PT773794E

PT773794E - Novos derivados de rodamina para terapia fotodinamica do cancro e purificacao in vitro de leucemias

Info

Publication number: PT773794E
Application number: PT95928907T
Authority: PT
Inventors: Louis Gaboury; Richard Giasson; Li Tiechao; Ajay Kumar Gupta; Luc Villeneuve
Original assignee: Univ Montreal
Priority date: 1994-09-02
Filing date: 1995-08-16
Publication date: 2001-12-28
Also published as: AU688100B2; CA2197435A1; JP4222628B2; KR970705413A; DE69521430D1; US5773460A; GR3036636T3; ATE202286T1; BR9508779A; ES2160173T3; JPH10505349A; AU3248895A; US5556992A; EP0773794A1; CA2197435C; WO1996007431A1; DK0773794T3; DE69521430T2; EP0773794B1

Description

DESCRIÇAΟ "NOVOS DERIVADOS DE RODAMINA PARA TERAPIA FOTODINÂMICA DO CANCRO E PURIFICA ÇÃO IN VITRO DE LEUCEMIAS"

Fundamento da invenção (a) Âmbito da invenção A invenção diz respeito ao uso de derivados de rodamina fotoactiváveis, para a manufactura de um medicamento para um tratamento fotodinâmico, para a destruição selectiva de células leucémicas malignas, sem afectar as células normais e sem provocar toxicidade sistémica para o paciente. (b) Descrição do estado da técnica

Os cancros correspondem a proliferações celulares incontroladas, que resultam da acumulação de alterações genéticas nas células dotadas de potencial proliferativo. Após um período de latência variável, durante o qual permanecem clinicamente silenciosas, as células malignas progridem para estados invasivos agressivos e metásticos, com a formação de tumor, hemorragia, susceptibilidade a infecções e vasta disseminação pelo corpo.

Apesar de importantes avanços no tratamento, o cancro ainda é a causa de 28% das mortes nos países ocidentais. O tratamento do cancro baseou-se principalmente na cirurgia, quimioterapia, radioterapia e mais recentemente imunoterapia. Em consequência, um avanço importante deu-se com o uso de modalidades combinadas, para um restrito números de cancros. Contudo, para os tipos de cancro mais frequentes (pulmão, mama, colo-rectal e leucemias), a remissão completa e a cura não foram alcançadas. Por conseguinte, o desenvolvimento de novas abordagens para o tratamento de pacientes com cancro é urgentemente necessário, particularmente para aqueles pacientes, cuja doença progrediu até um estado metástico e são que insubmissos à quimioterapia usual. Para ultrapassar esta resistência, tem sido empregue o transplante 2

de células mãe autólogo (TCMAu) no tratamento de algumas formas avançadas de cancro. Uma vez que a quimioterapia de dose elevada, com ou sem irradiação total do corpo, pode ser aplicada antes do TCMAu, tem-se observado velocidades de resposta maiores, quando comparada com a quimioterapia vulgar. Um aspecto importante que tem de ser salientado quando se utiliza TCMAu está relacionado com o risco de reinfusão de células tumorais residuais, apesar da sua remissão histológica. Tem sido desenvolvida uma variedade de técnicas, que podem retirar até 105 de células tumorais da medula. Estas técnicas, a purificação imunológica e farmacológica, não são totalmente satisfatórias. Um aspecto principal a considerar, quando se purificam medulas ósseas, corresponde ao facto de preservar o comportamento normal das células mãe hemopoiéticas, de modo a que a hemopoiése normal possa ser rapidamente restabelecida após enxertia. O potencial da terapia fotodinâmica, em associação com moléculas fotossensibilizadoras, capazes de destruir células malignas, enquanto poupam as células mãe hemopoiéticas normais, para purificar a medula óssea na preparação para o TCMAu, tem sido amplamente inexplorado. Estes assunto tem sido profundamente investigado para um tipo de neoplasma, leucemia mielóide crónica (LMC), já que o TCMAu tem o potencial de curar a doença, estando actualmente disponíveis técnicas de biologia molecular altamente sensíveis para determinar a eficácia do processo de purificação. A aplicação da terapia fotodinâmica para o tratamento de outras formas de leucemia, linfomas e tumores sólidos metásticos constitui uma possibilidade distinta, do ponto de vista das propriedades funcionas das moléculas corantes, que foram sintetizadas de acordo com a presente invenção e cuja descrição surge mais abaixo. A leucemia mielóide crónica (LMC) compreende 15% das leucemias. Corresponde a um distúrbio clonal pluripotente de células mãe hemopoiéticas, caracterizado por uma proliferação desregulada de progenitores de medula óssea e de células mielóides com diferenciação terminal circulantes. Caso não seja tratada, esta doença é invariavelmente fatal. A análise genética em células de LMC permitiu identificar uma anormalidade altamente característica, que consiste numa translocação equilibrada envolvendo o cromossoma 9 e 22, em que parte do protooncogene c-abl do cromossoma 9 está justaposta ao terminal 5' do gene bcr-1 no cromossoma 22, levando à formação de um gene de fusão, a uma transcrição quimérica c a uma proteína P210 bcr/abl, com actividade de tirosina cinase. Células de LMC possuindo a translocação são conhecidas por células Ph-1+, enquanto as células dc medula não clonais, presumivelmente normais, mas suprimidas são conhecidas por células Ph-1 negativas (Ph-1-). O tratamento de um paciente com LMC tem como objectivo erradicar as células Ph-1+ e restabelecer a hemopoiése Ph-1- não clonal. A terapia mielossupressiva convencional, com hidroxiurea, busulfano, e mais recentemente com interferão-alfa (IFN-alfa) e hemo-harringtonina (HTT) falharam em proporcionar remissões clínicas e citogenéticas prolongadas ou completas (revisto em Goldman J.M. (1994) Blood Reviews, 8:21-29). Até ao presente, apenas o transplante de medula óssea alogénico (TMOA) em pacientes jovens (<55 anos) com antigénio de leucócitos humanos de doadores de medula irmãos compatíveis (ALH-compatíveis) demonstrou ser curativo em mais de 50% de pacientes de baixo risco. No entanto, apenas uma minoria de pacientes (20%) é eleita para o transplante de medula óssea alogénico, devido à falta de doadores correspondentes apropriados ou porque os pacientes são considerados demasiado idosos para resistir ao processo. Consequentemente, têm de ser desenvolvidas estratégias alternativas para o tratamento da LMC. Uma linha de investigação promissora, que tem produzido resultados excitantes, consiste em restaurar a hemopoiése Ph- por enxerto da medula do próprio paciente ou de células mãe sangue periférico, que foram colhidas na fase crónica, antes da quimioterapia intensiva e irradiação corporal total. Este processo, conhecido como transplante de células mãe autólogo (TCMAu), envolve nenhumas ou algumas manipulações da medula ex vivo, para eliminar células leucémicas Ph+ malignas residuais. Para conseguir a erradicação do clone Ph-1+, foram propostas várias abordagens, incluindo: 1) exposição in vitro do enxerto a 4-per-hidroxiciclofosfamida (4-HC) ou a um derivado mais estável Mafosfamida™ (Asta-Z 7557); 2) selecção in vitro por crescimento em culturas de longo prazo; 3) selecção positiva de células mãe não clonais CD34+DR-; e 4) terapia in vitro com combinações de agentes antileucémicos ou com interferão-alfa, seguida de transplante.

