PT80452B

PT80452B - Processo de preparacao de sais estaveis da sulfo-adenosil-l-metionina (same) especialmente adequados para uso parenterico

Info

Publication number: PT80452B
Application number: PT80452A
Authority: PT
Original assignee: Bioresearch Spa
Priority date: 1984-05-16
Filing date: 1985-05-13
Publication date: 1987-08-19
Also published as: AU4251985A; IE58693B1; IE851187L; ES543199A0; PT80452A; US5102791A; DK167283B1; NO163743B; ZA853295B; DK215585D0; MX9203625A; ATE41157T1; FI851952L; FI851952A0; IT8420938A0; DK215585A; MX7661E; JPS60256394A; DE3568581D1; IN162199B

Description

DESCRIÇÃO DO INVENTO

Este

sais estáveis

invento descreve o processo de preparação de da sulfo-adenosil-L-metionina (SAMe).

o invento descreve o processo da reacção entre SAMe e ácifarmacêuticas que os contêm

Mais especificamente, de preparação de sais derivados dos dissulfónicos e composiçães como princípio activo.

Os sais citados são particularmente aconselháveis p_a ra uso parenteral.

SAMe é o principal dador biológico de grupos metilo e, devido a esta caracteristica, ê de considerável interesse tanto sob o ponto de vista biológico como pelo das suas aplicaçães terapêuticas.

Este produto apresenta contudo problemas quanto à sua aplicação em larga escala, estando estes problemas ligados à sua instabilidade térmica, mesmo à temperatura ambiente, e à complexidade da sua preparação e purificação.

SAMe tem portanto sido alvo de numerosas patentes d_i rigidas tanto à obtenção de novos sais estáveis como a proces. sos de preparação que possam ser aplicados à escala industrial.

0 actual requerente está ligado a várias patentes relativas a novos sais estáveis e a métodos de preparação da sul. fo-adenosil-L-metionina (patentes italianas 1 043 885,

1 022 016, 1 022 036 e 1 054 175} pedidos de patentes italianas 23603A/81 e 22622A/83).

Os sais descobertos pelo requerente, cobertos pelas patentes acima mencionadas, são todos muito estáveis e adequados ao uso farmacêutico. Têm contudo o inconveniente de uma acidez muito elevada (elevado número de equivalentes de ácidos fortes por equivalente de SAMe), devido ao que as formas liofilizadas injectáveis, contendo o princípio activo, têm de ser acompanhadas por um solvente tampão adequado que ajuste o pH da solução final aos limites fisiológicos.

63 782

RK.15/mb

-3-

fc

A elevada concentração salina do tampão impede portanto o uso de doses elevadas de produto.

A vantagem principal dos novos sais, preparados pelo presente invento, é a de conterem apenas 3 equivalentes ácidos por equivalente de SAMe e requererem portanto uma quantidade considerávelmente menor de tampão para a sua neutralização.

São portanto particularmente adequados para uso parentárico de altas dosagens de SAMe, o que era necessário para trai tamento clínico de certas afecçães.

Além disso, os sais SAMe de acordo com o presente invento são estáveis indefinidamente ao longo do tempo, a uma tejn peratura atê 452C e são solúveis em água atê à concentração de pelo menos 30% em peso e são insolúveis nos solventes orgânicos comuns.

Finalmente os referidos sais podem ser facilmente preparados de modo económico em escala industrial por um processo de elevado rendimento.

Os sais da sulfo-adenosil-L-metionina (SAMe), preparados pelo presente invento, são caracterizados pela fórmula geral :

SAMe.n(CH₂)_m(S0₃H)₂ (i)

onde n pode variar de 1 a 2 e m pode variar de 3 a 12.

0 processo para produzir os referidos sais, de acordo com o presente invento, ê caracterizado pelas seguintes operações: a) enriquecimento da levedura inicial com SAMe; b) lise

das células e recolha de uma solução rica em SAMe (lisado de cé, lulas); c) pre-purificação do lisado de células, por ultrafiltração; d) passagem do lisado prepurifiçado, através de uma cçj luna de resina permutadora de iões de ácido fraco e eluição com o requerido ácido sulfónico; e) passagem do eluado da referida coluna por uma outra coluna de resina de absorção e lavagem com o requerido ácido sulfónico; f) concentração do eluado da últi ma coluna por meio de osmose inversa; g) secagem da solução

63 782

RK.15/mb

-4concentrada.

