PT758342E - Nova substancia activa peptidica e sua preparacao - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "NOVA SUBSTÂNCIA ACTIVA PEPTÍDICA E SUA PREPARAÇÃO" A presente invenção refere-se a uma nova substância activa peptídica, bem como à sua preparação e a produtos de partida apropriados para a sua preparação.

No pedido PCT WO 93/23424 são descritas substâncias activas à base de peptídeos, possuidoras de actividades antineoplásticas interessantes. Produz um efeito especialmente bom o pentapeptídeo do exemplo 234 do pedido mencionado, com a seguinte fórmula:

NH

Me2Val significa Ν,Ν-dimetil-L-valina, MeVal representa N-metil-L-valina. Bzl representa o resíduo benzilo. O peptídeo pode ser preparado, segundo o pedido PCT mencionado, através de um processo de fase sólida, a partir de prolina. Nesta operação obtém--se a substância activa com um fraco rendimento e sob forma impura. É necessária uma dispendiosa purificação por cromatografia. Além disso o processo da fase sólida só é apropriado para a preparação de pequenas quantidades de substância. Até agora nunca se conseguiu preparar a substância do exemplo 234 da WO 93/23424 sob forma cristalina. A substância activa encontra-se sob a forma de resina. Desta forma é difícil a separação completa dos resíduos de solvente. São necessárias fases de purificação caras (secagem por pulverização, liofilização). O processamento galénico da substância é dificultado. Para se testar e aplicar a substância são necessárias grandes quantidades da substância. Para a sua preparação é necessário um processo realizável por meios técnicos que produza a substância activa sob forma cristalina. 2 f: t:'

Foi agora descoberto um processo que produz a substância activa isenta de racemização e com elevado grau de pureza, de forma que a substância pode ser transformada sem dificuldades num sal cristalina, o cloridrato. O objecto da presente invenção é um processo para a preparação de Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl.HCI, que consiste em, a partir de um composto da fórmula Z-Val-Val-MeVal-Pro-OR1 II, em que R1 significa um grupo alquilo-Gi-s e Z representa um grupo de protecção benziloxicarbonilo que pode ser substituído no anel fenilo, A a) se separar no terminal N o grupo de protecção Z e, no composto obtido

1) se metilar duplamente o grupo amina livre no terminal N 2) se hidrolisar o grupo alcoxi -OR1 no terminal C e b) se acoplar o composto obtido da fórmula

Me2Val-Val-MeVal-Pro-OH V com prolinabenzilamida XII ou B a) se remover no terminal C o grupo alcoxi -OR1 e b) e se acoplar o composto obtido da fórmula

Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH IX

com prolinabenzilamida XII e, o composto obtido da fórmula Z-Val-Va-MeVal-Pro-Pro-NHBzl XI 1) se libertar do grupo de protecção Z no terminal N e

2) se metilar duplamente no grupo amina livre no terminal N e se transformar o composto obtido no seu cloridrato. O processo A decorre segundo o esquema de reacção seguinte: 3

Z-Val-Val-MeVal-Pro-OR1 I II Val-Val-Meval-Pro-OR1 1 IH ▼ Me2Val-Val-MeVal-Pro-OR1 1 IV ▼ Me2Val-Val-MeVal-Pro-OH V ▼

Me2Val-Val-MeVal-Pro-0®M® VI

Me2Val-Val-MeVal-Pro-OCOR2 VII

Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl x HCI I

Os substituintes possuem, tanto no esquema de fórmulas anterior com em toda a descrição os seguintes significados: R1: alquilo-Ci-5 como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, terc-butilo. isobutilo, pentilo e preferencialmente metilo e etilo, R2: terc-butilo, 2-etil-hexilo, alcoxi-C-M como metoxi, etoxi, isobutoxi, Z: benziloxicarbonilo substituído no anel fenilo everitualmente por halogénio, alquilo-Ci-4, alcoxi-CM, aciloxi-C^, ou nitro ou especialmente por 2-CI, 3-CI, 4-CI, 4-Br, 4-CH30-, 4-CH3COO-, 2-NOz e 4-N02, Μ®: K®, Na®, Li® ou um ião de amónio como ®NH(C2Hs)3

