호 34(경질 링커); 및/또는

서열 번호 11(HPV6 E6^*).

AA 하위집단 번호 2:

서열 번호 1(HPV6 E2^*);

서열 번호 45(HPV11 E7 에피토프 링커);

서열 번호 3(HPV6 E4);

서열 번호 42(HPV11 E6 링커);

서열 번호 5(HPV6 E7);

서열 번호 40(HPV6 E6 링커);

서열 번호 7(HPV6 E4);

서열 번호 42(HPV11 E6 링커);

서열 번호 9(HPV6 E7);

서열 번호 45(HPV11 E7 에피토프 링커); 및/또는

서열 번호 11(HPV6 E6^*).

AA 하위집단 번호 3:

서열 번호 13(HPV6 E2^* 1-368(Del 206-306));

서열 번호 34(경질 링커);

서열 번호 42(HPV11 E6 에피토프 "링커");

서열 번호 34(경질 링커);

서열 번호 15(HPV6 E4 1-70(Del 21-50));

서열 번호 34(경질 링커);

서열 번호 45(HPV11 E7 에피토프 "링커");

서열 번호 34(경질 링커);

서열 번호 17(HPV6 E4 51-70);

서열 번호 34(경질 링커);

서열 번호 20(HPV6 E6^* 1-120(Del C-용어));

서열 번호 34(경질 링커); 및/또는

서열 번호 22(HPV6 E7 1-98(Del 40-75)).

AA 하위집단 번호 4:

서열 번호 24(HPV6 E2^* 1-205);

서열 번호 52(HPV16 E7 효능제 인핸서 링커);

서열 번호 42(HPV11 E6 에피토프 링커);

서열 번호 52(HPV16 E7 효능제 인핸서 링커);

서열 번호 26(HPV6 E4 1-20);

서열 번호 48(HPV16 E6 효능제 인핸서 번호 1 링커);

서열 번호 45(HPV11 E7 에피토프 링커);

서열 번호 50(HPV16 E6 효능제 인핸서 번호 2 링커);

서열 번호 17(HPV6 E4 51-70);

서열 번호 52(HPV16 E7 효능제 인핸서 링커);

서열 번호 40(HPV6 E6 에피토프 링커);

서열 번호 52(HPV16 E7 효능제 인핸서 링커); 및/또는

서열 번호 28(HPV6 E2^* 307-368).

AA 하위집단 번호 5:

서열 번호 28(HPV6 E2^*);

서열 번호 57(가요성 링커);

서열 번호 40(HPV6 E6 에피토프 링커);

서열 번호 57(가요성 링커);

서열 번호 30(HPV6 E4 에피토프 번호 1);

서열 번호 57(가요성 링커);

서열 번호 32(HPV6 E4 에피토프 번호 2);

서열 번호 57(가요성 링커);

서열 번호 45(HPV11 E7 에피토프 링커);

서열 번호 57(가요성 링커);

서열 번호 42(HPV11 E6 에피토프 링커);

서열 번호 57(가요성 링커);

서열 번호 48(HPV16 E6 효능제 인핸서 번호 1);

서열 번호 57(가요성 링커);

서열 번호 50(HPV16 E6 효능제 인핸서 번호 2);

서열 번호 57(가요성 링커); 및/또는

서열 번호 52(HPV16 E7 효능제 인핸서).

E62. DNA 하위집단 번호 1, DNA 하위집단 번호 2, DNA 하위집단 번호 3, DNA 하위집단 번호 4 또는 DNA 하위집단 번호 5의 임의의 2개 이상의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 서열은 임의의 순서로 있거나 하기에 기재된 것과 같이 순차적인 순서로 있는, 폴리뉴클레오타이드.

E63. DNA 하위집단 번호 1, DNA 하위집단 번호 2, DNA 하위집단 번호 3, DNA 하위집단 번호 4 또는 DNA 하위집단 번호 5의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드로서, 서열은 임의의 순서로 있거나 하기에 기재된 것과 같이 순차적인 순서로 있는, 폴리뉴클레오타이드.

DNA 하위집단 번호 1:

서열 번호 2(HPV6 E2^*);

서열 번호 35, 36, 37, 38 또는 39(경질 링커);

서열 번호 4(HPV6 E4 1-56);

서열 번호 35, 36, 37, 38 또는 39(경질 링커);

서열 번호 6(HPV6 E7 70-98);

서열 번호 35, 36, 37, 38 또는 39(경질 링커);

서열 번호 8(HPV6 E4 36-90);

서열 번호 35, 36, 37, 38 또는 39(경질 링커);

서열 번호 10(HPV6 E7 1-58);

서열 번호 35, 36, 37, 38 또는 39(경질 링커); 및/또는

서열 번호 12(HPV6 E6_*).

