PT792289E - Secretagogos da hormona de crescimento peptidomimeticos de baixo peso molecular - Google Patents

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Kathleen A Elias
Robert S Mcdowell
Mark S Stanley
John P Burnier
Thomas E Rawson
Ross G Clark
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Description

85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
DESCRICÂO "Secretagogos da hormona de crescimento peptidomiméticos de baixo peso molecular"
CAMPO DO INVENTO O invento refere-se a peptidomiméticos sintéticos possuindo actividade de libertação da hormona de crescimento em mamíferos. Os peptidomiméticos do presente invento são utilizados para estimular a libertação da hormona de crescimento endógena (GH) em mamíferos necessitando de uma elevação dos níveis de hormona de crescimento no soro.
ANTECEDENTES DO INVENTO É conhecido que a secreção da GH é inibida pela hormona somatostatina hipotalâmica (SS) e estimulada pela hormona de libertação da GH (GHRH), em todas as espécies de mamíferos estudadas, incluindo humanos. No Homem, a GH é libertada a partir dos somatotrofos da pituitária anterior em impulsos secretores pulsáteis ocorrendo cerca de 4-8 vezes em cada período de 24 horas (Devesa, J., et al., Trends Endocrinol Metab., 3:175-183 [1992] e Mason, W. T., et ai, Acta Paediatr. Suppl. 388:84-92 [1993]). Este padrão de libertação episódica parece ser óptimo para indução dos efeitos fisiológicos da GH, uma vez que muitos tecidos alvo parecem ser mais sensíveis à frequência do que à quantidade total de GH que chega ao tecido alvo (Robinson e Clark, Growth Hormone: Basic and Clinicai Aspects, Eds. Isaksson, Binder, Hall e Hokfelt, Amsterdão, p109-127 [1987]). Crê-se que a secreção episódica da GH é provocada pela libertação alternada rítmica do péptido excitatório GHRH de 44 aminoácidos e do tetradecapéptido inibidor SS, regulada através do "eixo pituitária-hipotálamo" (ver Figura 1). Por sua vez, a GH segregada, tanto directamente como indirectamente através do IGF-1, parece manter este ritmo estimulando a SS e inibindo a libertação de GHRH. Outros neurotransmissores modulam também a libertação de GH, usualmente estimulando ou inibindo a libertação de SS. Adicionalmente, outros factores incluindo o exercício, o sono, os glucocorticóides, as hormonas da tiróide (por exemplo, a TSH), os esteró.jdes sexuais (por exemplo, a testosterona e ο 17-β estradiol), os ácidos gordos livres, os aminoácidos (por exemplo, a arginina e a ornitina) e os níveis de glucose, modulam adicionalmente a libertação de GH.
Para além dos dois reguladores endógenos principais da libertação de GH, · SS e GHRH, tem sido mostrado que vários outros compostos de peptidilo/não peptidilo estimulam a libertação de GH, principalmente através do eixo pituitária-hipotálamo. Estes incluem os péptidos galanina, o péptido de activação da adenilatociclase de pituitária (PACAP), o péptido delta indutor do sono (DSIP) e a
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 2 angiotensina II. Contudo, estes péptidos não possuem geralmente especificidade para a libertação de GH. Vários secretagogos de GH não peptidilo, estruturalmente diversos (por exemplo, o Talipexole e a Clonidina) são noticiados como estimulando a libertação da GH in vitro e in vivo, mas crê-se que estes compostos mediam a seu efeito através dos percursos colinérgico, adrenérgico, dopaminérgico ou serotonérgico e assim não possuem também especificidade para a libertação da GH. À parte da GHRH, os secretagogos de GH possuindo a maior especificidade para a libertação de GH, e assim possuindo o maior potencial terapêutico, são os péptidos/peptidomiméticos de libertação de hormona de crescimento (GHRP) (Bowers, J. Pediatr. Endocrinol. 6:21-31 [1993]; e Schoen et ai, Annual Reports in Medicinal Chemistry, 28:177-186 [1993]). Estes compostos podem activar o eixo pituitária-hipotálamo (Dickson et ai, Neuroscience 53:303-306 [1993]) e actuam directamente no somatotrofo de pituitária (ver Figura 1) por uma via secretora independente (não-GHRH, não-opiato e não-SS). Deste modo, os compostos desta classe podem ser caracterizados pelas suas vias independentes de libertação da GH. Por exemplo, as células de somatotrofo estimuladas ao máximo com GHRP podem libertar GH adicional, quando tratadas com GHRH e vice versa. Similarmente, os efeitos inibidores de antagonistas específicos da GHRH ou de GHRP não têm qualquer efeito no estímulo da libertação de GH pelo secretagogo oposto in vitro. Estes compostos exibem também uma dessensibilização ou atenuação da libertação de GH, dependentes da dose, após exposição contínua ao mesmo composto ou a diferentes compostos da classe dos GHRP. Adicionalmente, os compostos GHRP cognatos, biologicamente inactivos, relacionados estruturalmente, capazes de inibirem a libertação de GH de um GHRP particular, não têm qualquer efeito no agonismo de GHRH. Estes efeitos suportam o modelo das vias independentes e servem como critérios experimentais para os compostos pertencentes à classe dos GHRP. Surpreendentemente, enquanto que o receptor de GHRH tem sido clonado em várias espécies, incluindo no Homem (Gaylin et ai, Mol. Endo. 7:77-84 [1993]), o receptor de GHRP tem permanecido elusivo.
Os compostos paradigma da classe dos GHRP são os GHRP sintéticos derivados de metionina-encefalina, identificados por Bowers et ai, Endocrinology 106:663-667 (1980) e por Momany et ai, Endocrinology 108:31-39 (1981). O GHRP mais estudado é designado por "GHRP-6" (Momany et ai, Endocrinology 114:1531-1536 [1984]; e Bowers et ai, Endocrinology 114:1537-1545 [1984]), que tem mostrado: ser específico para a libertação de GH, não ter qualquer toxicidade a longo prazo conhecida, ser bem tolerado e poder elevar a GH no soro, de um modo dependente da dose, em humanos normais (Bowers, J. Pediatric. Endocrinol. · 6:21-31 [1993]). O GHRP-6 é activo, de um modo dependente da dose, quando administrado quer iv, quer intranasalmente, quer oralmente, ainda que seja fracamente absorvido oralmente (-0,3%). Os hepta- e hexapéptidos de segunda geração mais potentes, "GHRP-1" e "GHRP-2" (também conhecidos como KP 102),
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desta classe têm sido descritos mais recentemente, ainda que seja de esperar que estes compostos sejam também fracamente absorvidos oralmente.
His-D-T rp-Ala-T rp-DPhe-Lys-NH (HwAWfK-NH2) GHRP-6
Ala-His-D-pNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 (AHbAWfK-NH2) GHRP-1
D-Ala-D-pNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH (abAWfK-NH2) GHRP-2
Mais recentemente, foram descritos secretagogos de GH de benzolactama não-peptidilo que parecem usar a mesma via de tradução de sinal alternativa que o GHRP-6 (Smith, R.G. et ai, Science 260:1640-1643 [1993] e Patente dos E.U.A. N° 5 206 235). A benzolactama L-692,429 em combinação com o GHRP-6, em concentrações que maximizam a libertação estimulada de GH, não produziu qualquer libertação de GH adicional. Contrariamente, tem sido noticiado que a GHRH e o L-692,429 proporcionam um aumento sinergístico na secreção de GH. A GHRH e o L-692,429 foram também noticiados como efectuando um padrão de dessensibilização transiente comum, indicando que estes compostos operam através de uma via de receptores comum. O L-692,429 é noticiado como sendo cerca de 6 vezes menos potente do que o GHRP-6 e como sendo específico para a libertação da GH, excepto para alguma libertação in vivo de ACTH e de cortisol.
L-692,429
Foi também noticiado um análogo mais potente do L-692,429 possuindo, no ensaio de células de pituitária de rato, uma potência ligeiramente superior à do GHRP-6 (Schoen W. R. et ai, Bioorg. & Medicinal Chem. Lett. 4:1117-1122
[1994]). Este composto, o L-692,585, provoca presumivelmente a libertação da GH pela mesma via alternativa que o GHRP-6.
L-692,585 Vários destes compostos (tais como, o "GHRP-6" e o L-692,429) são noticiados como sendo seguros e eficazes na promoção da libertação de GH endógena em humanos; contudo, subsistem os problemas com a disponibilidade oral e com a especificidade. A EP 0 018 072 revela péptidos sintéticos possuindo actividade de libertação de hormona de crescimento de pituitária, consistindo os péptidos em entre 5 e 8 aminoácidos.
Num primeiro aspecto do invento, o composto possuí preferivelmente um peso molecular entre 400-650 Da e é representado pela fórmula II
onde os símbolos na fórmula II são definidos como se segue:
Ar1 e Ar2 são cada um seleccionados independentemente de entre indoílo, e
Π
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ η e ο são independentemente 1,2 ou 3; L1 é seleccionado de entre -CH2-0-, -CH2-CH2-0-, -CH2-, -CH2-CH2- e -CH2-CH2-CH2-; L2 é seleccionado de entre uma ligação covalente, -O- e L1; RB e Rc são seleccionados de entre o grupo compreendendo hidrogénio, alquiloC^Cg opcionalmente substituído com um grupo seleccionado de entre -NR2R3 e fenil-C1-C3-NR2R3, e halogeno(F, Cl, Br, IjalquiloC^Cg; R1 é seleccionado de entre hidrogénio, alquiloCrC6, -C(=0)alquiloCrC6, -C(=0)-NR2R3, -C(=NR2)-NR2R3, -C(=0)0-alquiloCrC6 e halogeno(F, Cl, Br, OaiquiloC^Cg, alcoxialquiloC^Cg ou (hidroxialquilo); R2 e R3 são seleccionados independentemente de entre hidrogénio, alquiloCrC6 piperidinilo e halogeno(F, Cl, Br, l)alquiloC.,-C6; R2 e R3, conjuntamente com o N ao qual estão ligados, podem formar um heterociclo de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional seleccionado de entre O, S e N, e onde qualquer N está opcionalmente substituído com R1, qualquer carbono está opcionalmente substituído com R6 e onde o heterociclo está opcionalmente fundido com um anel fenilo, opcionalmente substituído com R4; R4 e R5 são seleccionados independentemente de entre o grupo compreendendo hidrogénio, halogéneo(F, Cl, Br e I), ciano, amino, amido, nitro, hidroxi, alquiloC^Cg opcionalmente substituído com 1-3 R6, alciniloC2-C6 opcionalmente substituído com 1-3 R6, alquiloxi^-Cg opcionalmente substituído com 1-3 R6, acilamino^-Cg opcionalmente substituído com 1-3 R6, alquilcarboniloC^Cg opcionalmente substituído com 1-3 R6, alquiloxicarboniloC1-C6 opcionalmente substituído com 1-3 R6, N-(alquilC1-C6),N-(acilC1-C6)amino opcionalmente substituído com 1-3 R6, N-(alquilC^Cgjcarboxamido opcionalmente substituído com 1-3 R6, N,N-di(alquilC0-C6)amino opcionalmente substituído com 1-3 R6, N,N-di(alquilC1-C6)carboxamido-opcionalmente substituído com 1-3 R6, perfluoroalquiloC^C^ e perfluoroalcoxiC,- c3;
6 R6 é seleccionado de entre o grupo compreendendo -COOR2, -0(C=0)R2, -CONR2R3, ciano, -NR2R3, -NR2COR3, azido, nitro e hidroxi; X é seleccionado de entre o grupo compreendendo hidrogénio, oxo (=0), -COOR2, -CONR2R3, alquilC0-C6-O-alquiloCrC6 opcionalmente substituído com 1-2 R6 e alquilo^-Cg opcionalmente substituído com 1-2 R6; e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
Numa concretização alternativa do invento, o composto é representado pelas fórmulas estruturais lll-llld.
IIIc 85 455
Illd ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ onde os símbolos nas fórmulas lll-llld são definidos como se segue:
Ar1 e Ar2 são cada um seleccionados independentemente de entre indoilo,
(R*)n t
e n e o são independentemente 1,2 ou 3; L1 e L2 são seleccionados independentemente de entre -CH2-0-, -CH2-CH2-CH2-0-, -CH2-, -CH2-CH2- e -CH2-CH2-CH2-; RB, Rc e RD são seleccionados de entre o grupo compreendendo hidrogénio, alquiloCrC6 opcionalmente substituído com um grupo seleccionado de entre -NR2R3 e fenil-C1-C3- NR2R3, e halogeno(F, Cl, Br, OalquiloC^Cg; R1 é seleccionado de entre hidrogénio, alquiloCrC6, -C(=0)alquiloCrC6f hidroxialquilo, -C(=0)-NR2R3, -C(=NR2)-NR2R3, -CíOjO-alquiloC^Ce e halogeno(F, Cl, Br, IJalquiloC^Ce; R2 e R3 são seleccionados independentemente de entre hidrogénio, alquiloC1-C6, piperidinilo e halogeno(F, Cl, Br, IjalquiloC^Ce; R2 e R3, conjuntamente com o N ao qual estão ligados, podem formar um heterociclo de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional seleccionado de entre O, S e N, onde qualquer N está opcionalmente substituído com R1, qualquer carbono está opcionalmente substituído com R6 e onde o heterociclo está opcionalmente fundido com um anel fenilo, opcionalmente substituído com R4; R4 e R5 são seleccionados independentemente de entre o grupo compreendendo hidrogénio, halogéneo(F, Cl, Br e I), ciano, amino, amido, nitro, hidroxi, alquiloC^Cg opcionalmente substituído com 1-3 R6, alciniloC2-C5 opcionalmente substituído com 1-3 R6, alquiloxiC^Cg opcionalmente substituído com 1-3 R6, àcilaminoC^Cg opcionalmente substituído com 1-3 R6, alquilcarboniloCrC6 opcionalmente substituído com 1-3 R6, alquiloxicarboniloC,-C6 opcionalmente substituído com 1-3 R6, N-(alquilC1-C6),N-(acilC1-C6)amino opcionalmente substituído com 1-3 R6, N-(alquilC,-C6)carboxamido opcionalmente substituído com 1-3 R6, N,N-di(alquilC0-C6)amino opcionalmente substituído com 1-3 R6, N.N-diíalquilC^CgJcarboxamido opcionalmente substituído com 1-3 R6, perfluoroalquiloC,^, e perfluoroalcoxiC.,- R5 é seleccionado de entre o grupo compreendendo -COOR2, -0(C=0)R2, -CONR2R3, ciano, -NR2R3, -NR2COR3, azido, nitro e hidroxi; R7 é seleccionado de entre o grupo compreendendo R6 e ariloC6-C10 opcionalmente substituído com halogéneo(F, Cl, Br e I), ciano, amino, amido, nitro, hidroxi, perfluoroalquiloC^Cí e perfluoroalcoxiC^Cs; Y é seleccionado de entre o grupo compreendendo alquiloC^Cg substituído com 1-2 R7, alceniloC2-C6 opcionalmente substituído com 1-2 R7 e alciniloC2-C6 opcionalmente substituído com 1-2 R7 e alquiloxiCrC6 opcionalmente substituído com 1-2 R7, e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
Numa concretização alternativa adicional do presente invento, o composto é representado pela fórmula estrutural IV
IV onde os símbolos da fórmula IV são definidos como se segue:
Ar1 e Ar2 são cada um seleccionados independentemente de entre indoílo, 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
9
e
η ο
Ar3 é seleccionado de entre o grupo compreendendo
Π e n e o são independentemente 1,2 ou 3; RB, Rc, RD e RE são seleccionados de entre o grupo compreendendo hidrogénio, alquiloCVCe opcionalmente substituído com um grupo seleccionado de entre -NR2R3 e fenil-C^Ca- NR2R3, e halogeno(F, Cl, Br, IJalquilo^-Ce; R1 é seleccionado de entre hidrogénio, alquiloCrC6, -C^OJalquiloC^Cg, -C(=0)-hidroxialquilo NR2R3, -C(=NR2)-NR2R3, -C(=0)0-alquiloCrC6 e halogeno(F, Cl, Br, IJalquiloC^Ce; R2 e R3 são seleccionados independentemente de entre hidrogénio, alquiloC,-^, piperidinilo e halogeno(F, Cl, Br, l)alquiloCrC6; R2 e R3, conjuntamente com o N ao qual estão ligados, podem formar um heterociclo de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional seleccionado de entre O, S e N, onde qualquer N está opcionalmente substituído com R1, qualquer carbono está opcionalmente substituído com R6 e onde o heterociclo está opcionalmente fundido com um anel fenilo, opcionalmente substituído com R4; R4 e R5 são seleccionados independentemente de entre o grupo compreendendo -hidrogénio, halogéneo(F, Cl, Br e I), ciano, amino, amido, nitro, hidroxi, alquiloC^Ce opcionalmente substituído com 1-3 R6, alciniloC2-C6 opcionalmente substituído com 1-3 R6, alquiloxiCrC6 opcionalmente substituído com 1-3 R6, acilaminoC^Ce opcionalmente substituído com 1-3 R6, alquilcarboniloC^Ce opcionalmente
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10 substituído com 1-3 R6, alquiloxicarboniloCVCg opcionalmente substituído com 1-3 R6, N-(alquilC1-C6),N-(acilC1-C6)amino opcionalmente substituído com 1-3 R6, N-(alquilC^CgJcarboxamido opcionalmente substituído com 1-3 R6, N,N-di(alquilC0-C6)amino opcionalmente substituído com 1-3 R6, N.N-dKalquilCrCejcarboxamido opcionalmente substituído com 1-3 R6, perfluoroalquiloC1-C4> e perfluoroalcoxiC,- R6 é seleccionado de entre o grupo compreendendo -COOR2, -0(C=0)R2, -CONR2R3, ciano, -NR2R3, -NR2COR3, azido, nitro e hidroxi; R7 é seleccionado de entre o grupo compreendendo R6, ariloC6-C10. opcionalmente substituído com halogéneo(F, Cl, Br e I), ciano, amino, amido, nitro, hidroxi, perfluoroalquiloCrC4, e perfluoroalcoxiCrC3; Z é seleccionado de entre o grupo compreendendo alquiloC^Cg substituído com 1-2 R7, alciniloC2-C6 opcionalmente substituído com 1-2 R7, alceniloC2-C6 opcionalmente substituído com 1-2 R7 e alquiloxiCrC6 opcionalmente substituído com 1-2 R7, Z e RE, conjuntamente com o N ao qual estão ligados, podem formar um heterociclo de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional seleccionado de entre O, S e N, onde qualquer N está opcionalmente substituído com R1, qualquer carbono está opcionalmente substituído com R7 e onde o heterociclo está opcionalmente fundido com um anel fenilo; e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
Um composto opcional desta concretização é representado pela fórmula estrutural (IVa)
onde os símbolos na fórmula IVa são definidos como se segue: RB, Rc, RD e RE são seleccionados de entre o grupo compreendendo hidrogénio e alquiloC^Cg;
Ar1 e Ar2 são cada um seleccionados independentemente de entre indoílo, e 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 11
Ar3 é seleccionado de entre o grupo compreendendo
RF é seleccionado de entre o grupo compreendendo OH, alquiloxiCrC4, -NR5R6 e 1 a 4 resíduos de aminoácido a; R4 é seleccionado de entre hidrogénio, halogéneo(F, Cl, Br e I), ciano, amino, amido, nitro, hidroxi, alcoxiCrC4, perfluoroalquiloCrC4 e perfluoroalcoxiC^Cai R5 e R6 são seleccionados independentemente de entre hidrogénio e alquiloCrC6; e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
Ainda numa outra concretização do presente invento, o composto é designado por "retroinverso" do composto com a fórmula II e é representado pela fórmula V
Ar1 Rb Y O
v onde Ar1, Ar2, L1, L2, RA, RB, Rc e X são definidos como anteriormente para o composto com a fórmula I. O invento compreende adicionalmente uma composição farmacêutica compreendendo um excipiente farmaceuticamente aceitável e qualquer dos compostos representados pelas fórmulas estruturais l-V. Adicionalmente, o invento proporciona utilizações médicas dos compostos anteriores para o aumento do nível · de hormona de crescimento endógena num mamífero pela administração ao mamífero de uma quantidade farmaceuticamente eficaz da composição anterior ao mamífero. As utilizações compreendem adicionalmente a administração da composição em combinação com um factor de crescimento seleccionado de entre: 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 12 .· λ & ψ· 4Γ hormona de libertação da hormona de crescimento (GHRH); factor de crescimento 1 do tipo insulina (IGF-1) e factor de crescimento 2 do tipo insulina (IGF-2). Numa utilização médica alternativa do presente invento, os GHRP representados pelas fórmulas l-V, bem como outros GHRP, são usados em combinação com o IGF-1 para tratar doenças para as quais o IGF-1 é indicado a longo prazo, incluindo, mas sem estar a esta limitado, a diabetes do Tipo II.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FIGURA 1. Esquema mostrando a regulação da libertação da hormona de crescimento (GH) pelo "eixo pituitária-hipotálamo" e a "via de GHRP" alternativa. São também mostrados alguns dos efeitos estimulantes (+) e inibidores (-) que o factor/hormona de libertação da hormona de crescimento (GHRH/F), os péptidos/peptidomiméticos de libertação da hormona de crescimento (GHRP), a somatostatina (SS), a GH e o factor de crescimento 1 do tipo insulina (IGF-1), têm em glândulas, órgãos e tecidos seleccionados. FIGURA 2. Ensaio representativo de resposta à dose, em células "pit" de rato, da libertação de GH durante uma exposição de 15 min. a concentrações crescentes de (inip)-bbFK-NH2. A libertação de GH é aumentada significativamente (p<0,05) a 0,3 nM e atinge um patamar a cerca de 1 nM com uma EC50 de 0,16 nM (ver no quadro à direita os pontos experimentais e a curva usada para calcular a EC50). A EC50 média (n=3) para o inip-bbFK-NH2 foi de 0,18 ± 0,04 nM, mais do que 30 vezes mais potente do que para o HwAWfK-NH2 ("GHRP-6") (6,2 ±1,5 nM; n=5). FIGURA 3. Demonstração de que o (inip)-bbFK-NH2 actua no "receptor de GHRP" proposto. Os desafios de células "pit" de rato foram realizados usando combinações de GHRP-6, (inip)-bbFK-NH2 e GHRH. O GHRP-6 e o (inip)-bbFK-NH2 (100 nM) provocaram ambos aumentos de 3 vezes nos níveis de GH em relação ao controlo (Ctrl), mas não se observou qualquer aumento adicional ou sinergístico quando usados em combinação (barras pretas a cheio). Por contraste, tanto o GHRP-6 como o (inip)-bbFK-NH2 mostraram sinergia com GHRH 10 nM indicando que nem o GHRP-6 nem o (inip)-bbFK-NH2 actuam através do receptor de GHRH (barras a tracejado). FIGURA 4. Efeito de dessensibilização do "receptor de GHRP" após desafio de células de pituitária de rato com três incubações sequenciais de 15 min. com (inip)-bbFK-NH2 fresco. A libertação de GH diminuiu após a segunda incubação de 15 min. (um total de 30 min. de exposição ao (inip)-bbFK-NH2) e não ocorreu· qualquer libertação significativa de GH em comparação com o controlo durante o desafio final com (inip)-bbFK-NH2. Contudo, quando se adicionou GHRH (10 nM) à incubação de 15 min. seguinte, ocorreu uma resposta de GH significativa, consistente com o modelo de receptor separado.
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85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 13 FIGURA 5. Supressão pela somatostatina da libertação de GH estimulada por GHRP. O (inip)-bbFK-NH2 a 0,1, 1, 10 e 100 nM eleva significativamente a libertação de GH (barras pretas a cheio). A co-incubação de (inip)-bbFK-NH2 com somatostatina 20 nM suprimiu esta libertação (barras a tracejado). FIGURA 6. Antagonismo da libertação de GH induzida por (inip)-bbFK-NH2 na ausência (barras pretas a cheio) e na presença de 10 μΜ do antagonista de "GHRP-6" HwkWfK-NH2 (barras a tracejado). FIGURA 7. Especificidade para a libertação de GH comparada com a libertação de prolactina induzida com (inip)-bbFK-NH2. Níveis de GH e de prolactina nos mesmos meios a partir de célula desafiadas com 100 nM de (inip)-bbFK-NH2. A libertação de GH foi de 3 vezes enquanto que os níveis de prolactina aumentaram 1,6 vezes. FIGURA 8. Libertação de TSH, FSH e LH induzida com (inip)-bbFK-NH2. As células de pituitária desafiadas com (inip)-bbFK-NH2 não tiveram qualquer efeito nestas concentrações de hormona. FIGURA 9. Libertação de ACTH induzida com factor de libertação de corticotrofina (CRF) ou com (inip)-bbFK-NH2. Os níveis de ACTH subiram 3 vezes quando estimulados com CRF mas não se observou qualquer modificação significativa com (inip)-bbFK-NH2100 nM. FIGURAS 10A-10D. Libertação de Ca++ em células de pituitária pelo (inip)-bbFK-NH2. Ca++ basal em células de pituitária carregadas com lndol-1 AM, após uma cultura em monocamada de 4 dias (Figura 10A e Figura 10C). Vinte e um (21) segundos após a adição de (inip)-bbFK-NH2, o fluxo aumentado de Ca""" na Figura 10D é demonstrado por áreas mais claras em algumas das células desta população heteróloga. A adição de veículo não alterou os níveis de Ca++ (Figura 10B). FIGURA 11. Libertação de GH dependente da dose com (inip)bb(feg). Libertação de GH por células de pituitária de rato em relação a concentrações crescentes de (inip)bb(feg) (quadro da esquerda) durante uma incubação de 15 minutos. O quadro da direita mostra os pontos experimentais e a curva usada para calcular a EC50 de 0,09 nM. FIGURA 12. Demonstração de que o (inip)bb(feg) actua no "receptor de · GHRP" proposto. A resposta de GH ao GHRP-6 (100 nM) e ao (inip)bb(feg) (100 nM) foi significativamente superior à do controlo mas a libertação de GH não foi sinergística quando ambos foram usados em combinação. A GHRH (100 nM) 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ induziu uma resposta de GH moderada que era sinergística em combinação, quer com o GHRP-6, quer com o (inip)bb(feg). FIGURA 13. Supressão pela somatostatina da libertação de GH estimulada por (inip)bb(feg). A libertação de GH com (inip)bb(feg) 100 nM foi totalmente suprimida na presença de somatostatina 20 nM. FIGURA 14. Dessensibilização do "receptor de GHRP" após desafio de células de pituitária de rato com três incubações sequenciais de 15 min. com (inip)bb(feg) fresco. Libertação de GH a partir das mesmas células de pituitária durante três incubações sequenciais de 15 minutos com (inip)bb(feg) (100 nM). Após um total de 45 minutos, a libertação de GH diminuiu acentuadamente em resposta ao (inip)bb(feg), mas estas células foram capazes de libertar mais GH em resposta a uma incubação final de 15 minutos com GHRH (10 nM). FIGURA 15. Libertação de GH dependente da dose com (inip)b(wol). Libertação de GH por células de pituitária de rato em relação a concentrações crescentes de (inip)b(wol) (quadro da esquerda) durante uma incubação de 15 minutos. O quadro da direita mostra os pontos experimentais e a curva usada para calcular a EC50 de 3,9 nM. FIGURA 16. Demonstração de que o (inip)b(wol) actua no "receptor de GHRP" proposto. A resposta de GH ao GHRP-6 (100 nM) e ao (inip)b(wol) (100 nM) foi significativamente superior à do controlo mas a libertação de GH não foi sinergística quando ambos foram adicionados em combinação. A GHRH (100 nM) induziu uma resposta de GH moderada que era sinergística em combinação, quer com o GHRP-6, quer com o (inip)b(wol). FIGURA 17. Supressão pela somatostatina da libertação de GH estimulada por (inip)b(wol). A libertação de GH com (inip)b(wol) 100 nM foi totalmente suprimida na presença de somatostatina 20 nM.
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14 FIGURA 18. Efeito de dessensibilização do "receptor de GHRP" após desafio de células de pituitária de rato com três incubações sequenciais de 15 min. com (inip)b(wol) fresco. Libertação de GH a partir das mesmas células de pituitária durante três incubações sequenciais de 15 minutos com (inip)b(wol) (100 nM). Após um total de 45 minutos, não se observou qualquer libertação significativa de GH em resposta ao (inip)b(wol), mas estas células foram capazes de libertar mais GH em resposta a uma incubação final de 15 minutos com GHRH (10 nM). FIGURA 19. Ganho no peso corporal em ratos adultos fêmea normais em resposta a excipiente (quadrados a branco), três doses de (inip)-bbFK-NH2 (4 pg/d círculos a branco, 20 pg/d triângulos a branco, 100 pg/d losangos meio-cheios), ou uma dose de GHRH (600 ug/d quadrados a cheio); a entrega foi realizada por
infusão subcutânea com mini-bomba durante 14 dias. Verificou-se um ganho de peso relacionado com a dose em resposta ao (inip)-bbFK-NH2 que, para 20 pg/d, atingiu a resposta à GHRH. São apresentados as médias e os erros padrão. FIGURA 20. Ganho no peso corporal em ratos adultos fêmea normais tratados durante 14 dias com excipiente (barra aberta), duas doses de (inip)-bbFK-NH2 administrado subcutaneamente por injecção (barra sombreada, 100 μg/d; barra a cheio, 20 .ug/d) ou infusão (barra a tracejado fino, 100 ,ug/d; barra a tracejado grosso, 20 ,ug/d). As injecções de (inip)-bbFK-NH2 foram mais eficazes do que as infusões. São apresentados as médias e os erros padrão. FIGURA 21. Ganho no peso corporal em ratos adultos fêmea normais tratados durante 14 dias com excipiente (quadrados a branco), ou com (inip)-bbFK-NH2 administrado por injecção subcutânea (100 ug/d; triângulos a branco) ou infusão (100 μg/d; círculos a branco). As injecções de (inip)-bbFK-NH2 produziram uma resposta de crescimento sustentada; as infusões deram uma resposta inicial grande mas que não foi mantida. São apresentados as médias e os erros padrão. FIGURA 22. Ganho no peso corporal em ratos macho magros (círculos a branco) e obesos Zucker Diabetic Fatty (ZDF) do Tipo II tratados subcutaneamente durante 24 dias com excipiente (círculos a cheio), hormona de crescimento humana recombinante (rhGH, quadrados a branco grandes, 500 pg/d), factor de crescimento 1 do tipo insulina humano recombinante (rhlGF-1, quadrados pequenos, 758 μρΜ), (inip)-bbFK-NH2 administrado por injecção (100 pg/d; triângulos a branco), a combinação de rhGH mais rhlGF-1 (quadrados a cheio) ou a combinação de rhlGF-1 mais (inip)-bbFK-NH2 (triângulos a cheio). A combinação de (inip)-bbFK-NH2 mais rhlGF-1 produziu uma resposta de crescimento sustentada igual à de rhlGF-1 mais rhGH. São apresentados as médias e os erros padrão. FIGURA 23. Ganho no peso corporal em ratos macho obesos Zucker Diabetic Fatty (ZDF) do Tipo II tratados subcutaneamente durante 7 dias com excipiente (círculos a cheio), factor de crescimento 1 do tipo insulina humano recombinante (rhlGF-1, círculos a branco, 758 μς/d), (inip)-bbFK-NH2 administrado por injecção (100 μg/d; triângulos a branco), ou a combinação de rhlGF-1 e de (inip)-bbFK-NH2 (triângulos a cheio). A combinação de (inip)-bbFK-NH2 mais rhlGF-1 produziu uma resposta de crescimento sustentada que era pelo menos aditiva comparada com a de cada agente administrado sozinho. São apresentados as médias e os erros padrão. FIGURA 24. Níveis basais de glucose no sangue obtidos semanalmente em ratos macho magros (quadrados pequenos) e obesos Zucker Diabetic Fatty (ZDF) do Tipo II tratados subcutaneamente durante 3 semanas com excipiente (controlos, círculos a cheio), hormona de crescimento humana recombinante (rhGH,
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quadrados a branco, 500 μς/d), factor de crescimento 1 do tipo insulina humano recombinante (rhlGF-1, círculos a branco, 758 ,ug/d), (inip)-bbFK-NH2 administrado por injecção (100 μς/Ή; triângulos a branco), ou a combinação de rhGH e de rhlGF-1 (quadrados a cheio) ou a combinação de rhlGF-1 e de (inip)-bbFK-NH2 (triângulos a cheio). Quando administrado sozinho ou em combinação com rhlGF-1, o (inip)-bbFK-NH2 teve um efeito menor na glucose do sangue (efeito diabetogénico) do que a rhGH em doses com efeitos somatogénicos similares (Figura 22). São apresentados as médias e os erros padrão. FIGURA 25. Concentrações de glucose no sangue após um desafio com insulina intravenosa (teste de tolerância à insulina) em ratos macho magros de controlo (barra aberta) e obesos Zucker Diabetic Fatty (ZDF) do Tipo II tratados subcutaneamente com excipiente (barra a cheio), hormona de crescimento humana recombinante (rhGH, tracejado ascendente fino da esquerda para a direita, 500 μg/d), factor de crescimento 1 do tipo insulina humano recombinante (rhlGF-1, barra levemente sombreada, 758 μg/d), (inip)-bbFK-NH2 administrado por injecção (100 ng/d; tracejado descendente fino da esquerda para a direita), ou a combinação de rhGH e de rhlGF-1 (tracejado ascendente grosso da esquerda para a direita), ou a combinação de rhlGF-1 e de (inip)-bbFK-NH2 (tracejado descendente grosso da esquerda para a direita). Quando administrado sozinho ou em combinação com rhlGF-1, o (inip)-bbFK-NH2 tinha um efeito grandemente reduzido na sensibilidade à insulina (efeito diabetogénico) em relação ao da rhGH em doses com efeitos somatogénicos similares (Figura 22). São apresentados as médias e os erros padrão. FIGURA 26. Ganhos diários de peso corporal em ratos adultos fêmea normais tratados durante 7 dias com injecções subcutâneas, duas vezes ao dia, de excipiente (quadrados a branco), hormona de libertação de hormona de crescimento (triângulos a branco), HwAWfK (quadrados a cheio), (inip)-bbF-NH2 (círculos a branco), (inip)-bnmb-bam (círculos a cheio) ou L-692,585 (triângulos a cheio). Ocorreu um ganho de peso significativo após tratamento com todas as moléculas à excepção do L-692,585. São apresentados as médias e os erros padrão. FIGURA 27. Ganho total no peso corporal em ratos adultos normais tratados durante 7 dias com injecções subcutâneas, duas vezes ao dia, de excipiente (barra a cheio), infusões de factor de crescimento 1 do tipo insulina humano recombinante (rhlGF-1, tracejado largo), ou com as combinações de rhlGF-1 mais hormona de libertação da hormona de crescimento (sombreado leve), de HwAWfK mais rhlGF-1 (tracejado estreito), de (inip)-bbF-NH2 mais rhlGF-1 (barra aberta) (inip)-bnmb-bam * mais rhlGF-1 (sombreado escuro) ou de L-692,585 mais rhlGF-1 (linhas horizontais) Os ganhos de peso tendem a ser maiores após o tratamento com combinações. São apresentados as médias e os erros padrão.
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 17 DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO A. Definições
Os termos usados nas reivindicações e na descrição são definidos como a seguir se apresenta, a não ser que se especifique de outro modo.
Os termos hormona de libertação da hormona de crescimento (GHRH) ou factor de libertação da hormona de crescimento (GHRF/GRF) são usados indiferentemente e referem-se ao secretagogo de GH hipotalamico endógeno, de qualquer espécie, possuindo a capacidade de se ligar ao somatotrofo de pituitária e de induzir uma libertação rápida de GH dependente da dose e aos seus análogos biologicamente activos. São incluídos nesta definição: GHRH(1-44), GHRH(1-43), GHRH(1-40) e GHRH(1-29). Na Patente dos E.U.A. n°4 622 312 descrevem-se outros exemplos de análogos de GHRH. 15 10 15 H-Tyr-Ala-Aap-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tvr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly- 16 20 25 30
Gln-Leu-Ser-AIa-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-Ile-Met-Ser-Arg-GIn- 31 35 40 44
Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gin-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-N'H2
Hormona de Libertação da Hormona de Crescimento (GHRH) O termo somatostatina (SS) refere-se ao tetradecapéptido hipotalâmico inibidor capaz de antagonizar, de um modo dependente da dose, o efeito de libertação de GH da GHRH. 1 5 H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-T rp
Cys-Ser-Thr-Phe-Thr-Lys 14 10
Somatostatina (SS)
Tal como é aqui utilizado, "IGF-1" refere-se ao factor de crescimento do tipo insulina de qualquer espécie, incluindo a bovina, a ovina, a suína, a equina, avícola e, preferivelmente, a humana, na sequência nativa ou numa forma variante, e de 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
18 qualquer fonte, quer natural, sintética, ou recombinante. É aqui preferida para utilização em animais a forma de IGF-1 da espécie particular que está a ser tratada, tal como o IGF-1 suíno para tratar porcos, o IGF-1 ovino para tratar ovelhas, o IGF-1 bovino para tratar gado vacum, etc.. É aqui preferida para utilização em humanos a sequência nativa de IGF-1 maduro, humano, mais preferivelmente sem uma metionina no terminal N, preparado, por exemplo, pelo processo descrito na EP 230 869, publicada em 5 de Agosto de 1987; na EP 128 733, publicada em 19 de Dezembro de 1984; ou na EP 288 451, publicada em 26 de Outubro de 1988. Mais preferivelmente, esta sequência nativa de IGF-1 é produzida de modo recombinante e está disponível na Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. para investigações clínicas. Também é preferido para utilização o IGF-1 que tem uma actividade específica superior a cerca de 14 000 unidades/mg conforme determinada por ensaio de radiorreceptores usando membranas de placenta, tal como o que está disponível na KabiGen AB, Estocolmo, Suécia.
As variantes de IGF-1 mais preferidas são as descritas na Patente dos E.U.A. n° 5 077 276, publicada em 31 de Dezembro de 1991, no PCT WO 87/01038, publicado em 26 de Fevereiro de 1987 e no PCT WO 89/05822, publicado em 29 de Junho de 1989, isto é, aquelas em que pelo menos o resíduo ácido glutâmico está ausente na posição 3, a partir do terminal N da molécula madura, ou aquelas com até cinco aminoácidos ausentes no terminal N. A variante mais preferida tem os três primeiros aminoácidos a partir do terminal N ausentes (designada, de um mdo variado, por IGF de cérebro, tlGF-1, des(1-3)IGF-1 ou deslGF-1). O termo "GHRP", tal como é aqui utilizado, refere-se a compostos que provocam a libertação da GH endógena, de um modo dependente da dose, libertação esta que é sinergística com a da GHRH, mas não com a de outros GHRP, tal como o GHRP-6, e libertação esta que provoca uma dessensibilização após exposição contínua ao GHRP, mantendo a capacidade para responder à GHRH. O termo "alquiloCn-Cm" designa um radical hidrocarboneto alifático saturado, ramificado ou não ramificado, cíclico ou linear, possuindo o número de átomos de carbono especificado, onde m e n são zero ou números interiros identificando a gama de átomos de carbono contida no grupo alquilo. Quando n é zero (0), o termo torna-se uma ligação química, usualmente uma ligação covalente. Exemplos de radicais alquilo incluem metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo (iPr), n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo (tBu), n-pentilo, 2-metilbutilo, 2,2-dimetilpropilo, n-hexilo, 2-metilpentilo, 2,2-dimetilbutilo, n-heptilo, 2-metil-hexilo, ciclo-hexilo, e similares. Os -.termos "alquilo inferior" e "alquiloC^-Cg" são sinónimos e são usados indiferentemente. 19 85 455 € ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ Ο termo "alceniloC2-Cm" designa um radical hidrocarboneto, ramificado ou não ramificado, cíclico ou linear, contendo pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono, possuindo o número de átomos de carbono especificado, cada ligação dupla sendo independentemente cis, trans, E ou Z, ou um isómero não geométrico. O termo "alciniloC2-Cm" designa um radical hidrocarboneto, cíclico ou linear, ramificado ou não ramificado, contendo pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono, possuindo o número de átomos de carbono especificado.
