PT567830E

PT567830E - Processo de modificacao de uma lipase

Info

Publication number: PT567830E
Application number: PT93105926T
Authority: PT
Inventors: Oliver Chmiel; Helmut Traitler
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 1992-04-25
Filing date: 1993-04-13
Publication date: 2000-06-30
Also published as: ATE190350T1; US5384256A; ES2144429T3; EP0567830A1; DE69327984D1; GR3033548T3; DK0567830T3; DE69327984T2; EP0567830B1; EP0567661A1

Description

//° se ? z$o p ^ ^ DESCRIÇÃO "PROCESSO DE MODIFICAÇÃO DE UMA LIPASE" A presente invenção relaciona-se com um processo de modificação de uma lipase bem como com as utilizações de uma lipase assim modificada em nutrição e em aromatização.

As lipases são enzimas que têm a propriedade de hidrolizar ou de esterificar as matérias gordas emulsionadas. Durante esse processo, os ácidos gordos são libertos a partir dos tri-, di- e monoglicéridos. Uma lipase possui uma especificidade própria consoante o seu tipo e a sua origem. Pode tratar-se de uma regioespecificidade, por exemplo no caso de uma lipase de Mucor miehei que provoca a clivagem selectivamente dos ácidos gordos nas posições 1 e 3 do glicérido ou de uma especificidade para o substrato, tratando-se por exemplo de uma lipase de Geotrichum candidum ou ainda de uma especificidade mista resultante das duas propriedades precedentes.

Procurámos alterar as propriedades naturais de lipases modificando-as quimicamente para lhes conferir uma melhor solubilidade nos solventes orgânicos, por exemplo segundo o EP-A-149520, com o objectivo de melhorar as suas actividades de hidrólise e de síntese nas reacções de transesterificação em meio orgânico.

Em J. Microb. Biotechnol., vol. 6, ns 2, 1991, está descrita uma lipase de origem fúngica com especificidade para o substrato, exibindo uma forte preferência em relação a triglicéridos e uma ausência de actividade em relação a ésteres metílicos dos ácidos caprllico, mirístico e esteárico. A lipase possui uma termostabilidade melhorada quando está imobilizada sobre um suporte de polissiloxano possuindo grupos epoxi. 1 \

Em Biocatalysis, vol. 3, ns 4, 1990, trata-se de tipos de especificidades variadas de diferentes lipases. O autor faz notar que foi descrito que certas lipases ligadas ao polietileno por ligação covalente têm uma solubilidade em meio aquoso e quando aplicável uma actividade acrescida em relação ao seu estado nativo. O autor faz notar igualmente que as lipases imobilizadas sobre um suporte inerte podem ser melhor reutilizadas do que no estado nativo. J. Am. Oil Chem. Soc., vol. 65, ns 6, 1988, relaciona-se com um estudo comparativo da actividade da lipase de M. miehei nos estados nativo e imobilizado e mostra que as lipases são altamente específicas em relação aos ésteres primários de triacilgliceróis e que sob a forma imobilizada, a sua especificidade em relação aos ésteres de ácidos gordos saturados em C14 e C16 é ligeiramente aumentada. 0 EP-A-0149520 relaciona-se com uma lipase modificada cuja actividade é conservada e que é solúvel nos solventes orgânicos quando é parcialmente substituída por um derivado de polialcileno glicol tendo um grupo terminal hidrófobo.

Deste modo, o estado da técnica reporta-se principalmente à imobilização das lipases e à modificação das suas propriedades físico-quimicas tais como a termostabilidade ou a solubilidade com o objectivo de as recuperar, mas não com a sua especificidade em relação ao substrato. O objectivo da invenção é modificar a lipase de modo a que permaneça solúvel em meio aquoso, e que o seu microambiente seja modificado de modo dirigido para alterar a sua especificidade em relação ao substrato e com outro objectivo que não a sua imobilização. 2 Γ- U, ^ A invenção relaciona-se assim com um processo de modificação de uma lipase com o objectivo de alterar a sua especificidade em relação aos substratos lipidicos, caracterizado por se criar uma polaridade induzida fazendo reagir a lipase com um oligómero ou um polímero de polaridade escolhida, para favorecer a libertação de ácidos gordos de grau de saturação pré-determinado sem modificar a sua especificidade em relação ao comprimento de cadeia dos ácidos gordos libertados.

