PT91468B

PT91468B - Processo para a preparacao de um novo antibiotico mersacidina e de composicoes farmaceuticas que o contem

Info

Publication number: PT91468B
Application number: PT91468A
Authority: PT
Inventors: Gerhard Seibert; Sugata Chatterjee; Volker Teetz; Herbert Kogler; Hans-Wolfram Fehlhaber; Bimal Naresh Ganguli; Richard Helmut Rupp; Deepak Kumar Chatterjee; Sukumar Chatterjee; Ranjendra Kumar Hariprasa Jani
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1988-08-17
Filing date: 1989-08-17
Publication date: 1995-05-04
Also published as: EP0362520B1; DK403789D0; HUT55054A; AU613228B2; NZ230303A; PH27179A; PT91468A; EP0362520A2; AU3996689A; NO174517C; FI893842A; DK403789A; NO893288D0; ATE113296T1; US5112806A; KR0139628B1; FI94648C; EP0362520A3; IE892638L; FI94648B

Description

Descrição referente à patente de invenção de HOECHST AÍCTIENGSSELLSCKAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-6230 Frankfurt am Ilain 80, República Federal Alemã, (inventores: Dr. Sukumar Chatterjee, Dr. Sugata Chatterjee, Dr. Bimal Karesh Ganguli, Dr. Deepak Kurnar Chatterjee, Dr. Rajendra Kurnar Hariprasad Jani, residentes na índia e Dr. Richard Hâmut Rupp, Dr. Hans-Wolfram Fehlhaber, Dr. Herbert Kogler, Prof. Dr. Gerhard Seibert, Dr. Volker Teetz, residentes na Alemanha Ocidental), para PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE Ui NOVO ANTIBIÓTICO PERSACIDINA E DE COMPOSIÇOES FARMACÊUTICAS

QUE 0 CONTEM¹¹

Descrição

A presente invenção refere-se a um novo antibiótico que é designado por mersacidina, a um processo para a sua preparação a partir do Eubacterium Bacillus Species Y-85,54728 (depositada em 6.5.1988 de acordo com as condiçSes do Tratado de Budapeste, no Deutschen Sammlung fur luikroorganismen com o n. DSI.Í 4 584) às suas variantes e mutantes, bem como à utilização demnersacidina como medicamento.

A mersicidina de acordo com a invenção é um polipeptídeo cíclico de fórmula I

CH.

ÇK₂

CH

CH₂ çh(ch₃)₂ ch„

H_?N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-H-CH-CO »

CH

CHCH„ • *C0-CH-NH-C0-CH-NH-C0-CH₂-NH-C0-CH₂-NH-C0-CH₂-NH-C0-CH₂-NH ch(ch₃)₂

CH

I

NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-C-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO »

CH,

I

CH

II

CH,

CHCH„ ch(ch₃)₂ co₂h

C H=C H- NH- C O- C H- NH

CH-CH c₂h₅

A configuração dos átomos de carbono quirálicos é evidenciada na fórmula II íBm»,

S S _xCH ^X CH ^J

I

CH,

CH(CH₃)₂ ch₉ ch_o ’ s · ² o h₉n-ch-co-nh-ch-co-nh-ch-co-nh-ch-co-nh-ch-co-n-ch-co

T? R R ι RR

CH, co-ch-nh-co-ch-nh-co-ch₉-nh-co-ch₉nh-co-ch₉-nh-co-ch₉ -NH

R ' d 4 à ch(ch₃)₂

S S 3 '

C 0- NH- C H- C 0- NH- C H- C 0- NH- 0 - 0 0- ?ÍH- C H- C 0- NH- C H- C 0

NH-CHs

I

CH₉ CH ^Z /

CHCH,

I

CH.

ι

CH,

I

CH(CH )₂ co₂h

CH=CH-NH-C0-CH-NH ι

^sch-ch₉ i -5 c₂h₅

A presente invenção refere-se não só à mersacidina mas também aos seus sais fisiológicamente aceitáveis aos seus equivalentes químicos evidentes.

Os antibióticos peptidicos cíclicos são descritos no CRC Handbook of antibiotics (Lanual de antibióticos), vol. IV, pág. 263-264, secção Cyclische Peptide. Os antibióticos isolados a partir do género 3acillus são também descritos em Antibiotics, origin, nat _ 3 ^Iaseç**o«, re and properties /antibióticos, origem caracteristicas e propriedades_7 editado por Korzybski, T. et al, 1978, vol III, pág. 1529-2078. Os antibióticos de polipeptideos e de outras fontes microbianas sâo descritos nas mesmas fontes da literatura, vol. I, pág. 311-491·

De acordo com todos os dados disponíveis, porém, a mersacidina distingue-se nitidamente de todos os antibióticos de polipeptideos cíclicos descritos na literatura disponível acima citada. No Chemical Abstracts nâo está registado qualquer composto que possua o peso molecular e a composição em aminoácidos de mersacidina.