DNA 하위집단 번호 2:

서열 번호 2(HPV6 E2_*);

서열 번호 46 또는 47(HPV11 E7 에피토프 링커);

서열 번호 4(HPV6 E4);

서열 번호 43 또는 44(HPV11 E6 링커);

서열 번호 6(HPV6 E7);

서열 번호 41(HPV6 E6 링커);

서열 번호 8(HPV6 E4);

서열 번호 43 또는 44(HPV11 E6 링커);

서열 번호 10(HPV6 E7 1-58);

서열 번호 46 또는 47(HPV11 E7 에피토프 링커); 및/또는

서열 번호 12(HPV6 E6_*).

DNA 하위집단 번호 3:

서열 번호 14(HPV6 E2_* 1-368(Del 206-306));

서열 번호 35, 36, 37, 38 또는 39(경질 링커);

서열 번호 43 또는 44(HPV11 E6 에피토프 링커);

서열 번호 35, 36, 37, 38 또는 39(경질 링커);

서열 번호 16(HPV6 E4 1-70(Del 21-50));

서열 번호 35, 36, 37, 38 또는 39(경질 링커);

서열 번호 46 또는 47(HPV11 E7 에피토프 링커);

서열 번호 35, 36, 37, 38 또는 39(경질 링커);

서열 번호 18 또는 19(HPV6 E4 51-70);

서열 번호 35, 36, 37, 38 또는 39(경질 링커);

서열 번호 21(HPV6 E6* 1-120(Del C-용어));

서열 번호 35, 36, 37, 38 또는 39(경질 링커); 및/또는

서열 번호 23(HPV6 E7 1-98(Del 40-75)).

DNA 하위집단 번호 4:

서열 번호 25 (HPV6 E2_* 1-205);

서열 번호 53, 54, 55 또는 56(HPV16 E7 효능제 인핸서 링커);

서열 번호 43 또는 44(HPV11 E6 에피토프 링커);

서열 번호 53, 54, 55 또는 56(HPV16 E7 효능제 인핸서 링커);

서열 번호 27(HPV6 E4 1-20);

서열 번호 49(HPV16 E6 효능제 인핸서 번호 1 링커);

서열 번호 46 또는 47(HPV11 E7 에피토프 링커);

서열 번호 51(HPV16 E6 효능제 인핸서 번호 2 링커);

서열 번호 18 또는 19(HPV6 E4 51-70);

서열 번호 53, 54, 55 또는 56(HPV16 E7 효능제 인핸서 링커);

서열 번호 41(HPV6 E6 에피토프 링커);

서열 번호 53, 54, 55 또는 56(HPV16 E7 효능제 인핸서 링커); 및/또는

서열 번호 29(HPV6 E2_* 307-368).

DNA 하위집단 번호 5:

서열 번호 29(HPV6 E2_*);

서열 번호 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 또는 65(가요성 링커);

서열 번호 41(HPV6 E6 에피토프 링커);

서열 번호 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 또는 65(가요성 링커);

서열 번호 31(HPV6 E4 에피토프 번호 1);

서열 번호 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 또는 65(가요성 링커);

서열 번호 33(HPV6 E4 에피토프 번호 2);

서열 번호 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 또는 65(가요성 링커);

서열 번호 46 또는 47(HPV11 E7 에피토프 링커);

서열 번호 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 또는 65(가요성 링커);

서열 번호 43 또는 44(HPV11 E6 에피토프 링커);

서열 번호 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 또는 65(가요성 링커);

서열 번호 49(HPV16 E6 효능제 인핸서 번호 1);

서열 번호 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 또는 65(가요성 링커);

서열 번호 51(HPV16 E6 효능제 인핸서 번호 2);

서열 번호 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 또는 65(가요성 링커); 및/또는

서열 번호 53, 54, 55 또는 56(HPV16 E7 효능제 인핸서).

E64. E1 내지 E16 및 E26 내지 E63 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 벡터.

E65. E64에 있어서, 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 비바이러스 벡터인, 벡터.

E66. E65에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터인, 벡터.

E67. E66에 있어서, 아데노바이러스 벡터는 비인간 영장류 바이러스 벡터인, 벡터.

E68. 약학적으로 허용 가능한 담체 및 E1 내지 E16 및 E26 내지 E63 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드, E17 및 E26 내지 E59 중 어느 하나의 폴리펩타이드 또는 E18 내지 E21 및 E64 내지 E67 중 어느 하나의 벡터를 포함하는 조성물 또는 백신.

E69. E1 내지 E22 및 E26 내지 E68 중 어느 하나에 있어서, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 벡터, 조성물 또는 백신은 항-HPV 면역 반응을 유도할 수 있는, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 벡터, 조성물 또는 백신.

E70. HPV 연관된 질환 또는 장애의 치료를 위한, E69의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 벡터, 조성물 또는 백신의 용도.

E72. E70에 있어서, 질환 또는 장애는 HPV6, HPV11 또는 HPV16 연관된 질환 또는 장애인, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 벡터, 조성물 또는 백신의 용도.

E72. E70에 있어서, 질환 또는 장애는 재발성 호흡기 유두종증(RRP)인, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 벡터, 조성물 또는 백신의 용도.