Contudo, a relevância clínica destes métodos permanece por estabelecer.

Existem muitos relatos sobre o uso da terapia fotodinâmica no tratamento de malignidades (Daniell M.D., Hill J.S. (1991) Aust. N. Z. J. Surg., 61: 340-348). O método tem sido aplicado para o cancro de várias origens e mais recentemente para a erradicarão Ue víius e agentes patogónicos (Raab O. (1900) Infusoria Z. Biol., 39' 524).

As experiências iniciais sobre o uso da terapia fotodinâmica para o tratamento de cancro, utilizando diversas substâncias fotoactiváveis que ocorrem naturalmente ou são produzidas sinteticamente, foram publicadas no inicio deste século (Jesionek A., Tappeincr V.H. (1903) Muench Med Wochneshr, 47: 2042; Hausman W. (1911) Biochem. Z., 30: 276). Nos anos 40 e 60, uma variedade de tipos de tumores foi sujeita a terapia fotodinâmica irt vitro e in vivo (Kessel, David (1990) Photodynamic Therapy of neoplastic disease, Vol. I, II, CRC Press. David Kessel, Ed. ISBN 0-8493-5816-7 (v. 1), ISBN 0-8493-5817-5 (v. 2)). Nos anos 70 e 80, Dougherty et al., e outros exploraram sistematicamente o potencial da aplicação oncológica da terapia fotodinâmica (Dougherty T. J. (1974) J. Natl Câncer Inst., 51: 1333-1336; Dougherty T. J. et al, (1975), J. Natl Câncer Inst., 55: 115-121; Dougherty T. J. et al., (1978) Câncer Res., 38: 2628-2635; Dougherty T. J. (1984) Urol. Suppl, 23: 61; Dougherty T. J. (1987) Photochem. Photobiol., 45: 874-889).

Tratamento da leucemia com terapia fotodinâmica

Presentemente existe uma falta de agentes anti-neoplásticos, que permitam uma destruição selectiva de células leucémicas expandidas, deixando intacta, mas suprimida a população celular residual normal. A assimilação preferencial de corantes fotossensíveis e a citotoxicidade da terapia fotodinâmica contra células leucémicas foi anteriormente demonstrada (Jamieson C. H. et al., (1990) Leuk. Res., 14: 209-219).

Seria bastante desejável estar munido de novos fotossensibilizadores, que possuam as seguintes características: i) localização preferencial e assimilação por parte das células malignas; ii) após aplicação de intensidades de luz apropriadas, matem as células que tenham acumulado e retido os agentes fotossensibilizadores; iii) poupem o compartimento de células mãe hemopoiéticas normais dos efeitos destrutivos dos fotossensibilizadores activados; e iv) potencial utilização de fotossensibilizadores para a purificação da medula óssea de medula colhida na preparação para o transplante de medula óssea autólogo.

Os corantes de rodamina A rodamina 123 (hidrocloreto do éster de metilo do ácido 2-(6-amino-3-imino-3H-xanten-9-il)benzóico, é um corante catiónico lipofílico da classe pirílio, que pode destruir a homeostase celular e ser citostático ou citotóxico após exposição a concentrações elevadas e/ou a terapia fotodinâmica, embora com um rendimento quântico bastante fraco (Darzynkiewicz Z., Cárter S. (1988) Câncer Res., 48: 1295-1299). Foi utilizado in vitro, como um corante fluorescente específico para mitocôndrias vivas. É assimilado e é preferencialmente retido por muitos tipos de células tumorais, prejudicando a sua proliferação e sobrevivência, por alteração da membrana e das funções mitocondriais (Oseroff A. R. (1992) em Photodynamic therapy (Henderson B. W., Dougherty T. J., eds) Nova Iorque: Mareei Dekker, pp. 79-91). In vivo, a quimioterapia com rodamina 123 pode prolongar a sobrevivência de ratos cancerosos, mas apesar das tentativas iniciais em utilizar rodamina 123 no tratamento de tumores, a sua toxicidade sistémica pode limitar a sua utilidade (Bemal, S.D., et al. (1983) Science, 222:169; Powers, S.K. et al., (1987) J. Neurosur., 67: 889). A patente dos Estados Unidos N.° 4 612 007 publicada a 16 de Setembro, 1986 em nome de Richard L. Edelson, divulga um método para o tratamento externo do sangue humano, com o objectivo de reduzir a população de linfócitos funcional no sistema sanguíneo de um indivíduo humano. O sangue retirado do sujeito é passado através de um campo de radiação ultravioleta, na presença de um agente fotoactivo dissolvido, capaz de formar fotoaductos com DNA linfocítico. Este método apresenta as seguintes desvantagens e deficiências. O processo descrito baseia-se na utilização de agentes químicos fotoactivos conhecidos e comercialmente disponíveis, para tratar ( extcmamente o sangue do paciente, deixando intactos no processo, a medula óssea e potenciais clones leucémicos residentes. De acordo com Richard L. Edelson, o método apenas reduz, não erradica, a população celular alvo. Para além disso, a gama de comprimentos de onda da radiação UV utilizada no processo proposto por Richard L. Edelson, poderia ser prejudicial às células normais. O pedido de patente internacional publicado a 7 de Janeiro, 1993, sob o número de publicação internacional WO 93/00005, divulga um método para inactivar agentes patogénieos num fluido corporal, enquanto minimiza os efeitos adversos causados pelos agentes fotossensíveis. Este método consiste, essencialmente, no tratamento das células na presença de um agente fotoactivo, sob condições que provoquem a destruição do agente patogénico, e em prevenir as células tratadas de contactar com proteína extracelular adicional durante um período de tempo pré-determinado. Este método está relacionado com a erradicação de agentes infecciosos do sangue recolhido e dos seus componentes, antes do armazenamento ou transfusão, e não impede a presente invenção.

