DE69327984T2

DE69327984T2 - Verfahren zur Modifizierung von Lipasen

Info

Publication number: DE69327984T2
Application number: DE69327984T
Authority: DE
Inventors: Oliver Chmiel; Helmut Traitler
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA; Nestle SA
Priority date: 1992-04-25
Filing date: 1993-04-13
Publication date: 2000-07-27
Anticipated expiration: 2013-04-14
Also published as: GR3033548T3; US5384256A; ATE190350T1; PT567830E; DK0567830T3; DE69327984D1; EP0567830A1; EP0567661A1; EP0567830B1; ES2144429T3

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Modifizieren einer Lipase sowie die Verwendungen einer auf diese Weise modifizierten Lipase für die Ernährung und für die Aromatisierung.
Lipasen sind Enzyme, die die Eigenschaft besitzen, emulgierte Fette zu hydrolysieren oder zu verestern. Bei diesem Vorgang werden die Fettsäuren aus den Tri-, Di- und Monoglyceriden freigesetzt. Eine Lipase besitzt je nach ihrem Typ und ihrem Ursprung eine eigene Spezifität. Dies kann eine Regiospezifität sein, beispielsweise im Fall einer Lipase aus Mucor miehei, die die Fettsäuren in den Positionen 1 und 3 des Glycerids selektiv abspaltet, oder eine Spezifität für das Substrat, beispielsweise bei einer Lipase aus Geotrichum candidum, oder eine gemischte Spezifität, die sich aus den beiden vorhergehenden Eigenschaften ergibt.
Man hat versucht, die natürlichen Eigenschaften von Lipasen zu verändern, indem man sie chemisch modifizierte, um ihnen eine bessere Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln zu verleihen, und zwar beispielsweise gemäß EP-A-149520, um ihre Hydrolyse- und Syntheseaktivitäten in den Umesterungsreaktionen in organischem Medium zu verbessern.
In J. Microb. Biotechnol., Bd. 6, Nr. 2, 1991, wird eine von Pilzen stammende Lipase mit Substratspezifität beschrieben, die eine starke Bevorzugung gegenüber Triglyceriden und ein Fehlen von Aktivität gegenüber den Methylestern der Caprylsäure, der Myristinsäure und der Stearinsäure zeigt. Die Lipase besitzt eine verbesserte Thermostabilität, wenn sie auf einem Polysiloxanträger mit Epoxygruppen immobilisiert ist.
In Biocatalysis, Bd. 3, Nr. 4, 1990 geht es um verschiedene Spezifitättypen von verschiedenen Lipasen. Dem Autor zufolge wurde berichtet, daß manche durch kovalente Bindung an Polyethylen gebundene Lipasen eine Löslichkeit in wässrigem Medium und ggf. eine gegenüber ihrem natürlichen Zustand erhöhte Aktivität besitzen. Der Autor gibt ferner an, daß die auf einem trägen Träger immobilisierten Lipasen besser als im nativen Zustand wiederverwendet werden können.
J. Am. Oil. Chem. Soc., Bd. 65, Nr. 6, 1988, betrifft eine vergleichende Untersuchung der Aktivität der Lipase aus M. miehei im nativen Zustand und im immobilisierten Zustand und zeigt, daß die Lipasen gegenüber den primären Estern von Triacylglycerolen hochspezifisch sind und daß ihre Spezifität gegenüber den Estern von gesättigten C&sub1;&sub4;- und C&sub1;&sub6;- Fettsäuren in immobilisierter Form leicht zugenommen hat.
EP-A-0149520 betrifft eine modifizierte Lipase, deren Aktivität bestehen bleibt und die in organischen Lösungsmitteln löslich ist, wenn sie durch ein Polyalkylenglycolderivat mit einer hydrophoben Endgruppe partiell substituiert wurde.
Der Stand der Technik bezieht sich also hauptsächlich auf die Immobilisierung der Lipasen und auf die Modifizierung ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften wie Thermostabilität oder Löslichkeit zum Zweck ihrer Rückgewinnung, jedoch nicht auf ihre Spezifität gegenüber dem Substrat.