Estas e outras características e vantagens dos sais SAMe preparados pelo presente invento ressaltarão à vista ao longo da descrição detalhada seguinte que descreve o processa de produção.

As etapas do processo para produzir sais SAMe de acordo com o presente invento são conduzidas do seguinte modo:

a) a levedura inicial ê enriquecida com SAMe juntando metionina a culturas de Saccharomyces cerevisiae, Torulopsis utilis, Candida utilis, etc., como foi descrito por Schlenk 27"^^nzy^mol°9i^a> 29, 238 (l965)_7;

b) lise de células seguida da recolha da solução aquosa rica em SAMe (lisado de células): a lise realiza-se tratando primeiro a levedura enriquecida, com uma mistura de água e acetato de etilo numa proporção em volume entre 3:1 e 0,5:1, de preferência entre 1,2:1 e 0,8:1; a quantidade usada de água-acetato de etilo está de preferência entre l/20 e l/2, melhor ainda entre l/4 e l/5 do peso das células molhadas, e o tratamento vai de 15 a 45 minutos, de preferência 30 minutos, □untou-se então ácido sulfúrico entre 0,1 N e 0,5 N, de preferência 0,35 N, numa quantidade entre 1:1 e 0,2:1, de preferência entre 0,5:1 e 0,6:1, em relação ao peso das células molhadas. 0 tratamento vai de uma a 2 horas, de preferência 1,5 ho ras à temperatura ambiente. A lise das células realizada desta maneira faz que pràticamente 100% da SAMe presente passe p.a ra a solução. Note-se que a lise das células de levedura com uma mistura de solvente orgânico e ácido sulfúrico diluído é consideravelmente melhor do que com ácido perclórico à tempera tura ambiente ou com ácido fórmico ou acético a 60SC e semelhari tes, pois que não somente a lise tem lugar à temperatura te o que favorece a estabilidade da SAMe, como também é conduz da em condições tais que a solução pode ser facilmente separada, por filtração, dos resíduos das células e não contém nenhuma das impurezas que estão presentes quando se usam outros meios de lise e que são difíceis de remover pelos processos conhecidos

iw· !□

63 782

RK.15/mb

-5-

de preparação de SAMe pura;

c) prepurificação, por ultrafiltração, do lisado de

células: o lisado de células da etapa b) é submetido a um pro

cesso de ultrafiltração usando membranas com um poder nominal de corte de 10 000, o que permite que os resíduos de proteínas e os resíduos de polissacáridos de elevado peso molecular sejam removidos do lisado pois que doutro modo se fixariam às re sinas permutadoras de iões na etapa seguinte reduzindo progrejs sivamente a sua actividade. 0 processo de ultrafiltração pode realizar-se quer com membranas planas ou, de preferência, com membranas tubulares. Note-se que a ultrafiltração permite que as colunas de resina da etapa seguinte sejam alimentadas com lisado consideravelmente mais puro e, em especial, livre de substâncias de elevado peso molecular que se fixam irreversivelmente às resinas e progressivamente as envenenam, reduzindo a sua actividade e assim a sua capacidade depuradora. Este pretratamento aumenta portanto consideravelmente o tempo médio de vida das resinas das colunas que de outro modo teriam de ser frequentemente substituídas devido ao seu envenenamento, re duzindo assim os custos de produção;

d) passagem do lisado prepurificado por uma resina permutadora de iões fracamente ácida: o filtrado resultante da etapa c) passa por uma coluna fracamente ácida (COOH) em forma H , a um pH entre 3,5 e 7, de preferência a pH 5, com um caudal entre 1 e 3 volumes hora de líquido por volume de resina, de preferência a um caudal de 2 volumes hora de líquido por volume de resina. A quantidade de resina utilizada está na re gião dos 10-50, de preferência 30, litros por kg de SAMe. Depois de o lisado passar pela coluna, esta ê lavada com água destilada e depois com ácido acético 0,1 M até o pH ser inferi, or a 3 e depois com água destilada e, finalmente, a SAMe é eluída com uma solução 0,2 N do ácido dissulfónico requerido.