Seria muito desejável estar munido de uma nova abordagem para o uso de derivados de rodamina no tratamento de tumores, que ultrapasse estas desvantagens e que não apresente toxicidade sistémica para o paciente.

Resumo da invenção

Uma vez que, o transplante de células mãe autólogo (TCMAu) oferece uma potencial estratégia curativa, caso as células hematopoiéticas normais consigam ser separadas das células mãe neoplásticas, quer in vitro ou in vivo, foi investigada a possibilidade de utilizar corantes fotossensibilizadores com elevadas eficiências quânticas de actividade fototóxica, em combinação com a terapia fotodinâmica (TFD), para conseguir uma erradicação selectiva de células leucémicas Ph-1+. Em flagrante contraste com relatos isolados, descrevendo a purificação da medula baseada na TFD, utilizando a fotoinactivação da merocianina sensibilizada, as moléculas da presente invenção foram projectadas para tirar vantagem da exclusão conhecida da rodamina 123 e seus derivados (observações pessoais) de células mãe hemopoiéticas normais, que coram 7 !

\ pouco com a rodamina 123, mantendo, no entanto, uma extensa auto-renovação in vitro. Além disso, um vez que a purificação da medula óssea baseada na TFD não exclui a utilização de outros meios de efectuar a selecção positiva e/ou negativa de medulas, ela pode ser usada em conjunto com outros regimes terapêuticos.

Um objectivo da presente invenção c a preparação de novos fotossensibilizadores dotados das seguintes características: i) localização preferencial e assimilação pelas células malignas; ii) após aplicação de intensidades de luz apropriadas, mate as células que tenham acumulado e retido os agentes fotossensibilizadores; iii) poupem o compartimento de células mãe hemopoiéticas normais dos efeitos destrutivos dos fotossensibilizadores activados; e iv) potencial utilização dos fotossensibilizadores para a purificação de medula óssea de medula recolhida na preparação para o transplante de medula óssea autólogo.

Assim, o método da presente invenção, utilizando a terapia fotodinâmica, foi estruturado de modo a erradicar as células clonogénicas malignas da medula óssea de LMC.

Outro objectivo da presente invenção consiste em, utilizando derivados de rodamina, fornecer um método novo para o tratamento de tumores, que ultrapasse os problemas de toxicidade sistémica, enquanto a terapia fotodinâmica é utilizada in vitro para a eliminação de clones cancerosos da medula óssea de pacientes com leucemia mielóide crónica (LMC).

De acordo com a presente invenção, foi ensaiada a fototoxicidade do éster de n-butilo de rodamina B (hidrocloreto do éster de n-butilo do ácido 2-(6-etilamino-3-etilimino-3H-xanten-9-il)benzóico), éster de n-butilo de 4,5-dibromorrodamina 110 (hidrocloreto do éster de n-butilo do ácido 2-(4,5-dibromo-6-amino-3-imino-3H-xanten-9-iljbenzóico) e éster de n-butilo da 4,5-dibromorrodamina 110 (hidrocloreto do éster de 8 metilo do ácido 2-(4,5-dibromo-6-amino-3-imino-3H-xanten-9-il)benzóico) e outros ésteres (etilo, octilo).

Em conformidade com a presente invenção, são fornecidos derivados de rodamina fotoactiváveis, para aumentar a produção de um rendimento quântico elevado e a formação de oxigénio Singleto após irradiação, enquanto mantêm α retenção diferencial pretendida da rodamina entre células normais e cancerosas, sendo os referidos derivados seleccionados do grupo que consiste em 4,5-dibromorrodamina 123 (hidrocloreto do éster de metilo do ácido 2-(4,5-dibromo-6-amino-3-imino-3H-xanten-9-il)-benzóico); 4,5-dibromorrodamina 123 (hidrocloreto do éster de etilo do ácido 2-(4,5-dibromo-6-amino-3-imino-3H-xanten-9-il)-benzóico); 4,5-dibromorrodamina 123 (hidrocloreto do éster de octilo do ácido 2-(4,5-dibromo-6-amino-3-imino-3H-xanten-9-il)-benzóico); éster de n-butilo de 4,5-dibromorrodamina 110 (hidrocloreto do éster de n-butilo do ácido 2-(4,5-dibromo-6-amino-3-imino-3H-xanten-9-il)-benzóico); éster de n-butilo da rodamina B (hidrocloreto do éster de n-butilo do ácido 2-(6-etilamino-3-etihmino-3H-xanten-9-il)-benzóico); em que a fotoactivação dos referidos derivados induz a morte celular, enquanto derivados inactivos são essencialmente não tóxicos para as células.