Ziel der Erfindung ist es, die Lipase so zu modifizieren, daß sie in wässrigem Medium löslich bleibt und daß ihre Mikroumgebung gerichtet modifiziert wird, um ihre Spezifität gegenüber dem Substrat zu ändern, und zwar zu einem anderen Zweck als ihre Immobilisierung.
Die Erfindung betrifft deshalb ein Verfahren zum Modifizieren einer Lipase mit dem Ziel, ihre Spezifität gegenüber Lipidsubstraten zu verändern, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine induzierte Polarität erzeugt, indem man die Lipase mit einem Oligomer oder einem Polymer einer ausgewählten Polarität reagieren läßt, um die Freisetzung von Fettsäuren mit einem vorgegebenen Sättigungsgrad zu begünstigen, ohne die Spezifität bezüglich der Kettenlänge der freigesetzten Fettsäuren zu modifizieren.
Im Rahmen der Erfindung gehört eine bevorzugte Lipase, MAP-10 ® aus Mucor javanicus, zu der zweiten oben erwähnten Kategorie und besitzt eine Substratspezifität bei den Fettsäuren mit mittlerer und langer Kette
Zum Modifizieren der Lipase läßt man sie mit einem ggf. aktivierten Oligomer oder Polymer (in der folgenden Beschreibung verwendet man den Begriff Polymer, um sowohl ein Oligomer als auch ein eigentliches Polymer zu bezeichnen) vorzugsweise mit einer Molekülmasse von 500 bis 106 reagieren, dessen Polarität von keiner Polarität bis zu einem Wert von etwa 1000 McReynolds geht. Die Polaritätsskala von McReynolds (McReynolds, W. O., J. Chromatogr. Sci. 8, 685 (1970)) kann auf der Basis der Indizes der Gasphasenchromatographieretention von fünf Lösungsmitteln mit verschiedenen Polaritäten definiert werden, die an einem Polymer gemessen wurden, das in einer Gasphasenchromatographiesäule als stationäre Phase verwendet wird, was eine Bewertung der Polarität des getesteten Polymers durch Vergleich mit Squalan (durch Hydrogenierung von Squalen erhaltener gesättigter C&sub3;&sub0;-Kohlenwasserstoff) ergibt, dem man per Definition den Polaritätswert 0 zuordnet.
Die verwendeten Polymere können von unterschiedlicher chemischer Natur, synthetischen Ursprungs oder vorzugsweise natürlichen Ursprungs sein. Zu nennen sind beispielsweise Dimethylpolysiloxane und mit polaren Gruppen aufgepropfte Polyethylenglycole oder vorzugsweise Pektine, die den Vor teil haben, in ihrer Struktur bereits polare Carboxylgruppen zu besitzen.
Als Polymere natürlichen Ursprungs sind ferner Proteine zu nennen, beispielsweise beta-Casein, Lactoglobulin, Albumin, Lactalbumin, und die Polypeptide, beispielsweise Poly-L- leucin, Poly-L-glutaminsäure und Poly-L-lysin. Die Proteine oder Polypeptide werden in Form von wässriger Lösung verwendet, die beispielsweise 1 bis 40 mg Protein/Polypeptid pro ml enthält.
Im Fall von Pfropfpolymeren kann man die Aufpfropfung, die in einer Aktivierung des Polymers besteht, durchführen, indem man es mit einem monomeren koppelnden Mittel mit bifunktionellen polaren Gruppen reagieren läßt, beispielsweise im Fall von Polysiloxanen mit einem Glycidoxypropyltrimetoxysilan in Gegenwart einer Initiatorzusammensetzung für eine radikalische Reaktion, beispielsweise Dicumylperoxid, oder im Fall eines Polyethylenglycols, beispielsweise mit Chlorcyan in Gegenwart eines Lösungsmittels.
Dann läßt man das Polymer, dessen Polarität auf diese Weise modifiziert wurde, mit dem Enzym bei stark basischen pH- Bedingungen im Fall von Polysiloxanen oder Polyethylenglycolen oder bei schwach saurem pH im Fall von Pektinen reagieren und trocknet das behandelte Enzym beispielsweise durch Lyophilisierung zum Zweck seiner späteren Verwendung.