참고문헌

본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 참고로 포함된 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다. 참고로 포함된 자료에 이루어진 임의의 개시내용이 본 출원에서의 개시내용과 상충하는 경우에, 본 출원의 개시내용이 이 자료를 지배하고 대신한다고 여겨져야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> Precigen Inc. <120> HUMAN PAPILLOMA VIRUS VACCINES AND USES OF THE SAME FOR HPV ASSOCIATED DISEASES <130> 2584.166PC01 <150> US 63/118,222 <151> 2020-11-25 <160> 81 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Met Glu Ala Ile Ala Lys Arg Leu Asp Ala Cys Ala Glu Gln Leu Leu 1 5 10 15 Glu Leu Ala Glu Glu Asn Ser Thr Asp Leu His Lys His Val Leu His 20 25 30 Trp Lys Cys Met Arg His Ala Ser Val Leu Leu Tyr Lys Ala Lys Gln 35 40 45 Met Gly Leu Ser His Ile Gly Met Gln Val Val Pro Pro Leu Lys Val 50 55 60 Ser Glu Ala Lys Gly His Asn Ala Ile Glu Met Gln Met His Leu Glu 65 70 75 80 Ser Leu Leu Arg Thr Glu Tyr Ser Met Glu Pro Trp Thr Leu Gln Glu 85 90 95 Thr Ser Tyr Ala Met Trp Gln Thr Pro Pro Lys Arg Cys Phe Lys Lys 100 105 110 Arg Gly Lys Thr Val Glu Val Lys Phe Asp Gly Cys Ala Asn Asn Thr 115 120 125 Met Asp Tyr Val Val Trp Thr Asp Val Tyr Val Gln Asp Asn Asp Thr 130 135 140 Trp Val Lys Val His Ser Met Val 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tacgtcgtgt ggaccgatgt gtatgtgcaa 420 gacaatgaca catgggtcaa ggtccactcc atggtggacg ctaagggaat ctattacaca 480 tgcggacagt ttaagacata ctatgtgaat ttcgtcaagg aagccgaaaa gtatggctcc 540 accaaacact gggaggtctg ctatggctcc accgtcatct gtagccctgc ctccgtgtcc 600 agcacaaccc aagaggtcag cattcccgaa agcacaacct atacccctgc ccagacctcc 660 accctcgtgt ccagctccac caaagaggat gccgtccaga caccccctag aaaaagagct 720 agaggagtgc aacagtcccc ctgtaacgct ctgtgtgtgg ctcacattgg ccctgtggat 780 agcggaaacc ataacctcat cacaaacaat cacgatcagc atcagaggag aaataactcc 840 aactccagcg ctacccctat cgtccagttt cagggagagt ccaactgtct gaaatgcttt 900 agatatagac tcaacgatag acatagacat ctgtttgacc tcatctccag cacatggcat 960 tgggccagct ccaaggctcc ccataagcac gccattgtga cagtgacata cgatagcgaa 1020 gagcaaagac aacagtttct ggatgtggtc aagattcccc ctaccattag ccataagctc 1080 ggctttatgt ccctgcatct gctc 1104 <210> 15 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 15 Met Ala Asp Asp Ser Ala Leu His Lys Lys Tyr Pro Phe Leu Asn Leu 1 5 10 15 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tcatctccag cacatggcat 960 tgggccagct ccaaggctcc ccataagcac gccattgtga cagtgacata cgatagcgaa 1020 gagcaaagac aacagtttct ggatgtggtc aagattcccc ctaccattag ccataagctc 1080 ggctttatgt ccctgcatct gctccattgc tatgagcaac tggaagactc cagcgaagac 1140 gaagtggata tggcagacga ttctgcactg cataaaaagt acccattcct gaacctgctg 1200 cataccccac cgcatcgccc accgccactg tgtccgcaag ctccacgcaa gacccaatgc 1260 aagcgccgtc tgggtaacga gcacgaggaa tccaactccc cgctggctac tccgtgtaca 1320 gccgaaatct atgcctatgc ctataagaat ctgaaagtgg tccaatgcac agagacagac 1380 attagagaag tgcaacagct cctgctcggc acactgaata tcgtctgccc tatctgtgcc 1440 cctaagacaa cagccgaaat ctatagctat gcctataagc aactgaaagt gctccaatgc 1500 aagcgccgtc tgggtaacga gcacgaggaa tccaactccc cgctggctac tccgtgtgtt 1560 tggccgactc tggacccgtg gaccgtggaa actaccactt