Os termos "aciloxiC^C^" ou "alcanoiloxiCrC12" são usados indiferentemente e representam aqui grupos com a fórmula alquiloC0-C12-C(=O)-O- tais como: formiloxi, acetoxi, propioniloxi, butiriloxi, pentanoiloxi, hexanoiloxi, heptanoiloxi e similares. O termo "N,N-diaiquil(C0-C6)amino" representa aqui grupos com a fórmula (alquiloC0-C6)2N- onde ambos, um ou nenhum dos átomos de hidrogénio de H2N-estão substituídos por alquiloC^Cg. O termo "N-(alquilC1-C6),N-(acilC1-C6)aminoM representa aqui um grupo amino onde um hidrogénio está substituído por um grupo alquiloC^Cg e o outro hidrogénio está substituído por um grupo aciloC^Cg.
Os termos "alquiloxicarboniloC,-^" e "carboalcox^-Cg" são aqui usados indiferentemente e representam grupos com a fórmula alquilC1-C6-OC(=0)-.
Os termos "N-íalquilC^CeJcarboxamido" e "N-(alquilCrC6)-aminocarbonilo" são aqui usados indiferentemente e representam grupos com a fórmula alquilCrCg-NH-C^O)-.
Os termos "alquilcarboniloC^C^", "alcanoiloC1-C12" e "aciloC^C^", são aqui usados indiferentemente e representam grupos com a fórmula alquilC0-C12-C(=O)-. e abrangem grupos tais como formilo, acetilo, propionilo, butirilo, pentanoílo, hexanoílo, heptanoílo, benzoílo e similares. O termo "C^Cgacilamino representa grupos com a fórmula alquilC1-C6-C(=0)-NH-.
Os termos "alquiloxiCrC12" e "alquiloxiC^C,-, substituído" representam grupos alquiloC^C^ e alquiloC^C^ substituído, respectivamente, ligados a um oxigénio que, por sua vez, é o ponto de ligação para o grupo alquiloxi ou alquiloxi · substituído ao grupo ou ao substituinte designado (tal como alquilCrC12-0-). Estes incluem grupos tais como metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, t-butoxi, ciclo-hexiloxi e grupos similares. 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 20
Ο termo "arilo", quando usado sozinho, significa um radical hidrocarboneto aromático homocíclico, fundido ou não fundido, possuindo o número de átomos de carbono designado, ou se não for designado nenhum, de 6 a 14. Os radicais aromáticos podem ser mononucleares ou polinucleares. Exemplos de grupos arilo incluem fenilo, naftilo, antranilo, fenantranilo, azulilo e similares. Os grupos arilo preferidos incluem fenilo, naftilo, bifenilo, fenantrenilo, naftacenilo e similares (ver, por exemplo, Lang's Handbook of Chemistry (Dean. J. A., ed) 13,h ed. Table 7-2 [1985]).
Opcionalmente, o "arilo” está substituído com um ou mais substituintes usualmente designados por um grupo “-Rn,‘, onde n é um número inteiro qualquer. Exemplos de grupos fenilo substituídos incluem grupos mono- ou di-(halogeno)fenilo, tais como 4-clorofenilo, 2,6-diclorofeniio, 2,5-diclorofenilo, 3,4-diclorofenilo, 3-clorofenilo, 3-bromofeniio, 4-bromofenilo, 3,4-dibromofenilo, 3-cloro-4-fluorofenilo, 2-fluorofenilo e similares; grupos mono- ou di-(hidroxi)fenilo, tais como 4-hidroxifenilo, 3-hidroxifenilo, 2,4-di-hidroxifenilo, os seus derivados com hidroxi protegido e similares; grupos nitrofenilo, tais como 3- ou 4-nitrofenilo; grupos cianofenilo, por exemplo, 4-cianofenilo; grupos mono- ou di-(alquilo inferior)fenilo, tais como 4-metilfenilo, 2,4-dimetilfenilo, 2-metilfenilo, 4-(isopropil)fenilo, 4-etilfenilo, 3-(n-propil)fenilo e similares; grupos mono- ou di-(alcoxi)fenilo, por exemplo, 2,6-dimetoxifenilo, 4-metoxifenilo, 3-etoxifenilo, 4-(isopropoxi)fenilo, 4-(t-butoxi)fenilo, 3-etoxi-4-metoxifenilo e similares; 3- ou 4-trifluorometilfenilo; grupos mono- ou dicarboxifenilo ou (carboxi protegido)fenilo, tais como 4-carboxifenilo; grupos mono-ou di-(hidroximetil)fenilo ou (hidroximetil protegido)fenilo, tais como 3-(hidroximetil protegido)fenilo ou 3,4-di-(hidroximetil)fenilo; 2,3- e 3,4-metilenodioxi; grupos mono-ou di-(aminometil)fenilo ou (amínometil protegido)fenilo, tais como 2-(aminometil)fenilo ou 2,4-(aminometil protegido)fenilo; ou grupos mono- ou di-((N-(metilsulfonilamino))fenilo, tais como 3-(N-metilsulfonilamino)fenilo. Também, o termo "fenilo substituído" representa grupos fenilo dissubstituídos, onde os substituintes são diferentes, por exemplo, 3-metil-4-hidroxifenilo, 3-cloro-4-hidroxifenilo, 2-metoxi-4-bromofenilo, 4-etil-2-hidroxifenilo, 3-hidroxi-4-nitrofenilo, 2-hidroxi-4-clorofenilo e similares. Os grupos fenilo substituídos preferidos incluem os grupos 2- e 3-trifluorometilfenilo, 4-fluoro ou clorofenilo, o 4-hidroxifenilo, o 2-aminometilfenilo e o 3-(N-(metilsulfonilamino))fenilo. O termo "arilalquilo" significa um, dois ou três grupos arilo possuindo o número de átomos de carbono designado, apensos a um radical alquilo possuindo o número de átomos de carbono designado, incluindo, sem estarem a estes limitados, benzilo, naftilmetilo, fenetilo, benzidrilo (difenilmetilo), tritilo e similares. Um grupo arilalquilo preferido é o grupo benzilo. O termo "arilCg-C^-alquiloCVCe substituído" representa um grupo alquiloC^Ce substituído em qualquer carbono com um grupo ariloC6-C12 ligado ao grupo alquilo através de qualquer posição do anel arilo e substituído na porção 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
21 alquiloC^Ce com um, dois ou três grupos seleccionados de entre halogéneo (F, Cl, Br, I), hidroxi, hidroxi protegido, amino, amino protegido, aciloxiCrC6, nitro, carboxi, carboxi protegido, carbamoílo, carbamoiioxi, ciano, alquiltioC^-Cg, N-(metilsulfonilamino), alcoxiC^Cg ou outros grupos especificados. Opcionalmente, o grupo arilo pode estar substituído com um, dois ou três grupos seleccionados de entre halogéneo (especialmente F), ciano, hidroxi, hidroxi protegido, nitro, alquiloC-i-Cg, alcoxiC^C^ carboxi, carboxi protegido, carboximetilo, carboximetilo protegido, hidroximetilo, hidroximetilo protegido, aminometilo, aminometilo protegido, ou um grupo N-(metilsulfonilamino). Como anteriormente, quando qualquer uma das porções alquiloCrC6 ou arilo, ou ambas, estiverem dissubstituídas, os substituintes podem ser iguais ou diferentes.
Exemplos do termo "arilC6-C10-alquiloCrC6 substituído" incluem grupos tais como 2-fenil-1 -cloroetilo, 2-(4-metoxifenil)etilo, 2,6-di-hidroxi-4-fenil(n-hexilo), 5-ciano-3-metoxi-2-fenil(n-pentilo), 3-(2,6-dimetilfenil)-n-propilo, 4-cloro-3-aminobenzilo, 6-(4-metoxifenil)-3-carboxi(n-hexilo), 5-(4-aminometilfenil)-3-(aminometil)(n-pentilo) e similares. A não ser onde especificado de outro modo, os termos "heterociclo", "grupo heterocíclico", "heterocíclico" ou "heterocídilo" são aqui usados indiferentemente e referem-se a qualquer anel mono-, bi-, ou triciclico, saturado, insaturado ou aromático, possuindo o número de átomos no anel designado onde pelo menos um anel é um anel hidrocarboneto com 5, 6 ou 7 membros contendo um número designado de heteroátomos seleccionados de entre azoto, oxigénio e enxofre, preferivelmente pelo menos um dos heteroátomos é azoto (Lang's Handbook of Chemistry, supra). O heterociclo é um anel hidrocarboneto de 5 ou 6 membros, saturado, insaturado ou aromático, contendo usualmente 1, 2 ou 3 heteroátomos, preferivelmente 1 ou 2, seleccionados de entre O, N e S. Tipicamente, o anel de 5 membros tem 0 a 2 ligações duplas e o anel de 6 ou 7 membros tem de 0 a 3 ligações duplas e os heteroátomos de azoto ou de enxofre podem estar opcionalmente oxidados, e qualquer heteroátomo de azoto pode estar opcionalmente substituído ou quarternizado. São incluídos na definição quaisquer grupos bicíclicos onde qualquer dos anéis heterocíclicos anteriores está fundido com um anel benzeno. Preferem-se os heterocíclicos nos quais o azoto é o heteroátomo.
Os sistemas de anel seguintes são exemplos dos radicais heterocíclicos (substituídos ou não substituídos) designados pelo termo "heterocíclico": tienilo, furilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, tiazolilo, isotiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, triazoliio, tíadiazolilo, oxadiazolilo, tetrazolilo, tiatriazolilo, oxatriazolilo, piridilo, · pirimidilo, pirazinilo, piridazinilo, tiazinilo, oxazinilo, triazinilo, tiadiazinilo, oxadiazinilo, ditiazinilo, dioxazinilo, oxatiazinilo, tetrazinilo, tiatriazinilo, oxatriazinilo, ditiadiazinilo, imidazolinilo, di-hidropirimidilo, tetra-hidropirimidilo, tetrazolo[1,5-
bjpiridazinilo e purinilo, bem como os derivados fundidos com benzeno, por exemplo, benzoxazolilo, benzotiazolilo, benzimidazolilo e indolilo.
Os sistemas de anel heterocíclico de 5 membros, contendo um átomo de enxofre ou de oxigénio e um a três átomos de azoto, são também adequados para utilização no presente invento. Exemplos destes grupos preferidos incluem tiazolilo, em particular tiazol-2-ilo e N-óxido de tiazol-2-ilo, tiadiazolilo, em particular 1,3,4-tiadiazol-5-ilo e 1,2,4-tiadiazol-5-ilo, oxazolilo, preferivelmente oxazol-2-ilo, e oxadiazolilo, tal como 1,3,4-oxadiazol-5-ilo e 1,2,4-oxadiazol-5-ilo. Um grupo de exemplos preferidos adicionais de sistemas de anel de 5 membros com 2 a 4 átomos de azoto inclui imidazolilo, preferivelmente imidazol-2-ilo; triazolilo, preferivelmente 1,3,4-triazol-5-ilo; 1,2,3-triazol-5-ilo, 1,2,4-triazol-5-ilo, e tetrazolilo, preferivelmente 1H-tetrazol-5-ilo. Um grupo preferido de exemplos de derivados fundidos com benzeno são benzoxazol-2-ilo, benzotiazol-2-ilo e benzimidazol-2-ilo.
Outros exemplos específicos adequados dos sistemas de anel heterocíclico anteriores são os sistemas de anel de 6 membros contendo um a três átomos de azoto. Estes exemplos incluem piridilo, tal como pirid-2-ilo, pirid-3-ilo e pirid-4-ilo; pirimidilo, preferivelmente pirimid-2-ilo e pirimid-4-ilo, triazinilo, preferivelmente 1.3.4- triazin-2-ilo e 1,3,5-triazin-4-ilo; piridazinilo, em particular piridazin-3-ilo, e pirazinilo. Os N-óxidos de piridina e os N-óxidos de piridazina e os radicais piridilo, pirimid-2-ilo, pirimid-4-ilo, piridazinilo e 1,3,4-triazin-2-ilo, são grupos preferidos. Os heterociclos de anel de 6 membros opcionalmente preferidos são: piperazinilo, piperazin-2-ilo, piperidilo, piperid-2-ilo, piperid-3-ilo, piperid-4-ílo, morfolino, morfolin-2-ilo e morfolin-3-ilo.
Um grupo opcional de "heterocíclicos" inclui: 1,3-tiazol-2-ilo, 4-(carboximetil)-5-metil-1,3-tiazol-2-ilo, sal de sódio de 4-(carboximetil)-5-metil-1,3-tiazol-2-ilo, 1,2,4-tiadiazol-5-ilo, 3-metil-1,2,4-tiadiazol-5-ilo, 1,3,4-triazol-5-ilo, 2-metil-1,3,4-triazol-5-iio, 2-hidroxi-1,3,4-triazol-5-ilo, sal de sódio de 2-carboxi-4-metil-1,3,4-triazol-5-ilo, 2-carboxi-4-metil-1,3,4-triazol-5-ilo, 1,3-oxazol-2-ilo, 1,3,4-oxadiazol-5-ilo, 2-metil- 1.3.4- oxadiazol-5-ilo, 2-(hidroximetil)-1,3,4-oxadiazoi-5-ilo, 1,2,4-oxadiazol-5-ilo, 1.3.4- tiadiazol-5-ilo, 2-tiol-1,3,4-tiadiazol-5-ilo, 2-(metiltio)-1,3,4-tiadiazol-5-ilo, 2-amino-1,3,4-tiadiazol-5-ilo, 1 H-tetrazol-5-ilo, 1 -metil-1 H-tetrazol-5-ilo, 1-(1-(dimetilamino)et-2-il)-1H-tetrazol-5-ilo, 1-(carboximetil)-1H-tetrazol-5-ilo, sal de sódio de 1-(carboximetil)-1H-tetrazol-5-ilo, 1-(ácido metilsulfónico)-1H-tetrazol-5-ilo, sal de sódio de 1-(ácido metilsulfónico)-1H-tetrazol-5-ilo, 2-metil-1 H-tetrazol-5-ilo, 1,2,3-triazol-5-ilo, 1 -metil-1,2,3-triazol-5-ilo, 2-metil-1,2,3-triazol-5-ilo, 4-metil-1,2,3-triazol-5-ilo, N-óxido de piríd-2-ilo, 6-metoxi-2-(N-óxido)-piridaz-3-ilo, 6-hidroxipiridaz-3-ilo, 1 -metilpirid-2-ilo, 1 -metilpirid-4-ilo, 2-hidroxipirimid-4-ilo, 1,4,5,6--tetra-hidro-5,6-dioxo-4-metil-as-triazin-3-ilo, 1,4,5,6-tetra-hidro-4-(formilmetil)-5,6-dioxo-as-triazin-3-ilo, 2,5-di-hidro-5-oxo-6-hidroxi-as-triazin-3-ilo, sal de sódio de 2,5-di-hidro-5-oxo-6-hidroxi-as-triazin-3-ilo, sal de sódio de 2,5-di-hidro-5-oxo-6-hidroxi-2-metil-as-triazin-3-ilo, 2,5-di-hidro-5-oxo-6-hidroxi-2-metil-as-triazin-3-ilo, % 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ ν/Ρ
23 2,5-di-hidro-5-oxo-6-metoxi-2-metil-as-triazin-3-ilo, 2,5-di-hidro-5-oxo-as-triazin-3-ilo, 2,5-di-hidro-5-oxo-2-metil-as-triazin-3-ilo, 2,5-di-hidro-5-oxo-2,6-di-metil-as-triazin-3-ilo, tetrazolo[1,5-b]piridazin-6-ilo e 8-aminotetrazolo[1,5-b]-piridazin-6-ilo.
Um grupo alternativo de "hetercíclicos" inclui: 4-(carboximetil)-5-metil-1,3-tiazol-2-ilo, sal de sódio de 4-(carboximetil)-5-metil-1,3-tiazol-2-ilo, 1,3,4-triazol-5-ilo, 2- metil-1,3,4-triazol-5-ilo, 1 H-tetrazol-5-ilo, 1 -metil-1 H-tetrazol-5-ilo, 1-(1-(dimetilamino)et-2-il)-1H-tetrazol-5-ilo, 1-(carboximetil)-1H-tetrazol-5-ilo, sal de sódio de 1-(carboximetil)-1H-tetrazol-5-ilo, 1-(ácido metilsulfónico)-1H-tetrazol-5-ilo, sal de sódio de 1-(ácido metilsulfónico)-1H-tetrazol-5-ilo, 1,2,3-triazol-5-ilo, 1,4,5,6-tetra-hidro-5,6-dioxo-4-metil-as-triazin-3-ilo, . 1,4,5,6-tetra-hidro-4-(2-formilmetil)-5,6-dioxo-as-triazin-3-ilo, sal de sódio de 2,5-di-hidro-5-oxo-6-hidroxi-2-metil-as-triazin- 3- ilo, 2,5-di-hidro-5-oxo-6-hidroxi-2-metil-as-triazin-3-ilo, tetrazolo[1,5-b]piridazin-6-ilo e 8-aminotetrazolo[1,5-b]piridazin-6-ilo.
Os termos "grupo heteroarilo" ou "heteroarilo" são aqui usados indiferentemente e referem-se a quaisquer anéis aromáticos mono-, bi-, ou tricíclicos possuindo o número de átomos no anel designado onde pelo menos um anel é um anel hidrocarboneto com 5, 6 ou 7 membros contendo de um a quatro heteroátomos seleccionados de entre azoto, oxigénio e enxofre, preferivelmente pelo menos um heteroátomo é azoto. A porção arilo do termo "heteroarilo" refere-se à aromaticidade, um termo conhecido dos peritos na arte e definido com maior pormenor em Advanced Organic Chemistry J. March,, 3a ed., págs. 37-69, John Wiley & Sons, New York (1985).
Os "isómeros ópticos", "diastereómeros" e "isómeros geométricos" de alguns dos compostos representados pelas fórmulas aqui descritas são entendidos como estando no âmbito do presente invento, bem como as formas racémicas e resolvidas enantiomericamente puras e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
Os "sais farmaceuticamente aceitáveis" incluem ambos os sais de adição de ácido e de base. "Sal de adição de ácido farmaceuticamente aceitável" refere-se aos sais que mantêm a eficácia e as propriedades biológicas das bases livres e que não são biologicamente ou de outro modo indesejáveis, formados com ácidos inorgânicos incluindo, mas sem estarem a estes limitados, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido sulfâmico, ácido nítrico, ácido fosfórico e similares, e com ácidos orgânicos tais como, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido málico, ácido maloneico, · ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido esteárico, ácido ascórbico, ácido benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfónico, ácido etanossulfónico, ácido isetiónico, ácido p-toluenossulfónico, ácido salicílico, aminoácidos de ocorrência natural e similares. 24 * 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ "Sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis" incluem os obtidos a partir de bases inorgânicas tais como sais de sódio, potássio, lítio, amónio, cálcio, magnésio, ferro, zinco, cobre, manganês, alumínio e similares. Os sais de amónio, potássio, sódio, cálcio e magnésio são particularmente preferidos. Os sais obtidos a partir de base orgânicas não tóxicas farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de aminas primárias, secundárias e terciárias, de aminas substituídas, incluindo aminas substituídas de ocorrência natural, de aminas cíclicas e resinas de permuta iónica básica, tais como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dietilaminoetanol, trimetamina, diciclo-hexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, etilenodiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperizina, piperidina, N-etilpiperidina, resinas de poliamina e similares. As bases não tóxicas orgânicas particularmente preferidas são isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetamina, diciclo-hexilamina, colina e cafeína.
De um modo geral, a não ser que se especifique de outro modo, as abreviaturas, usadas para a designação de aminoácidos e dos seus grupos protectores, são baseadas nas recomendações da Comissão de Nomenclatura Bioquímica da IUPAC-IUB (Biochemistry, 11:1726-1732 (1972)). Na Tabela 1 apresenta-se uma lista de símbolos ou abreviaturas vulgarmente usados (abr.) para descrever os compostos do presente invento.
Tabela I ABR J ESTRUTURA (SMILES) R/S I NOME COMUM DO COMPOSTO ! A NC(C)C(=0) S í L-alanina a NC(C)C(=0) R ! D-alanina Ab NCCCC(=0) ácido 4-aminobutírico Ac C(C=0) acetilo Abx NC2(CCCCC2)C(=0) ácido 1-amino-1-ciclo-hexano-carboxílico Ahp NCCCCCCC(=0) ácido 7-amino-heptanóico __ Ahx NCCCCCC(=0) ácido 6-amino-hexanóico amb NCc4ccc(cc4)C(=0) ácido p-aminometilbenzóico amF NC(C)(Cclcccccl)C(=0) S alfa-metil-L-fenilalanina apc N3CCC(N)CC3 1 -(4-aminopiperidina) api NC3CCNCC3 4-(4-aminopiperidina) _ Ava NCCCCC(=0) ácido 5-aminovalérico B NC(Cclcc2ccccc2cc1 )C(=0) S L-beta-naftilalanina __ b NC(Cc1 cc2ccccc2cc1 )C(=0) R D-beta-naftilalanina bA NCCC(=0) beta-alanina 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 25
Tabela ABR ESTRUTURA (SMILES) R/S NOME COMUM DO COMPOSTO bam NCCCCN 1 1,4-butanodiamina Bmn NC(Cclcc2ccccc2cc1 )CN S L-2-amino-3-(2-naftil)propilamina bmn NC(Cc1 cc2ccccc2cc1 )CN R D-2-amino-3-(2-naftil)propilamina BOC C(C)(C)0C(=0) ! terc-butoxicarbonilo Boi NC(Cclcc2ccccc2cc1 )CO S L-beta-naftilalanol boi NC(Cclcc2ccccc2cc1 )CO R D-beta-naftilalanol chA NC(CC1CCCCC1)C(=0) 3-ciclo-hexilanina chf NC(Cc1ccc(C1)cc1)C(=0) R D-4-cloro-fenilalanina cho C4CCC(CC4)C(=0) ácido ciclo-hexanocarboxílico cxa NC3CCC(N)CC3 trans-1,4-ciclo-hexanodiamina Cxp N4CCN(CC4)C(=0) ! 1-carboxipiperazina dam N(C)C N,N-dimetilamina F NC(Cc1 cccccl )C(=0) S L-fenilalanina f NC(Cc1 cccccl )C(=0) R D-fenilalanina fbd N(CCc1 cccccl )CCCCN N-(2-feniletil)butanodiamina feb N(CCc1 cccccl )CCC(=0) N-(2-feniletil)beta-alanina feg N(CCc1 cccccl )CC(=0) N-(2-feniletil)glicina fem NCCc1ccccc1 1-fenetilamina G NCC(=0) i glicina H NC(Cc1[nH]cnc1)C(=0) s L-histadina h NC(Cc1 [nH]cnc1 )C(=0) R D-histadina hcF NC(Cc1 cccccl )CC(=0) S 3-(S)-benzil-beta-alanina hF NC(CCc1 cccccl )C(=0) s homo-L-fenilalanina hf NC(CCc1 cccccl )C(=0) R homo-D-fenilalanina inip N4CCC(CC4)C(=0) ácido isonipecotico isog N4CC=C(CC4)C(=0) isoguvacina K NC(CCCCN)C(=0) S L-lisina k NC(CCCCN)C(=0) R D-lisina mab N(C)CCCC(=0) ácido N-metil-4-aminobutírico mam NC metilamina man NCCclcc2ccccc2cc1 N-(2-naftilmetil)amina mBm N(C)C(Cc1 cc2ccccc2ccl)CN S N-metil-[2-amino-3-(2- naftil)propil]amina mbm N(C)C(Cc1 cc2ccccc2cc1 )CN R N-metil-[2-amino-3-(2- naftil)propil]amina men N(C)CCc1 cc2ccccc2cc1 N-metil-2-(2-naftiletilamina) miz N(C)C(Cc1 cc2ccccc2cc1 )CN(=N)N R 2(R)-2-(N-metilamino)-1-azido-3- (2-naftil)propano 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
26 Tabela I 26
ABR ESTRUTURA (SMILES) R/S NOME COMUM DO COMPOSTO mor N1CCOCC1 ! morfolina Ν NC(CC(=0)N)C(=0) S L-asparagina η NC(CC(=0)N)C(=0) R D-asparagina nba NC(C)(C)CC(=0) ácido 3,3-dimetil-3-aminopro-piónico nbol N(C)C(Cc1 cc2ccccc2cc1 )CO S N-metil-D-beta-naftilalanol nL NC(CCCC)C(=0) S L-norleucina nl NC(CCCC)C(=0) R D-norleucina nmB N(C)C(Cc1 cc2ccccc2cc1 )C(=0) S N-metil-L-beta-naftilalanina nmb N(C)C(Cc1 cc2ccccc2cc1 )C(=0) R N-metil-D-beta-naftilalanina nmF N(C)C(Cc1ccccc1)C(=0) S N-metil-L-fenilalanina nmK N(C)C(CCCCN)C(=0) S N-metil-L-lisina npA NC(Cc1 c2ccccc2ccc1 )C(=0) S L-alfa-naftilalanina npa NC(Cc1 c2ccccc2ccc1 )C(=0) R D-alfa-naftilalanina npe NCCcl cc2ccccc2cc1 2-(2-naftil)etilamina 0 NC(CCCN)C(=0) S L-ornitina 0 NC(CCCN)C(=0) R D-ornitina P N1C(CCC1)C(=0) S L-prolina P N1C(CCC1)C(=0) R D-prolina pac n4ccc(cc4)CC(=0) í ácido piridino-4-acético pam NCCCCCN I 1,5-pentanodiamina Pg NC(c1ccccc1 )C(=0) S L-fenilglicina pG NC(c1 cccccl )C(=0) R D-fenilglicina Pol NC(Cc1 ccccd )CO s L-fenilalanol ppc N1 CCC(C0)C(=0) ácido piperidino-4-carboxílico ppz N3CCNCC3 piperazina pyc n4ccc(cc4)C(=0) ácido piridino-4-carboxílico ram NCCCN ! 1,3-propanodiamina S NC(C0)C(=0) S L-serina tam NCCN 1,2-etanodiamina tbm NC(C)(C)C terc-butilamina tic N7C(Cc8ccccc8C7)C(=0) S D-tetra-hidroisoquinolina Tic N7C(Cc8ccccc8C7)C(=0) R L-tetra-hidroisoquinolina W NC(Cc1 [nH]c2ccccc2c1 )C(=0) S L-triptofano w NC(Cc1 [nH)c2ccccc2c1 )C(=0) R D-triptofano wol NC(Cc1 [nH]c2ccccc2c1 )CO R D-triptofanol Y NC(Cc1ccc(0)cc1)C(=0) S L-tirosina y NC(Cdccc(0)cc1)C(=0) R D-tirosina 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 27
Tabela I
! ABR
ESTRUTURA (SMILES) R/S NOME COMUM DO COMPOSTO S 3-iodo-L-tirosina Y(l) NC(Cc1ccc(Q)c(l)c1 )C(=Q)
Notas: ; a) As estruturas anteriores são ilustradas no formato SMILES ("SMILES, 1. Introduction to Encoding | Rules" Weinenger, D. J. Chem. Inf. Comput. Sei. 1988, 28, 31.). Estas são geralmente escritas do terminal ! N para o terminal C com os pontos de ligação nos átomos do lado esquerdo e/ou direito dependendo da i posição na sequência. Nos casos onde a ligação é ambígua, são usados dois acrónimos diferentes para j ilustrar os dois modos se se utilizarem ambos. I b) Deve ser entendido que, quando ligado numa posição terminal, a função do terminal C apropriada indicada na tabela (isto é, -OH, -NH2, -OMe) é adicionada para completar a estrutura (ácido, amida, éster de Me, respectivamente). Também devem ser adicionados átomos de hidrogénio às funções amina I terminais para preencher a valência._ B. Utilidade
Os compostos com a Fórmula I podem ser administrados a mamíferos, incluindo o Homem, para libertar a hormona de crescimento endógena in vivo. Por exemplo, os compostos podem ser administrados a mamíferos comercialmente importantes, tais como suínos, bovinos e ovinos, e similares, para acelerar e aumentar a sua taxa e extensão de crescimento e a eficiência da sua conversão de alimentos em tecido corporal, e para aumentar a produção de leite destes mamíferos. Adicionalmente, estes compostos podem ser administrados a humanos in vivo como uma ferramenta de diagnóstico para determinar se a pituitária é ou não capaz de libertar hormona de crescimento. Os compostos com a Fórmula I podem ser administrados in vivo a adultos e a crianças para estimular a libertação de hormona de crescimento.
Deste modo, o presente invento inclui no seu âmbito composições farmacêuticas compreendendo, como ingrediente activo, pelo menos um dos compostos com a Fórmula I em associação com um transportador ou diluente farmacêutico. Opcionalmente, o ingrediente activo de composições farmacêuticas pode compreender um agente de promoção do crescimento para além de pelo menos um dos compostos com a Fórmula I.
Os agentes de promoção de crescimento incluem, mas sem estarem a estes * limitados: TRH, dietilstilbestrol, teofilina, encefalinas, prostaglandinas da série E, péptidos da familia VIP-secretina-glucagon-GRF e outros secretagogos de hormona de crescimento, tais como o GHRP-6 e o GHRP-1, conforme descrito na Patente dos E.U.A. n° 4 411 890; lactamas fundidas com benzo tais como as
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reveladas na Patente dos E.U.A. n° 5 206 235; e a hormona de libertação da hormona de crescimento (GHRH) e seus análogos ou hormona de crescimento (GH) e seus análogos, ou somatomedinas incluindo IGF-1 e IGF-2 e seus análogos.
Os compostos do presente invento mostraram induzir a libertação de hormona de crescimento e de IGF-1. É conhecido dos peritos da arte que existem muitas utilizações para a hormona de crescimento e para os IGF. Deste modo, a administração dos compostos do presente invento, para efeitos do estímulo da libertação da hormona de crescimento endógena ou do IGF-1, pode ter os mesmos efeitos ou utilizações que as próprias hormona de crescimento ou somatomedinas. Estas utilizações da hormona de crescimento e do IGF-1 incluem as seguintes; estímulo da libertação da hormona de crescimento em humanos idosos; prevenção dos efeitos colaterais catabólicos dos glucocorticóides, tratamento da osteoporose, estímulo do sistema imunitário, tratamento de atrasos, aceleração da cicatrização de feridas, aceleração da reparação de fracturas ósseas, tratamento de atrasos de crescimento, tratamento da falência ou insuficiência renal resultando em atraso de crescimento, tratamento da baixa estatura fisiológica, incluindo de crianças deficientes em hormona de crescimento, tratamento de baixa estatura associada a doenças crónicas, tratamento da obesidade e de atrasos de crescimento associados à obesidade, tratamento de atrasos de crescimento associados com o síndroma de Prader-Willi e com o síndroma de Turner; aceleração da recuperação e redução da hospitalização de pacientes queimados; tratamento de atrasos de crescimento intra-uterino, displasia esquelética, hipercortisolismo e síndroma de Cushings; indução da libertação por impulsos da hormona de crescimento; substituição de hormona de crescimento em pacientes sofrendo de "stress"; tratamento de osteocondrodisplasias, síndroma de Noonans, esquizofrenia, depressão, doença de Alzheimer, doenças de desmeilinação, esclerose múltipla, cicatrização retardada de feridas e privação psicossocial; tratamento de disfunção pulmonar e da dependência de ventilador; atenuação da resposta catabólica de proteínas após uma operação importante; redução da cachexia e da perda de proteínas devida a doenças crónicas tais como o cancro ou a SIDA; tratamento da hiper-insulinemia, incluindo a diabetes do Tipo II; tratamento auxiliar para a indução da ovulação; estímulo do desenvolvimento tímico e prevenção do declínio, relacionado com a idade, da função tímica; tratamento de paciente imunossuprimidos; tratamento de pacientes transplantados de medula óssea, melhoria da resistência muscular, da mobilidade, doenças da função muscular, distrofia muscular, manutenção da espessura de pele, hemostáse metabólica, melhoria da função renal e da hemostáse incluindo falência renal aguda e crónica, estímulo de osteoblastos, remodelação óssea, e crescimento da cartilagem; * estímulo do sistema imunitário em animais de companhia; promoção do crescimento em gado incluindo estimulo da produção de leite em ruminantes e do crescimento da lã ou do pelo.
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Uma utilização alternativa dos GHRP do presente invento, representados pelas fórmulas l-V, bem como de outros GHRP como aqui se definiram incluindo, mas sem estarem a estes limitados, GHRP-6 e GHRP-1, conforme se descreve na Patente dos E.U.A. n° 4 411 890; GHRP-2; GHRP de lactama fundida com benzo tais como os revelados na Patente dos E.U.A. n° 5 206 235; consiste na sua utilização, em combinação com IGF-1, para tratar doenças para as quais é indicado um tratamento de longa duração com IGF-1. Esta utilização dos GHRP consiste em trazer os níveis de GH no soro para o normal, quando a terapia de IGF-1 de longa duração regula para baixo a secreção de GH de pituitária. Esta utilização inclui, mas não está a esta limitada, a utilização no tratamento da diabetes do Tipo II.
Outras utilizações dos presentes compostos serão evidentes a partir das referências seguintes: Amato et ai, Journal of Clinicai Endocrinology and Metabolism 77(6):1671-1676 (1993), Bengtsson et ai, Journal of Clinicai Endocrinology and Metabolism 76(2):309-317 (1993), Binnerts et ai, Clinicai Endocrinology 37:79-87 (1992), Bowers, Journal of Clinicai Endocrinology and Metabolism 76(4):817-823 (1993), Cuneo et ai, J. Applied Physioi 70(2):688-694 (1991), Cuneo et ai, J. Applied Physioi 70(2):695-700 (1991), Degerblad et ai, Acta Endocrinologica 126:387-93 (1992), Edén et ai, Arteriosclerosis and Thrombosis 13(2):296-301 (1993), Hartman et ai, Horm Res 40:37-47 (1993), Ho et ai, Horm Res 40:80-86 (1993), J0gensen et ai, Acta Endocrinologica 125:449-453 (1991), J0gensen et ai, The Lancet June 3:1221-1224 (1989), Lamberts et ai, Clinicai Endocrinology 37:111-115 (1992), McGauley et ai, Horm Res 33(suppl 4): 52-54 (1990), M0ller et ai, Clinicai Endocrinology 39:403-408 (1993), 0'Halloran et ai, Journal of Clinicai Endocrinology and Metabolism 76(5):1344-1348 (1993), Orme et ai, Clinicai Endocrinology 37:453-459 (1992), Rodriguez-Amao et ai, Horm Res 39:87-88 (1993), Rosén et ai, Clinicai Endocrinology 40:111-116 (1994), Rosén et ai, Acta Endocrinologica 129:195-200 (1993), Rudman et ai, The New England Journal of Medicine 323(1):1-6 (1990), Salomon et ai, The New England Journal of Medicine 321(26):1797-1803 (1989), Shibasaki et ai, Journal of Clinicai Endocrinology and Metabolism 58(1):212-214 (1984), Sõnksen et ai, Acta Paediatr Scand [Suppl] 379:139-146 (1991), Tauber et ai, Journal of Clinicai Endocrinology and Metabolism 76(5): 1135-1139 (1993), Vandeweghe et ai, Clinicai
Endocrinology 39:409-415 (1993), Whitehead et ai, Clinicai Endocrinology 36:45-52 (1992), e Bercu et ai, Patente dos E.U.A. n° 5 246 920.
Adicionalmente, os compostos mais potentes do presente invento podem ser usados como antagonistas de GH. É conhecido que as hormonas hipotalamicas que são super-agonistas podem também ser usadas como antagonistas. Por exemplo, os super-agonistas de Hormona de Libertação da Gonadotrofina (GnRH) * tais como o GONADORELIN e o LEUPROLIDE actuam, quer como agonistas, quer como antagonistas, dependendo do método de administração. As acções dos super-agonistas de GnRH são resumidas em Goodman e Gilmans, The Pharmacological Basis of Therapertics, 8th Ed., McGraw Hill Inc., p. 1353 (1993).
Por analogia, crê-se que a administração contínua dos compostos com as fórmulas l-V conduzirá a uma regulação para baixo da resposta de crescimento. Deste modo,, estas moléculas podem ser usadas como antagonistas funcionais da secreção de GH de pituitária, antagonizando desse modo a acção da GH ou do IGF-1.
As utilizações destes antagonistas da secreção de GH incluem, sem estarem a estes limitados: tratamento da secreção de GH em excesso tal como na acromegalia ou gigantismo; no cancro da mama, do colón e da próstata; em diabetes especialmente em pacientes adolescentes do Tipo I para contrariar o fenómeno de Dawn; e em pacientes do Tipo I e do Tipo II para controlar directamente a glucose no sangue e para controlar os efeitos de longo prazo da diabetes, tal como por exemplo na retinopatia.
Os compostos do presente invento podem ser administrados pelas vias de administração oral, parentérica (tal como por injecção ou infusão intramuscular, intraperitoneal, intravenosa ou subcutânea, ou implante), nasal, pulmonar, vaginal, rectal, sublingual ou tópica, e podem ser formulados em formas de dosagem apropriadas para cada via de administração. C. Métodos de Preparação 1. Síntese Geral de Péptidos
Um método para a produção de GHRP envolve a síntese química do "polipéptido". Esta pode ser realizada usando metodologias bem conhecidas dos peritos na arte (ver Stewart, J. M. & Young, J. D. Solid Phase Peptide Synthesis Pierce Chemical Co. Rockford, IL[1984]; ver também Patentes dos E.U.A. n° 4 105 603; 3 972 859; 3 842 067 e 3 862 925).