No quadro da presente invenção, uma lipase preferida, ΜΑΡΙΟ® de Mucor javanicus, pertence à segunda categoria anteriormente referida e possui uma especificidade de subtrato para os ácidos gordos de cadeia média e longa.

Para modificar a lipase, faz-se reagir a lipase com um oligómero ou um polímero (na exposição subsequente, utilizar-se-á o termo polímero para designar tanto um oligómero como um polímero propriamente dito), quando aplicável activado, de preferência de massa molecular 500 até 106, cuja polaridade vai desde a ausência de polaridade até um valor de cerca de 1000 McReynolds. A escala de polaridade de McReynolds (McReynolds, W. 0., J. Chromatogr. Sei. 8, 685 (1970)) pode ser definida com base nos índices de retenção em cromtografia em fase gasosa de cinco solventes de diferentes polaridades medidas sobre um polímero utilizado como fase estacionária numa coluna de cromatografia em fase gasosa, o que fornece uma avaliação da polaridade do polímero testado por comparação com o esqualano (hidrocarboneto saturado em C30 obtido por hidrogenação do esqualeno) ao qual se atribui por definição o valor de polaridade 0.

Os polímeros utilizados podem ser de natureza química diversa, de origem sintética ou de preferência naturais. Pode citar-se por exemplo os dimetilpolissiloxanos e os polietilenoglicóis enxertados com grupos polares ou de 3 Γ preferência as pectinas, que têm a vantagem de possuir já grupos polares carboxilo na sua estrutura.

Como polímeros de origem natural, pode igualmente citar-se as proteínas, por exemplo a beta-caseína, a lactoglobulina, a albumina, a lactalbumina e os polipéptidos, por exemplo a poli-L-leucina, o ácido poli-L-glutâmico e a poli-L-lisina. As proteínas ou polipéptidos são utilizados sob a forma de solução aquosa contendo por exemplo 1 até 40 mg de proteína/polipéptido por mL.

No caso dos polímeros enxertados, pode realizar-se o enxerto que consiste em activar o polímero fazendo-o reagir com um agente acoplante monomérico contendo grupos bifuncionais polares, por exemplo no caso dos polissiloxanos com um glicidoxipropiltrimetoxissilano em presença de um composto iniciador de uma reacção radicalar, por exemplo o peróxido de dicumilo ou no caso de um polietilenoglicol, por exemplo com o cloreto do ácido cianídrico em presença de um solvente.

Em seguida faz-se reagir o polímero cuja polaridade foi assim modificada com a enzima em condições de pH fortemente básico no caso dos polissiloxanos ou polietilenoglicóis, ou a pH fracamente ácido no caso das pectinas, depois seca-se a enzima tratada, por exemplo por liofilização com vista a uma utilização posterior.

Constatámos que a especificidade natural da enzima assim transformada, por exemplo no caso da lipase de Mucor javanicus que no estado nativo liberta especificamente os ácidos gordos de cadeia média e de cadeia longa, se mantém na enzima modificada. Pelo contrário, a proporção saturados/insaturados dos ácidos gordos de cadeia longa do mesmo comprimento de cadeia libertados pela hidrólise mudava com a polaridade do reagente constituído pelo polímero em relação à que era obtida com a enzima nativa. Deste modo, um aumento da polaridade do polímero tinha como 4

consequência um deslocamento dos ácidos gordos libertados em direcção aos insaturados. Inversamente, um tratamento da enzima com um polímero apoiar conduzia à libertação preferencial de ácidos gordos saturados com comprimento de cadeia igual.

Este fenómero surpreendente da influência por via externa da especificidade da enzima pode ser utilizado com vantagem em diferentes aplicações do domínio alimentar.