Wir haben festgestellt, daß die natürliche Spezifität des auf diese Weise umgewandelten Enzyms beispielsweise im Fall der Lipase aus Mucor javanicus, die im nativen Zustand spezifisch die mittelkettigen und langkettigen Fettsäuren freisetzt, bei dem modifizierten Enzym bestehengeblieben ist. Dagegen änderte sich das Verhältnis gesättigt/ungesättigt bei den durch die Hydrolyse freigesetzten langkettigen Fettsäuren derselben Kettenlänge mit der Polarität des Polymer-Reagenz gegenüber dem bei dem nativen Enzym erhaltenen Verhältnis. Auf diese Weise hatte eine Erhöhung der Polarität des Polymers eine Verschiebung der freigesetzten Fettsäuren in Richtung auf die ungesättigten zur Folge. Umgekehrt führte eine Behandlung des Enzyms mit einem apolaren Polymer zur bevorzugten Freisetzung von gesättigten Fettsäuren mit gleicher Kettenlänge. Diese überraschende Erscheinung der Beeinflussung der Spezifität des Enzyms auf äußerem Weg kann in verschiedenen Anwendungen im Nahrungsmittelbereich genutzt werden.
Die Erfindung betrifft deshalb auch ein Verfahren zur Aromatisierung eines Lebensmittelprodukts, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man diesem Produkt ein Substrat einarbeitet, das mit einer nach dem vorstehenden Verfahren modifizierten Lipase inkubiert wurde, oder daß man dieses Produkt mit einer in dem vorstehenden Verfahren modifizierten Lipase behandelt.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Verbesserung der Ernährungseigenschaften eines Lipidsubstrats, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Fett mit einer modifizierten unpolaren Lipase behandelt, d. h. mit einer Polarität, die so erhöht wurde, daß in einem ersten Zeitraum bevorzugt gesättigte Fettsäuren freigesetzt werden, wonach man in einem zweiten Zeitraum das Substrat mit einer polaren modifizierten Lipase behandelt, was dazu führt, daß vorzugsweise ungesättigte Fettsäuren durch Umesterung in das Fett eingeführt werden.
Dies führt zu einer Erhöhung des Werts des Fettes in ernährungsphysiologischer Hinsicht. Die Bedeutung dieser Methode liegt in der Möglichkeit der Umwandlung eines Substrats ausgehend von einer nativen Lipase desselben Ursprungs beispielsweise mit Nahrungsmittelqualität in einem mehrere Schritte erfordernden Vorgang.
Gemäß einem anderen Aspekt kann man die Eigenschaft der Modifizierung eines spezifischen, bevorzugt Fettsäuren mit kurzer Kettenlänge freisetzendes Enzyms beispielsweise bei der Käseherstellung verwenden, indem man eine beschleunigte Reifung vornimmt, um beispielsweise spezifische Aromen zu erzeugen. Ein solches Enzym kann auf diese Weise in der gewünschten Richtung modifiziert werden, beispielsweise ohne eine Modifikation des Schutzmikroorganismus des Enzyms auf genetischem Weg vornehmen zu müssen. Indem man bevorzugt ungesättigte Fettsäuren mit langer Kettenlänge durch Wirkung eines in geeigneter Weise modifizierten Enzyms freisetzt, kann man ferner Aromavorläufer erzeugen, da die Produkte der Oxidation und der Zersetzung dieser Fettsäuren, beispielsweise Alkohole, Alkane, Aldehyde, Cetone und Ester, Aromen sind. Auf diese Weise kann man beispielsweise eine Milchschokolade mit einem "crumb" -Aroma erzeugen, wie in der Parallelanmeldung EP 92107095.9 "Procede d'aromatisation d'un chocolat au lait" der Anmelderin beschrieben ist. Die Enzyme können natürlich so, wie sie sind, in Lösung oder in Suspension in dem Substrat oder in auf einem Träger immobilisierter Form verwendet werden.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung. In diesen beziehen sich die Anteile und Prozentsätze auf das Gewicht, sofern nicht anders angegeben ist.