Os "polipéptidos" do invento podem ser convenientemente preparados usando a síntese de péptidos em fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149 [1964]; Houghten, Proc. Natl. Acal. Sei. USA 82:5132 [1985]). A síntese em fase sólida inicia-se no terminal carboxi do péptido putativo por acoplamento de um aminoácido protegido a uma resina adequada (tal como resina de poliestireno clorometilada) conforme se mostra nas Figuras 1-1 e 1-2, nas páginas 2 e 4 de Stewart e Young supra. Após remoção do grupo protector de. α-amino, por exemplo, com ácido trifluoroacético (TFA) em diclorometano, e neutralização, por exemplo, em TEA, é adicionado na síntese o aminoácido seguinte com o α-amino e com a cadeia lateral protegidos. Os aminoácidos restantes, com o α-amino e, se> necessário, com a cadeia lateral protegidos, são depois acoplados sequencialmente por condensação, na ordem desejada, para obter um composto intermediário ligado à resina. Alternativamente, alguns aminoácidos podem ser
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acoplados uns aos outros formando um péptido antes da adição do péptido à cadeia polipeptídica crescente em fase sólida. A condensação entre dois aminoácidos ou entre um aminoácido e um péptido ou entre um péptido e um péptido pode ser realizada de acordo com os métodos de condensação usuais, tais como o método da azida, o método do anidrido de ácido misto, os métodos da DCC (Ν,Ν'-diciclo-hexilcarbodi-imida) ou da DIPC (Ν,Ν'-di-isopropilcarbodi-imida), o método do éster activo, o método do éster de p-nitrofenilo, o método do BOP [hexafluorofosfato de benzotriazolo-1-il-oxi-tris(dimetilamino)fosfónio], o método do éster de imido do ácido N-hidroxissuccínico, etc, e o método do reagente K de Woodward. É comum às sínteses químicas de péptidos a protecção de quaisquer grupos reactivos de cadeia lateral dos aminoácidos com grupos protectores adequados. Finalmente, estes grupos protectores são removidos após a cadeia polipeptídica desejada ter sido sequencialmente montada. É também comum a protecção do grupo α-amino num aminoácido ou num fragmento, enquanto essa entidade reage no grupo carboxilo, seguida pela remoção selectiva do grupo protector de a-amino para permitir que a reacção subsequente ocorra nessa localização. Deste modo, é comum na síntese de polipéptidos produzir um composto intermediário que contém cada um dos resíduos de aminoácido localizados, na sequência desejada, na cadeia peptídica com vários destes resíduos possuindo grupos protectores de cadeia laterais ligados. Estes grupos protectores são depois vulgarmente removidos, substancialmente ao mesmo tempo, para produzir o produto resultante desejado após remoção da resina.
Os grupos protectores adequados para a protecção dos grupos a- e ε-amino de cadeia lateral são exemplificados por benziloxicarbonilo (CBZ), isonicotiniloxicarbonilo (iNOC), O-clorobenziloxicarbonilo (2-CI-CBZ), p-nitrobenziloxicarbonilo [Z(N02)], p-metoxibenziloxicarbonilo [Z(OMe)], t-butoxicarbonilo (BOC), t-amiloxicarbonilo (AOC), isoborniloxicarbonilo, adamatiloxicarbonilo, 2-(4-bifenil)-2-propiloxicarbonilo (BPOC), 9-fluorenilmetoxicarbonilo (FMOC), metilsufoniletoxicarbonilo (Msc), trifluoroacetilo, ftalilo, formilo, 2-nitrofenilsulfenilo (NPS), difenilfosfinotioilo (Ppt), dimetilofosfinotioilo (Mpt) e similares.
Os grupos protectores para o grupo funcional carboxi são exemplificados por: éster de benzilo (OBzl), éster de ciclo-hexilo (Chx), éster de 4-nitrobenzilo (ONb), éster de t-butilo (OtBu), éster de 4-piridilmetilo (OPic) e similares. É frequentemente desejável que aminoácidos específicos, tais como arginina, cisteína e serina, possuindo outros grupos funcionais para além dos grupos amino e carboxilo, sejam protegidos por um grupo protector adequado. Por exemplo, o grupo guanidino da arginina pode ser protegido com nitro, p-toluenossulfonilo, benziloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, p-metoxibenzenossulfonilo, 4-metoxi-2,6-
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dimetilbenzenossulfonilo (Mds), 1,3,5-trimetilfenilsulfonilo (Mts), e similares. O grupo tiol da cisteína pode ser protegido com p-metoxibenzilo, trifenilmetilo, acetilaminometilo, etilcarbamoílo, 4-metilbenzilo, 2,4,6-trimetilbenzilo (Tmb), etc., e o grupo hidroxilo da serina pode ser protegido com benzilo, t-butilo, acetilo, tetra-hidropiranilo e similares.
Stewart e Young supra proporcionam uma informação detalhada em relação a procedimentos para a preparação de péptidos. Nas páginas 14-18 descreve-se a protecção de grupos α-amino e nas páginas 18-28 descreve-se o bloqueamento da cadeia lateral. Nas páginas 149-151 é apresentada uma tabela de grupos protectores para funções amina, hidroxilo e sulfidrilo.
Após a sequência de aminoácidos desejada estar completa, o péptido intermediário é removido do suporte de resina por tratamento com um reagente, tal como HF líquido e um ou mais sequestrantes contendo tio, que não apenas fazem a clivagem do péptido da resina, como também clivam todos os grupos protectores de cadeia lateral restantes. Após a clivagem com HF, o resíduo de péptido é lavado com éter e extraído a partir da resina por lavagem com acetonitrilo aquoso e ácido acético.
Preferivelmente, de modo a evitar a alquilação dos resíduos no polipéptido (por exemplo, alquilação dos resíduos metionina, cisteína e tirosina) usa-se uma mistura sequestrante de tio-cresol e cresol. 2. Outros Procedimentos Gerais
Os compostos peptidomiméticos do presente invento podem também ser convenientemente preparados pelos métodos para a síntese de péptidos descritos em monografias (tais como "Principies of Peptide Synthesis, M. Bõdanszky, Springer-Verlag, 2a Ed., 1993; "Synthetic Peptides: A Users Guide", G. A. Grant, Ed, W. H. Freeman and Co., 1992; e referências aí citas), ou por quaisquer outros métodos geralmente conhecidos de um perito na arte. A síntese de compostos do presente invento que são de natureza peptidomimética (isto é, que contêm outras ligações para além das ligações peptídicas padrão) podem ser preparados por extensão dos métodos descritos nos Exemplos específicos 1-37 e nos métodos apresentados nos Esquemas l-IV seguintes, pelos métodos de síntese gerais descritos em "Comprehensive Organic Transformations”, R. C. Larock, VCH Publishers, 1989, e por métodos geralmente conhecidos dos peritos na arte.
Para os compostos da reivindicação 1, onde as ligações peptídicas * (-C(=0)-NH-) estão substituídas por ligações isostere de amida tais como: -CH2-NH-, -CH2-S, -CH2-CH2-, -CH=CH- (cis e trans), -C(=0)-CH2-, -CH(OH)-CH2-, -CH(CN)-NH-, -0-C(=0)-NH- e -CH2-SO-, são utilizados métodos de substituição da ligação peptídica conhecidos na arte. As referências seguintes descrevem a 33 85 455 ΊΡ ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ preparação de ligações isostere de amida que incluem estas porções de ligação alternativa: Spatola, A. F., Vega Data 1(3): "Peptide Backbone Modifications" (General Review) (Mar 1983), Spatola, A. F., em "Chemistry and biochemistry of Amino Acids Peptides and Proteins", B. Weinstein, ed., Mareei Dekker, New York, p.267 (1983); Morley, J. S., Trends Pharm. Sei. pp. 463-468; Hudson, D. et ai., tnt. J. Pept. Prot. Res. 14:177-185 (1979) (-CH2NH-, -CH2CH2-); Spatola, A. F., et ai, Life Sei. 38:1243-1249 (1986) (-CH2-S-); Hann, Μ. M., J. Chem. Soe. Perkin. Trans. I 307-314 (1982) (-CH=CH-, cis e trans); Almquist, R. G., et ai, J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980) (-C(=0)-CH2-); Jennings-White C., et ai, Tetrahedron Lett. 23: (1982) (-C(=0)-CH2-); Szelke, M., et ai, Pedido de Patente Europeia N° 45665 (1982) Chem. Abs: 9739405 (1982) (-CH(OH)-CH2-); Holladay, M. W., et ai, Tetrahedron Lett. 24:4401-4404 (1983) (-C(OH)-CH2-); Hruby, V. J. Life Sei. 31:189-199 (1982) (-CH2S-); e Cho, C. Y. et ai, Science 261:1303-1305 (1993) (-0-C(=0)-NH-).
Os compostos das Reivindicações 2-5 são preparados especificamente pelos métodos descritos nos Esquemas l-IV. O grupo amino do terminal N é mostrado como ácido isonipecótico para ser mais claro, mas é entendido que os compostos do presente invento com outros grupos (RA) nesta posição são preparados por substituição do ácido isonipecótico protegido, no esquema, pelo reagente apropriadamente protegido. De um modo geral, podem-se usar vários métodos para acoplamento dos componentes tais como ésteres activos pré-formados, cloretos de ácido e reagentes de acoplamento. As ligações que não de amidas, por exemplo, alquilação, acilação e sulfonilação, podem ser realizadas usando os reagentes apropriadamente activados e os métodos descritos em "Comprehensive Organic Transformations", R. C. Larock, VCH Publishers, (1989). 3. Esquemas Específicos
Como se mostra no Esquema I, os aminoácidos protegidos do tipo 1 podem ser alquilados de acordo com o procedimento de Benoitin (Can. J. Chem. 55, 906, 1977) para dar uma variedade de compostos N-substituídos (2).
1) EtOCOCI, Et3N, THF__ 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 34
Esquema I
Ar ^<λΛ0Η
1) NaH, Rb-I
Ar' I ? ;/ R> ° 2
2) NaBHU ,Ar’ 1)P(Ph)3,HN3 "4 X 1_oh O í
Ar'
DEAD, THF 2) TFA 3) DCC. NMM BOC BOC- CK ρβ
1) H2. Pd/C 2) Ar^L-COCI, EUN
Ar' O { F?c ^Λν^ν^ο OH ror RC * H:
TFA BOC- JO i
Ar’ NaH, Rc-I HNs_/ pa
Ar1 0 i RCΛ..Α *v
Ra
1) Ha. Pd/C BOC’
2) Ar1-L2-S02CI. Et3N
6, Ilc Ar' o / η V BOC' ο' V Àr
For Rc * H: TFA NaH, Rc*l
Ar28. Ilc
Para produzir compostos de amida reduzidos ou invertidos do Tipo ilc (Reivindicação 3), (2) pode ser reduzido através de um anidrido misto pré-formado com boro-hidreto de sódio para dar os aminoalcoóis protegidos (3). A conversão da função hidroxilo numa amina pode ser realizada via acoplamento de Mitsunobu de (3) com ácido hidrazóico para dar uma amino-azida protegida intermediária. O desbloqueamento da função amino e acoplamento ao grupo N-terminal é * convenientemente realizado nesta fase diferenciada. Neste exemplo, o N-BOC é removido com TFA e a amino-azida de base livre resultante é acoplada ao ácido N-BOC-isonipecótico usando o reagente DCC para dar (4).
A azida intermediária (4) pode ser convertida numa variedade de compostos do presente invento. Por exemplo, a hidrogenação da função azido proporciona uma amina que pode ser acilada com uma variedade de grupos, por exemplo, Ar1-L2-COCI para dar (5) (Esquema I). Para a síntese da gama de grupos L2 aqui reivindicada deve ser entendido que o Ar1-L2-COCI pode estar substituído com uma variedade de agentes de acilação diferentes tais como cloro, carbonatos, ésteres activados, isocianatos e semelhantes. Por exemplo, podem-se usar cloreto de 2-naftoílo, cloroformato de benzilo, cloreto de fenilacetilo, cloreto de di-hidrocinamoílo e isocianato de fenilo para proporcionar compostos (6) com uma gama de ligantes L2. A desprotecção global proporciona depois 6, para Rc = Η. A incorporação da substituição de N, Rc, em (5), pode ser realizada por alquilação de (5), por exemplo, por desprotonação com hidreto de sódio e reacção com um halogeneto de alquilo. Por desprotecção obtém-se (6) (R0^ H).
Para a síntese de compostos de N-sulfonamido, a amina produzida por redução de (4) pode ser sulfonilada, alternativamente alquilada no azoto (para Rc^ H)e desprotegida para dar (8).
Para a síntese de compostos (6) e (8) onde R3 = H e Rc * H, pode ser mais conveniente incorporar o substituinte Rc através de uma aminação redutiva. Por exemplo, usando um equivalente de um aldeído apropriado e cianoboro-hidreto de sódio, o Rc pode ser introduzido na amina a partir da redução de (4), antes da acilação ou sulfonilação para dar (6) ou (8), respectivamente.
Os compostos llc (reinvindicação 3) em que X = H, alquilo, alquilo substituído e semelhantes, podem ser sintetizados através da via que se mostra no Esquema M.
Esquema M 1) HN(OMe)Me. Ar' I 0 ( R» 0 BOP, HOBt 2) DIBAL NaCNBH3, pH 6 R* ^ 9 10 Ar' or: 2)
1) TFA 2) DCC. NMM
11, llc 1) TsCI, piridina 3
Os aminoácidos protegidos intermediários (1) ou (2) (do Esquema I) são convertidos nos amino-aldeídos protegidos (9), convenientemente através de redução com DIBAL da N-metil-N-metoxiamida derivada. Por aminação redutiva subsequente com uma amina apropriadamente substituída obtém-se (10). Alternativamente, (10) pode ser preparado a partir de (3) por conversão do álcool num tosilato ou noutro grupo rejeitável adequado, e deslocamento com uma amina apropriadamente substituída (Esquema II). Será evidente que, para formar (10), se podem usar nestas duas vias uma grande variedade de aminas, incluindo triptamina, N-metil-(2-naftil)etilamina, alfa-metilfenetilamina, triptofanol e N-metil-beta-naftilalanol. A amina pode também ser parte de um heterociclo, isto é, 2-benzil- ou naftilmetilpiperidina.
Esta estratégia de aminação redutiva é um método geral para incorporação de um isostere de amida reduzida numa cadeia de poliamida. Deste modo, a substituição de um derivado de aminoácido ou péptido apropriadamente protegido com uma alfa-amina livre, para o componente de amina no Esquema II (9) para (10) proporciona um intermediário, de isostere de amida reduzido, protegido. Deste modo, os compostos do tipo exemplificado na Reinvindicação 8, lllb-llle, podem ser preparados usando os grupos protectores ortogonais apropriados para a funcionalidade reactiva. Este método pode também ser utilizado quando o componente de amina está ligado a um suporte sólido, adequado para a síntese de péptidos, proporcionando um método conveniente para a síntese de compostos peptídicos mais compridos. A conclusão da síntese de compostos do Tipo 11 (Esquema II) (e, por analogia, dos compostos da reivindicação 8, lllb-llle), requer a desprotecção do grupo amino e o acoplamento a uma porção N-terminal apropriadamente protegida, mostrada no Esquema II como N-R1-ácido isonipecótico para efeitos de clareza. Dependendo dos substituíntes particulares X, RB e Rc em (10), pode ser necessário proteger ortogonalmente a funcionalidade reactiva antes da remoção do grupo bloqueador N-terminal. Por exemplo, para (10) (Rc = X = H) a amina secundária em (10) pode ser acilada com FMOC-CI (por exemplo, Rc = FMOC) antes da remoção do BOC N-terminal. Isto assegura que a acilação subsequente apenas ocorre na amina terminal.
Será de notar que, ao intermediário desprotegido (10), pode ser ligada uma grande variedade de grupos N-terminais. Qualquer aminoácido adequadamente protegido, isto é, ácido BOC-4-aminobutírico, ácido N-alquil-isonipecótico, pode ser ligado usando um reagente de acoplamento convencional. Podem-se também usar ésteres activos, anidridos e cloretos de ácido, protegidos. Para a síntese de * ligações do tipo ureia, pode-se fazer reagir o intermediário desprotegido (10) com carbonildi-imidazole ou com fosgénio, seguido da adição de uma amina adequadamente protegida ou simétrica. Em particular, a reacção com piperazina, 37 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ com propanodiamina ou com N1 ,N4-dimetilpropanodiamina, proporciona os compostos preferidos.
Para a síntese de compostos com uma ligação carbamato N-terminal, pode-se fazer reagir o intermediário desprotegido (10) (Rc φ H) com carbonildi-imidazolo ou com fosgénio, seguido da adição de um aminoálcool adequadamente N-protegido, tal como BOC-aminoetanol, BOC-aminopropanol e BOC-2 ou 3-hidroxipiperidina. Alternativamente, pode-se fazer reagir o intermediário desprotegido (10) directamente com um cloroformato N-bloqueado pré-formado. O passo final necessário para a conclusão da síntese dos compostos do tipo 11 é a remoção da funcionalidade protectora usando as condições apropriadas (para uma monografia geral sobre grupos protectores, ver Greene, W. T., Wuts, P. G. M. Protective Groups in Organic Systhesis, 2a Ed., John Wiley & Sons, NY [1991]).
Será de notar que estes métodos para a incorporação de diferentes grupos N-terminais (isto é RA) são geralmente aplicados aos compostos do presente invento e não estão limitados ao exemplo particular do Esquema II.
As sínteses dos compostos peptidomiméticos da Reivindicação 3, lld-llg, são a seguir apresentadas nos Esquemas lll-VI. Para a síntese de Md (Esquema III), o aminoácido protegido (2) ou (1 para RB = H) é convertido no éster de metilo homólogo através de um rearranjo da diazocetona com Ag(l) em metanol.
Esquema III o
Ar / ^'o'JÍ"nayOH 6
1) EtOCOCI. Et3N. THF
Ar , 9 { 2) 1) TsCl, piridina
13 1) TFA 2) DCC, NMM,
2) CH-N, r® 3) AgOÓOPh, MeOH 4) NaBK* 12
14. Ild A redução do éster proporciona o álcool (12) que, quando convertido num * tosilato ou num grupo rejeitável similar, pode ser deslocado por uma grande gama de aminas substituídas, tal como é exemplificado pela conversão de 3 em 10 (Esquema II). A desprotecção do produto (13) e a acilação proporcionam (14) após desprotecção. 38 38 •jí|‘,C'j£ €?t' <?" 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
Os compostos do tipo lie podem ser preparados como se mostra no Esquema IV.
Esquema IV
BC C
ArI^N.R= *CHfiOCl H Et3N 15
1) EtOCOCl, Et3N, THF 18
ArOH^Hj 17
Ar*
2) CHjNa 3) AgOCOPh. MeOH 4) aq NaCH
BOC
2) irA ,R 3) ’Η-Ι (opcional)
1) 17. DCC. NMM
Ar
20, lie A amina substituída (15) é acilada com brometo de bromoacetilo para dar (16), que se faz reagir com uma segunda amina para dar (17). Por acilação com uma porção N-terminal apropriada obtém-se (20). Por exemplo, um terminal N preferido, 4-carboximetilpiperidina (19), é preparado por homologação de ácido BOC-isonipecótico (18), e acilado em (17) com DCC. Por desprotecção e alquilação opcional do terminal amina obtém-se (20). A aminação redutiva com um aldeído apropriado é um método alternativo para a incorporação dos substituintes R1 na amina terminal. Este é um método geralmente aplicável, útil para muitos compostos do presente invento.
Os compostos do tipo llf (Esquema V) podem ser preparados a partir de (17) via redução com LAH da funcionalidade de amida. Por acilação com (19), desprotecção e N-alquilação opcional obtém-se (21).
Esquema V
Rc
Ar1 2 3
1) LAH, THF
Ar1 ( ΟΤΎ 21, llf
Os compostos pseudo-simétricos do tipo llg são preparáveis através da via que se mostra no Esquema VI. A conversão da arilamina (22) em (23) é análoga à preparação de (17) anterior. 1
19, DCC, NMM 2
TFA 3 1R-I (opcional)
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Esquema VI
1) BrCHjCOCl Ar^NH2 Eí3N
Ar’.
1) LAH 2) 19, DCC, NMM i \ 23 ( 2) Ar,CH2NH2
Ar 3) TFA 4) ’R-I (opcional) ’R-
Ar'
24, tlg ? rr
Ar2 A redução com LAH proporciona uma etanodiamina substituída, simétrica ou não simétrica, que é acilada simultaneamente em ambos os azotos com 19 ou com outro reagente apropriado. Por desbloqueamento como anteriormente obtém-se (24). D. Concretizações Preferidas O presente invento é baseado na identificação de várias novas classes de peptidomiméticos pequenos que provocam a libertação da hormona de crescimento em mamíferos. É um objectivo preferido do presente invento proporcionar agentes que são selectivos para a libertação de GH e que possuem uma segurança e uma eficácia adequadas para administração crónica a mamíferos. Numa concretização mais preferida, o presente invento proporciona compostos que são adequados para entrega oral, intranasal ou pulmonar. É um objectivo das concretizações mais preferidas do presente invento, proporcionar compostos que sejam superiores aos da arte anterior pelos critérios anteriores. Adicionalmente, prefere-se que os compostos sejam facilmente sintetizáveis numa forma opticamente pura quando necessário.
Em face do anterior, os compostos preferidos do presente invento possuem uma EC50, no ensaio de células "pit" de rato, inferior a cerca de 1,0 nM e, muito preferivelmente, inferior a cerca de 0,5 nM. Os compostos preferidos do presente invento têm também um peso molecular inferior a 650 Da e, muito preferivelmente, inferior a 600 Da. As concretizações preferidas dos compostos do presente invento são representadas pela Fórmula estrutural (I).
I 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 40
onde os símbolos da Fórmula (I) são seleccionados de entre os seguintes: A partir das substruturas mostradas para o grupo A na Fórmula (I), os A preferidos são seleccionados de entre:
S
e enquanto que os A mais preferidos incorporam, uma ligação peptídica, ou uma ligação carbamato, tal como em ;
e
Em relação a certas combinações de L1-Ar1 e B, prefere-se usar, como material de partida, um aminoácido disponível comercialmente.
Para os grupos RA da substrutura A, as concretizações preferidas incorporam funcionalidades que colocam o átomo de azoto básico (ou uma sua forma proroga) a uma distância de aproximadamente de 4 a 8 ligações C-C do ponto de ligação de L1-Ar\ numa medição através de ligação. Por exemplo, os RA preferidos das substruturas A mais preferidas anteriormente indicadas, incluem alquilaminas (CH2)nNR2R3 (onde n=2 a 4) e heterociclos de anel saturado de seis membros contendo 1 ou 2 átomos de azoto, para os A ligados a amida, e (CH2)nNR2R3 (onde n=2 ou 3) e heterociclos de anel saturado de seis membros, substituídos nas posições 3 ou 4, contendo 1 ou 2 átomos de azoto, para os A ligados a carbamato. Os R preferidos ligados ao átomo de azoto de RA incluem hidrogénio, metilo, etilo, 2-hidroxietilo e 2-hidroxipropilo. Mais preferidos são os RA que colocam a amina a aproximadamente 6 ligações C-C do ponto de ligação de * L1- Ar1, medida através da ligação, tal como é o caso dos RA mais preferidos (CH2)3NR2R3, 4-piperidinilo e piperazinilo, para os A ligados a amida, e (CH2)3NR2R3, para os A ligados a carbamato, onde R2 e R3 são seleccionados de entre o grupo compreendendo hidrogénio e metilo. No caso do carbamato onde RA 41 j«*V 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ * «ft está ligado directamente a azoto, um RA adicionalmente preferido forma uma piperazina, onde o azoto do carbamato é incorporado como um átomo de anel. Assim, uma concretização muito preferida do presente invento incorpora uma substrutura A com a composição seguinte: R3
R1'
O
O N. i N R8 R1' R 8 R3-" R2 N.
'V
f?B
\ 'pi o R3
R1
R3
R2 I
O N O k/Νγ0· onde os grupos RB são hidrogénio ou alquilo inferior.
Na concretização mais preferida do presente invento, a substrutura A com a Fórmula (I) é uma amida derivada a partir da ligação de ácido isonipecótico (inip)(ácido piperidino-4-carboxilico).
O R1'1 ΐ
B
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 42 onde os grupos RB e R1 são hidrogénio ou alquilo inferior.
Tal como é ensinado no presente invento, as substruturas A anteriores exibem a funcionalidade amina a uma distância óptima próxima de L1 - Ar1 na Fórmula (I) e assim prefere-se que os RA apensos para outras substruturas A do presente invento imitem esta distância, tão proximamente quanto possível, através da incorporação de uma substrutura carbo-rigidificante ou heterocíclica.
As concretizações preferidas de outras substruturas do composto representado na Fórmula (I) são como se segue:
Para os grupos a e b, são mais preferidos o hidrogénio e o metilo, seleccionados independentemente. Numa concretização muito preferida a e b são ambos hidrogénio.
Para a substrutura B, que liga as duas cadeias laterais aromáticas, são mais preferidos a amida, a amina e o éter com as funções seguintes:
e
Os B muito preferidos são seleccionados de entre:
e onde Rc é, de um modo adicionalmente preferido, hidrogénio ou metilo.
Adicionalmente, quando as substruturas A, B e/ou C são constituídas pela função amida C(=0)NH, o presente invento ensina que o NH pode ser substituído por NMe com retenção da actividade biológica. Deste modo, é uma concretização muito preferida do presente invento que os grupos RB, Rc e RD sejam seleccionados, independentemente, de entre metilo e hidrogénio, uma combinação particular escolhida de modo a optimizar as propriedades desejadas da molécula, tais como, a estabilidade e a lipofilia. A partir da lista preferida de substruturas C da Fórmula I, as concretizações · mais preferidas são convenientemente discutidas por classe. Para a "série curta, pentapéptido", exemplificada pelo (inip) b w F K-NH2 (onde C é -C(=0)-Phe-Lys-amida) mais preferido e pela Fórmula la a seguinte, as concretizações mais preferidas incluem, para além do -C(=0)-Phe-Lys-amida mais preferido, a 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 43 «e?^ substituição de Lys (Y) pelas n-alquildiaminas H2N(CH2)nNH2, onde n=2 - 6, e pelas aminoamidas seleccionadas de entre os aminoácidos comuns. ΛΓ1 Ll/ u OΊ bI Δ——B—Y-
X-Y \
Ar2 (Ia)
Tal como é ensinado no presente invento, são permitidas uma grande gama de substituições na Lys (Y) e, numa menor extensão, na posição Phe (X). Deste modo, é preferível seleccionar, de entre todos os grupos C-terminais possíveis, aqueles que são mais baratos e que melhoram as propriedades físicas globais do composto. Ll/ . O A- t i a ’\
Ar2 (Ib) Para a posição Phe (X), na Fórmula (Ib) anterior e no "tetrapéptido, série curta", a Phe é muito preferida quando se inclui uma amida C-terminal, tal como a L-alfa-naftilalanina, a L-beta-naftilalanina e a Tyr. Nas séries curtas, exemplificadas por (inip) b b F-NH2, a carboxamida C-terminal é uma concretização preferida. São também preferidas as Ν,Ν-dimetil-, N-metil- e morfolinil-amidas. Numa concretização adicionalmente preferida, a carboxamida está substituída pelo ácido livre e pelo congénere reduzido CH2OH e hidrogénio.
Uma classe adicional de compostos muito preferidos (Fórmula Ic) é obtida pela substituição da Phe nas estruturas anteriores por um resíduo não aromático. Nesta classe, são muito preferidos os compostos onde X (a seguir) é uma amida derivada das diaminas de alquilo inferior e das aminocarboxamidas de alquilo inferior. Muito preferível, é quando X é butanodiamina.
(Ic)
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Muito preferível é um composto onde X é uma butanodiamina e B e uma N metilamida. Compostos adicionais muito preferíveis incluem aqueles onde X é NH2, suas alquilamidas, OH, e seus ésteres de alquilo inferior.
Na "série micro", exemplificada por (inip) b (wol), e a seguir representada, prefere-se que Z seja CH2OH, CH20C(=0)R2, CH2NR2R3, CH2OR e hidrogénio. Muito preferido é Z = CH2OH ou hidrogénio.
a L2 \
Ar2 (Id) A partir da lista preferida de L1-Ar e ΙΛΑγ2 detalhada na Reivindicação 1, os muito preferidos são seleccionados de entre CH2Ar, onde Ar é preferivelmente 1-ou 2-naftilo, 3-indoílo ou fenilo substituído. Numa concretização muito altamente preferida, L1-Ar1 é CH2(2-naftilo) e ΙΛΑγ2 é CH2(3-indoílo) ou CH2(2-naftilo).
Outros compostos muito preferidos do presente invento incluem:.
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 46 Μ
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 48
ΝΗ,
50 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ '' 4¾ ί·Γ'
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 51
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r^VSrV^oH L° ΗΝ
^AvAw*, 0 \ n o
,T< Y.NH ^hVAV^nh, NH, NH,
'^hVtVA*'* NH2 /
VíWiiW ^^Í^AV^Ah, NH, NH,
^AVAAYnH,
NH, NH, 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 54
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 55
56 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
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63 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
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85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ E. Actividade Biológica 1. Actividade in Vitro A. EC50 In Vitro
Os valores de EC50 "pit" para todos os GHRP foram determinados pela resposta à dose da GH em relação ao GHRP, usando o sistema de cultura em monocamada de pituitária de rato detalhado no Exemplo 38. Os resultados são apresentados nas Tabelas ll-VI no Exemplo 39. A Tabela II detalha os dados 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 66
biológicos seleccionados para os compostos da arte anterior, incluindo o GHRP-6 com uma EC50 de "células pit" de 6,2 ± 1,5 nM (n=5). A Tabela III detalha os dados biológicos seleccionados para 64 compostos com a Fórmula IV. O (inip)-bbFK-NH2, que é significativamente mais pequeno do que o GHRP-6, está incluído nesta nova classe de compostos, com uma EC50 de 1,8 ± 0,04, cerca de 30 vezes mais potente do que o GHRP-6. Na Tabela IV detalham-se os dados biológicos seleccionados de 63 compostos derivados da Fórmula III, incluindo o (inip)bb(feg) com uma EC50 de 0,25 ±0,19 (n=3); cerca de 25 vezes mais potente do que o GHRP-6. Na Tabela V detalham-se os dados biológicos seleccionados de 23 compostos com a Fórmula II incluindo o (inip)b(wol)(ECso = 10,6 ± 6,2; n=3) com uma EC50 aproximadamente equivalente à do GHRP-6. Na Tabela VI detalham-se os dados biológicos seleccionados a partir de compostos "retroinversos" incluindo o mais potente (Ab)bBB(ram), com uma EC50 de 2 nM (n=2). B. Caracterização In Vitro
Adicionalmente, os representantes das novas classes de GHRP foram adicionalmente caracterizados in vitro para determinar se estes compostos actuavam de um modo análogo ao "GHRP-6". Os representantes incluem: da Fórmula IV, o (inip)-bbFK-NH2, da Fórmula III o (inip)bb(feg) e da Fórmula II o (inip)b(wol). Detalham-se a seguir os resultados da caracterização. Todas as experiências tiveram o mínimo de três réplicas.
1. Representantes da Fórmula IV
(inip)-bbFK-NH2
Uma resposta à dose do representante para a libertação de GH no ensaio de células "pit" de rato, durante uma exposição de 15 min. a concentrações crescentes de (inip)-bbFK-NH2, é demonstrada na Figura 2 (ver Exemplo 38 para
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todos os protocolos de ensaio). A libertação de GH é significativamente aumentada (p<0,05) para 0,3 nM e atinge um patamar a 1 nM com uma EC50 de 0,16 nM. A EC50 média (n=3) para o (inip)-bbFK-NH, foi de 0,18 ± 0,04 nM, 30 vezes mais potente do que o (GHRP-6) (6,2 ± 1,5 nM; n=5).
Para demonstrar que o novo (inip)-bbFK-NH2 estava a actuar de um modo análogo ao "GHRP-6", foram realizados desafios usando combinações de (GHRP-6), (inip)-bbFK-NH2 e GHRH (ver Figura 3). O GHRP-6 e o (inip)-bbFK-NH2 (100 nM) causaram ambos aumentos de 3 vezes nos níveis de GH, mas não se observou qualquer aumento adicional quando se usaram estes dois GHRP em combinação. Isto sugere que ambos os GHRP podem actuar no mesmo sítio. Por contraste, ambos os GHRP mostraram sinergia com a GHRH no ensaio de células "pit" de rato, indicando que nenhum dos GHRP actua através do receptor da GHRH.
Observou-se um efeito de dessensibilização no receptor de GHRP putativo quando as células foram desafiadas sequencialmente com (inip)-bbFK-NH2 fresco de 15 em 15 min.. (Figura 4). A libertação de GH diminuiu após a segunda incubação de 15 min. (exposição total de 30 min. ao (inip)-bbFK-NH2) e não ocorreu qualquer libertação significativa de GH, em comparação com o controlo, durante o desafio final com (inip)-bbFK-NH2. Contudo, quando se adicionou GHRH (10 nM) à incubação de 15 min. seguinte, ocorreu uma resposta de GH significativa, consistente com o modelo de receptores separados para a GHRH e para os GHRP. É conhecido que a somatostina suprime a libertação de GH estimulada por GHRP. Para 1, 10 e 100 nM de (inip)-bbFK-NH2 observaram-se aumentos significativos de GH. A co-incubação de somatostatina (20 nM) com (inip)-bbFK-NH2 para as mesmas concentrações suprimiu esta libertação aumentada (Figura 5).
Outra evidência de que o (inip)-bbFK-NH2 evoca o receptor de GHRP inclui a resposta ao antagonista do receptor de GHRP, HwkWfK. Conforme demonstrado na Figura 6, embora fossem requeridas doses elevadas (10 μΜ), o HwkWfK antagonizou de facto o (inip)-bbFK-NH2. A especificidade do (inip)-bbFK-NH2 in vitro foi demonstrada pelo facto de a libertação de LH, FSH, TSH ou ACTH permanecer inalterada com 100 nM de (inip)-bbFK-NH2. As concentrações de prolactina foram significativamente aumentadas mas menos do que 2 vezes (Figuras 7-9).
Na Figura 10 mostram-se as determinações do fluxo de Ca++. Os quadros à esquerda (A e C) mostram o padrão de Ca++ basal imediatamente antes da adição de veículo ou de (inip)-bbFK-NH2. Vinte e um (21) segundos após a aplicação de
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68 (inip)-bbFK-NH2 ο fluxo aumentado de Ca no quadro D é demonstrado por cores mais claras em algumas das células desta população heteróloga. Como controlo, a adição de veículo não alterou o perfil de Ca++ (B), mas a adição do secretagogo de cálcio ionomicina resultou num estímulo máximo de todas as células (dados não apresentados).
2. Representativo da Fórmula III
(inip)bb(feg)
Este novo GHRP é mais pequeno em cerca de um resíduo aminoácido (lisina) em comparação com o (inip)-bbFK-NH2 anteriormente descrito. Na Figura 11 mostra-se a libertação de GH dependente da dose com (inip)bb(feg). A libertação de GH por células de pituitária de rato para concentrações crescentes de (inip)bb(feg) (quadro da esquerda) durante uma incubação de 15 minutos, mostra um aumento dependente da dose. O quadro à direita mostra os pontos experimentais e a curva usada para calcular a EC50 de 0,09 nM para o GHRP (inip) bb(feg). A EC50 média (n=3) para o (inip)bb(feg) foi de 0,25 ± 0,19 nM.
Para demonstrar que o (inip)bb(feg) actua também no "receptor de GHRP" proposto, mediu-se a resposta de GH ao GHRP-6 (100 nM) e ao (inip)bb(feg) (100 nM) como se mostra na Figura 12. A combinação destes dois GHRP produziu uma libertação de GH significativamente superior à do controlo, mas a libertação de GH não foi sinergística quando estes GHRP foram adicionados em combinação. A GHRH (100 nM) induziu uma resposta de GH moderada que era sinergística em combinação, quer com o GHRP-6, quer com o (inip)bb(feg), indicando que estes GHRP evocam um receptor diferente do da GHRH.
Na Figura 13 mostra-se a supressão pela somatostatina da libertação de GH estimulada por (inip)bb(feg). A libertação de GH com 100 nM de (inip)bb(feg) foi totalmente suprimida na presença de 20 nM de somatostatina, consistente com a resposta de supressão de SS de outros GHRP. 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 69
Similarmente, na Figura 14 demonstra-se a dessensibilização do "receptor de GHRP" após desafio de células de pituitária de rato com três incubações sequenciais de 15 min. com (inip)bb(feg) fresco. A libertação de GH a partir das mesmas células de pituitária após três incubações sequenciais de 15 minutos com (inip)bb(feg) (100 nM) demonstrou um padrão clássico de dessensibilização de GHRP. Após um total de 45 minutos, a libertação de GH diminuiu acentuadamente em resposta ao (inip)bb(feg) mas estas células eram capazes de libertar mais GH em resposta a uma incubação final de 15 minutos com GHRH (10 nM).
3. Representante da Fórmula II
(inip)b(wol)
Este novo GHRP é ainda mais pequeno do que o (inip)bb(feg), contendo apenas dois resíduos aromáticos (b-wol) em comparação com os três para o (inip)-bbFK-NH2 e o (inip)bb(feg). Na Figura 15 demonstra-se uma libertação de GH dependente da dose com o (inip)b(wol). A libertação de GH por células de pituitária de rato com concentrações crescentes de (inip)b(wol) (quadro da esquerda) durante uma incubação de 15 minutos mostra um aumento dependente da dose. O quadro à direita mostra os pontos experimentais e a curva usada para calcular a EC50 de 3,9 nM para o GHRP (inip)b(wol). A EC^ média (n=3) para o (inip)b(wol) foi de 10,6 ± 6,2 nM.
De novo, para demonstrar que o (inip)b(wol) actua no "receptor de GHRP" proposto, mediu-se a resposta de GH ao GHRP-6 (100 nM) e ao (inip)b(wol) (100 nM) como se mostra na Figura 16. A libertação de GH com estes dois GHRP era * significativamente superior à do controlo, mas não sinergística. Por contraste, a GHRH (100 nM) induziu uma resposta de GH moderada que era sinergística em combinação, quer com o GHRP-6, quer com o (inip)b(wol).
Na Figura 17 demonstra-se a supressão pela somatostatina da libertação de GH estimulada por (inip)b(wol). A libertação de GH para 100 nM de (inip)b(wol) foi totalmente suprimida na presença de 20 nM de somatostatina consistente com a resposta de supressão de SS de outros GHRP.
Finalmente, na Figura 18 mostra-se o efeito de dessensibilização do "receptor de GHRP", após desafio de células de pituitária de rato com três incubações sequenciais de 15 min. com (inip)b(wol) fresco. A libertação de GH a partir das mesmas células de pituitária, após três incubações sequenciais de 15 minutos com (inip)b(wol) (100 nM), demonstrou um padrão clássico de dessensibilização de GHRP. Após um total de 45 minutos não se observou qualquer libertação significativa de GH na resposta ao (inip)b(wol), mas estas células eram capazes de libertar GH em resposta a uma incubação final de 15 minutos com GHRH (100 nM). 4. Sumário da Caracterização In Vitro
Pelos ensaios funcionais aqui demonstrados, os representantes de cada nova classe de compostos (Fórmulas II, III, IV e V) induzem claramente uma libertação de GH de um modo análogo ao "GHRP-6". Todas as três classes de compostos libertaram GH de um modo dependente da dose, eram sinergísticos com a GHRH mas não com o GHRP-6, e tinham uma dessensibilização do receptor, após exposição contínua ao GHRP, mantendo a capacidade de responder à GHRH; todas as observações consistentes com o facto de estes compostos trabalharem através do "receptor de GHRP" putativo. Estes ensaios são bem aceites e têm sido usados extensivamente na literatura. (Cheng et ai, Endocrinology 132:2727-2731 [1993]; Blake e Smith, Jornal of Endocrinology 129:11-19 [1991]; Cheng et ai, Endocrinology 124:2791-2798 [1989]; Smith, Science 260:1640-1643 [1993]; e Akman et ai, Endocrinology 132:1286-1291 [1993]).