De acordo com a presente invenção, a inibição completa do crescimento das linhas de células tumorais é conseguida in vitro, após a terapia fotodinâmica realizada com os fotossensibilizadores acima mencionados. Este efeito contrasta com a falta de efeito inibitório após exposição quer à luz por si só ou a uma concentração saturante de fotossensibilizadores.

Devido à retenção específica da classe de corantes da rodamina 123 pelas células malignas anormais e a concomitante falta da sua acumulação pelas células mãe hematopoiéticas normais, estes resultados fornecem evidência para o potencial uso destes três novos corantes para a terapia fotodinâmica in vivo ou in vitro.

Breve descrição das figuras A Fig. 1 é um gráfico da fototoxicidade da 4,5-dibromorrodamina 123 usada de acordo com o método da presente invenção e expressa em % de viabilidade;

As Figs. 2A, 2B e 2C mostram três gráficos da fototoxicidade do éster de n-butilo da 4,5-dibromorrodamina 110 usado de acordo com o método da presente invenção e expressa em % de viabilidade; e

As Figs. 3A e 3B mostram dois gráficos da fototoxicidade do éster de n-butilo da rodamina B usado de acordo com o método da presente invenção e expressa em % de viabilidade.

Descrição detalhada da invenção

Os corantes fotoactivos são excitados do estado fundamental para o estado excitado singleto após a absorção de fotões. Os estados excitados singletos das moléculas orgânicas possuem, em geral, tempos de vida curtos (10"12-10"^ seg.), na medida em que relaxam rapidamente para o estado fundamental, através de processos não-radiativos (modos vibracionais) e radiativos (fluorescência). A passagem intersistema para o estado excitado tripleto mais estável, compete igualmente com o relaxamento para o estado fundamental. Os estados excitados tripleto possuem, geralmente, tempos de vida mais longos (10-6-10 seg.), o que lhes permite difundir e reagir com outras moléculas existentes no meio. A reactividade entre o oxigénio molecular e um fotossensibilizador excitado para o estado tripleto, ambos presentes nas células malignas, constitui o principio operacional da maioria das terapias fotodinâmicas. Estados excitados tripleto podem reagir com o oxigénio molecular por via de dois mecanismos diferentes. O primeiro mecanismo (Tipo I), consiste na transferência de um electrão dos corantes excitados para o oxigénio molecular, resultando na presença de radicais livres altamente reactivos no meio celular. O segundo mecanismo (Tipo II), consiste na transferência de energia dos corantes excitados para o oxigénio molecular, conduzindo à formação de oxigénio singleto citotóxico.

Por conseguinte, os fotossensibilizadores têm de reunir duas condições, para que sejam um agente fototerapêutico eficaz. A primeira condição corresponde ao facto de terem de

estar presentes nas células malignas numa concentração bastante mais elevada do que nas células normais. Uma concentração mais elevada de corantes nas células malignas resulta numa concentração mais elevada de espécies citotóxicas fotogeradas e, consequentemente, numa maior taxa de morte. A segunda condição corresponde ao facto de a irradiação do agente fototerapêutico, na presença de concentrações intracelulares de oxigénio molecular, ter de conduzir à formação de espécies citotóxicas de elevada eficiência.

Sabe-se que a rodamina 123 é assimilada e preferencialmente retida por muitas células tumorais e, consequentemente, a sua aplicação como um agente fototerapêutico tem sido proposta. Contudo, o estado excitado singleto da rodamina 123 não sofre uma passagem intersistema para o estado excitado tripleto eficiente. Devido a este facto, a rodamina 123 é uma fototoxina fraca (Morliere, P et al., (1990) Photochemistry and Photobiology, 52(4): 703-710).

Para ultrapassar as limitações dos métodos do estado da técnica, a estrutura química da rodamina 123 pode ser modificada, de modo a aumentar a passagem intersistema para o estado excitado tripleto. Teoricamente, isto pode ser alcançado substituindo os átomos de hidrogénio por átomos pesados, tais como Br ou outros haletos, na estrutura molecular da rodamina 123. Assim, foi preparada e testada a dibromorrodamina 123. A estrutura antipática e a hidrofilicidade dos corantes pode modular as membranas citoplasmática e mitocondrial e afectar a fototoxicidade do corante. Por exemplo, a hidrofobicidade mostrou ser o factor mais importante a influenciar a assimilação in vitro de porfirinas (Chi-Wei Lin (1990) em Photodynamic therapy of neoplastic disease, Vol II, CRC Press, pp 79-101). Deste modo, foram preparados e testados diferentes ésteres de rodamina 123 e rodamina B. Mais especificamente, éster de n-butilo da dibromorrodamina (EBDB) e éster de n-butilo da rodamina B (EBRB).

Diferentes substituições de átomos de hidrogénio da estrutura principal da rodamina por átomos pesados (substituição halogénica), por exemplo, derivados dibromo e di-iodo da rodamina B e R 110, estão a ser preparados e testados. 11 Dímeros/oligómeros, hetero dímeros oligómeros de tais compostos também serão preparados e testados.

Substituições do heteroátomo de oxigénio da cadeia principal da rodamina por um átomo pesado, para reduzir a divisão So/Si, teoricamente deveriam aumentar o acoplamento dc "spin"-orbital c promover α passagem intersistema do estado Si para o estado T|, produzindo maiores rendimentos tripleto que o corante original. Isto deve aumentar proporcionalmente à produção de oxigénio singleto. Assim, substituições do átomo de oxigénio (O) da cadeia principal da rodamina por S (enxofre), Se (selénio) e Te (telúrio) estão a ser exploradas. Para além disso, são testadas outras estratégias para aumentar os rendimentos quânticos elevados de produtos do tipo I (radicais livres) ou tipo II (anião superóxido ou oxigénio singleto) e a acumulação tumoral selectiva do corante.

De acordo com a presente invenção, é proporcionado o uso dos corantes anteriormente mencionados, em conjugação com anticorpos específicos para tumores, ou substâncias venenosas, ou proteínas lipossomais ou lipoproteínas, ou aductos fluorocromos.