Assim a invenção também se relaciona com um processo de aromatização de um produto alimentar, caracterizado por se incorporar nesse produto um substrato incubado com uma lipase modificada pelo processo precedente ou por se tratar esse produto com uma lipase modificada pelo processo precedente. A invenção também se relaciona com um processo de melhoramento das qualidades nutritivas de um substrato lipídico, caracterizado por se tratar uma matéria gorda com uma lipase modificada apoiar, isto é de polaridade acrescida de maneira a dela libertar num primeiro passo preferencialmente os ácidos gordos saturados, depois tratar num segundo passo o substrato com uma lipase modificada polar, o que conduz a introduzir preferencialmente ácidos gordos insaturados na matéria gorda por transesterificação.

Isto tem como consequência o aumento do valor da matéria gorda do ponto de vista da fisiologia da nutrição. O interesse deste método é a possibilidade de transformar um substrato a partir de uma lipase nativa da mesma origem, por exemplo de qualidade alimentar num processo necessitando de várias etapas.

Noutra ordem de ideias, pode utilizar-se a propriedade de modificar uma enzima específica libertando preferencialmente ácidos gordos de cadeia curta, por exemplo no fabrico de queijos realizando uma maturação acelerada, por exemplo para produzir aromas específicos. Uma tal enzima pode assim ser modificada no 5 r sentido desejado, por exemplo sem ter de recorrer a uma modificação pela via genética do microrganismo produtor da enzima.

Por outro lado, ao libertar preferencialmente ácidos gordos insaturados de cadeia longa por acção de uma enzima modificada de modo apropriado, pode produzir-se precursores de aroma uma vez que se sabe que os produtos da oxidação e da degradação desses ácidos gordos, por exemplos os álcoois, alcanos, aldeídos, cetonas e ésteres são aromas. Pode por exemplo produzir-se desta maneira um chocolate de leite com um aroma de "crumb" tal como o descrito no pedido de patente paralelo EP 92107095.9 da titular depositado sob a epígrafe "Processo de aromatização de um chocolate de leite".

As enzimas podem é claro ser utilizadas tal e qual em solução ou em suspensão no substrato ou na forma imobilizada sobre um suporte.

Os exemplos a seguir ilustram a invenção. Nestes exemplos, as partes e percentagens são em peso salvo indicação em contrário.

Exemplo 1

Dissolve-se 2 g de dimetilpolissiloxano de massa molecular de cerca de 10^ (SE-30®), 1 g de silano monómero bifuncional (glicidoxipropoxissilano, A-187®) e 30 mg de peróxido de dicumilo em 150 mL de clorofórmio e aquece-se, mantendo depois a mistura a refluxo durante 2 h. 0 polímero utilizado tem polaridade 44 na escala de McReynolds, isto é praticamente é não polar. 6 p Lc- ^^

Em seguida evapora-se o solvente, depois retoma-se o residuo em 200 mL de uma solução aquosa tampão 0,1 M de tetroxidoborato de sódio de pH 9.

Adiciona-se então 0,2 g de lipase de Mucor javanicus (ΜΑΡΙΟ®, de AMANO) e mantém-se a mistura com agitação durante 1 h à temperatura ambiente sob azoto. Terminada a reacção, ajusta-se o pH para 7 por adição de ácido clorídrico concentrado, em seguida concentra-se a solução por ultrafiltração e liofiliza-se o concentrado.

Exemplo 2

Dissolve-se 30 g de monometoxipolietilenoglicol de massa molecular cerca de 1500 (PEG-1540, Carbowax®) em 200 mL de tolueno na presença de 12 g de um crivo molecular e de 12 g de carbonato de sódio. Em seguida activa-se o polímero fazendo-o reagir com 0,8 g de cloreto do ácido cianídrico durante 2 h a 80°C com agitação. Após arrefecimento, filtra-se o meio reaccional, em seguida retoma-se em éter de petróleo e recupera-se o polímero activado. Tem uma polaridade de 554 na escala de McReynolds.

Dissolve-se 0,2 g de monometoxipolietilenoglicol activado e 0,2 g de lipase MAP-lo® em 250 mL de uma solução aquosa tampão 0,1 M de tetróxidoborato de sódio de pH 10, em seguida agita-se esta solução durante 1 h à temperatura ambiente sob azoto.

Após a reacção, leva-se a solução a pH 7 por adição de ácido clorídrico concentrado, em seguida dialisa-se a solução e liofiliza-se.