Bzl: benziio

Me: metilo. O éster tetrapeptídico II é dissolvido num solvente adequado, p. ex., num álcool, como metanol, etanol, isopropanol, butanol; um éter como THF, dioxano, MTBE; um éster como acetato de etilo ou ácido acético glacial. Após adição de um catalisador adequado, como p. ex. Pd/C ou Pt/C, introduz-se hidrogénio a (9 4

temperaturas entré os 0 e 50 °C, de preferência entre 10 e 30 °C. A introdução de hidrogénio pode ser realizada sob pressão normal ou pressão elevada até 10 bar. A reacção pode ser acelerada quando se deixa passar uma determinada corrente de gases de escape. Uma vez terminada a admissão de hidrogénio adicionam-se 2 a 5 equivalentes de formaldeído sob a forma de uma solução aquosa ou sob a forma de gás ou sob a forma de paraformaldeído. Em seguida introduz-se ainda hidrogénio sob as condições acima mencionadas. Em seguida remove-se o catalisador por filtração. IV pode ser purificado através de cristalização como cloridrato a partir de um solvente ou mistura de solventes apropriados. Deu bons resultados a mistura de isopropanol/éter metil-terc-butílico. Os vestígios dos éster Z-tetrapeptídico II em IV podem ser removidos através de processo de separação extractivos. A saponificação do éster IV é realizada num solvente apropriado como p. ex. um álcool como metanol, etanoí, isopropanol; um éter como MTBE, THF, dioxano; um hidrocarboneto como tolueno, xileno ou um hidrocarboneto clorado como 1,2-dicloroetano, cloreto de metileno, clorofórmio, com ou sem adição de água e com uma base adequada como NaOH, KOH, LiOH. A separação do éster pode também ser realizada com ácidos. Para R1 = a butilo terciário são especialmente apropriados CF3CO2H e uma solução de HCI em dioxano..

Seguidamente 0 ácido tetrapeptídico V tem de ser acoplado com prolinabenzilamida XII ao pentapeptídeo I. No caso destas reacções de acoplagem deste género atinge-se facilmente a racemização. G. Pettit et al. (J. Am. Chem. Soc. H3, 6692-3 (1991)) utilizam, por isso, uma acoplagem análoga com 0 ácido tetrapeptídico, com 0 reagente de acoplagem DEPC [(OEt)2POCN], DEPC não se encontra disponível no comércio em grandes quantidades. O método requer, por isso, fases processuais adicionais com reagentes venenosos de fósforo e cianeto.

Os resíduo com cianeto levantam problemas de eliminação. Por isso, 0 processo não é apropriado para uma execução à escala industrial. Um método de acoplagem de peptídeos que é especialmente simples de realizar a uma escala técnica consiste no método de anidrido misto (cf. p. ex. J. Meienhofer em The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, volume 1, Academic Press, Orlando, 1979, P. 264-314). Neste processo 0 ácido V é submetido a eliminação do protão com uma base adequada, p. ex. uma amina terciária como trietilamina, N-metilmorfolina, diciclo-hexiletilamina, diisopropiletilamina, em VI. Os ésteres da fórmula IV podem também ser transformados com bases como NaOH, KOH, LiOH, directamente nos sais VI. Os compostos VI são transformados com um cloreto de ácido CICOR2 no anidrido misto da fórmula VII. A par de cloreto de pivaloílo podem-se também utilizar outros cloreto de ácido como p. ex. cloreto de ácido 2-etil-hexanóico, cloroformiato de etilo, cloroformiato de metilo e cloroformiato de isobutilo. Os anidrido misto tendem a racemizar com bastante intensidade (cf. p. ex. J. Meienhofer em The Peptides, volume 1, Academic Press, Orlando, 1979, p. 276 ss.)