Adicionalmente, um representante da Fórmula IV, o (inip)-bbFK-NH2, foi adicionalmente caracterizado e demonstrou uma libertação de GH selectiva, a partir de células de pituitária heterogéneas (com excepção de um aumento moderado, mas significativo, na prolactina), capacidade para libertar GH através de um mecanismo de fluxo de Ca++ e ser inibido por um antagonista de GHRP (Bowers et ai, Endocrinology 128:2027-2035 [1991]).
Estes dados são consistentes com a perspectiva de que todas as quatro novas classes de GHRP induzem a libertação de GH de um modo análogo ao * "GHRP-6" e, assim, podem operar através do mesmo mecanismo para libertar GH in vitro. 2. Actividade In Vivo em ratos normais
Para determinar se as novas moléculas de GHRP exibiam eficácia in vivo, trataram-se ratos jovens (90 dias de idade) e adultos (120 dias de idade) com os GHRP do presente invento e com GHRH, de acordo com os protocolos nos Exemplos 41 e 44. A GHRH de rato, que tinha mostrado aumentar o peso corporal em ratos fêmea, jovens, normais, foi usada como controlo positivo nestas experiências. (Clark e Robinson, Nature 314:281-283 [1985]). A. Ganho de Peso Corporal em Ratos Normais.
Na Figura 19, mostram-se os ganhos de peso corporal representados em função do tempo para os 5 grupos de tratamento. Tanto o (inip)bbFK-NH2 como a GHRH de rato induziram um ganho significativo do peso corporal, em comparação com os ratos tratados com o excipiente de veiculo. No dia 5 do tratamento, os ganhos de peso de todos os grupos tratados eram superiores, de um modo estatisticamente significativo, em relação aos ratos tratados com excipiente. Na Figura 19 apresenta-se a natureza relacionada com a dose dos ganhos de peso corporal em relação ao (inip)bbFK-NH2. O ganho de peso, em resposta a uma dose muito superior de GHRH de rato (600 ,ug/dia), era muito similar ao induzido pela dose média (20 .ug/dia) de (inip)bbFK-NH2. Adicionalmente, uma dose tão pequena quanto 4 ug/dia (igual a 166 ng/hora) de (inip)bbFK-NH2 induziu um ganho de peso significativo em ratos jovens normais. A grande potência do (inip)bbFK-NH2 pode ser observada a partir desta comparação com a GHRH e a partir da dose muito baixa requerida para induzir um efeito anabólico significativo in vivo.
Na Figura 26 mostram-se os ganhos no peso corporal representados em função do tempo para os grupos de ratos adultos fêmea normais tratados com outros secretagogos de GH. Os grupos tratados com GHRH e com os GHRP 6, (inip)bbF-NH2 e (inip)b(nmb)(bam) mostraram um ganho de peso corporal significativo, mas o grupo tratado com L-692,585 não mostrou qualquer ganho de peso significativo. Ainda que a resposta ao GHRP (inip)bbF-NH2 pareça ser superior à de outros secretagogos, esta diferença não era estatisticamente diferente. O ganho de peso em resposta ao GHRP (inip)bbF-NH2 (36 ± 8 g em 7 dias) era similar à do GHRP (inip)bbFK-NH2 (36 ± 3 g em 14 dias) apresentada na Figura 20.
Estes estudos mostram que as várias classes dos secretagogos de GH do presente invento têm efeitos anabólicos significativos em ratos normais com a função pituitária intacta. Uma molécula da arte anterior com uma actividade mínima ' era o L-692,585, uma molécula de potência relativamente baixa tanto in vitro como in vivo. Contudo, crê-se que se tivesse sido administrada uma quantidade maior desta molécula teriam resultado efeitos anabólicos significativos.
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 72 Β. Ganho no Peso de Órgãos em Ratos Normais Jovens
Nestas experiências, após o sacrifício, pesaram-se os órgãos para medir os efeitos destes tratamentos nos sistemas de órgãos principais. O peso da pituitária e dos rins não foi afectado pelo tratamento. O peso do baço foi aumentado pela dose elevada de (inip)bbFK-NH2 (100 ng/dia) e pela GHRH (excipiente, 532 ± 25 mg; dose elevada de (inip)bbFK-NH2, 628 ± 26 mg; GHRH, 624 ± 23 mg). O peso do coração foi aumentado pelo tratamento com GHRH (p<0,05) e tinha tendência para ser aumentado pela dose elevada de (inip)bbFK-NH2 (p<0,10 mas >0,05), em comparação com os controlos tratados com excipiente. O timo foi também aumentado em peso, tanto pelo (inip)bbFK-NH2 como pela GHRH. O peso do timo nos ratos tratados com excipiente era de 485 ± 21 mg, 584 ± 34 mg nos ratos tratados com a dose elevada de (inip)bbFK-NH2 e 575 ± 39 mg nos ratos tratados com GHRH. O fígado aumentou, em peso, de um modo dependente da dose com o (inip)bbFK-NH2. O peso do fígado nos ratos tratados com excipiente era de 8,75 ± 0,24 e, com as doses crescentes de (inip)bbFK-NH2, o peso do fígado aumentou de 9,40 ± 0,37 g para 9,70 ± 0,29 g e 10,14 ± 0,29 g para as doses baixa, média e elevada de (inip)bbFK-NH2, respectivamente. O peso do fígado foi também significativamente aumentado por tratamento com GHRH. Nestas experiências, não se verificou um aumento estatisticamente significativo na largura da placa epifisária por tratamento, quer com (inip)bbFK-NH2, quer com GHRH. C. Sumário do Ganho de Peso de Órgãos e Corporal
Estas experiências mostram que o (inip)bbFK-NH2 tem uma gama de efeitos anabólicos em ratos fêmea jovens normais. Este efeito anabólico foi observado por aumentos no peso corporal, no peso do fígado, no peso do baço e no peso do timo, com uma tendência para o peso do coração aumentar também, em comparação com os ratos de controlo tratados com excipiente. O efeito do GHRP (inip)bbFK-NH2 estava também relacionado com a dose, com doses de 4, 20 e 100 pg/rato/dia sendo todas doses anabólicas eficazes. Nestas experiências, as duas doses mais elevadas de (inip)bbFK-NH2 tinham efeitos equivalentes. Deste modo, uma dose tão baixa quanto 166 ng/hora de (inip)bbFK-NH2 (para ratos de 200 g; 0,83 pg/kg/h) era eficaz na indução de um efeito anabólico. O efeito relacionado com a dose do (inip)bbFK-NH2 no fígado é um bom indicador da quantidade de secreção de GH provocada pelo GHRP (inip)bbFK-NH2. O crescimento do fígado é particularmente sensível ao estímulo pela GH e o peso do fígado aumentado é a resposta esperada a uma secreção aumentada de GH causada tanto pelo (inip)bbFK-NH2 como pela GHRH. O rim mostra uma resposta * de crescimento relativamente pobre ao tratamento com GH; a ausência de um efeito do (inip)bbFK-NH2 neste órgão é, deste modo, o resultado esperado. Wagner e Scow, Endocrinology 61:419-425 (1957); Clark et ai, Endocrinology and Metabolism 1:49-54 (1994). 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 73
Os efeitos do (inip)bbFK-NH2 no peso do timo e do baço indicam que seria de esperar que os presentes novos GHRP estimulassem a função imunitária. Outros estudos têm mostrado que a GH e o IGF-1 podem estimular significativamente a função imunitária, pelo que seria de esperar que os GHRP do presente invento, pelo aumento da secreção de GH, pudessem também estimular a função imunitária (Kelley, Ann. N. Y. Acad. Sei. 594:95-118 (1990), Clark et ai, J. Clin. Invest. 92:540-548 (1993)). O (inip)bbFK-NH2 tinha tendência para aumentar o peso cardíaco, indicando um efeito anabólico significativo deste GHRP no coração. A GH e o IGF-1 têm mostrado ser eficazes em modelos animais de falência cardíaca congestiva e existem dados de que a GH é eficaz, em humanos, na melhoria da função cardíaca em adultos deficientes na hormona de crescimento. Estes dados sugerem que o (inip)bbFK-NH2 será também eficaz na melhoria da função cardíaca e no tratamento da falência cardíaca congestiva (Sacca et ai, Endocrine Reviews 15:555-573 [1994]). O GHRP (inip)bbFK-NH2 era também eficaz no estímulo de uma resposta anabólica, quando entregue por infusão contínua. A entrega de (inip)bbFK-NH2 por infusão SC é um tratamento eficaz e pode ser conseguido um efeito similar por qualquer método que mantenha uma exposição aproximadamente contínua aos presentes GHRP. Por exemplo, os sistemas de entrega oral, emplastro transdérmico ou outros sistemas de entrega, concebidos para manterem uma exposição contínua a estes GHRP, podem ser apropriados. D. Comparação da Infusão de GHRP Versus Injecções em Ratos Normais
Ganho de Peso Corporal: O GHRP (inip)bbFK-NH2 a 20 e 100 pg/dia, entregue tanto por injecção como por infusão, induziu um ganho de peso corporal significativo em comparação com os ratos tratados com excipientes (ver Exemplo 42). No dia 2 de tratamento, os ganhos de peso de todos os grupos tratados eram superiores, de um modo estatisticamente significativo, aos dos ratos tratados com excipiente. Na Figura 20 pode-se observar a natureza relacionada com a dose dos ganhos de peso corporal para injecções de (inip)bbFK-NH2. Por contraste, verificaram-se ganhos de peso similares em resposta a infusões de 20 e 100 pg/dia de (inip)bbFK-NH2. Adicionalmente, verificaram-se padrões de ganho de peso muito diferentes em resposta a infusões ou injecções de (inip)bbFK-NH2, como se pode observar na Figura 21. A Figura 21 mostra também um ganho de peso inicial rápido, durante 2 dias, em resposta à dose elevada de (inip)bbFK-NH2 infundido (100 pg/dia), seguido por uma ausência acentuada de qualquer resposta adicional durante a duração da experiência. Isto fornece evidência de que a exposição contínua a 74 /\ . 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ /Τ*. . .· ,·/ tf/fe, doses elevadas de GHRP pode induzir a taquifalaxias e assim funcionam como antagonistas de GH.
Por contraste com as infusões, as injecções periódicas de (inip)bbFK-NH2 mantiveram uma resposta de crescimento significativa. Injecções duas vezes ao dia de 10 μg do GHRP (inip)bbFK-NH2 produziram um grande ganho de peso (30 g) em ratos adultos fêmea.
Pesos de Órgãos: Os pesos de órgãos após sacrifício foram medidos para determinar os efeitos da injecção versus infusão do (inip)bbFK-NH2 nos sistemas de órgãos principais. As carcaças evisceradas e esfoladas eram significativamente mais pesadas para os animais injectados com a dose elevada (152,4 ± 2,5 g) e com a dose baixa (152,8 ± 2,8 g) de (inip)bbFK-NH2, em comparação com os controlos (141,8 ± 3 g). A pele era mais pesada nos animais injectados com (inip)bbFK-NH2 e naqueles infundidos com a dose baixa de (inip)bbFK-NH2, em comparação com os animais de controlo. Quando se exprimiram os pesos de pele e de carcaça como percentagem do peso corporal, não se verificou qualquer efeito significativo devido ao tratamento, indicando que o ganho de peso era devido a um aumento proporcional de todo o corpo dos ratos. Apenas o músculo solhar, os rins e o fígado também não foram afectados pelo tratamento. As injecções de dose elevada de (inip)bbFK-NH2 aumentaram significativamente o peso do coração, em comparação com os controlos (1,15 ± 0,10 g vs. 0,96 ± 0,03 g). O peso do timo foi aumentado pelas injecções com dose elevada de (inip)bbFK-NH2 (0,33 ± 0,02 g) em comparação com os animais infundidos com dose elevada (0,25 ± 0,03 g). A largura da placa epifisária foi aumentada pelas injecções de (inip)bbFK-NH2 de dose elevada (191 ±8 μιτι), em comparação com as injecções de dose baixa (160 ±11 μιτι), enquanto que as infusões com (inip)bbFK-NH2 não aumentaram significativamente o crescimento de cartilagem. As concentrações de IGF-1 no soro não foram significativamente afectadas por qualquer dos modos de entrega do (inip)bbFK-NH2.
Mediram-se as químicas dos soros em amostras de sangue obtidas no sacrifício. Mediram-se os níveis de enzimas indicativas das funções cardíaca, hepática, muscular e renal. Não se observaram efeitos estatisticamente significativos do (inip)bbFK-NH2. Adicionalmente, mediram-se os metabolitos (glucose, azoto de ureia do sangue, creatinina, proteína total, albumina, colesterol, bilirrubina) e os iões (cálcio, fosfato, sódio, potássio e cloreto). O único metabolito que apresentou alguma evidência de alterações foi o triglicérido do soro. Verificou-se alguma evidência de que o triglicérido do soro foi aumentado pelas injecções de dose elevada do GHRP (inip)bbFK-NH2, mas não pelas injecções de dose baixa * (controlo 126 ±11 mg%, dose elevada 183 ±17 mg%, dose baixa 128 ± 11mg%) ainda que este efeito não conseguisse atingir significância estatística. 75 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
Esta experiência mostra claramente que o GHRP (inip)bbFK-NH2, quando administrado, quer por injecções, quer por infusões, tem uma gama de efeitos anabólicos em ratos adultos fêmea normais. Este efeito de promoção de crescimento foi observado por aumentos no ganho de peso corporal, de peso da carcaça, de peso da pele, de peso do coração e de peso do timo, em comparação com ratos de controlo tratados com excipiente. Nesta experiência, duas injecções por dia de 10 pg de (inip)bbFK-NH2 provocaram um ganho de peso aproximadamente igual ao de duas injecções por dia de 50 ng de (inip)bbFK-NH2. Deste modo, 10 ng de (inip)bbFK-NH2 (para ratos de 200 g; 50 pg/kg/dia) parecem ser uma dose máxima de (inip)bbFK-NH,, para induzir uma resposta anabólica. Experiências de injecção intravenosa aguda com (inip)bbFK-NH2, em ratos de 80 g (Exemplo 40), para uma gama de doses de 25 vezes (isto é, 1,0, 0,2 e 0,04 ng/injecção), demonstram que a indução da secreção de GH ocorre dentro desta gama de dose-resposta (ED50 0,2 μg/rato). Em ratos de 200 g, isto sugere que uma dose de 10 ,ug de GHRP (inip)bbFK-NH2 seria bem superior à gama eficaz de doses-respostas.
Verificaram-se diferenças significativas entre os efeitos anabólicos do (inip)bbFK-NH2 em ratos com 90 vs 150 dias de idade. Nos ratos mais velhos, não se verificou um efeito claro no peso do fígado ou no peso do baço, tal como se observava com a infusão do GHRP (inip)bbFK-NH2 nos ratos mais novos. As injecções com (inip)bbFK-NH2 aumentaram o peso do timo, sugerindo que estes GHRP podem estimular o crescimento do tecido imunitário e, deste modo, aumentar a função imunitária. Outros estudos têm mostrado que a GH e o IGF-1 podem estimular significativamente a função imunitária de modo que, seria de esperar que os GHRP do presente invento, pelo aumento da secreção de GH, pudessem também estimular a função imunitária. Kelley, Ann. N. Y. Acad. Sei. 594:95-118 (1990), Clark et ai, J. Clin. Invest. 92:540-548 (1993). O GHRP (inip)bbFK-NH2 tem tendência para aumentar o peso cardíaco, indicando um efeito na estrutura e na função cardíacas. A GH e o IGF-1 têm também mostrado ser eficazes em modelos de falência cardíaca congestiva e estes dados sugerem que o (inip)bbFK-NH2 será também eficaz no tratamento da falência cardíaca congestiva. Sacca et ai, Endocrine Reviews 15:555-573 (1994). O GHRP (inip)bbFK-NH2 foi claramente eficaz no estímulo de uma resposta anabólica, quando entregue tanto por injecção como por infusão contínua. A entrega do (inip)bbFK-NH2 por injecção subcutânea, duas vezes ao dia, parece ser um método eficaz para a entrega do GHRP. Outros métodos de entrega que produzem um perfil do GHRP no sangue similar, por exemplo, a entrega oral, a entrega ao pulmão ou outros sistemas de entrega, concebidos para manter uma · exposição intermitente ao GHRP, serão também um meio eficaz de induzir a secreção de GH e, desse modo, os efeitos da GH.
As químicas do soro normal indicam que os efeitos do (inip)bbFK-NH2 podem ocorrer sem perturbar o equilíbrio normal dos metabolitos e dos iões no sangue. A única excepção possível foi a tendência para o triglicérido do soro ser aumentado por injecções de doses elevadas, mas não por injecções de doses baixas, do GHRP (inip)bbFK-NH2. Isto pode indicar que doses muito elevadas de (inip)bbFK-NH2 podem ter impacto no sistema de ACTH e induzir actividade de corticosterona. Contudo, injecções de 10 Lig de (inip)bbFK-NH2 não pareceram afectaros lípidos do soro, indicando que esta dose, embora máxima para estimular a secreção de GH, tem um efeito mínimo na secreção de corticosterona. E. Tratamento de Ratos Normais com Combinação de GHRP e IGF-1
Seleccionaram-se ratos adultos fêmea normais para estudar o efeito anabólico dos GHRP 6, (inip)bbf-NH2, (inip)b(nmb)(bam) e L-692,585, quando administrados em combinação com IGF-1. No Exemplo 44 descrevem-se os detalhes dos protocolos usados para este estudo.
As respostas de ganho de peso corporal aos secretagogos de GH, administrados em combinação com IGF-1 (Figura 27), foram muito superiores às respostas aos secretagogos de GH administrados sozinhos (Figura 26). Adicionalmente, as respostas à combinação dos secretagogos de GH e de IGF-1 tinham tendência para serem superiores às do IGF-1 sozinho.
Este estudo mostra, pela primeira vez, que o GHRP tem uma actividade anbólica significativa quando administrado em combinação com IGF-1 administrado cronicamente. Adicionalmente, existe um benefício anabólico adicional da administração da combinação de secretagogos de GH e de IGF-1.
3. Actividade In Vivo em Ratos ZDF A. Terapia com Combinação de GHRP ê IGF-1 em Ratos obesos É conhecido que o IGF-1 inibe a secreção de GH por um mecanismo de resposta de retorno actuando quer indirectamente no hipotálamo, quer directamente na pituitária. Tannenbaum et ai, Science 220:77-79 (1981). É também conhecido que a secreção de GH induzida pela GHRH é suprimido por administração de IGF-1. (Bermann et al., Program and Abstracts 76th Annual Meeting US Endocr. Soc., Abstract 565, (1994). Contudo, era desconhecido se o GHRP podia induzir a secreção de GH ou produzir efeitos, em combinação com a administração de IGF-1. No Exemplo 43, apresenta-se o protocolo para administração de IGF-1 em combinação com GHRP e GH. Como controlo positivo na experiência, usou-se GHRH de rato que tinha mostrado aumentar o peso corporal em ratos fêmea normais. 1¾¾ Λ / itilj 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 77 (> ν·.£. -3*^ ί >/ " ¢5. ^
Ganho de Peso Corporal: Na Figura 22 mostram-se os ganhos de peso corporal representados em função do tempo para todos os grupos de tratamento durante todo o estudo (isto é, 24 dias). Na Figura 23 mostram-se os ganhos de peso corporal, para os primeiros 7 dias, para os grupos de tratamento com GHRP (inip)bbFK-NH2 e IGF-1. Tanto o (inip)bbFK-NH2 como o rhlGF-1 induziram um ganho de peso corporal significativo, em comparação com os ratos tratados com veículo, tal que, no dia 2 do tratamento (ver Figura 23), os ganhos de peso eram superiores, de um modo estatisticamente significativo, aos dos ratos tratados com excipiente ((inip)bbFK-NH2, 18,3 ± 1,0 g; rhlGF-1,21,5 ± 0,7 g; e controlos obesos, 13,8 ± 0,4 g). O tratamento com rhGH não aumentou nesta altura o ganho de peso (13,6 ± 2,5 g). O ganho de peso em resposta ao GHRP (inip)bbFK-NH2 mais rhlGF-1 (26,8 ± 0,8 g) era superior (p<0,05) ao da combinação rhGH + rhlGF-1 (23,3 ± 1,2 g). No dia 7 do tratamento, mantinham-se estas diferenças no ganho de peso. No dia 24 do tratamento (Figura 22), a resposta de ganho de peso em relação ao (inip)bbFK-NH2 mais IGF-1 (247,4 ± 7,1 g) era similar à de rhGH + rhlGF-1 (245,2 ± 4,9 g) e muito superior à dos controlos obesos (169,0 ± 1,6 g), e significativamente superior (p<0,05) à do tratamento com rhlGF-1 sozinho (232 ± 2 g). Foi surpreendente que um GHRP (inip)bbFK-NH2 pudesse induzir um ganho de peso, quando administrado em combinação com IGF-1, e que este ganho de peso fosse igual ao de uma grande dose de rhGH, e que os efeitos da combinação de GHRP e de rhlGF-1 resultassem em ganhos de peso superiores ou iguais aos da combinação de rhGH e rhlGF-1. B. Tratamento de Ratos diabéticos com Combinação de GHRP e IGF-1
Seleccionaram-se ratos Zucker Diabetic Fatty (ZDF) obesos para estudar o efeito diabetogénico do GHRP, quando administrado em combinação com IGF-1. No Exemplo 43 descrevem-se os detalhes dos protocolos usados para este estudo.
Glucose no sangue: Usaram-se concentrações elevadas de glucose no sangue para definir o estado diabético de um animal. Começou-se o tratamento com os ratos antes da diabetes se desenvolver (no dia 0, não existia diferença entre os valores de glucose no sangue de ratos magros e obesos). A Figura 24 mostra a variação ao longo do tempo da glucose no sangue em jejum para os 6 grupos obesos e para os controlos magros. No dia 14, os ratos obesos estavam claramente diabéticos (controlos obesos, 218 ± 27 mg%; controlos magros, 140 ± 3 mg%). O tratamento com rhGH resultou num aumento superior (p<0,05) na glucose do sangue (504 ± 38 mg%) em relação ao do GHRP (inip)bbFK-NH2 (386 ± 63 mg%). Adicionalmente, a combinação do GHRP (inip)bbFK-NH2 mais IGF-1 * resultou num valor de glucose no sangue de 190 ± 27 mg%, comparável ao do tratamento com rhGH + IGF-1 de 233 ± 49 mg%. 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 78
No dia 24, a glucose no sangue dos ratos diabéticos obesos tinha aumentado para mais do dobro em relação aos controlos magros (147 ± 4 mg% vs. 330 ± 57 mg%) e os valores eram significativamente (p<0,05) maiores para os ratos tratados com rhGH (725 ± 30 mg%) do que para os ratos tratados com GHRP (542 ± 37 mg%). Esta diferença entre a rhGH e o GHRP foi também observada no tratamento de combinação com rhlGF-1. O GHRP mais rhlGF-1 resultaram numa medição de glucose no sangue inferior (301 ± 53 mg%) à do tratamento com rhGH + rhlGF-1 (512 ± 55 mg%). Contudo, os valores de glucose no grupo tratado com GHRP + IGF-1 eram elevados (p<0,05) em comparação com os animais que receberam rhlGF-1 sozinho (177 ± 4 mg%).
Insulina no soro: No dia 0, os níveis nos ratos obesos eram elevados, em comparação com os controlos magros, mas não se verificaram diferenças entre os níveis nos grupos de tratamento obesos. Na semana 1, o tratamento com IGF-1 reduziu significativamente a insulina no soro (controlo obeso, 21 ± 2ng/ml; tratados com IGF-1, 8 ± 1 ng/ml). O GHRP (inip)bbFK-NH2, por si só, elevou a insulina no soro 39 ± 6 ng/ml, tal como o tratamento com rhGH (48 ± 6 ng/ml). Contudo, a combinação do GHRP (inip)bbFK-NH2 mais IGF-1 diminuiu significativamente a insulina (para 10 ± 2 ng/ml) em comparação com a combinação de rhGH mais IGF-1 (25 ± 3 ng/ml, p<0,05). Deste modo, existe evidência de que a combinação do GHRP (inip)bbFK-NH2 e IGF-1 estimulou a secreção de insulina numa menor extensão (foi menos diabetogénica) do que a combinação de GH e IGF-1.
Sensibilidade à Insulina: No dia 24, a sensibilidade dos animais à insulina foi avaliada por medição da glucose no sangue 30 minutos após um desafio com insulina (Figura 25). Após a insulina, os valores absolutos de glucose no sangue eram de novo mais elevados em animais diabéticos obesos (277 ± 42 mg%) do que nos animais magros (84 ± 8 mg%). Contudo, a glucose no sangue era agora reduzida, nos animais tratados com GHRP, para níveis (323 ± 67 mg%) não diferentes dos obtidos para os controlos obesos. Por contraste, nos ratos tratados com rhGH, a glucose permanecia significativamente (p<0,05) elevada (533 ± 55 mg%), em comparação com os controlos obesos ou com os ratos tratados com GHRP. Observou-se uma diferença similar entre o tratamento com rhGH e GHRP, quando estes foram combinados com tratamento de rhlGF-1. A glucose no sangue era significativamente (p<0,05) menor nos ratos tratados com GHRP + rhlGF-1 (238 ± 47 mg%) do que nos ratos tratados com rhGH + rhlGF-1 (388 ± 48 mg%).
Estas experiências comparam os efeitos anabólico e diabetogénico de GH e GHRP administrados num modelo de rato da diabetes Tipo II. Pela primeira vez, estas experiências mostram que os GHRP administrados têm uma actividade anabólica significativa, quando administrados em combinação com IGF-1. Esta actividade anabólica era equivalente à induzida por tratamento com GH mais IGF-1. Por contraste, a administração de GH provocou uma resistência à insulina significativamente superior à do GHRP administrado, conforme determinado pela 79 79 ί 7/^VdSâ Váájjsá^ .ν ψ 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ glucose e pela insulina no soro, e por um desafio com insulina, mesmo quando estes foram administrados em combinação com rhlGF-1. Este estudo mostra que o efeito diabetogénico do GHRP (inip)bbFK-NH2 era significativamente menor do que o da rhGH, para doses que produziram efeitos anabólicos similares. F. Administração O presente invento proporciona também composições contendo uma quantidade eficaz de compostos do presente invento, incluindo os seus sais de adição, amidas e ésteres, não tóxicos, que podem, sozinhas, servir para proporcionar os benefícios terapêuticos anteriormente referidos. Estas composições podem ser proporcionadas conjuntamente com diluentes, adjuvantes e excipientes, líquidos, em gel ou sólidos, fisiologicamente toleráveis.
Os compostos e composições podem ser administrados a mamíferos, incluindo humanos, de um modo similar ao de outros agentes terapêuticos. A dosagem a ser administrada dependerá dos factores usuais incluindo: idade, peso, sexo e estado do paciente, e da via de administração. De um modo geral, a dosagem requerida para a eficácia terapêutica estará na gama de cerca de 0,001 a 1000 Lig/kg, mais usualmente, de 0,01 a 2,5 ,ug/kg do peso corporal do hospedeiro. Alternativamente, podem-se administrar dosagens, dentro destas gamas, por infusão constante, durante um período de tempo prolongado, até os bebefícios terapêuticos desejados terem sido obtidos.
Tipicamente, estas composições são preparadas como soluções ou suspensões líquidas injectáveis. As composições podem também estar emulsionadas. O ingrediente activo é frequentemente misturado com diluentes ou excipientes que são fisiologicamente toleráveis e compatíveis com o ingrediente activo. Diluentes e excipientes adequados são, por exemplo, solução aquosa salina, dextrose, glicerol e semelhantes, e suas combinações. Adicionalmente, se desejado, as composições podem conter pequenas quantidades de substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes estabilizantes ou de tamponação de pH e semelhantes. Para uma descrição mais detalhada do anterior, ver um texto farmacêutico convencional, tal como Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. Easton, PA. (1970).
Convencionalmente, as composições do presente invento são administradas parentericamente por injecção, quer subcutânea quer intravenosa. Formulações adicionais, que são adequadas para outros modos de administração, incluem supositórios, aerossóis intranasais e, em alguns casos, formulações orais. Para * supositórios, os ligantes e excipientes tradicionais podem incluir, por exemplo, polialquilenoglicóis ou triglicéridos; estes supositórios podem ser formados a partir de misturas contendo o ingrediente activo na gama de 0,5% a 10%, preferivelmente, 1%-2%. As formulações orais incluem os excipientes normalmente
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 80 utilizados tais como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio e semelhantes. Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de libertação sustentada ou pós, e contêm 10%-95% de ingrediente activo, preferivelmente, 25%-70%.
Os compostos peptidomiméticos podem ser formulados nas composições na forma neutra ou de sal. Os sais não tóxicos farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos amino livres), e que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou com ácidos orgânicos, tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico e semelhantes. Os sais formados com os grupos carboxilo livres podem ser obtidos a partir de bases inorgânicas, tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou férrico, e de bases orgânicas, tais como isopropilamina, 2-etilaminoetanol, histidína, procaína e outras.
EXEMPLOS
Procedimento Experimental Geral:
Os compostos sintetizados através das vias apresentadas nos Esquemas l-VI seguiram metodologias convencionais de fase sólida. (Barany, G. e Merrifieid, R. B. (1980) em "The Peptides", 2, 1-284, Gross, E. and Meienhofer, J. Eds. Academic Press, New York).
As abreviaturas dos nomes químicos para os reagentes comuns e para os aminoácidos não usuais usados nos exemplos seguintes são definidas como se segue (para definição de acrónimos específicos das Tabelas do Exemplo 39, Ver Tabelai):
aNal BOC BOP BOP-CI CBZ pNal DpNal DCM L-a-naftilalanina ou (L-3-(1-naftil)alanina) terc-butiloxicarboniio hexafluorofosfato de benzotriazol-1 -iloxi-tris-(dimetilamino)fosfónio cloreto bis(2-oxo-3-oxazolidinil)fosfínico benziloxicarbonilo L-p-naftilalanina ou (L-3-(2-naftil)alanina) D-p-naftilalanina ou (D-3-(2-naftil)alanina) diclorometano 85 455 EP 0 792 289/PT 81 DIPC di-isopropilcarbodi-imida DIPEA di-isopropiletilamina DMF N,N-dimetilformamida DMA N,N-dimetilacetamida DMSO dimetilsulfóxido EDC cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodi-imida FMOC fluoreniloximetilcarbonilo HBTU hexafluorofosfato de [2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio] HOBt hidroxibenzotriazolo inip ácido isonipecótico (ácido pideridino-4-carboxílico) MBHA p-metilbenzidrilamina MeOH metanol EM espectrometria de massa N-Me N-metilo NMM N-metilmorfolina NMP N-metilpirrolidinona TEA trietilamina TFA ácido trifluoroacético THF tetra-hidrofurano
Nota: Usam-se os códigos padrão de três letras para designar os aminoácidos naturais com um "D" colocado antes significando o enantiómero dextro-rotatório (isto é, D-Phe é a D-fenilalanina).
Apresentam-se a seguir os protocolos das químicas em fase sólida geralmente preferidos para a síntese dos compostos peptídicos do presente invento, usando ambos os protocolos de grupos protectores da alfa-amina do BOC-e do FMOC-. Na ausência de um procedimento experimental detalhado em contrário, para as sínteses dos compostos nos exemplos, utilizou-se a química seguinte:
Ciclo Padrão da Química do BOC
1) 3x1 min. DCM 2) teste de ninidrina, acoplar novamente se positivo
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 82 3) 1x1 min. TFA a 45%* 4) 1 χ 25 min. TFA a 45%
5) 1 χ 30 s DCM
6) 1 χ 1 min. MeOH
7) 2x1 min. DCM
8) 1 χ 1 min. 10%TEA/DCM
9) 1x8 min. 10% TEA/DCM
10) 3 χ 1 min. DCM 11) adicionar o aminoácido pré-activado e acoplar durante 1 h 12) ir para o passo 1) * TFA a 45% = 45% de TFA, 45% de DCM, 5% de anisolo, 5% de etanoditiol (em volume).
Notas: a) Para amidas peptídicas, usar resina MBHA e iniciar a síntese no passo 7. b) Para o acoplamento dos aminoácidos padrão, pré-misturar 3 equiv. de aminoácido, BOP e HOBt em DMA durante 10 min., adicionar 3 equiv. de NMM e depois adicionar a mistura à resina peptídica. Fazer borbulhar azoto suavemente na lama por meio de uma frita de vidro é um método de agitação preferido durante os passos de reacção e de lavagem. c) Para o acoplamento dos N-a-alquil-aminoácidos, usar 3 equiv. de aminoácido e DIPC, de um dia para o outro. Alternativamente, podem-se usar 3 equiv. de aminoácido, BOP-CI e DIPEA em DCM, de um dia para o outro. d) Para desbloquear e clivar completamente o péptido da resina, adicionar (por 1 g de resina) 10 ml de HF, 1 ml de anisolo e 0,5 ml de ^ etilmetilsulfureto e agitar a 0°C durante 1 h (para os péptidos contendo Trp, tem de se adicionar 0,25 g de p-cresol). Após remover o HF, o resíduo é triturado com éter, recolhido numa frita de vidro e lavado várias vezes com éter. O péptido em bruto é extraído da resina por 83 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ lavagem, sucessivamente com 10% de HOAc/água, HOAc, acetonitrilo, 10% de HOAc/água e água. Os filtrados combinados são congelados e liofilizados. Por purificação, preferivelmente através de HPLC de fase inversa (C-18) usando um gradiente de acetonitrilo (0,1% de TFA)/água (0,1% de TFA), obtém-se o péptido puro.
Ciclo Padrão da Química do FMOC
1) 5x1 min. DMA 2) teste de ninidrina, acoplar novamente se positivo 3) 1x1 min. 20% piperidina/DCM*
4) 1x15 min. 20% piperidina/DCM
5) 5x1 min. DMA
6) 1x1 min. DCM 7) adicionar o aminoácido pré-activado e acoplar durante 30 min. a 1 h 8) ir para o passo 1) *Para a síntese de ácidos peptídicos, pode-se usar o protocolo seguinte, após desprotecção do segundo aminoácido, para prevenir a formação de dicetopiperizina. Continuar a partir do passo 3:
4a) 1 x 30 s DMA 5a) 1 x 30 s DCM 6a) 1 x 30 s DMA 7a) 1 x 30 s DCM 8a) adicionar o aminoácido pré-activado e acoplar durante 30 min. -1 h 9a) ir para o passo 1 anterior
84 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
Notas: a) Para as amidas peptídicas, usar FMOC-Am-resina (ver a síntese a seguir), pré-intumescida com DCM, e iniciar a síntese no passo 3. b) Para o acoplamento dos aminoácidos padrão, pré-misturar 3 equiv. do aminoácido e BOP em DMA/DCM (1:1) durante 10 min., adicionar 3 equiv. de NMM e depois adicionar a mistura à lama de péptido-resina em DMA/DCM (1:1), com borbulhar suave de azoto.. c) Para o acoplamento dos Ν-α-alquiiaminoácidos, usar 3 equiv. de aminoácido e DIPC em DCM, de um dia para o outro. Alternativamente, podem-se usar 3 equiv. de aminoácido, BOP-CI e DIPEA em DCM, de um dia para o outro. d) Para desbloquear e clivar completamente o péptido da resina, adicionar (por 1 g de resina) 10 - 15 ml de 95% de TFA/trietilsilano (v/v) e sacudir ou agitar à temperatura ambiente durante 1 h. O TFA é removido sob vácuo e o resíduo é triturado com éter, recolhido numa frita de vidro e lavado várias vezes com éter. O péptido em bruto é extraído da resina por lavagem, sucessivamente, com 10% de HOAc/água, HOAc, acetonitrilo, 10% de HOAc/água e água. Os filtrados combinados são congelados e liofilizados. Por purificação, preferivelmente através de HPLC de fase inversa (C-18) usando um gradiente de acetonitrilo (0,1% de TFA)/água (0,1% de TFA), obtém-se o péptido puro. e) A FMOC-Am-resina foi preparada como se segue: colocaram-se 60,5 g (0,47 mmol/g, 28,4 mmol, Advanced Chemtech #SA5002) de resina de poliestireno aminometilada num vaso reaccional em funil de vidro sinterizado e intumesceu-se com DCM durante 20 min. mantendo a agitação com borbulhar de azoto. Removeu-se o solvente por aplicação de vácuo ao fundo do funil e adicionou-se 10% de TEA em DCM. Após 20 min., lavou-se a resina com três porções de DCM e adicionou-se uma solução de 23,0 g de p-[(R,S)-a-[1-(9H-fluóren-9-il)metoxiformamido]-2,4-dimetoxibenzil]-PA (42,6 mmol, Novachem) em 100 ml de DMA. Adicionaram-se 100 ml de uma solução 1M de DIPC em DCM (100 mmol) e agitou-se a suspensão espessa durante 3,5 h. Lavou-se a resina cinco vezes com DMA, duas vezes com DCM e duas vezes com metanol. Por secagem in vacuo obtiveram-se 70,2 g de FMOC-Am-resina com uma substituição de aproximadamente 0,40 mmol/g. 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 85
Exemplo 1
(inip)-DpNal-DpNal-Phe-Lys-amida, sal de TFA
Método A
Passo A: (N-e-BOC)Lys-(Am-resina)
Desbloqueou-se FMOC-Am-resina (10 g, 0,50 mmol/g, 5,0 mmol) por agitação com 20% de piperidina em DMA durante 15 min., seguindo-se lavagens sucessivas com DMA (5x) e DCM (1χ). A resina deu um teste positivo com a ninidrina. Adicionou-se uma solução de 9,37 g (20 mmol) de FMOC-(N-s-BOC)-L-lisina, 8,85 g (20,0 mmol) de BOP e 3,31 ml (30,0 mmol) de NMM em 30 ml de DMA, e agitou-se a solução durante 1 h. Lavou-se a resina (5x) com DMA e verificou-se que dava um teste da ninidrina negativo. Removeu-se o grupo protector Ν-α-FMOC com 20% de piperidina em DMA durante 15 min., seguindo-se lavagens sucessivas com DMA (5x) e DCM (1x) para dar a (N-8-BOC)Lys-(Am-resina).
Passo B: Phe-(N-s-BOC)Lys-(Am-resina)
Pré-activou-se uma solução de FMOC-L-fenilalanina (7,75 g, 20,0 mmol) e de BOP (8,85 g, 20,0 mmol) em 50 ml de DMA/DCM (1:1) durante 10 min. e adicionou-se à (N-s-BOC)Lys-(Am-resina) do passo A, seguida de NMM (3.31 ml, 30,0 mmol). Após uma hora, lavou-se a resina com DMA (5x, teste da ninidrina negativo), desbloqueou-se com 20% de piperidina em DMA durante 15 min. e 86 85 455 τβ^'" yjfczs.i ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ lavou-se de novo com DMA (5x) e DCM (1x) para dar a Phe-(N-s-BOC)Lys-(Am-resina) mostrando um teste da ninidrina positivo.