Adicionalmente, os fotossensibilizadores a serem descritos possuem o potencial para agir sinergicamente em combinação com outras substâncias fotoactivas.

Para além disso, o processo de selecção negativa proporcionado pelo uso de tratamentos fotodinâmicos não exclui a utilização de outros meios para enriquecer células mãe hematopoiéticas, tal como a selecção positiva com anticorpos monoclonais anti-CD34.

Outras aplicações clínicas

Para além da utilização de fotossensibilizadores no contexto da purificação in vitro da medula óssea para leucemias e cancros metásticos, as moléculas podem igualmente ser utilizadas in vivo para locais do tumor directamente acessíveis à exposição a uma fonte de luz e a concentrações locais apropriadas de drogas a serem descritas. 12 12

Síntese química

Todas as cromatografias do tipo "flash" foram efectuadas de acordo com o método de Still et al. (Still W. C. et al., (1978) J. Org. Chem., 43: 2923). A cromatografia em camada fina foi realizada em gel de sílica 60™ (HF-245, E. Merck) com uma espessura de 0,20 mm. Os espectros de ressonância magnética nuclear foram obtidos com um aparelho da Varian VXR 300™ (300MHz). Os dados espectrais são apresentados na seguinte ordem: desvio químico (ppm), multiplicidade, constantes de acoplamento, número do protão, atribuição. Espectros de massa de baixa resolução, usando bombardeamento atómico rápido (FAB), foram obtidos num espectrómetro Kratos MS-50 TA™. Espectros de ultravioleta foram obtidos num espectrofotómetro Varian DMS100™ e os dados são apresentados como λ/^.

1. Preparação do éster de n-butilo da rodamina B

Cloridrato de rodamina B (150 mg, 0,31 mmol) foi dissolvido em 1-butanol (5 ml). A mistura de reacção foi saturada com HC1 (gás) e, em seguida, agitada a 100°C durante 15 h. O 1-butanol foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo oleoso bruto foi purificado por cromatografia do tipo "flash", usando CH2C12 (200 ml) e depois CH2C12/CH30H (85:15) como eluente, dando origem a 142 mg (0,27 mmol, rendimento de 87%) de um sólido vermelho escuro. *H RMN (Varian 300MHz, acetona, TMS) d 8,31 (dd, J=l,4 e 7,8Hz, 1H); 7,86-7,94 (M, 2HO); 7,54 (dd, J=l,5 e 7,4Hz, 1H); 7,14-7,23 (M, 4H); 7,02 (d, J=2,2Hz, 2H); 3,97 (t, J=6,3HZ, 2H); 3,79 (q, J=7,lHz, 8H); 1,32 (t, J=7,lHz, 12H); 1,2-1,4 (M, 2H); 1,01 (h, J=7,5Hz, 2H); 0,75 (h, J=7,3Hz, 3H). UV (metanol)/max: 545 nm / 2. Preparação do éster de n-butilo da dibromorrodamina

2.1 Preparação do éster de n-butilo da rodamina A rodamina 110 (14 mg, 0,038 mmol) foi dissolvida em 1-butanol (5 ml). A mistura de reacção foi saturada com HC1 (gás) e depois agitada a 100°C durante 15 h. O 1-butanol foi evaporado sob pressão reduzida. O resíduo oleoso bruto foi purificado por cromatografia do tipo "flash", usando CH2CI2/CH3OH (85:15) como eluente, dando origem a 14 mg (0,033 mmol, rendimento de 87%) de um sólido vermelho. 2.2 Preparação do éster de n-butilo da dibromorrodamina O éster de n-butilo da rodamina (14 mg, 0,033 mmol) foi dissolvido em etanol absoluto (3 ml), depois foi adicionado bromo (0,0036 ml, 0,070 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1 h. O solvente foi evaporado e o resíduo da reacção bruto foi purificado por cromatografia do tipo "flash", usando CH2CI2/CH3OH (85:15) como eluente, originando 15,9 mg (0,027 Mol, rendimento de 83%) de um sólido vermelho. 'H RMN (Varian 300MHz, CD3OD) 14

d 8,31 (dd, J=l,7 e 7,5Hz, 1H); 7,84 (M, 2H); 7,46 (dd, J=l,8 e 6,9Hz, 1H); 7,12 (d, J=9,2IIz, 2H); 7,03 (d, J-9,2HZ, 2H); 3,95 (t, J=6,2Hz, 2H); 1,22 (M, 2H); 0,93 (M, 2H); 0,75 (t, J=7,3Hz, 3H). MS (LR, FAB) m/z: calculado para C24, H2iN203Br2; 543 Observado: 543 3. Preparação da dibromorrodamina 123

Br Rr

A uma solução de rodamina 123 (25 mg, 0,066 mmol) em etanol seco (1 ml), foi adicionado bromo (0,01 ml, 0,19 mmol) e a mistura resultante agitada à temperatura ambiente durante 0,5 h. A evaporação do solvente no vácuo forneceu o composto bruto, o qual foi purificado por cromatografia do tipo "flash", usando CH2CI2/CH3OH (85:15) como eluente, dando origem a 27,0 mg (0,050 Mol, rendimento de 77%) de um sólido vermelho. *H RMN (Varian 300MHz, CD3OD) d 8,34 (dd, J=l,7 e 7,5Hz, 1H); 7,85 (M, 2H); 7,46 (dd, J=l,7 e 7,2Hz, 1H); 7,10 (d, J-9,2Hz, 2H); 7,01 (d, J=9,2Hz, 2H); 3,64 (s, 3H); 8,3 (d, 1H, J=9,lHz, aromático), 7,9 (m, 2H, aromático), 7,45 (d, 1H, 9,1Hz, aromático), 7,0, 7,2 (sistema AB, 4H, aromático), 3,64 (s, 3H, OCH3). MS (LR/ FAB) m/z: Calculado para C24, H2iN203Br2; 501 Observado: 501 UV (metanol)/,™»: 510 nm

Propriedades físicas e fotoquímicas

Após a síntese, α pureza da preparação dos corantes foi testada por análise de RIVfN e mostrou ser superior a 95%. Os espectros de absorção e emissão foram determinados para cada um dos corantes.