Surpreendentemente, o ácido tetrapeptídico V pode agora ser feito reagir segundo o método do anidrido misto completamente isento de racemização. Obtiveram-se resultados éspecialmente bons com o anidrido misto preparado a partir de V e de cloreto de pivaloílo. Ao contrário dos resultados publicados mais recentemente (N.L. Benoiton et al., Can. J. Chem. 65, 619-625 (1987)) a reacção com cloreto de pivaloílo produz, no que se refere a selectividade e rendimento, melhores resultados do que a reacção com ésteres de ácido clorofórmico. A preparação do anidrido misto VII e a subsequente acoplagem com prolinabenzilamida é realizada a temperaturas entre -20 a +5 °C, num solvente adequado como dioxano, NMP, THF, tolueno, cloreto de metileno, dimetilformamida. Em vez da prolinabenzilamida XII pode-se também utilizar um sal adequado deste composto como p. ex. o sulfato de hidrogénio, o sulfonato de metilo, o cloridrato ou o bromidrato. Neste caso é necessária adicionar mais uma base equivalente, p. ex. trietilamina. Após uma acoplagem do peptídeo com sucesso e um processamento extractivo corrente dissolve-se o produto em bruto num solvente adequado, por exemplo um hidrocarboneto como tolueno, xileno ou um éter como éter dietílico, THF, dioxano, éter metil-terc-butílico; uma cetona como acetona, metiletilcetona, dietilcetona, ciclo-hexanona; ou um solvente clorado como cloreto de metileno, clorofórmio, 1,2-dicloroetano. Através da introdução de HCI gasoso ou dosagem de uma solução de HCI num solvente adequado, como p. ex. THF, metanol, isopropanol, n-pentanol, éter diisopropílico, precipita o cloridrato I. Revelou-se especialmente eficaz um processo em que se dissolve primeiro a base livre do pentapeptídeo em metiletilcetona e depois se adiciona uma solução de HCI em isopropanol. 6

0 processo Β desenvolve-se conforme o seguinte esquema:

II

IX

Z-Val-Val-MeVal-Pro-OR

Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH

Z-Val-Val-MeVal-Pro-0-CO-R2+XII i

X

XI Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl

Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl x HCI A saponificação do éster II, a preparação dos anidridos mistos X e a acoplagem, dos peptídeos a XI são realizados de forma análoga à sequência de síntese IV->V->VI->VII->I. A separação do grupo de protecção Z e dimetilação em I são realizados de forma análoga à reacção ll->lll->IV.

Também na variante processual B o método do anidrido misto decorre surpreendentemente sem racemização. Ao contrário dos resultados publicados por Benoiton, obtiveram-se os melhores rendimentos com o anidrido misto preparado a partir do ácido IX e cloreto de pivaloílo. O material de partida II necessário para a preparação do peptídeo I pode ser preparado a partir de Z-Val-O-CO-R2 (XIII) e Val-MeVal-Pro-OR1 (XIV). O novo processo produz a substância activa I sob forma cristalina. O peptídeo pode ainda ser mais purificado de forma simples através de recristalização. Não são necessárias dispendiosas fases de purificação por cromatografia. A presente invenção refere-se também aos seguintes produtos preliminares para a preparação de I:

II

III

Z-Val-Val-MeVal-Pro-OR

Val-Val-MeVal-Pro-OR 7

VII

IX

X

XI

Me2Val-Val-MeVal-Pro-0-CO-R2

Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH Z-Val-Val-MeVal-Pro-O-CO-R2 Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl em que R1 e Z possuem os significados atribuídos na reivindicação 3 e R2 representa butilo terciário, 2-etil-hexilo, alcoxi-Ci-4, metoxi, etoxi e isobutoxi. O composto I é eficaz contra tumores fixos (tumores dos pulmões, da mama, do intestino, da bexiga, do recto, do útero, da próstata), contra leucemias, linfomas e outras afecções neoplásicas.

Os exemplos que se seguem esclarecem a presente invenção.