Subacterium utilizado para a preparação da mersacidina com o número de cultura Hoechst índia Limited Y-65, 54728, doravante designado por Y-85, 54728, foi isolado de uma amostra do solo colhida em L.ulund (dalzpfanne), liaharashtra, índia e foi identificado como uma espécie de bacilo.

Os sais fisiológicamente aceitáveis da mersacidina obtêm-se de forma conhecida por si com diversos compostos, por exemplo com aminas orgânicas, como por exemplo trietilamina ou tri-(2-hidroxietil)-amina, com metais alcalinos e alcalino-terrosos tais como sódio, potássio, magnésio e cálcio, com ácidos inorgânicos, como por exemplo ácido clorídrico, ácido sulfúrico ou ácido fosfórico e com ácidos orgânicos, como por exemplo os ácidos acético, citrico, benzoico, maleico, fumárico, tartárico ou p-toluenosulfónico.

objectivo da presente invenção é também um processo para a preparação de um novo antibiótico, a mersacidina, preparado a partir da cultura n. Hoechst índia, Limited, Y-85, 54728, assim como dos seus mutantes e variantes.

processo mencionado compreende a cultura da cultura η. Y-85, 54728, dos seus mutantes e/ou variantes em condiySes aeróbicas, num meio nutriente contendo fontes de carbono e de azoto, sais nutrientes inorgânicos e oligoelementos, assim como o isolamento e a purificação do antibiótico referido a partir da calda de cultura.

No que se refere às fontes de carbono pode-se tratar por exemplo de galactose, glicerina, sacarose ou glucose. A galactose é preferida como fonte de carbono. Como fontes de azoto mencionam-se preferivelmente extractos de levedura, extractos de carne, água de infusão de milho, ácido casamlnico ou substâncias inorgânicas, tais como por exemplo sais de amónio. A água de infusão de milho é especialmente preferida como fonte de azoto. Quanto aos sais nutrientes inorgânicos, pode tratar-se por exemplo de hidrogenofosfato de sódio, hidrogenofosfato de potássio, cloreto de cálcio ou sulfato de magnésio. Como oligoelementos podem mencionar-se por exemplo sais de ferro, de manganês de cobre ou sais de zinco, ou outros sais metálicos.

A cultura da cultura n. Y-85, 54728 é realizada de preferência a temperaturas compreendidas entre 26 e 29°C e a valores de pH compreendidos entre cerca de 6,5 e 7,2. A cultura n. Y-85, 54728 é cultivada muito preferivelmente a 28°C (- 1°C) e a um pH de 7,2.

A cultura é realizada de preferência durante cerca de 60 a 72 horas, precipitando o antibiótico de acordo com a invenção com rendimento óptimo. A cultura é realizada especialmente de preferência durante 66 horas em condiçSes de imersão, em balSes com agitação, bem como em fermentadores laboratoriais. Caso seja necessário, podem utilizar-se nos fermentadores agentes antiespumantes (por exemplo Desmophen^\ poliois da finna Bayer AG. leverkusen). 0 decorrer da cultura e a formação da mersacidina de acordo com a invenção sâo controláveis por medição

- ,51

da bioactividade da calda de cultura relativamente a Staphylococcus aureus 35 209 P, Staphylococcus aureus R 85 e Alaaligenes faecalis, com os conhecidos métodos de comprovação por difusão em placas de agar (ver por exemplo B. Oxold-Handbuch 1972, 2- edição, editor Oxoid Limited, Londres, Inglaterra).

Na calda de cultura resultante a mersacidina encontra-se apenas no filtrado da cultura, que é separado por centrifugação da massa celular. A mersacidina pode ser isolada por meio de um ou mais de vários processos conhecidos, como por exemplo a cromatografia de acção hidrofa revesrível, por exemplo sobre adsorbentes polirnéricos tais como Diaion HB-20^^ (Mitsubishi Chemical Industries, Japão) ou Amberlite^) xaD-2 (R), XAD-7(R) ( adsorvente polimérico sobre uma matriz de poliestireno, acrilatos ou aminoóxidos com um diâmetro Médio de poros de (40-225) x 10^-4θ m, Rohm e Haas Co. USA) ou extracção com dissolventes imisclveis com água, com acetato de etilo ou butanol, a partir do filtrado da cultura. 0 processo preferido é a adsorçâo em Diaion HP-20 com a subsequente desorçâo do composto com dissolventes orgânicos apropriados como por exemplo metanol, acetonitrilo ou combinações aquosas destes dissolventes. 0 metanol é preferido como dissolvente para eluição da mersacidina.