Avaliação da viabilidade celular A linha celular de leucemia mielóide crónica K562 (Lozzio, B.B. e Lozzio, C.B. (1979) Câncer Res., 3(6): 363-370) foi obtida da American Type Culture Collection (ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 USA) sob o número de acesso F-10601 R243-CCL. As culturas foram mantidas a 37°C num incubador humidificado com uma atmosfera de 95% de ar e 5% de CO2. Os meios de cultura (IMDM (Iscove Modified Dulbeco Media) suplementados com 10% de soro bovino fetal) foram mudados quinzenalmente e as células ressuspensas para uma concentração de 100,000/ml. As células mostraram ser micoplasma negativas, por meio de um teste de rotina com um intervalo de 4 semanas.

Antes de cada ensaio, a viabilidade das células foi avaliada e 2 x 106 células viáveis foram distribuídas em cada tubo de ensaio de 15 ml. As células foram depois incubadas durante lha 37°C, centrifugadas e o pellet celular ressuspenso no meio de cultura na presença ou ausência do corante. Em seguida, as células foram incubadas durante um tempo apropriado, geralmente 40 minutos, a 37°C, depois lavadas duas vezes com PBS (Phosphate Buffer Saline (tampão fosfato salino)) e ressuspensas no meio de cultura. A terapia fotodinâmica foi então aplicada à cultura de células, imediatamente ou ao após um período de incubação a 37°C. As culturas celulares foram mantidas a 4°C durante a aplicação da activação fotodinâmica.

Fototoxicidade da 4,5-dibromorrodamina 123

Para determinar o potencial fotoquimioterapêutico e a fototoxicidade in vitro da 4,5-dibromorrodamina 123 (DBR), foi aplicado 0 ensaio da linha celular leucémica K-562 (como descrito acima). A exposição a uma radiação de 514,5 nm, proveniente de um laser de ião de árgon a 10 J/cm2 induziu fototoxicidade nas células K-562 tratadas com DBR com uma concentração final de 10 pg/ml. A DBR mostrou ser significativamente mais fototóxica do que a rodamina 123; crê-se que a actividade aumentada seja uma consequência da passagem intersistema várias vezes aumentada da DRR para o tripleto, via acoplamento de "spin"-orbital induzido pelos átomos pesados. Como representado na Fig.l, a dibromorrodamina é extremamente fototóxica a doses tão pequenas quanto 1 J/cm2 e a viabilidade das células decresce para menos de 5% em menos de 24 horas após a irradiação.

Fototoxlcidade do éster de n-butilo da 4,5-dibromorrodamina 110

Para determinar o potencial fotoquimioterapêutico do éster de n-butilo da 4,5-dibromorrodamina 110 (EBDB), a fototoxicidade in vitro foi avaliada pelo processo da linha celular K-562 descrito. As células foram incubadas com concentrações crescentes de EBDB e a viabilidade celular foi medida a diferentes tempos, após a terapia fotodinâmica. Os resultados apresentados nas Figs. 2A, 2B e 2C mostram que uma dose de 10 pg/ml do corante e uma breve exposição a 0,5 J/cm2, suprime completamente a viabilidade celular em menos de 24 horas após a irradiação.

Fototoxicidade do éster de n-butilo da rodamina B A fototoxicidade in vitro do éster de n-butilo da rodamina B (EBRB) foi avaliada segundo o processo da linha celular K-562, para estabelecer o seu potencial fotoquimioterapêutico. Foi feita a comparação com a fototoxicidade induzida pela rodamina 123 (123R) e o éster de butilo da rodamina B. A viabilidade celular foi avaliada 2 e 20 horas após a terapia fotodinâmica. Os resultados apresentados nas Figs. 3A e 3B demonstram que uma dose de 10 pg/ml do corante e uma exposição à luz de 5 J/cm2, suprimem significativamente a viabilidade celular das células K562 em menos de 20 horas após irradiação. A rodamina 123 não tem qualquer efeito sobre a viabilidade celular, mesmo a exposições de 10 J/cm2.

Fototoxicidade contra culturas de medula óssea

Observa-se que o tratamento por luz, por si só, a níveis de energia até 10 J/cm2, ou a pré-incubação de células a concentrações saturantes de corantes não afectou nem o estabelecimento da cultura de longo prazo, nem a formação, em ensaios semi-sólidos, de colónias celulares resultantes da multiplicação e diferenciação dos progenitores 17 ί; implicados, presentes na medula óssea (unidades formadoras de colónias-eritrócitos (UFC-E), unidades formadoras de blaslos-eritrócitos (UFB-E), unidades formadoras de colónias-granulócitos, macrófagos, (UFC-G-M)). Contudo, como descrito para a rodamina 123, o estabelecimento de culturas de longo prazo (CLP) é mais sensível aos corantes, mas o número de percursores implicados viáveis e de células mãe permanece não afectado. A terapia fotodinâmiea com rodamina 123, éster de n-butilo da rodamina B e éster de n-butilo da 4,5-dibromorrodamina comprometeu minimamente o estabelecimento de culturas de longo prazo de medula óssea de ratos normais e a formação de colónias hematopoiéticas em ensaios semi-sólidos. Este facto está de acordo com os resultados obtidos anteriormente noutros laboratórios usando rodamina 123.

Abordagens convencionais para o tratamento de cancro, tais como a radioterapia e a quimioterapia intensiva estão limitadas pela sua toxicidade intrínseca e pelos efeitos mielossupressivos. A introdução do transplante de medula óssea alogénico e autólogo permitiu a administração de quimioterapia ablativa da medula e de radioterapia a pacientes cujas malignidades não podem ser curadas por medidas menos agressivas. No entanto, o transplante de medula óssea alogénico não é amplamente acessível aos pacientes, devido à falta de dadores adequados e ao despoltar da doença enxerto-versus-hospedeiro nos receptores. Para ultrapassar estas limitações e elevar o número de pacientes e o limite de idade para a terapia curativa intensiva, o potencial beneficio da purificação in vitro da medula óssea e o transplante de medula óssea autólogo têm-se tomado vastamente reconhecidos.