Exemplo 1 (processo A): A. Preparação dos materiais de partida a. Z-Val-Val-MeVal-Pro-Ome (II, R1 = Me)

Numa caldeira de hidrogenação de 400 I colocaram-se 39,6 kg (83,3 mol) de Z-Val-MeVal-Pro-OMe (VIII) em 320 I de metanol, juntamente com 4 kg de paládio/carbono a 5 %. Em seguida introduz-se sob arrefecimento entre 20 e 30 °C hidrogénio até que já não seja possível detectar educto na solução de reacção. O catalisador foi removido por filtração à saída do conteúdo da caldeira. Para o processamento concentrou-se numa caldeira de esmalte de 400 I, sob vácuo com água pulverizada, até 50 I. Em seguida deixou-se escorrer 50 I de tolueno e extraiu-se com 40 I de HCI 2N. A fase de tolueno foi uma vez mais extraída com 40 I de ácido clorídrico 1 N e foi deixada repousar. As fases aquosas ácidas reunidas foram recolocadas na caldeira, foram cobertas com 40 I de cloreto de metileno e seguidamente ajustadas a pH 9 através de adição de lixívia de soda a 50 %, sob agitação vigorosa e arrefecimento. Após separação de fase, pôs-se de lado a fase de cloreto-de metileno e extraiu-se ainda mais duas vezes a fase aquosa com 40 I de cloreto de metileno de cada vez. A solução de cloreto de metileno do produto reunida foi lavada até à neutralidade com água. Em seguida 8

a fase de cloreto de metileno foi concentrada até 90 I. Obteve-se Val-MeVal-Pro--OMe (XIV, R1=-CH3).

Rendimento de 24,2 kg = 85,2 %.

Numa caldeira de 400 I são dissolvidos 17,84 kg (70,88 mol) de Z-valina e 4,59 kg (74,42 mol) de trietilamina em 170 I de cloreto de metileno. A esta solução junta-se, entre - e -10 °C, 8,58 kg (70,88 mol) de cloreto de ácido piválico. Após um tempo de reacção de 2 h a -5 C deixa-se escorrer a -5 C uma solução de 24,2 kg de Val-MeVal-Pro-OMe em 86 I de cloreto de metileno. Passadas mais 2 h a -5 C aqueceu-se a 20 °C e agitou-se a esta temperatura durante 12 h. Para o processamento foram adicionados 50 I de água. Após separação da fase aquosa extraiu-se a fase orgânica uma vez com 40 I de ácido clorídrico 2 N e por duas vezes com 40 I de lixívia de soda 2 N de cada vez. Após lavagem da fase orgânica com água até à neutralidade removeu-se o solvente cloreto de metileno por destilação e substituiu-se por 300 I de éter diisopropílico. A emulsão do óleo do produto foi aquecida a 60 °C para cristalização, foi tratada com cristais de inoculo e mantida durante 7 h a 60 °C. Para se completar a cristalização continuou-se a agitar sucessivamente durante 5 h a 50 °C e durante 5 h a 40 °C e depois arrefeceu-se a 20 °C. A suspensão cristalina foi filtrada sobre um filtro de pressão de 120 I e seca sob corrente de azoto.

Rendimento: 32,2 kg = 79 %

Ponto de fusão: 134 - 135 °C b. Cloridrato de prolinabenzilamida (XII x HCI) A uma solução de 99,7 g de Z-prolina e 58 ml de trietilamina em 1 I de CH2CI2 adicionou-se gota a gota, entre -10 e -15 °C, 48,2 g de cloreto de pivaloílo. Agitou-se durante 45 min a -10 °C e adicionou-se seguidamente, no espaço de 0,5 h, a -10 °C, 42,8 g de benzilamina em 500 ml de CH2CI2. Agitou-se durante 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, a solução de CH2CI2 foi lavada por duas vezes com 500 ml de água, por duas vezes com 500 ml de solução de NaHC03 aquosa a 10 %, por duas vezes com 500 ml de água, por duas vezes com 500 ml de solução de ácido cítrico aquosa a 5 % e por duas vezes com 500 ml de água, foi seca sobre Na2S04 e concentrada por evaporação. Restaram 120 g de resíduo que foi tomado em 200 ml de acetato de etilo. Adicionou-se à solução de acetato de etilo 1,2 1 de n-heptano, agitou-se durante uma hora, aspirou-se e secou-se a 50 °C sob vácuo.