A eliminação dos dissolventes dos eluidos activos produz a nersadidina bruta. A purificação subsequente é realizada por cromatografia em substâncias tais como silica-gel, sílica-gel modificada, celulose ou Sephadex(R) LK-20 (material de filtração por gel lipófilo, fabricante Pharmacia Pine Chemicals JLB, Suécia). A cromatografia da mersacidina bruta sobre sílica-gel com utilização de misturas acetonitrilo-água para eluição por aumento gradual da concentração de água de 5 a 10% de cada vez, representa o processo preferido. Os eluidos activos (determinados com o processo biológico de comprovação) são con6 centrados com obtenção de um composto semi-puro. 0 antibiótico semi-puro assim obtido pode ser posteriormente pu rificado por exemplo por cromatografia em materiais lipófilos de filtração por gel, como por exemplo Sephadex^^ LH-20 com utilização de dissolventes, como por exemplo água, metanol, clorofórmio, hexano ou as suas combinações correspondentes, eventualmente com o tratamento subsquente com pó de carvão activado, ou por cromatografia liquida de alta pressão preparativa sobre uma coluna de sílica-gel utilizando-se dissolventes tais como por exemplo metanol, CH^CN, água ou as suas correspondentes combinações. A cromatografia líquida de alta pressão preparativa sobre uma coluna com material HPLC com grupos octadeciljtriclorossilano (como por exemplo p produto Hypersil' ⁷ da fiima Shandon, USA) e com utilização de uma mistura (70:30) de CH^CN e água, é o processo preferido. Depois da eliminação do dissolvente orgânico do eluido activo, por exemplo por destilação do dissolvente em vácuo e a subsquente liofilizaçâo para eliminação da água, obtem-se a Mersacidina como um pó branco.

A mersacidina é apropriada para utilização como medicamento devido á sua eficácia antibacteriana (ver os ensaios de eficácia). Sâo pois também objecto da presente invenção medicamentos com um conteúdo de mersacidina, além das substâncias auxiliares e/fcu substân cias veiculares' correntes genericamente conhecidas, bem como a utilização da mersacidina para a preparação de medicamentos com acção antibiótica e/ou imunossupressiva, *

de foima conhecida por si.

Os exemplos seguintes servem para elucidação da presente invenção em maior poimenor.

_ 7 _

EXHJPLO 1

Isolamento da cultura Y-85, 54728 do solo.

(a) Composição do meio nutriente de isolamento

proteose peptona	20,0 g
K₂so₄	1,5 ,
ligS0₄.7H₂0	1,5 ,
glicerina	10,0 ,
pó de agar	15,0 ,
água desmineralizada	1 lirro
valor do pH	6,8

(b) Extracçâo do solo e isolamento

A 10 g de uma amostra de solo recolhida numa exploração de sal em Iiulund adicionaram-se 90 ml de água desmineralizada esterilizada, num balão de Erlenmeyer de /

250 ml, e o balão foi agitado 2 horas numa maquina de agi* taçâo a 220 rotações. A suspensão do solo acima foi depois _ 5 diluída por fases, sucessivamente, de 10 a 10 . Colocou-se 1 ml da suspensão com a hltima diluição no centro de uma placa de vidro de Petri esterilizada (6 polegadas de diâmetro), após o que se verteram aproximadamente 50 ml do meio de isolamento acima descrito arrefecido a 45°C, e a placa foi depois agitada vigorosamente. Deixou-se assentar a mistura formada pela suspensão do solo e o meio, e incubou-se durante 3 dias a 28°C (+ 1°C). A placa de Petri foi observada a intervalos regulafes e isolou-se a cultura no Y-85,54728 dos microorganismos em crescimento.

EXEMPLO 2

Obtenção da cultura Y-85,54728

Composição do meio de otençâo

A cultura n— Y-85,54728 foi obtida de um meio nutriente de agar com a seguinte composição

Paptona 10 g extracto de carne 3 g extracto de levedura 3 g agar em pó 15 g

água desmineralizada litiro pH 7,2

Depois de uma dissolução cuidadosa dos ingredientes por aquecimento distribui-se em frascos de reagentes e seguidamente esterilizou-se por aquecimento a 121°C durante 20 min. Os frascos de reagentes foram airrefecidos e deixou-se solidificar em posição inclinada. As cultãras em agar foram misturadas cmm a cultura η— Y-85, 54728 por meio de uma argola de arame e foram incubadas a 28°C ( + 1°C) ate ser visível um bom crescimento. As culturas bem desenvolvidas foram conservadas emf frigoríficos a +8°C.

