PT830061E - Toalhitas desinfectantes humidas com bacteriocina e metodos para a sua utilizacao - Google Patents

Description

84 495 ΕΡ Ο 830 061 /ΡΤ DESCRICÃO "Toalhitas desinfectantes húmidas com bacteriocina e métodos para a sua utilização"

ANTECEDENTES DO INVENTO

Toalhitas desinfectantes, ou toalhetes, húmidos estão, correntemente disponíveis no comércio e são produzidos numa variedade de formas. As toalhitas correntemente disponíveis têm um certo número de utilizações incluindo a desinfecção das mãos, pele, linhas alimentares e superfícies hospitalares, bem como aplicações na indústria dos lacticínios.

As toalhitas desinfectantes húmidas presentemente disponíveis contêm, tipicamente, como agente(s) desinfectante(s), um germicida como clorhexidina, digluconato de clorhexidina ou povidona-iodo e/ou um álcool. O componente álcool, geralmente numa concentração de 70% ou superior, também actua como um agente de secagem. Embora a secagem eficiente de uma superfície exposta a uma toalhita húmida seja importante, a elevada concentração do álcool, comummente usada, coloca um problema de excesso de secagem e gretadura da pele. Existe uma preocupação adicional com o ponto de ignição das formulações com um teor em álcool tão elevado. Para além disso, os desinfectantes usados comummente não têm a potência ideal e as quantidades requeridas para a obtenção de propriedades de desinfecção razoáveis podem apresentar problemas de toxicidade ou de sensibilização.

Uma área em particular na qual os problemas não foram completamente abordados pelos métodos de desinfecção correntemente conhecidos é a indústria dos lacticínios. A indústria dos lacticínios incorre em perdas enormes, superiores a 2 mil milhões de dólares por ano somente nos Estados Unidos da América, como resultado de mastite. É recomendada a prática da higiene adequada do úbere antes, durante e após a ordenha de modo a controlar a infecção por mastite. A preparação de uma vaca leiteira para a ordenha é tida como a parte mais intensiva em termos de mão de obra e a que mais tempo consome de todo o procedimento de ordenha. Comummente, os produtores de leite usam um de 84 495 ΕΡ Ο 830 061 /ΡΤ 2

dois métodos diferentes. Ο método prevalecente é a lavagem do úbere. Esta prática consiste na utilização de uma solução de lavagem do úbere, toalhas de papel individuais e água. A solução de lavagem do úbere pode ser injectada na corrente de uma mangueira de água e pulverizada sobre o úbere. Alternativamente é embebida uma toalha na solução de lavagem do úbere contida num balde, e a toalha de papel húmida é usada para a lavagem e a massagem do úbere. Em qualquer um dos casos o úbere é, então, seco com uma toalha de papel. A pré-imersão com uma solução germicida de imersão de tetas substituiu a lavagem do úbere em aproximadamente 40% das unidades de produção de leite nos EUA. O ordenhador pulverizará ou mergulhará as tetas da vaca com a solução de imersão da teta (em oposição a todo o úbere), permitindo que a solução de imersão fique em contacto com a teta durante, pelo menos, 15 segundos. A solução de imersão da teta é, seguidamente, removida com uma toalha de papel.

Embora qualquer um destes métodos tenha certas vantagens, nenhum trata eficazmente todas as preocupações encontradas neste meio. De entre estas preocupações estão a limpeza e secagem eficazes, a contaminação do leite pelo escorrimento do produto de lavagem do úbere e/ou por resíduos da solução de pré-imersão e a utilização eficiente da mão-de-obra e do tempo na preparação da vaca.

Tem sido investido muito esforço para remediar a contaminação bacteriana generalizada e cara, do leite. Foram descritos vários métodos melhorados para o tratamento de pré-ordenha dos úberes e métodos para a prevenção e tratamento da mastite bovina (ver e.g. Patente US N° 4 206 529 de Neumann; N° 5 124 145 e 5 234 684 de Sordillo, et a!.·, N° 4 253 420 de Hoefelmayr e N° 5 366 732 de Zighelboim). Outros descreveram composições antimicrobianas melhoradas que têm aplicação particular ao problema de resíduos contaminantes em operações de higiene de pré-ordenha. (ver e.g., Patente US N° 5 139 788 de Schmidt) ou descreveram sistemas melhorados, de aplicabilidade geral, para a distribuição de toalhitas húmidas (ver, e.g., Patente US N° 4 775 582 de Abba, et al. e N° 4 853 281 de Win, et a!.). Berg, et a/., J. Dairv Sei. 68, 457-461 (1985); Pankey, et al. Veterinarv Clinics of North America 9. 519-530, 1993; McKinnon, et a!.. J. Dairv Res. 50, 153-162, 84 495 ΕΡ Ο 830 061/ΡΤ 3

1983; Murdough, et a!., J. Dairv Sei. 76, 2033-2038, 1993 e Ansari, et a/., Am. J. Infect. Control 19, 243-249, 1991 proporcionam descrições adicionais do presente estado da arte e descrevem a evolução da higiene do úbere em termos dos vários aspectos dos procedimentos aplicados comummente para a higienização de pré-ordenha das tetas. WO-A-9413143 descreve formulações contendo a bacteriocina lantationa, que também contêm metionina e agentes quelantes, úteis em toalhitas desinfectantes.

Existe, assim, uma necessidade de toalhitas desinfectantes, húmidas, que proporcionem desinfecção e secagem eficientes, em um passo, de superfícies, mas que empreguem agentes de desinfecção com maior potência bactericida, no entanto com o menor número possível de efeitos secundários indesejáveis. As toalhitas melhoradas também deverão proporcionar secagem eficiente sem gretaduras ou outra perda de integridade de superfícies sensíveis.

SUMÁRIO DO INVENTO 0 presente invento refere-se a novas toalhitas húmidas, de papel ou de tecido, que proporcionam a desinfecção e secagem de superfícies, rápida e em um passo. As toalhitas contêm uma formulação de desinfecção líquida compreendendo, tipicamente, uma bacteriocina como o agente de desinfecção, um estabilizante para a bacteriocina, um agente quelante, um tensioactivo, um sal, um condicionante ou humectante da pele e um agente para a promoção da secagem rápida. O agente de desinfecção bacteriocina também pode ser combinado com os agentes germicidas comummente usados, na medida do adequado. Nas toalhitas do presente invento os referidos agentes germicidas podem ser empregues em quantidades muito menores, minorando, assim as preocupações com a toxicidade e a sensibilização. Dado que as toalhitas do invento empregam bacteriocinas, i.e. agentes bactericidas muito mais potentes, o componente álcool é requerido, principalmente como um agente de secagem e, assim, a concentração necessária de álcool é substancialmente reduzida, em relação à que é requerida para a acção bactericida. Isto proporciona uma solução para o problema de gretadura de superfícies sensíveis encontrado, tipicamente, com as formulações com teor elevado em álcool.