Passo C: DpNal-Phe-(N-8-BOC)Lys-(Am-resina)
Pré-activou-se FMOC-D-p-naftillalanina (4,37 g, 10,0 mmol) e 4,42 g (10,0 mmol) de BOP em 50 ml de DMA/DCM (1:1) durante 10 min., adicionaram-se 1,65 ml (15,0 mmol) de NMM e adicionou-se a mistura à Phe-(N-s-BOC)Lys-(Am-resina) do passo B. Após agitação durante 2 h, lavou-se a resina com DMA (5x, teste da ninidrina negativo), desbloqueou-se com 20% de piperidina em DMA durante 15 min. e lavou-se de novo com DMA (5x) e DCM (1χ), para dar a DpNal-Phe-(N-8-BOC)Lys-(Am-resina) mostrando um teste da ninidrina positivo.
Passo D: FMOC-DpNal-DpNal-Phe-(N-s-BOC)Lys-(Am-resina)
Pré-activou-se FMOC-DpNal (4,37 g, 10,0 mmol) e 4,42 g (10,0 mmol) de BOP em 50 ml de DMA/DCM (1:1) durante 10 min. e adicionou-se à mistura de DpNal-Phe-(N-8-BOC)Lys-(Am-resina) do passo C, seguido de 1,65 ml (15,0 mmol) de NMM. Após agitação durante 3 h, lavou-se a resina com DMA (5χ, teste da ninidrina negativo), DCM (2x) e metanol (2x). Secou-se a resina in vacuo para dar 15,6 g de FMOC-DpNal-DpNal-Phe-(N-8-BOC)Lys-(Am-resina) com um nível de substituição de aproximadamente 0,32 mmol/g.
Passo E: Ácido N-FMOC-isonipecótico A uma solução de 10,0 g (77,4 mmol) de ácido isonipecótico (Aldrich) em carbonato de sódio 1 N/dioxano (1:1) a 0°C, adicionaram-se 21,1 g (77,4 mmol) de carbonato de 9-fluorenilmetiisuccinimidilo, em porções. Após 14 h, removeu-se o dioxano in vacuo e diluiu-se a suspensão com 1200 ml de água. Após extracção com 2 porções de éter (rejeitadas), arrefeceu-se a solução aquosa num banho de gelo e acidificou-se até pH 3 com ácido clorídrico concentrado. Extractou-se duas vezes a lama com acetato de etilo e lavaram-se as fases orgânicas combinadas com água, salmoura, secaram-se sobre sulfato de magnésio anidro e filtraram-se. . Concentrou-se o filtrado até 500 ml, diluiu-se com 700 ml de hexano e colocou-se num frigorífico de um dia para o outro. Recolheu-se o produto num filtro e secou-se
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 87 tr^mÉkí··- in vacuo para dar 25,8 g (95%) de ácido N-FMOC-isonipecótico na forma de um sólido incolor.
Passo F: (inip)-DpNal-DpNal-Phe-Lys-amida, sal de TFA
Intumesceu-se FMOC-DpNal-DpNal-Phe-(N-s-BOC)Lys-(Am-resina) (1,0 g, 0,32 mmol) com DCM durante 15 min., desbloqueou-se com 20% de piperidina em DMA durante 15 min. e lavou-se com DMA (5x) e DCM (1x), para dar a DpNal-DpNal-Phe-(N-s-BOC)Lys-(Am-resina), mostrando um teste da ninidrina positivo. Adicionou-se solução pré-activada de ácido N-FMOC-isonipecótico (462 mg, 1,32 mmol), 583 mg (1,32 mmol) de BOP e 0,217 ml (1,98 mmol) de NMM em 10 ml de DMA/DCM (1:1). Após agitação durante 2 h, lavou-se a resina com DMA (5x, teste da ninidrina negativo) e desbloqueou-se com 20% de piperidina em DMA durante 15 min.. Lavou-se de novo a resina com DMA (5x) e DCM (3x) e depois secou-se in vacuo. Suspendeu-se a resina seca em 10 ml de TFA e adicionaram-se 0,50 ml de trietilsilano. Agitou-se a mistura durante 1 h, concentrou-se in vacuo, e lavou-se a resina 3x com éter. O péptido em bruto foi recuperado a partir da resina por lavagem com HOAc aquoso a 10% seguido de acetonitrilo. Os filtrados combinados foram liofilizados para dar 140 mg de um sólido. Purificou-se uma alíquota de 70 mg por HPLC de fase inversa (15-20 μιτι, 300 Á, Vydac C-18, 1 χ 50 cm, gradiente: 23 - 38% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 60 min. a 9 ml/min., rt= 30 min.) para dar 34 mg de (inip)-DpNal-DpNal-Phe-Lys-amida, sal de TFA, na forma de um pó incolor após liofilização. EM (electropulverização, M+H) 798,4.
Método B
Passo A: BOC-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina)
Lavou-se uma amostra de 20,0 g de MBHA-resina (substituição de 1,04 mmol/g, 20,8 mmol), sucessivamente com NMP, DCM (2x), 5% de DIPEA/DCM (1x 1 min.), 5% de DIPEA/DCM (1x10 min.) e DCM (4x). Adicionou-se uma solução de 25,8 g (3 eq) de BOC-L-(N-£-(2-CI-CBZ)-lisina em NMP/DCM (1:1) seguida de 8,40 g (3 eq) de HOBt em NMP e de 62,4 ml (3 eq) de uma solução 1,0 M de DIPC em DCM. Após agitação durante 1 h, lavou-se a resina com NMP (1x), DCM (2x) e considerou-se que o acoplamento estava completo através do teste da ninidrina. · Neutralizou-se a resina com 5% de DIPEA/DCM (1x 1 min.), 5% de DIPEA/DCM (1x10 min.) e DCM (4x), e rematou-se por adição de 19,7 ml (10 eq) de anidrido 85 455
ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 88 acético e 14,4 ml (4 eq) de DIPEA em DCM durante 10 min.. Por lavagem da resina com DCM (3x) obteve-se a BOC-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina).
Passo B: BOC-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina)
Nota: O ciclo de síntese seguinte foi usado para todos os acoplamentos subsequentes a esta amostra de resina: 1) Desproteger com 50% de TFA/DCM durante 1 min. 2) Desproteger com 50% de TFA/DCM durante 20 min.
3) Lavar a resina 4x com DCM 4) Neutralizar com 5% de DIPEA/DCM durante 1 min. 5) Neutralizar com 5% de DIPEA/DCM durante 5-10 min.
6) Lavar a resina 3x com DCM
7) Lavar a resina 1x com NMP 8) Pré-activar o BOC-aminoácido (3 eq) com BOP (3 eq) e HOBt (3 eq) em NMP durante 10 min., adicionar NMM (4,5 eq) e transferir para o vaso com a resina. Acoplar durante 1 h.
9) Lavar a resina 1χ com NMP
10) Lavar a resina 2x com DCM 11) Testar com ninidrina para avaliar a conclusão do acoplamento 12) Acoplar novamente, se necessário (passos 4-11) 13) Se o acoplamento estiver completo, prosseguir com os passos 1-11 para o acoplamento do resíduo seguinte.
Especificamente, a BOC-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina), vide supra, foi desbloqueada, lavada e acoplada com 16,4 g (3 eq) de BOC-L-Phe, 27,6 g de BOP, 8,4 g de HOBt e 10,3 ml de NMM durante 40 min. para dar a BOC-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) (teste da ninidrina negativo).
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Passo C: BOC-DpNal-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) A amostra anterior de BOC-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina), foi desbloqueada, lavada e acoplada com 13,1 g (2 eq) de BOC-D-p-naftilalanina, 18,3 g de BOP, 5,6 g de HOBt e 6,85 ml de NMM durante 1 h dando uma reacção incompleta (teste da ninidrina positivo). A resina foi reacoplada (ver passo 12 anterior) usando 6,55 g (1 eq) de BOC-D-p-naftilalanina, 9,2 g de BOP, 2,8 g de HOBt e 3,43 ml de NMM durante 1 h para dar a BOC-DpNal-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) (teste da ninidrina negativo).
Passo D: BOC-DpNal-DpNal-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) A amostra anterior de BOC-DpNal-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) foi desbloqueada, lavada e acoplada com 13,1 g (2 eq) de BOC-D-p-naftilalanina, 18,3 g de BOP, 5,6 g de HOBt e 6,85 ml de NMM durante 3 h para dar a BOC-DpNal-DpNal-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) (teste da ninidrina negativo).
Passo E: Ácido N-BOC-isonipecótico A uma solução fria de 12,4 g (0,31 mmol, 1,0 eq) de hidróxido de sódio em 300 ml de água e 600 ml de dioxano, adicionaram-se 40,0 g (0,31 mmol, 1,0 eq) de ácido isonipecótico, seguidos de 84,0 g (38 mmol, 1,2 eq) de dicarbonato de di-t-butilo. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 5 h, depois submeteu-se a partição entre acetato de etilo e ácido cítrico 0,5 N. Lavou-se a fase orgânica com água, salmoura, secou-se sobre sulfato de sódio e concentrou-se. O produto cristalino foi recolhido por filtração, lavado com hexano e seco sob vácuo. Rendimento: 64,0 g (90%). RMN-1H (300 MHz, CDCI3) δ 10,78 (1H, exc), 4,0 (2H, d), 2,85 (2H, t), 2,48 (1H, m), 1,9 (2H, m), 1,65 (2H, m), 1,42 (9H, s). EM (FAB, M+H) 230,1.
Passo F: BOC-(inip)-D|3Nal-DpNal-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) A amostra anterior de BOC-DpNal-DpNal-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina). foi desbloqueda, lavada e acoplada com 9,54 g (2 eq) de ácido BOC-isonipecótico, 18,3 g de BOP, 5,6 g de HOBt e 6,85 ml de NMM durante 1 h para dar a
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B0C-(inip)-DpNal-DpNal-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) (teste da ninidrina negativo).
Passo G: (inip)-DpNal-DpNal-Phe-Lys-amida A amostra anterior de BOC-(inip)-DpNal-DpNal-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) foi desbloqueda, lavada, neutralizada, lavada com DCM (4x), etanol (4x) e seca sob vácuo para dar 40,4 g de (inip)-DpNal-DpNal-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina). Transferiu-se a resina para um vaso reaccional de "teflon" e agitou-se com uma mistura de 200 ml de HF, 20 ml de anisolo e 20 ml de etilmetilsulfureto, a 0°C durante 1 h. Removeram-se os voláteis in vacuo, transferiu-se a resina para um funil de frita de vidro e lavou-se repetidamente com éter. Extraiu-se o produto a partir da resina por lavagens sucessivas com 10% de HOAc/água, acetonitrilo e água. Reuniram-se as lavagens e liofilizaram-se obtendo-se 7,5 g de um pó que foi purificado por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 Á, Vydac C-18, 5 χ 25 cm, gradiente: 25 - 45% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 200 min. a 50 ml/min., rt= 50 min.) para dar 4,39 g de (inip)-DpNal-DpNal-Phe-Lys-amida, sal de TFA, na forma de um pó incolor após liofilização. EM (electropulverização, M+H) 798,7.
Exemplo 2
(4-aminobutanoil)-DpNal-DpNal-Phe-Lys-amida, sal de TFA
Intumesceu-se a FMOC-DpNal-DpNal-Phe-(N-s-BOC)Lys-(Am-resina) (1,0 g, 0,32 mmol), do Exemplo 1, Método A, passo D, com DCM durante 15 min., desbloqueou-se com 20% de piperidina em DMA durante 15 min., e lavou-se com 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 91
DMA (5χ) e DCM (1χ) para dar a DpNal-DpNal-Phe-(N-8-BOC)Lys-(Am-resina) exibindo um teste da ninidrina positivo. Adicionou-se uma solução pré-activada de ácido N-BOC-4-aminobutírico (403 mg, 1,98 mmol), 875 mg (1,98 mmol) de BOP e 0,33 ml (2,97 mmol) de NMM em 15 ml de DMA/DCM (1:1). Após agitação durante 1 h, lavou-se a resina com DMA (5x, teste da ninidrina negativo), DCM (3χ), MeOH (2x) e secou-se in vacuo. Suspendeu-se a resina seca em 10 ml de TFA e adicionaram-se 0,50 ml de trietilsilano. Agitou-se a mistura durante 1 h, concentrou-se in vacuo e lavou-se a resina com éter. O péptido em bruto foi recuperado a partir da resina por lavagem com HOAc aq. a 10%, seguido de acetonitrilo. Os filtrados combinados foram liofilizados obtendo-se 245 mg de um sólido. Purificou-se uma alíquota de 50 mg por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 Λ, Vydac C-18, 1 x 50 cm, gradiente: 23 - 38% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 60 min. a 9 ml/min., rt= 25 min.) para dar 28 mg de (4-aminobutanoil)-DpNal-DpNal-Phe-Lys-amida, sal de TFA, na forma de um pó incolor após liofilização. EM (electropulverização, M+H) 772,4.
Exemplo 3
[4-(N-metllamino)butanoil]-DpNal-DpNal-Phe-Lys-amida,
sal de TFA
Passo A: Ácido BOC-4-(N-metilamino)butírico A uma solução a 0°C de 5,00 g (24,6 mmol) de ácido BOC-4-aminobutírico em 75 ml de THF seco, adicionaram-se 12,2 ml (197 mmol) de iodeto de metilo, seguidos de 2,95 g (73,8 mmol, dispersão a 60% em óleo mineral) de hidreto de sódio, em porções. Agitou-se rapidamente a mistura reaccional à temperatura
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92 ambiente durante 12 h e extinguiu-se pela adição cuidadosa de água. Submeteu-se a mistura a partição entre éter e água e extractou-se a fase orgânica com bicarbonato de sódio aquoso 1 N. Arrefeceram-se as fases aquosas combinadas e acidificaram-se até pH 3 com hidrogenossulfato de sódio 1N, depois extractaram-se com duas porções de acetato de etilo. As fases orgânicas combinadas foram lavadas sucessivamente com água, tiossulfato de sódio aquoso a 5%, água, salmoura e depois secaram-se sobre sulfato de magnésio anidro. Por concentração in vacuo obtiveram-se 5,00 g (94%) de ácido BOC-4-(N-metilamino)butírico. RMN-1H (300 MHz, CDCI3) δ 3,28 (2H, bt, J = 7 Hz), 2,84 (3H, s), 2,36 (2H, t, J = 7,5 Hz), 1,85 (2H, m), 1,45 (9H, s).
Passo B: [4-(N-metilamino)butanoil]-DpNal-DpNal-Phe-Lys-amida, sal de TFA
Seguindo o procedimento do Exemplo 2, desbloqueou-se FMOC-DpNal-DpNal-Phe-(N-s-BOC)Lys-(Am-resina) (0,50 g, 0,17 mmol, do Exemplo 1, Método A, Passo D) e acoplou-se ao ácido BOC-4-(N-metilamino)butírico (Passo A) (147 mg, 0,68 mmol) usando 300 mg (0,68 mmol) de BOP e 0,11 ml (1,02 mmol) de NMM. Por clivagem a partir da resina obtiveram-se, após liofilização, 120 mg de um sólido. Purificou-se uma alíquota de 62 mg por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 À, Vydac C-18, 1 x 50 cm, gradiente: 23 - 38% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 60 min. a 9 ml/min., rt= 23 min.) para dar 27 mg de [4-(N-metilamino)butanoil]-DpNal-DpNal-Phe-Lys-amida, sal de TFA, puro. EM (electropulverização, M+H) 786,4.
Exemplo 4
(inlp)-(N-Me-DpNal)-DTrp-Phe-Lys-amida, sal de TFA
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Passo A: DTrp-Phe-(N-s-BOC)Lys-(Am-resina)
Fez-se reagir uma amostra de 1 g (aprox. 0,4 mmol) de Phe-(N-s-BOC)Lys-(Am-resina) (Exemplo 1, Método A, Passo B) com uma solução pré-activada de 0,85 g (2,0 mmol) de FMOC-D-triptofano, 0,88 g de BOP e 0,33 ml de NMM durante 1 h. Por lavagem e desprotecção de acordo com o protocolo geral anterior obteve-se a DTrp-Phe-(N-s-BOC)l_ys-(Am-resina), mostrando um teste da ninidrina positivo.
Passo B: BOC-N-Metil-D-p-naftilalanina (BOC-N-Me-DpNal) A uma solução agitada de N-BOC-D-p-naftilalanina (15,0 g, 47,6 mmol) e de iodeto de metilo (14,8 ml, 238 mmol), em THF, fria (0°C), adicionou-se hidreto de sódio (5,70 g de dispersão a 60% em óleo mineral, 143 mmol)), em porções durante 45 min.. Deixou-se a mistura aquecer lentamente até à temperatura ambiente durante 16 h e depois concentrou-se parcialmente e verteu-se sobre 1 I de solução aquosa diluída de bicarbonato de sódio. Extraíram-se as espécies neutras para acetato de etilo e rejeitaram-se. Acidificou-se a fase aquosa com ácido cítrico e extraíu-se o produto para acetato de etilo, lavou-se com bissulfito de sódio diluído, salmoura, secou-se sobre sulfato de magnésio e concentrou-se. Cristalizou-se o produto em bruto a partir de DCM/hexano obtendo-se 14,9 g (95%) do composto do título. RMN-Ή (300 MHz, CDCI3, isómeros rotacionais evidentes) δ 1,31 (9H, 2s, BOC), 2,70 (3H, 2s, N-Me), 3,32 (2H, m, CH2Ar), 4,80 (1H, m, CH), 7,54 (7H, m, Ar). EM (FAB, M+H) 330,2.
Passo C: FMOC-N-Metil-D-p-naftilalanina (FMOC-N-Me-DpNal)
Dissolveu-se BOC-N-metil-D-p-naftilalanina (10,0 g, 30,4 mmol) em TFA (100 ml) e agitou-se durante 1 h. Removeu-se o TFA sob vácuo e combinou-se o resíduo com carbonato de 9-fluorenilmetilsuccinimidilo (13,3 g, 40,0 mmol), carbonato de potássio (6,2 g, 45 mmol), THF (300 ml), água (124 ml) e agitou-se à temperatura ambiente durante 18 h. Submeteu-se a mistura reaccional a partição entre acetato de etilo e HCI aq. diluído e lavou-se a fase orgânica com salmoura, secou-se sobre sulfato de magnésio e concentrou-se. Recolheu-se o produto cristalino por filtração e lavou-se com hexano obtendo-se 12,9 g (94%) do composto do título. RMN-1H (300 MHz, DMSO-d6, isómeros rotacionais evidentes) δ
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 94 2,70 (3Η, 2s, NMe), 3,20 (2Η, m, CH2Ar), 4,18 (3H, m, OCH2 e CHAr), 4,90 (1H, m, COCHN), 7,0 a 8,0 (15 H, m, Ar), 13,0 (1H, s, COOH). [a]20d = +48,0° (c = 1,625 em MeOH/DCM 1:1). EM (FAB, M+H) 452,3.
Passo D: (N-Me-DpNal)-DTrp-Phe-(N-s-BOC)Lys-(Am-resina)
Agitou-se a DTrp-Phe-(N-s-BOC)Lys-(Am-resina) do Passo A com uma solução pré-activada de 0,68 g (1,5 mmol) de FMOC-(N-Me-DpNal), 0,88 g de BOP e 0,33 ml de NMM durante 3 h. Por lavagem e desprotecção de acordo com o protocolo geral do FMOC obteve-se a (N-Me-DpNal)-DTrp-Phe-(N-s-BOC)Lys-(Am-resina) exibindo uma cor-de-laranja clara no teste da ninidrina.
Passo E: (inip)-(N-Me-DpNal)-DTrp-Phe-Lys-amida, sal de TFA
Tratou-se a (N-Me-DpNal)-DTrp-Phe-(N-s-BOC)Lys-(Am-resina) (1,0 g, 0,32 mmol, Passo D) com uma solução pré-activada de 0,88 g (2,5 mmol) de ácido N-FMOC-isonipecótico, 1,10 g de BOP e 0,66 ml de NMM durante 4 h. Após lavagem com DMA (5x), um teste da ninidrina mostrou que a reacção estava incompleta. Acoplou-se novamente a resina usando 0,88 g (2,5 mmol) de ácido N-FMOC-isonipecótico, 0,56 g de BOP-CI e 0,87 ml de DIPEA durante 12 h (teste da ninidrina negativo). A resina foi lavada, desbloqueda com 20% de pideridina em DMA, lavada e seca irt vacuo. Por clivagem com TFA e extracção de acordo com o protocolo geral obtiveram-se, após liofilização, 75 mg de um sólido que foram purificados por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 À, Vydac C-18, 1x 50 cm, gradiente: 17 - 32% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 60 min. a 9 ml/min., rt= 45 min.) para dar 23 mg de produto impuro. Por nova cromatografia (15-20 μ, 300 A, Vydac C-18, 1χ 50 cm, gradiente: 35 - 55% de metanol (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 80 min. a 10 ml/min., rt= 30 min.) obtiveram-se 11 mg do composto do título puro. EM (electropulverização, M+H) 801,6. 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 95
Exemplo 5 ΗΙ
(inlp)-(N-Me-DpNal)-DpNal-Phe-Lys-amida, sal de TFA
Passo A: (N-Me-DpNal)-DpNal-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina)
Uma amostra de 0,8 g (aprox. 0,3 mmol) de BOC-DpNal-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) (Exemplo 1, Método B, Passo C) foi desbloqueda, lavada e feita reagir com uma solução pré-activada de 0,33 g (1,0 mmol) de BOC-(N-Me-DpNal) (Exemplo 4, Passo B), 0,44 g de BOP, 0,14 g de HOBt e 0,11 ml de NMM em DMA durante 1,5 h. Por lavagem e desprotecção, de acordo com o protocolo geral do BOC, obteve-se o composto do título exibindo uma cor-de-laranja claro no teste da ninidrina positivo.
Passo B: (inip)-(N-Me-DpNal)-DpNal-Phe-Lys-amida, sal de TFA
Tratou-se o intermediário do passo A com 0,23 g (1,0 mmol) de ácido N-BOC-isonipecótico (Exemplo 1, Método B, Passo E), 0,29 g de BOP-CI e 0,20 ml de DIPEA em DCM durante 12 h. Por lavagem, secagem e clivagem de acordo com o protocolo geral do BOC anterior obtiveram-se 250 mg de um pó. Purificou-se uma alíquota de 102 mg por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 Â, Vydac C-18,1x 50 cm, gradiente: 23 - 38% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 60 min. a 9 ml/min., rt= 32 min.) para dar 23 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 812,4.
(inip)-DpNal-(N-Me-DpNal)-Phe-Lys-amida, sal de TFA
Passo A: (N-Me-DpNal)-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina)
Uma amostra de 0,8 g (aprox. 0,30 mmol) de BOC-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) (Exemplo 1, Método B, Passo B) foi desbloqueda, lavada e feita reagir com uma solução pré-activada em DMA de 0,33 g (í,0 mmol) de BOC-(N-Me-DpNal) (Exemplo 4, Passo B), 0,44 g de BOP, 0,14 g de HOBt e 0,11 ml de NMM durante 1,5 h. Por lavagem e desprotecção, de acordo com o protocolo geral do BOC anterior, obteve-se o composto do título, exibindo uma cor-de-laranja claro, teste da ninidrina positivo.
Passo B: DpNal-(N-Me-DpNal)-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina)
Tratou-se o intermediário do passo A com 0,32 g (1,0 mmol) de N-BOC-D-β-naftilalanina, 0,29 g de BOP-CI e 0,20 ml de DIPEA em DCM durante 12 h. Por lavagem e desprotecção de acordo com o protocolo geral do BOC anterior obteve-se o composto do título exibindo um teste de ninidrina positivo.
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 97
Passo C: (inip)-DpNal-(N-Me-DpNal)-Phe-Lys-amida, sal de TFA
Fez-se reagir o intermediário do passo B com uma solução pré-activada de 0,23 g (1,0 mmol) de ácido N-BOC-isonipecótico, 0,44 g de BOP, 0,14 g de HOBt e 0,11 ml de NMM em DMA durante 1 h. Por desbloqueamento, lavagem, secagem e clivagem com HF, de acordo com o protocolo geral do BOC anterior, obtiveram-se 200 mg de um pó. Purificou-se uma alíquota de 67 mg por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 Â, Vydac C-18, 1x 50 cm, gradiente: 13 - 28% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 60 min. a 9 ml/min., rt= 30 min.) para dar 25 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 812,4.
Exemplo 7
(5-Aminovaleril)-{N-Me-DpNal)-DpNal-Phe-Lys-amida,
sal de TFA
Passo A: BOC-(N-Me-DpNal)-DpNal-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina)
Uma amostra de 0,33 mmol de BOC-DpNal-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) (Exemplo 1, Método B, Passo C) foi tratada com TFA, desbloqueada, neutralizada, lavada e acoplada com 3 eq de BOC-(N-Me-DpNal) (do Exemplo 4, Passo B), 3 eq de BOP, 3 eq de HOBt e 4,5 eq de NMM em DMA/DCM durante 1 h. Lavou-se a resina com DMA (5x) obtendo-se o composto do título (teste da ninidrina negativo). 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
98
Passo Β: (5-Aminovaleril)-(N-Me-DpNal)-DpNal-Phe-Lys-amida, sal de TFA A amostra anterior de BOC-(N-Me-DpNal)-DpNal-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) foi desbloqueada com TFA, neutralizada, lavada e acoplada com 4 eq de ácido N-BOC-5-aminovalérico, 4 eq de BOP-CI e 6 eq de DIPEA em DCM de um dia para o outro. Após confirmação do acoplamento completo com o teste da ninidrina, desbloqueou-se o péptido com TFA, lavou-se e secou-se in vacuo para dar a (5-aminovaleril)-(N-Me-DpNal)-Dpi\lal-Phe-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina). Clivou-se o péptido da resina e liofilizou-se, usando os métodos descritos no procedimento geral, para dar 193 mg de um sólido em bruto. Purificou-se uma alíquota de 53 mg por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 À, Vydac C-18, 1x 50 cm, gradiente: 23 - 38% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 60 min. a 9 ml/min., rt= 43 min.) para dar 7,4 mg de (5-aminovaleril)-(N-Me-DpNal)-DpNal-Phe-Lys-amida, sal de TFA, puro, na forma de um pó incolor após liofilização. EM (electropulverização, M+H) 800,2.
Exemplo 8
(inip)-DpNal-DpNal-aNal-Lys-amida, sal de TFA
Passo A: BOC-aNal-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina)
Uma amostra de 1,0 g de BOC-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) do Exemplo 1, Método B, Passo A, foi desbloqueada, lavada, neutralizada com 5% de
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 99 DIPEA/DCM, lavada e acoplada com 945 mg (3 mmol) de BOC-L-a-naftilalanina, 1.32 g de BOP e 0,45 ml de NMM, durante 1 h, obtendo-se a BOC-aNal-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) (teste da ninidrina negativo).
Passo B: BOC-DpNal-aNal-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) O intermediário do Passo A foi desbloqueado, lavado, neutralizado com 5% de DIPEA/DCM, lavado e acoplado com 945 mg (3 mmol) de BOC-D-β-naftilalanina, 1,32 g de BOP e 0,45 ml de NMM, durante 1 h, obtendo-se a BOC-DpNal-aNal-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) (teste da ninidrina negativo).
Passo C: BOC-DpNal-DpNal-aNal-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) A resina do Passo B foi desbloqueada, lavada, neutralizada com 5% de DIPEA/DCM, lavada e acoplada com 945 mg (3 mmol) de BOC-D-p-naftilalanina, 1.32 g de BOP e 0,45 ml de NMM, durante 1 h, obtendo-se a BOC-DpNal-DpNal-aNal-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) (teste da ninidrina negativo).
Passo D: (inip)-DpNal-DpNal-aNal (2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) A resina do Passo C foi desbloqueada, lavada, neutralizada com 5% de DIPEA/DCM, lavada e acoplada com 690 mg (3 mmol) de ácido N-BOC-isonipecótico, 1,32 g de BOP e 0,45 ml de NMM, durante 1 h, obtendo-se a BOC-(inip)-DpNal-DpNal-aNal-(2-CI-CBZ)Lys-(MBHA-resina) (teste da ninidrina negativo). A resina foi desbloqueada, lavada com metanol e seca in vacuo obtendo-se 1,1 g do composto do título.
Passo E: (inip)-DpNal-DpNal-aNal-Lys-amida, sal de TFA A resina anterior (1,1 g) foi clivada com HF de acordo com o procedimento geral para dar 87 mg de um sólido que foi purificado por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 Â, Vydac C-18, 1x 50 cm, gradiente: 25 - 40% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 60 min. a 9 ml/min., rt= 32 min.) para dar 11 mg . de (inip)-DpNal-DpNal-aNal-Lys-amida, sal de TFA, puro. EM (electropulverização, M+H) 848,4.
100 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
Exemplo 9
(4-Aminobutanoil)^Nal-DpNal-pNal-[N-(3-aminopropil)]amida,
sal de TFA
Passo A: 1,3-Propanodiaminocarbonilbenziloxi-resina (PDA-COO-resina)
Lavou-se resina de hidroximetilo (10 g, 1 meq/g, 100-200 mesh, Bachem RMIS35) com 5% de DIPEA/DCM, tolueno (6x), suspendeu-se em 60 ml de tolueno e agitou-se gentilmente com borbulhar de azoto. Adicionou-se uma solução de fosgénio em tolueno (70 ml, 1,93 M, Fluka) e, após 20 min., lavou-se a resina com tolueno (6x), ressuspendeu-se em 60 ml de THF seco e adicionou-se 1,3-propanodiamina (5,0 g, Fluka). Agitou-se a mistura durante 1 h, lavou-se com DMA (5x) e verificou-se que dava um teste da ninidrina positivo. Adicionou-se uma solução de 10% de TFA em DCM e lavou-se a resina com DCM (4x), metanol (2x) e secou-se In vacuo.
Passo B: BOC-pNal-(PDA-COO-resina)
Uma amostra de 3,0 g de PDA-COO-resina foi neutralizada com 5% de DIPEA/DCM, lavada e acoplada com 2,84 g (9,0 mmol) de BOC-pNal, 3,96 g de BOP e 1,5 ml de NMM durante 1 h (teste da ninidrina negativo). Após lavagem com DCM, lavou-se a resina com metanol e secou-se.
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 10.1
Passo C: BOC-DpNal-pNal-(PDA-COO-resina)
Uma amostra de 1,0 g da resina do Passo B foi desbloqueada, lavada, neutralizada com 5% de DIPEA/DCM, lavada e acoplada com 945 mg (3,0 mmol) de BOC-DpNal, 1,32 g de BOP e 0,45 ml de NMM durante 1 h, obtendo-se a BOC-DpNal-pNal-(PDA-COO-resina) (teste da ninidrina negativo).
Passo D: BOC-DpNal-DpNal-pNal-(PDA-COO-resina) A amostra anterior foi lavada, desbloqueada, lavada, neutralizada com 5% de DIPEA/DCM, lavada e acoplada com 945 mg (3,0 mmol) de BOC-DpNal, 1,32 g de BOP e 0,45 ml de NMM durante 1 h, obtendo-se a BOC-DpNal-DpNal-pNal-(PDA-COO-resina) (teste da ninidrina negativo).
Passo E: (4-Aminobutanoil)-DpNal-DpNal-pNal-(FDA-COO-resina) A amostra anterior foi lavada, desbloqueada, lavada, neutralizada com 5% de DIPEA/DCM, lavada e acoplada com 609 mg (3,0 mmol) de ácido N-BOC-4-aminobutírico, 1,32 g de BOP e 0,45 ml de NMM durante 1 h (teste da ninidrina negativo). A resina foi lavada, desbloqueada, lavada com metanol e seca in vacuo obtendo-se 1,3 g do composto do título.
Passo F: (4-Aminobutanoil)-DpNal-DpNal-pNal-[N-(3-aminopropil)]amida, sal de TFA A resina anterior (1,3 g) foi clivada com HF para dar 225 mg de um sólido após liofilização. Purificou-se uma amostra de 60 mg por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 Â, Vydac C-18, 1x 50 cm, gradiente: 25 - 40% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 60 min. a 9 ml/min., rt= 30 min.) para dar 29 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 751,4. 102 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
Exemplo 10
DpNal-pNal-pNal-[N-(3-aminopropil)]amida, sal de TFA
Passo A: BOC^Nal-pNal-(PDA-COO-resina)
Uma amostra de 2 g de BOC-pNal-(PDA-COO-resina) (do Exemplo 9, Passo B) foi lavada, desbloqueada, lavada, neutralizada com 5% de DIPEA/DCM, lavada e acoplada com 1,89 g (6,0 mmol) de BOC-pNal, 2,64 g de BOP e 0,90 ml de NMM durante 1 h, obtendo-se a BOC-pNal-pNal-(PDA-COO-resina) (teste da ninidrina negativo). A resina foi lavada com metanol e seca in vacuo obtendo-se o composto do título.
Passo B: BOC-DpNal-pNal-pNal-(PDA-COO-resina)
Uma grama da amostra anterior foi desbloqueada, lavada, neutralizada com 5% de DIPEA/DCM, lavada e acoplada com 945 mg (3,0 mmol) de BOC-DpNal, 1,32 g de BOP e 0,45 ml de NMM durante 1 h, obtendo-se a BOC-DpNal-pNal-pNal-(PDA-COO-resina) (teste da ninidrina negativo). A resina foi lavada, desbloqueada, com metanol e seca in vacuo.
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 103
Passo C: DpNal-pNal-pNal-[N-(3-aminopropil)]amida, sal de TFA A resina anterior (1,15 g) foi clivada com HF para dar 99 mg de um sólido após liofilização. Purificou-se a amostra como no Exemplo 2 (gradiente: 27%-42% em 60 min. (rt= 22 min.)) para dar 58 mg de DpNal-pNal-pNal-[N-{3-aminopropil)]amida, sal de TFA. EM (electropulverização, M+H) 666,4.
Exemplo 11
Acetil-DpNal-pNal-pNal-[N-(3-aminopropil)]amida,
sal de TFA
Passo A: Acetil-DpNal-pNal-pNal-(PDA-COO-resina)
Uma amostra de 1,0 g do produto do Exemplo 10, Passo B, foi desbloqueada, neutralizada com 5% de DIPEA/DCM e acoplada com anidrido acético (2 ml) em 5% de DIPEA/DCM (10 ml), obtendo-se a acetil-DpNal-pNal-pNal-(PDA-COO-resina) (teste da ninidrina negativo). A resina foi lavada com metanol e seca in vacuo obtendo-se 1,23 g de resina.
Passo B: Acetil-DpNal-pNal-pNal-[N-(3-aminopropil)]amida, sal de TFA A resina anterior (1,23 g) foi clivada com HF para dar 155 mg de um pó após liofilização. Purificou-se uma amostra de 68 mg como no Exemplo 2 (gradiente: 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
104 30% - 45% em 60 min. (rt= 40 min.)) para dar 31 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 708,4.
Exemplo 12
(5-Aminovaleril)-DPhe-pNal-pNal-Lys-amida, sal de TFA
Passo A: pNal-(N-s-BOC)Lys-(Am-resina)
Fez-se reagir uma amostra de 0,5 g (aprox. 0,25 mmol) de (N-s-BOC)Lys-(Am-resina) (Exemplo 1, Método A, Passo A) com uma solução pré-activada de 0,44 g (1,0 mmol) de FMOC-L-pNal, 0,44 g de BOP e 0,17 ml de NMM durante 1 h. Por lavagem e desprotecção de acordo com o protocolo geral anterior obteve-se o composto do título.
Passo B: pNal-pNal-(N-s-BOC)Lys-(Am-resina)
Fez-se reagir o produto do Passo A com uma solução pré-activada de 0,44 g (1,0 mmol) de FMOC-L-pNal, 0,44 g de BOP e 0,17 ml de NMM durante 1 h. Por lavagem e desprotecção de acordo com o protocolo geral anterior obteve-se o composto do título.
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 105
Passo C: DPhe^Nal-pNal-(N-E-BOC)Lys-(Am-resina)
Fez-se reagir o produto do Passo B com uma solução pré-activada de 0,39 g (1,0 mmol) de FMOC-D-fenilalanina, 0,44 g de BOP e 0,17 ml de NMM durante 1 h. Por lavagem e desprotecção de acordo com o protocolo geral anterior obteve-se o composto do título.
Passo D: (5-Aminovaleril)-DPhe-pNal-pNal-Lys-amida, sal de TFA
Fez-se reagir o produto do Passo C com uma solução pré-activada de 0,22 g (1,0 mmol) de ácido N-BOC-5-aminovalérico, 0,44 g de BOP e 0,17 ml de NMM durante 1 h. Por lavagem, secagem e clivagem de acordo com o protocolo geral do FMOC anterior obtiveram-se 100 mg de um pó. Purificou-se uma alíquota de 51 mg por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 Â, Vydac C-18, 1x 50 cm, gradiente: 25 - 40% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 60 min. a 9 ml/min., rt= 25 min.) para dar 23 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 786,5.
Exemplo 13
(5-Aminovaleril)-DPhe-pNal-pNal-[N-(4-aminobutil)]amida,
sal de TFA 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 106
Passo A: 1,4-Butanodiaminocarbonilbenziloxi-resina (BDA-COO-resina)
Lavou-se resina de hidroximetilo (10 g, 1 meq/g, 100-200 mesh, Bachem RMIS35) com 5% de DIPEA/DCM, tolueno (6x), suspendeu-se em 60 ml de tolueno e agitou-se gentilmente com borbulhar de azoto. Adicionou-se uma solução de fosgénio em tolueno (70 ml, 1,93 M, Fluka) e, após 20 min., lavou-se a resina com tolueno (6x), ressuspendeu-se em 60 ml de THF seco e adicionou-se 1,4-diaminobutano (5,0 g, Fluka). Agitou-se a mistura durante 1 h, lavou-se com DMA (5x) e verificou-se que dava um teste da ninidrina positivo. Adicionou-se uma solução de 10% de TFA em DCM e lavou-se a resina com DCM (4x), metanol (2x) e secou-se in vacuo.
Passo B: BOC-pNal-(BDA-COO-resina)
Uma amostra de 1 g de BDA-COO-resina do Passo A foi neutralizada com 5% de DIPEA/DCM, lavada e acoplada com 945 mg (3 mmol) de BOC-pNal, 1,32 g de BOP e 0,45 ml de NMM durante 1 h, obtendo-se a BOC-pNal-(BDA-COO-resina) (teste da ninidrina negativo).
Passo C: BOC-pNal-pNal-(BDA-COO-resina) A amostra anterior foi desbloqueada, lavada, neutralizada com 5% de DIPEA/DCM, lavada e acoplada com 945 mg (3 mmol) de BOC-pNal, 1,32 g de BOP e 0,45 ml de NMM durante 1 h, obtendo-se a BOC-pNal-pNal-(BDA-COO-resina) (teste da ninidrina negativo).