0 eluado contendo a SAMe contém também pequenas quantidades de

impurezae coradas, e de cerca de 3/o a 10/o de 5'-deoxi-5'-metil

tioadenosina (o produto de degradação principal da SAMe). Estas impurezas são removidas usando resinas de absorção (etapa e);

63 782

RK.15/mb

-6Ι’

e) passagem do eluado da coluna precedente por uma coluna de absorção e lavagem com o ácido sulfónico requerido: inesperadamente verificou-se que polímeros de absorção do tipo Amberlite XAD2, Amberlite XAD4 ou Amberlite XAD7, quando em s.o lução fortemente ácida, como o eluado da coluna precedente (etapa d), não retém praticamente nenhuma SAMe enquanto são ca pazes de absorver facilmente impurezas coradas, adenina e 5'-deoxi-5'-metiltioadenosina. A etapa e) realiza-se fazendo passar o eluado da etapa d) por uma coluna das acima referidas resinas, de preferência Amberlite XAD4, a um caudal entre 0,2 e 1 volume hora de líquido feBxxxrfKxicirçfifxstB por volume de resina, de preferência 0,5 volumes hora de líquido por volume de resina. A quantidade de resina usada encontra-se na região dos 10-50, de preferência 30 litros/kg de SAMe. A solução SAMe passa pela coluna que é então lavada com uma solução 20 mN do ácido dissulfónico requerido atê que a SAMe desapareça do.eluado. 0 eluado, contendo cerca de 10 g/l de SAMe muito puro, segue para a concentração subsequente da etapa f). Note-se que as impurezas coradas eram removidas, na arte anteri. or, pelo uso de carvães activados os quais se por um lado são eficientes na remoção deste tipo de impurezas por outro absoj? vem irreversivelmente uma quantidade considerável de SAMe (cejr ca de 15$ do peso do carvão utilizado), levando assim a uma considerável redução do rendimento. A vantagem das resinas

de absorção consiste no facto de possuirem o mesmo grau de purificação mas com rendimento consideravelmente mais elevado do que quando se usa carvão activado.

f) concentração do eluado da etapa e) por meio de o_s mose inversa: a etapa f) realiza-se sujeitando o eluado da etapa e) a um processo de osmose inversa usando membranas de dessalinização de elevada rejeição de NaCl que sejam capazes de reterem praticamente toda a SAMe, deixando passar a água e parte do ácido dissulfónico. Usam-se de preferência membranas de poliamida pela sua elevada resistência em soluçães fortemente ácidas. A concentração por osmose inversa permite concentrar o eluado da etapa e) de 10 g/l até 100-150 g/l, de prefe63 782

RK.15/mb

-7rência atê 120 g/l. A solução de SAMe concentrada por osmose inversa foi analisada para determinar as concentrações de SAMe e de ácido dissulfónico. Adiciona-se uma quantidade adequada de ácido dissulfónico a fim de obter a necessária composição estequiométrica (de preferência 3 equivalentes ácidos por equi. valente de SAMe). Esta solução segue para a etapa g) de secagem que usa um secador por aspersão ("spray dryer") para se obter o produto final?

g) secagem da solução concentrada: nesta fase o produto é atomizado numa câmara de secagem alimentada por ar que_n te. A concentração da solução de entrada (expressa em SAMe) está entre 100 e 200 g/l e de preferência 120 g/l. A temperatura do ar de secagem previamente desumidificado está entre 1409 e 2009C, de preferência 160SC. A temperatura do ar à saí, da está de preferência entre 409 e 1009C, de preferência 609C. Nestas condições o produto à salda tem uma temperatura entre 409 e 6090 e ê arrefecido atê temperatura ambiente por meio de ar desumidificado. De preferência a instalação opera com um dispositivo adequado ã extracção contínua do produto seco. No te-se que o uso do secador por aspersão, tal como a liofilização, resulta numa considerável redução dos custos e é mais facilmente posta em prática numa escala de grande produção.

Os ácidos dissulfónicos que salificam a SAMe e são usados para eluição da coluna que contém a resina permutadora de iões fracamente ácida, etapa d), podem ser obtidos no comér cio ou facilmente preparados sob a forma de sais dissódicos dos dibrometos correspondentes por reacção com sulfito de sódio de acordo com a equação:

(CH₂)_m(Br)₂ + 2Na₂S0₃ -> (CH₂)_m(S0₃Na)₂ + 2NaBr

onde m pode variar de 3 a 13.