84 495 ΕΡ Ο 830 061/ΡΤ 4

As toalhitas do presente invento são adequadas para a desinfecção e secagem de qualquer superfície na qual é requerida a higienização. Uma aplicação particular das toalhitas do invento consiste na desinfecção e secagem, rápidas e eficientes das tetas de vacas. 0 presente invento refere-se ainda a um método para a redução da incidência de infecção por mastite em animais de produção de leite, que emprega as novas toalhitas.

As Patentes US N° 5 135 910; 5 217 950; 5 260 271; 5 304 540 e 5 334 582 descrevem, todas, composições bactericidas de espectro largo compreendendo uma lanticina (uma bacteriocina que contém lantionina) tal como nisina e um agente quelante. As patentes descrevem ainda um certo número de utilizações para as composições com base nas suas propriedades bactericidas. Consept, uma formulação contendo nisina, no âmbito das composições descritas nas patentes referidas está no mercado já há alguns anos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A Figura 1 apresenta o efeito de diferentes concentrações de metionina sobre a estabilidade de nisina em toalhas de papel a diferentes tempos de exposição. A Figura 2 apresenta a eficácia de diferentes concentrações de metionina na protecção da nisina após 6 dias de exposição. A figura 3 apresenta o efeito da metionina e/ou NaCI sobre a degradação da nisina.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 0 presente invento proporciona uma toalhita descartável de um tecido de papel ou têxtil, tipicamente, com uma formulação à base de bacteriocina, compreendendo adicionalmente um agente quelante, um componente sal, um estabilizante para a protecção da bacteriocina contra a degradação, um agente de secagem e um tensioactivo. As toalhitas do presente invento proporcionam desinfecção e secagem de superfícies, eficientes, em um passo, e têm aplicabilidade em qualquer situação que requeira a higienização de uma

84 495 ΕΡ Ο 830 061/ΡΤ 5 superfície. Uma aplicação particular consiste na desinfecção e secagem de tetas de vaca.

As toalhitas do presente invento contêm uma formulação desinfectante compreendendo, tipicamente, como ingrediente activo uma bacteriocina em combinação com um componente sal. 0 agente activo preferido é uma lantocina (uma bacteriocina que contém lantionina) tal como nisina, subtilina, epidermina, galidermina, cinamicina, duramicina, ancovenina ou Pep 5. Também podem ser empregues adequadamente outras bacteriocinas peptídicas tais como lisostafina . Os agentes bacteriocina do presente invento são muito mais potentes do que os germicidas comummente utilizados e não exibem efeitos secundários indesejáveis. Contudo, os agentes activos das formulações de acordo com o presente invento não estão confinados a bacteriocinas peptídicas; podem ser empregues adequadamente outros agentes antibacterianos tais como clorhexidina em combinação com as bacteriocinas do invento. A presença do componente bacteriocina permite o emprego da clorhexidina ou de outro componente germicida de tipo diferente da bacteriocina em concentrações muito mais baixas eliminando, assim, as preocupações relativas a efeitos secundários indesejados. Para além disso, o agente activo pode compreender duas ou mais bacteriocinas em combinação, ou uma bacteriocina em combinação com outro agente antibacteriano. A concretização mais preferida do presente invento, conhecida até este momento, compreende nisina como ingrediente activo.

A utilização de bacteriocinas, tal como nisina, em conjunto com uma toalhita de papel ou têxtil, apresenta dificuldades inerentes que são devidas à natureza peptídica do ingrediente activo. Seria de esperar que estes compostos adsorvidos numa toalhita não se libertassem facilmente da toalhita, no presente caso para o local onde a desinfecção é desejada. Consequentemente, as formulações do presente invento compreendem adicionalmente um componente para aumentar a força iónica e que actua, assim, no sentido de tornar mais fracas as ligações entre o agente bactericida e a superfície da toalhita. Verificou-se, também, que este componente constitui um factor que melhora a estabilidade do agente activo quando em contacto com a toalhita. Agentes adequados para o aumento da força iónica são, sais halogeneto de carboxilatos, sais hidroxiácido, salicilatos, glicolatos, fosfatos e polifosfatos. Um componente preferido é NaCI numa gama de concentrações de 10 a 100 mM. A

84 495 ΕΡ Ο 830 061/ΡΤ 6 concentração preferida de NaCI é 50 mM, Um outro componente preferido é citrato de sódio numa gama de concentrações de 1 a 10 mM. A concentração preferida de citrato é 5 mM.

Verificou-se que (ver Patentes US N° 5 135 910; 5 217 950; pedido de patente, pendente, US N° Ser. 08/386 122, aqui incorporados por referência) 5 260 271; 5 304 540 e 5 334 582, aqui incorporadas por referência) lantocinas em combinação com agente quelante exibem potência melhorada e espectro mais largo como bactericidas. Consequentemente, as formulações do presente invento contêm, tipicamente, um componente quelante. Agentes quelantes adequados são, por exemplo, EDTA, CaEDTA, CaNa2EDTA e outros tetra-acetatos de alquildiamina, bem como EGTA e citrato. Os agentes quelantes preferidos são EDTA (1-10 mM) e/ou citrato (1-30 mM). As concentrações mais preferidas de EDTA e de citrato são 3 mM e 5 mM, respectivamente. Os agentes quelantes podem ser utilizados sozinhos ou em combinação.

As bacteriocinas peptídicas preferidas do presente invento são algo lábeis e podem ocorrer perdas por degradação quando a bacteriocina está em contacto com a toalhita. Verificou-se (pedido de patente, pendente, US N° Ser. 08/386 122) que a metionina e compostos tioéter relacionados actuam no sentido da protecção de bacteriocinas, particularmente da nisina, contra a degradação. Consequentemente, a metionina é tipicamente um componente das formulações do presente invento. A metionina é empregue numa gama de concentrações de 1-10 mM, sendo 2 mM a concentração mais preferida. Verificou-se também que uma combinação de EDTA e de citrato não só confere as propriedades descritas anteriormente para os quelantes, mas melhora adicionalmente a estabilidade do componente bacteriocina.

Do mesmo modo, na linha da estabilização do agente activo, pode ser adicionada catalase à formulação para a destruição de quaisquer peróxidos que possam estar presentes. A catalase pode ser empregue, tipicamente, numa gama de concentrações de 6 a 600 unidades/ml. A concentração mais preferida de catalase é de 60 unidades/ml.