Passo D: BOC-DPhe-pNal-pNal-(BDA-COO-resina) A amostra anterior foi desbloqueada, lavada, neutralizada com 5% de DIPEA/DCM, lavada e acoplada com 795 mg (3 mmol) de BOC-D-fenilalanina, 1,32 g de BOP e 0,45 ml de NMM durante 1 h, obtendo-se a BOC-DPhe-pNal-pNal-(BDA-COO-resina) (teste da ninidrina negativo). 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 107
' V·
Passo Ε: BOC-(5-aminovaleril)-DPhe-pNal-|3Nal-(BDA-COO-resina) A resina do Passo D foi desbloqueada, lavada, neutralizada com 5% de DIPEA/DCM, lavada e acoplada com 621 mg (3 mmol) de ácido N-BOC-5-aminovalérico, 1,32 g de BOP e 0,45 ml de NMM durante 1 h, obtendo-se a BOC-(5-aminovaleril)-DPhe-pNal-pNal-(BDA-COO-resina) (teste da ninidrina negativo). A resina foi lavada, desbloqueada, lavada com metanol e seca in vacuo.
Passo F: (5-Aminovaleril)-DPhe-pNal-pNal-[N-(4-aminobutil)]amida, sal de TFA A resina anterior (1,1 g) foi desbloqueada com HF para dar 72 mg de sólido após liofilização. Purificou-se a amostra como no Exemplo 2 com um gradiente de 25%-40% (rt= 22 min.) para dar 16 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 729,5.
Exemplo 14
(inip)-DpNal-DpNal-Phe-amida, sal de TFA
Passo A: Phe-(MBHA-resina)
Uma amostra de 8,0 g de resina MBHA (com uma substituição de 0,57 mmol/g, 4,56 mmol) foi neutralizada, lavada e feita reagir com uma solução pré-activada de 5,30 g (13,7 mmol) de BOC-L-fenilalanina, 6,05 g de BOP, 1,85 g de HOBt e 1,5 ml de NMM em DMA durante 1,5 h. Por lavagem e desprotecção de * acordo com o protocolo geral do BOC anterior obteve-se o composto do título.
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 108
Passo Β: DpNal-Phe-(MBHA-resina)
Fez-se reagir ο intermediário do Passo A com uma solução pré-activada de 2.87 g (9,12 mmol) de N-BOC-D-p-naftilalanina, 4,03 g de BOP, 1,23 g de HOBt e 1.00 ml de NMM em DMA durante 1,5 h. Por lavagem e desprotecção obteve-se o composto do título.
Passo C: DpNal-DpNal-Phe-(MBHA-resina)
Fez-se reagir o intermediário do Passo B com uma solução pré-activada de 2.87 g (9,12 mmol) de N-BOC-D-p-naftilalanina, 4,03 g de BOP, 1,23 g de HOBt e 1.00 ml de NMM em DMA durante 1,5 h. Por lavagem e desprotecção de acordo com o protocolo geral do BOC obteve-se o composto do título.
Passo D: (inip)-DpNal-DpNal-Phe-amida, sal de TFA
Fez-se reagir metade da resina intermediária do Passo C (2,28 mmol) com uma solução pré-activada de 1,57 g (6,84 mmol) de ácido N-BOC-isonipecótico, 3,02 g de BOP e 1,00 ml de NMM em DMA durante 3 h. Por desbloqueamento, lavagem, secagem e clivagem com HF de acordo com o protocolo geral do BOC anterior obtiveram-se 560 mg de um pó que foi purificado por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 Â, Vydac C-18, 1x 50 cm, gradiente: 30-44% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 150 min. a 9 ml/min., rt= 60 min.) para dar 436 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 670,4.
Exemplo 15
(inip)-DpNal-DT rp-Phe-amida, sal de TFA 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 109
Passo A: DTrp-Phe-(MBHA-resina)
Fez-se reagir uma amostra de 2,0 g (aprox. 1,14 mmol) de Phe-(MBHA-resina) (do Exemplo 14, Passo A) com uma solução pré-activada de 1,04 g (3,42 mmol) de N-BOC-triptofano, 1,51 g de BOP, 0,46 g de HOBt e 0,38 ml de NMM em DMA durante 1,5 h. Por lavagem e desprotecção de acordo com o protocolo geral do BOC anterior obteve-se o composto do título.
Passo B: Οβ^Ι-φΤΓρ^ΡΙίΘ-ίΜΒΗΑ-Γβείηθ)
Fez-se reagir o intermediário do Passo A com uma solução pré-activada de 1,08 g (3,42 mmol) de N-BOC-D-p-naftilalanina, 1,51 g de BOP, 0,46 g de HOBt e 0,38 ml de NMM em DMA durante 1,5 h. Por lavagem e desprotecção de acordo com o protocolo geral do BOC anterior obteve-se o composto do título.
Passo C: (inip)-DpNal-(DTrp)-Phe-amida, sal de TFA
Fez-se reagir o intermediário do Passo B com uma solução pré-activada de 0,78 g (3,42 mmol) de ácido N-BOC-isonipecótico, 1,51 g de BOP, 0,46 g de HOBt e 0,38 ml de NMM em DMA durante 2 h. Por desbloqueamento, lavagem, secagem e clivagem com HF de acordo com o protocolo geral do BOC anterior obtiveram-se 240 mg de um pó. Purificou-se uma alíquota de 50 mg por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 Â, Vydac C-18, 1x 50 cm, gradiente: 23 - 38% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 60 min. a 9 ml/min., rt= 30 min.) para dar 23 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 659,2.
Exemplo 16
(inip)-DpNal-DpNal-Phe, sal de TFA 110 110 sy 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
Passo A: BOC-DpNal-Phe-(O-resina)
Intumesceu-se resina N-BOC-Phe-(O-resina) disponível comercialmente (8,0 g, 0,55 mmol/g, 4,41 mmol, 1,0 eq) em DCM, desbloqueou-se, lavou-se e acoplou-se com 2,78 g (8,82 mmol, 2,0 eq) de N-BOC-D-p-naftilalanina usando 7,8 g de BOP, 1,2 g de HOBt e 1,45 ml de NMM durante 3 h, para dar a N-BOC-DpNal-Phe-(O-resina) (teste da ninidrina negativo) após lavagem.
Passo B: BOC-DpNal-DpNal-Phe-(O-resina) A amostra anterior de ΒΟΟϋβΝθΙ-ΡΙιβ-ίΟ-Γβείηβ) foi desbloqueada, lavada e acoplada com 2,78 g (8,82 mmol, 2,0 eq) de BOC-D-P-naftilalanina usando 7,8 g de BOP, 1,2 g de HOBt e 1,45 ml de NMM durante 3 h para dar a BOC-DpNal-ϋβΝ3ΐ-ΡΜβ-(0-Γβ5ίη3) (teste da ninidrina negativo).
Passo C: BOC-(inip)^Nal^Nal-Phe-(0-resina) A amostra anterior de BOC^Nal^Nal-Phe-(O-resina) foi desbloqueda, lavada e acoplada com 3,0 g (13,2 mmol, 3,0 eq) de ácido N-BOC-isonipecótico (do Exemplo 1, Método B, Passo E), usando 7,8 g de BOP, 1,2 g de HOBt e 1,45 ml de NMM durante 2 h para dar a ΒΟΟ-(ίηΐρ)-ΟβΝ3ΐ-ΟβΝ3ΐ-ΡΙιβ-(0-Γβ5ϊη3) (teste da ninidrina negativo), que foi lavada com metanol e seca in vacuo. Rendimento: 10,1 9-
Passo D: (inip)-DpNal^Nal-Phe, sal de TFA
Intumesceu-se uma amostra de 3,0 g da BOC-(inipH^NaM^Nal-Phe-(0-resina) anterior em DCM, desbloqueou-se, lavou-se com metanol, secou-se e o produto foi clivado da resina pelo procedimento do HF geral para dar 790 mg de (ίηίρ^ΟβΝθΙ-ϋβΝθΙ-ΡΜβ com uma pureza de aproximadamente 90%. Purificou-se uma alíquota de 37 mg por HPLC (Vydac C-18, 27 a 42% de acetonitrilo em água durante 60 min., 0,1% de TFA, 9 ml/min., 214 nm, rt= 41-51 min.) para dar 4,3 mg do composto do título. EM (electropulverizaçâo, M+H) 671,2. 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ Exemplo 17 111
(inip)-DpNal-DpNal-Phe-metiléster, sal de TFA A uma solução de 50 mg de (inip)-DpNal-DpNal-Phe (do Exemplo 16, Passo D) em 20 ml de metanol, adicionaram-se 10 gotas de HCI 1 M em dietiléter. Após agitação de um dia para o outro, concentrou-se a mistura reaccional e purificou-se o produto por HPLC para dar 22 mg do composto do título (Vydac C-18, 1x 50 cm, 9 ml/min., 27 a 42% de acetonitrilo em água durante 60 min., 0,1% de TFA, 214 nm, rt= 39-52 min.). EM (electropulverização, M+H) 685,4.
Exemplo 18
(inip)-DpNal-OpNal-(L-fenilalanol), sal de TFA 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 112
Passo A: BOC-(inip)-DpNal-DpNal-(L-fenilalanol) Α 50 ml de THF seco adicionaram-se 1,5 g (ca. 0,8 mmol, 1,0 eq) de BOC-(inip)-DpNal-DpNal-Phe-(O-resina) (do Exemplo 16, Passo C) e 4,0 ml (80 mmol, 10 eq) de solução 2,0 M de boro-hidreto de lítio em THF. Agitou-se gentilmente a mistura reaccional durante 1,5 h, adicionaram-se gota-a-gota 10 ml de HOAc e cóntinuou-se a agitação durante mais 0,5 h. Removeu-se a resina por filtração, lavou-se com metanol e evaporaram-se parcialmente os filtrados combinados. Submeteu-se o produto a partição entre acetato de etilo e água e lavou-se a fase orgânica com salmoura, secou-se e evaporou-se, e cristalizou-se o produto em acetato de etilo. I.V. (cm'1): 3409, 3289, 2957, 2930, 1695, 1635, 1536, 1164, 739, 699. EM (FAB, M+H) 757,4.
Passo B: (inip)-DpNal-DpNal-(L-fenilalanol), sal de TFA
Tratou-se uma solução de 50 mg de BOC-(inip)-DpNal-DpNal-(L-fenilalanol) (Passo A) em 2 ml de DCM, com 2 ml de THF durante 1 h, concentrou-se e purificou-se o produto por HPLC (Vydac C-18, 1 χ 50 cm, 31 a 45% de acetonitrilo em água durante 60 min., 0,1% de TFA, 9 ml/min., 214 nm, rt= 38-45 min.). EM (electropulverização, M+H) 657,4.
Exemplo 19
NH2
(inip)-DpNal-DpNal-(3(S)-3-benzil-p-Ala)amida sal de TFA 113 113 /y / <·· --. 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
Passo A: Acido 3(S)-3-(t-butoxicarbonilamino)-4-fenilpropiónico (N-BOC-3(S) 3-benzil-p-Ala)
Este composto foi o mais convenientemente preparado pelo método de Ondetti e Engel, J. Med. Chem. 18(7), (1975), 761-763. Usando este procedimento, converteram-se 2,0 g de N-BOC-L-fenilalanina, disponível comercialmente, em 760 mg do composto do título com um rendimento global de 36%. RMN-1H (300 MHz, CDCI3) δ 11,3 (1H, s, exc.), 7,2 (5H, m), 5,1 (1H, d), 2,85 (2H, m), 2,5 (2H, m), 1,4 (9H, s). I.V. (cm1) 3316, 2977, 2930, 1709, 1662, 1496, 1370, 1164, 1050, 1025, 746, 699. EM (FAB, M+H) 280,0.
Passo B: BOC-(3(S)-3-benzil-p-Ala)-(MBHA-resina)
Intumesceu-se uma amostra de 2,54 g de MBHA-resina (0,64 mmol/g, 2,06 mmol) em DCM/DMA 1:1 e acoplou-se com 0,60 g (2,15 mmol, 1,1 eq) de N-BOC-(3(S)-3-benzil-p-Ala) (do Passo A) usando 1,44 g de BOP, 241 mg de HOBt e 196 llI de NMM durante 72 h. Lavou-se a resina e rematou-se por acetilação com uma mistura de anidrido acético, TEA e piridina em DCM durante 15 min., obtendo-se o composto do título após lavagem (teste da ninidrina negativo).
Passo C: BOC-DpNal-(3(S)-3-benzil-p-Ala)-(MBHA-resina) A amostra anterior de BOC-(3(S)-3-benzil-p-Ala)-(MBHA-resina) foi desbloqueada, lavada e acoplada com N-BOC-D-p-naftilalanina usando 2,85 g de BOP, 290 mg de HOBt e 708 pl de NMM durante 2 h, de acordo com o procedimento geral, para dar a BOC-DpNal-(3(S)-3-benzil-p-Ala)-(MBHA-resina) (teste da ninidrina negativo).
Passo D: BOC-DpNal>DpNal-(3(S)-3-benzil^-Ala)-(MBHA-resina) A amostra anterior de BOC-DpNal-(3(S)-3-benzil-p-Ala)-(MBHA-resina) foi desbloqueada, lavada e acoplada com N-BOC-D-p-naftilalanina usando 2,85 g de BOP, 290 mg de HOBt e 708 μΙ de NMM durante 2 h para dar o composto do título. (teste da ninidrina negativo).
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 114
Passo Ε: BOC-(inip)-DpNal-DpNal-(3(S)-3-benzil-p-Ala)-(MBHA-resina) Ο produto do Passo D foi desbloqueado, lavado e acoplado com ácido N-BOC-isonipecótico, usando 2,85 g de BOP, 581 mg de HOBt e 708 μΙ de NMM durante 18 h para dar a BOC-(inip)-DpNal-DpNal-(3(S)-3-benzil-p-Ala)-(MBHA-resina) (teste da ninidrina negativo)
Passo F: (inip)-DpNal-DpNal-(3(S)-3-benzil-p-Ala)amida, sal de TFA A amostra anterior de BOC-(inip)-DpNal-DpNal-(3(S)-3-benzil-p-Ala)-(MBHA-resina) foi desbloqueada, lavada com metanol e seca. O produto foi clivado a partir da resina com HF, de acordo com o procedimento geral, para dar 280 mg de um sólido. Purificou-se uma porção de 56 mg por HPLC (Vydac C-18, 1x 50 cm, 27 a 42% de acetonitrilo em água durante 60 min., 9 ml/min., 0,1% de TFA, rt= 28-38 min.) para dar 23 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 684,2.
Exemplo 20
(inip)-DpNal-DpNal-(N-2-feniletil-Gly)amida, sal de TFA
Passo A: 2-Bromoacetil-(MBHA-resina)
Intumesceu-se uma amostra de 2,0 g de MBHA-resina (0,64 mmol/g, 1,28 mmol) em DCM e acoplou-se com 0,36 g (2,56 mmol, 2,0 eq) de ácido 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 115
bromoacético usando 3,84 ml (3,84 mmol, 3,0 eq) de DIPC 1 M em DCM durante 2 h. Lavou-se a resina com DCM (5x) para dar a 2-bromoacetil-(MBHA-resina) (teste da ninidrina negativo).
Passo B: BOC-DpNal-(N-2-feniletil-Gly)-(MBHA-resina)
Retomou-se a amostra anterior de 2-bromoacetil-(MBHA-resina) em DCM e adicionaram-se 4,0 ml de fenetilamina. Após 5 h, lavou-se a resina (teste da ninidrina positivo) e acoplou-se com 806 mg (2,56 mmol, 2,0 eq) de N-BOC-D-β-naftilalanina usando 1,70 g de BOP, 346 mg de HOBt e 421 μΙ de NMM durante 18 h, para dar o composto do título (teste da ninidrina negativo).
Passo C: BOC-DpNal-DpNal-(N-2-feniletil-Gly)-(MBHA-resina) O produto do Passo B foi desbloqueado, lavado e acoplado a 806 mg (2,56 mmol, 2,0 eq) de N-BOC-D-p-naftilalanina usando 1,70 g de BOP, 346 mg de HOBt e 421 μΙ de NMM durante 4 h para dar a BOC-DpNal-DpNal-(N-2-feniletil-Gly)-(MBHA-resina) (teste da ninidrina negativo).
Passo D: BOC-(inip)-DpNal-DpNal-(N-2-feniletil-GlyMMBHA-resina) A amostra anterior de BOC-DpNal-DpNal-(N-2-feniletil-Gly)-(MBHA-resina) foi desbloqueada, lavada e acoplada a 586 mg (2,56 mmol, 2,0 eq) de ácido N-BOC-isonipecótico, usando 1,70 g de BOP, 346 mg de HOBt e 421 μΙ de NMM durante 4 h para dar a BOC-(inip)-DpNal-DpNal-(N-2-feniletil-Gly)-(MBHA-resina) (teste da ninidrina negativo).
Passo E: (inip)-DpNal-DpNal-(N-2-feniletil-Gly)amida, sai de TFA A resina do Passo D foi desbloqueada, lavada com metanol, seca e clivada com HF, de acordo com o procedimento geral, para dar 802 mg de um sólido. Purificou-se uma porção de 70 mg por HPLC (Vydac C-18, 1 χ 50 cm, 25 a 40% de acetonitrilo em água durante 60 min., 0,1% de TFA, 9 ml/min., rt= 33-50 min.) para dar 42 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 684,2.
116 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
Exemplo 21
(inip)-DpNal-DpNal-(3-l-Tyr), sal de TFA Passo A: [3-l-Tyr(3-BrBzl)]-(0-resina)
Acoplou-se N-BOC-(0-3-bromobenzil)-3-iodo-L-tirosina [Península Labs, BOC-(3-l-Tyr(3-BrBzl)] a hidroximetil-resina (Bachem, 1% DVB, 100-200 mesh, 1,0 mmol/g) com DIPC (3 eq) e DMAP (0,25 eq) em DMA durante 3 h. A resina foi lavada, desbloqueada e de novo lavada, de acordo com o procedimento geral, para dar o composto do título (teste da ninidrina positivo).
Passo B: DpNal-[3-l-Tyr(3-BrBzl)]-(0-resina)
Activou-se BOC-DpNal (SyntheTech, 3 eq) com HBTU (Richelieu Biotechnologies, 4 eq) e DIPEA em DMA e acoplou-se à resina durante 1 h (teste da ninidrina negativo). A resina foi lavada, desbloqueada e de novo lavada para dar o composto do título (teste da ninidrina positivo).
Passo C: DpNal-DpNal-[3-l-Tyr(3-BrBzl)]-(0-resina)
Activou-se BO.C-DpNal (3 eq) com HBTU (4 eq) e DIPEA em DMA e acoplou-se à resina durante 1 h (teste da ninidrina negativo). A resina foi lavada, desbloqueada e de novo lavada para dar o composto do título (teste da ninidrina positivo). 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 117
Passo D: (inip)-DpNal-DpNal-[3-l-Tyr(3-BrBzl)]-(0-resina)
Activou-se ácido N-BOC-isonipecótico (3 eq) com HBTU (4 eq) e DIPEA em DMA e acoplou-se à resina anterior durante 1 h (teste da ninidrina negativo). A resina foi lavada, desbloqueada, lavada com DCM, MeOH e seca in vacuo para dar o composto do título (teste da ninidrina positivo).
Passo E: (inip)-DpNal-DpNal-(3-l-Tyr), sal de TFA O intermediário do Passo D foi clivado com HF anidro, de acordo com o procedimento geral, para dar 350 mg de um sólido, que foi purificado por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 Á, Vydac C-18, 2,5 χ 27 cm, gradiente: 32 - 46% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA) em 80 min., a 18 ml/min., rt= 20 min.) para dar 101 mg de (inip)^Nal-DpNal-(3-l-Tyr), sal de TFA, na forma de um pó incolor após liofilização. EM (electropulverização, M+H) 813,0.
Exemplo 22
(inip)-DpNal-DpNal-[N-(2-feniletil), N-(4-aminobutil)]amida,
sal de TFA
Passo A: D(3Nal-[4-N-(2-feniletil)]-(BDA-COO-resina)
Intumesceu-se uma amostra de 1,0 g de BDA-COO-resina (Exemplo 13, Passo A) com DCM e adicionou-se uma solução de 1% de HOAc em DMF, seguida
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
118 de 69 mg (1,2 eq) de fenilacetaldeido e de 60 mg de cianoboro-hidreto de sódio. Após 14 h, lavou-se a resina repetidamente com DMA e DCM (o teste da ninidrina mostrou uma cor vermelha substituindo o azul carregado da resina de partida) e neutralizou-se a resina. A uma lama da resina em DCM, adicionaram-se 0,45 g (1,44 mmol) de BOC-D-p-naftilalanina, 0,43 g de BOP-CI e 0,30 ml de DIPEA. Após 14 h, a resina foi lavada, desbloqueada e de novo lavada, para dar o composto do título (teste da ninidrina positivo).
Passo B: DpNal-DpNal-[4-N-(2-feniletil)]-(BDA-COO-resina)
Fez-se reagir o intermediário do Passo A com uma solução pré-activada de 0,45 g (1,44 mmol) de BOC-D-p-naftilalanina, 0,64 g de BOP, 0,19 g de HOBt e 0,21 ml de NMM em DMA durante 1,5 h. A resina foi lavada, desbloqueada e de novo lavada, obtendo-se o composto do título (teste da ninidrina negativo).
Passo C: (inip)-DpNal-DpNal-[N-(2-feniletil), N-(4-aminobutil)]amida, sal de TFA
Fez-se reagir o intermediário do Passo B com uma solução pré-activada de 0,33 g (1,44 mmol) de ácido N-BOC-isonipecótico, 0,64 g de BOP, 0,19 g de HOBt e 0,21 ml de NMM em DMA durante 2 h. A resina foi lavada, desbloqueada, lavada com metanol e seca in vacuo. Por clivagem com HF, de acordo com o protocolo geral do BOC anterior, obtiveram-se 100 mg de um pó, que foi purificado por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 Á, Vydac C-18, 1x 50 cm, gradiente: 23 - 38% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 60 mín. a 9 ml/min., rt= 35 min.) para dar 10 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 698,4.
Exemplo 23
(inip)-DpNal-DpNal-(N-2-feniletil)amida, sal de TFA
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 119
Passo A: FMOC-DpNal-(resina Wang)
Intumesceu-se resina Wang (6,0 g, 0,63 mmol/g, 3,78 mmol) em DCM e acoplou-se com 2,48 g (5,67 mmol) de N-FMOC-D-p-naftilalanina usando DIPC (11,3 ml de uma solução 1 M em DCM, 11,3 mmol) e 100 mg de DMAP em DCM durante 6 h, para dar o composto do título, após lavagem com metanol e secagem in vacuo (rendimento de 8,14 g).
Passo B: DpNal-DpNal-(resina Wang)
Utilizando o ciclo padrão da química do FMOC anterior, intumesceu-se uma amostra de 4,0 g de FMOC-DpNal-(resina Wang) (0,63 mmol/g, 2,52 mmol) em DCM, desbloqueou-se, lavou-se e acoplou-se com 2,20 g (5,04 mmol) de N-FMOC-DpNal usando 2,23 g de BOP e 0,83 mi de NMM durante 1,5 h. A amostra foi depois desbloqueada e lavada para dar DpNal-DpNal-(resina Wang) (teste da ninidrina positivo).
Passo C: BOC-(inip)-DpNal-DpNal-(resina Wang) A amostra anterior de DpNal-DpNal-(resina Wang) foi acoplada com 2,31 g (10,1 mmol) de ácido N-BOC-isonipecótico (do Exemplo 1, Método B, Passo E), usando 4,45 g de BOP e 1,38 ml de NMM durante 2 h para dar a BOC-(inip)-DpNal-DpNal-(resina Wang) (teste da ninidrina negativo), que foi lavada com metanol e seca in vacuo.
Passo D: (inip)-DpNal-DpNal-(N-2-feniletil)amida, sal de TFA
Suspendeu-se uma amostra de 0,30 g da BOC-(inip)-DpNal-DpNal-(resina Wang) anterior em 5 ml de fenetilamina (Aldrich) e 5 ml de DMA. Colocou-se a mistura agitada num banho de óleo a 50°C sob azoto durante 18 h, filtrou-se e lavou-se a resina com DCM. Concentrou-se o filtrado e submeteu-se a partição entre hidrogenossulfato de sódio 1 N e acetato de etilo. Lavou-se a fase orgânica sucessivamente com bicarbonato de sódio 1 N, água, salmoura e secou-se sobre sulfato de magnésio. Por concentração obteve-se um óleo que foi tratado com 6 ml de DCM/TFA (1:1) durante 1 h à temperatura ambiente e concentrado, para dar 30 mg de uma goma. Por purificação por HPLC de fase inversa (15-20 μίτι, 300 Â,
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 120
Vydac C-18, 1 χ 50 cm, gradiente: 23 - 38% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 60 min. a 9 ml/min., rt= 33 min.) obtiveram-se 7,6 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 627,6.
Exemplo 24
(inip)-DpNal-DpNal-[N-(4-aminobutil)]amida, sal de TFA
Passo A: BOC-DpNal-(BDA-COO-resina)
Uma amostra de 5,0 g (0,24 mmol/g, 1,2 mmol) de BDA-COO-resina do Exemplo 13, Passo A, foi neutralizada, lavada com DCM e acoplada com 0,76 g (2,4 mmol) de BOC-DpNal, 1,06 g de BOP, 0,32 g de HOBt e 0,40 ml de NMM durante 2 h, de acordo com o protocolo geral da química do BOC apresentado anteriormente. A resina foi lavada, obtendo-se a BOC-DpNal-(BDA-COO-resina) (teste da ninidrina negativo).
Passo B: BOC-D|’»Nal-DpNal-(BDA-COO-resina) A amostra anterior foi desbloqueada, lavada, neutralizada, lavada e acoplada com 0,76 g (2,4 mmol) de BOC-DpNal, 1,06 g de BOP, 0,32 g de HOBt e 0,40 ml de NMM durante 2 h, obtendo-se a BOC-DpNal-DpNal-(BDA-COO-resina)„ (teste da ninidrina negativo).
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 121
Passo C: (inip)-DpNal-DpNal-(BDA-COO-resina) A resina do Passo B foi lavada, desbloqueada, lavada, neutralizada, lavada e acoplada com 0,55 g (2,4 mmol) de ácido N-BOC-isonipecótico (Exemplo 1, Método B, Passo E), 1,06¾ de BOP, 0,32 g de HOBt e 0,40 ml de NMM durante 2 h, obtendo-se a BOC-(inip)-DpNal-DpNal-(BDA-COO-resina) (teste da ninidrina negativo). A resina foi lavada com DCM, desbloqueada, lavada com DCM, metanol e seca in vacuo.
Passo D: (inip)-DpNal-DpNal-[N-(4-aminobutil)]amida, sal de TFA A resina anterior (6 g) foi clivada com HF de acordo com o protocolo geral para dar 320 mg de um sólido após liofiiização. A amostra foi purificada por HPLC de fase inversa (15-20 Lim, 300 Â, Vydac C-18, 1 χ 50 cm, gradiente: 12 - 26% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 80 min. a 9 ml/min., rt= 18 min.) para dar 138 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 594,2.
Exemplo 25
(inip)-DpNal-(N-Me-DpNal)-[N-(4-aminobutil)]amida,
sal de TFA
Passo A: BOC-(N-Me-DpNal)-(BDA-COO-resina)
Uma amostra de 1,0 g de BDA-COO-resina do Exemplo 13, Passo A, foi lavada, neutralizada com 5% de DIPEA/DCM, lavada e acoplada com 981 mg (3
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 122 mmol) de BOC-(N-Me-DpNal), 1,32 g de BOP e 0,45 ml de NMM, durante 1 h, obtendo-se a BOC-(N-Me-DpNal)-(BDA-COO-resina) (teste da ninidrina negativo).
Passo B: BOC-DpNal-(N-Me-DpNal)-(BDA-COO-resina) A amostra anterior foi lavada, desbloqueada, lavada, neutralizada com 5% de DIPEA/DCM e lavada. Activou-se BOC-DpNal (3,29 g, 10 mmol) com DIPC (5,0 ml, 1,0 M em DCM) em 15 ml de DCM durante 4 min., depois adicionou-se à resina. Após 6 h, a resina foi lavada, obtendo-se a BOC-DpNal-(N-Me-DpNal)-(BDA-COO-resina) (teste da ninidrina negativo).
Passo C: (inip)-DpNal-(N-Me-DpNal)-(BDA-COO-resina) A amostra anterior foi desbloqueada, lavada, neutralizada com 5% de DIPEA/DCM, lavada e acoplada com 648 mg (3 mmol) de ácido N-BOC-isonipecótico, 1,32 g de BOP e 0,45 ml de NMM durante 1 h, obtendo-se a BOC-(inip)-DpNal-(N-Me-DpNal)-(BDA-COO-resina) (teste da ninidrina negativo). A resina foi lavada com DCM, desbloqueada, lavada com DCM, metanol e seca in vacuo, obtendo-se 1,2 g do composto do título.
Passo D: (inip)-DpNal-(N4Vle-DpNal)-[N-(4-aminobutil)]amida, sal de TFA A resina anterior (1,2 g) foi clivada com HF de acordo com o procedimento geral para dar 100 mg de um sólido após liofilização. Purificou-se uma amostra de 57 mg por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 Λ, Vydac C-18, 1χ 50 cm, gradiente: 20 - 35% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 60 min. a 9 ml/min., rt= 28 min.) para dar 27 mg do composto do título puro. EM (electropulverização, M+H) 607,7. 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 123 f/tj .w .V ''íjw/ i* Zl af ;»>
Exemplo 26
(inip)-DpNal-(N-Me-DpNal)-N-(4-piperidinil)amida, sal de TFA
Passo A: Ácido N-CBZ-isonipecótico
Adicionou-se cloroformato de benzilo (16,4 ml, 115 mmol) em tolueno (50 ml), gota-a-gota, a uma solução agitada de 12,9 g (110 mmol) de ácido isonipecótico (Aldrich) e de 21,0 g (250 mmol) de bicarbonato de sódio em 200 ml de água. Após 14 horas, extraiu-se a mistura com éter (3 χ 50 ml) e rejeitaram-se as camadas de éter. Acidificou-se a camada aquosa com HCI conc. até pH 2, provocando a precipitação do produto. Submeteu-se o produto a partição para acetato de etilo (3 χ 50 ml) e lavaram-se as camadas orgânicas combinadas com salmoura, secaram-se sobre sulfato de magnésio e concentraram-se in vacuo obtendo-se 22,6 g (88%) de ácido N-CBZ-isonipecótico na forma de um óleo viscoso.
Passo B: N-CBZ-4-(BOC-amino)-piperidina
Tratou-se uma solução de ácido N-CBZ-isonipecótico (10,3 g, 38,9 mmol) em terc-butilálcool (100 ml) e DCM (100 ml), com difenilfosforilazida (11,8 g, 42,8 mmol), TEA (5,97 ml, 42,8 mmol) e aqueceu-se a mistura resultante ao refluxo durante 3 dias. Concentrou-se a solução in vacuo e submeteu-se o resíduo a partição entre éter e água. Lavou-se a camada aquosa sucessivamente com ácido cítrico aq. a 10%, bicarbonato de sódio sat., salmoura, secou-se sobre sulfato de
magnésio e concentrou-se até se obter um óleo. Purificou-se este resíduo por cromatografia flash em sílica gel (eluição em gradiente, 7:3 a 1:1 de hexano-éter) obtendo-se 3,2 g (25%) do composto do titulo na forma de um sólido cristalino incolor: TLC Rf 0,21 (hexano:éter etílico 1:1).
Passo C: 4-(BOC-amino)-piperidiha
Dissolveu-se N-CBZ-4-(BOC-amino)-piperidina (3,0 g, 9,0 mmol) em etanol (100 ml) e transferiu-se para um recipiente de agitação de Parr. Após adicionar 10% de paládio sobre carbono (0,5 g), agitou-se a mistura sob uma atmosfera de hidrogénio a 50 psi durante 0,75 h num dispositivo.de Parr. Removeu-se o catalisador por filtração através de um leito de Celite. Lavou-se o bolo de filtração com etanol e o combinado do filtrato e das lavagens foi concentrado in vacuo obtendo-se 1,8 g (100%) de 4-(BOC-amino)-piperidina em bruto na forma de um óleo amarelo pálido. Este produto foi usado imediatamente no passo seguinte sem qualquer purificação adicional.
Passo D: [4-(BOC-amino)-piperidina]-(COO-resina)
Enxaguou-se resina de hidroximetilo (4,0 g com 0,45 mmol/g, 1,8 mmol) várias vezes com tolueno. À resina de hidroximetilo adicionou-se uma solução a 20% de fosgénio em tolueno (50 ml) (2 χ 30 min.) para gerar o intermediário cloroformato. Após enxaguamento da resina várias vezes com tolueno e dioxano, adicionou-se uma solução de 4-(BOC-amino)-piperidina (Passo C, 1,8 g, 9,0 mmol) em dioxano e agitou-se a mistura resultante durante 3 h. Enxaguou-se a resina com dioxano, DCM e secou-se in vacuo, obtendo-se 4,4 g do composto do título.
Passo E: BOC-(N-Me-DpNal)-[4-(4-aminopiperidina)]-(COO-resina)
Uma alíquota (0,82 g, 0,33 mmol) da resina do Passo D foi tratada com TFA, desbloqueada, neutralizada, lavada e acoplada com 3 eq de BOC-(N-Me-DpNal) (do Exemplo 4, Passo B), 3 eq de BOP, 3 eq de HOBt e 4,5 eq de NMM em DMA/DCM durante 1 h, após o que se observou um teste de ninidrina negativo. 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
125
Passo F: FMOC-DpNal-(N-Me-DpNal)-[4-(4-amino-piperidina)]-(COO-resina) A amostra anterior de BOC-(N-Me-DpNal)-[4-(4-aminopiperidina)]-(COO-resina) foi desbloqueada com TFA, neutralizada, lavada e acoplada com 4 eq de FMOC-D-p-naftilalanina, 4 eq de BOP-CI e 6 eq de DIPEA em DCM de um dia para o outro, após o que se observou um teste de ninidrina negativo.
Passo G: (inip)-DpNal-(N-Me-DpNal)-N-(4-piperidinil)amida, sal de TFA A amostra anterior de ΡΜΟΟ-ΟβΝ3ΐ-(Ν-Μβ-ΟβΝ3ΐ)-[4-(4-3ηηΐηορίρβπόίη3)]-(COO-resina) foi desbloqueada com 20% de piperidina/DMA, lavada e acoplada com 3 eq de ácido N-BOC-isonipecótico (do Exemplo 1, Método B, Passo E), 3 eq de BOP, 3 eq de HOBt e 4,5 eq de NMM em DMA/DCM durante 1 h, após o que se observou um teste da ninidrina negativo. O péptido foi desbloqueado com TFA, lavado e seco in vacuo obtendo-se a (ΐηΐρ)-ϋβΝ3ΐ-(Ν-Μβ-ϋβΝ3ΐ)-[4-(4-3ηηΐηο-piperidina)]-(COO-resina). Este péptido foi clivado da resina com HF e liofilizado, de acordo com o procedimento geral, para dar 88 mg de um sólido em bruto. Purificou-se o sólido por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 A, Vydac C-18, 1x 50 cm, gradiente: 23 - 38% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 60 min. a 9 ml/min., rt= 43 min.) para dar 39 mg do composto do título na forma de um pó incolor após liofilização. EM (electropulverização, M+H) 619,4.
Exemplo 27
(inip)^Nal-(D-^-naftilalanol), sal de TFA 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 126
Suspendeu-se uma amostra de 0,30 g de ΒΟΟ-Οηίρ^ΟβΝβΙ-ΟβΝβΙ-ίΓββίηβ Wang) (do Exemplo 23, Passo C) em 5 ml de THF sob azoto e adicionaram-se 0,90 ml de uma solução 2,0 M de boro-hidreto de lítio em THF (Aldrich). Após 1,5 h, adicionaram-se cuidadosamente 2 ml de HOAc, filtrou-se a suspensão e lavou-se a resina com MeOH. Os filtrados combinados foram concentrados três vezes a partir de MeOH para dar um sólido, que foi tratado com 9 ml de TFA/DCM (2:1), contendo algumas gotas de trietilsilano, durante 1 h. Concentrou-se a solução obtendo-se 270 mg de um sólido que foi purificado por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 Â, Vydac C-18, 2,5x 27 cm, gradiente: 25 - 39% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TEA), em 80 min. a 18 ml/min., rt= 50 min.) para dar 39 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 510,0.
Exemplo 28
(inip)^Nal-(N-metil-D^-naftilalanol), sal de TFA
Passo A: (Ν-Μβ-ΟβΝβΙΗΟ-Γθβϊηβ)
Uma amostra de 1,48 g (4,50 mmol) de BOC-N-metil-D^-naftilalanina (do Exemplo 4, Passo B) foi acoplada a 1,5 g (1,0 mmol/g, 1,5 mmol) de hidroximetil-resina com DIPC (4,50 ml de uma solução 1,0 M em DCM, 4,50 mmol) e 55 mg (0,45 mmol) de DMAP em DMA/DCM (1:1) durante 2 h. A resina foi lavada,
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desbloqueada e lavada de acordo com o procedimento geral do BOC, obtendo-se o composto do título (pérolas com um teste da ninidrina cor-de-laranja).
Passo B: DpNal-(N-Me-DpNal)-{0-resína) A (N-Me-DpNal)-(O-resina) anterior foi acoplada com 1,42 g (4,50 mmol) de BOC-D-p-naftilalanina, 1,01 g de BOP-CI e 1,46 ml de DIPEA em DCM durante 12 h. A resina foi lavada e desbloqueada (teste da ninidrina positivo) para dar o composto do título.
Passo C: BOC-(inip)-DpNal-(N-Me-DpNal)-(0-resina) A uma lama da DpNal-(N-Me-DpNal)-(0-resina) anterior em DCM/DMA (1:1) adicionaram-se 1,03 g (4,50 mmol) de ácido N-BOC-isonipecótico, 1,99 g de BOP e 0,61 g de HOBt, seguidos de 1,0 ml de NMM. Após 1 h, a resina foi lavada, lavada de novo com metanol e seca in vacuo para dar 2,33 g do composto do título.
Passo D: (inip)-DpNal-(N-metil-D-p-naftilalanol), sal de TFA
Suspendeu-se uma amostra de 1,0 g (0,64 mmol) da BOC-(inip)-DpNal-(N-Me-DpNal)-(O-resina) anterior em 10 ml de THF sob azoto e adicionaram-se 3,2 ml de uma solução 2,0 M de boro-hidreto de lítio em THF (Aldrich). Após 1,5 h, adicionaram-se cuidadosamente 2,0 ml de HOAc, filtrou-se a suspensão e lavou-se a resina com MeOH. Os filtrados combinados foram concentrados 3χ a partir de MeOH para dar um sólido, que foi tratado com 6 ml de TFA/DCM (1:1), contendo algumas gotas de trietilsilano, durante 1 h. Concentrou-se a solução obtendo-se 700 mg de um sólido contendo sais. Uma aiíquota de 386 mg foi purificada por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 Á, Vydac C-18, 1 χ 50 cm, gradiente: 23 - 38% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 60 min. a 9 ml/min., rt= 40 min.) para dar 21 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 525,0.