A reacção ê conduzida sob refluxo numa mistura água-álcool, contendo de preferência 7,5 partes de água, 2 partes

de 95% de etanol e 0,5 partes de n-butanol, de preferência durante 3 dias.

63 782

RK.15/mb

-8-

Suspende-se 1 mole do dibrometo de alquilo, como atrás se definiu, em 1 litro de mistura água-álcool, como atrás se definiu, juntaram-se 2,2 moles de sulfito de sódio anidro e aqueceu-se a mistura sob refluxo durante 3 dias.

No final da reacção, removeram-se os álcoois por destilação, concentrou-se a solução aquosa até um volume entre 0,5 e 1 litro e deixou-se cristalizar, em ambiente frio (43C) o sal dissódico do ácido sulfónico.

Recristalizou-se em igual volume de água, separou-se por filtração e secou-se sob vácuo, 0 rendimento médio em sal dissódico é de 90 mol ;^:ò.

0 sal dissódico é redissolvido em água em quantidade tal que se obtenha uma solução 0,3 N e a solução obtida vai alimentar uma coluna de resina permutadora de iões fortemente ácida (Amberlite IR 120 ou do tipo Domex 50) em forma H⁺, que tenha sido cuidadosamente activada e lavada, A resina retém o sódio e, na saída da coluna, obtém-se uma solução do ácido dis sulfénico.

Lavou-se a coluna com água destilada até pH 4, titulou-se o eluado e diluiu-se atê se obter uma solução 0,2 N do ácido dissulfónico.

Esta solução foi usada nas etapas d) e e) da produção de SAMe.

Dão-se a seguir exemplos para ilustrar sem limitar o processo de preparação de sais estáveis de SAMe dos ácidos dissulfónicos, do presente invento, e de composições farmacêuticas dos referidos sais.

EXEMPLO 1

Preparação de soluções 0,2 N de ácidos dissulfónicos de fórmula

geral (^CH2)_m(^S03^H)2

Ountaram-se 75 litros de água destilada, 20 litros de

etanol a 95$ e 5 litros de n-butanol, a 21,6 kg (100 moles) de

1,4-dibromobutano. Ountaram-se 26,46 kg (210 moles) de sulfito

63 782

RK.15/mb

-9de sõdio anidro e aqueceu-se a mistura sob refluxo durante 3 dias.

No fim da reacção juntaram-se 20 litros de água desti lada e destilou-se a mistura até se removerem completamente os álcoois.

Diluiu-se com água a mistura até um volume final de 60 litros e aqueceu-se até completa dissolução.

0 sal dissódico do ácido 1,4-butanodissulfónico foi deixado a cristalizar, durante a noite, a 4SC.

Separou-se o produto por filtração e lavou-se com 10 litros de água.

0 licor mãe foi concentrado sob vácuo até um volume de 20 litros e deixou-se cristalizar durante a noite a 42C.

Separou-se o produto por filtração e lavou-se com 4 litros de água.

A massa cristalina das duas filtrações foi ressuspensa em 50 litros de água e dissolvida a quente.

Deixou-se a solução cristalizar durante a noite a 4SC

Separou-se o produto por filtração e lavou-se com 5 litros de água. Secou-se sob vácuo o sal sódico do ácido butanodissulfónico.

Obteve-se uma outra fracção do produto concentrando o licor mãe de 10 litros e deixando-o cristalizar durante a noite a 42C, separando o produto por filtração e secando-o sob vácuo.

Deste modo obtiveram-se 25,2 kg do sal dissódico do ácido 1,4-butanodissulfónico monohidratado (90 moles, 90# de rendimento molar).

0 produto foi identificado por análise elementar e

corresponde à fórmula C^HgO^SgNag.HgO:

63 782

RK.15/mb

-10-

	vf r* /ob	$H	$S
Calculado	17,1	3,6	22,9
Obtido	17,1	3,7	22,9

Preparou-se uma coluna contendo 200 litros de Amberlite IR 120 previamente activada com HCl 6N atê desaparecer o ião Na⁺ do eluado, e lavou-se com água destilada atê o ião Cl desaparecer do eluado.

Dissolveram-se 25,2 kg do sal dissódico monohidratado do ácido 1,4-butanodissulfónico em 300 litros de água, para ali. mentar a cabeça da coluna. 0 eluado contendo o ácido 1,4-buta nodissulfónico foi recolhido e lavou-se a coluna com água até o pH do eluado atingir 4.