EXEMPLO 3

Fermentação da cultura Y-85,54728 em baloÕes de agitação

Composição do maio de cultura de semente

Ácidos casamlnicos 5 g água de infusão de milho 5 g glicerina 20 g galactose 10 g água desmineralizada 1 litro pH 7,2

Para cada caso 25 ml do meio de cultura de semente anterior foram colocados num balão de Erlenmeyer de 250 ml e aqueceu-se a 121°C durante 20 min em autoclave. Os balões foram arrefecidos e em cada um inocãlou-se, por meio de uma argola metálica, a cultura bem desenvolvida descrita acima do exemplo 2, e agitou-se a 28°C (+ 1°C) durante 24 horas a 220 rotações por min. A solução da cul tura assim obtida foi utilizada como cultura de semente para a inoculação dps balões de preparação como será de_s crito adiante.

Preparação do antibiótico mersacidina em balões de agitarão meio de preparação corresponde ao meio de semente desErito no exemplo 3. ϋπ cada caso 100 ml deste meio

foram colocados em balSes de Erlenmeyer de 500 ml e aqueceu-se a 121°C durante 20 minutos em autoclaves. Os balões foram arrefecidos, seguidamente foram inoculados com a cultura de sementeira anterior (1% v/v). A fementação foi realizada numa máquina de agitação em rotação a 220 rotaçSes por minuto e a uma temperatura de 28°C (- 1°C) durante 66 horas.

A produção do antibiótico foi controlada através do perfil de bioactividade ensaiado de forma conhecida por si, contra Staphylococcus aureus 209 P, Staphylococcus aureus R85 e Alcaligenes faecalis, utilizando-se o processo de difusão em placa. Depois da colheita a caída de cultura foi centrifugada e isolou-se a mersacidina do filtrado da cultura e purificou-se como se descreve a seguir.

EXBiiPLO 4

Cultura da cultura η. Y-85, 54728 em fermentadores

Passo 1: preparação da cultura de semente em balSes de agitação meio de cultura de semente do exemplo 3(100 ml) foi colocado em balSes de Erlenmeyer de 500 ml, com um pH de pré-esterilização ajustado a 6,8. 0 meio foi esterilizado a 121°C durante 20 min. numa autoclave, arrefeceu-se e inoculou-se com a cultura bem desenvolvida do exemplo 2, por meio de uma argola metálica. Os balSes forem incubados a 28°C (- 1°C) durante 24 horas numa máquina de agitação com rotação, a 220 rotaçSes por minuto. Esta cultura de crescimento foi utilizada para inoculação de pequenos fermentadores, como se descreve adiante.

Passo 2: preparação da cultura de semente em pequenos fermentadores

1 do meio de semente (como descrito no exemplo 3) com um pH de pré-esterilização ajustado a 6,8,

foram colocados em fermentadores de aço inoxidável de 15 1 de capacidade, conjuntamente com 0,04)6 (v/v) de Desmophen como agente anti-espumante, esterilizou-se a 121°C durante 36 min. numa autoclave, arrefeceu-se e inoculou-se com 40 (v/v) do meio de semente do passo 1 anterior do exemplo 4 em condições assépticas. Seguidamente cultivou-se durante 24 h nas seguintes condições:

temperatura 28°C (- 1°C) velocidade de agitação 150 rpm arejamento 6 1 por minuto.

A cultura depois de 24 horas de crescimento, foi utilizada para inoculação do meio de preparação do passo 3.

Passo 3: fermentação em escala de produção

100 1 do meio de preparação (correspondente ao meio de semente descrito no Exemplo 3) com um pH de pré-esterilização ajustado a 6,8 e coip adição de 0,060 de Desmophen, foram introduzidos num fermentador de 150 1, ou em alternativa 250 1 daquele meio contendo 0,06/ de Desmophen, foram colocados num fermentador de 390 1 de capacidade, esterilizou-se durante 28 min. a 121°C in situ e inoculou-se com 4)6 da cultura de semente do passo 2.

Cultivou-se nas seguintes condições:

temperatura: 28° (-1°C)

Velocidade de agitação: 80 a 100 rpm arejamento: 50 1 por min. (no fermentador de 100 1) ou 125 1 por min. (no fermentador de 390 1).

Tempo de cultura: passadas 66 h.