Outro componente importante da formulação é um agente de secagem. Tem que ser conseguido um equilíbrio delicado entre formulações que são

84 495 ΕΡ Ο 830 061 /ΡΤ 7 demasiadamente "molhadas" e aquelas que são demasiadamente "secas". Tal como descrito anteriormente, demasiada humidade durante o procedimento de desinfecção pode interferir com o processo de desinfecção; aumentar as oportunidades de contaminação cruzada; e particularmente no caso de superfícies sensíveis, tais como pele e tetas, provocar irritação. Por outro lado, tem que ser mantida uma quantidade mínima de "humidade" de modo a optimizar a função do componente bacteriocina; as toalhitas de acordo com o presente invento não são "activadas por humidade", mas deve ser mantido um ambiente de humidade mínima de modo a assegurar a eficiência desejada. Para além disso, formulações que promovam uma secagem demasiadamente rápida ou completa, podem promover irritação de superfícies sensíveis.

Consequentemente, as formulações do presente invento, tipicamente compreendem, adicionalmente, um agente de secagem, tal como um álcool. Devido ao componente bacteriocina empregue nas toalhitas do invento, o componente álcool apenas é requerido na qualidade de secante e não na de desinfectante. Consequentemente, as formulações do presente invento contêm muito menos álcool do que é tipicamente requerido em formulações conhecidas de toalhitas. As preocupações típicas com a sensibilidade da superfície e com o ponto de ignição associado ao alto teor em álcool são assim evitadas. De entre os álcoois adequados para o uso nas toalhitas do invento, encontram-se metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol e álcool benzílico. O componente de secagem preferido é o 1-propanol numa concentração de 10 a 20% p/v. A concentração mais preferida para o 1-propanol é 1 2% p/v.

As patentes citadas anteriormente como dirigidas a composições de nisina-quelante, também descrevem que um componente tensioactivo pode melhorar adicionalmente a potência e a gama de actividade de composições bactericidas contendo lantocina. As formulações do presente invento podem compreender, adicionalmente, um destes componentes. Estes componentes incluem tensioactivos e emulsionantes não iónicos e anfotéricos, compostos quaternários, monoglicéridos e ácidos gordos. Mais particularmente, estes componentes podem ser seleccionados de entre monolaurato de glicerol (0,03 a 0,3% p/v); tensioactivos não iónicos, tais como Polisorbate 20 (0,1 a 3% p/v), Arlasolve 200 (0,1 a 3% p/v) e Triton X-100 (0,1 a 3% p/v); agentes catiónicos, tais como óxido de lauramina (0,1 a 3% p/v); ou agentes zwiteriónicos, tais como betaínas de coco-amidopropilo (0,1 a 3% p/v). O componente tensioactivo preferido, presentemente conhecido, é o tensioactivo

84 495 ΕΡ Ο 830 061 /ΡΤ 8 não iónico Polisorbate 20 a uma concentração de 1 % p/v. A formulação de toalhitas do presente invento pode compreender adicionalmente um componente condicionante/humectante e um agente espessante. 0 condicionante é particularmente útil quando a toalhita é aplicada a superfícies de pele facilmente irritáveis. Tipicamente este componente pode ser seleccionado de entre propilenoglicol, glicerol, sorbitol e lactilato, cada um na gama de concentrações de 1 a 10% p/v. O condicionante preferido é propilenoglicol a uma concentração de 10% p/v. O agente espessante pode ser seleccionado de entre hidroxietilcelulose, metilcelulose, polivinilpirrolidona ou misturas destes agentes, cada um na gama de concentrações de 0,1 a 1% p/v. De acordo com o presente invento, o componente preferido é a hidroxietilcelulose a 0,35% p/v. A capacidade de transporte de líquido da toalhita pode ser aumentada quando um espessante é um componente da formulação da toalhita. 0 pH das formulações é ajustado na gama de 3,0 a 5,0. O pH final preferido das formulações é 3,5.

As patentes '910, '950, '271, '540 e '582, referidas anteriormente, descrevem um certo número de composições e de formulações que compreendem várias combinações dos ingredientes referidos anteriormente na descrição das presentes formulações. As patentes são referidas quanto à sua descrição da produção de composições de nisina-quelante, composições que podem ser utilizadas nas toalhitas do presente invento. A escolha do papel da toalhita a ser utilizado em combinação com a formulação à base de nisina é também importante para a realização com êxito do invento. Por exemplo, alguns papéis não permitem a adsorção vantajosa do agente activo. Isto poderá resultar ou em adsorção insuficiente do ingrediente activo pela toalhita ou em dificuldade de libertação do ingrediente activo da toalhita para a área alvo. Outras considerações a este respeito consistem no custo, textura relativamente ao impacto na pele, capacidade para líquido por toalhete, resíduo líquido deixado na pele e resistência à tracção do papel quando molhado. Os melhores papéis que são correntemente conhecidos dos inventores são celulose hidroemaranhada.

84 495 ΕΡ Ο 830 061/ΡΤ 9

De acordo com ο presente invento, as toalhitas podem ser distribuídas por uma variedade de meios, todos eles concebidos para conservar a integridade das toalhitas não utilizadas da sujidade e para impedir a secagem prematura das toalhitas. As toalhitas podem ser distribuídas por um distribuidor com descarga central através de um rolo, a partir de uma caixa com as toalhitas dispostas em camadas ou com as toalhitas dobradas umas nas outras e intercaladas umas entre as outras ou de um modo de saída sob pressão ("pop-up"). Um outro aspecto do invento proporciona a distribuição de toalhitas a partir de um saco de plástico reciclável, descartável e selado.