Beispiel 1

Man löst 2 g Dimethylpolysiloxan mit einer Molekülmasse von etwa 106 (SE-30 ®), 1 g monomeres bifunktionelles Silan (Glycidoxypropoxysilan, A-187 ®) und 30 mg Dicumylperoxid in 150 ml Chloroform, erhitzt und hält dann die Mischung während 2 h unter Rückfluß. Das eingesetzte Polymer hat die Polarität 44 auf der McReynolds-Skala, d. h. es ist praktisch nicht polar.
Anschließend dampft man das Lösungsmittel ab und nimmt dann den Rückstand in 200 ml einer 0,1 M wässrigen Pufferlösung von Natriumtetroxyborat mit pH 9 auf.
Man gibt dann 0,2 g Lipase aus Mucor javanicus (MAP-10 ® aus AMANO) bei und hält die Mischung unter Rühren während 1 h unter Stickstoff auf Raumtemperatur. Nach Beendigung der Reaktion stellt man das pH durch Beigabe von konzentrierter Salzsäure auf 7 ein, konzentriert die Lösung durch Ultrafiltration und lyophilisiert das Konzentrat.

Beispiel 2

Man bringt 30 g Monomethoxypolyethylenglycol mit einer Molekülmasse von etwa 1500 (PEG-1540, Carbowax ®) in Gegenwart von 12 g eines Molekularsiebs und 12 g Natriumcarbonat in 200 ml Toluol in Lösung. Man aktiviert dann das Polymer, indem man es während 2 h bei 80ºC unter Rühren mit 0,8 g Chlorcyan reagieren läßt. Nach Abkühlen filtert man das Reaktionsmedium, nimmt es dann in Petrol-ether auf und gewinnt das aktivierte Polymer. Es hat eine Polarität von 554 auf der McReynolds-Skala.
Man bringt 0,2 g aktiviertes Monomethoxypolyethylenglycol und 0,2 g Lipase MAP-10 ® in 250 ml einer wässrigen 0,1 M Pufferlösung von Natriumtetroxyborat mit pH 10 in Lösung und rührt diese Lösung während 1 h bei Raumtemperatur unter Stickstoff.
Nach Reaktion bringt man die Lösung durch Beigabe von konzentrierter Salzsäure auf pH 7, dialysiert die Lösung und lyophilisiert sie.

Beispiel 3

Man löst 3 g Dicyanoethylpolysiloxan mit einer Molekülmasse von 105-106 (OV-275, ®), 1 g bifunktionales monomeres Silan (Glycidopropoxysilan, A-187 ®) und 45 ml Dicumylperoxid in 200 ml Aceton, das man erhitzt und während 3 h unter Rückfluß hält. Das Polymer hat eine Polarität von 844 auf der McReynolds-Skala. Nach Abdampfung des Lösungsmittels nimmt man den Rückstand in 150 ml Aceton auf und gibt eine Lösung von 0,2 g Lipase MAP-10 ® in 25 ml wässrigem Puffer von pH 9 bei, der 0,1 M Natriumtetroxyborat enthält, und rührt dann die Lösung während 1 h bei Raumtemperatur unter Stickstoff. Nach Reaktion stellt man das pH durch Beigabe von konzentrierter Salzsäure auf 7 ein und lyophilisiert dann die Lösung.

Beispiel 4

Man mischt 1 g Apfelpektin A mit einer Molekülmasse von 10&sup5; - 1,5 · 10&sup5; (zu 10% methyliert) und 0,2 g Lipase MAP-10 ® in wässriger Lösung mit einem pH von 5 und rührt die Lösung während 1 h bei Raumtemperatur unter Stickstoff.
Das Polymer ist sehr polar. Man trennt anschließend das nicht solubilisierte Pektin durch Zentrifugieren vorsichtig ab, stellt dann das pH der Lösung durch Beigabe einer Base auf 7 ein, konzentriert die Lösung durch Ultrafiltration und lyophilisiert das Konzentrat.

Beispiel 5

Man verwendet die modifizierten Enzyme der vorhergehenden Beispiele zur Durchführung einer Lipolyse der Milch. Zu diesem Zweck inkubiert man Vollmilch mit 0,5 U/ml Lipase während 30 min bei 37ºC. Nach Reaktion nimmt man das Substrat in dem Vierfachen seines Volumens einer volumensgleichen Mischung aus Chloroform und Methanol unter Rühren auf und zentrifugiert es dann während 10 min. Man gewinnt anschließend die organische Phase, die man auf Dünnschichtchromatographieplatten aufbringt, trennt die freien Fettsäuren der anderen Verbindungen ab und bildet durch Veresterung ihre Isopropylester.
Dann analysiert man die Isopropylester quantitativ durch Gasphasenchromatographie.
Die Ergebnisse der Lipolyse sind in der nachstehenden Tabelle 1 in Form des Verhältnisses der jeweiligen freigesetzten Mengen von Palmitinsäure (C 16 : 0), Oleinsäure (C 18 : 1) und Linolsäure (C 18 : 2) zu der entsprechenden freigesetzten Menge Stearinsäure (C 18 : 0) angegeben. Tabelle 1
Man stellt fest, daß sich die Anteile der durch die modifizierten Enzyme freigesetzten Fettsäuren im Vergleich zu den Anteilen der durch das native Enzym freigesetzten Fettsäuren in Richtung einer merklichen Zunahme der ungesättigten Fettsäuren gleicher Kettenlänge ändern.

Beispiele 6-12

Man löst 0,2 g Lipase MAP-10 ® in 10 ml wässriger Lösung, die 200 mg der im nachstehenden angeführten Proteine und Polypeptide enthält. Man läßt dann das Enzym während 1 h unter Rühren in Gegenwart des Substrats. Man führt anschließend das Enzympräparat in eine stabile Mischung von Emulsionen auf der Basis von Trisearin und Triolein ein und inkubiert sie wie im vorstehenden Beispiel 5. Die Isolierung und Identifizierung der freigesetzten Fettsäuren findet wie in Beispiel 5 statt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 2 angeführt und in Form des Gewichtsverhältnisses von Oleinsäure zu Stearinsäure ausgedrückt.