A produção do antibiótico foi controlada através de actividade ensaiado contr- Staphylococcus aureus 209 P, Staphylococcus aureus R85 e alacaligenes faecalis. A calda de cultura depois da colheita foi centrifugada e o antibiótico foi isolado e purificado a partir do filtrado

- Il-

da cultura, como se descreve a seguir.

EX34RL05

Isolamento e purificação da mersacidina

Aproximadamente 100 1 da calda recolhida foram separados do micélio por centrifugação. 0 filtrado assim ohtido (pH 6,8-7,0) foi passado através de unia coluna de 5 1 de Diaion HR-20. A coluna foi primeiramente lavada com 50 1 de água desmineralizada. Foi seguidamente lavada sucessivamente com 70/ de água em metanol (40 1),50/ de água em metanol (50 1) e 30/ de água em metanol (50 1) e as águas de lavagem foram descartadas. A coluna foi finalmente eluída com 10 1 de metanol. Os eluidos activos foram concentrados a pressão reduzida até à obtenção de uma substância oleosa castanha. Esta foi triturada com 1 litro de éter cie petróleo (ponto de ebulição 40 a 60°C), filtrou-se e o filtrado foi descartado. Este passo foi repetido até ficar como resíduo de filtração um pó. A mersacidina bruta foi obtida deste modo na forma de um pó amarelo acastanhado,

A mersacidina bruta foi depois submetida a cromatografia líquida de média pressão através de 300g de sílica-gel (200 a 300 mesh) numa coluna de vidro de 5,5

débito de 16 ml por minuto. Recolheram-se fracçSes de 250 ml e ensaiaram-se através de um controlo por UV a um comprimento de onda de 210 nm e por processos de verificação microbiana. Daquelas 6 fracçSes (1,5 l) do eluído com solução

liofilizou-se, obte;do-se deste modo 2 g de uma substância semi-pura como um pó amarelado.

- 12 0 material semi-pu.ro assim obtido foi de novo submetido a uma cromatografia líquida de média pressão através de sílica-gel (200 a 300 mesh) numa coluna de vidro com 4 x 54 cm. A coluna foi eluída sucessivamente com CH^CN ( 1 lt) solução aquosa a 5% de OH^CN (1 lt) e solução aquosa a 10% de CH^CN (4,5 1) com um débito de líquido de 30 ml por min. Recolheram-se fracções de 250 ml e controlaram-se por análise UV a 210 nm e por comprovação microbiana. A mersacidina foi obtida por eluição com solução aquosa a 10% de CH-.CN (7 50 ml) que foi depois concentrada a pressão reduzida a 35 0, seguida por liofilização, obtendo-se 593 mg de mersacidina na forma de um pó branco a esbranquiçado.

A purificação final da mersacidina foi realizada por cromatografia líquida de alta pressão numa coluna de 4 x 250 mm com Hypersil (lOu) com utilização de solução aquosa a 30% de CH-jCN como eluente e com um débito de líquido de 1,0 ml por minuto. As fracções foram controladas por análise UV a 210 nm. Nestas condições, a mersacidina tinha um tempo de retenção de cerca de3,5 minutos.

As fracções correspondentes foram recolhidas e reunidas, concentradas em vácuo a 35°C e finalmente liofilizou-se, obtendo-se assim 275 mg do antibiótico na forma de um pó branco. A pureza da mersacidina foi comprovada por meio de uma coluna de 4 x 120 mm de APS-Hypersil (5 u); mistura (70:30) de CH^CN e água como eluente; débito de líquido 1 ml por minuto; velocidade do papel: lOmm por minuto; verificação a 210 nm. 0 cromatograma líquido de alta pressão está representado na fig. 1.

Propriedades físico-químicas da mersacidina

A mersacidina é um composto novo cuja estrutura se caracteriza por um nonadecapeptídeo com um radical C-terminal vinilamida e 4 pontes de sulfureto intramoleculares.

- 13 0 quadro 1 contém as propriedades físico-químicas da mersacidiha.

QUADRO 1: Propriedades fisico-quimicas da mersacidina

Aspecto: pó amorfo branco

Carácter: polipeptídeo ciclico

Ponto de fusão: cerca de 240°C (com decomposição)

ZT<7_D ²⁰° “ 9,4° (c = 0,3, MeOH)

Fórmula empárica: Οθθ Η^θ N^q 0^

-Determinado por espectroscopia de massa de alta resolução (ionização FAB, matriz álcool 3-nitrobenzíIico)

- m/z medido 1825,785 do ião M+H⁺

- m/z calculado 1825,790 para

12, '80

32<

121

Espectro de massa (FAB, matriz álcool 3-nitrobenzilico)F. 2.