Diluiu-se até um volume final de 900 litros para obter uma solução 0,2 N do ácido 1,4-butanodissulfónico que foi usado como tal para a preparação do sal de SAMe correspondente.

Operando de modo análogo mas usando 20,2 kg de 1,3-di. bromopropano como material de partida, obtiveram-se 900 litros de uma solução 0,2 N do ácido 1,3-propanodissulfónico.

Usando 23 kg de 1,5-dibromopentano, obtiveram-se 900 litros de uma solução 0,2 N do ácido 1,5-pentanodissulfónico.

Usando 24,4kg de 1,5-dibromohexano, obtiveram-se 900 1 de uma solução 0,2 l\l do ácido 1,6-hexanodissulfónico.

Usando 27,2 kg de 1,8-dibromooctano, obtiveram-se 900 1 de uma solução 0,2 N do ácido 1,8-octanodissulfónico.

Finalmente, usando 30 kg de 1,10-dibromodecano, obtiveram-se 900 litros de uma solução 0,2 N do ácido 1,10-decanodissulfónico.

EXEMPLO 2

Preparação do sal SAMe,1,5 (1,4-butanodissulfonato)

Ountaram-se 220 litros de acetato de etilo e 220 litros de água, à temperatura ambiente, a 1800 kg de levedura eri

riquecida com SAMe (6,88 g/kg) de acordo com Schlenk /“Enzymo63 782

RK.15/mb

-11logia 29, 283 (1965)/7.

Depois de 30 minutos de agitação enérgica, juntaram-se 1 000 litros de ácido sulfúrico 0,35 N e continuou-se a agitar por mais 1 l/2 hora.

Filtrou-se a mistura por um filtro rotativo que foi lavado com água obtendo-se 2 800 litros de solução contendo 4,40 g/l de SAMe, igual a 99,5% da presente no material de pa.r tida.

A solução de SAMe assim obtida (pH 2,5) foi alimentar uma instalação de ultrafiltração com membranas tubulares com 10 000 de poder de corte.

0 produto filtrado pelas membranas é recolhido num ua so adequado onde o concentrado ê continuamente reciclado até um volume final de 200 litros. Nesta altura juntou-se água destilada e a reciclagem continuou até se completar a extracção de SAMe. Obtiveram-se 3 500 litros de lisado ultrafiltrado cu jo pH foi ajustado atê 5 juntando NaOH 2 N.

Preparou-se uma coluna contendo 400 litros da resina Amberlite CG 50 em forma H⁺, que foi cuidadosamente lavada com água destilada.

Passou-se o lisado pela coluna de resina a um caudal de 800 l/h mantido constante durante todo o processo.

Passou-se depois em sucessão 400 litros de água desti lada, 3 200 litros de ácido acético 0,1 M e 400 litros de água destilada,

A SAMe foi eluída com 800 litros de ácido 1,4-butanodissulfénico 0,2 N. Os 800 litros de eluado obtidos deste modo continham aproximadamente 10 kg de SAMe.

Preparou-se uma coluna contendo 400 litros de resina Amberlite XAD4 previamente activada com 800 litros de 0,1 N NaOH e 800 litros de 0,1 N H^O^, e depois lavou-se cuidadosamente com água destilada.

A solução de SAMe anteriormente obtida é passada pela

63 782

RK.15/mb

-12coluna a um caudal de 200 l/h, caudal mantido constante durante todo o processo.

Passaram-se então 400 litros de ácido 1,4-butanodissul fónico 20 mN pela coluna.

Recolheu-se o eluado contendo a SAMe (cerca de 1 000 litros contendo 10 kg de SAMe).

A solução obtida deste modo vai alimentar uma instalação de osmose inversa de tipo plano usando membranas de dessalinização, de poliamida.

Nesta instalação concentrou-se a solução de SAMe até 80 litros contendo 9,9 kg de SAMe.

Juntaram-se 5 litros de uma solução 2 N de ácido buta nodissulfónico.

A solução obtida deste modo vai alimentar uma instala, ção de secagem por aspersão com ar quente a 16QSC.

0 produto seco é extraído continuamente da instalação.