Rendimento: 110 g, 81,3 %

P.f.: 93 a 94 °C 110 g da Z-prolinabenzilamida obtida desta forma foram dissolvidos em 1,5 I de metanol. Após adição de 0,5 g Pd/C (a 10 %) introduziu-se hidrogénio. A solução absorveu à temperatura ambiente, no espaço de 1,5 h, 0,5 I de H2. Após a remoção por filtração do catalisador e concentração por evaporação restaram 4,6 g de um óleo amarelo. 413 g da prolinabenzilamida obtida desta forma foram dissolvidos em 400 ml de isopropanol. Adicionou-se 630 ml de uma solução saturada de HCI em isopropanol, agitou-se a suspensão resultante durante 2 h entre 0 e 5 °C, aspirou--se e lavou-se por duas vezes com 250 ml de isopropanol. O resíduo foi seco a 50 °C sob vácuo. Obteve-se 401 g de cloridrato de prolinabenzilamida; ctD20:-45°. B. Preparação do produto final a.1

Me2Val-Val-MeVal-Pro-Ome x HCI (IV x HCI, R1 = Me)

Numa caldeira de hidrogenação de 400 I colocou-se 20 kg (34,8 mol) de Z-Val-Val-MeVal-Pro-OMe (II, R1=Me) juntamente com 2 kg de paládio/carbono a 5 % em 200 I de metanol. Em seguida, sob arrefecimento a 20 °C, introduziu-se hidrogénio até já não se poder detectar mais educto na solução de reacção. Em seguida acrescentou-se 8,46 kg de solução de formaldeído aquosa a 37 % (104 mol) e submeteu-se a hidrogenação até terminar a absorção de hidrogénio , a 20 °C. O catalisador foi removido por filtração à saída do conteúdo da caldeira. Para processamento foi concentrado numa caldeira de esmalte de 400 I, sob vácuo com água pulverizada, até atingir 50 I. Em seguida adicionaram-se 200 I de isopropanol e concentrou-se novamente até aos 50 I. Em seguida dissolveu-se em 135 1 de éter metil-terc-butílico e introduziu-se sob arrefecimento a 20 °C um equivalente de HCI isopropanólico. A suspensão resultante foi ainda agitada 10

0 durante 3 a 4 h a 20 °C e durante 2 h entre 0 e 5 °C e depois foi filtrada num filtro de pressão de 120 I. O bolo do filtro foi lavado uma vez com 50 I de éter metil--terc-butílico fresco.

Rendimento: 16,2 kg = 92,3 %

Ponto de fusão: 224 °C (Decomposição) a.2

Foi também possível isolar a fase intermédia Val-Val-MeVal-Pro-OMe (III, R1=CH3) quando, depois da primeira fase de hidrogenação, se procedeu da seguinte forma: A solução de reacção foi separada do catalisador e concentrada. O resíduo foi tomado em acetato de etilo. A solução de acetato de etilo foi extraída por duas vezes com ácido clorídrico 2 N. O pH da fase aquosa ácido foi ajustado com lixívia de soda a pH 9 e extraída por duas vezes com cloreto de metileno. A fase de cloreto de metileno foi em seguida lavada até à neutralidade e concentrada por evaporação. HPLC 96,8 % 1H-NMR (400 MHz, CDCI3 / TMSint.): δ (ppm) : 0, 84 - 1,08 (m, 18H); 1,45 - 1,6 (s, largo, NH2);1,85 - 2,15 (m, 4H); 2,1.8 - 2,38 (m, 3H); 3,15 (s, N-ÇH3); 3,25 (d, 1H); 3,65 -3,75 (m, 1H); 3,73 (s, O-ÇH3); 3,9 - 4,05 (m, 1H); 4,38 - 4,45 (m, 1H); 4,73 - 4,83 (m, 1H); 5,12 (d, 1H); 7,9 (d, NH) a.3 A preparação de Me2Val-Val-MeVal-Pro-C)ME x HCI (IV x HCI, R1=Me) pode também ser realizada segundo as seguintes instruções de preparação, nas quais se prescinde de um isolamento e purificação da fase intermédia Z-Val-Val--MeVal-Pro-OMe (II, R1=Me):