Numa tentativa de desenvolver novas drogas anti-neoplásticas, que permitam uma destruição selectiva de células leucémicas malignas, foram preparadas e testadas novas moléculas corantes como possíveis novos fotossensibilizadores, úteis para a terapia fotodinâmiea de leucemias e cancros metásticos. Foram preparados três novos fotossensibilizadores da família do pirííio e é fornecida evidência para o seu potencial uso no tratamento fotodinâmico do cancro e de leucemias. 18

A presente invenção será melhor compreendida através da referência aos seguintes exemplos, que são apresentados para ilustrar a invenção e não limitar o seu âmbito.

EXEMPLO I Método para o tratamento de leucemias 1. ProcusMis de diagnóstico O diagnóstico da leucemia mielóide crónica (LMC) será estabelecido usando um ou mais do:·, seguintes procedimentos em sangue ou em células da medula óssea: a) estudos citogenéticos convencionais com a identificação das metafases Ph 1+ contendo o t(9:22); b) hibridaçâo fluorescente in situ para a detecção do rearranjo bcr/abl; e c) análise por "Southern blot" para a detecção de um fragmento ber rearranjado ou PCR-RT para a detecção de RNA mensageiro de ber/abl quimérico. 2. Colheita da medula óssea

Após diagnóstico, a medula óssea (MO) ou as células mãe hemopoiéticas derivadas do sangue periférico (SP) serão recolhidas usando os processos descritos anterionnente para o transplante de medula autólogo na terapia do cancro (revisto por Herzig GP, (1981) Prog. Hematol., 12:1). As células mãe hemopoiéticas recolhidas para o autoenxerto serão imediatamente tratadas ex vivo como descrito abaixo. 3. Purificação in vitro de leucemia O tratamento ex vivo consistirá numa incubação de curto prazo de MO ou de células mãe do SP com um ou vários dos compostos fotoactivos seleccionados. A duração da incubação, concentração celular e a molaridade da droga será determinada para cada paciente, usando uma alíquota da população de células recolhida. O excesso de corantes será removido por lavagem das células com meio esterilizado isento de corante, suplementado com 2% de soro autólogo. As células serão em seguida expostas a uma energia radiante de intensidades suficientes para efectuar a eliminação fotodinâmica de células leucémicas. A eficácia do processo de eliminação fotodinâmica será verificada numa alíquota da população de células tratada, antes de se efectuar a criopreservação e/ou a re-infusão no paciente. Até re-infusão no paciente, as células serão criopreservadas em 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) - 90% de meio de soro aulúlugu, a -196°C na fase vapor ou cm azoto líquido. 4. Tratamento sistémico de pacientes

Após a colheita de células mãe, o paciente será, ou tratado por meio de regimes convencionais ate o autoenxerto ser clinicamente indicado ou será imediatamente submetido a quimioterapia de dose intensiva e a irradiação total do corpo quando indicado. 5. Transplante de células mãe autólogo

Após o tratamento do paciente adequado, por quimioterapia de dose elevada e irradiação e no momento clínico certo, a medula ou as células mãe do sangue periférico criopreservadas serão rapidamente descongeladas e diluídas num meio contendo 25 UI de DNase ml'1, para minimizar a aglutinação. Um mínimo 2 x 101 2 3 4 5 6/kg de células nucleadas com 85% a 95% de viabilidade, como medido por exclusão de Trypan™ blue, será devolvido ao paciente.

EXEMPLO II Método para o tratamento de malignidades 1. Processos de diagnóstico O diagnóstico de malignidades será estabelecido usando o exame histológico convencional de tumores primários. A detecção do envolvimento da medula por células neoplásticas será conseguido por exame histológico directo e processos auxiliares, quando indicado (por exemplo, imuno-peroxidase, imuno-histoquímica, marcadores de tumores e estudos de hibridação). 1

Colheita da medula óssea 2

Após o diagnóstico, a medula óssea (MO) ou células hemopoiéticas derivadas do 3 sangue periférico (SP) serão recolhidas, usando os processos descritos anteriormente 4 para o transplante de medula autólogo na terapia do cancro (revisto por Herzig GP, 5 (1981) Prog. Hematol., 12:1). As células mãe hemopoiéticas colhidas para o 6 autoenxerto serão imediatamente tratadas ex vivo como descrito abaixo. 3. Purificação in vitro da leucemia O tratamento cx vivo consistirá na incubação da MO ou de células mãe do SP por nm curto período de tempo, com um ou vários dos compostos fotoactivos seleccionados. A duração da incubação, concentração celular e molaridade da droga será determinada para cada paciente usando uma alíquota da população celular recolhida. O excesso de corantes será removido por lavagem das células com meio estéril isento de corante, suplementado com 2% de soro autólogo. Em seguida, as células serão expostas a uma energia radiante de intensidades suficientes para efectuar a purificação fotodinâmica de células leucémicas. Sempre que um marcador molecular sensível esteja disponível, uma alíquota da população de células tratada será testada para a detecção de células ncoplásticas residuais, antes de ser tentada a criopreservação e/ou reinfusão no paciente. As células serão criopreservadas em 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO) — 90% de meio de soro autólogo, a 196°C na fase vapor ou em azoto líquido. 4. Tratamento sistémico de pacientes

Após a colheita de células mãe, o paciente será, ou tratado com regimes convencionais, até que o autoenxerto seja clinicamente indicado, ou imediatamente submetido a quimioterapia de dose intensiva e irradiação total do corpo, quando indicado. 5. Transplante de células mãe autólogo

Após a quimioterapia de dose elevada e irradiação, a medula ou as células mãe do sangue periférico criopreservadas serão rapidamente descongeladas e diluídas num meio contendo 25 UI de DNase/ΜΓ1, para minimizar a aglutinação. Um mínimo de 2 x 107/kg de células nucleadas com 85% a 95% de viabilidade, como medido por exclusão de Trypan™ blue, será devolvido ao paciente.