Tabelle 2

Verhältnis C 18 : 1/C 18 : 0

Nicht behandelte Lipase 2,9
Beispiel 6: Beta-Casein 6,3
Beispiel 7: Lactoglobulin 5,5
Beispiel 8: Albumin 3,8
Beispiel 9: Lactalbumin 4
Beispiel 10: Poly-L-glutaminsäure 4,4
Beispiel 11: Poly-L-lysin 3,9
Beispiel 12: Poly-Lleucin 2,4

Beispiel 13

Die Wirkungen der Lipolyse durch die Einwirkung der nativen Lipase MAP-10 ®(3) und der modifizierten Lipase gemäß Beispiel 4 (2) wurden bei gleichen Inkubationsbedingungen an einem Instantfrischkäse, der aus 70 g Pulver in 210 ml Wasser rekonstituiert wurde, durch Vergleich mit dem Standardkäse (1) mit Hilfe von Blinddegustationstests getestet. Die Lipolyse wurde durchgeführt, indem 70 g rekonstituiertem Käse in 205 ml Wasser 30 mg in 5 ml Wasser solubilisiertes Enzym beigegeben wurde und während 30 min bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Der Käse wurde anschließend auf etwa 8-10ºC gekühlt.
Der Käse (2) zeigte einen Käsegeschmack ähnlich dem von (1), und zwar intensiver, jedoch ohne Auftreten von schlechten Gerüchen oder altem Geschmack, wie sie mit (3) erzielt wurden.
Die mittleren Geschmacksnoten betrugen 6 bei (1), 7,6 bei (2) und 8, 8 bei (3) (0 = beste Note, 10 = weniger gute Note).

Beispiel 14

Zur Herstellung von Käsesaucen mit Cheddargeschmack wurde ein Konzentrat aus ultrafiltrierter Vollmilch, die entweder durch die native Lipase MAP-10 ® (b) oder durch die modi fizierte Lipase gemäß Beispiel 4 (c) lipolysiert wurde, als partieller Ersatz des Cheddar in der Standardformulierung (a) eingeführt. Die ultrafiltrierte Milch wurde während 24 h bei 50ºC mit den Lipasen inkubiert. Die Zusammensetzung der Saucen ist in der nachstehenden Tabelle 3 angeführt. Tabelle 3
(0 = besser,
10 = weniger gut)
Gegenüber der Standardsauce (a) hatte die Sauce, die das mit der nativen Lipase lipolysierte Konzentrat enthält (b), einen ausgeprägten Cheddargeruch und -geschmack, und die Sauce, die das mit der modifizierten Lipase lipolysierte Konzentrat (c) enthält, hatte eine leichte angenehme Butternote und einen leichten und angenehmen Nußgeschmack.

Claims

1. Verfahren zum Modifizieren einer Lipase mit dem Ziel, ihre Spezifität gegenüber Lipidsubstraten zu verändern, dadurch gekennzeichnet, daß man eine induzierte Polarität erzeugt, indem man die Lipase mit einem Oligomer oder einem Polymer einer ausgewählten Polarität reagieren läßt, um die Freisetzung von Fettsäuren mit einem vorgegebenen Sättigungsgrad zu begünstigen, ohne die Spezifität bezüglich der Kettenlänge der freigesetzten Fettsäuren zu modifizieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Lipase, die eine Substratspezifität für Fettsäuren mittlerer und langer Kettlänge aufweist, mit einem polaren Oligomer oder Polymer reagieren läßt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lipase mit einem Pektin reagieren läßt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipase MAP-10® aus Mucor javanicus ist.

5. Verfahren zur Aromatisierung eines Lebensmittelprodukts, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Substrat mit einer nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 modifizierten Lipase inkubiert, wonach man das inkubierte Substrat einarbeitet.

6. Verfahren zur Aromatisierung eines Lebensmittelprodukts, dadurch gekennzeichnet, daß man das Produkt mit einer nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 modifizierten Lipase inkubiert.

7. Verfahren zur Verbesserung der Ernährungseigenschaften eines Lipidsubstrats, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Fett mit einer unpolaren Lipase, die nach einem Verfahren nach Anspruch 1 modifiziert wurde, behandelt, und zwar so, daß deren Polarität so gewählt wurde, daß in einem ersten Zeitraum bevorzugt gesättigte Fettsäure freigesetzt werden, wonach man in einem zweiten Zeitraum das Substrat mit einer polaren Lipase behandelt, die nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 2 und 3 modifiziert wurde, was dazu führt, daß vorzugsweise ungesättigte Fettsäuren durch Umesterung in das Fett eingeführt werden.