Num balão de 4 I dissolveram-se 128 g (0,51 mol) de Z-valina e 55,1 g (0,54 mol) de trietilamina em 1,2 I de cloreto de metileno. A esta solução doseou--se entre, -5 °C e -10 °C, 62,1 g (0,51 mol) de cloreto de ácido piválico. Após um 11

tempo de reacção de 2 h a -5 °C deixou-se escorrer uma solução de 174,6 g (0,51 mol) de Val-MeVal-Pro-OMe em 0,8 I de cloreto de metileno, agitou-se durante mais 2 h a -5 °C e depois de aquecimento a 20 °C agitou-se durante mais 12 h. Em seguida misturou-se a mistura reaccional com 370 ml de água. Após a separação de fases lavou-se a fase de cloreto de metileno uma vez com 290 ml de ácido clorídrico 2 N, por duas vezes com 290 ml de lixívia de soda 2 N de cada vez e por três vezes com 370 ml de água. Em seguida removeu-se o solvente cloreto de metileno por evaporação e substituiu-se por 3 I de metanol. A esta solução adicionou-se uma suspensão de 30 g de paládio/carbono a 5 % em 110 ml de água e hidrogenou-se a 25 °C através de um agitador de mistura de gases e bureta de hidrogénio até se recolher um equivalente de hidrogénio. Depois adicionou-se 123 g (1,53 mol) de solução de formaldeído aquosa a 37 % e hidrogenou-se até se recolher mais 2 equivalentes de hidrogénio. Em seguida separou-se do catalisador e concentrou-se por evaporação num evaporador rotativo. O óleo restante foi dissolvido em 670 ml de isopropanol e 2,6 I de éter metil-terc-butílico. A esta solução adicionou-se um equivalente de HCI isopropanólico. Continuou-se a agitar a suspensão obtida a 20 °C ao longo de 12 h e depois aspirou-se. O bolo do filtro foi lavado com pouco éter metil-terc-butílico e subsequentemente foi seco num estufa de vácuo a 40 °C.

Rendimento: 182,8 g = 71 %

Ponto de fusão: 224 °C (Decomposição) b. Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl x HCI (I)

Numa caldeira de 400 I colocaram-se 15,9 kg (31,5 mol) de Me2Val-Val--MeVal-Pro-OMe x HCI (IV x HCI, R1 = -CH3) juntamente com 140 I de tolueno e 15 I de metanol. Adicionaram-se 3,15 kg (76,38 mol) de hidróxido de sódio granulado. Após saponificação completa, i.e., passadas 3 h a 20 °C neutralizou-se através da adição de HCI isopropanólico. Em seguida destilou-se em com separação azeotrópica com tolueno a 100 mbar até se encontrar livre de álcool e de água. O solvente removido por destilação foi sucessivamente substituído por tolueno. Em seguida adicionaram-se 80 I de cloreto de metileno e 6,44 kg (63,0 mol) de trietilamina (conteúdo: 99 %), arrefeceu-se a -5 °C e mediram-se a esta temperatura 3,84 kg (31,5 mol) de cloreto de ácido piválico. Após um tempo de reacção de duas horas adicionou-se entre -5 °C e 0 °C 7,6 kg (31,5 mol) de Pro--NHBzl x HCI proporcionalmente. Após repouso de 2 h a -5 °C aqueceu-se a 20 12 β