Para conveniência do utilizador, o distribuidor pode estar na forma de apetrecho para cinto ou montado de modo acessível próximo de cada posto de trabalho. Um distribuidor do tipo "saco descartável" será adequado para montagem em toda a área de utilização. Um aspecto do invento trata dos distribuidores reutilizáveis, um conceito que aborda o problema da eliminação de resíduos. 0 produto embalado pode, adequadamente, ter várias formas, incluindo um pacote pré-cheio com a toalhita e a formulação líquida, uma caixa contendo as toalhitas secas sendo o componente líquido adicionado imediatamente antes da distribuição, uma caixa reutilizável à qual as toalhitas e o líquido possam ser adicionados no momento adequado, ou um pacote contendo toalhitas secas impregnadas com reagentes aos quais poderão ser adicionados água ou componentes líquidos formulados, no momento adequado antes da utilização. Uma aplicação das toalhitas do presente invento proporciona um método de preparação de pré-ordenha das tetas das vacas, combinando as vantagens da lavagem do úbere (remoção do excesso de sujidade, estimulação mecânica do úbere para promover o "baixar" do leite); da pré-imersão com um germicida (higienização da pele da teta e da extremidade da teta, remoção do excesso de resíduos e secagem com uma toalha de papel); rapidez e economia de esforços num único passo. Á medida que as unidades de produção de leite se tornam maiores e a prática da ordenha de vacas três vezes por dia se torna mais prevalecente, cresce deste modo a importância de práticas que poupem tempo e de meios para o aumento da eficiência da ordenha. As toalhitas húmidas descartáveis do invento e o procedimento num passo, do presente invento abordam as preocupações principais relativamente à preparação de pré-ordenha delineada por National Mastitis Council (NMC) nas suas directrizes. O tratamento de acordo com o presente invento diminui o tempo e a mão de obra necessários para a preparação dos animais e aumenta a 84 495 ΕΡ Ο 830 061/ΡΤ 10

eficiência da ordenha. A prática da higiene de pré-ordenha promove a redução da contaminação bacteriana do leite que tem sido o foco de estudos desde há muitos anos e que continua a ser de primordial importância. O tratamento de pré-ordenha das tetas com as toalhitas do presente invento remove quaisquer detritos sólidos ou sujidade da superfície da teta em contacto com a unidade de ordenha, estimula a libertação de oxitocina por massagem do úbere, melhorando, assim, o "baixar" do leite, proporciona uma acção germicida para matar as bactérias que induzem a mastite na teta e deixa na teta um resíduo líquido mínimo, de secagem rápida, eliminando deste modo a necessidade de secagem da teta num passo em separado. A aplicação das toalhitas descartáveis do presente invento pode igualmente proporcionar benefícios de poupança de tempo e de mão de obra, quando utilizados para limpar e higienizar a pele durante o manuseamento de alimentos sem luvas (minimizando ao mesmo tempo o risco de contaminação dos alimentos com resíduos germicidas). A aplicação do presente invento proporcionará benefícios semelhantes quando utilizado para limpar e higienizar superfícies duras de contacto com alimentos ou outras superfícies inanimadas de contacto com alimentos. A aplicação das toalhitas descartáveis de acordo com o presente invento pode, igualmente, proporcionar benefícios de poupança de tempo e de mão-de-obra quando utilizadas para limpar a pele da cabeça, pescoço e face, ou qualquer superfície de pele que possa beneficiar da limpeza e higienização combinadas, com uma toalhita húmida, que deixa um resíduo húmido que seca rapidamente. A qualidade de limpeza da toalhita pode proporcionar ao utilizador um benefício de frescura ou de limpeza. De igual modo, as qualidades de limpeza e germicidas podem ser utilizadas antes e após pequenas cirurgias ou antes de outros procedimentos que possam ter como consequência a perda da integridade da pele, tal como a perfuração verificada durante a aplicação de uma agulha hipodérmica.

As toalhitas podem estar contidas num contentor de plástico HDPE fixo ou, alternativamente, num distribuidor montado num cinto que se prende em torno da cintura. As toalhitas podem estar na forma de rolo com distribuição central num tubo cilíndrico ou num contentor rectangular com as folhas intercaladas umas nas outras e embebidas na solução germicida de acordo com o presente invento. Um distribuidor com um mecanismo de puxagem central minimizará a probabilidade de todo o conjunto de toalhitas ficar sujo.

84 495 ΕΡ Ο 830 061 /ΡΤ 11 Ο emprego das toalhitas do presente invento tem um certo número de vantagens relativamente aos procedimentos correntemente empregues. De entre estas estão a transformação da limpeza e da higienização numa única operação, poupando tempo e esforço, sendo a mão do operador, simultaneamente, higienizada todas as vezes no ponto da aplicação.

Para o trabalhador da indústria de lacticínios os procedimentos correntes compreendem passos separados de remoção de sujidade, higienização com solução de imersão da teta e secagem com uma toalha de papel; agora um único produto pode realizar todos estes passos. Para além disso, uma toalhita de papel de para uma única utilização elimina a contaminação cruzada. 0 tratamento descrito, aborda eficazmente a prática recomendada por NMC no sentido de ser evitado o excesso de líquido da lavagem do úbere que escorre pela teta; poucos ou nenhuns resíduos líquidos permanecem nas tetas e chegam ao leite.

As toalhitas proporcionam libertação na quantidade óptima do agente germicida adequado e secagem óptima da área tratada. Adicionalmente a acção da limpeza remove fisicamente as bactérias (>90%) bem como detritos superficiais e, quando utilizado em vacas leiteiras, proporciona, adicionalmente, a estimulação simultânea para o baixar do leite pela acção de massagem. A quantidade de substância de higienização requerida é reduzida devida à eliminação da necessidade da descartagem frequente do produto do recipiente de imersão da teta, requerida para ultrapassar/impedir a contaminação cruzada pela solução germicida suja que fica na taça. 0 tratamento de acordo com o presente invento também pode ser utilizado beneficamente num regime de pós-ordenha. Este aspecto do tratamento proporciona remoção mecânica do leite residual no orifício "aberto" da teta e a concomitante redução da probabilidade de infecção, bem como o facto de uma teta "seca" protegida do risco de gretaduras e de "congelação" em tempo frio. A higienização pós-ordenha também proporciona uma medida adicional de prevenção de mastite.

84 495 ΕΡ Ο 830 061/ΡΤ 12 EXEMPLO 1

Para determinar se metionina poderia proteger a nisina da degradação, quando a nisina é exposta às toalhas de papel, foi preparada formulação de higienização à base de nisina (PDF), com metionina em concentrações de 0 a 100 mM. Foram incubadas secções frescas de toalha de papel nestas soluções e as amostras de PDF foram analisadas quanto ao teor em nisina em intervalos, ao longo de 6 dias. 0 teor em nisina foi determinado como a absorvância a 210 nm após separação por HPLC. Verificou-se que a metionina proporciona protecção contra a perda de nisina. Cromatogramas das amostra mostraram degradação da nisina em componentes múltiplos nas amostras de controlo sem metionina e protecção contra esta degradação em amostras contendo metionina. A formulação de pré-imersão A (PDF-A) era constituída pelo seguinte: 1 -propanol, 24 ml propilenoglicol, 6 ml Polisorbate a 10% 206 ml EDTA 100 mM 1,2 ml água, qb 60 ml pH ajustado a 3,5

Foram então feitas as seguintes soluções teste de PDF-A:

Met (200 mM) nisina (10 mg/ml) PDF H20 1. 0,0 ml 0,045 ml 8,96 ml 9,0 ml 2. 0,45 ml 0,045 ml 8,96 ml 8,55 ml 3. 0,9 ml 0,045 ml 8,96 ml 8,1 ml 4. 1,8 ml 0,045 ml 8,96 ml 7,2 ml 5. 4,5 ml 0,045 ml 8,96 ml 4,5 ml 6. 9,0 ml 0,045 ml 8,96 ml 0,0 ml A tubos de polipropileno de 50 ml foram adicionados pedaços de 100 cm2 (10 cm x 10 cm) de toalha de papel e alíquotas de 9 ml da solução de teste em questão. Os tubos foram, depois, agitados suavemente à temperatura 13 84 495 ΕΡ Ο 830 061 /ΡΤ ambiente e foram colhidas alíquotas de 400 μΙ a vários tempos para análise da nisina. Os resultados são apresentados nas Figuras 1 e 2.

Figura 1

Toalha de papel em PDF (iw 11-100)

Metionina O 0 mM □ 5 mM Δ 10 mM 0 20 mM + 50 mM x 100 mM Dias

Figura 2

Toalha de papel em PDF 6 dias

metionina, mM 84 495 ΕΡ Ο 830 061/ΡΤ 14

Os dados sugerem que a presença de metionina protege contra a perda de nisina por degradação. Estudos sobre a estabilidade da nisina exposta às toalhitas de papel também revelaram perda de nisina sem o correspondente surgimento de produtos de degradação. Esta perda sugeriu a existência de uma fonte adicional de instabilidade da nisina no produto toalhitas húmidas e que a metionina não protegia contra esta segunda forma de perda. EXEMPLO 2 A nisina numa formulação de toalhitas é estabilizada contra a degradação por metionina e contra a perda por adsorção por adição de sal.

Os resultados apresentados na Figura 3 indicam que a presença de cloreto de sódio reduz a perda de nisina por adsorção e que a metionina e o cloreto de sódio em conjunto estabilizam a nisina na formulação de toalhitas e permitem a recuperação de > 90% da nisina nas amostras após 6 dias à temperatura ambiente.

contrat Mst NaQ MeuNaCl

Figura 3. Recuperação de nisina a partir de Consept®, metionina ±10 mM e NaCI ± 100 mM após exposição a toalhas de papel durante 6 dias. EXEMPLO 3 A nisina numa formulação de toalhitas é estabilizada contra degradação por adição de metionina e contra a perda por adsorsão por adição de sal. Foram avaliados tipos de papel de várias origens que abarcam uma gama de

84 495 ΕΡ Ο 830 061/ΡΤ 15 composições, pesos, toque e resistência à tracção, quanto à sua adequabilidade com a formulação de toalhitas.

Foi preparada PDF (nisina 25 pg/ml) tal como resumido na Tabela I. Para cada condição na experiência, foi colocada uma secção de 100 cm2 de toalha num tubo cónico de polipropileno de 50 ml, foram adicionados 9 ml de solução de teste e os tubos foram colocados numa mesa de agitação à temperatura ambiente. Foram recolhidas amostras de líquido para análise (1 ml) após 3 dias (Tabela II).

Os dados apresentados na Tabela II confirmam que a nisina na formulação de toalhitas é estabilizada pela adição de sal e de metionina à formulação. Os dados ilustraram adicionalmente que isto permite a utilização de uma larga gama de papéis, mas que a celulose hidroemaranhada era a escolha de papel mais adequada.

TABELA I

Formulações de PDF A B C regular + Met + Met +NaCI 1 -propanol (%) 20 20 20 propilenoglicol (%) 10 10 10 Polisorbate 20 (%) 1 1 1 EDTA mM 1 1 1 metionina mM - 10 10 NaCI mM - - 100 nisina pg/ml 25 25 25 água Dl qb qb qb

84 495

ΕΡ Ο 830 061/PT 16

TABELA II

Avaliação de amostras de toalhas quanto à suavidade, resistência e concentração residual de nisina na fase líquida após 3 dias à temperatura ambiente peso g/yd2 (g/m2) suavidade* resistência** controlo + Met + Met + NaCI Nisina, ug/ml poliéster/ 57 4 4 0 4 28 celulose (68) algodão 3 1 7 12 23 100% Rayon/poli- 45 3 3 10 15 26 propileno (54) Rayon 45 4 3 9 17 25 acrílico (54) Rayon 100% 26 4 2 0 3 20 cardado (31) Rayon 100% 32 4 2 0 0 12 cardado (38) Rayon/celulose 26 3 2 1 3 26 estirados em (31) húmido papel crepe 23#/R 2 2 4 9 29 controlo 26 27 27 Rayon 70/30 30 4 3 6 10 19 (36) celulose 31 3 3 22 26 28 hidroemaranhada (37) * 1 = áspero 4 = macio ** 1 = rasga facilmente 4 = resiste ao rasgar EXEMPLO 4 A potência germicida de formulações de toalhitas foi avaliada contra suspensões bacterianas de E. coli da estirpe ATCC 8739 e de S. aureus da estirpe ATCC 6538. As composições da formulação eram idênticas às ilustradas na Tabela I, mas com 12% de 1-propanol e com 10% de propilenoglicol substituídos por 5% de glicerol. Adicionalmente, foram adicionadas às formulações uma gama de concentrações de álcool benzílico e/ou de citrato. Para além disto, as formulações de teste foram avaliadas quanto à potência

84 495 ΕΡ Ο 830 061/ΡΤ 17 germicida na presença de 50% em volume de leite completo para actuar como uma carga orgânica. As formulações foram pré-incubadas durante 2 horas na presença de leite e, seguidamente, foi avaliado o seu desempenho germicida após incubação de 1 minuto com suspensões de bactérias, a 37°C.

Os dados nas Tabelas III e IV ilustram que a adição de citrato melhora a potência germicida da formulação à base de nisina, particularmente na presença da carga orgânica proporcionada pelo leite. A combinação dos quelantes, citrato e EDTA na formulação foi surpreendentemente eficaz na superação de catiões bivalentes presentes no leite. De modo idêntico, o desempenho germicida das formulações foi adicionalmente melhorado pela incorporação de álcool benzílico.