cttccctgac tatcactacc 1620 tccaccaagg acggcaccac tgttactgtt caactgcgta ccgctgagat ttacgcttac 1680 gcttacaaaa acctcaaggt cgtgatgcac ggcaggcacg tcaccctcaa ggatatcgtc 1740 ctggatctgc aaccccctga ccctgtggga ctgcattgct atgagcaact ggtggattcc 1800 agcgaagacg aagtggatga ggtggacgga caggatagcc aacccctcaa gcaacacttt 1860 cagattgtga catgctgtca ctgttacgaa cagctggagg atagctccga ggatgaggtg 1920 gacatggaaa gcgctaacgc cagcacaagc gctaccacaa tcgaccagct ctgcaaaacc 1980 tttaacctct ccatgcacac actgcaaatc aactgcgtct tctgtaagaa tgccctcacc 2040 acagccgaaa tctatagcta tgcctataag catctgaaag tgctcttcag gggcggatac 2100 ccttacgctg cctgtgcctg ttgcctggag tttcacggaa agattaacca atacgctcac 2160 tttgactatg ccggatacgc taccacagtg gaagaggaaa ccaaacagga tatcctcgac 2220 gtgctgatta gatgttacct ctgccataag cctcagtgtg aggtcgagaa agtgaaacac 2280 attctgacaa aggctagatt tatcaaactg aattgcacaa gaaaaggcag gtgcctccac 2340 tgttggacaa cctgtatgga agacatgctg cct 2373 <210> 70 <211> 599 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 70 Met Glu Ala Ile Ala Lys Arg Leu Asp Ala Cys Ala Glu Gln Leu Leu 1 5 10 15 Glu Leu Ala Glu Glu Asn Ser Thr Asp Leu His Lys His Val Leu His 20 25 30 Trp Lys Cys Met Arg His Ala Ser Val Leu Leu Tyr Lys Ala Lys Gln 35 40 45 Met Gly Leu Ser His Ile Gly Met Gln Val Val Pro Pro Leu Lys Val 50 55 60 Ser Glu Ala Lys Gly His Asn Ala Ile Glu Met Gln Met His Leu Glu 65 70 75 80 Ser Leu Leu Arg Thr Glu Tyr Ser Met Glu Pro Trp Thr Leu Gln Glu 85 90 95 Thr Ser Tyr Ala Met Trp Gln Thr Pro Pro Lys Arg Cys Phe Lys Lys 100 105 110 Arg Gly Lys Thr Val Glu Val Lys Phe Asp Gly Cys Ala Asn Asn Thr 115 120 125 Met Asp Tyr Val Val Trp Thr Asp Val Tyr Val Gln Asp Asn Asp Thr 130 135 140 Trp Val Lys Val His Ser Met Val Asp Ala Lys Gly Ile Tyr Tyr Thr 145 150 155 160 Cys Gly Gln Phe Lys Thr Tyr Tyr Val Asn Phe Val Lys Glu Ala Glu 165 170 175 Lys Tyr Gly Ser Thr Lys His Trp Glu Val Cys Tyr Gly Ser Thr Val 180 185 190 Ile Cys Ser Pro Ala Ser Val Ser Ser Thr Thr Gln Glu Arg His Arg 195 200 205 His Leu Phe Asp Leu Ile Ser Ser Thr Trp His Trp Ala Ser Ser Lys 210 215 220 Ala Pro His Lys His Ala Ile Val Thr Val Thr Tyr Asp Ser Glu Glu 225 230 235 240 Gln Arg Gln Gln Phe Leu Asp Val Val Lys Ile Pro Pro Thr Ile Ser 245 250 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Gly Tyr Pro Tyr Ala Ala Cys Ala Cys Cys Leu Glu Phe His Gly Lys 465 470 475 480 Ile Asn Gln Tyr Ala His Phe Asp Tyr Ala Gly Tyr Ala Thr Thr Val 485 490 495 Glu Glu Glu Thr Lys Gln Asp Ile Leu Asp Val Leu Ile Arg Cys Tyr 500 505 510 Leu Cys His Lys Pro Gln Cys Glu Val Glu Lys Val Lys His Ile Glu 515 520 525 Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Met His Gly Arg His Val Thr 530 535 540 Leu Lys Asp Ile Val Leu Asp Leu Gln Pro Pro Asp Pro Val Gly Leu 545 550 555 560 His Cys Tyr Glu Gln Leu Val Asp Ser Ser Glu Asp Glu Val Asp Glu 565 570 575 Ile Arg Glu Val Gln Gln Leu Leu Leu Gly Thr Leu Asn Ile Val Cys 580 585 590 Pro Ile Cys Ala Pro Lys Thr 595 <210> 71 <211> 1797 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 71 atggaagcca ttgccaaaag actcgacgct tgcgccgagc agctgctgga