Ê Λ

ΐ:.ί (?S $ °C e deixou-se reagir durante mais 6 h. Em seguida removeu-se por destilação a 500 mbar o cloreto de metileno adicionado e acrescentou-se 80 I de tolueno. Em seguida adicionou-se 50 I de água e ajustou-se o valor de pH da fase aquosa a pH 9. Após agitação vigorosa separou-se a. fase aquosa e lavou-se a fase orgânica uma vez com 25 I de água. Em seguida a fase orgânica foi extraída por duas vezes com 50 I de ácido clorídrico 2 N. O produto foi extraído de volta, a partir da fase ácida, após ajuste do pH a 9 através de extracção tripla com 50 I de cloreto de metileno de cada vez. Após lavagem neutra da fase de cloreto de metileno com água removeu-se o cloreto de metileno por destilação e substituiu--se por 180 I de metiletilcetona. A solução foi aquecida a 40 °C e foi misturada com um equivalente (31,5 mol) de HCI isopropanólico. A suspensão formada foi aquecida a 60 °C e depois foi agitada durante mais 12 h sem mais aplicação de calor. Em seguida arrefeceu-se a 20 °C e agitou-se durante mais 5 h. Em seguida arrefeceu-se a 5 °C e filtrou-se através de um filtro de pressão de 120 I. O bolo do filtro foi lavado com 60 I de metiletilcetona fresca, a 5 °C. Após pré-secagem sobre o filtro, o produto foi seco em estufa de vácuo, a 40 °C até atingir um peso constante.

Rendimento: 14,36 kg = 67 %

Ponto de fusão: 214 °C (Decomposição)

Exemplo 2 (processo BI : a. Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH (IX)

Num balão de 2 I são dissolvidos 117 g (0,2 mol) de Z-Val-Val-MeVal-Pro--OMe (II, R1 = Me, exemplo 1Aa) em 900 ml de metanol e 47,5 ml de água. Em seguida acrescentam-se 18 g (0,45 mol) hidróxido de sódio granulado e agita-se durante 12 h a 20 °C. Para o processamento adicionou-se 250 ml de água e removeu-se o metanol por destilação. Em seguida adicionou-se acetato de etilo até se obter uma nítida separação de fases (cerca de 500 ml). A fase de acetato de etilo foi separada. A fase aquosa foi acidificada com ácido clorídrico a pH 1 e foi extraída por duas vezes com 500 ml de cloreto de metileno. A fase orgânica foi em seguida evaporada até à secura.

Rendimento: 105 g = 96,4 % 13

1H-NMR (200 MHz, CDCI3 / TMSint.): δ (ppm): O', 6 -1,2 (m, 18H); 1,7 - 2,45 (m, 7H); 3,2 (s, N-CH2): 3,55 - 3,95 (m, 2H); 4,05 - 4,2 (m, 1H); 4,35 - 4,5 (m, 1H); 4,68 - 4,85 (m, 1H); 4,98 - 5,2 (m, 3H); 5,93 (d, Val-1 NH); 7,2 - 7,4 (m, 5H); 7,53 - 7,68 (Val-2NH); 9,6-10,2 (s, largo, COOH) b. Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl (XI) 5 g de Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH (8,75 mmol) (IX) foram dissolvidos em 50 ml de CH2CI2, adicionou-se 1,79 g (17,5 mmol) de trietilamina gota a gota, arrefeceu-se a 10 °C e adicionou-se gota a gota, a esta temperatura, 1,08 g (8,75 mmol) de cloreto de ácido piválico. Após agitação durante 2 h a 10 °C adicionou--se a esta temperatura uma solução de 2,11 g (8,75 mmol) de Pro-NHBzl x HCI em 10 ml de metanol gota a gota, depois agitou-se durante 2 h a 10 °C e durante a noite à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi lavada por 3 vezes com 50 ml de água de cada vez, uma vez com 50 ml de água a pH 9 e ainda 2 vezes com 50 ml de água de cada vez. A solução de cloreto de metileno foi concentrada em evaporador rotativo. Como resíduo restaram 5,3 g (81,4 %) de um produto cristalino branco (grau de pureza 88,7 %).