TABELA III % alc. benzílico % citrato E. coli (cfu/ml)* - leite 50% 1,5 3,0 <5 <5 1,5 2,5 <5 <5 1,5 2,0 <5 <5 1,5 1,5 <5 <5 1,5 1,0 <5 <5 1,5 0,5 <5 <5 1,5 0,0 <5 <5 3,0 <5 5 2,5 <5 <5 2,0 <5 170 1,5 <5 <5 1,0 <5 10 0,5 <5 3,75x10® 0,0 <5 5,70x107 * Contagem de viáveis inicial: 3,7x109 cfu/ml

84 495 ΕΡ Ο 830 061 /ΡΤ 18

TABELA IV % alc. benzílico % citrato S. aureus (cfu/ml)* leite 50% 1,5 3,0 <5 20 1,5 2,5 <5 10 1,5 2,0 <5 70 1,5 1,5 <5 330 1,5 1,0 <5 6,45x103 1,5 0,5 <5 4,00X10® 1,5 0,0 <5 9,65x107 3,0 <5 1,30x10® 2,5 <5 6,15x10® 2,0 <5 5,04x10® 1,5 <5 2,68x107 1,0 <5 1,72x10® 0,5 <5 4,40x107 0,0 5 2,74x10® * Contagem de viáveis inicial: 2,35x10® cfu/ml. EXEMPLO 5

Foram formuladas toalhitas com PDF tal como na Tabela I, com a excepção de Arlasolve 200® substituir o Polisorbate 20, a concentração de nisina ser de 50 μοΛηΙ e o NaCI, quando presente, ser 300 mM e de o citrato ser 1 % quando presente. Foi utilizado papel de várias origens, nas várias formulações de toalhitas. A estabilidade da nisina foi monitorizada por HPLC depois de armazenamento das formulações das toalhitas à temperatura ambiente. Os resultados são apresentados nas Tabelas V e VI.

Os dados confirmam que são adequados vários papéis, incluindo celulose hidroemaranhada (HEC), quando as formulações contêm metionina para impedir a degradação da nisina, com NaCI ou com citrato para impedir perdas de nisina por adsorção.

84 495 ΕΡ Ο 830 061/ΡΤ 19

TABELA V

Ensaio # ΜΑ3-16 Produto de Papel NaCI + /- Met + /- Cone dia 1 entração dia 6 de Nisina dia 18 ig/ml dia 28 1 Chubbs + - 22,2 35,6 30,6 26,5 2 Chubbs - + 45,4 46,9 43,1 43,2 3 New Chubbs + + 49,2 49,0 47,1 42,1 4 New Chubbs + - 42,1 37,4 29,7 25,2 5 New Chubbs - + 52,5 53,6 50,6 44,9 6 New Chubbs - - 44,5 35,2 25,3 21,1 7 AMBI #546 + + 49,6 52,9 53,0 40,8 8 AMBI #546 + - 52,7 43,7 37,9 36,0 9 AMBI #546 - + 46,7 56,9 60,2 48,2 10 AMBI #546 - - 45,6 42,2 34,5 26,2 11 Papel HEC + + 50,6 53,4 56,6 46,8 12 Papel HEC -f. - 41,5 42,5 45,1 33,9 13 Papel HEC - J- 53,2 55,2 61,8 48,8 14 Papel HEC - - 44,2 40,4 38,0 29,2 15 Scott 1480 + + 49,6 56,1 61,4 51,0 16 Scott 1480 + - 43,8 44,4 43,5 33,1 17 Scott 1480 - + 53,1 56,9 60,5 49,3 18 Scott 1480 - - 43,5 38,0 27,4 22,8 19 Scott 1 29 4- + 49,4 52,1 55,9 31,7 20 Scott 1 29 -r - 46,0 44,9 45,2 35,5 21 Scott 1 29 - + 44,1 41,7 29,1 26,7 22 Scott 1 29 Solução Base - - 35,9 29,3 16,5 16,1 23 MA3-15-1 + + 52,1 49,3 48,7 39,0 24 MA3-15-2 + - 45,6 37,6 30,8 26,0 25 MA3-15-3 - + 55,1 52,3 48,6 39,6 26 MA3-15-4 - - 45,6 36,3 25,6 25,5

84 495 ΕΡ Ο 830 061/ΡΤ 20

TABELA VI

Ensaio # MA3-29 Produto de Papel Citrato + /- Metionina + /- Cone dia 0 entração de n dia 14 isina dia 28 1 New Chubbs + + 38,5 31,4 42,0 2 New Chubbs + - 21,0 17,8 23,6 3 New Chubbs - + 34,6 26,3 21,8 4 New Chubbs - - 13,5 28,0 27,3 5 AMBI #546 + + 42,1 39,2 48,2 6 AMBI #546 + - 24,0 20,8 30,2 7 AMBI #546 - + 34,9 7,4 7,6 8 AMBI #546 - - 13,5 3,8 6,3 9 Papel HEC* + + 40,0 38,2 46,9 10 Papel HEC T - 22,0 24,9 37,9 11 Papel HEC - + 33,3 17,8 15,9 12 Papel HEC - - 16,3 4,8 11,3 13 MA3-29-1 Base -i- + 40,8 37,1 41,9 14 MA3-29-2 Base 4- - 22,6 17,2 23,0 15 MA3-29-3 Base - + 39,6 33,5 39,9 16 MA3-29-4 Base - - 19,3 30,2 36,5 * Papel de celulose hidroemaranhada EXEMPLO 6

Este estudo foi realizado para determinar a quantidade de líquido suficiente para molhar uma toalhita para utilizar como um produto toalhita. Foram pesadas áreas medidas de cada amostra de papel, depois foram molhadas com PDF de modo a ficarem completamente humedecidas sem ficarem molhados e demasiadamente ensopados e foram pesados de novo para a determinação da quantidade de formulação requerida para este estado. Os resultados são apresentados na Tabela VII.

TABELA VII

Papel Área Total Peso do Papel Peso do Papel Molhado Líquido Adicionado ml líquido/ cm2 papel New Chubbs 344,0 cm2 1,92 g 8,20 g 6,4 ml 0,019 #546 310,6 cm2 1,17 g 3,60 g 2,3 ml 0,007 celulose hidroemaranhada #565 288,5 cm2 1,13 g 4,50g 3,3 ml 0,011

84 495 ΕΡ Ο 830 061/ΡΤ 21 EXEMPLO 7

Foram preparadas toalhitas formuladas tal como apresentado na Tabela I, mas com NaCI 300 mM e foram avaliados quanto ao desempenho germicida em pele de teta de vaca viva de acordo com o protocolo A seguinte.