Obtiveram-se 18 kg de produto em pó com a seguinte composição:

SAMe 54,9%

ácido 1,4-butanodissul

fónico 44,9%

H₂0 0,2%

correspondente ao sal SAMe.1,5 (l,4-butanodissulfonato)*

0 produto encontrava-se sob a forma de pó branco cristalino, solúvel em água até 30% em peso com a formação de uma solução incolor, e insolúvel nos solventes orgânicos vulqa res.

Verificou-se por cromatografia em camada fina, de acor

do com Anal. 3iochem. 4, 16-28 (1971), que o produto estava l_i

vre de quaisquer impurezas.

Análise elementar:

63 782

RK.15/mb

-13-
^C15^H22^N6°5^S	.i,5 C₄H_iQ0₆S₂ %!\l	%C	%H
Calculado	11,6	34,7	5,1
Obtido	11,5	34,8	5,1
0	espectro ultravioleta do	produto mostrou	uma
ção máxima	(em tampão de pH 4) a 258	,5 nm, com E^ =	193

EXEMPLO 3

Preparação do sal SAMe.1,5 (l,3-propanodissulfonato)

Seguiu-se o processo do Exemplo 2 mas usou-se o ácido 1,3-propanodissulfónico em vez do ácido 1,4-butanodissulfó nico.

Obtiveram-se 17,45 kg de pá que, por análise, revelou a seguinte composição:

SAMe 56,5%

ácido 1,3-propanodissulfónico 43,3%

H₂0 0,2%

correspondente ao sal SAMe.1,5 (l,3-propanodissulfonato)·

0 produto encontrava-se sob a forma de pó branco cris talino, solúvel em água atê 30% em peso com formação de uma sjo lução incolor, e insolúvel nos solventes orgânicos comuns.

Por cromatografia em camada fina, de acordo com Anal. Biochem. 4, 16-28 (l97l), verificou-se que o produto estava livre de quaisquer impurezas.

Análise elementar:

^C15^H22^N6^Q5^S’¹’^{5 C}3^H8°6^S2

	%N	/aC	%H
Calculado	11,9	33,2	4,8
Obtido	11,9	33,1	4,8

0 espectro ultravioleta do produto mostrou uma absojç ção máxima (em tampão de pH 4) a 258,5 nm com E^ = 199.

63 782

RK.15/mb

-14-

EXEMPLO 4

Preparação do sal SAMe.1,5 (l,5-pentanodissulfonato)

Seguiu-se o processo do Exemplo 2, mas usou-se ácido 1,5-pentanodissulfónico em vez de ácido 1,4-butanodissulfónico.

Obtiveram-se 18,5 kg de pá que por análise revelou a seguinte composição:

SAMe 53,3%

ácido 1,5-pentanodissulfónico 46,5%

H₂0 0,2%

correspondente ao sal SAMe.1,5 (l,5-pentanodissulfonato).

0 produto encontrava-se sob a forma de pó branco cris talino, solúvel em água atê 30% em peso com formação de uma s.q lução incolor, e era insolúvel nos solventes orgânicos comuns.

Por cromatografia em camada fina, de acordo com Anal. Biochem. 4, 16-28 (l97l), verificou-se que o produto estava li vre de quaisquer impurezas.

Análise elementar:

^C15^H22^N6^θ5^S·^{1,5 C}5^H12°6^S2

	%N	%C	%H
Calculado	11,3	36,2	5,4
Obtido	11,4	36,2	5,3
0 4) mostrou	espectro ultravioleta do um máximo de absorção a	produto (em 258,5 nm com	tampão de pH 4% ⁼

EXEMPLO 5

Preparação do sal SAMe.1,5 (l,6-hexanodissulfonato)

Seguiu-se o processo do Exemplo 2 mas usou-se ácido

1,6-hexanodissulfónico em vez do ácido 1,4-butanodissulfónico.

Obtiveram-se 19 kg de pá que, por análise, revelou a

seguinte composição:

63 782

RK.15/mb

-15SAMe 51,8%

ácido 1,6-hexanodissulfónico 48%

H₂0 0,2%

correspondente ao sal SAMe.1,5 (l,6-hexanodissulfonato).

0 produto encontrava-se sob a forma de pó branco cristalino, solúvel em água atá 30% em peso com formação de uma solução incolor, e era insolúvel nos solventes orgânicos comuns.