Exemplo 3

Dxssolve-se 3 g de dicianoetilpolissiloxano de massa molcular 105-10^ (OV-275®), 1 g de silano monómero bifuncional 7 V Γ L-Ci t (glicidopropoxissilano, A-187®) e 45 mL de peróxido de dicumilo em 200 mL de acetona que se aquece e se mantém a refluxo durante 3 h. O polímero tem uma polaridade de 844 na escala de McReynolds. Após a evaporação do solvente, retoma-se o resíduo em 150 mL de acetona, depois adiciona-se uma solução de 0,2 g de lipase MAP-10® em 25 mL de tampão aquoso de pH 9 contendo 0,1 M de tetróxidoborato de sódio, em seguida agita-se a solução durante 1 h à temperatura ambiente sob azoto. Após a reacção, ajusta-se o pH para 7 por adição de ácido clorídrico concentrado, em seguida liofiliza-se a solução.

Exemplo 4

Mistura-se 1 g de pectina A de maçã de massa molcular 105-l,5xl05 (metilada a 10%) e 0,2 g de lipase MAP-10® em solução aquosa de pH 5 e agita-se a solução durante 1 h sob azoto à temperatura ambiente. 0 polímero é muito polar. Em seguida separa-se com cuidado por centrifugação da pectina não solubilizada, depois ajusta-se o pH da solução para 7 por adição de uma base, concentra-se a solução por ultrafiltração e liofiliza-se o concentrado.

Exemplo 5

Utiliza-se as enzimas modificadas dos exemplos anteriores para realizar a lipólise do leite. Para tal, incuba-se leite inteiro com 0,5 U/mL de lipase durante 30 min a 37°C. Após a reacção, retoma-se o substrato em 4 vezes o seu volume de uma mistura equivolumétrica de clorofórmio e de metanol com agitação, depois centrifuga-se durante 10 min. Recolhe-se em seguida a fase orgânica que se aplica em placas de cromatografia em camada fina, depois separa-se os ácidos gordos livres dos outros compostos e forma-se os seus ésteres isopropílicos por esterificação. 8 Γ u t os ésteres

Analisa-se então quantitativamente isopropílicos por cromatografia em fase gasosa.

Os resultados da lipólise estão apresentados na tabela 1 a seguir na forma da razão entre as quantidades libertadas respectivamente dos ácidos palmítico (C 16:0), oleico (C 18:1) e linoleico (C 18:2) e a quantidade libertada correspondente de ácido esteárico (C 18:0).

Tabela 1

Polímero por polaridade Razão das quantidades de ácidos crescente gordos libertados C16:0 C18:1 C18:2 C18:0 C18:0 C18:0

Exemplo 1 2,57 1,59 0,15 Exemplo 2 3,93 1,45 0,05 Exemplo 3 3,78 4,43 2,07 Exemplo 4 3,43 5,08 0,22 Lipase nativa 3,15 2,45 0,14

Verifica-se uma alteração das proporções dos ácidos gordos libertados pelas enzimas modificadas em comparação com os ácidos gordos libertos pela enzima nativa, no sentido de um aumento apreciável dos ácidos gordos insaturados de cadeia longa idêntica.

Exemplos 6-12

Dissolve-se 0,2 g de lipase MAP-10® em 10 mL de solução aquosa contendo 200 mg das proteínas e polipéptidos indicados adiante. Deixa-se a enzima em presença do substrato durante 1 h com agitação. 9

Introduz-se em seguida a preparação enzimática numa mistura estável de emulsões à base de triestearina e de trioleína e incuba-se como no exemplo 5 acima. 0 isolamento e a identificação dos ácidos gordos libertos tem lugar como indicado no exemplo 5.

Os resultados obtidos estão apresentados na tabela 2 a seguir e expressos na forma da razão ponderai ácido oleico/ácido esteárico.