Protocolo A

Foram preparadas e limpas dez vacas para o protocolo A. Isto envolveu a remoção do pêlo do lado inferior dos úberes e uma série de lavagens. As tetas das vacas foram lavadas com Theratec® (iodofor a 0,5%), foram enxaguadas cuidadosamente com água e depois esfregadas com mechas com álcool. Foram etiquetados conjuntos de taças de recolha que foram colocadas ao lado de cada vaca, quatro por vaca. Cada teta foi imersa até 1 5 mm numa suspensão de bactérias a aproximadamente 10a células/ml. Após 10 minutos, a teta foi mergulhada na solução de teste adequada até uma profundidade de 30 mm ou foi limpa com uma toalhita. A acção de limpeza consistiu em agarrar a teta na sua base, puxar para baixo, girando a mão a 90° e uma vez mais agarrar a teta pela sua base puxando para baixo. Após um minuto, as células sobreviventes foram colhidas utilizando uma seringa cheia com 10 ml de solução de extinção para neutralizar a acção da nisina e para recolher as bactérias da superfície da teta para a taça de recolha. As taças de recolha foram imediatamente tapadas e colocadas em gelo num frigorífico. Aproximadamente uma hora mais tarde, as 80 amostras foram diluídas e plaqueadas em duplicado em placas de ágar-sangue. As placas foram incubadas a 37°C durante 24-48 horas. As unidades formadoras de colónias (cfu) foram contadas e as reduções em cfu foram calculadas relativamente às cfu recuperadas das tetas de controlo. Em cada vaca, todas as quatro tetas foram testadas e foi testado um total de 20 vacas. As duas tetas traseiras foram as tetas de controlo, ou seja foram mergulhadas em água. As duas tetas dianteiras foram testadas com um dos produtos germicidas.

Os resultados, expressos como redução logarítmica em cfu, para S. aureus. são apresentados na Tabela VIII. O valor da redução logarítmica por vaca foi calculado por subtracção das cfu logarítmicas médias das duas tetas teste (dianteiras) das cfu logarítmicas médias duas tetas de controlo (traseiras). 22

22 r/A 84 495 ΕΡ Ο 830 061/ΡΤ

Para as cinco vacas a Redução Logarítmica Média Total em cada condição de teste está também apresentada na Tabela VIII.

As toalhitas de PDF tiveram um desempenho comparável ao da solução de imersão de PDF. A acção de lavagem somente com uma toalhita com água, originou uma redução logarítmica de 1,7.

TABELA VIII VACA Theratec® (iodofor a 5%) VACA PDF (nisina 25ug/ml) VACA Toalhitas de PDF VACA Toalhitas com água #1 0,5 #6 3,3 #11 3,6 #16 1,7 #2 0,7 #7 3,2 #12 2,7 #17 1,9 #3 0,4 #8 2,7 #13 1,9 #18 1,8 #4 0,5 #9 4,2 #14 2,4 #19 1,6 #5 0,8 #10 1,6 #15 2,2 #20 1,4 Red. Log. Méd. Total 0,6 Red. Log. Méd. Total 3,0 Red. Log. Méd. Total 2,6 Red. Log. Méd. Total 1,7 EXEMPLO 8

Foi preparada formulação de toalhitas (PDF) como descrito na Tabela I, com a excepção de ter sido usado Arlasolve® 200 a 1 % em vez de Polisorbate 20 e de ter sido utilizado citrato a 1 % em vez de NaCI e a nisina estar presente a 50 μς/ιτιΙ. Quando presente, o 1-propanol era a 20%. As formulações de teste #1 com, e #2, sem 1-propanol, foram avaliadas quanto ao desempenho germicida relativamente a S. aureus em pele de teta de vaca viva de acordo com o protocolo A (anterior) e foram comparadas com o desempenho de Theratec® (iodofor a 0,5%) e com o da solução de imersão da teta de PDF.

Os resultados são apresentados na Tabela IX e evidenciam que ambas formulações de toalhitas tinham um desempenho comparável contra S. aureus e que eram equivalentes em termos de desempenho ao iodofor a 0,5%

84 495 ΕΡ Ο 830 061/ΡΤ 23

TABELA IX VACA Toalhitas #1 nisina 50 .ug/ml VACA Toalhitas #2 nisina 50 μς/πηΙ VACA Theratec ® Iodofor a 0,5% VACA PDF nisina 25 Lig/ml #1 1,9 #6 2,4 #11 2,4 #16 4,3 #2 3,4 #7 2,4 #12 3,1 #17 2,3 #3 3,4 #8 3,9 #13 1,7 #18 2,5 #4 2,3 #9 2,6 #14 2,2 #19 4,7 #5 2,9 #10 3,1 #15 2,7 #20 4,7 Red. Log. Méd. Total 2,8 Red. Log. Méd. Total 2,9 Red. Log. Méd. Total 2,4 Red. Log. Méd. Total 3,7 EXEMPLO 9

Foram preparadas formulações de toalhitas (PDF) tal como descrito no exemplo 8 e foram utilizadas para a preparação de toalhitas de papel húmidas, com um teor de líquido de 3 g, 5 g e 7 g por toalhita. Cada toalhita media 6x6,75 polegadas (15,2x17,1 cm). Estas toalhitas foram avaliadas quanto à actividade germicida contra E. coli em pele de teta de vaca viva, de acordo com o protocolo A (anterior) e foram comparados com o desempenho de Theratec® (iodofor a ,5%).

Os resultados são apresentados na Tabela X e evidenciam que 7 g de líquido/toalhita proporcionam actividade germicida superior à das toalhitas com carga de líquido mais baixa.

TABELA X data formulação alvo redução log. do tratamento controlo positivo 2/2/95 toalhitas de PDF, 3g/toalhita E. coli 2,2 3,2 toalhitas de PDF, 5g/toalhita 3,4 toalhitas de PDF, 7g/toalhita 3,7 24 84 495 ΕΡ Ο 830 061/ΡΤ EXEMPLO 10

Foram preparadas formulações de toalhitas (PDF) tal como descrito no Exemplo 8 e foram utilizadas para a preparação de toalhitas de papel húmidas. Estas toalhitas foram avaliadas quanto à actividade germicida contra uma gama de organismos em pele de teta de vaca viva, de acordo com o protocolo A (anterior) e comparados com o desempenho de várias soluções de imersão de tetas como controlos positivos.

Os resultados são apresentados na Tabela XI e evidenciam que toalhitas formuladas com PDF têm actividade germicida eficaz nas tetas das vacas contra os organismos patogénicos mais importantes envolvidos nas infecções de mastite.