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Exemplo 29
BOC-(inip)-DpNal-{N-metil,N-[(2R)-2-(1-amino-3-(2-naftil)propil]}amida,
sal de TFA
Passo A: BOC-(inip)-DpNal A uma solução agitada de 10,0 g (0,44 mmol, 1,0 eq) de ácido N-BOC-isonipecótico (do Exemplo 1, Método B, Passo E) em 200 ml de DCM, adicionaram-se 100 mg de DMAP e 4,53 g (22 mmol, 0,5 eq) de DCC. Após 1 h, removeu-se por filtração a diciclo-hexilureia e adicionou-se o filtrado a uma solução de 4,7 g (22,0 mmol, 0,5 eq) de D-p-naftilalanina e 35 ml de NMM em 200 ml de DCM. Agitou-se a mistura reaccional de um dia para o outro, concentrou-se e submeteu-se o resíduo a partição entre acetato de etilo e ácido cítrico 0,5 N. A camada orgânica foi lavada com água, salmoura, evaporada e o produto foi recristalizado a partir de acetato de etilo, obtendo-se 3,95 g de BOC-(inip)-DpNal. Obtiveram-se outros 2,14 g por cromatografia das águas-mães em sílica (acetato de etilo/HOAc, 98:2), rendimento combinado: 65%. RMN-1H (300 MHz, d6-acetona) δ 7,8 (3H, m), 7,65 (1H, s), 7,4 (3H, m), 7,2 (1H, d), 4,8 (1H, m), 3,88 (2H, m), 3,35 (1H, m), 3,15 (1H, m), 2,62 (2H, m), 2,35 (1H, m), 1,6-1,4 (4H, m), 1,35 (9H, s). EM (FAB, M+H) 427,2.
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Passo Β: BOC-(N-Me-D-p-naftilalanol) A uma solução fria de 3,25 g (9,9 mmol, 1,0 eq) de BOC-(N-Me-DpNal) (do Exemplo 4, Passo B) e de 1,10 g (10,9 mmol, 1,1 eq) de TEA em 50 ml de THF seco, adicionou-se, gota-a-gota, durante 30 min., uma solução de 1,19 g (10,9 mmol, 1,1 eq) de cloroformato de etilo em 10 ml de THF seco. A mistura reaccional ficou vermelho brilhante e o cloridrato de TEA precipitou e foi removido por filtração. Adicionou-se o filtrado vermelho, gota-a-gota, a uma solução fria agitada de 1,50 g (39,6 mmol, 4,0 eq) de boro-hidreto de sódio em 50 ml de metanol/água (1:1). Após agitação de um dia para o outro, concentrou-se a mistura reaccional até 1/2 do volume inicial e submeteu-se a partição entre acetato de etilo e ácido cítrico 0,5 N. Lavou-se a fase orgânica sucessivamente com água, carbonato de potássio a 10%, bicarbonato de sódio saturado, salmoura, secou-se sobre sobre sulfato de sódio, filtrou-se e concentrou-se, obtendo-se 2,91 g de um óleo (94%). RMN-1H (300 MHz, CDCI3) δ 7,75 (3H, m), 7,6 (1H, s), 7,4 (3H, m), 4,3 (1H), 3,7 (2H, m), 3,0-2,8 (6H, m), 1,3 (9H, 2s). I.V. (cnrv1) 3428, 3050, 2977, 1689, 1669, 1363, 1144. EM (EI, e/m) 427,2.
Passo C: (2R)-1-azido-2-(BOC-metilamino)-3-(2-naftil)propano
Preparou-se uma solução fria de ácido hidrazóico (4,14 mmol, 1,5 eq) em benzeno, por acidificação de uma mistura agitada de 269 mg (4,14 mmol) de azida de sódio, 5 ml de água e 5 ml de benzeno com 5 ml de ácido sulfúrico 3,6 N a 10°C. Separou-se a fase de benzeno, secou-se sobre sulfato de sódio e filtrou-se. Adicionou-se esta solução a uma mistura agitada de 867 mg (3,31 mmol, 1,2 eq) de trifeniifosfina e 669 mg de di-isopropilazodicarboxilato (3,31 mmol, 1,2 eq) em THF seco a -78°C. Adicionou-se uma solução de 870 mg (2,76 mmol, 1,0 eq) de BOC-(N-Me-D-p-naftilalanol) (Passo B) em 10 ml de THF seco e deixou-se a mistura reaccional atingir a temperatura ambiente durante 2 h. Adicionou-se bicarbonato de sódio saturado (20 ml) e concentrou-se parcialmente a mistura reaccional para remover 0 THF. Submeteu-se a mistura a partição entre acetato de etilo e bicarbonato de sódio saturado e lavou-se a fase orgânica com salmoura, secou-se sobre sulfato de sódio, filtrou-se e evaporou-se. Por cromatografia flash em sílica (hexano/acetato de etilo, 80:20) obtiveram-se 600 mg (64%) do composto do título. RMN-1H (300 MHz, CDCI3) δ 7,75 (3H, m), 7,6 (1H, d), 7,42 (2H, m), 7,25
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(1 Η, m), 4,4 (1 Η, m), 3,6-2,8 (4Η, m), 2,7 (3Η, 2s), 1,3 (9Η, 2s). I.V. (crrv1) 3057, 2977,2094, 1689.
Passo D: BOC-(inip)-DpNal-{N-metil, N-[(2R)-2-(1-azido-3-(2-naftil)propil]} amida
Tratou-se uma solução de 300 mg de (2R)-1-azido-2-(BOC-metilamino)-3-(2-naftil)propano (0,88 mmol, 1,0 eq) (Passo C) em 2,0 ml de DCM, com 2,0 ml de TFA durante 1 h e depois evaporou-se várias vezes a partir de DCM. Dissolveu-se o resíduo numa solução de 5 ml de DCM e 250 μΙ de NMM e depois adicionou-se a uma mistura previamente preparada de 751 mg (1,76 mmol, 2,0 eq) de N-BOC-(inip)-DpNal (Passo A), 363 mg (1,76 mmol, 2,0 eq) de DCC, 238 mg (1,76 mmol, 2,0 eq) de HOBt e 250 μΙ de NMM em 15 ml de DCM/DMF (2:1). Agitou-se a mistura reaccional de um dia para o outro, triturou-se com 1 ml de água e removeu-se por filtração a diciclo-hexilureia precipitada. Retomou-se a mistura reaccional com acetato de etilo e lavou-se sucessivamente com ácido cítrico 0,5 N, água, carbonato de potássio a 10%, água, bicarbonato de sódio saturado, salmoura, secou-se sobre sulfato de sódio, filtrou-se e evaporou-se. Por cromatografia flash em sílica (acetato de etilo/hexano, 1:1, Rf = 0,4) obtiveram-se 380 mg (67%) do composto do título. I.V. (cm'1) 3309, 3057, 2977, 2930, 2100, 1689, 1635, 1171. EM (FAB, M+H) 649,4.
Passo E: BOC-(inip)-DpNal-{N-metil, N-[(2R)-2-(1-amino-3-(2-naftil)propil]> amida, sal de TFA
Uma solução de 280 mg (0,43 mmol) da azida do Passo D em 15 ml de metanol e 1 ml de HOAc foi hidrogenada sobre 100 mg de 10% de paládio sobre carbono a 30 psi durante 8 h. Removeu-se o catalisador por filtração e evaporou-se o filtrado obtendo-se 250 mg de produto em bruto. Uma alíquota de 20 mg foi purificada por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 Â, Vydac C-18, 1x 50 cm, gradiente: 30 - 45% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 60 min. a 9 ml/min., rt= 39-48 min.) para dar 8 mg do composto do título. I.V. (cm'1) 3409, 3296, 3057, 2977, 1675, 1430, 1204, 1171, 1131. EM (electropulverização, p M+H) 624,5.
(inip)-DpNal-{N-metil, N-[(2R)-2-(1-amino-3-(2-naftil)propil]>amida,
sal de TFA
Tratou-se uma solução de 200 mg de BOC-(inip)-DpNal-{N-metil, N-[(2R)-2-(1-amino-3-(2-naftil)propil]}amida, sal de TFA (do Exemplo 29, Passo E) em 2 ml de DCM, com 2 ml de TFA, agitou-se durante 1 h e concentrou-se para dar 490 mg de produto em bruto. Uma alíquota de 100 mg foi purificada por HPLC (Vydac ΟΙ 8, 1 x 50 cm, 20 a 35% de acetonitrilo em água, 60 min., 0,1% de TFA, 9 ml/min., rt= 21-31 min.) obtendo-se 17 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 523,2.
Exemplo 31
(inip)-DpNal-(N-metil, N-[(2R)-2-(1-acetamido-3-(2-naftil)propil]}amida,
sal de TFA
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 132
A uma solução de 33 mg (0,05 mmol) de BOC-(inip)-DpNal-{N-metil, N-[(2R)-2-(1-amino-3-(2-naftil)propil]}amida, sal de TFA (do Exemplo 29, Passo E) em 0,5 ml de DCM, adicionaram-se 0,5 ml de TEA e 0,5 ml de anidrido acético. Agitou-se a mistura reaccional durante 1 h, depois evaporou-se e submeteu-se a partição entre acetato de etilo e água. Secou-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio e evaporou-se. Retomou-se o resíduo em 2 ml de DCM e adicionaram-se 2 ml de TFA. Agitou-se a mistura durante 1 h, evaporou-se e o produto em bruto (48 mg) foi purificado por HPLC (Vydac C-18, 1 χ 50 cm, 20 a 50% de acetonitrilo em água durante 60 min., 9 ml/min., 0,1% de TFA, rt= 29 min.) obtendo-se 15 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 565,4.
Exemplo 32
(inip)-DpNal-[N-1-{2-(2-naftil)etil}]amida, sal de TFA
Passo A: Cloridrato de 2-(2-naftil)etilamina
Agitou-se uma solução de hidreto de alumínio e lítio (LAH, 100 mmol, 3,0 eq) em 300 ml de éter seco a 0°C, e adicionou-se, durante 2 h, uma solução de 2-naftilacetonitrilo (5,0 mg, 30 mmol, 1,0 eq) em 200 ml de éter seco. À lama cor-de-laranja brilhante resultante adicionaram-se, gota-a-gota, 25 ml de ácido sulfúrico 12 N frio (0°C), e agitou-se a mistura até ficar incolor. Submeteu-se a mistura reaccional a partição entre éter e água e rejeitou-se a fase de éter, contendo sobretudo 2-naftilacetonitrilo não reagido. Alcalinizou-se a fase aquosa com 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 133
hidróxido de sódio e extraiu-se a amina livre separada com éter, secou-se sobre sulfato de sódio, filtrou-se e acidificou-se com HCI anidro em dioxano. Recolheu-se por filtração o sal de HCI precipitado obtendo-se 890 mg do composto do título. RMN-1H (300 MHz, D20) δ 7,82 (3H, t), 7,7 (1H, s), 7,45 (2H, m), 7,38 (1H, d), 3,25 (2H, t), 3,05 (2H, t). EM (FAB, M+H) 172,1.
Passo B: BOC-(inip)-DpNal-[N-1-{2-(2-naftil)etil}]amida
Agitou-se uma mistura de 100 mg (0,23 mmol, 1,0 eq) de N-BOC-(inip)-DpNal (do Exemplo 29, Passo A), 42 mg (0,23 mmol, 1,0 eq) de cloridrato de 2-(2-naftil)etilamina (Passo A), 132 mg (0,69 mmol, 3,0 eq) de EDC, 31 mg (0,23 mmol, 1,0 eq) de HOBt, 87 μΙ (0,69 mmol, 3,0 eq) de NMM e 5,0 ml de DMF, de um dia para o outro à temperatura ambiente. Submeteu-se a mistura a partição entre acetato de etilo e ácido clorídrico diluído e lavou-se a fase orgânica separada sucessivamente com água, bicarbonato de sódio saturado, salmoura, secou-se sobre sobre sulfato de sódio, filtrou-se e evaporou-se. O produto em bruto foi submetido a cromatografia em sílica (acetato de etilo/hexano (70:30), Rf = 0,5) obtendo-se 110 mg do composto do título. I.V. (cm ') 3289, 3057, 2977, 2930, 2857, 1695, 1642, 1423, 1171,819, 739. EM (FAB, M+H) 580,3.
Passo C: (inip)-DpNal-[N-1-{2-(2-naftil)etil}]amida, sal de TFA
Tratou-se uma solução de 110 mg de N-BOC-(inip)-DpNal-[N-1-{2-(2-naftil)etil}]amida (Passo B) em 4 ml de DCM com 2 ml de TFA e agitou-se durante 2 h. O produto em bruto concentrado (121 mg) foi purificado por HPLC (1 χ 50 cm, Vydac C-18, 25 a 40% de acetonitrilo em água durante 60 min., 9 ml/min., 0,1% de TFA, rt= 25-30 min.) obtendo-se 29 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 479,9.
Exemplo 33
(inip)-DpNal-[N-metil, N-1 -{2-(2-naftil)etil}]amida, sal de TFA
Passo A: N-metil-N-2-{2-naftil)etilamina, sal de TFA
Preparou-se uma solução de 2-(2-naftil)etilamina (1,4 mmol, 1,0 eq) em DCM submetendo a partição 250 mg de cloridrato de 2-(2-naftil)etilamina (do Exemplo 32, Passo A) entre 5 ml de DCM e 5 ml de hidróxido de sódio aq. a 10%. Secou-se a fase orgânica sobre sulfato de sódio, filtrou-se e adicionaram-se 363 mg (1,67 mmol, 1,2 eq) de di-t-butildicarbonato, seguidos de 1,0 ml de TEA. Após agitação durante 30 min., a mistura reaccional foi concentrada e o produto cristalizado a partir de hexano a -78°C. Rendimento: 250 mg.
Dissolveu-se este produto em 10 ml de THF seco, adicionaram-se 262 μΙ (4,2 mmol, 3,0 eq) de iodeto de metilo e arrefeceu-se a solução até 0°C. Adicionou-se hidreto de sódio (47 mg, dispersão a 60% em óleo mineral, 1,96 mmol), em porções, com agitação, durante 10 min., e deixou-se a mistura reaccional aquecer até à temperatura ambiente de um dia para o outro. Os solventes foram evaporados e retomou-se o produto em bruto em acetato de etilo/hexano e lavou-se sucessivamente com bicarbonato de sódio saturado, bissulfito de sódio 1 N, água, salmoura, secou-se sobre sulfato de sódio, filtrou-se e evaporou-se. Por tratamento com TFA/DCM (1:1) durante 1 h e concentração, obtiveram-se 190 mg do composto do título na forma de um óleo. RMN-1H (300 MHz, CDCI3) δ 7,78 (3H, t), 7,62 (1H, s), 7,4 (2H, m), 7,32 (1H, d), 2,9 (4H, m), 2,4 (3H, s), 1,55 (1H, s). EM ’ (FAB, M+H) 186,0.
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 135
Passo Β: BOC-(inip)-DpNal-[N-metil, N-1-{2-(2-naftil)etil}]amida
Agitou-se uma mistura de 525 mg (1,23 mmol, 1,2 eq) de BOC-(inip)-DpNal (do Exemplo 29, Passo A), 190 mg (1,02 mmol, 1,0 eq) de N-metil-N-2-(2-naftil)etilamina (Passo A), 584 mg (3,06 mmol, 3,0 eq) de EDC, 138 mg (1,02 mmol, 1,0 eq) de HOBt, 412 mg (4,08 mmol, 4,0 eq) de NMM em 15 ml de DMF, de um dia para o outro, à temperatura ambiente. Submeteu-se a mistura reaccional a partição entre acetato de etilo e ácido cítrico diluído e lavou-se a fase orgânica separada sucessivamente com água, bicarbonato de sódio saturado, salmoura, secou-se sobre sobre sulfato de sódio, filtrou-se e evaporou-se. O produto em bruto foi submetido a cromatografia em sílica (80:20, acetato de etilo/hexano) obtendo-se 550 mg do produto do título. I.V. (cm'1) 3302, 3050, 2977, 2930, 1689, 1629, 1423, 1164, 819, 732.
Passo C: (inip)-DpNal-[N-metil, N-1-{2-(2-naftil)etil}]amida, sal de TFA
Tratou-se uma solução de 550 mg de BOC-(inip)-DpNal-[N-metil, N-1-{2-(2-naftil)etil}]amida (Passo B) em 4 ml de DCM com 3 ml de TFA, agitou-se durante 2 h e concentrou-se obtendo-se 569 mg de produto em bruto. Uma alíquota de 90 mg foi purificada por HPLC (1 χ 50 cm, Vydac C-18, 27 a 42% de acetonitrilo em água durante 60 min., 0,1% de TFA, 9 ml/min., 214 nm, rt= 30-45 min.) obtendo-se 29 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 493,8.
Exemplo 34
(inip)-DpNal-[N-(2-naftil)metil]amida, sal de TFA
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 136
Passo A: Cloridrato de 2-aminometilnaftileno
Tratou-se uma solução agitada a 0°C de 20,0 g de 2-naftaldeído (128 mmol) e de 98,7 g (1,28 mol) de acetato de amónio em 200 ml de MeOH/HOAc (99:1), com 5,62 g (90,0 mmol) de cianoboro-hidreto de sódio, em porções. Agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 24 h, concentrou-se in vacuo, ressuspendeu-se em água e alcalinizou-se com hidróxido de sódio. Extraiu-se o produto com éter, lavou-se com água, salmoura, secou-se sobre sulfato de magnésio e filtrou-se. Tratou-se o filtrado com uma solução em éter seca de HCI e lavou-se o produto precipitado com éter e secou-se, obtendo-se 16,5 g (65%) de cloridrato de 2-aminometilnaftileno.
Passo B: (inip)-DpNal-(2-aminometilnaftil)amida, sal de TFA
Agitou-se uma mistura de 124 mg (0,29 mmol) de N-BOC-(inip)-DpNal (do Exemplo 29, Passo A), 84,5 mg (0,54 mmol) de cloridrato de 2-aminometilnaftileno (Passo A), 67 mg (0,348 mmol) de EDC, 47 mg (0,348 mmol) de HOBt e 140 μΙ de NMM em 5 ml de DMF, de um dia para o outro, à temperatura ambiente. Submeteu-se a mistura reaccional a partição entre acetato de etilo e água e lavou-se a fase orgânica separada sucessivamente com hidrogenossulfato de sódio 1 N, bicarbonato de sódio 1 N, salmoura, secou-se sobre sobre sulfato de magnésio, filtrou-se e evaporou-se. O produto em bruto foi dissolvido em 4 ml de DCM/TFA (1:1), agitou-se durante 2 h e reconcentrou-se, obtendo-se 160 mg de produto em bruto. Uma alíquota de 85 mg foi purificada por HPLC (1 χ 50 cm, Vydac C-18, 23 a 38% de acetonitrilo em água durante 60 min., 0,1% de TFA, 9 ml/min., rt= 45 min.) obtendo-se 4,6 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 466,0.
(inip)-DpNal-(D-triptofanol), sal de TFA
Passo A: BOC-DpNal-DTrp-(O-resina)
Uma amostra de 1,5 g de BOC-DTrp-(O-resina) (0,5 mmol/g, 0,75 mmol) foi desbloqueada (TFA/DCM (1:1) contendo 1 g/l de indole como sequestrante), lavada, neutralizada e acoplada com 0,71 g (3 eq) de BOC-DpNal, 1,02 g (3 eq) de BOP, 0,30 g (3 eq) de HOBt e 0,37 ml (4,5 eq) de NMM durante 1,5 h, de acordo com o procedimento geral do BOC, obtendo-se a BOC-DpNal-DTrp-(O-resina) (teste da ninidrina negativo).
Passo B: BOC-(inip)-DpNal-DTrp-(0-resina) A amostra anterior de BOC-DpNal-DTrp-(O-resina) foi desbloqueada, lavada e acoplada com 0,52 g (3 eq) de ácido N-BOC-isonipecótico, 1,02 g (3 eq) de BOP, 0,30 g (3 eq) de HOBt e 0,37 ml (4,5 eq) de NMM durante 1 h, obtendo-se 1,76 g do composto do título após lavagem com metanol e secagem in vacuo (teste da ninidrina negativo).
Passo C: (inip)-DpNal-(D-triptofanol), sal de TFA
Suspendeu-se a resina seca do Passo B (BOC-(inip)-DpNal-DTrp-(O-resina), 1,76 g) em 50 ml de THF sob azoto e adicionaram-se 4,80 ml de uma solução 2,0 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
138 Μ de boro-hidreto de lítio em THF. Após 1,5 h, adicionaram-se gota-a-gota 4,5 ml de HOAc durante 10 min.. Após 30 min., filtrou-se a suspensão e lavou-se a resina com MeOH. Os filtrados combinados foram concentrados e submetidos a partição entre acetato de etilo e água (com a adicção de algumas gotas de HOAc). Concentrou-se a fase orgânica e tratou-se com 20 ml de TFA/DCM (1:1) durante 30 min.. Removeu-se o TFA in vacuo e reconcentrou-se o produto a partir de DCM (3x) obtendo-se 700 mg de um óleo. Uma alíquota de 100 mg foi purificada por HPLC de fase inversa (15-20 μ, 300 À, Vydac C-18, 1x 50 cm, gradiente: 23 - 38% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TFA), em 60 min. a 9 ml/min., rt= 20 min.) para dar 23 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 499,5.
Exemplo 36
N H
(inip)-DpNal-[N-triptaminil]amida, sal de TFA
Passo A: BOC-(inip)-DpNal-[N-triptaminil]amida
Agitou-se uma mistura de 100 mg (0,23 mmol, 1,0 eq) de N-BOC-(inip)-DpNal (do Exemplo 29, Passo A), 132 mg (0,69 mmol, 3,0 eq) de EDC e 47 mg (0,35 mmol, 1,5 eq) de HOBt, em 15 ml de DCM/DMF (2:1), durante 10 min., depois adicionaram-se 40 mg (0,25 mmol, 1,1 eq) de triptamina e'40 μΙ (0,35 mmol, 1,5 eq) de NMM. Após 14 h à temperatura ambiente, submeteu-se a mistura reaccional a partição entre acetato de etilo e ácido cítrico diluído e lavou-se a fase orgânica 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 139
separada sucessivamente com água, bicarbonato de sódio saturado, salmoura, secou-se sobre sulfato de sódio, filtrou-se e evaporou-se. O produto em bruto (160 mg) foi submetido a cromatografia em sílica (acetato de etilo/hexano (70:30), Rf = 0,5) obtendo-se 90 mg do composto do título na forma de um sólido cristalino. I.V. (cm'1) 3342, 3289, 3057, 2977, 2924, 2857, 1675, 1636, 1556, 1436, 1224, 1164, 739. EM (FAB, M+H) 569,3.
Passo B: (inip)-DpNal-[N-triptamínil]amida, sal de TFA
Tratou-se uma solução de 70 mg de N-BOC-{inip)-DpNal-[N-triptaminil]amida (Passo A) em 4 ml de DCM com 3 ml de TFA e agitou-se durante 1 h. O produto em bruto concentrado foi purificado por HPLC (1 χ 50 cm, Vydac C-18, 20 a 35% de acetonitrilo em água durante 60 min., 9 ml/min., 0,1% de TFA, rt= 30-48 min.) obtendo-se 32 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 469,4.
Exemplo 37
(inip)-DpNal-DTrp-Phe-Lys-amida, sal de TFA O composto do título foi preparado de um modo idêntico ao (inip)-DpNal-DpNal-Phe-Lys-amida, sal de TFA (Exemplo 1, Método B) sendo a única _ modificação a substituição de BOC-DpNal por BOC-D-triptofano no terceiro acoplamento (Passo C). Por lavagem, secagem e clivagem, de acordo com o protocolo geral do BOC anterior, obtiveram-se 250 mg de um pó. Uma aliquota de 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 140
102 mg foi purificada por HPLC de fase inversa (15-20 μιτι, 300 Â, Vydac C-18, 1 x 50 cm, gradiente: 23 - 38% de acetonitrilo (0,1% de TFA) em água (0,1% de TF A), em 60 min. a 9 ml/min., rt= 32 min.) para dar 23 mg do composto do título. EM (electropulverização, M+H) 812,4.
Exemplo 38
Ensaios de Células de Pituitária Anterior (Ensaios de Células "Pit")
Dispersão: Engaiolaram-se grupos de ratos adultos fêmea Sprague-Dawley (160 - 180 g, Charles River) num ciclo de claridade:escuridão 12:12, com comida e água ad libitum. Removeram-se as pituitárias de dez ratos, rejeitou-se a pituitária posterior e colocou-se a pituitária anterior em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS: sem cloreto de cálcio, sem cloreto de magnésio, sem sulfato de magnésio, Gibco) contendo. 20 mM de HEPES (Gibco) e 100 U/ml de penicilina -estreptomicina (PS: JRH Biosciences). Sob condições estéreis, as pituitárias foram enxaguadas duas vezes e depois picadas em pequenos fragmentos com uma lâmina. Ressuspenderam-se os fragmentos em 5 ml de HBSS/HEPES contendo 20 mg de colagenase (Serva 17449) e 200 ml de ADNase (Sigma) 1 mg/ml, durante uma incubação de 40 min. a 37°C, num agitador com banho de água giro-rotatório (New Brunswick Scientific, Modelo G76; posição 10). Após a incubação, trituraram-se os fragmentos obtendo-se pequenos aglomerados e células isoladas. Centrifugaram-se as células a 1000 χ g durante 5 min., suspenderam-se de novo, contaram-se e plaquearam-se com uma concentração final de células de 100 000 células/ml. O meio de incubação era meio DME de baixo teor em glucose com NaHC03 (Gibco) contendo 20 mM de HEPES, 100 U/ml de PS e 10% de FBS (Hyclone A-111-L). As células foram plaqueadas a 0,5 ml por poço em placas de 48 poços (Falcon) e incubadas a 37°C, em 5% de C02 durante três dias. Para os desafios para determinar a libertação de outras hormonas de pituitária, as células foram plaqueadas com 200 000 células por ml, com 2 ml por poço numa placa de 6 poços (Corning).
Desafio: Preparou-se uma concentração de reserva de 1 mM de (inip)-bbFK-NH2 (ou de outros GHRP) em DMSO e diluiu-se com meio aquecido aproximadamente 30 min. antes da utilização. A concentração mais elevada de DMSO no meio era de 0,1%. As soluções de reserva (1 mM) de GHRH de rato, de somatostatina (Sigma) e do antagonista de GHRP HwkWfK foram preparadas de
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 141 ^ &/'ϊφ ^ fresco nos meios e diluídas conforme apropriado. O meio usado erri todos* os desafios e passos de lavagem era DME de baixo teor em glucose com 20 mM de HEPES, 100 U/ml de PS, 10% de FBS. O meio foi aquecido a 37°C e gaseificado por colocação no incubador antes do desafio. No dia três, o meio foi rejeitado e adicionou-se meio fresco (aproximadamente 1 ml) para a primeira de três lavagens. Após a última lavagem, a placa foi de novo colocada no incubador para uma pré-incubação de 15 min.. Depois, lavaram-se as células 2x (com meio aquecido e gaseificado) e adicionaram-se 0,5 ml de meio fresco para a segunda pré-incubação de 15 min.. Após a segunda pré-incubação, lavaram-se as células 2x como anteriormente e adicionaram-se 0,5 ml de soluções de controlo e de teste para uma incubação final de 15 min.. Após esta incubação, os meios foram removidos para o ELISA de GH subsequente. ELISA de GH: Usou-se um ELISA de dois locais para determinar a concentração de GH de rato no meio. Resumidamente, usou-se anticorpo de cabra anti-GH de rato (lote# 19164-20) para revestir imuno-placas Nunc de um dia para o outro. Após bloqueamento e lavagem, diluiram-se os meios padrão (preparação de referência de GH de rato: Parlow) e de desafio, de 1:20, antes do ensaio da GH e adicionam-se para uma incubação de 1 h à temperatura ambiente.
Estatística: Determinou-se a média de cada grupo e analisou-se por análise de variância com um único factor com um post-hoc Student-Newman-Keuls. A significância é definida para p<0,05. A EC50 foi calculada usando um programa de ajuste de curvas de 4 parâmetros (Kaleidagraph). Usaram-se três a quatro valores independentes de EC50 para calcular a média e o erro padrão. RIA de hormonas de pituitária: A LH, a FSH, a TSH e a prolactina foram determinadas com estojos disponíveis comercialmente da Amersham, e os níveis de ACTH foram determinados com um estojo RIA da ICN.
Experiência do fluxo de cálcio: As células de pituitária foram plaqueadas em poços com rampas de duas câmaras (Nunc) revestidos com fibronectina (Collaborative Research). Após quatro dias de cultura em monocamada, enxaguaram-se as células três vezes com HBSS (Gibco) em 1% de BSA e 15 mM de HEPES e depois incubaram-se durante 30 min., a 37°C, com 5 μΜ de indo-1 AM (Molecular Probes, Eugene) em HBSS contendo também 1% de F127 plurónico (Molecular Probes). Enxaguaram-se as células uma vez e adicionou-se
meio fresco para a incubação à temperatura ambiente. Desafiram-se as células em 30 min. com 10 nM de (inip)-bbFK-NH2, veículo ou 2,5 μΜ de ionomicina (Sigma). O fluxo de Ca++ foi visualizado com um Meridian ACAS 570 usando um varrimento por etapas com intervalos de 21 segundos. A lndo-1 ligada a Ca++ foi medida a 405 ± 22 nm e a lndo-1 isenta de Ca++ foi medida a 530 ± 1 nm. Calculou-se a relação da lndo-1 ligada versus livre e corrigiu-se com uma curva padrão criada sob condições de regulação instrumental idênticas (Grynkiewicz, G., Peonie, M., Tsien, R. T., "A new generation of Ca++ indicators with greatly improved fluorescence properties", Journal of Biological Chemistry 260: 3440-3450 [1985]).
Exemplo 39
Dados Biológicos In vitro e In vivo
Na Tabela II apresentam-se os dados biológicos para compostos da arte anterior seleccionados.
Tabela II Código da literatura Estrutura Terminal C EC;o (nM) em células "pit" SE n EDS0 (pg) IV em rato - Y w w F amida O o o 3 "GHRP 6" HwAWfK amida 6,2 1,5 5 1,0 "GHRP 2" a bAWfK amida 1,0 0,2 3 0,35 - (Ava) b A W f K amida 0,2 0,03 3 1,5 "GHRP 1" AHbAWfK amida 1,4 2 L-692,429 lactama benzo-fundida 26,2 5,3 5 100 L-692,585 lactama benzo-fundida 10,6 4,0 4 10
Na Tabela III apresentam-se os dados biológicos in vitro e in vivo seleccionados seguintes para os compostos representados pela Fórmula IV. (Segue tabela)
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Ar1 Ar3
Tabela III
Estrutura Terminal C EC50 (nM) em células "pit" SE n ED50 (,ug) IV em rato YwwFK amida 1000 3 Η w w F Κ amida 25,8 3,9 3 50 HbwFK amida 6,8 1,2 3 4,2 H w b F K amida 15,0 5,0 3 50 H b b F K amida 2,4 1,2 3 15,4 G w w F K amida 2,1 0,3 3 2,5 (Ava) w w F K amida 13,0 2,6 4 5 awwFK amida 4,1 2 3 1,47 G bwF K amida o,8 ; 2 4,8 (Ava) b w F K amida 4,6 1,5 6 11,8 H w w nmF K amida 37,3 11,3 3 G b b F K amida 14,9 2 100 bA b b F K amida 4,8 3,3 3 6,7 (Ab) b b F K amida 0,4 0,1 3 1 (Ava) b b F K amida 2,8 0,4 4 2,6 (ahx) b b F K amida 1000 2 250 (ahp) b b F K amida 34,3 8,2 3 100 (nba) b b F K amida 2,8 2 100 (inip)b b FK amida 0,18 0,04 3 0,2 (pyc) b b F K amida >300 4 200 (pac) b b F K amida 100 2 (Ava) b b F G amida 7,2 1,9 4 50 (Ava) b b F N amida 7,7 4,5 3 200
Estrutura Terminal C EC50 (nM) em células "pit" SE n i ED50 (pg) IV em rato (Ava) b b F n amida 10 1 12,5 (Ava) b b F k amida 17 1 33,3 (Ava) b b F P amida 51 ! i 1 50 b b F K amida 1000 2 (Ava) b b F K Y amida 13,6 2,6 3 20 (Ava) b nmb F K amida 3,8 1,4 3 100 (Ava) nmb b F K amida 1,8 j 0,6 3 0,4 (Ava) b b B K amida 0.7 1 50 (Ava) b b hF K amida j 5.0 1,7 3 50 (Ava) a b F K amida >300 2 (Ava) b b chA K amida 44,3 9,5 3 (Ava) b b (Pg) K amida >100 1 (Ava) b b (pG) K amida >100 1 (inip) b b npA K amida 0,1 2 1 (Ava) b b A K amida >150 2 (Ava) b a F K J amida >300 3 abbFK amida 3,5 1,5 3 10 Ab b F K amida 2,1 0,8 4 10 (mab) b b F K amida 1,4 1 0,7 (inip) nmb nmb F K amida 1,4 1 (inip) nmb b F K amida 0,27 0,06 4 0,4 (inip) b nmb F K amida 0,2 2 1 (inip) b b F K Y amida 0,43 0,01 4 1 (inip) b b F bA amida 0,2 0,05 4 2 nmb b F K amida >100 1 1000 (Ab) nmb b F K amida 0,5 2 1 (inip) nmb w F K amida 0,2 2 0,2 (inip) b b F K GGSGGSY amida 0,4 2 (inip) nmb b F dam 6,0 1 (inip) nmb b F mor 0,8 1 10 nmb b Y K amida 1000 4 500 (Ava) b b npA K amida 1000 1 (cho) b b F K amida 1000 1 (Ab) b b B ram 2,4 1,1 3 10
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Estrutura Terminal C EC;0 (nM) em células "pit" SE n ED50 (pg) IV em rato (inip)bbfdam 12 1 (inip) b b F dam 12 1 10 (inip)bbfmam 7,0 1 (inip) b b F mam 2,0 1 2 (inip) b b F tbm 10 1 10 (inip) b b Y(l) K amida (inip) b b Y K amida j 0,2 1 (inip) b b FKY(I) amida 0,69 0,54 3 (inip) b w F K amida 1,1 0,5 3 0,070
Na Tabela IV apresentam-se os dados biológicos in vitro e in vivo seleccionados seguintes para os compostos representados pela Fórmula III.
Ar1 r
,Y R8 O 2t. ,R° Ar2
O 1l_' Rc O
*RAN>SrNY^N
III
Tabela IV
Estrutura Terminal C EC50 (nM) em células "pit" SE n ED50 (pg) IV em rato H w w F amida 1000 4 (Ava)ffF amida 1000 1 (Ava) f w F amida >300 3 1000 (Ava) b b F amida 17,1 5,7 3 100 (Ava) b b fem >200 4 (inip) b b bam 18,5 2 3,3 (Ava) b F K amida >300 4 (inip) b b fem 2,04 0,9 .3 (inip) b b F amida 0,28 0,07 5 1,7 (inip) nmb b F amida 0,5 0,2 4 5 (inip) nl b F amida 101 1 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 146 Estrutura Terminal C EC50 (nM) em SE n EDS0 (pg) células "pit" IV em rato (inip) b nl F amida 72 1 (inip) b b nL amida 4,3 2 3,3 (inip) b b P amida 9 1 5 (inip) b b amF amida 0,5 1 5 (inip) b b nmF amida 0,6 2 5 (inip) nmb b F ácido 1,4 1 5 (inip) nmb b F éster de Me 1,4 2 10 (inip) nmb B F >100 1 (inip) b b feg amida 0,25 0,19 3 1 (inip) b b feb amida 0,3 2 0,67 (inip) b b fbd 0,9 2 0,67 (inip) b b hcF amida 0,2 0,09 3 2,5 (inip) hf b F amida 27 1 (inip) b hf F amida 14 1 10 (inip) nmb B F ácido 7 1 100 (inip) b b npA amida 0,2 1 5 (inip) b b B amida 0,1 2 50 (Ab) b b F amida 3,1 1 10 (inip) b b Pol 0,2 0,02 3 5 (inip) b chf F amida 2,1 j 1 5 (inip) chf b F amida 2,2 i 1 10 (inip) b nmb F amida 1 2 5 (inip) b b bA amida 10 1 10 (inip) b b F éster de Me 2,8 1 2 (inip) b b F ácido 0,2 2 2 (inip) w w F amida 0,9 2 5 (inip) b w F amida 0,1 2 0,67 (inip) b b Abx amida 13 1 100 (inip) b Abx F amida >100 1 (inip) b b tam 11 1 20 (inip) b b ram 16 1 5 (inip) b b pam 43 1 (inip) b b cxa 14 1 10 (inip) b b ppz ! 10 1 10 (inip) b b ab amida 10 1 10
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 147
Estrutura Terminal C EC50 (nM) em células "pit" SE n EDS0 (pg) IV em rato (inip) b b apc 39 1 (inip) b b api 2,7 2 25 (inip) b b 0 amida 5,9 2 1 (inip) b b o amida 10 1 (inip) b b Y ácido 5 1 10 (inip) b nmb bam j ; 0,3 2 1,67 (inip) nmb B bam 1000 1 (inip) nmb b bam n/d (inip) b nmb api 0,5 2 2 (inip) b b Y(l) ácido o,i ! 2
Na Tabela V apresentam-se os dados biológicos in vitro e in vivo seleccionados seguintes para os compostos representados pela Fórmula II. O 1L/
Ar1
Rc
Rb O 2l Âr2 11
Tabela V
Estrutura Terminal C EC50 (nM) em células "pit" SE n ed50 (pg) IV em rato (inip) b b amida 17,6 5,6 3 (inip) b Bnm j 36 1 20 (inip) b b ácido 82 1 « (inip) b boi 2 2 10 (inip) b b éster de Me 5 1 100 (inip) b mbm 7 1 20 (inip) b BoJ 100 • 4 (inip) B Boi 1000 1 (inip) B boi 1000 1 (inip) b wol 10,6 6,2 3 0,8
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 148
Estrutura Terminal C ECS0 (nM) em células "pit" SE n ED50 (pg) IV em rato (inip) w wol 4 1 20 (inip) w boi 1000 1 (inip) b npe 11 2 500 (inip) b men 12 2 500 (inip) b man 9 1 500 (inip) b tam 1000 1 (Ava) b boi I 190 1 (inip) b nbol 3 1 20 (amb) b boi 1000 1 (inip) b miz 12 1 (inip) b mbm Ac 90 2 Boc (inip) b mbm 13 1 ! I (inip) b tra 100 2 100
Na Tabela VI apresentam-se os dados biológicos in vitro e in vivo seleccionados seguintes para os compostos "retroinversos" representados pela Fórmula V.