¹H-NídR (270 mHz, CD^OD) : Fig. 3 ¹³C-M»ÍR (100 IiHz, CD^OH): Quadro 2

Tabela 2: Dados de ^b3C-NMR da mersacidina (solução a 7^c/° em CD^H, 310 K)

Desvio quimico Multiplicidade Esquema da estrutura

10.42	9	C-5	Ile (19)
15.97	9	C-4¹	¹ Ile (19)
18.51	9	C-4	tio-Abu (2)
18.68	9	0-4'	¹ Vai (11)
19.77	9	C-4	Vai (11)
20.13	9	C-4	3-tio-Abu(4+15)

- 14 _

Tabela 2: (cont)

Desvio químico ppm

Multiplicidade

Esquema da estrutura

21.28	9	C-4	3-tio-Abu	(13)
22.43	t	C-3	Cys (1)
22.43	q	C-5	' Leu (5)
23.17	q	C-5	' Leu (14)
23.53	q	C-5	Leu (5)
23.58	q	C-5	Leu (14)
25.47	4	C-4	Leu (5)
25.78	4	C-4	Leu (14)
26.00	t	C-4	Pro (6)
26.68	t	C-4	Ile (19)
28.17	t	C-3	Glu (18)
30.85	t	C-3	Pro (6)
32.54	d	C-3	Vai (11)
33. 58	t	C-3	Cys (12)
35.21	d	C-3	Ile (19)
35.59	t	C-4	Glu (17)
37.14	t	C-3	Cys (18)
37.34	t	C-3	Phe (3)
39.39	d	C-3	3-tio-Abu	(2)
40.93	t	C-3	Leu (14)
4-2.02	t	0-3	Leu (5)
42.81	t	C-2	Gly (10)
43.38	t	C-2	Gly (9)
43.59	d	C-3	3-tio-Abu	(4)
44.10	t	C-2	Gly (7)
44.62	t	C-2	Gly (8)
45.50	d	C-3	3-tie-Abu	(13)
48.67	t	C-5	Pro (6)
49.46	d	C-3	3-tio-Abu	(15)
50.42	d	C-2	Leu (14)
52.71	d	C-2	Leu (5)
55.25	d	C-2	Cys (18)

Tabela 2 (cont):

55.72	d	C-2 (Cys (12)
56.72	d	C-2 Glu (17) , _s
	d d	ti ⁽¹⁵⁾
58.12	d	C-2 Cys (1)
59.07	d	C-2 3-ti-Abu (2)
59.08	d	C-2 3-tio-Abu (4)
59.19	d	C-2 3-tio-Abu (13)
61.60	d	C-2 Pro (6)
62.64	d	C-2 Ile (19)
63.14	d	C-2 Vai (11)
103.84	d	C-2 Tiovinilamida (20)
112.41	<&	C-2 desidro-Ala (16)
127.97	d	C-7 Phe (3)
129.56	d	C-l Tiovinilamida (20)
129.71	d	C-6 Phe (3)
130.22	d	C-5 Phe (3)
136.96	s	C-4 Phe (3)
138.15	s	C-2 Desidro-Ala (16)
166.56	s	C-l Desidro-Ala (16)
171.16	s	C-l Ile (19)
171.38	s	C-l Gly (10)
171.44	s	C-l-Cys (18)
171.62	s	C-l 3-tio-Abu (4)
171.76	s	C-l 3-tio-Abu (15)
171.82	s	C-l Gly (9)
171.84	s	C-l Leu (5)
171.86	s	C-l 3-tio-Abu (13)
171.87	s	C-l 3-tio-Abu (2)
172.59	s	C-I Gly (8)
172.74	s	C-l Leu (14)
173.06	s	C-l Gly (7)
173.76	s	C-l (Cys (12)
174.00	s	C-l Vai (11)
174.25	s	C-l Glu (17)

- l6

Tabela 2 (cont)

174.61	s	C-l	Cys	(D
174.81	s	C-l	Phe	(3)
175.62	s	C-l	Pro	(6)
181.31	s	C-5	Glu	(17)

Testes de eficácia:

a) eficácia da mersacidina in vitro

As propriedades biológicas da mersacidina, como valores lúHK necessários para a inibição do crescimento de diversos microorganismos, estão indicados no Quadro 3.