Enquanto a invenção foi descrita em conexão com formas de realização específicas, será entendido que ela é capaz de sofrer mais modificações e que esta aplicação destina-se a abranger quaisquer variações, usos ou adaptações da invenção, seguindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo tais desvios da presente descrição como conhecidos ou dentro do âmbito da prática usual do estado da técnica, ao qual pertence a invenção e como podendo ser aplicados às características essenciais anteriormente descritas na presente c, como se segue, dentro do âmbito das reivindicações em anexo.

Lisboa,

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Claims

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REIVINDICAÇÕES 1. Derivados de rodamina fotoactiváveis, para aumentar a produção de um rendimento quântico elevado e geração de oxigénio singleto após irradiação, mantendo a retenção diferencial da rodamina desejada entre células normais e células cancerosas, sendo os referidos derivados seleccianados do grupo consistindo de 4,5-dibromorrodamina 123 (hidrocloreto do éster de metilo do ácido 2-(4,5-dibromo-6-amino-3-imino-3H-xanten-9-il)-benzóico); 4,5-dibromorrodamina 123 (hidrocloreto do éster de etilo do ácido 2-(4,5-dibromo-6-amino-3-imino-3H-xanten-9-il)-benzóico); 4,5-dibromorrodamina 123 (hidrocloreto do éster de octilo do ácido 2-(4,5-dibromo-6-amino-3-imino-3H-xanten-9-il)-benzóico); éster de n-butilo da 4,5-dibromorrodamina 110 (hidrocloreto do éster de n-butilo do ácido 2-(4,5-diboromo-6-amino-3-imino-3H-xanten-9-il)-benzóico); éster de n-butilo da rodamina B (hidrocloreto do éster de n-butilo do ácido 2-(6-etil-amino-3-etil-imino-3H-xanten-9-il)-benzóico); em que a fotoactivação dos referidos derivados induz a morte celular, enquanto derivados inactivados são essencialmente não tóxicos para as células.
2. Uso de um derivado fotoactivável de acordo com a reivindicação 1, para a manufactura de um medicamento para a terapia fotodinâmica de um paciente com cancro, através da destruição das células cancerosas humanas, em que níveis intracelulares apropriados do referidos derivados são conseguidos e é aplicada uma irradiação de um comprimento de onda e intensidade adequados.
3. Uso de um derivado fotoactivável de acordo com a reivindicação 1, para a manufactura de um medicamento para a terapia fotodinâmica de um paciente sofrendo de leucemias, mielomas múltiplos disseminados ou linfomas, que compreende os passos de: a) colheita da medula óssea humana do referido paciente; b) purificação da medula óssea do passo a) por terapia fotodinâmica, utilizando uma quantidade terapêutica de um derivado fotoactivável de acordo com a reivindicação 1, mediante irradiação com um comprimento de onda adequado; e 2

c) realização de um transplante de células mãe autólogo, usando a medula óssea purificada do passo b).
4. Uso da reivindicação 3, em que a referida purificação do passo b), compreende ainda os processos de quimioterapia intensiva e irradiação total do corpo (ITC).
5. Uso de um derivado fotoactivável de acordo com a reivindicação 1, para a manufactura de um medicamento para purificação in vitro da medula óssea humana, contendo metástases de tumores sólidos, seleccionadas do grupo consistindo de metástase mamária, pulmonar, prostática, pancreática e carcinomas do cólon, melanomas disseminados e sarcomas, em que a excisão cirúrgica ou redução de volume pode ser alcançada, compreendendo os passos de: a) colheita da medula óssea humana do referido paciente; b) purificação da medula óssea do passo a) por terapia fotodinâmica usando uma quantidade terapêutica de um derivado fotoactivável de acordo com a reivindicação 1, mediante irradiação com um comprimento de onda adequado; e c) realização de um transplante de células mãe autólgo, usando a medula óssea purificada do passo b).
6. Uso da reivindicação 5, em que a referida purificação do passo b) compreende ainda os processos de quimioterapia intensiva e irradiação total do corpo (ITC).
7. Uso de um derivado fotoactivável de acordo com a reivindicação 1, para a manufactura de um medicamento para a terapia fotodinâmica de um paciente com cancro, que compreende a administração a um paciente de um nível intracelular aceitável em termos terapêuticos do referido derivado fotoactivável e sujeição do referido paciente a irradiação de um comprimento de onda adequado em termos terapêuticos.
8. Uso da reivindicação 7, em que o referido derivado fotoactivável é administrado por instilação, injecção, difusão na corrente sanguínea nos locais do tumor directamente 3 3 Λ * acessíveis à emissão de luz ou a locais do tumor acessíveis a raios laser, usando endoscópios rígidos ou flexíveis.
9. Uso da reivindicação 8, em que o referido local do tumor acessível ao laser é seleccionado do grupo constituído pela bexiga urinária, cavidade oral, esófago, estômago, tracto digestivo inferior, tracto respiratório superior e inferior.
10 Uso de derivados fotoactiváveis de acordo com a reivindicação 1, para a manufactura de um medicamento para o tratamento de leucemias num paciente, o qual compreende os seguintes passos: a) purificação de clones cancerosos a partir da medula óssea do referido paciente; b) sujeição dos referidos clones purificados do passo a) a tratamento fotodinâmico, usando uma quantidade terapêutica dos referidos derivados fotoactiváveis, mediante irradiação com um comprimento de onda adequado para destruição selectiva das células leucémicas, sem afectar as células normais do paciente; c) administração dos referidos clones tratados do passo b) ao paciente; não causando, com isso, toxicidade sistémica para o paciente. Lisboa, 'Ao Dra. Maria Silvlna Fcrreira AgsnteOfcL ' .·, -rial R. Ldòi.i.íJ, “ . . _ . CU -OuOA Telefs.23ÔõU53 - 21 õôl 50 50