TABELA XI tetas de vaca alvo redução log. do controlo (n = ) tratamento positivo 10 S. aureus 2,5 0,2* 10 S. agalactiae 4,3 * o 10 S. uberis 3,0 3,3* 10 Klebsiella 2,6 3,2* 10 E. coli 2,3 10 S. aureus 3,4 10 S. uberis 2,8 2,5$ 10 K. pneumoniae 3,1 4,1$ 10 S. aureus 3,4 3,0$ 10 E. coli 2,0 4,0$ * Consept® Solução de Pré + Pós imersão $ Teat Guard®, Solução de Imersão de tetas, de iodofor a 1 % EXEMPLO 11

Toalhitas formuladas, preparadas como apresentado na Tabela I mas com 1-propanol a 12%, EDTA 3 mM e citrato 5 mM, foram utilizados num ensaio de Desafio Experimental seguindo o protocolo padrão de NMC. Foi utilizada uma manada de 160 vacas leiteiras em Cornell University Veterinary College para testar a eficácia das toalhitas de PDF no terreno. As quatro condições de 25 84 495 ΕΡ Ο 830 061/ΡΤ tratamento estão sumarizadas na Tabela XII, existiam 40 vacas em cada grupo de tratamento. Para criar condições infecciosas extremas, promovendo a probabilidade de infecções de mastite, cada teta das vacas foi mergulhada numa suspensão de S. aureus e S. aaalactiae (108 cfu/ml para cada organismo) de segunda-feira a sexta-feira, imediatamente a seguir à ordenha da tarde. O desafio bacteriano foi seguido imediatamente pela higienização pós-ordenha adequada para aquele grupo.

Os dados apresentados na Tabela XII mostram que as toalhitas de PDF utilizadas como um tratamento pós-ordenha, ou como um tratamento pré-ordenha em combinação com pós-imersão em solução de imersão de teta Consept®, reduz a incidência de infecções de mastite comparável com o efeito da solução de imersão de teta Theratec ® (iodofor a 5%).

TABELA XII grupo tratamento pré-ordenha tratamento pós-ordenha infecções de mastite às 2 semanas A Controlo Negativo lavagem com toalha de papel embebida em água - secagem com toalha de papel separada nenhum 13 B Controlo positivo lavagem com toalha de papel embebida em água - imersão em Theratec© iodofor a 5% - secagem com toalha de papel separada imersão em Theratec iodofor a 5% 5 C limpeza e higienização com toalhitas de PDF imersão em Consept®, solução de imersão de teta à base de nisina 6 D lavagem com toalha de papel embebida em água - secagem com toalha de papel separada Higienização com toalhita de PDF 7

Lisboa, ία JÍ!L 200Θ

Por AMBI Inc. O AGENTE OFICIAL -

ANTÓNIO JOAO CUNHA FERREIRA Ag. 0[. Pr. Ind.

R«o dos Flores, 74 - 4.· 1ΒΘΟ LISBOA

Claims (17)

1. 84 495 ΕΡ Ο 830 061/PT 1/3 REIVINDICAÇÕES 1 - Toalhita de papel ou tecido, húmida, contendo uma formulação líquida compreendendo, como componentes separados, uma bacteríocina, um agente quelante, um estabilizante para a protecção da bacteríocina contra a degradação, um tensioactivo, um sal e um agente de secagem de álcool.
2. 2 - Toalhita de acordo com a reivindicação 1, em que a bacteríocina é uma lantocina
3. 3 - Toalhita de acordo com a reivindicação 2, em que a lantocina é nisina.
4. 4 - Toalhita de acordo com a reivindicação 2 ou 3, em que o agente quelante é um ou mais de um tetra-acetato de alquilenodiamina, Ν,Ν,Ν',Ν'-tetra-acetato de etilenoglicol-bis-(p-aminoetil)éter (EGTA) ou citrato.
5. 5 - Toalhita de acordo com a reivindicação 2, 3 ou 4, em que o sal é cloreto de sódio.
6. 6 - Toalhita de acordo com reivindicação 4, em que o estabilizante é um tioéter e o tensioactivo é não iónico ou catiónico, ou é um monoglicérido ou um ácido gordo.
7. 7 - Toalhita de acordo com a reivindicação 6, em que o agente quelante é EDTA ou é EDTA e citrato em combinação, o estabilizante é metionina, o tensioactivo é Polisorbate 20 e o agente de secagem é 1-propanol.
8. 8 - Toalhita de acordo com a reivindicação 7, ao qual se aplica uma ou mais das condições seguintes: (a) a concentração de nisina é de 25 a 500 microgramas/ml e a concentração de cloreto de sódio é 10 a 300 mM; (b) o agente quelante é EDTA numa concentração de 0,1 a 10 mM; (c) o agente quelante é EDTA numa concentração de 0,1 a 10 mM, em combinação com citrato numa concentração de 1 a 30 mM; (d) a concentração de metionina é 1 a 10 mM; (e) a concentração de Polisorbate 20 é 0,1 a 3%; e

   84 495 ΕΡ Ο 830 061/ΡΤ 2/3 (f) a concentração de propanol é 10 a 20%.
9. 9 - Toalhita de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a formulação compreende adicionalmente um condicionante e um espessante.
10. 10 - Toalhita de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a formulação compreende adicionalmente clorhexidina.
11. 11 - Toalhita de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que é de um material de papel não tecido.
12. 12 - Toalhita de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, para utilização antes ou depois da ordenha na desinfecção e secagem de uma teta de uma vaca ou para utilização na limpeza de uma teta de uma vaca depois da ordenha para a redução da incidência de mastite.
13. 13-Toalhita de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, para utilizar na desinfecção e secagem ou na limpeza da pele humana.
14. 14 - Utilização de uma toalhita de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, para a desinfecção e secagem de uma superfície inanimada em contacto com alimentos. 5 - Utilização de uma bacteriocina, especialmente de uma lantocina e muito especialmente de nisina, na formulação de uma toalhita de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11.
15. 16- Utilização de acordo com a reivindicação 15, em que a toalhita é destinada a um fim especificado na reivindicação 1 2 ou 13.
16. 17 - Distribuidor contendo toalhitas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 1 3, concebido para preservar a integridade das toalhitas não usadas da sujidade e para impedir a secagem prematura das toalhitas.
17. 18 - Utilização de nisina no fabrico de um produto para imersão de tetas para utilização pós-ordenha, em vacas que antes da ordenha foram tratadas por 84 495 ΕΡ Ο 830 061/ΡΤ 3/3 limpeza das suas tetas com uma toalhita de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 1 2. Lisboa, jo ' iU. ui»'L Por AMBI Inc. 0 AGENTE OFICIAL -

    ANTÓNIO JOÃO I CUNHA FERREI RA Ag. O/. Pr. Ind. Rmb das Flores, 74 - 4,·