Quadro 3:

Número	Organismo	ensaiado	Valores LiHK (ug/ml)
1.	Staph. aureus 209 P	0,78 - 1,56
2.	11	Ξ 88	6.25 - 12.50
3.	11	3066	12.50 - 25,00
4.	11	20240	3.12 - 6.25
5.	11	20424	1,56 - 3.12
6.	11	503	0,78 - 1,56
7.	11	789	0,78 - 1,56
8.	11	722	3.12 - 6.25
9.	tl	SG 511	0,39 - 0,78
10.	H	20666	3.12 - 6.25
11.	II	E 712	3.12 - 6.25
12.	11	285	0,78 - 1,56
13.	11	R 85	0,39 - 0,78
14.	II	710	0,39 - 0,78
15.	Liicrococcus luteus	0,097 5-0,195
16.	Bacillus	subtilis	0,39 - 0,78
17.	Streptococcus faecalis	0,0975 - 0,195
l8.Str D	21777		1,56 - 3,12

- l7 -

19.	3. epidermidis MRSE	0,5 -	16,0
20.	3. epidermis MSSE	0,5 -	16,0
21.	Gruppe A Streptococci	0,5 -	8,0
22.	Gruppe B Streptococci	1,0 -	8,0
23.	Gruppe C Streptococci	2,0 -	64
24.	Gruppe G	2,0 -	8,0
25.	Streptococci bovis	4,0 -	32,0
26.	viridans	0,5 -	32,0
27.	faecalis	64,0
28.	pneumoniae	1,0 -	4,0
29.	Corynebacterium JX	2,0 -	4,0
30.	listeria monocyctmgHnes	16,0 -	64,0
31 ·	Clostridium species	0,5-	ló, 0
32.	Peptostreptococci species	0,5 -	8,0
33.	Propionobacterium genes	1,0 -	16,0

b) Eficácia da mersacidina in vivo

No sistema in vivo de ratos de laboratório a mersacidina mostrou boa actividade. Na administração subcutânea numa dose de 9.37 e 25,00 mg/Xg, em ratos de laboratório infectados experimentalmente com Staphylococcus aureus 5G 511 e 5. aureus 710 (resistente comntra a meticilina) foi obtida uma relação de cura de 100%. Além disso verificou-se a toxicidades aguda do antibiótico em ratos de laboratório. Liesrno para uma dose de 500 mg/Xg (subcutânea) a concentração de ensaio mais elevada até ao presente, não se observou qualquer mortalidade entre os animais. Os resultados estão indicados no Quadro 4.

Quadro 4: Eficácia in vivo da mersacidina contra 3. aureus 3G 511

-Infecção em ratos em comparação com a vancomicina. leio de inoculação utilizado: 1,75 x 10θ g KBE/rato

Com oosto dose/ /aplicação mg/Kg x 3

s.c.

Ndm. ratos tratados(grau de cura em %)

^ED50’ ^90 ng/Xg x 3

Mersacidina 9,37 6,25 3,12 1, 60 0,80	53/53 (100) 38/40 (95) 18/27 (67) 3/24 (12) 0/27 (0)	2,59 5,38
Vancomicina 18,75	71/71 (100)
12,5	59/61 (97)	7,20
9,37	48/53 (85)	9,37

6.25 13/44 (29)

3,12 2/41 (5)

Eficácia in vivo da mersacidina contra S. aureus Ξ 710 (MRSA)

em ratos em comparação com a vancomicina
Meio de inoculação	u utilizado: 5 x 10^ g	K3E/rato (l MLD)
dose/ Num. ratos /aplicação tratados mg/Kg x 3 (grau de Composto s.c. cura %)	Relação EB ^50’ ^90 mg/Kg x 3
25,00	12/12 (100)	10,81
Mersacidina 12,50	10/16 (63)	19,59
9,37	4/10 (40)
6,25	1/10 (10)
Vancomicina 37,00	6/6 (100)	18,94
25,00	14/21 (67)	32,01
12,50	3/H (27)
6.25	0/11 (0)

Eficácia in vivo da mersacidina contra S. aureus SG 511

Abcessos em ratazanas, em comparação com a vancomicina.

Meio de inoculação utilizado: 2 x 10^ em mucina a 5% injecta da sob a pele.

Tratamento: 50 mg/Kg x 7 dias.

Resultados: a mersacidina reduziu a formação de bactérias de 1,4 ^Ιοδ₁₀ KBU/ml (unidades de formação de colónias) a vancomicina reduziu a formação de feactérias de 0,79 Iog^ KBU/ml.