Análise elementar:

^C15^H22^N6°5^S*^{1,5 C}6^H14°6^S2

Calculado

10,9

Obtido

10,8

%c	77 L) /on
37,6	5,6
37,5	5,6

0 espectro ultravioleta do produto (em tampão de pH 4) mostrou uma absorção máxima a 258,5 nm com E^^ = 182.

EXEMPLO 6

Preparação do sal SAMe.1,5 (l,8-octanodissulfonato)

Seguiu-se o procedimento do Exemplo 2 mas usou-se áci. do 1,8-octanodissulfónico em vez de ácido 1,4-butanodissulfóni co.

Obtiveram-se 20 kg de guinte composição:

pó que por análise revelou a se

SAMe 49,3%

ácido 1,8-octanodissulfónico 50,5%

H₂0 0,2%

correspondente ao sal SAMe.1,5 (l,8-octanodissulfonato).

0 produto encontrava-se sob a forma de pó branco cris

talino, solúvel em água até 30% em peso com formação de uma so,

63 782

RK.15/mb

-16-

lução incolor, e era insolúvel em solventes orgânicos comuns.

Por cromatografia em camada fina, de acordo com Anal. Biochem. 4, 16-28 (1971), verificou-se que o produto estava li vre de quaisquer impurezas.

Análise elementar:

^15^H22^6°5^*^1,5 ^C8^H18°6^S2

			U /5ΓΙ
Calculado	10,4	40,0	6,0
Obtido	10,4	59,9	5,9
0 4) mostrou	espectro ultravioleta do um máximo de absorção a	produto (em 258,5 nm com	tampão de pH Eijj = 175.
EXEMPLO 7

Preparação do sal SAMe.1,5 (l,10-decanodissulfonato)

Seguiu-se o procedimento do Exemplo 2 mas usou-se o ácido 1,10-decanodissulfónico em vez do ácido 1,4-butanodissul fónico.

Obtiveram-se 21 kg de ter a seguinte composição:

SAMe

ácido 1,10-decanodissulfónico

h₂o

correspondente ao sal SAMe.1,5

pó que, por análise, revelou

46,8^

53f

0,2^

(l,10-decanodissulfonato).

0 produto encontrava-se sob a forma de pó branco cristalino, solúvel em água até 20f> em peso com formação de uma solução incolor, e era insolúvel nos solventes orgânicos comuns·

Por cromatografia em camada fina, de acordo com Anal.

Biochem. 4, 16-28 (1971) verificou-se que o produto estava livre de quaisquer impurezas.

Análise elementar:

63 782

RK.15/mb

-17^C15^H22^6°5^S,1,5 ^C10^H22°6³2

	$N	$C
Calculado	9,8	42,3	6,5
Obtido	9,9	42,4	6,5

0 espectro ultravioleta do produto 4) mostrou um máximo de absorção a 258,5 nm

EXEMPLO 8

(em tampão de pH

com E_lt/ = 164.

!/□

Misturas farmacêuticas injectáveis contendo sais de

S-adenosil-L-metionina de ácidos dissulf ónicos, com lisina cçi mo agente tampão.

a) o conteúdo liofilizado de urn pequeno frasco

contêm:

SAMe.1,5 (l,4-butanodissulfonato) 364 mg

equivalente ao ião de SAMe 200 mg

o solvente para o produto do pequeno frasco

contêm:

lisina base 150 mg

água para soluçães injectáveis q.b. 3 ml

b) o conteúdo liofilizado de um pequeno frasco

contêm:

SAMe.1,5 (l,4-butanodissulfonato) 729 mg

equivalente ao ião de SAMe 400 mg

o solvente para o produto do pequeno frasco

contém:

lisina base 300 mg

água para soluçães injectáveis q.b. 5 ml

c) o conteúdo liofilizado de um pequeno frasco

contém:

SAMe.1,5 (l,4-butanodissulfonato) 1 821 mg equivalente ao ião de SAMe 1 000 mg

63 782

RK. 15/tnb

-18o solvente para o produto do pequeno frasco

contém:

lisina base 750 mg

água para soluções injectáveis q.b. 10 ml

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 - Processo de preparação de sais estáveis da sulfo-adenosil-L-metionina (SAMe) correspondendo ã fórmula geral:

SAMe.n(CH₂)_m(S0₃H)₂ (i)

onde n pode variar de 1 a 2 e m pode variar de 3 a 12, caracte rizado pelas seguintes operações:

a) enriquecer com SAMe a levedura inicial; b) proceder à lise das células e recolher uma solução rica em SAMe (li sado de células); c) pré-purificar o lisado de células por ul trafiltração; d) passar o lisado pré-purifiçado, por uma colu na de resina permutadora de iões, fracamente ácida, e eluir com o necessário ácido dissulfónico; e) passar o eluado da re ferida coluna por uma coluna de resina de absorção e lavar com o necessário ácido dissulfónico; f) concentrar o eluado da úl. tima coluna por meio de osmose inversa; g) secar a solução concentrada.
2 - Processo de preparação de sais estáveis de SAMe, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a operação da etapa a) se realizar juntando metionina a culturas de microrganismos como Saccharomyces cerevisiae, Torulopsis utilis, Candida utilis.
3 - Processo de preparação de sais estáveis de SAMe, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a operação da etapa b) se realizar tratando primeiro a levedura enriqueci, da, com uma solução de água e acetato de etilo e depois com ácido sulfúrico entre 0,1 N e 0,5 N, de preferência 0,35 N.

63 782

RK.15/mb

-194 - Processo de preparação de sais estáveis de SAMe, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a operação da etapa c) se realizar sujeitando o lisado de células a ultrafiltração, usando membranas com frequência nominal de corte de 10 000.
5 - Processo de preparação de sais estáveis de SAMe, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a operação da etapa d) se realizar passando o lisado pré-purifiçado, por uma coluna de resina fracamente ácida (COOH), sob forma H⁺, a pH entre 3,5 e 7, de preferência a pH 5.
6 - Processo de preparação de sais estáveis de SAMe, de acordo com as reivindicações 1 e 5, caracterizado por a opei ração da etapa d) se realizar passando o referido lisado pré-purificado pela referida coluna a um caudal entre 1 e 3 volju mes de liquido/hora por volume de resina, e de preferência a um caudal de 2 volumes de líquido/hora por volume de resina.
7 - Processo para preparar sais estáveis de SAMe, de acordo com as reivindicações 1, 5 e 6, caracterizado por a ope, ração da etapa d) se realizar passando o referido lisado prê-purificado, pela referida coluna contendo uma quantidade de resina entre 10 e 50 litros por kg de SAMe, de preferência coji tendo 30 litros por kg de SAMe.
8 - Processo para preparar sais estáveis de SAMe, de acordo com as reivindicações 1, 5, 6 e 7, caracterizado por na operação da etapa d) o SAMe ser eluído com uma solução 0,2 N de ácido sulfúrico.
9 - Processo para preparar sais estáveis de SAMe, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a operação da etapa e) se realizar passando o eluado da etapa d) por uma c_o luna de resina de absorção do tipo Amberlite, de preferência Amberlite XAD4, a um caudal entre 0,2 e 1 volume de liquido/ /hora por volume de resina e, de preferência a um caudal de 0,5 volumes de líquido/hora por volume do resina.

63 782

RK.15/mb

-2010 - Processo para preparar sais estáveis de SAMe, de acordo com as reivindicações 1 e 9, caracterizado por, na etapa e), após a passagem da solução de SAMe, se lavar a referida coluna com uma solução de um ácido dissulfónico até que a SAMe desapareça do eluado.
11 - Processo para preparar sais estáveis de SAMe, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na etapa f) a operação se realizar por osmose inversa usando membranas de dessalinização de elevada rejeição de NaCl, de preferência do tipo poliamida.
12 - Processo de preparação de sais estáveis de SAMe, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na etapa g), a operação se realizar secando a solução concentrada de SAMe por atomização numa cêmara alimentada com ar quente.
13 - Processo de preparação de sais estáveis de SAMe, de acordo com as reivindicaçães 1 e 12, caracterizado por na etapa g), a referida solução alimentar a referida cêmara a uma concentração em SAMe entre 100 e 200 g/l, de preferência a uma concentração de 120 g/l.
14 - Processo de preparação de sais estáveis de SAMe, de acordo com as reivindicaçães 1, 12 e 13, caracterizado por na etapa g) o referido ar quente, de preferência desumidificado, alimentar a referida cêmara a uma temperatura entre 14Q2 e 2005Ç, de preferência a uma temperatura de 160SC, e deixar a referida cêmara a uma temperatura entre 402 e 1002C, de preferência a uma temperatura de 605C,