gctggccgaa 60 gagaatagca cagacctcca caaacacgtc ctgcattgga agtgcatgag acatgcctcc 120 gtgctcctgt ataaggccaa gcagatggga ctgtcccaca ttggaatgca ggtcgtgcct 180 cccctcaagg tcagcgaagc caaaggccat aacgctatcg aaatgcaaat gcacctggaa 240 agcctcctga ggaccgaata ctccatggaa ccctggaccc tccaggaaac ctcctacgct 300 atgtggcaga caccccctaa gaggtgcttt aagaaaagag gaaagacagt ggaagtgaaa 360 ttcgatggct gtgccaataa cacaatggat tacgtcgtgt ggaccgatgt gtatgtgcaa 420 gacaatgaca catgggtcaa ggtccactcc atggtggacg ctaagggaat ctattacaca 480 tgcggacagt ttaagacata ctatgtgaat ttcgtcaagg aagccgaaaa gtatggctcc 540 accaaacact gggaggtctg ctatggctcc accgtcatct gtagccctgc ctccgtgtcc 600 agcacaaccc aagagagaca tagacatctg tttgacctca tctccagcac atggcattgg 660 gccagctcca aggctcccca taagcacgcc attgtgacag tgacatacga tagcgaagag 720 caaagacaac agtttctgga tgtggtcaag attcccccta ccattagcca taagctcggc 780 tttatgtccc tgcatctgct cgaggctgcc gctaaggaag ctgccgccaa aacagccgaa 840 atctatgcct atgcctataa gaatctgaaa gtggtcgagg ctgccgccaa ggaggccgcc 900 gctaagatgg cagacgattc tgcactgcat aaaaagtacc cattcctgaa cctgctgcat 960 accccaccgc tggctactcc gtgtgtttgg ccgactctgg acccgtggac cgtggaaact 1020 accactgagg ccgcggctaa agaggcggcc gcgaaacatt gctatgagca actggaagac 1080 tccagcgaag acgaagtgga tgaggcagcc gcaaaggagg ctgccgcaaa accgctcgca 1140 acaccatgcg tttggcccac actcgatccc tggactgtcg agacaaccac agaggcagcc 1200 gcaaaggagg ccgcagctaa gatggaaagc gctaacgcca gcacaagcgc taccacaatc 1260 gaccagctct gcaaaacctt taacctctcc atgcacacac tgcaaatcaa ctgcgtcttc 1320 tgtaagaatg ccctcaccac agccgaaatc tatagctatg cctataagca tctgaaagtg 1380 ctcttcaggg gcggataccc ttacgctgcc tgtgcctgtt gcctggagtt tcacggaaag 1440 attaaccaat acgctcactt tgactatgcc ggatacgcta ccacagtgga agaggaaacc 1500 aaacaggata tcctcgacgt gctgattaga tgttacctct gccataagcc tcagtgtgag 1560 gtcgagaaag tgaaacacat tgaggctgcc gctaaggaag ctgccgccaa aatgcacggc 1620 aggcacgtca ccctcaagga tatcgtcctg gatctgcaac cccctgaccc tgtgggactg 1680 cattgctatg agcaactggt ggattccagc gaagacgaag tggatgagat tagagaagtg 1740 caacagctcc tgctcggcac actgaatatc gtctgcccta tctgtgcccc taagaca 1797 <210> 72 <211> 411 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 72 Met Glu Ala Ile Ala Lys Arg Leu Asp Ala Cys Ala Glu Gln Leu Leu 1 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Lys Val Val Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Val 225 230 235 240 Met Ala Asp Asp Ser Ala Leu His Lys Lys Tyr Pro Phe Leu Asn Leu 245 250 255 Leu His Thr Pro Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Val His Cys Tyr 260 265 270 Glu Gln Leu Glu Asp Ser Ser Glu Asp Glu Val Asp Gln Leu Tyr Asn 275 280 285 Lys Pro Leu Cys Asp Val Pro Leu Ala Thr Pro Cys Val Trp Pro Thr 290 295 300 Leu Asp Pro Trp Thr Val Glu Thr Thr Thr Arg Thr Leu Glu Asp Leu 305 310 315 320 Leu Met Gly Val Thr Ala Glu Ile Tyr Ser Tyr Ala Tyr Lys Gln Leu 325 330 335 Lys Val Leu Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Val Arg His Arg 340 345 350 His Leu Phe Asp Leu Ile Ser Ser Thr Trp His Trp Ala Ser Ser Lys 355 360 365 Ala Pro His Lys His Ala Ile Val Thr Val Thr Tyr Asp Ser Glu Glu 370 375 