EXEMPLO 6

Preparação de sais soláveis em água da mersacidina

A mersacidina é solúvel em água na forma dos seus sais alcalinos. Estes podem ser preparados por exemplo pela reacção da mersacidina com um equivalente do correspondente hidróxido de metal alcalino, na presença de piridina. Por exemplo, dissolveram-se 50 mg de mersacidina em 1 ml de piridina, a silução foi arrefecida a 0°C e adicionou-se-lhe sõh agitação uma solução de 1,683 mg de potassa cáustica em 3 ml de água destilada. A mistura foi agitada Ih a 0°C e seguidamente foi liofilizada. Obtiveram-se 49 mg do sal de potássio da mersacidina na forma de um pó branco. Este sal de potássio de mersacidina é solúvel até 150 mg/ml de água. As propriedades anti-bacterianas in vitro e in vivo do sal de potássio da mersacidina são comparáveis às da própria mersacidina. Os resultados dos ensaios estão indicados nos quadros 5 e 6.

Quadro 5

Valores IvíHK do sal de potássio da mersacidina

Número

Organismo ensaiado

Valores KHK (ug/ml)

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8. 9.

10.

11.

12.

Staph. aureus 209P R 85

710

3066

25923 epideimis 32965

823 haemolyticus 712

809

Strepto. hominis KL 22 faecalis 29212

21777

Quadro 6

Eficácia in vivo do sal de potássio de mersacidina contra infecçSes de S. aureus e Strept. pyogenes A 77 no rato

Organismo

Ensaiado meio de inoculação utilizado

Dose eficaz a 50^ (ED₅₀) mg/Kgx 3

Staph. aureus SG 511 1,75 x 10^ (Kethicillin sensitive)

2,85

Staph. aureus E 710 1 x ΙΟ^θ (Kethicillin resistant)

6,72

Staph. aureus C 31153 2 x 10 (Kethicillin & Caphalexin resistent)

15,35

Strept. pyogenes A 77

3,8 x 10³

0,46

Claims

Processo qara a oreoaração de um comoosto de fórmula I

CH₉

I <CH t

ch(ch₅)₂rv ;n,

H^N-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-HH-CH-CO-NH-CH-CO-N-CH-CO lL.

f

CHC0-CH-NH-C0-CH-NH-C0-CH₂-rn-C0-CH₂-HH-C0-CH₂-NH-C0-CH₂-NH ch(ch₃)₂

H-CO-NH-CH-OO-NH-CH-CO-HH-C-CO-HH-CH-CO-NH-CH-CO

I

CH

CH(CH₅)₂ ύ-Τ !

CH i

C0₂H

CH=CH-NH-CO-CH-NH

CH-CHC₂ ^H5 caracterizado pelo facto de se cultivar o Eubacerium Bacillus sp . Y-85,54 728 (DSM 4584-) os seus mutantes e/ou variantes em condições aeróbicas num meio nutriente contendo fontes de carbono e de azoto, sais nutrientes inorgânicos e oligoelementos e se isolar o composto de forma convencional a partir da calda de cultura e se purificar.

Processo para a preparação de um composto de fórmula II gh(ch₅)₂ σκ₂

S \ !

H ^N-CH-CO -NH-C H-CO-NH-CH -CO -NH-CH -CO -NH -CH -CO -N-CH-CO R S S ' S S

CO -CH -NH-CO -CH-NH-CO -CH_O-NH-CO -CH^-NH-CO-CH,-NH-CO -CHA-NH R 2 n 2 2 ch(ch₅)₂

CH t

CH_O t <s s s

NH-OH-CO -NH-CH-CO -NH-CH-CO -NH-C -CO -NH-CH-CO-NH-CH -CO S ' ' ’ R

CH <CH

CH,

CH_O i <CH_O » b

CH(CH₅)₂ co caracterizado pelo facto de se cultivar o Eubacerium Bacillus sp. Y-S5,54728 (DSM 4-584) os seus mutantes e/ou variantes em condições aeróbicas, num meio nutriente contendo fontes de carbono e de azoto, sais nutrientes inorgânicos e oligoelementos e se isolar o composto de forma convencional a partir da calda de cultura, e se purificar.

- 3â Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se realizar a cultura a temperaturas compreendidas entre cerca de 26 e 29°C e a um valor de pH compreendido entre cerca de 6,5 θ 7,2.

- 4-ã Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 3 , caracterizado pelo facto de se realizar a cultura a 28°G ( + 1°C) e a um valor de pH de cerca de 7,2.

- 5a _

Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 4-, caracterizado pelo facto de se realizar a fermentação por um período superior a 60 horas.

- 6â Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 5» caracterizado pelo facto de os compostos de fórmulas I e II serem purificados por métodos cromatográficos.

Processo para a preparação de composi ções farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se incorporar como ingrediente activo um composto de fórmula I ou II quando preparado por um processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 1 a 6, eventualmente em combinação com substâncias auxiliares e/ou substâncias veiculares correntes para a preparação de composições farmacêuticas, e de se lhe dar uma forma apropriada para administração farmacêutica.