Ar1
Rs 1L' O
v
Tabela VI
Estrutura Terminal C EC50 (nM) em células "pit" SE n ED50 (pg) IV em rato (dhc) B B bam >200 3 (Ava) f B B K amida 36 1 (Ava) f B B bam 22 1 100 (Ab) b B B ram 2 2 b B B ram 15,2 1 100 Ac b B B ram 4,8 2 100 (inip) B B api 96 2 (inip) B B bam 1000 1
Exemplo 40
Secreção de Hormona de Crescimento Induzida por GHRP: Administração Intravenosa
Os ratos Sprague Dawley fêmea recém-desmamados imaturos foram adquiridos nos Laboratórios Charles River Labs (Portage, Oregon) e engaiolados em grupo com água e comida disponíveis ad libitum. Quando os ratos tinham 24-30 dias de idade (pesando 50-90 g), foram anestesiados com pentobarbitona (4 mg em 0,5 ml, aproximadamente 60 mg/kg) administrada por injecção intraperitoneal. Depois, os ratos foram colocados por breves instantes sobre um leito aquecido, para distender as suas veias caudais, e administrou-se uma injecção intravenosa na veia caudal dos péptidos, 20 minutos após receberem a anestesia. A injecção intravenosa foi de 0,1 ml usando uma seringa de 1 ml. As injecções continham doses graduadas de péptidos ou o veículo (o veículo para todos os péptidos administrados intravenosamente era um tampão de 20 mM de acetato de sódio, 45 g/l de manitol, pH 5,0. Dez minutos após a injecção intravenosa, recolheu-se sangue por punção cardíaca, usando uma seringa de 3 ml, e os ratos foram depois sacrificados. O sangue foi depois coagulado em gelo, centrifugado, o soro foi decantado e congelado para análise subsequente usando o ELISA de GH de rato descrito noutro local na memória descritiva. Para o ELISA de GH de rato, o soro foi diluído 1:50 ou 1:250, dependendo das concentrações esperadas de GH a atingir no soro, e ensaiado em duplicado.
Exemplo 41
Ganho de Peso Induzido por GHRP, Dependente da Dose em Ratos Métodos: Quarenta ratos fêmea Sprague Dawley normais (Fornecedor, Charles River, 90 dias de idade, peso médio 200 g) foram engaiolados em grupo, numa sala com temperatura e luz controladas, e alimentados com uma ração granulada padrão para ratos e com água da torneira ad libitum. Os ratos foram pesados no dia da cirurgia (ver abaixo) e foram constituídos aleatoriamente 5 grupos de 8/grupo usando um programa de agrupamento.
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 150
Dissolveu-se ο GHRP (inip)-bbFK-NH2 num tampão acetato de sódio (20 mM) (pH 5,0) contendo manitol (45 g/l), a 8 g/l, 1,6 g/l e 0,33 g/l. Dissolveu-se GHRH (1-43) de rato no mesmo tampão a 25 g/l. Encheram-se minibombas osmóticas (Alza, Paio Alto, modelo 2002, taxa de bombagem 0,52 μΙ/h durante 14 dias, volume de enchimento 230 μΙ) com estas soluções (1/rato para o (inip)-bbFK-NH2 e 2/rato para a GHRH de rato); um quinto conjunto de bombas foi cheio com o tampão acetato de sódio. Todas as bombas foram preparadas por incubação em solução salina isotónica de um dia para o outro num frigorífico.
No dia seguinte, inseriram-se estas bombas osmóticas nos ratos. Para o efeito, anestesiaram-se os ratos com cetamina/xilazina (62,5 e 12,5 mg/kg/rato, respectivamente, por injecção i.p.). A zona dorsal do pescoço foi depois rapada, esfregada com solução de betadine e limpa com álcool. Foi depois feita uma incisão na zona dorsal do pescoço e criada caudalmente uma bolsa subcutânea por dissecação romba. Depois, as bombas foram inseridas na bolsa, ficando a extremidade da bomba que fornece a solução numa posição afastada da incisão. A incisão foi depois fechada com agrafos, o rato foi colocado num leito aquecido e, quando ambulatório, foi devolvido à sua gaiola de origem.
Os ratos foram depois pesados todos os dias e no dia 14 foram sacrificados usando inalação com dióxido de carbono. Foram depois sangrados a partir do coração e retiraram-se os órgãos. A pituitária, o baço, o coração, os rins, o fígado e o timo, foram recolhidos e pesados enquanto que as tíbias foram removidas e colocadas em formalina a 10% para avaliação histológica subsequente. Para o efeito, as tíbias foram seccionadas longitudinalmente e a largura da placa epifisária foi medida usando um microscópio equipado com um micrómetro ocular.
As químicas do soro foram medidas por procedimentos automatizados padrão. O factor de crescimento 1 do tipo insulina (IGF-1) no soro foi medido por radio-imunoensaio, usando um anticorpo criado em coelhos, após extracção com etanol ácido para removera proteína ligada ao IGF-1. A significância estatística foi avaliada por análise de variância que, se significativa (p<0,05), foi seguida por um Novo Teste de Amplitude Múltipla de Duncan ("Duncan's New Multiple Range Test”) para testar as diferenças entre os
85 455
ER Ο 792 289/PT 151 são apresentados como a média ± o grupos de tratamento individuais. Os dados erro padrão da média com 8 ratos por grupo.
Na Figura 19 mostram-se os ganhos de peso corporal representados em função do tempo para os 5 grupos de tratamento. Tanto o (inip)-bbFK-NH2 como a GHRH de rato induziram um ganho no peso corporal e um ganho no peso dos órgãos, significativos em comparação com os ratos tratados com veículo.
Exemplo 42
Comparação entre as Injecções SC e as Infusões SC Métodos: Quarenta ratos fêmea Sprague Dawley normais (Fornecedor, Charles River, 150 dias de idade, peso médio 280 g) foram engaiolados em grupo, numa sala com temperatura e luz controladas, e alimentados com uma ração granulada padrão para ratos e com água da torneira ad libitum. Os ratos foram pesados no dia da cirurgia (ver abaixo) e foram constituídos aleatoriamente 5 grupos de 8/grupo usando um programa de agrupamento.
Dissolveu-se o GHRP (inip)-bbFK-NH2 num tampão acetato de sódio (20 mM) (pH 5,0) contendo manitol (45 g/l), a 8 g/l e 1,6 g/l para encher as minibombas e a 0,5 e 0,1 g/l para as soluções para injecção. Encheram-se minibombas osmóticas (Alza, Paio Alto, modelo 2002, taxa de bombagem 0,52 μΙ/h durante 14 dias, volume de enchimento 230 μΙ, uma por rato) com estas soluções; um quinto conjunto de bombas foi cheio com o tampão acetato de sódio. Todas as bombas foram preparadas por incubação em solução salina isotónica de um dia para o outro num frigorífico.
No dia seguinte, inseriram-se estas bombas osmóticas em todos os ratos. Para o efeito, anestesiaram-se os ratos com cetamina/xilazina (62,5 e 12,5 mg/kg/rato, respectivamente, por injecção i.p.). A zona dorsal do pescoço foi depois rapada, esfregada com solução de betadine e limpa com álcool. Foi depois feita uma incisão na zona dorsal do pescoço e criada caudalmente uma bolsa subcutânea por dissecação romba. Depois, as bombas foram inseridas na bolsa, ficando a extremidade da bomba que fornece a solução numa posição afastada da incisão. A incisão foi depois fechada com agrafos, o rato foi colocado num leito aquecido e, quando ambulatório, foi devolvido à sua gaiola de origem.
85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 152
Os grupos de tratamento foram: 1) Bomba de excipiente, injecções de excipiente 2 vezes ao dia. 2) Bomba de (inip)-bbFK-NH2 (100 pig/dia), injecções de excipiente 2 vezes ao dia. 3) Bomba de (inip)-bbFK-NH2 (20 pig/dia), injecções de excipiente 2 vezes ao dia.
I 4) Bomba de excipiente, injecções de 50 ,ug de (inip)-bbFK-NH2 2 vezes ao dia. 5) Bomba de excipiente, injecções de 10 Lig de (inip)-bbFK-NH2 2 vezes ao dia.
Os ratos foram depois pesados todos os dias e injectados duas vezes ao dia, com excipiente, ou com as duas doses de (inip)-bbFK-NH2. No dia 14 foram sacrificados usando inalação com dióxido de carbono. Foram depois sangrados a partir do coração e retiraram-se os órgãos. Os ratos foram esfolados e eviscerados para pesar a quantidade de pele, de músculo e de ossos (a carcaça). A pituitária, o baço, o coração, os rins, o fígado, o timo e o músculo solhar foram também recolhidos e pesados enquanto que as tíbias foram removidas e colocadas em formalina a 10% para avaliação histológica subsequente. As tíbias foram seccionadas longitudinalmente e a largura da placa epifisária foi medida usando um microscópio equipado com um micrómetro ocular.
As químicas do soro foram medidas usando técnicas automatizadas padrão. O factor de crescimento 1 do tipo insulina (IGF-1) no soro foi medido por radio-imunoensaio, usando um anticorpo criado em coelhos, após extracção com etanol ácido para remover a proteína ligada ao IGF-1. A significância estatística foi avaliada por análise de variância que, se significativa (p<0,05), foi seguida por um Novo Teste de Amplitude Múltipla de Duncan para testar as diferenças entre os grupos de tratamento individuais. Os ^ dados são apresentados como a média ± o erro padrão da média com 8 ratos por grupo. 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 153
Ο (inip)-bbFK-NH2 a 20 e a 100 ^ig/dia, entregue tanto por injecção como por infusão, induziu um ganho de peso corporal significativo comparado com o dos ratos tratados com veículo. Na Figura 20 pode-se observar a natureza relacionada com a dose dos ganhos de peso corporal para as injecções com (inip)-bbFK-NH2. Por contraste, verificaram-se ganhos de peso corporal similares em resposta a infusões tanto com 20 como com 100 ,ug/dia de (inip)-bbFK-NH2. Adicionalmente, verificaram-se padrões muito diferentes no ganho de peso em resposta a infusões ou a injecções de 100 μg/dia de (inip)-bbFK-NH2, como se po.de observar na Figura 21.
Exemplo 43
Tratamento de Ratos obesos com Combinação de GHRP e de IGF-1 Métodos: Quarenta e oito (48) ratos macho obesos Zucker Diabetic Fatty (ZDF) (Genetic Models Inc., Indianapolis, IN 46268), com 6 semanas de idade, foram engaiolados em grupo, numa sala com temperatura e luz controladas, e alimentados com uma ração granulada padrão para rato e com água da torneira ad libitum. Os ratos foram pesados no dia da cirurgia (ver abaixo) e foram constituídos aleatoriamente 6 grupos de 8/grupo usando um programa de agrupamento. Dez ratos ZDF magros serviram como grupo de controlo adicional.
Dissolveu-se o GHRP (inip)-bbFK-NH2 num tampão acetato de sódio (20 mM) (pH 5,0) contendo manitol (45 g/l) a 0,5 g/l. Este GHRP foi administrado por injecção sc. duas vezes ao dia, cada dose de 100 μΙ contendo deste modo 50 μg/injecção ou 100 μg/dia.
Carregou-se IGF-1 humano recombinante (rhlGF-1) a 13,8 mg/ml em tampão acetato, em minibombas osmóticas (Alza, Paio Alto, modelo 2ML4, taxa de bombagem 2,29 μΙ/h durante 28 dias, volume de enchimento 2064 μΙ). Outras bombas foram cheias com o tampão acetato. As bombas foram preparadas por incubação em solução salina isotónica de um dia para o outro num frigorífico. A dose entregue de rhlGF-1 era deste modo de 758 μg/dia. A hormona de crescimento humana recombinante (rhGH, Lote R9092AX, Genentech Inc.) foi diluída em água esterilizada a 2,5 g/l e administrou-se uma injecção de 100 μΙ duas vezes ao dia (250 μg/injecção ou 500 μg/dia). 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 154
No dia seguinte, inseriram-se as bombas osmóticas nos ratos. Para o efeito, anestesiaram-se os ratos com cetamina/xilazina (62,5 e 12,5 mg/kg/rato, respectivamente, por injecção i.p.). A zona dorsal do pescoço foi depois rapada, esfregada com solução de betàdine e limpa com álcool. Foi depois feita uma incisão na zona dorsal do pescoço e criada caudalmente uma bolsa subcutânea por dissecação romba. Depois, as bombas foram inseridas na bolsa, ficando a extremidade da bomba que fornece a solução numa posição afastada da incisão. Todos os ratos que não receberam bombas contendo rhlGF-1, foram implantados com bombas que fornecem o excipiente de tampão acetato. A incisão foi depois fechada com agrafos, o rato foi colocado num leito aquecido e, quando ambulatório, foi devolvido à sua gaiola de origem.
Os ratos foram depois pesados todos os dias e injectados duas vezes ao dia, com droga activa (GH ou GHRH), ou com excipiente de veículo. No dia 24, recolheu-se sangue após um jejum de 4 h e injectaram-se i.p. 1,5 U/kg de insulina regular e recolheu-se uma segunda amostra de sangue 30 minutos mais tarde. Os ratos foram depois sacrificados usando dióxido de carbono, sangrados a partir do coração e retiraram-se os órgãos. A glucose no soro foi medida por procedimentos automatizados padrão. A significância estatística foi avaliada por análise de variância que, se significativa (p<0,05), foi seguida por um Novo Teste de Amplitude Múltipla de Duncan para testar as diferenças entre os grupos de tratamento individuais. Os dados são apresentados como a média ± o erro padrão (SE) da média com 8 ratos por grupo.
Ganho de peso Corporal: Na Figura 22 mostram-se os ganhos de peso corporal representados em função do tempo para todos os grupos de tratamento durante todo o estudo e na Figura 23 mostram-se para os primeiros 7 dias para os grupos de tratamento com o GHRP (inip)bbFK-NH2 e IGF-1. Na Figura 24 mostram-se os valores basais de glucose no sangue representados em função do tempo para todos os grupos de tratamento para a experiência completa e na Figura 25 mostram-se as respostas de glucose no sangue a um desafio com insulina intravenosa no final da experiência.
85 455 155 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ Exemplo 44
Tratamento de Ratos Normais com Combinação de GHRP e de IGF-1 Métodos: Sessenta ratos SD fêmea adultos normais (Fornecedor, Charles River, 120 dias de idade, 250 a 320 g) foram engaiolados em grupo, numa sala com temperatura e luz controladas, e alimentados com uma ração granulada padrão para rato e com água da torneira ad libitum. Os ratos foram pesados no dia da cirurgia e foram constituídos aleatoriamente 12 grupos de 5/grupo usando um programa de agrupamento.
Dissolveram-se a 0,5 g/l os secretagogos de GH (GHRP e GHRH) num tampão acetato de sódio (20 mM) (pH 5,0) contendo manitol (45 g/l). Os secretagogos de GH foram administrados por injecção sc. duas vezes ao dia, cada dose de 100 μΙ. As diferentes doses das moléculas foram administradas com base na sua potência no ensaio IV (por exemplo, o L-692,585 foi administrado em doses 3 vezes mais elevadas pois era inferior ao menos potente dos secretagogos). Carregaram-se IGF-1 humano recombinante (rhlGF-1) a 2,5 mg/ml em tampão acetato, em minibombas osmóticas (Alza, Paio Alto, modelo 2ML1, taxa de bombagem 10,16 μΙ/h durante 7 dias, volume de enchimento 2086 μΙ). Outras bombas foram cheias com o tampão acetato. As bombas foram preparadas por incubação em solução salina isotónica de um dia para o outro num frigorífico. A dose entregue de rhlGF-1 era deste modo de 610 μg/dia.
No dia seguinte, inseriram-se as bombas osmóticas nos ratos. Para o efeito, anestesiaram-se os ratos com cetamina/xilazina (62,5 e 12,5 mg/kg/rato, respectivamente, por injecção i.p.). A zona dorsal do pescoço foi depois rapada, esfregada com solução de betadine e limpa com álcool. Foi depois feita uma incisão na zona dorsal do pescoço e criada caudalmente uma bolsa subcutânea por dissecação romba. Depois, as bombas foram inseridas na bolsa, ficando a extremidade da bomba que fornece a solução numa posição afastada da incisão. Todos os ratos que não receberam bombas contendo rhlGF-1, foram implantados com bombas que fornecem o excipiente de tampão acetato. A incisão foi depois fechada com agrafos, o rato foi colocado num leito aquecido e, quando ambulatório, foi devolvido à sua gaiola de origem. 156 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
Os grupos de tratamento foram: 1) Excipiente 2) Excipiente 3) GHRH (300 .ug/dose) 4) GHRH (300 ,ug/dose) 5) GHRP-6 (50 μg/dose) 6) GH'RP-6 (50 pg/dose) 7) (inip) b b F-NH2 (50 pg/dose) 8) (inip) b b F-NH2 (50 pg/dose) 9) (inip) b nmb bam (50 pg/dose) 10) (inip) b nmb bam (50 pg/dose) 11) L-692,585 (150 pg/dose) 12) L-692,585 (150 pg/dose) 2 injecções/d Bomba de excipiente 2 injecções/d Bomba de IGF-1 2 injecções/d Bomba de excipiente 2 injecções/d Bomba de IGF-1 2 injecções/d Bomba de excipiente 2 injecções/d Bomba de IGF-1 2 injecções/d Bomba de excipiente 2 injecções/d Bomba de IGF-1 2 injecções/d Bomba de excipiente | 2 injecções/d Bomba de IGF-1 2 injecções/d Bomba de excipiente 2 injecções/d Bomba de IGF-1
Os ratos foram depois pesados todos os dias e injectados duas vezes ao dia, com droga activa (GHRH ou GHRP), ou com excipiente de veículo. Os ratos foram depois sacrificados usando dióxido de carbono, sangrados a partir do coração e retiraram-se os órgãos. As químicas do soro foram medidas por procedimentos automatizados padrão. A significância estatística foi avaliada por análise de variância que, se significativa (p<0,05), foi seguida por um Novo Teste de Amplitude Múltipla de Duncan para testar as diferenças entre os grupos de tratamento individuais. Os dados são apresentados como a média ± o erro padrão da média com 8 ratos por grupo.
Ganho de peso Corporal: Na Figura 26 mostram-se os ganhos de peso corporal representados em função do tempo para os grupos tratados apenas com os secretagogos de GH. As respostas à combinação de secretagogos de GH e IGF-1 tendem a ser superiores às do IGF-1 sozinho (Figura 27). í? ΊΠΤ 2ΠΠ0
Lisboa,
Por GENENTECH, INC.

Claims (18)

  1. 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 1/39 REIVINDICAÇÕES 1. Composto representado pela Fórmula estrutural II
    onde Ar1 e Ar2 são cada um seleccionados independentemente de entre indoílo,
    n e o são independentemente 1,2 ou 3; L1 é seleccionado de entre -CH2-0-, -ch2-ch2-o-, -ch2-, -CH2-CH2-, e -CH2-CH2-CH2-; L2 é seleccionado de entre uma ligação covalente, -O-, -0-CH2-, e 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 2/39
    RB e Rc são seleccionados de entre o grupo compreendendo hidrogénio, alquiloCVCg opcionalmente substituído com um grupo seleccionado de entre NR2R3 e fenil-CrC3-NR2R3, e halogeno(F, Cl, Br, l)alquiloCrC6; R1 é seleccionado de entre hidrogénio, alquiloCrC6, C(=0)alquiloC,-C5, C(=0)-NR2R3, C(=NR2)-NR2R3, C(=0)0-alquiloCrC6, halogeno(F, Cl, Br, l)alquiloCrC6, e alquiloCrC6 substituído com 1-3 grupos hidroxilo; R2 e R3 são seleccionados independentemente de entre alquilC^Cg-NHj, alquilCrC6-heterociclo, alquilC1-C6-NH-alquiloC1-C6, alquilC^Cg-N-ídialquiloCT-Cg), R1, e piperidinilo; R2 e R3, conjuntamente com o N ao qual estão ligados, podem formar um heterociclo de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional seleccionado de entre O, S e N, e onde qualquer N está opcionalmente substituído com R1, qualquer carbono está opcionalmente substituído com R6 e onde o heterociclo está opcionalmente fundido com um anel fenilo, opcionalmente substituído com R4; R4 e R5 são seleccionados independentemente de entre o grupo compreendendo hidrogénio, halogéneo(F, Cl, Br e I), ciano, amino, amido, nitro, hidroxi, alquiloC,-C6 opcionalmente substituído com 1-3 R6, alciniloC2-C6 opcionalmente substituído com 1-3 R6, alquiloxiCrC6 opcionalmente substituído com 1-3 R6, acilaminoCrC6 opcionalmente substituído com 1-3 R6, alquilcarboniloC^Cg opcionalmente substituído com 1-3 R6, alquiloxicarboniloCrC6 opcionalmente substituído com 1-3 R6, N-(alquilC1-C6),N-(acilC1-C6)amino opcionalmente substituído com 1-3 R6, N-(alquilCrC6)carboxamido opcionalmente substituído com 1-3 R6, N,N-di(alquilC0-C6)amino opcionalmente substituído com 1-3 R6, 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 4/39 N,N-di(alquilC1-C6)carboxamido opcionalmente substituído com 1-3 R6, perfluoroalquiloC^-C^ e perfluoroalcoxiCrC3; R6 é seleccionado de entre o grupo compreendendo COOR2, CONR2R3, ciano, NR2R3, NR2COR3, azido, nitro, e hidroxi; X é seleccionado de entre o grupo compreendendo hidrogénio, oxo (=0), COOR2, CONR2R3, alquilCo-Ce-O-alquiloCrCg opcionalmente substituído com 1-2 R6, e alquiloCrC6 opcionalmente substituído com 1-2 R6; e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
  2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1 representado pela Fórmula estrutural (lia) 85 455
    ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 5/39
    νΛΥΝΤ X Αγ2 onde Ar1 e Ar2 são cada um seleccionados independentemente de entre indoílo, e
    RB e Rc são seleccionados de entre o grupo compreendendo hidrogénio, e metilo; R1 é seleccionado de entre hidrogénio, alquiloCrC6, C^OJalquiloCVCg, C(=0)-NR2R3, C(=NR2)-NR2R3, C(=0)0-alquiloCrC6, e halogeno(F, Cl, Br, l)alquiloCrC6; R2 e R3 são seleccionados independentemente de entre hidrogénio, alquiloC^Cg, ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 6/39 piperidinilo, e halogeno(F, Cl, Br, l)alquiloCrC6; R2 e R3, conjuntamente com o azoto ao qual estão ligados, podem formar piperidinilo, pirrolidinilo, piperazinilo, e morfolinilo; R6 é seleccionado de entre o grupo compreendendo COOR2, CONR2R3, ciano, NR2R3, NR2COR3, azido, nitro, e hidroxi; X é seleccionado de entre o grupo compreendendo hidrogénio, oxo (=0), COOR2, CONR2R3, alquilC0-C6-O-alquiloCrC6 opcionalmente substituído com 1-2 R6, e ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 7/39 alquiloCrC6 opcionalmente substituído com 1-2 R6; e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
  3. 3. Composto representado pela fórmula seleccionada de entre o grupo compreendendo: (Seguem fórmulas)
    85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
    e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
  4. 4. Composto representado pela Fórmula estrutural (III)
    onde Ar1 e Ar2 são cada um seleccionados independentemente de entre indoílo,
    (R\
    n e o são independentemente 1, 2 ou 3; L1 e L2 são seleccionados independentemente de entre -CH2-0-, 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 12/39 -ch2-ch2-o-,
    -ch2-, -CH2-CH2-, e -CH2-CH2-CH2-; RB, Rc e RD são seleccionados de entre o grupo compreendendo hidrogénio, alquiloCrC6 opcionalmente substituído com um grupo seleccionado de entre NR2R3, e fenil-CrC3-NR2R3, e halogeno(F, Cl, Br, l)alquiloCrC6; R1 é seleccionado de entre hidrogénio, alquiloC^Cg, C(=0)alquiloC1-C6, C(=0)-NR2R3, C(=NR2)-NR2R3, C(=0)0-alquiloCrC6, e halogeno(F, Cl, Br, l)alquiloC.,-C6; R2 e R3 são seleccionados independentemente de entre hidrogénio, alquiloCrC6 piperidinilo, e
    85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 13/39 halogeno(F, Cl, Br, l)alquiloCrC6; R2 e R3, conjuntamente com o N ao qual estão ligados, podem formar um heterociclo de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional seleccionado de entre O, S e N, onde qualquer N está opcionalmente substituído com R1, qualquer carbono está opcionalmente substituído com R6 e onde o heterociclo está opcionalmente fundido com um anel fenilo, opcionalmente substituído com R4; R4 e R5 são seleccionados independentemente de entre o grupo compreendendo hidrogénio, halogéneo(F, Cl, Br e I), ciano, amino, amido, nitro, hidroxi, alquiloC^Cg opcionalmente substituído com 1-3 R6, alciniloC2-C6 opcionalmente substituído com 1-3 R6, alquiloxiC^Cg opcionalmente substituído com 1-3 R6, acilaminoC^Cg opcionalmente substituído com 1-3 R6, alquilcarboniloCrC6 opcionalmente substituído com 1-3 R6, alquiloxicarboniloC^Ce opcionaimente substituído com 1-3 R6, N-íalquilC^Cej.N-íacilC^Cgjamino opcionalmente substituído com 1-3 R6, N-íalquilC^Cejcarboxamido opcionalmente substituído com 1-3 R6, N,N-di(alquilC0-C6)amino opcionalmente substituído com 1-3 R6, N.N-diíalquilC^Cgjcarboxamido opcionalmente substituído com 1-3 R6,
    85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 14/39 perfluoroalquiloC,-C4, e perfluoroalcoxiCrC3; R6 é seleccionado de entre o grupo compreendendo COOR2, CONR2R3, ciano, NR2R3, NR2COR3, azido, nitro, e hidroxi; R7 é seleccionado de entre o grupo compreendendo R6, e ariloC6-C10 opcionalmente substituído com halogéneo(F, Cl, Bre I), ciano, amino, amido, nitro, hidroxi, perfluoroalquiloC1-C4, e perfluoroalcoxiCrC3; 85 455
    ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 15/39 Υ é seleccionado de entre o grupo compreendendo alquiloCrC6 substituído com 1-2 R7, alciniloC2-C6 opcionalmente substituído com 1-2 R7 alceniloC2-C6 opcionalmente substituído com 1-2 R7, e alquiloxiCrC5 opcionaimente substituído com 1-2 R7, e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
  5. 5. Composto De acordo com a reivindicação 4 seleccionado de entre o grupo compreendendo
    e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
  6. 6. Composto 4 representado pelas Fórmulas estruturais llla-llld. o \ lo Ar Rc
    85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 16/39
    III d R° Ν^Υ onde Ar1 e Ar2 são cada um seleccionados independentemente de entre indoílo,
    n e o são independentemente 1,2 ou 3; RB, Rc e RD são seleccionados de entre o grupo compreendendo hidrogénio, alquiloCrC6 opcionalmente substituído com um grupo seleccionado de entre NR2R3, e fenil-C1-C3-NR2R3, e halogeno(F, Cl, Br, l)alquiloCrC6;
    85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 17/39 R1 é seleccionado de entre hidrogénio, alquiloCrC6, C(=0)alquiloC1-C6, C(=0)-NR2R3, C(=NR2)-NR2R3, C(=0)0-alquiloCrC6, e halogeno(F, Cl, Br, l)alquiloCrC6; R2 e R3 são seleccionados de entre hidrogénio, alquiloCrC6, piperidinilo, e halogeno(F, Cl, Br, IjalquiloC^Cg; R2 e R3, conjuntamente com o N ao qual estão ligados, podem formar um heterociclo de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional seleccionado de entre O, S e N, onde qualquer N está opcionalmente substituído com R1, qualquer carbono está opcionalmente substituído com R7 e onde o heterociclo está opcionalmente fundido com um anel fenilo, opcionalmente substituído com R4; R4 e R5 são seleccionados independentemente de entre o grupo compreendendo hidrogénio, halogéneo(F, Cl, Br e I), ciano, amino, amido, 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 18/39
    nitro, hidroxi, perfluoroalquiloCrC4, e perfluoroalcoxiCrC3; R7 é seleccionado de entre o grupo compreendendo COOR2, CONR2R3, ciano, NR2R3, NR2COR3, azido, nitro, hidroxi, ariloC6-C10 opcionalmente substituído com halogéneo(F, Cl, Br e I), ciano, amino, amido, nitro, hidroxi, perfluoroalquiloC1-C4, e perfluoroalcoxiC!^; 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 19/39
    Υ é seleccionado de entre o grupo compreendendo alquiloCrC6 substituído com 1-2 R7, alciniloC2-C6 opcionalmente substituído com 1-2 R7 alceniloC2-C6 opcionalmente substituído com 1-2 R7, alquiloxiC^Cg opcionalmente substituído com 1-2 R7, e piperidinilo; e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
  7. 7. Composto de acordo com a reivindicação 6 representado pela Fórmula estrutural (llla)
    onde Ar1 e Ar2 são cada um seleccionados independentemente de entre indoílo, e
    RB, Rc e RD são seleccionados de entre o grupo compreendendo hidrogénio, alquiloC^Cg, arilCe-C^-alquiloCrCg, e halogeno(F, Cl, Br, OalquiloC^Cg;
    85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 20/39 R1 é seleccionado de entre hidrogénio, alquiloCrC6, C^OjO-alquiloC^Cg, e halogeno(F, Cl, Br, IjalquiloC^Ce; R2 e R3 são seleccionados de entre hidrogénio, alquiloC^Ce, piperidinilo, e halogeno(F, Cl, Br, OalquiloC^Cg; R2 e R3, conjuntamente com o azoto ao qual estão ligados podem formar um anel opcionalmente mono- ou dissubstituído seleccionado de entre piperidinilo, pirrolidinilo, pirrilo, imidazolilo, piperazinilo, e morfolinilo, onde os substituintes são seleccionados de entre alquilo C^Ca; R7 é seleccionado de entre o grupo compreendendo COOR2, CONR2R3, ciano, 85 455
    ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ NR2R3, NR2COR3, azido, nitro, hidroxi, e ariloC6-C10 opcionalmente substituído com halogéneo(F, Cl, Br e I), ciano, amino, amido, nitro, hidroxi, perfluoroalquiloCrC4, e perfluoroalcoxiCrC3; Y é seleccionado de entre o grupo compreendendo alquiloC^Cg substituído com 1-2 R7, alciniloC2-C6 opcionalmente substituído com 1-2 R7 alceniloC2-C6 opcionalmente substituído com 1-2 R7, alquiloxiC^Ce opcionalmente substituído com 1-2 R7, e piperidinilo; Y e R°, conjuntamente com o N ao qual estão ligados, podem formar um heterociclo de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional seleccionado de entre O, S e N, onde qualquer N está opcionalmente substituído 0. ÉLâ^ ff Sf e onse ^ 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 22/39 com R1, qualquer carbono está opcionalmente substituído com R7 heterociclo está opcionalmente fundido com um anel fenilo; e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
  8. 8. Composto de acoordo com a reivindicação 6 ou a reivindicação 7 seleccionado de entre o grupo compreendendo
    e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
    85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 26/39
  9. 9. Composto representado pela Fórmula estrutural (IV)
    onde Ar1 e Ar2 são cada um seleccionados independentemente de entre indoílo,
    e Ar3 é seleccionado de entre o grupo compreendendo
    ^ (R4)n n e o são independentemente 1, 2 ou 3; RB, Rc, RD e RE são seleccionados de entre o grupo compreendendo hidrogénio, alquiloC^Ce opcionalmente substituído com um grupo seleccionado de entre -NR2R3, e fenil-C^Cg- NR2R3, e 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 27/39
    ,-sa» halogeno(F, Cl, Br, l)alquiloCrC6; R1 é seleccionado de entre hidrogénio, alquiloCrC6, C(=0)alquiloCrC6l C(=0)-NR2R3, -C(=NR2)-NR2R3, C(=0)0-alquiloC1-C6, e halogeno(F, Cl, Br, IjalquiloC^-Cg; R2 e R3 são seleccionados independentemente de entre hidrogénio, alquiloC^Ce, piperidinilo, e halogeno(F, Cl, Br, l)alquiloCrC6; R2 e R3, conjuntamente com o N ao qual estão ligados, podem formar um heterociclo de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional seleccionado de entre O, S e N, onde qualquer N está opcionalmente substituído com R1, qualquer carbono está opcionalmente substituído com R6 e onde o heterociclo está opcionalmente fundido com um anel fenilo, opcionalmente substituído com R4; R4 e R5 são seleccionados independentemente de entre o grupo compreendendo hidrogénio, halogéneo(F, Cl, Br e I), ciano,
    85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 28/39 amino, amido, nitro, hidroxi, alquiloC^Cg opcionalmente substituído com 1-3 R6, alciniloC2-C6 opcionalmente substituído com 1-3 R6, alquiloxiC^Cg opcionalmente substituído com 1-3 R6, acilaminoC,-^ opcionalmente substituído com 1-3 R6, alquilcarboniloC^Cg opcionalmente substituído com 1-3 R6, alquiloxicarboniloC.-C6 opcionalmente substituído com 1-3 R6, N-(alquiiC1-C6),N-(acilCl-C6)amino opcionalmente substituído com 1-3 R6, N-íalquilCrCgJcarboxamido opcionalmente substituído com 1-3 R6, N,N-di(alquilC0-C6)amino opcionalmente substituído com 1-3 R6, N.N-dKalquilCrCjjJcarboxamido opcionalmente substituído com 1-3 R6, perfluoroalquiloC^^, e perfluoroalcoxiCrC3; R6 é seleccionado de entre o grupo compreendendo COOR2, CONR2R3, 0(C=0)R2, ciano, 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 29/39 NR2COR3,
    azido, nitro, e hidroxi; R7 é seleccionado de entre o grupo compreendendo R6, e ariloC6-C10 opcionalmente substituído com halogéneo(F, Cl, Br e I), ciano, amino, amido, nitro, hidroxi, perfluoroalquiloC1-C4, e perfluoroalcoxiCrC3; Z é seleccionado de entre o grupo compreendendo alquilo^-Ce substituído com 1-2 R7, alciniloC2-C6 opcionalmente substituído com 1-2 R7, alceniloC2-C6 opcionalmente substituído com 1-2 R7, e alquiloxiCrCg opcionalmente substituído com 1-2 R7, Z e RE, conjuntamente com o N ao qual estão ligados, podem formar um heterociclo de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional seleccionado de entre O, S e N, onde qualquer N está opcionalmente substituído 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 30/39
    com R1, qualquer carbono está opcionalmente substituído com R7 e onde o heterociclo está opcionalmente fundido com um anel fenilo; e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
  10. 10. Composto de acordo com a reivindicação 9 seleccionado de entre o grupo compreendendo
    e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
    85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 31/39
  11. 11. Composto representado pela Fórmula estrutural (IVa)
    onde RB, Rc, RD e RE são seleccionados de entre o grupo compreendendo hidrogénio, e alquiloCrC6;
    Ar1 e Ar2 são cada um seleccionados independentemente de entre indoílo, e Ar3 é seleccionado de entre o grupo compreendendo
    R\ RF é seleccionado de entre o grupo compreendendo OH, alquiloxiC^C,,, NR5R6, e 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 32/39
    1 a 4 resíduos aminoácido α; R4 é seleccionado de entre hidrogénio, halogéneo(F, Cl, Br e I), ciano, amino, amido, nitro, hidroxi, alcoxiC^C^ perfluoroalquiloC^C^ e perfiuoroalcoxiC1-C3; Rõ e R6 são seleccionados independentemente de entre hidrogénio, e alquiloC^Cg; e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
  12. 12. Composto de acordo com a reivindicação 11 seleccionado de entre o grupo compreendendo
    85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 33/39
    e
    85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 35/39
    -CH2-CH2-, e -CH2-CH2-CH2-; L2 é seleccionado de entre uma ligação covalente -O--0-CH2-, e RB e Rc são seleccionados de entre o grupo compreendendo hidrogénio, alquiloCrC6 opcionalmente substituído com um grupo seleccionado de entre NR2R3 e fenil-C1-C3-NR2R3, e halogeno(F, Cl, Br, l)alquiloCrC6; RA e RB, conjuntamente com o N ao qual estão ligados, podem formar um heterociclo de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional seleccionado de entre O, S e N, e onde qualquer N está opcionalmente substituído com R1, qualquer carbono está opcionalmente substituído com R6 e onde o heterociclo está opcionalmente fundido com um anel fenilo, opcionalmente substituído com R4; R1 é seleccionado de entre hidrogénio, alquiloC^Ce, C^OjalquiloC^Ce, C(=0)-NR2R3, C(=NR2)-NR2R3, 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 36/39
    C(=0)0-alquiloCrC6, e halogeno(F, Cl, Br, l)alquiloC,-C6; R2 e R3 são seleccionados independentemente de entre R1, hidrogénio, alquiloC.,-C6, piperidinilo, e halogeno(F, Cl, Br, I)alquiloC1-C6; R2 e R3, conjuntamente com o N ao qual estão ligados, podem formar um heterociclo de 5 ou 6 membros, contendo opcionalmente um heteroátomo adicional seleccionado de entre O, S e N, e onde qualquer N está opcionalmente substituído com R1, qualquer carbono está opcionalmente substituído com R6 e onde o heterociclo está opcionalmente fundido com um anel fenilo, opcionalmente substituído com R4; R4 e R5 são seleccionados independentemente de entre o grupo compreendendo hidrogénio, halogéneo(F, Cl, Br e I), ciano, amino, amido, nitro, hidroxi, alquiloC^Ce opcionalmente substituído com 1-3 R6, alciniloC2-C6 opcionalmente substituído com 1-3 R6,
    85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 37/39 alquiloxiCrC6 opcionalmente substituído com 1-3 R6, acilaminoCi-Cg opcionalmente substituído com 1-3 R6, alquilcarboniloC^Cg opcionalmente substituído com 1-3 R6, alquiloxicarboniloCrC6 opcionalmente substituído com 1-3 R6, N-(alquilCrC6),N-(acilCrC6)amino opcionalmente substituído com 1-3 R6 N-(alquilCrC6)carboxamido opcionalmente substituído com 1-3 R6, N,N-di(alquilC0-C6)amino opcionalmente substituído com 1-3 R6, N,N-di(alquilCrC6)carboxamido opcionalmente substituído com 1-3 R6, perfluoroalquilo^-C^ e perfluoroalcoxiCrC3; R6 é seleccionado de entre o grupo compreendendo COOR2, CONR2R3, ciano, NR2R3, NR2COR3, azido, nitro, e hidroxi; X é seleccionado de entre o grupo compreendendo hidrogénio, COOR2, ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ
    38/39 alquilC0-C6-NR2R3, alquilCo-Cg-O-alquiloC^Ce opcionalmente substituído com 1-2 R6, alquiloC^Ce opcionalmente substituído com 1-2 R6; e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
  13. 14. Composto de acordo com a reivindicação 13 seleccionado de entre o grupo compreendendo
    e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis.
  14. 15. Composição farmacêutica compreendendo um excipiente farmaceuticamente aceitável e o composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
  15. 16. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 para utilização num método de tratamento médico. 85 455 ΕΡ Ο 792 289/ΡΤ 39/39
  16. 17. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 na preparação de um medicamento para aumentar o nível de hormona de crescimento endógena num mamífero.
  17. 18. Utilização de acordo com a reivindicação 17 compreendendo adicionalmente a administração do composto em combinação com um factor de crescimento seleccionado de entre o grupo compreendendo hormona de crescimento (GH), hormona de libertação da hormona de crescimento (GHRH), factor de crescimento 1 do tipo insulina (IGF-1) e factor de crescimento 2 do tipo insulina (IGF-2).
  18. 19. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 na preparação de um medicamento para o tratamento da diabetes do Tipo II num mamífero. 12. OUI 2000 Lisboa, Por GENENTECH, INC.
    EN6.° ÂNTÓMIO JOÂG BA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Etse des Flores, 74 - 4.® 1BOQ LISBOA
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