380 Gln Arg Gln Gln Phe Leu Asp Val Val Lys Ile Pro Pro Thr Ile Ser 385 390 395 400 His Lys Leu Gly Phe Met Ser Leu His Leu Leu 405 410 <210> 73 <211> 1233 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 73 atggaagcca ttgccaaaag actcgacgct tgcgccgagc agctgctgga gctggccgaa 60 gagaatagca cagacctcca caaacacgtc ctgcattgga agtgcatgag acatgcctcc 120 gtgctcctgt ataaggccaa gcagatggga ctgtcccaca ttggaatgca ggtcgtgcct 180 cccctcaagg tcagcgaagc caaaggccat aacgctatcg aaatgcaaat gcacctggaa 240 agcctcctga ggaccgaata ctccatggaa ccctggaccc tccaggaaac ctcctacgct 300 atgtggcaga caccccctaa gaggtgcttt aagaaaagag gaaagacagt ggaagtgaaa 360 ttcgatggct gtgccaataa cacaatggat tacgtcgtgt ggaccgatgt gtatgtgcaa 420 gacaatgaca catgggtcaa ggtccactcc atggtggacg ctaagggaat ctattacaca 480 tgcggacagt ttaagacata ctatgtgaat ttcgtcaagg aagccgaaaa gtatggctcc 540 accaaacact gggaggtctg ctatggctcc accgtcatct gtagccctgc ctccgtgtcc 600 agcacaaccc aagagagaac actggaagac ctcctgatgg gcgtcacagc cgaaatctat 660 gcctatgcct ataagaatct gaaagtggtc agaaccctgg aggatcttct catgggggtg 720 atggcagacg attctgcact gcataaaaag tacccattcc tgaacctgct gcatacccca 780 aagctccccc aactgtgtac cgaagtgcat tgctatgagc aactggaaga ctccagcgaa 840 gacgaagtgg atcagctcta caataagcct ctgtgtgacg tgccgctggc tactccgtgt 900 gtttggccga ctctggaccc gtggaccgtg gaaactacca ctcgaacact ggaagacttg 960 ctgatgggag tcacagccga aatctatagc tatgcctata agcaactgaa agtgctcaga 1020 acgctagaag atcttctcat gggtgtgaga catagacatc tgtttgacct catctccagc 1080 acatggcatt gggccagctc caaggctccc cataagcacg ccattgtgac agtgacatac 1140 gatagcgaag agcaaagaca acagtttctg gatgtggtca agattccccc taccattagc 1200 cataagctcg gctttatgtc cctgcatctg ctc 1233 <210> 74 <211> 559 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 74 Met Glu Ala Ile Ala Lys Arg Leu Asp Ala Cys Ala Glu Gln Leu Leu 1 5 10 15 Glu Leu Ala Glu Glu Asn Ser Thr Asp Leu His Lys His Val Leu His 20 25 30 Trp Lys Cys Met Arg His Ala Ser Val Leu Leu Tyr Lys Ala Lys Gln 35 40 45 Met Gly Leu Ser His Ile Gly Met Gln Val Val Pro Pro Leu Lys Val 50 55 60 Ser Glu Ala Lys Gly His Asn Ala Ile Glu Met Gln Met His Leu Glu 65 70 75 80 Ser Leu Leu Arg Thr Glu Tyr Ser Met Glu Pro Trp Thr Leu Gln Glu 85 90 95 Thr Ser Tyr Ala Met Trp Gln Thr Pro Pro Lys Arg Cys Phe Lys Lys 100 105 110 Arg Gly Lys Thr Val Glu Val Lys Phe Asp Gly Cys Ala Asn Asn Thr 115 120 125 Met Asp Tyr Val Val Trp Thr Asp Val Tyr Val Gln Asp Asn Asp Thr 130 135 140 Trp Val Lys Val His Ser Met Val Asp Ala Lys Gly Ile Tyr Tyr Thr 145 150 155 160 Cys Gly Gln Phe Lys Thr Tyr Tyr Val Asn Phe Val Lys Glu Ala Glu 165 170 175 Lys Tyr Gly Ser Thr Lys His Trp Glu Val Cys Tyr Gly Ser Thr Val 180 185 190 Ile Cys Ser Pro Ala Ser Val Ser Ser Thr Thr Gln Glu Val Ser Ile 195 200 205 Pro Glu Ser Thr Thr Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ser Thr Leu Val Ser 210 215 220 Ser Ser Thr Lys Glu Asp Ala Val Gln Thr Pro Pro Arg Lys Arg Ala 225 230 235 240 Arg Gly Val Gln Gln Ser Pro Cys Asn Ala Leu Cys Val Ala His Ile 245 250 255 Gly Pro Val Asp Ser Gly Asn His Asn Leu Ile Thr Asn Asn His Asp 260 265 270 Gln