Ponto de fusão: 118 - 122 °C c. Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl x HCI (I) 12 g de Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl (XI) foram dissolvidos em 200 ml de metanol. Adicionou-se-lhe 2 g de paládio/carbono a 5 % (precipitado com 20 ml de água) e hidrogenou-se a 20 °C até terminar a absorção de hidrogénio. Em seguida adicionou-se 6,5 g de solução aquosa de formaldeído a 37 % e prosseguiu-se a hidrogenação até terminar a absorção de hidrogénio. Em seguida removeu-se 0 catalisador e concentrou-se a solução de reacção sob vácuo. O resíduo foi recolhido em tolueno, novamente concentrado, misturado mais uma vez com 200 ml de tolueno e filtrado. A solução de tolueno foi em seguida extraída 2x com 50 ml de ácido clorídrico 2 N. O pH da fase aquosa ácida foi ajustado a 9 com lixívia de soda e esta fase foi extraída por três vezes com 50 ml de cloreto de metileno. A fase de cloreto de metileno foi lavada com água e 14

concentrada. A base em bruto foi recolhida numa solução de 150 ml de metiletilcetona e 7,5 ml de isopropanol. Desta solução precipita-se através da adição de 4 g de HCI isopropanólico 25 % a 40 °C o produto salino. A suspensão foi agitada durante 3 h a 20 °C e uma hora entre 0 e 5 °C e depois foi aspirada.

Rendimento: 7,1 g

Conteúdo: 99,1 %(HPLC - percentagem por área)

Ponto de fusão: 214 °C (Decomposição)

Lisboa, 2 8 JAU 2000 O Agente Oficial da Propriedade Industrial

U

Américo da Silva Carvalho

Claims (5)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl HCI (I)

2. Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl HCI (I) sob forma cristalina.

3. Processo para a preparação de Me2Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl HCI, caracterizado por se partir de um composto da fórmula II Z-Val-Val-MeVal-Pro-OR1 em que R1 significa um grupo alquilo-Ci.5 e Z representa um grupo de protecção benziloxicarbonilo que pode ser substituído no anel fenilo, A a) se separar no terminal N o grupo de protecção Z e, no composto obtido 1) se metilar duplamente o grupo amina livre no terminal N 2) se hidrolisar o grupo alcoxi -OR1 no terminal C e b) se acoplar o composto obtido da fórmula Me2Val-Val-MeVal-Pro-OH V com prolinabenzilamida ou B a) se remover no terminal C o grupo alcoxi -OR1 e b) e se acoplar o composto obtido da fórmula Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH IX com prolinabenzilamida e, no composto obtido da fórmula Z-Val-Va-MeVal-Pro-Pro-NHBzl XI 1) se libertar do grupo de protecção Z no terminal N e 2) se metilar duplamente no grupo amina livre no terminal N e se transformar o composto obtido no seu cloridrato.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se transformar os ácidos carboxílicos tetrapeptídicos das fórmulas V ou IX por meio de acoplagem com prolinabenzilamida, primeiro em anidridos mistos com ácido piválico.

5. Produto prévio para a preparação do composto I de acordo com a reivindicação 1 das fórmulas Z-Val-Val-MeVal-Pro-OR1 II Val-Val-MeVal-Pro-OR1 III Me2Val-Val-MeVal-Pro-0-CO-R2 VII Z-Val-Val-MeVal-Pro-OH IX Z-Val-Val-MeVal-Pro-O-CO-R2 X Z-Val-Val-MeVal-Pro-Pro-NHBzl XI em que R1 e Z possuem os significados atribuídos na reivindicação 3 e R2 representa butilo terciário, 2-etil-hexilo, alcoxi-Ci.4, metoxi, etoxi, ou isobutoxi. Lisboa- 2 8 JAN. 2000 O Agente Oficial da Propriedade Industrial

,¾ §Hva Carvalho i.. :&? lie Prcpfieásáa Industrial R.Casii;ho, 2G1 - 3.° E -1 C?0 LISBOA Telefs. 3851339 - 3854613