Tabela 2

Razão C 18:1/C18:0

Lipase não tratada 2,9

Exemplo 6: Beta caseína 6,3

Exemplo 7: Lactoglobulina 5,5

Exemplo 8: Albumina 3,8

Exemplo 9: Lactalbumina 4

Exemplo 10: Ácido poli-L-glutâmico 4,4

Exemplo 11: Poli-L-lisina 3,9

Exemplo 12: Poli-L-leucina 2,4

Exemplo 13

Os efeitos da lipólise por acção da lipase MAP-10® nativa (3) e da lipase modificada segundo o exemplo 4 (2) foram testados nas mesmas condições de incubação sobre um queijo fresco instantâneo reconstituído a partir de 70 g de pó em 210 mL de água em comparação com o queijo padrão (1) por meio de ensaios de degustação às cegas. A lipólise foi realizada por adição de 30 mg de enzima solubilizada em 5 mL de água a 70 g de queijo reconstituído em 205 mL de água e incubação durante 30 min à temperatura ambiente. Os queijos foram em seguida arrefecidos a cerca de 8-10°C. 10 p ^^ Ο queijo (2) apresentou um gosto de queijo semelhante ao de (1) embora mais intenso, mas sem aparecimento dos maus odores nem gosto a velho obtidos com (3).

As notas hedónicas médias eram 6 para (1), 7,6 para (2) e 8,8 (para (3) (0 = nota melhor, 10 = nota pior).

Exemplo 14

Com o objectivo de produzir molhos de queijo com sabor de Cheddar, incorporou-se um concentrado de leite inteiro ultrafiltrado lipolisado com lipase nativa MAP-10® (b), ou com lipase modificada de acordo com o exemplo 4 (c) em substituição parcial do Cheddar na fórmula padrão (a). O leite ultrafiltrado foi incubado com as lipases a 50°C durante 24 h. A composição dos molhos está indicada na Tabela 3 a seguir.

Tabela 3

Ingrediente Concentração (%)

Agua 68,05 68 69,35 Cheddar 10 6 6 Concentrado lipolizado (b) — 4 — Concentrado lipolizado (c) — — 4 Aroma de Cheddar 0,8 0,8 — Amido de milho 13,8 13,8 13,8 Óleo de soja Sais, corantes, espessantes 3,9 3,9 complemento a 3,9 100% Nota hedónica (0 = melhor, 10 = pior) 2,8 1,8 1,4 Em relação ao molho padrão (a), o que continha concentrado lipolizado com a lipase nativa (b) possuía um odor e 11 sabor de Cheddar pronunciados e o que continha o concentrado lipolizado com a lipase modificada (c) tinha uma nota butirica e um sabor a noz leves e agradáveis.

Lisboa, 28 de Março de 2000 agente oficial da propriedade industrial

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Claims

Γ

REIVINDICAÇÕES 1. Processo de modificação de uma lipase com o objectivo de modificar a sua especificidade em relação aos substratos lipidicos, caracterizado poe se criar uma polaridade induzinda fazendo reagir a lipase com um oligómero ou um polímero de polaridade seleccionada, para favorecer a libertação de ácidos gordos de grau de saturação pré-determinado sem modificar a sua especificidade em relação ao comprimento de cadeia dos ácidos gordos libertados.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se fazer reagir uma lipase apresentando uma especificidade de subtrato para ácidos gordos de cadeia média e longa com um oligómero ou um polímero polar.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se fazer reagir a lipase com uma pectina.
4. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a lipase ser MAP-10® de Mucor javanicus.
5. Processo de aromatização de um produto alimentar, caracterizado por se incubar um substrato com uma lipase modificada pelo processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, seguido da incorporação do referido substrato incubado.
6. Processo de aromatização de um produto alimentar, caracterizado por se incubar o referido produto com uma lipase modificada pelo processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 4.
7. Processo de melhoramento das qualidades nutricionais de um substrato lipídico, caracterizado por se tratar uma 1 matéria gorda com uma lipase apoiar modificada pelo processo de acordo com a reivindicação 1, isto é, cuja polaridade foi seleccionada de modo a dai libertar primeiramente preferencialmente os ácidos gordos saturados, que num segundo passo é tratada com uma lipase polar, modificada pelo processo de acordo com uma das reivindicações 2 e 3, o que conduz a introduzir preferencialmente ácidos gordos insaturados na matéria gorda por transesterificação. Lisboa, 28 de Março de 2000 λοηνίέ oficial da propriedade industrial

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