His Gln Arg Arg Asn Asn Ser Asn Ser Ser Ala Thr Pro Ile Val 275 280 285 Gln Phe Gln Gly Glu Ser Asn Cys Leu Lys Cys Phe Arg Tyr Arg Leu 290 295 300 Asn Asp Arg His Arg His Leu Phe Asp Leu Ile Ser Ser 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Ser Lys Leu 515 520 525 Thr Arg Gln Leu Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Val Val Ser Gln Thr 530 535 540 Ser Lys Leu Thr Arg Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Val 545 550 555 <210> 75 <211> 1677 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 75 atggaagcca ttgccaaaag actcgacgct tgcgccgagc agctgctgga gctggccgaa 60 gagaatagca cagacctcca caaacacgtc ctgcattgga agtgcatgag acatgcctcc 120 gtgctcctgt ataaggccaa gcagatggga ctgtcccaca ttggaatgca ggtcgtgcct 180 cccctcaagg tcagcgaagc caaaggccat aacgctatcg aaatgcaaat gcacctggaa 240 agcctcctga ggaccgaata ctccatggaa ccctggaccc tccaggaaac ctcctacgct 300 atgtggcaga caccccctaa gaggtgcttt aagaaaagag gaaagacagt ggaagtgaaa 360 ttcgatggct gtgccaataa cacaatggat tacgtcgtgt ggaccgatgt gtatgtgcaa 420 gacaatgaca catgggtcaa ggtccactcc atggtggacg ctaagggaat ctattacaca 480 tgcggacagt ttaagacata ctatgtgaat ttcgtcaagg aagccgaaaa gtatggctcc 540 accaaacact gggaggtctg ctatggctcc accgtcatct gtagccctgc ctccgtgtcc 600 agcacaaccc aagaggtcag cattcccgaa agcacaacct atacccctgc ccagacctcc 660 accctcgtgt ccagctccac caaagaggat gccgtccaga caccccctag aaaaagagct 720 agaggagtgc aacagtcccc ctgtaacgct ctgtgtgtgg ctcacattgg ccctgtggat 780 agcggaaacc ataacctcat cacaaacaat cacgatcagc atcagaggag aaataactcc 840 aactccagcg ctacccctat cgtccagttt cagggagagt ccaactgtct gaaatgcttt 900 agatatagac tcaacgatag acatagacat ctgtttgacc tcatctccag cacatggcat 960 tgggccagct ccaaggctcc ccataagcac gccattgtga cagtgacata cgatagcgaa 1020 gagcaaagac aacagtttct ggatgtggtc aagattcccc ctaccattag ccataagctc 1080 ggctttatgt ccctgcatct gctcgtgtcc cagacaagca aactgacaag aacagccgaa 1140 atctatagct atgcctataa gcaactgaaa gtgctcgtaa gccagacaag caagcttacc 1200 agagcactgc ataaaaagta cccattcctg aacctgctgc ataccccacc gcatcgccca 1260 ccgccactgg ttagccaaac cagtaagttg accaggccgc tggctactcc gtgtgtttgg 1320 ccgactctgg acccgtggac cgtggaaact accacttctt ccctggtatc ccagactagc 1380 aagctcacca ggcattgcta tgagcaactg gaagactcca gcgaagacga agtggatgtt 1440 agtcagacca gtaagttgac aaggacagcc gaaatctatg cctatgccta taagaatctg 1500 aaagtggtcg tgtcccagac atcaaagctg actagaaagc tcccccaact gtgtaccgaa 1560 gtggtctctc agacctctaa actcacccga cagctctaca ataagcctct gtgtgacgtg 1620 gtgtcccaga caagcaaact gacaagaaga acactggaag acctcctgat gggcgtc 1677 <210> 76 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 76 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 77 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 77 gaggctgccg ctaag 15 <210> 78 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 78 gaggctgccg ccaag 15 <210> 79 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 79 gaggccgcgg ctaaa 15 <210> 80 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 80 gaggcagccg caaag 15 <210> 81 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 81 gaggcagccg caaag 15

Claims

인간 파필로마 바이러스 6(HPV6: human papilloma virus 6)으로부터 유래된 적어도 하나의 에피토프 및 인간 파필로마 바이러스 11(HPV11: human papilloma virus 11)로부터 유래된 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 비자연 발생 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서, 비자연 발생 폴리펩타이드는 인간 파필로마 바이러스 16(HPV16: human papilloma virus 16)으로부터 유래된 적어도 하나의 에피토프를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서, 비자연 발생 폴리펩타이드는
HPV6 E2 단백질;
HPV6 E4 단백질;
HPV6 E6 단백질;
HPV6 E7 단백질;
HPV11 E6 단백질; 및/또는
HPV11 E7 단백질 중 임의의 4개로부터 유래된 HPV 에피토프를 포함하고;
폴리펩타이드는 적어도 하나의 HPV6 에피토프 및 적어도 하나의 HPV11 에피토프를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서, 비자연 발생 폴리펩타이드는 HPV16 단백질로부터 유래된 적어도 하나의 에피토프를 추가로 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서, 비자연 발생 폴리펩타이드, 비자연 발생 폴리펩타이드는
a) HPV6 E2 단백질, HPV6 E4 단백질, HPV6 E6 단백질, HPV6 E7 단백질, HPV11 E6 단백질 및 HPV11 E7 단백질; 또는
b) HPV6 E2 단백질, HPV6 E4 단백질, HPV6 E6 단백질, HPV6 E7 단백질, HPV11 E6 단백질, HPV11 E7 단백질; HPV16 E6 단백질 및 HPV16 E7 단백질로부터 유래된 HPV 에피토프를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
제5항에 있어서, 하나 이상의 폴리펩타이드 링커를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하고, 하나 이상의 링커는
a) 서열 번호 34;
b) 서열 번호 40;
c) 서열 번호 42;
d) 서열 번호 45;
e) 서열 번호 48;
f) 서열 번호 50;
g) 서열 번호 52; 및/또는
h) 서열 번호 57의 아미노산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
비자연 발생 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서, 비자연 발생 폴리펩타이드는
a) HPV6 E2 단백질, HPV6 E4 단백질, HPV6 E6 단백질, HPV6 E7 단백질, HPV11 E6 단백질 및 HPV11 E7 단백질이되, 폴리펩타이드는 서열 번호 45, 서열 번호 42 또는 서열 번호 40의 적어도 하나의 링커 서열을 추가로 포함하는 것;
b) HPV6 E2 단백질, HPV6 E4 단백질, HPV6 E6 단백질, HPV6 E7 단백질, HPV11 E6 단백질 및 HPV11 E7 단백질이되, 폴리펩타이드는 서열 번호 34의 적어도 하나의 링커 서열을 추가로 포함하는 것;
c) HPV6 E2 단백질, HPV6 E4 단백질, HPV6 E6 단백질, HPV11 E6 단백질, HPV11 E7 단백질, HPV16 E6 단백질; HPV16 E7 단백질이되, 폴리펩타이드는 서열 번호 52, 서열 번호 48 또는 서열 번호 50의 적어도 하나의 링커 서열을 추가로 포함하는 것; 또는
d) HPV6 E2 단백질, HPV6 E4 단백질, HPV6 E6 단백질, HPV11 E6 단백질, HPV11 E7 단백질, HPV16 E6 단백질; 및 HPV16 E7 단백질이되, 폴리펩타이드는 서열 번호 57의 적어도 하나의 링커 서열을 추가로 포함하는 것으로부터 유래된 HPV 에피토프를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
a) 서열 번호 67;
b) 서열 번호 69;
c) 서열 번호 71;
d) 서열 번호 73; 또는
e) 서열 번호 75와 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 98% 동일한 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
a) 서열 번호 66;
b) 서열 번호 68;
c) 서열 번호 70;
d) 서열 번호 72; 또는
e) 서열 번호 74와 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 비자연 발생 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
제9항에 있어서, 아미노산 서열은 a), b), c), d) 또는 e) 중 어느 하나와 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 98% 동일하거나 100% 동일한, 폴리뉴클레오타이드.
제1항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드.
조성물 또는 백신에서 사용하기 위한 비자연 발생 폴리펩타이드를 암호화하는 HPV6 및 HPV11 조성물, 백신 또는 폴리뉴클레오타이드를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 자연 발생 HPV 폴리펩타이드의 유도체를 암호화하도록 HPV 폴리뉴클레오타이드 서열을 조작하는 단계를 포함하고, 바이러스 폴리펩타이드의 적어도 하나는 종양발생 생물학적 활성 또는 필수 바이러스 복제 기능을 갖고, 하나 이상의 아미노산 서열 치환, 결실, 삽입, 분리 또는 재배열의 조합은 유도체 바이러스 폴리펩타이드를 생성하도록 조성물, 백신을 통해 발현되거나 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되고, HPV 종양발생 생물학적 활성 또는 필수 HPV 복제 기능은 유도체 바이러스 폴리펩타이드로부터 제거되지만, 유도체 바이러스 폴리펩타이드에 대한 숙주 면역-반응성 및/또는 면역원성 활성은 상응하는 자연 발생 바이러스 폴리펩타이드와 비교하여 보유되거나 향상되는, 방법.
제12항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 또는 유도체 바이러스 폴리펩타이드는 생체내 항원 에피토프 인식의 인실리코 예측, 생체내 알레르겐 인식의 인실리코 예측, 인간 프로테옴 교차반응성 서열 상동성 분석, 아미노산 서열 이화학적 특성 분석, 3차원(3D) 구조 분석, 종양발생 및/또는 바이러스 기능 불활성화 돌연변이, 결실, 치환 및/또는 재배열의 확인 중 임의의 2개 이상과 조합된 바이러스 항원의 확인을 포함하는 단계를 이용하여 설계되는, 방법.
비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 임의의 2개 이상의 성분의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.
제14항에 있어서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 A, B, C, D, E, F 및 L1의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.
제14항에 있어서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 A, B, C, D, E, F, L2, L3 및 L4의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.
제14항에 있어서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 G, H, I, J, K, L1, L2 및 L4의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.
제14항에 있어서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 I, L, M, N, L2, L4, L5, L6 및 L7의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.
제14항에 있어서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 표 5의 성분 N, O, P, L2, L3, L4, L5, L6, L7 및 L8의 서열을 포함하는, 비자연 발생 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드.
제1항의 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 벡터.
제20항에 있어서, 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 비바이러스 벡터인, 벡터.
제21항에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터인, 벡터.
제22항에 있어서, 아데노바이러스 벡터는 비인간 영장류 바이러스 벡터인, 벡터.
약학적으로 허용 가능한 담체 및 제1항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 조성물 또는 백신.
HPV 연관된 질환 또는 장애의 치료를 위한, 제24항의 조성물 또는 백신의 용도.
제25항에 있어서, 질환 또는 장애는 HPV6, HPV11 또는 HPV16 연관된 질환 또는 장애인, 조성물 또는 백신의 용도.
제25항에 있어서, 질환 또는 장애는 재발성 호흡기 유두종증(RRP: Recurrent Respiratory Papillomatosis)인, 조성물 또는 백신의 용도.